KR20100028064A - 면역글로불린 정제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 양이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 것을 포함하는, 면역글로불린의 정제 벙법에 관한 것이다.

Description

면역글로불린 정제{IMMUNOGLOBULIN PURIFICATION}
본 발명은 폴리펩타이드 정제 분야에 관한 것이다. 용액 중의 면역글로불린을 불순물로부터, 특히 응집된 형태의 면역글로불린으로부터 분리시킴에 의해 단량체 형태의 면역글로불린을 제공하는 방법을 개시한다.
단백질 및 특히 면역글로불린은 오늘날의 의료 포트폴리오에서 중요한 역할을 한다. 인간에 적용하기 위해, 모든 치료적 단백질은 분명한 기준을 충족시켜야 한다. 인간에 대한 생물약제(biopharmaceutical agent)의 안전성을 보장하기 위해, 심각한 유해를 야기할 핵산, 바이러스 및 숙주 세포 단백질은 특별히 제거되어야 한다. 규제 내역을 충족시키기 위해, 하나 이상의 정제 단계가 제조 공정에 이어져야 한다. 무엇보다, 순도, 처리량 및 수율은 적절한 정제 공정을 결정하는데 중요한 역할을 한다.
다양한 방법들, 예를 들면, 미생물 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피(예: 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예: 양이온 교환(설포프로필 또는 카복시메틸 수지), 음이온 교환(예: 아미노 에 틸 수지) 및 혼합-모드 이온 교환), 친티오성(thiophilic) 흡착(예: 베타-머캅토에탄올 및 다른 SH 리간드 사용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예: 페닐-세파로즈, 아자-아레노필릭(aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산 사용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예: Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 사용), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예: 겔 전기영동, 모세관 전기영동)(문헌[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech., 75 (1998) 93-102])이 단백질 정제에 잘 확립되어 있으며 널리 사용되고 있다.
문헌[Necina, R. et al., Biotechnol. Bioeng., 60 (1998) 689-698]은 고전하 밀도를 나타내는 이온 교환 매질에 의해 세포 배양 상청액으로부터 인간 단클론 항체를 직접 포집하는 것을 보고하였다. WO 89/05157 호에는 세포 배양 배지를 양이온 교환 처리에 직접 적용하여 생성물 면역글로불린을 정제하는 방법이 보고되어 있다. 마우스의 복수로부터 단클론성 IgG 항체의 1-단계 정제방법이 문헌[Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth., 115 (1998) 79-88]에 기술되어 있다.
문헌[Mhatre, R. et al., J. Chrom. A, 707 (1995) 225-231]은 양이온 교환 크로마토그래피 및 pH 구배 용리에 의한 항체 Fab 단편의 정제를 연구하였다.
WO 94/00561 호는 인간 단클론성 항-레수스(anti-rhesus) 항체 및 이를 생성하는 세포주를 보고하고 있다. 하나 이상의 오염물질로부터 목적 폴리펩타이드를 분리하기 위해 구배 세정을 이용하는, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 폴리펩타이드를 정제하는 방법이 WO 2004/024866 호에 기록되어 있다. 문헌[Schwarz, A. et al., Laborpraxis, 21 (1997) 62-66]은 CM-하이퍼D-컬럼을 사용한 단클론성 항체의 정제를 보고하고 있다.
WO 2004/076485 호는 단백질 A 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제 방법을 보고하고 있다. EP 0 530 447 호에는, 3단계 크로마토그래피 단계의 조합에 의해 IgG 단클론성 항체를 정제하는 방법이 보고되어 있다. 항체 제제로부터 단백질 A의 제거는 US 4,983,722 호에 보고되어 있다.
재조합 단클론성 항체 공정은 미량 수준의 불순물 및 잠재적 오염물질, 예컨대 DNA, 숙주 세포 단백질 및 바이러스를 결합시키면서 항체는 플로우 쓰루되도록 하기 위해 종종 음이온-교환 크로마토그래피를 사용한다(문헌[Knudsen, H.L., et al., J. Chrom. A 907 (2001) 145-154]).
WO 95/16037 호는 단백질 A 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된 하이브리드 하이브리도마로부터 항-EGF-R/항-CD3 이중특이성 단클론 항체의 정제를 기록하고 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 그의 다량체(multimer)로부터 항체 단량체를 분리하는 것이 EP 1 084 136 호에 보고되어 있다. US 5,429,746 호는 항체 분자 단백질의 정제에 소수성 상호작용 크로마토그래피 조합 크로마토그래피의 적용에 관한 것이다.
유체, 특히 하전된 미립자로 오염된 비경구(parenteral) 또는 생물학적 액체의 여과에서 사용되는 음이온 개질된 미세다공질 막이 US 4,604,208 호에 보고되어 있다. WO 03/040166 호는 단백질 함유 스트림에서의 미량의 불순물의 제거를 위해 설계된 막 및 장치를 보고한다.
폴리펩타이드를 회수하는 방법은 US 6,716,598 호에 보고되어 있다. US 2006/0194953 호에는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 항체로부터 누출된 단백질 A를 선택적으로 제거하는 방법이 보고되어 있다.
발명의 요약
본 발명은 면역글로불린 정제 분야에서의 많은 양태를 포함한다. 한 양태는, 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 양이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계를 포함하는, 면역글로불린의 정제 방법이다. 하나의 실시양태에서, 상기 단계는 플로우-쓰루(flow-through) 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 양이온 교환 단계 전 또는 후에, 단량체 형태 및/또는 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 음이온 교환 물질에 적용하고, 상기 음이온 교환 물질의 플로우-쓰루 통과액으로부터 상기 면역글로불린을 회수하는 추가 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 단계는 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계이다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 양이온 교환 단계 전 또는 상기 음이온 교환 단계 전에, 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함 하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 친화성 컬럼에 결합하는 조건 하에, 친화성 컬럼에 적용하고, 상기 친화성 컬럼으로부터 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 회수하는 추가 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 단계는 결합-및-용리 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계이다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 양이온 교환 단계로서, 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 막(membrane) 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 막 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 막 양이온 교환 물질 플로우-쓰루 통과액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 양이온 교환 물질은 막 양이온 교환 물질이다. 다른 실시양태에서, 상기 막 양이온 교환 물질은 무스탕(Mustang)TM S, 무스탕TM C, 또는 사토바인드(Sartobind)TM S 또는 사토바인드TM C이다. 또 다른 실시양태에서, 막 양이온 교환 물질은 설폰산 기 또는 카복시메틸 기로 개질된 폴리에터설폰계 막 또는 재생 셀룰로스계 막이다. 하나의 실시양태에서, 상기 용액은 pH 4 내지 pH 8, 바람직하게는 pH 5 내지 pH 8의 pH 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 용액은 1 내지 15 mS/cm, 바람직하게는 4.0 내지 10.0 mS/cm의 전도율을 갖는다.
다른 실시양태는 상기 플로우-쓰루 통과액으로부터 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 것이, 침전, 탈염, 한외여과, 투석여과, 냉동건조, 친화성 크로마토그래피, 또는 농축 용액을 수득하기 위한 용매 체적 감축법으로부터 선택된 방법 에 의해 수행된다. 바람직하게는, 상기 회수는 한외여과, 냉동건조 또는 용매 체적 감축법에 의한다.
다른 실시양태에서, 상기 면역글로불린은 막 양이온 교환 물질의 플로우-쓰루 통과액으로부터 수득되고, 그 면역글로불린 중 95% 이상이 단량체 형태이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단량체 형태의 면역글로불린의 90% 이상은 양이온 교환 물질에 결합하지 않는다. 하나의 실시양태는, 상기 완충된 수용액이 인산 또는 그의 염, 시트르산 또는 그의 염 또는 히스티딘 또는 그의 염을 포함하는 용액인 것이다. 다른 실시양태에서, 상기 완충된 수용액은 염화나트륨 또는 염화칼륨을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 크로마토그래피 단계는 컬럼 크로마토그래피 또는 카세트 크로마토그래피이다.
본 발명은 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 양이온 교환 물질과의 접촉, 즉 제거 후에 상기 용액 또는 상청액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계를 포함하는, 면역글로불린의 정제 방법을 포함한다.
본원에서 내에서 사용된 "이온 교환 물질" 및 이와 문법적으로 균등한 용어는 공유 결합된 하전된 치환체를 갖는 고정상(immobile) 고분자량 매트릭스를 의미한다. 전체 전하가 중성이 되도록, 공유 결합되지 않은 상대 이온은 이온성 상호작용에 의해 하전된 치환체에 결합된다. "이온 교환 물질"은 주위 용액의 유사하게 하전된 결합 파트너 또는 이온에 대해 그의 공유 결합되지 않은 상대 이온을 교환하는 능력을 갖는다. 그의 교환가능한 상대 이온의 전하에 따라, "이온 교환 물질"은 양이온 교환 물질 또는 음이온 교환 물질로 지칭된다. 하전된 기(치환체)의 성질에 따라, "이온 교환 물질"은, 예를 들면, 양이온 교환 물질의 경우, 설폰산 또는 설포프로필 수지(S) 또는 카복시메틸 수지(CM)로 지칭된다. 하전된 기/치환체의 화학적 성질에 따라, "이온 교환 물질"은 또한 공유결합된 하전된 치환체의 강도에 따라 강 이온 또는 약 이온 교환 물질로 분류될 수 있다. 예를 들면, 강한 양이온 교환 물질은 하전된 치환체로서 설폰산 기, 바람직하게는 설포프로필 기를 가지며, 약한 양이온 교환 물질은 하전된 치환체로서 카복실산기, 바람직하게는 카복시메틸기를 갖는다. 강한 음이온 교환 물질은 하전된 치환체로서 4급 암모늄 기를 갖고, 약한 음이온 교환 물질은 하전된 치환체로서 다이에틸아미노에틸기를 갖는다.
본원 내에서 사용된 "막"이라는 용어는 미세다공질 또는 거대다공질 막 모두를 의미한다. 상기 막 자체는 중합체 물질, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리 비닐 클로라이드, 폴리아미드(나일론, 예컨대 제타포어TM, N66 포시다인TM), 폴리에스터, 셀룰로스 아세테이트, 재생 셀룰로스, 셀룰로스 복합체, 폴리설폰, 폴리에터설폰, 폴리아릴설폰, 폴리페닐설폰, 폴리아크릴로나이트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 부직 및 제직 직물(예컨대 타이벡®), 또는 섬유성 물질로 이루어지거나, 또는 무기 물질 예컨대 제올라이트, SiO2, Al2O3, TiO2 또는 하이드록시아파타이트로 이루어진다. 하나의 실시양태에서, 상기 막은 폴리에터설폰 막 또는 재생 셀룰로스 막이다.
이온 교환 수지는 많은 회사로부터 다양한 명칭으로 입수가능하며, 예를 들면, 양이온 교환 수지 예컨대 바이오-렉스®(예컨대 유형 70), 첼렉스®(예컨대 유형 100), 마크로-프레프®(예컨대 유형 CM, High S, 25 S), AG®(예컨대 유형 50W, MP)(이들 모두는 바이오래드 래버러토리즈(Biorad Laboratories)에서 시판), WCX2(사이퍼겐(Ciphergen)에서 시판), 다우엑스®(Dowex) MAC-3(다우 케미칼 캄파니에서 시판), 무스탕 C 및 무스탕 S(폴 코포레이션(Pall Corp.)에서 시판), 셀룰로스 CM(예컨대, 유형 23, 52), 하이퍼-D 및 파티스피어(partisphere)(와트만 피엘씨(Watman plc)에서 시판), 앰버라이트(Amberlite)® IRC(예컨대 76, 747, 748), 앰버라이트® GT 73, 토요펄®(예컨대 타입 SP, CM, 650M)(이들 모두는 토소 바이오사이언스 게엠베하(Tosoh Bioscience GmbH)에서 시판), CM 1500 및 CM 3000(바이오크롬 랩스(BioChrom Labs)에서 시판), SP-세파로스TM, CM-세파로스TM(GE 헬스케어에서 시판), 포로스(Poros) 수지(퍼셉티브 바이오시스템즈(PerSeptive Biosystems)에서 시판), 아사히팩 ES(예컨대 유형 502C), CX팩 P, IEC CM(예컨대 유형 825, 2825, 5025, LG), IEC SP(예컨대 유형 420 N, 825), IEC QA(예컨대 유형 LG, 825)(쇼코 아메리카 인코포레이티드에서 시판), 50W 양이온 교환 수지(에이크롬 테크놀로지스 인코포레이티드에서 시판), 및 예를 들면 음이온 교환 수지, 예컨대 다우엑스® 1(다우 케미칼 캄파니에서 시판), AG®(예컨대 유형 1, 2, 4), 바이오-렉스® 5, DEAE 바이오-겔 1, 마크로-프레프® DEAE(이들 모두는 바이오래드 래버러토리즈에서 시판), 음이온 교환 수지 유형 1(에이크롬 테크놀로지스 인코포레이티드에서 시판), 소스 Q, ANX 세파로스 4, DEAE 세파로스(예컨대 유형 CL-6B, FF), Q 세파로스, 캅토 Q, 캅토 S(이들 모두는 GE 헬스캐어에서 시판), AX-300(퍼킨엘머에서 시판), 아사히팩 ES-502C, AX팩 WA(예컨대 유형 624, G), IEC DEAE(이들 모두는 쇼코 아메리카 인코포레이티드에서 시판), 앰버라이트® IRA-96, 토요펄® DEAE, TSK겔 DEAE(이들 모두는 토소 바이오사이언스 게엠베하에서 시판), 무스탕 Q(폴 코포레이션에서 시판)가 있다. 막 이온 교환 물질에서, 결합 부위는 플로우-쓰루 공극 벽에서 찾을 수 있고 확산 공극 내에 숨어 있지 않아서, 확산보다는 대류를 통해 매스(mass) 전달을 가능케 한다. 막 이온 교환 물질은 많은 회사로부터 다양한 명칭으로 입수가능하며, 예를 들면, 사토리우스(막 양이온 교환 물질: 사토바인드TM CM, 사토바인드TM S, 막 음이온 교환 물질: 사토바인드TM Q), 또는 폴 코포레이션(막 양이온 교환 물질: 무스탕TM S, 무스탕TM C, 막 음이온 교환 물질: 무스탕TM Q), 또는 폴 바이오파마슈티칼즈가 있다. 하나의 실시양태에서, 막 양이온 교환 물질은 사토바인드TM CM 또는 사토바인드TM S, 또는 무스탕TM S 또는 무스탕TM C이다. 다른 실시양태에서, 막 양이온 교환 물질은 설폰산 기 또는 카복시메틸 기로 개질된 폴리에터설폰계 막 또는 재생 셀룰로스계 막이다. 또 다른 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 Q-유형(4급 암모늄 기-유형) 막 음이온 교환 물질 또는 Q-음이온 교환 컬럼이다.
"폴리펩타이드"는 천연이든 또는 합성으로 생성된 것이든, 펩타이드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드를 "펩타이드"라 칭한다.
"단백질"은 100개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄 또는 하나의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 탄수화물기와 같은 비-펩타이드 성분을 포함한다. 탄수화물 및 다른 비-펩타이드 치환체는 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 부가될 수 있으며, 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 단백질은 본원에서 그의 아미노산 주쇄 구조와 관련하여 정의되며; 탄수화물기와 같은 치환체는 일반적으로 명시하지 않으나, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
본원 내에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "면역글로불린" 및 이와 문법적으로 균등한 용어는 2개 이상의 경쇄 폴리펩타이드 및 2개의 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 각각 항원과의 상호작용을 위한 결합 영역을 함유하는 가변 영역(일반적으로 폴리펩타이드 쇄의 아미노 말단 부분)을 함유한다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 각각 또한 숙주 조직, 또는 면역 시스템의 다양한 세포, 일부 식세포 및 전통적인 보체계의 제 1 성분(C1q)을 포함한 인자들에 대한 항체의 결합을 매개할 수 있는 불변 영역(일반적으로 폴리펩타이드 쇄의 카복시 말단 부분)을 포함한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드는 각각, 경쇄 폴리펩타이드의 경우 가변 영역, 즉, VL 또는 VH, 및 불변 영역, 즉, CL로 본질적으로 이루어지고, 또는 중쇄 폴리펩타이드의 경우 가변 영역, 즉, VL 또는 VH, 및 불변 영역, 즉, CH1, 힌지(hinge), CH2, CH3 및 임의로 CH4로 본질적으로 이루어진다.
본원에서 사용된 용어 "면역글로불린"은 실질적으로 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진 단백질을 말한다. 인지된 항체 유전자는 다양한 불변 영역 유전자, 및 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 면역글로불린은, 예를 들면, Fv, Fab 및 F(ab)2 및 단일쇄를 포함하여 다양한 형태로 존재할 수 있다(예를 들면, 문헌[Huston, J.S., et al., PNAS USA 85 (1988) 5879-5883]; [Bird et al., Science, 242 (1988) 423-426]; 및 일반적으로, 문헌[Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y. (1984) 2nd edition]; 및 [Hunkapiller and Hood, Nature, 323 (1986) 15-16] 참조). 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 단클론성 항체 및 그의 단편, 예를 들면, 단리된 중쇄 또는 경쇄, 또는 추가 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 융합된 중쇄 또는 경쇄, 및 이들의 단편을 포함한다.
"단량체 형태의 면역글로불린" 및 이와 문법적으로 균등한 용어는 제 2 면역글로불린 분자와 결합되지 않는, 즉 면역글로불린 분자가 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로도 제 2 면역글로불린 분자에 결합되지 않는 면역글로불린 분자를 의미한다. "응집된 형태의 면역글로불린" 및 이와 문법적으로 균등한 용어는 하나 이상의 추가의 면역글로불린 분자와 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 결합되는 면역글로불린 분자를 의미한다. 응집된 형태의 면역글로불린은 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 단일 피크로서 용리된다. 본원 내에서 사용된 "단량체 형태의" 및 이와 문법적으로 균등한 용어는, 면역글로불린 분자의 100%가 단량체 형태로 존재하는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. 또한, 이는, 면역글로불린 분자 중에서, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99% 초과의 면역글로불린 분자가 단량체 형태임을 의미한다. "단량체 형태 및 응집된 형태의"라는 용어는 다른 면역글로불린 분자와 결합되지 않은 면역글로불린 분자 및 다른 면역글로불린 분자와 결합된 면역글로불린 분자의 혼합물을 의미한다. 이 혼합물에서, 단량체 형태 또는 응집된 형태 어느 것도 독점적으로 존재하지 않는다.
본원 내에서 사용된 "100%"라는 용어는 특정 성분 외의 성분들의 양이 특정 조건 하에서의 분석 방법에서의 검출 한계 미만으로 존재하는 것을 의미한다.
본원 내에서 사용된 "90%", "95%", "98%", "99%"라는 용어는 정확한 값은 아니지만, 특정 조건 하에서의 분석 방법에서 정확도 범위 내의 값을 의미한다.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 그의 사용법은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E.(ed), Elsevier Science Publishing Company, New York (1992)]; [Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z.(ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)]; [Chromatography Today, Poole, C.F., and Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)]; [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, (1982)]; [Sambrook, J., et al.(ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]; 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al.(eds), John Wiley & Sons, Inc., New York]을 참조하시오.
재조합식으로 생성된 면역글로불린의 정제에서 다양한 컬럼 크로마토그래피 단계들의 조합이 종종 이용된다. 일반적으로 단백질 A 친화성 크로마토그래피 후 1 또는 2회의 추가 분리 단계가 따른다. 최종 정제 단계는, 미량의 불순물 및 오염물질, 예컨대 응집된 면역글로불린, 잔류 HCP(숙주 세포 단백질), DNA(숙주 세포 핵산), 바이러스 또는 내독소의 제거를 위한 소위 "폴리싱(polishing) 단계"이다. 이러한 폴리싱 단계에서 플로우-쓰루 모드의 음이온 교환 물질이 종종 사용된다.
본원 내에 사용된 "플로우-쓰루 모드" 및 이와 문법적으로 균등한 용어는, 정제되어지는, 목적 물질 예컨대 단량체 형태의 면역글로불린을 함유하는 용액을 정지 상, 바람직하게는 고체 상과 접촉시켜 목적 물질이 그 정지 상에 결합하지 않는 정제 방법, 예컨대 크로마토그래피 방법의 수행 모드를 의미한다. 결과적으로, 목적 물질은 플로우-쓰루 통과액(정제 방법이 크로마토그래피 방법인 경우) 또는 상청액(정제 방법이 배치(batch) 방법인 경우) 내에 수득된다. 목적하지 않는 물질, 예컨대 용액 중에 또한 존재하는 응집된 형태의 면역글로불린은 정지 상에 결합하고, 이런 식으로 용액으로부터 제거된다. 이는 목적하지 않은 물질의 100%가 상기 용액으로부터 제거되는 것을 반드시 의미하지는 않지만, 목적하지 않은 물질이 본질적으로 100%, 즉 50% 이상, 75% 이상, 90% 이상 또는 95% 초과로 상기 용액으로부터 제거됨을 의미한다.
본원 내에서 사용된 "~에 적용하는" 및 이와 문법적으로 균등한 표현은 정제 방법의 일부 단계로서, 이는 정제되는 목적 물질을 함유하는 용액을 정지 상과 접촉시키는 것을 의미한다. 이는 a) 정지 상이 위치된 크로마토그래피 장치에 상기 용액을 첨가하거나, 또는 b) 정지 상이 상기 용액으로 첨가되는 것을 가리킨다. a)의 경우, 정제되는 목적 물질을 함유하는 용액은 정지 상을 통과하여, 정지 상과 용액 중의 물질 사이의 상호작용을 허용한다. 조건, 예컨대 pH, 전도율, 염 농도, 온도 및/또는 유속에 따라, 용액의 일부 물질은 정지 상에 결합되고, 따라서 용액으로부터 제거된다. 다른 물질은 용액 중에 남아 있다. 용액 중에 남아 있는 물질은 플로우-쓰루 통과액에서 나타날 수 있다. "플로우-쓰루 통과액"이라는 용어는 크로마토그래피 장치를 통과한 후 수득된 용액을 의미한다. 바람직하게는, 크로마토그래피 장치는 컬럼 또는 카세트이다. 하나의 실시양태에서, 크로마토그래피 단계는 컬럼 크로마토그래피, 즉 컬럼 내에 고체 상을 사용하는 크로마토그래피 단계이거나, 또는 카세트 크로마토그래피, 즉 카세트 내에 고체 상을 사용하는 크로마토그래피 단계이다. 바람직한 실시양태에서, 카세트 크로마토그래피는 카세트 내에 막을 사용한다. 정지 상에 결합되지 않은 목적 물질은, 하나의 실시양태에서 당업자에게 익숙한 방법, 예컨대 침전, 탈염, 한외여과, 투석여과, 냉동건조, 친화성 크로마토그래피, 또는 농축 용액을 수득하기 위한 용매 체적 감축법에 의해 플로우-쓰루 통과액으로부터 회수될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단량체 형태의 면역글로불린은 냉동건조, 한외여과 또는 용매 체적 감축법에 의해 플로우-쓰루 통과액으로부터 회수된다. b)의 경우, 정지 상은 정제되는 목적 물질을 함유하는 용액에 예컨대 분말로서 첨가되어, 정지 상과 용액 중의 물질 사이의 상호작용을 허용한다. 상호작용 후, 정지 상을 예컨대 여과에 의해 제거하고, 상기 정지 상에 결합되지 않은 목적 물질은 상청액에서 수득된다.
본원 내에서 사용된 "~에 결합하지 않은" 및 이와 문법적으로 균등한 표현은 목적 물질, 예컨대 면역글로불린이 정지 상 예컨대 이온 교환 물질과 접촉되는 경우에 용액 중에 남아 있는 것을 의미한다. 이는 목적 물질의 100%가 용액 중에 남아 있는 것을 반드시 의미하는 것은 아니며, 목적 물질이 본질적으로 100%, 즉 50% 이상, 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 초과하여 용액 중에 남아 있으며 정지 상에 결합하지 않는 것을 의미한다.
본원 내에서 사용된 "완충된"이라는 용어는 산성 또는 염기성 물질의 첨가 또는 방출에 의해 pH의 변화가 완충 물질에 의해 평탄화된(leveled) 용액을 의미한다. 완충 물질을 포함하는 용액은 "완충된 용액"이다. 이런 효과를 생성하는 임의의 완충 물질이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 완충 물질, 예컨대 인산 및 그의 염, 시트르산 또는 그의 염, 모폴린, 2-(N-모폴리노) 에탄설폰산 및 그의 염, 히스티딘 및 그의 염, 글리신 및 그의 염, 또는 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄(TRIS) 및 그의 염이 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 완충 물질은 인산 및/또는 그의 염, 시트르산 및/또는 그의 염, 또는 히스티딘 및/또는 그의 염이다. 임의적으로, 상기 완충된 용액은 추가의 염, 예컨대 염화나트륨, 나트륨 설페이트, 염화칼륨, 칼륨 설페이트, 나트륨 시트레이트 또는 칼륨 시트레이트를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 완충된 용액은 염화나트륨 또는 염화칼륨을 포함한다.
본원 내에서 사용된 "결합-및-용리(bind-and-elute) 모드"라는 용어는 정제 방법의 수행 모드를 의미하는 것으로서, 이때 정제되는 목적 물질을 함유하는 용액이 정지 상, 바람직하게는 고체 상에 접촉됨으로써, 목적 물질이 상기 정지 상에 결합한다. 결과적으로, 목적 물질은 정지 상에 보유되는 반면, 목적하지 않는 물질은 플로우-쓰루 통과액 또는 상청액과 함께 제거된다. 그 뒤로 목적 물질은 세정 단계 후에 임의적으로 제 2 단계에서 정지상으로부터 용리됨으로써, 용리 용액과 함께 상기 정지 상으로부터 회수된다.
응집된 형태의 면역글로불린으로부터의 단량체 형태의 면역글로불린의 분리에서, 일반적으로 결합-및-용리 모드에서 수행되는 양이온 교환 물질을 사용한 크로마토그래피 방법이 사용된다(예컨대 WO 2006/125599 호 참조). 이제, 플로우-쓰루 모드에서 수행되는 양이온 교환 물질이 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 함유하는 용액으로부터의 응집된 형태의 면역글로불린의 제거를 위해 사용될 수 있다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 면역글로불린의 정제에 이 방법을 사용하여, 단량체 형태의 면역글로불린 및 응집된 형태의 면역글로불린 모두의 혼합물을 함유하는 용액으로부터 신속하고 용이한 방식으로 응집된 형태의 면역글로불린을 제거할 수 있다.
따라서, 본 발명은,
a) 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 양이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계
를 포함하는, 면역글로불린의 정제 방법을 개시한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 용액으로부터 단량체 형태의 면역글로불린을 수득하는 방법으로서, 상기 방법은, 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 양이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 단계는 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계이다. 다른 실시양태에서, 상기 양이온 물질은 막 양이온 교환 물질이다.
본원 내에 사용된 "단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건"이라는 표현 및 그와 문법적으로 균등한 표현은, 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질과 접촉 시에 용액 중에 남아 있음을 의미한다. 이는 단량체 형태의 면역글로불린의 100%가 용액 중에 남아 있는 것을 반드시 의미하지는 않지만, 단량체 형태의 면역글로불린이 본질적으로 100%, 즉 50% 이상, 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 초과하여 용액 중에 남아 있으며 상기 양이온 교환 물질에 결합하지 않음을 의미한다. 이런 조건은 예컨대 하나의 실시양태에서 완충된 수용액의 pH가 pH 5 내지 pH 8이고/이거나, 다른 실시양태에서 완충된 수용액의 전도율이 1.0 mS/cm 내지 15 mS/cm, 바람직하게는 4.0 mS/cm 내지 10.0 mS/cm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 면역글로불린의 정제 방법은, 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 막 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 막 양이온 교환 물질에 적용하고, 막 양이온 교환 물질의 플로우-쓰루 통과액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계를 포함한다.
이 실시양태에서, 상기 정제 방법은 면역글로불린의 신속한 정제를 가능케 하는 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 방법이며, 그 이유는 단량체 형태의 목적 면역글로불린이 컬럼의 플로우-쓰루 통과액으로부터 용이하게 수득될 수 있어 예컨대 컬럼의 세정, 결합된 물질의 용리 또는 용리된 면역글로불린 용액의 탈염과 같은 추가 단계가 불필요하게 되기 때문이다.
본 발명에 따른 방법은 단일 단계 방법으로서 또는 다른 단계, 예컨대 하나의 실시양태에서 음이온 교환 크로마토그래피 단계 또는 또 다른 실시양태에서 친화성 크로마토그래피 단계와 함께 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 실시양태는,
b) 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적용하고, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 플로우-쓰루 통과액으로부터 완충된 수용액으로서 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계, 및
a) 상기 b) 단계에서 수득된 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 양이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계
를 순차로 포함하는, 면역글로불린의 정제 방법이다.
하나의 실시양태에서, 단계 b)는 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 방법이다. 다른 실시양태에서, 단계 a)는 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 방법이다. 다른 실시양태에서, 상기 단계 a)에서의 양이온 교환 물질은 막 양이온 교환 물질이다. 단계 b)에 대한 조건은 당업자에게 공지되어 있다. 단계 b)에서, 면역글로불린을 함유하는 용액에서의 숙주 세포 단백질(HCP), 단백질 A, 내독소 및/또는 바이러스의 양을 감소시킬 수 있다. 또한, 상기 두 가지 이온 교환 단계들의 순서를 바꿀 수도 있다. 정제 방법의 하나의 단계(또는 후속 단계)에 용액을 적용하기 전에, 파라미터, 예컨대 용액의 pH 값 또는 전도율은 조정되어야 한다. 하나의 실시양태에서, 단계 a)에 적용되는 수용액의 pH 값은 pH 4 내지 pH 8, 바람직하게는 pH 5 내지 pH 8이다. 다른 실시양태에서, 상기 수용액의 전도율은 4.0 mS/cm 내지 10.0 mS/cm이다.
또한, 하나의 실시양태에서 본 발명은,
a) 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 양이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계, 및
c) 상기 a) 단계에서 수득된 단량체 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적용하고, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 플로우-쓰루 통과액으로부터 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계
를 순차로 포함하는, 면역글로불린의 정제 방법을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 단계 c)는 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 방법이다. 다른 실시양태에서, 단계 a)는 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 방법이다. 다른 실시양태에서, 단계 a)에서의 양이온 교환 물질은 막 양이온 교환 물질이다. 친화성 크로마토그래피를 사용하여 예컨대 최초의 정제 단계에서 벌크한 숙주 세포 단백질 및 배양 부산물을 제거하는 것이 유익할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태는,
d) 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 친화성 컬럼에 결합하는 조건 하에, 친화성 컬럼에 적용하고, 상기 친화성 컬럼으로부터 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 완충된 수용액으로서 회수하는 단계, 및
b) 임의로, 상기 단계 d)에서 수득된 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적용하고, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 플로우-쓰루 통과액으로부터 완충된 수용액으로서 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계, 및
a) 상기 d) 단계 또는 단계 b)에서 수득된 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 양이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계
를 상기 순서로 포함하는, 면역글로불린의 정제 방법이다.
하나의 실시양태에서, 단계 b)는 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 방법이다. 다른 실시양태에서, 단계 a)는 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 방법이다. 다른 실시양태에서, 단계 d)는 결합-및-용리 모드로 수행된다. 다른 실시양태에서, 상기 양이온 교환 물질은 막 양이온 교환 물질이다. 친화성 컬럼은, 예컨대 단백질 A 친화성 컬럼, 단백질 G 친화성 컬럼, 소수성 전하 유도 크로마토그래피 컬럼(HCIC) 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼(HIC, 예컨대 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭(aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산)일 수 있다. 바람직하게는 상기 친화성 컬럼은 단백질 A 컬럼 또는 HCIC 컬럼이다.
추가 실시양태에서, 단계 b)에서 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액 및/또는 단계 c)에서 단량체 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액은 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하는 조건 하에 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적용되고, 상기 음이온 교환 물질로부터 완충된 수용액으로서 회수된다.
본 발명의 한 양태는,
a) 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 막 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 막 양이온 교환 물질의 플로우-쓰루 통과액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계
를 포함하는, 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 용액으로부터 단량체 형태의 면역글로불린을 수득하는 방법이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 단계 a) 이전에,
단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적용하고, 상기 음이온 교환 컬럼의 플로우-쓰루 통과액으로부터 완충된 수용액으로서 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 회수하는 것을 포함하는, 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 단계 a) 이후에,
c) 상기 a) 단계에서 수득된 단량체 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적용하고, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 플로우-쓰루 통과액으로부터 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 것을 포함하는, 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 단계 a) 또는 단계 b) 이전에,
d) 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 친화성 컬럼에 결합하는 조건 하에, 친화성 컬럼에 적용하고, 상기 친화성 컬럼으로부터 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 완충된 수용액으로서 회수하는 것을 포함하는, 결합-및-용리 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 플로우-쓰루 통과액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 것은 침전, 탈염, 한외여과, 투석여과, 냉동건조, 친화성 크로마토그래피, 또는 농축 용액을 수득하기 위한 용매 체적 감축법으로부터 선택된 방법에 의해 수행된다. 바람직하게는 상기 회수는 한외여과, 냉동건조 또는 용매 체적 감축법에 의한다.
하나의 실시양태에서, 상기 면역글로불린은 막 양이온 교환 물질의 플로우-쓰루 통과액으로부터 수득되고, 상기 면역글로불린의 95% 이상이 단량체 형태이다. 다른 실시양태에서, 단량체 형태의 면역글로불린의 90% 이상이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 완충된 수용액의 pH 값은 pH 5 내지 pH 8이다. 추가 실시양태에서, 상기 완충된 수용액의 전도율은 4.0 mS/cm 내지 10.0 mS/cm이다. 하나의 실시양태에서, 상기 완충된 용액은 인산 또는 그의 염, 시트르산 또는 그의 염 또는 히스티딘 또는 그의 염을 포함하는 용액이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 수용액은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
하나의 실시양태에서, 막 양이온 교환 물질은 설폰산 기 또는 카복시메틸 기로 개질된 폴리에터설폰계 막 또는 재생 셀룰로스계 막이다. 추가의 실시양태에서, 상기 크로마토그래피 단계는 컬럼 크로마토그래피 또는 카세트 크로마토그래피이다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 개시된다. 본 발명의 정신으로부터 벗어남이 없이 개시된 절차에 변형이 행해질 수 있음을 이해할 것이
도 1: 무스탕TM S 막을 사용한 mAb IL13 플로우-쓰루 모드 정제의 도면.
도 2: a) 샘플 물질 mAb IL13의 SEC(크기 제외 크로마토그램) 분석; b) 플로우-쓰루 통과액의 분획 2의 SEC 분석.
도 3: mAb IL13을 함유하는 샘플 물질의 사토바인드TM C 막 공정의 플로우-쓰루 통과액의 분획 2의 SEC 분석.
도 4: mAb Her2를 함유하는 샘플 물질의 사토바인드TM C 막 공정의 플로우-쓰루 통과액의 분획 4의 SEC 분석.
재료 및 방법:
컨디셔닝된 단백질 A 용리물:
항-(IL-13Rα1) 항체(이후 mAb IL13으로 칭함, 예컨대 WO 2006/072564 호 참조) 및 항-Her2 항체(이후 mAb Her2으로 칭함, 예컨대 US 5,677,171 호 참조)를 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 제 1 단계로 정제하였다.
mAb IL13을 산성 조건(3.5 mM 염산, 2.7 ± 0.2의 pH 값) 하에 단백질 A 컬럼에서 용리하였다. 여과 단계 전에, 면역글로불린을 함유하는 분획의 pH 값을, 농축된 예컨대 pH 9.0의 1M 완충 용액(예: 트리스 (하이드록시메틸) 아미노메탄(TRIS) 또는 포스페이트 완충액)으로 pH 5.0으로 조정하였다. 이 물질을 이후에 mAb IL13의 컨디셔닝된 단백질 A 용리물로 칭한다.
mAb Her2를, 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 제 1 단계에서 정제하였다. 단백질 A 컬럼에서의 용리는 산성 조건(10 mM 나트륨 시트레이트 완충액, 3.0 ± 0.5의 pH 값) 하에 실시된다. 여과 단계 이전에, 면역글로불린을 함유하는 분획의 pH 값을, 농축된 트리스 (하이드록시메틸) 아미노메탄(TRIS) 완충액을 사용하여 pH 5.6으로 조정한다. 이 물질을 이후 mAb Her2의 컨디셔닝된 단백질 A 용리물로 칭한다.
분석 방법:
크기 배제 크로마토그래피:
수지: TSK 3000(토소하스(Tosohaas))
컬럼: 300 x 7.8 mm
유속: 0.5 ml/분
완충액: 250 mM 염화칼륨을 함유하는 200 nM 칼륨 포스페이트, pH 7.0으로 조정됨.
파장: 280 nm
DNA-역치-계(threshold-system): 예컨대 문헌[Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403] 참조.
단백질 A ELISA: 마이크로 타이터(titer) 플레이트의 웰은 병아리로부터 유래된 다클론성 항-단백질 A-IgG로 코팅된다. 결합 후에 비반응된 항체를, 샘플 완 충액으로써 세정함에 의해 제거한다. 단백질 A 결합을 위해, 규정된 체적의 샘플이 상기 웰에 첨가된다. 샘플에 존재하는 단백질 A는 병아리 항체에 의해 결합되고, 플레이트의 웰에 남는다. 배양 후, 샘플 용액을 제거하고, 웰을 세정한다. 검출을 위해, 이어서 병아리 유래 다클론성 항-단백질 A-IgG-바이오틴 접합체 및 스트렙트아비딘 퍼옥시다제 접합체를 첨가한다. 추가 세정 단계 후에, 기질 용액을 첨가하여 착색된 반응 생성물을 형성한다. 색상의 강도는 샘플의 단백질 A 함량에 비례한다. 규정된 시간 후에 반응을 중단시키고, 흡광율을 측정한다.
숙주 세포 단백질(HCP) ELISA: 마이크로 타이터 플레이트의 웰의 벽을 혈청 알부민 및 스트렙트아비딘의 혼합물로 코팅한다. HCP에 대한 염소 유래 다클론성 항체는 마이크로 타이터 플레이트의 웰의 벽에 결합된다. 세정 단계 후에, 마이크로 타이터 플레이트의 다양한 웰들을, 상이한 농도 및 샘플 용액의 HCP 보정 서열과 함께 배양하였다. 배양 후에, 완충 용액으로 세정함에 의해 결합되지 않은 샘플 물질을 제거한다. 검출을 위해, 웰을 항체 퍼옥시다제 접합체와 함께 배양하여 결합된 숙주 세포 단백질을 검출한다. ABTS와 함께 배양시키고 405 nm에서 검출함에 의해 고정된 퍼옥시다제 활성도를 검출한다.
실시예 1
단량체 형태로의 mAb IL13의 정제 - 조건의 비교
단량체 형태로의 mAb IL13의 정제에서 다양한 조건들이 평가되었다.
정제 방법은 플로우-쓰루 모드의 크로마토그래피 정제 방법으로서 수행된다. mAb IL13의 플로우-쓰루 정제에 대한 다양한 조건들이 평가되었다. 막 양이온 교환 물질로서 무스탕TM S-흡착제 시스템(무스탕TM S 코인, 1.5 cm2 막 면적, 미국의 폴 코포레이션)이 사용되었다.
컨디셔닝된 단백질 A 용리물은 90.9%의 단량체 형태의 면역글로불린 및 9.1%의 응집된 형태의 면역글로불린과 함께 7.1 g/l의 농도의 mAb IL13을 가졌다. 컨디셔닝된 단백질 A 용리물은 실험 전에 바이러스 비활성화되고, 0.2 ㎛ 공극 필터를 통해 여과되었다. 상응하는 완충액을 사용하여 약 1 mg/ml의 단백질 농도로 희석(약 1:7(v/v)의 비), pH 및 전도율 조정한 후에, 그 용액을 막 양이온 교환 물질에 적용하였다. 필요한 경우, pH 조정을, 칼륨 하이드로젠 포스페이트 또는 칼륨 다이하이드로젠포스페이트를 사용하여 수행하고, 전도율 조정은 KCl 또는 탈이온수를 첨가함으로써 수행하였다(각각 약 5.5 및 7.5의 pH로). 이런 희석, 조정 및 컨디셔닝된 단백질 A 용리물을 이후 샘플 물질로 칭한다.
다양화된 파라미터는 전도율 및 pH였다. 관찰된 파라미터는 샘플 물질 중의 단량체 형태의 플로우-쓰루 면역글로불린의 수율 및 순도였다. 샘플 물질의 다양화된 파라미터는 표 1에 요약되어 있다.
Figure 112009081557155-PCT00001
단량체 형태의 면역글로불린 및 응집된 형태의 면역글로불린의 양을 결정하기 위해 플로우-쓰루 통과액을 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 크로마토그래피 시스템의 데드(dead) 체적에 의해 지속적인 유동이 존재하지 않으므로써 미지 희석률의 제 1 분획이 생성되기 때문에 공정의 초기(제 1 분획)에는 안정하지 못한 정제 공정이 수행되기 때문에, 분석용으로 제 2 분획을 선택하였다. 예시적 플로우-쓰루도가 도 1에 도시되어 있다. 결과는 표 2에 요약되어 있다. 샘플 물질 및 분획 2(pH 6.5, 5.8 mS/cm)의 크기 배제 크로마토그램이 도 2a) 및 2b)에 도시되어 있다.
Figure 112009081557155-PCT00002
표 2에 제공된 데이터는 mAb IL13의 정제, 즉 응집된 형태로부터 단량체 형태의 면역글로불린의 분리에 적합한 조건, 즉 단량체 형태의 면역글로불린이 막 양이온 교환 물질에 결합되지 않는 조건을 보여 주며, 예컨대 5.8 mS/cm의 전도율 및 6.5의 pH로 조정되는 경우에 우수한 수율이 수득될 수 있다.
실시예 2
단량체 형태로의 mAb IL13의 정제- 막의 비교
실시예 1에서 수득된 결과는 일반적으로 적용가능하고, 막 양이온 교환 물질 사토바인드TM S(75 cm2 막 면적, 독일 쾨팅엔 소재의 사토리우스 AG)에 적용하였다. 무스탕TM S에 바람직한 조건, 즉 5.8 mS/cm의 전도율 및 6.5의 pH를 또한 상기 사토바인드TM 물질에 적용하였다. mAb IL13을 함유하는 샘플 물질은 94.8%의 단량체 형태의 면역글로불린 및 5.2%의 응집된 형태의 면역글로불린과 함께 1.34 mg/ml의 단백질 농도를 가졌다. 샘플 물질은 실시예 1에 기재된 바와 같이 막에 적용되었다. 정제 공정의 결과는 표 3에 요약되어 있다.
Figure 112009081557155-PCT00003
또한 동일한 샘플 물질을 사토바인드TM C 막에도 적용하였다. 그 결과는 표 4에 제공되고, 제 3 분획의 예시적 크기 배제 크로마토그램이 도 3에 도시되어 있다.
Figure 112009081557155-PCT00004
모든 실험에서 하나의 막 물질에 의해 결정된 정제 조건을 사용함에 의해, 시험되는 모든 양이온 막 흡착제는 동일 조건에 의한 플로우-쓰루 모드 수행에서 응집체를 제거하고 단량체 IgG를 수득하는 능력을 가질 것이다.
실시예 3
단량체 형태로의 mAb Her2의 정제- 막의 비교
컨디셔닝된 단백질 A 용리물은 98.8% 순도와 함께 7.61 g/l의 mAb Her2 농도를 가졌다. 응집된 형태의 면역글로불린은, 3일 동안 37℃로 mAb Her2 용액을 가열함에 의해 제조/수득되었다. 열 처리 후 그 용액은, 열처리된 샘플 중에 존재하는 저분자량 물질은 고려함이 없이, 99.0%의 단량체 형태의 면역글로불린 및 1.0%의 응집된 형태의 면역글로불린을 함유하였다. 컨디셔닝된 단백질 A 용리물은 실험 전에 바이러스 비활성화되고, 0.2 ㎛ 공극 필터를 통해 여과되었다. 1.03 mg/ml의 단백질 농도로 희석, pH 및 전도율 조정한 후에, 그 용액을 막 양이온 교환 물질 사토바인드TM S 및 C에 각각 적용하였다. 전도율 조정은 NaCl(5 mol/l)을 첨가함으로써 수행하였다. 그 결과는 표 5 및 6에 기재되어 있다.
Figure 112009081557155-PCT00005
Figure 112009081557155-PCT00006
사토바인드TM C 막의 플로우-쓰루 통과액의 분획 4의 예시적 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석은 도 4에 도시되어 있다.
이로부터, pH 값 및 전도율(mS/cm)의 합은 바람직하게는 9 내지 18, 보다 바람직하게는 10 내지 15 범위에 있다는 것으로 요약할 수 있다.
실시예 4
단백질 A, DNA 및 HCP 함량의 분석.
실시예 2에서 수득된 분획을 단백질 A-, DNA- 및 HCP-함량에 대해 분석하였다. 그 결과는 표 7 및 8에 기재되어 있다.
사토바인드TM S 막에 적용하기 이전의 용액 중 단백질 A-함량은 2.6 ng/ml이었고, DNA-함량은 0.3 pg/mg 미만이었고, 숙주 세포 단백질(HCP)-함량은 1791 ng/mg였다.
Figure 112009081557155-PCT00007
사토바인드TM C 막에 적용하기 이전의 용액 중 단백질 A-함량은 3.0 ng/ml이었고, DNA-함량은 0.4 pg/mg 미만이었고, 숙주 세포 단백질(HCP)-함량은 5250 ng/mg였다.
Figure 112009081557155-PCT00008

Claims (23)

  1. 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 용액으로부터 단량체 형태의 면역글로불린을 수득하는 방법으로서,
    상기 방법이,
    a) 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 양이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 단계 a)가, 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 단량체 형태의 면역글로불린이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 양이온 교환 물질에 적용하고, 상기 양이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 것을 포함하는, 플로우-쓰루(flow-through) 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법이, 상기 단계 a) 이전에,
    b) 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 음이온 교환 물질에 적용하고, 상기 음이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 단계 b)가, 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 음이온 교환 물질에 적용하고, 상기 음이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 회수하는 것을 포함하는, 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이, 상기 단계 a) 후에,
    c) 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 음이온 교환 물질에 적용하고, 상기 음이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 단계 c)가, 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 음이온 교환 물질에 결합하지 않는 조건 하에, 음이온 교환 물질에 적용하고, 상기 음이온 교환 물질과의 접촉 후에 상기 용액으로부터 상기 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 것을 포함하는, 플로우-쓰루 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이, 상기 단계 a) 이전에 또는 상기 단계 b) 이전에,
    d) 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 친화성 컬럼에 결합하는 조건 하에, 친화성 컬럼에 적용하고, 상기 친화성 컬럼으로부터 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 회수하는 추가 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 단계 d)가, 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 포함하는 완 충된 수용액을, 상기 면역글로불린이 친화성 컬럼에 결합하는 조건 하에, 친화성 컬럼에 적용하고, 상기 친화성 컬럼으로부터 상기 단량체 형태 및 응집된 형태의 면역글로불린을 회수하는 것을 포함하는, 결합-및-용리(bind-and-elute) 모드로 수행되는 크로마토그래피 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a)에서 양이온 교환 물질이 막(membrane) 양이온 교환 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 막 양이온 교환 물질이 무스탕(Mustang)TM S, 무스탕TM C, 또는 사토바인드(Sartobind)TM S 또는 사토바인드TM C인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 막 양이온 교환 물질이 설폰산 기 또는 카복시메틸 기로 개질된 폴리에터설폰계 막 또는 재생 셀룰로스계 막인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a)의 완충된 수용액이 pH 5 내지 pH 8의 pH 값을 갖는 것을 특징으로 하 는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a)의 완충된 수용액이 1.0 내지 15.0 mS/cm의 전도율을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 단계 a)의 완충된 수용액이 4.0 내지 10.0 mS/cm의 전도율을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 플로우-쓰루 통과액으로부터 단량체 형태의 면역글로불린을 회수하는 것이, 침전, 탈염, 한외여과, 투석여과, 냉동건조, 친화성 크로마토그래피, 또는 농축 용액을 수득하기 위한 용매 체적 감축법으로부터 선택된 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 회수가 한외여과, 냉동건조 또는 용매 체적 감축법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막 양이온 교환 물질의 플로우-쓰루 통과액으로부터 수득된 면역글로불린 중 95% 이상의 면역글로불린이 단량체 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단량체 형태의 면역글로불린의 90% 이상이 양이온 교환 물질에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충된 수용액이, 인산 또는 그의 염, 시트르산 또는 그의 염 또는 히스티딘 또는 그의 염을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충된 수용액이 염화나트륨 또는 염화칼륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 크로마토그래피 단계가 컬럼 크로마토그래피 또는 카세트 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a)에서의 완충된 수용액의 pH 값 및 mS/cm 단위의 전도율의 합이 9 내지 18 범위에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 합이 10 내지 15 범위에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
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