JPH01235588A

JPH01235588A - 赤血球由来Ｃｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼを製造する方法

Info

Publication number: JPH01235588A
Application number: JP5952588A
Authority: JP
Inventors: Sadami Sekiguchi; 定美関口; Keizo Ito; 敬三伊藤; Kiyoshi Fukui; 福井　喜代志; Masayuki Watanabe; 正幸渡辺
Original assignee: NIPPON SEKIJIYUUJISHIYA; Ube Industries Ltd
Current assignee: NIPPON SEKIJIYUUJISHIYA; Ube Corp
Priority date: 1988-03-15
Filing date: 1988-03-15
Publication date: 1989-09-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、溶血液から赤血球由来Ｃｕ　、　Ｚｎ型スー
パーオキシドジスムターゼ（以下、単にＳＯＤという）
及びカタラーゼを製造する方法に関する。さらに詳しく
は、溶血液を陰イオン交換体で処理することによって、
ＳＯＤ及びカタラーゼを共に回収する方法に関する。

（従来技術と発明が解決しようとする課題）ＳＯＤは、
下式に示す不均化反応によりスーパーオキシドを消失さ
せる作用を有する酵素であ２０ｉ＋２Ｈ”−−→０□＋
Ｈ２Ｏ２カタラーゼは、下式に示す反応により、ＳＯＤの作用に
よってスーパーオキシドから変換・生成された過酸化水
素を無害な水と酸素に分解する酵２Ｈ２０，２Ｈ２０＋
０２したがって、ＳＯＤ及びカタラーゼは、生体内で酸素分
子から発生したスーパーオキシドあるいはそれから生成
する過酸化水素などの活性酸素に起因する、組織障害、
例えば、炎症、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、未熟
児酸素網膜症、白内障、アドリアマイシンなどの制癌剤
の副作用、虚血部分への血流再開に伴う障害などに対す
る有効な治療剤として注目されている。溶血液からのＳ
ＯＤ及びカタラーゼの製造方法は、例えば、ジャーナル
・オブ拳バイオロジカル・ケミストリ　　、　Ｊこ−２
１−３２　　　（１１）　　　、４２９９　　　（１９
６５）　　　；　　　アチーブズーオブ拳バイオケミス
トリー拳アンド・バイオフィジクス、上５０，６０６　
（１９７２）；ジャーナル・オブφバイオロジカル・ケ
ミストリー、２４７　（２１）、７０４３　（１９７２
）に開示されている。しかしながら、これらの方法は高
純度のＳＯＤ及びカタラーゼを効率よく回収・取得する
ことができず、工業生産に適したものとは言い難い。

赤血球中の蛋白質の９６％はヘモグロビンであり、赤血
球からＳＯＤ及びカタラーゼを精製するためにはＳＯＤ
及びカタラーゼの回収率を低下させることなくヘモグロ
ビンを除去することが重要である。ヘモグロビンの除去
法として土橋法［ビオヘミシェ・ツァイトシュリフト、
上４０．６３（１９２３）］が知られているが、この方
法を用いた場合、ヒト赤血球からのＳＯＤは種々の異性
体の生成となり、純度よ＜ＳＯＤが得られないことが示
されており、この問題を解決するために溶血液を陰イオ
ン交換体で処理する方法が開示されている［ジャーナル
◆オブφバイオロジカル・ケミストリー、ｌ土７　（２
１）、７０４３（１９７２）］、また、溶血液からカタ
ラーゼを回収する方法として、陰イオン交換体で処理す
る方法が開示されている［アチーブズφオブ・バイオケ
ミストリー・アンド・バイオフィジクス。

１５０．６０６　（１９７２）；ヨーロピアン会ジャー
ナル・オブ拳バイオケミストリー、上」。

４９　（１９６９）、ジャーナル金オブ・バイオロジカ
ルｅケミストリー、２±０（１１）。

４２９９　（１９６５）］、Ｌかしながら、これらの方
法では、樹脂の目詰りが生じ、処理に時間を要し、有効
にヘモグロビンを除去することができないという問題が
あるほか、原料赤血球の保存期間が延びるにつれ、カタ
ラーゼの回収率が低下（４°Ｃ１３０日保存で回収率が
１１５〜１／４に減少）し、ＳＯＤ及びカタラーゼを共
に効率よく回収することができないという問題がある。

また、これらの陰イオン交換体処理において、有機アミ
ン系緩衝液を使用すると、得られたＳＯＤ及びカタラー
ゼを共に含む画分からカタラーゼを分離精製する際、硫
安分画、ゲル口過、陰イオン交換クロマトグラフィー、
陽イオン交換クロマトグラフィー、メタルキレーティン
グアフィニティクロマトグラフィーなどの公知の方法で
は分離できない不純物がカタラーゼ中に混入するという
問題もある。

（課題を解決するための手段）そこで、本発明者らは、溶血液からＳＯＤ及びカタラー
ゼを共に回収する方法において、上記問題を解決するこ
とを目的として観念検討を行った。その結果、溶血液を
、ある物質の存在下で、あるいは、ある緩衝液で平衡化
させた陰イオン交換体で処理することにより、上記した
従来技術の問題点が解決できることを見い出し１本発明
を完成した。

本発明は、非イオン性界面活性剤の存在下、陰イオン交
換体で処理するか、ｐ）１７．２〜７．５のリン酸緩衝
液で平衡化した陰イオン交換体で処理することを特徴と
するＳＯＤ及びカタラーゼの製造方法である。

本発明で使用される溶血液は、ヒト、サル、ウシ、ウマ
、ヒツジ、ブタ、ヤギなどの哺乳動物の血液から１例え
ば、遠心分離などの公知の方法で血禁成分を除いて得ら
れる赤血球を生理食塩水で洗浄したのち、得られた血球
画分に等容量の蒸留水、または非イオン性界面活性剤を
含む蒸留水を加えて溶血し、透析あるいはゲル口過など
の公知の方法によって脱塩をすることによって得ること
ができる。この溶血操作において、非イオン性界面活性
剤を用いると、ＳＯＤ及びカタラーゼの回収率を向上さ
せることができる。

本発明で使用される陰イオン交換体は、交４！！！！基
としてジエチルアミノエチル基などの三級アミン及びト
リメチルアミノエチル基などの四級アンモニウム塩・及
び担体としてセルロース、デキストラン、アガロース、
合成ポリマーなどからなるイオン交換体である。

例えば、イオン交換基として三級アミンを有するイオン
交換体としては、イオン交換基としてジエチルアミノエ
チル基を有するセルロースイオン交換体、デキストラン
イオン交換体、アガロースイオン交換体、合成ポリマー
イオン交換体が挙げられる。イオン交換基として四級ア
ンモニウム塩を有するイオン交換体としては、イオン交
換基としてジエチル−２−ヒドロキシプロピルアンモニ
ウム基を有するセルロースイオン交換体、デキストラン
イオン交換体、アガロースイオン交換体、合成ポリマー
イオン交換体、ジエチルメチルアンモニウム基を有する
セルロースイオン交換体、デキストランイオン交換体、
アガロースイオン交換体、合成ポリマーイオン交換体、
及びトリメチルアンモニウム基を有するセルロースイオ
ン交換体、デキストランイオン交換体、アガロースイオ
ン交換体、合成ポリマーイオン交換体などが挙げられる
０合成ポリマーイオン交換体として使用される合成ポリ
で−としては、ビニル系およびスチレン系のポリマーが
挙げられる。

具体的な陰イオン交換体としては、例えば、ＤＥ−５２
（ワットマン社）、ＤＥＡＥ−セファ−セル（ファルマ
シア１．ＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５およびＡ３０
（ファルマシア社）、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６
Ｂ　（ファルマシア社）、ＤＥＡＥ−セファロースツア
ーストフロラ（ファルマシア社）、ＤＥＡＥ　　ＢＩＯ
−ＧＥＬ　　Ａ（バイオラッド社）、ＤＥＡＥ−）ヨパ
ール（東ソーＭ）、ＱＡＥ−セファデックスＡ２５およ
びＡ５０　（ファルヤシ７社）、Ｑ−セファロースＣＬ
−６Ｂ　（ファルマシア社）、Ｑ−セファロースツアー
ストフロラ（ファルマシア社）などが挙げられる。イオ
ン交換体の使用量は、溶血液１２に対して、通常、０．
１〜１文である。この使用量が、０．１１より少ないと
ＳＯＤおよびカタラーゼを十分に回収できないので好１
しくなく・　１１を超えると混合物の撹拌を円滑に行う
ことができなく、また非効率的であって好ましくない。

本発明の第１の方法は、非イオン性界面活性剤の存在下
・溶血液を陰イオン交換体を用いて処理する方法である
。用いる非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエ
チレンデシルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエ
ーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリ
オキシエチレン−ｐ−（ｔ−オクチル）フェニルエーテ
ル、ポリオキシエチレン・ｐ−ノニルフェニルエーテル
、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビ
タン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソ
ルビタン、ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタ
ン、ポリオキシエチレンモノパルミチン酸ソルビタン、
ポリオキシエチレンモノステアリン酸ソルビタン、ポリ
オキシエチレンモノオレイン酸ソルビタンなどのうち、
ポリオキシエチレンの重合度が７〜２５の合成非イオン
性界面活性剤およびステロイド骨格を有するサポニンな
どの天然の非イオン性界面活性剤が挙げられる。

具体的な非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｂｒ
１ｊ３５、Ｂｒ１ｊ５６、Ｂｒ１ｊ５Ｂ、Ｂｒ１ｊ　　
　７６　、　　Ｂｒ１ｊ９６　、　　Ｂｒ１ｊ９８　、
　　ト　リ　ト　ンＸ−１００、トリトンＸ−１０２、
トリドアＸ−１６５、エマルジエン１０６．エマルジエ
ンｉｏｇ、エマルジエン２２０、エマルジエン８１０、
ツウィーン２０などが挙げられる。

非イオン性界面活性剤は、陰イオン交換体と接触させる
際に系に存在していればよいが、通常は、陰イオン交換
体と接触させるべき溶血液中に存在させておくのが良い
、すなわち、非イオン性界面活性剤は溶血操作中に添加
しておくか、できた溶血血液に直接添加するか、あるい
は、透析及びゲル口過など公知の方法により脱塩する際
にこのものの存在下で行うことにより、陰イオン交換体
と接触させるべき溶血液中に存在させることができる。

非イオン性界面活性剤の存在量は、通常０．０５〜０．
５％（Ｗ／Ｖ）であるが、その量が０．０５％未満であ
ると樹脂の目詰りがおこり、また樹脂の汚れもひどくな
るので好ましくなく、０．５％を超えてもその添加効果
に差がなく、非経済的であり、また過剰の界面活性剤に
よりタンパクが変性を受けるなどの理由で好ましくない
、かくして非イオン性界面活性剤を存在させた溶血液は
、例えば、ＰＨ６，５〜７．５の１〜１０　ｍ　Ｍ　９
度の緩衝液で平衡化した陰イオン交換体を加え、混合物
を緩かに１〜６時間、好ましくは２〜３時間、撹拌した
のち、混合物を吸引口過し、使用した陰イオン交換体の
３倍容量の前記緩衝液で洗浄し、ＳＯＤ及びカタラーゼ
を吸着した陰イオン交換体を集め、これをカラムに充填
し、次にカラムを、使用した陰イオン交換体の２〜４倍
量の前記Ｉｓ衝液に０．０５〜０．１のイオン強度にな
るように塩類を加え、ｐＨを６〜７に調整したもの、あ
るいは平衡化した緩衝液と同一成分、ｐＨが６〜７、濃
度が５０〜１００ｍＭの緩衝液で展開することによって
ＳＯＤ及びカタラーゼを精製することができる。また、
本発明の方法においては、陰イオン交換体による処理は
、前記方法に限られることなく、例えば、初めに陰イオ
ン交換体をカラムに充填し、これをｐＨ６，５〜７．５
の１〜１０ｍＭの緩衝液で平衡化したのち、前述の非イ
オン性の界面活性剤の存在する溶血液を通し、使用した
陰イオン交換体の５倍容量のＰＨ６，５〜７．５の緩衝
液で洗浄後、前述と同一の展開液により展開することに
よっても実施できる。緩衝液としては、リン酸ナトリウ
ム塩、カリウム塩、及びトリエタノールアミンの塩酸塩
あるいは酢酸塩などの有機アミンの塩酸塩あるいは酢酸
塩が使用できる。添加する塩類としては、塩化ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化カリウム
、塩化アンモニウムなどが適当である。

本発明の第２の方法は、溶血液をｐＨ７、２〜７．５の
リン酸緩衝液で平衡化した陰イオン交換体で処理するこ
とによってＳＯＤ及びカタラーゼを精製する方法である
。

本発明において用いられるリン酸緩衝液のｐＨが７．２
より低いとカタラーゼの回収量が低下し、７．５より高
いとタンパクの変性が過度に促進され好ましくない。

本発明の方法は、溶血液をｐＨ７，２〜７．５のリン酸
緩衝液で平衡化した陰イオン交換体と接触・処理する方
法であれば、いかなる方法によってもよいが、例えば、
溶血液にｐＨ７、２〜７．５のリン酸緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換体を加え、混合物を緩かに１〜６時間、
好ましくは２〜３時間撹拌した後、混合物を吸引口過し
、使用した陰イオン交換体の３倍容量の前記リン酸緩衝
液で洗浄しＳＯＤ及びカタラーゼを共に吸着した陰イオ
ン交換体を集め、これをカラムに充填する。それから、
カラムを使用した陰イオン交換体の２〜４倍容量の前記
リン酸緩衝液で洗浄したのち、ｐＨ６，８の５０ｍＭリ
ン酸緩衝液で展開することによってＳＯＤ及びカタラー
ゼを精製することができる。また、本発明の方法は、前
記方法に限られることなく、初めに陰イオン交換体をカ
ラムに充填し、これをｐ）！７．２〜７．５のリン酸緩
衝液で平衡化したのち、これに溶血液を通し、使用した
陰イオン交換体の５倍量のｐＨ７、２〜７．５のリン酸
緩衝液で洗浄後、ｐＨ６，８の５０ｍＭリン酸緩衝液で
展開することによっても行われる。

なお、本発明の方法においては、第１方法において述べ
た非イオン性界面活性剤を存在させる方法と、第２方法
において述べた、ｐＨ７、２〜７．５のリン酸緩衝液で
平衡化した陰イオン交換体を用いて処理する方法とを組
合せた方法、すなわち、非イオン性界面活性剤の存在化
、ｐＨ７、２〜７．５のリン酸緩衝液で平衡化した陰イ
オン交換体を用いて処理する方法が最も好ましい。

このようにして得られるＳＯＤ及びカタラーゼを共に含
む画分からは、硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフ
ィー、陽・イオン交換クロマトグラフィー、メタルキレ
ーティングアフィニティクロマトグラフィーなどの公知
の方法を用いて更に精製することにより、高純度のＳＯ
Ｄ及びカタラーゼを得ることができる。

（実施例）本発明を実施例及び参考例により、更に詳しく説明する
が、本発明の範囲はこれらの例に限定されるものではな
い。

本発明の実施例及び比較例において、ＳＯＤの活性測定
は、リボフラビン、メチオニン存在下に可視光を照射す
ることにより生じたスーパーオキシド（０ミ）によるニ
トロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の還元をＳＯＤが
阻害することを利用したビューチャンプとフリートピッ
チの方法に従って行った［アプリティカル・バイオケミ
ストリー、±４　、２７６　（１９７１）参照］、カタ
ラーゼの活性測定はシンハの方法に従って行った［アプ
リティカル・バイオケミストリー、生１゜３８９　（１
９７２）参照］。

１１町」３週間、４℃にて保存したヒ）ＣＰＤ加濃厚赤血球を用
いた。４℃、１５００ＸＧ、１５分遠心分離した。上清
液を除去後、沈降した赤血球を生理食塩水で３回洗浄し
た。この赤血球沈澱ｌ容に、０．２％（Ｗ／Ｖ）のサポ
ニンを含む冷水ｌ容を加え、４°Ｃに１時間撹拌し溶血
した。溶血液を１ｍＭリン酸緩衝液に対して透析し、脱
塩を行った。

１考涜」３週間、４℃にて保存したヒ）ＣＰＤ加濃厚赤血球を４
℃、１５００ＸＧで１５分遠心分離した。上清液を除去
後、沈降した赤血球を生理食塩水で３回洗浄した。この
赤血級沈殿ｌ容に、０．４％（Ｗ／Ｖ）のトリトンＸ−
１００を含む冷水ｌ容を加え、４℃に１時間撹拌し溶血
した。

実」１帆」カラム（φ２ｃｍＸ！１５．５ｃｍ）に、１ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７、２）を用いて平衡化したＤＥ−５２（
ワットマン社）１８−を充填した。これに、参考例１で
得られた溶血液に０．１％（Ｗ／Ｖ）になるようにトリ
トンＸ−１００を添加した溶液２０−を通した。このと
きの流速は２．３ｍｌ　／　ｍ　！　ｎであった。溶血
液を通した後、６０−の前記平衡化用緩衝液で洗浄し、
次いで５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６、８）　５０ｗＪ
で展開し、ＳＯＤ及びカタラーゼを共に含む両分を得た
。ＳＯＤ及びカタラーゼの活性回収率は、それぞれ、８
５％及び７５％であった。

１庭１」カラム（φ２ｃｍＸ１５　、５ｃｍ）に、１ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７、２）を用いて平衡化したＤＥ−５２（
ワットマン社）１８−を充填した。これに、参考例１で
得た溶血液に０．１％（Ｗ／　Ｖ　）になるようにツウ
ィーン２０を添加した溶液２〇−を通した。このときの
流速は２　、４＋ａ／／ｌｌ１ｎであった。溶血液を通
した後、６０−の前記平衡化用緩衝液で洗浄した後、次
いで５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）１６　、８）　５０−
で展開し、ＳＯＤ及びカタラーゼを共に含む画分を得た
。ＳＯＤ及びカタラーゼの活性回収率は、それぞれ、８
３％及び７５％であった慟又立胴」参考例２で得た溶血液を透析用セルロースチューブに入
れ、４℃で、１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、２）に対し
て透析脱塩を行った。１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、２
）で平衡化したＤＥ−５２（ワットマン社）を用い、上
記の処理を施した溶血液を回分式で処理し、蛋白質の吸
着したＤＥ−５２を平衡化に珀いた同一の緩衝液で洗浄
し、非吸着物を洗い流した。洗浄後の蛋白の吸着したＤ
Ｅ−５２をカラムにつめ、ＤＥ−５２の樹脂容量の３倍
量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）で展開し、Ｓ
ＯＤ及びカタラーゼを共に含む両分を得た。非吸着部分
及び洗浄部分を素通り画分とし、５０ｍＭリン酸緩衝液
溶出部分を吸着画分とし、各々のＳＯＤ及びカタラーゼ
活性を測定した。溶血液よりの活性回収率は以下の通り
であった。

活性回収率（％）素通り画分　　　　　０９吸着画分　　　８７　　　８２参考例２で得た溶血液を透析用セルロースチューブに入
れ、４℃で、１ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）１７　、５）に
対して透析脱塩を行った。１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
、５）を用いて平衡化したＤＥ−５２（ワットマン社）
を用い、上記の処理を施した溶血液を回分式で処理し、
蛋白質の吸着したＤＥ−５２を平衡化に用いた同一の緩
衝液で洗浄し、非吸着物を洗い流した。以下の操作は実
施例３と同様に行った。

活性回収率（％）ＳＯＤ　　　　　カタラーゼ素通り画分　　　　　０　　　　　　　０吸着画分　　
　８５　　〜１００参考例２で得た溶血液を透析用セルロースチューブに入
れ、４°Ｃで、１ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）１７　、０）
に対して透析脱塩を行った。１ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ
７，０）を用いて平衡化したＤＥ−５２（ワットマン社
）を用い、上記の処理を施した溶血液を回分式で処理し
、蛋白質の吸着したＤＥ−５２を平衡化に用いた同一の
緩衝液で洗浄し、非吸着物を洗い流した。以下の操作は
実施例３と同様に行った。

活性回収率（％）素通り画分　　　　　０　　　　　７７（混りが多い）吸着画分　　　８５　　　　１１（発明の効果）本発明の方法によれば、ＳＯＤ及びカタラーゼの精製に
用いられる陰イオン交換体の目詰りが生じ難く、そのた
め処理に要する時間も短縮されるという処理操作上の利
点が得られるほか、目的とするＳＯＤ及びカタラーゼの
回収率も高く、かつ回収されたＳＯＤ及びカタラーゼの
純度が高く、これをさらに精製することにより一暦高純
度のＳＯＤ及びカタラーゼをそれぞれ得ることができる
という利点を得ることができ、本発明の方法は、産業上
極めて有用な発明であるということができる。

Claims

【特許請求の範囲】１、溶血液を、非イオン性界面活性剤の存在下、陰イオ
ン交換体で処理することによって、Ｃｕ、Ｚｎ型スーパ
ーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼを共に回収する
ことを特徴とするＣｕ、Ｚｎ型スーパーオキシドジスム
ターゼ及びカタラーゼの製造方法。２、非イオン性界面活性剤の存在下、陰イオン交換体で
処理する代わりに、ｐＨ７．２〜７．５のリン酸緩衝液
で平衡化した陰イオン交換体で処理することを特徴とす
る請求項１記載のＣｕ、Ｚｎ型スーパーオキシドジスム
ターゼ及びカタラーゼの製造方法。