JPS6253147B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血球を溶解し、得た溶液から所望の酵
素を単離することによつて血液から酵素を回収す
る方法に関する。 得ることができる酵素のうちには特にCu、Zn
−スーパーオキサイドデイスムターゼ（SOD）
およびカタラーゼがあるが、またたとえば炭酸ア
ンヒドラーゼも回収することができる。 デンマーク特許第132864号明細書は哺乳動物血
液、特に牛血液からSODを回収する方法を開示
する。その方法はデカンテーシヨンもしくは遠心
分離により血漿を除去した血球を、任意には少量
の界面活性剤を含む冷イオン除去水により溶解
し、そしてエタノールのような水混合性有機溶媒
の存在下にクロロホルムのようなハロゲン化有機
溶媒により、もしくは５℃以下の温度で硫酸アン
モニウムにより溶血物を沈澱させる工程より成
る。沈澱は１回もしくは数回イオン除去水で洗滌
し、合せた上澄液は熱不安定性たん白、特にカル
ボン酸アンヒドラーゼを変性させるために0.69〜
0.80Åの原子半径を有する２価金属イオンを含む
緩衝溶液の存在下に60〜65℃に加熱した。室温以
下に急速冷却後沈澱たん白は過および遠心分離
により除去し、SOD含有溶液はイオン交換クロ
マトグラフイ、分取電気泳動および／もしくはゲ
ル過により精製した。その方法は充填赤血球を
規準にして約0.01％（重量／容量）のSODの収量
を供することを報告する。 その方法における加熱工程をK₂HPO₄およびア
セトンによる分別に置き換え、その後分別可溶性
たん白の活性部分をPH7.4でジエチルアミノエチ
ルセルロース（DEAEセルロース）上でクロマト
グラフして、充填ウシ血球から本SOD活性の60
％に相当する3300ユニツト／mgの活性を有する
0.006％（重量／容積）のSODの収量を得た。 しかし、その多工程方法は、一部はその方法を
複雑化する多工程のために、一部は多量の有機溶
媒および任意にはK₂HPO₄を使用する必要がある
ために商業規模では有用ではない。 デンマーク特許第133246号明細書によればヘモ
グロビンの沈澱をクロロホルムおよび／もしくは
エタノールで除き、(a)溶血物を約６のPH値および
約0.01M以下のイオン強度に調整してカルボン酸
アンヒドラーゼを除去するためにK₂HPO₄および
アセトンにより分別し、その溶液を弱い塩基性基
を有するイオン交換樹脂、好ましくはDEAEセル
ロースのカラムを通して樹脂上にSODを吸着さ
せ、(b)同じPHおよびイオン強度の緩衝塩溶液によ
りカラムを洗滌してヘモグロビンを除去し、そし
て(c)5.7〜6.3のPH値および約0.02M以下から約
0.03M以上に徐々に、もしくは一歩づつの勾配で
増加するイオン強度を有する水性媒体で吸着
SODをカラムから溶離させ、SODはA₂₆₅〜A₂₈₀の
吸着値の比が最高に達する最初のイオン強度に始
まり、CuおよびZn含有およびA₂₆₅〜A₂₈₀比が同
時に減少する最初のイオン強度に終る溶離物のフ
ラクシヨンから溶離することが試みられた。この
方法は0.01〜0.013％（重量／容積）の充填赤血
球から2500ユニツト／mgもしくは溶血物の初めの
全SOD活性のほとんど75％と同じ活性を有する
SODの収量を得ることが報告される。しかし、
この方法は大量の液のクロマトグラフイより成
り、相当する大量のクロマトグラフイカラムを必
要とするので商業規模では有用ではない。更にク
ロマトグラフイされる98.8％より多いたん白はカ
ラムの寿命およびクロマトグラフイ速度を減少さ
せ、望ましくないたん白である。 デンマーク特許第139914号明細書ではクロロホ
ルム／エタノールによるヘモグロビンの沈澱およ
びカルボン酸アンヒドラーゼを除去するための
K₂HPO₄およびアセトンによる分別は、PH５〜８
の溶血物を60〜80℃の温度に加熱し、ヘモグロビ
ンと共にカルボン酸アンヒドラーゼおよび他の熱
不安定性たん白を沈澱させる単一加熱工程により
置換され、そして次に混合物を冷却し、沈澱たん
白を分離し、SODはたとえばアセトンによる沈
澱、もしくは好ましくは上記方法と同一条件で
DEAEセルロース上でイオン交換クロマトグラフ
イによる上澄液から単離される。これは勿論工程
を簡畧化する。しかし、それでも尚満足できな
い。何故ならばSODのロスが加熱工程で起こる
からである。その特許は加熱沈澱後40〜50回の精
製および出発血液に含まれるものの70〜90％の
SODの収量を報告する。 BriggsおよびFee（Biochem.et Bio hys.
Acta537、1978、86〜99頁）はヘモグロビンおよ
び熱不安定性たん白の沈澱を、最初にPH６でカル
ボキシメチルセルロース（CMセルロース）によ
り、次に約中性までのPHの調整下に混合ベツドイ
オン交換器による溶血物のバツチ処理で置換す
る。生成混合物はDEAEセルロースで処理し、そ
れをカラムに移し、最初に大量の２ｍＭリン酸ソ
ーダ緩衝液で洗滌し、次に0.1Mリン酸ソーダ緩
衝液で溶離しそして活性フラクシヨンを集めた。
これらを組み合せ再度混合ベツドイオン交換剤お
よびCMセルロースでそれぞれバツチ処理して更
に随伴たん白を除去する。SOD含有溶液は再び
DEAEセルロースカラムに適用し、２〜100ｍＭ
のリン酸ソーダ緩衝液の直線勾配で溶離し、そし
て活性フラクシヨンを集め、限外過により濃縮
し、「Biogel Ｐ−100」上でゲル過した。クロ
マトグラフイおよびゲル過は反復し、純粋標品
を得た。 この方法は多工程により非常に複雑であり、且
過剰に大量のイオン交換剤が、たとえば、最初の
精製工程で２の溶血物に対し2.5KgのCMセルロ
ースおよび0.5Kgの混合ベツドイオン交換剤が使
用されるので商業規模で使用するには総じて不適
である。更に、この方法におけるSODの収量は
理論的収量の僅か21％であり、CMセルロース精
製工程において既に全SOD活性の約25％のロス
がある。それは同時係属出願デンマーク特許第第
1687／80号明細書に記載の発明がすなわちカルボ
キシメチルセルロースは4.7〜5.5のPHで完全に
SODを吸着することができることに基づく最近
の発見に微して不思議ではない。 今日まで血液からSODの回収に実際に使用さ
れた唯一の方法は、溶血物をクロロホルム／エタ
ノールで沈澱させ、上澄はK₂HPO₄およびアセト
ンで分別し、次いでDEAEセルロース上で活性部
分をクロマトグラフする上記のものである。これ
は一般に約100mg１の理論的収量に対し充填血
球１につき約40mgの純SODを収得させる。 本発明によれば血球を溶血し、全SOD活性お
よび他の所望酵素、特にカタラーゼおよびカルボ
ン酸アンヒドラーゼの活性を保有させながら１工
程でヘモグロビンを沈澱させることができること
がわかつた。その結果それらの酵素は商業規模で
それ自体を使用できる方法で回収することができ
る。 これは全部もしくは一部単離した血球を、２〜
４炭素原子を有するアルカノール、好ましくはエ
タノールと10〜70容量％の濃度まで混合し、血球
の溶血およびヘモグロビンを変性させるために放
置し、次に少なくとも約２倍容まで水を加え、サ
スペンジヨンから血球残留物、ヘモグロビンおよ
び他の変性たん白の沈澱を除去し、最後に得た溶
液から所望の酵素を単離することを特徴とする発
明方法により達成される。 本方法は全部もしくは一部単離した血球、たと
えば放置し大部分の血漿をデカンテーシヨンによ
り除いた血液を、等しい大量の96％エタノールと
烈しく撹拌しながら混合することによりもつとも
実用的に行なわれる。約１時間撹拌しながら放置
してサスペンジヨンはイオン除去水で２倍容に稀
釈し、30〜60分間撹拌を継続する。次にサスペン
ジヨンは遠心分離し、ヘモグロビンおよび血球残
留物のケーキを少量の水で洗滌する。すなわち
SOD、カタラーゼおよびカルボン酸アンヒドラ
ーゼを含む透明赤色溶液が生成する。 カルボン酸アンヒドラーゼはこの溶液から特定
的にカルボン酸アンヒドラーゼを吸着し、他の所
望酵素を吸着しない樹脂上で親和クロマトグラフ
イにより容易に単離することができる。このよう
な樹脂の例はグリシル−チロシン−アゾベンゼン
スルホンアミド基で置換した架橋結合アガロース
「Sepharose」（商標）である。樹脂の洗滌により
カルボン酸アンヒドラーゼはJ.T.Johansen
（Carsberg Research Commu−nications
Vol.41、73〜81、1976）の記載のようにチオシア
ン酸カリ水溶液で溶離することができる。 カルボン酸アンヒドラーゼが除去された溶液は
尚SODおよびカタラーゼを含む。本発明によれ
ばデンマーク特許出願第1687／80号明細書に特許
請求される水性溶液からSODを単離する方法
は、使用PH範囲でSODと同じ極性を有するカチ
オン交換剤上でPH4.7〜5.5のその溶液をクロマト
グラフイすることにより単一工程で溶液から
SODおよびカタラーゼの両者を単離するために
使用できることがわかつた。SODおよびカタラ
ーゼは4.7〜7.5の範囲のPHおよび0.01〜1.0Mの範
囲のイオン強度を有する緩衝溶液により樹脂から
もつとも良く溶離される。SODは最低PHおよ
び／もしくは最低イオン強度で溶離される。これ
らの範囲におけるPH勾配および／もしくはイオン
強度勾配は既知方法で使用することができ、その
結果SODが最初に単離される。好ましくはSOD
は4.7〜5.5のPHおよび0.02〜0.2Mのイオン強度を
有する緩衝溶液により最初に溶離され、次にカタ
ラーゼは6.5〜7.5のPHおよび0.1〜1.0Mのイオン
強度を有する緩衝溶液で溶離される。次にSOD
およびカタラーゼ含有フラクシヨンは別々に既知
方法で更に精製することができる。 上記クロマトグラフイにおける有用なカチオン
交換樹脂の例は、「CM−23」および「CM−52」
の各称で英国whatman Ltd.が、および「CM−
Sephacel」（商標）の名称でスエーデンの
Pharmacia Fine Chemicals ABが市販するよう
なカルボキシメチルセルロース、「CM
Sephadex」（商標）の名称でPharmacia Fine
Chemicals ABが市販するようなカルボキシメチ
ル基で置換した架橋結合デキストラン、「SP−
Sephadex」の名称でPharmacia Fine Chemicals
ABが市販するスルホプロピル基で置換した架橋
結合デキストランおよび「CM−Sepharose（商
標）CL 6B」の名称でPharmacia Fine
Chemicals ABが市販するようなカルボキシメチ
ル基で置換した架橋結合アガロースを挙げること
ができる。 溶離後カラムは塩基、水、酸および水を流し、
その後所望の緩衝液で平衡化することにより再生
することができる。 カチオンイオン交換樹脂上の溶液のクロマトグ
ラフイは任意にはイオン交換粒子を溶液中に撹拌
することによつてバツチ式で行なうことができ
る。しかし、大規模での作業がより容易であり、
すべての酵素がイオン交換剤上に吸着されること
を保証するカラム処理として行なうことがもつと
も有利である。 得た２溶液をそれ以上精製する前に、この段階
で限外過することによりその両者を濃縮するこ
とが有利であることがわかつた。 適当には、次にSODは低イオン強度のリン酸
塩緩衝液を使用し透析過し低分子不純物を除去
することができる。 SOD溶液の最後の精製は適当にはDEAEセルロ
ース上のクロマトグラフイにより行なうことがで
きる。これにより透明溶液を得、任意には凍結乾
燥することにより精製SODを固形で単離するこ
とができる。 上記の方法で本発明方法を使用し理論的に可能
な約100mg／の約60％に相当する充填血球１
につき約60mgの完全に純粋のSODの収量を供す
るであろうことがわかつた。 カタラーゼ溶液は適当には硫酸アンモニウムに
よる分別沈澱により精製することができる。 本発明方法は次例で更に十分に例示されるであ
ろう。 例 ヘモグロビンの溶血と沈澱 約２の血漿を尚含み、約５の充填血球が相
当するデカントした７の血液を烈しく撹拌しな
がら７の96％エタノールと混合した。１時間後
15のイオン除去水を添加し、そして30分間撹拌
を続けた。 サスペンジヨンは約2000pmのMSEバスケツト
遠心分離機で遠心分離し、ヘモグロビンのケーキ
は遠心機を空にする前に２の水で洗滌した29.5
の上澄液を得た。 カルボン酸アンヒドラーゼの単離 上澄液はカルボン酸アンヒドラーゼを特異的に
吸着するが、SODおよびカタラーゼを吸着しな
い親和マトリツクス「Sepharose」−グリシル−
チロシン−アゾベンゼンスルホンアミドの10×12
cmカラムに適用した。親和マトリツクスの洗滌
後、カルボン酸アンヒドラーゼは0.05M「トリ
ス」サルフエートを含み、6.5のPHを有する0.2M
チオシアン酸カリ水溶液で溶離した。 SODおよびカタラーゼの単離 SODおよびカタラーゼを含む溶液は1M酢酸で
PH4.5に調整し、20ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液でPH4.8
に平衡化した２の「CM−23」を詰めた20cm直
径カラムを通した。流速は約15／時間であつ
た。次にイオン交換剤はPH4.8の20ｍＭ酢酸ソー
ダ緩衝液15で洗滌した。 カラムは1.5／時間の流速でPH4.8の３の
100ｍＭおよび３の200ｍＭ酢酸ソーダの直線状
勾配で溶離した。SODは約150ｍＭ酢酸ソーダで
溶離した。 カタラーゼはPH7.0の0.1Mリン酸ソーダ緩衝液
で溶離した。 フラクシヨンを含むSODおよびカタラーゼは
別別にプールし、「DDS MF cell」中の「DDS
600」膜（両者ともDe danske Sukkerfabriker
Ａ／Ｓから市販）上で限外過した。 SODの精製 SOD溶液はPH7.5の10ｍＭリン酸ソーダ緩衝液
を使用し透析過し、更に10ｍＭリン酸ソーダ緩
衝液のPH7.5に平衡化した「DE−52」カラム（５
×８cm）上でクロマトグラフして精製した。カラ
ムは０→0.125M NaClを含むPH7.5の10ｍＭリン
酸ソーダ緩衝液２×600ｍの直線状勾配で展開し
た。流速は110ml／時間で、10mlのフラクシヨン
を集めた。SOD含有フラクシヨンはプールし
た。比活性および吸収スペクトルは酵素が純粋で
あることを示した。 カタラーゼの精製 限外過からのカタラーゼ溶液は（NH₄）₂SO₄
分別により精製した。 「CM−23」カラムの再生 カタラーゼの溶離後３の0.5M NaOH溶液を
カラムを通し次いで３の水を通した。次に３
の0.5M Hclをカラムを通し、次いで３の水を
通し、そしてPH4.8の３の0.2M酢酸ソーダが衝
液を通した。 次にカラムは溶離物の伝導度およびPHが緩衝液
のものと同じになるまで、PH4.8の20ｍＭ酢酸ソ
ーダ緩衝液で処理した。カラムは再使用の用意が
できた。 結 果 行なつた精製工程およびSOD、カタラーゼお
よびカルボン酸アンヒドラーゼの収量の調査は次
表に示す。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血液細胞を分離し、得た溶液から所望の酵素
   を単離することによる血液から酵素を回収する方
   法において、全部もしくは一部単離した血液細胞
   を２〜４炭素原子を有するアルカナール、好まし
   くはエタノールと、10〜70容量％の濃度まで混合
   し、血球の溶血およびヘモグロビンを変性させる
   ために放置し、次に少なくとも約２倍容まで水を
   添加し、血球残留物、ヘモグロビンおよび他の変
   性たん白の沈澱をサスペンジヨンから除去し、そ
   して最後に得た溶液から所望の酵素を単離するこ
   とを特徴とする、上記方法。 ２ 溶液から１種もしくはそれ以上の酵素Cu、
   Zn−スーパーオキサイドデイスムターゼ
   （SOD）、カタラーゼおよびカルボン酸アンヒド
   ラーゼを単離することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３ SODおよびカタラーゼはPH4.7〜5.5でその溶
   液を使用PH範囲でSODと同じ極性のカチオン交
   換樹脂上でクロマトグラフし、SODおよびカタ
   ラーゼを4.7〜5.5の範囲のPHおよび0.01〜0.1Mの
   範囲のイオン強度を有する緩衝溶液により樹脂か
   ら溶離し、SODは最低PHおよび／もしくは最低
   イオン強度で溶離することを特徴とする特許請求
   の範囲第１項および第２項記載の方法。 ４ SODを4.7〜5.5のPHおよび0.02〜0.2Mのイオ
   ン強度を有する緩衝溶液によりカチオン交換樹脂
   から溶離し、そして6.5〜7.5のPHおよび0.1〜
   1.0Mのイオン強度を有する緩衝溶液によりカタ
   ラーゼを溶離することを特徴とする特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 ５ カチオン交換樹脂としてカルボキシメチルセ
   ルロース、もしくはカルボキシメチル基もしくは
   スルホプロピル基で置換した架橋結合デキストラ
   ン、もしくはカルボキシメチル基で置換した架橋
   結合アガロースを使用することを特徴とする特許
   請求の範囲第３項もしくは第４項記載の方法。