DK144800B - Fremgangsmaade til udvinding af enzymer fortrinsvis cu,znsuperoxid-dismutase (sod) catalas og carbonsyreanhydrase fra blod - Google Patents

Fremgangsmaade til udvinding af enzymer fortrinsvis cu,znsuperoxid-dismutase (sod) catalas og carbonsyreanhydrase fra blod Download PDF

Info

Publication number
DK144800B
DK144800B DK168880AA DK168880A DK144800B DK 144800 B DK144800 B DK 144800B DK 168880A A DK168880A A DK 168880AA DK 168880 A DK168880 A DK 168880A DK 144800 B DK144800 B DK 144800B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
sod
catalase
blood cells
solution
hemoglobin
Prior art date
Application number
DK168880AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK144800C (da
DK168880A (da
Inventor
J T Johansen
Original Assignee
Forenede Bryggerier As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forenede Bryggerier As filed Critical Forenede Bryggerier As
Priority to DK168880A priority Critical patent/DK144800C/da
Priority to US06/149,393 priority patent/US4341867A/en
Priority to EP80301615A priority patent/EP0038393B2/en
Priority to JP6516080A priority patent/JPS56148287A/ja
Priority to DE8080301615T priority patent/DE3066356D1/de
Priority to AT80301615T priority patent/ATE6077T1/de
Publication of DK168880A publication Critical patent/DK168880A/da
Publication of DK144800B publication Critical patent/DK144800B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK144800C publication Critical patent/DK144800C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

144800
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til udvinding af enzymer, fortrinsvis Cu,Zn-superoxid-dismutase (SOD), catalase og carbonsyreanhydrase, fra blod, hvorved blodcellerne lyseres, og de ønskede enzymer isoleres fra den 5 opnåede opløsning.
Fra dansk patentskrift nr. 132 864 kendes en fremgangsmåde til udvinding af SOD fra pattedyrblod, især okseblod, hvorved blodceller, befriet for plasma ved dekantering eller centrifugering, blev lyseret med koldt 10 deioniseret vand, eventuelt indeholdende lidt overflade aktivt middel, og hæmolysatet blev fældet med et halogeneret organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, i nærvær af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom ethanol, eller med ammoniumsulfat ved en 15 temperatur under 5°C. Bundfaldet blev tilbagevasket en eller flere gange med deioniseret vand, hvorpå den kombinerede supernatant blev underkastet opvarmning til 60-65°C i nærvær af en pufferopløsning indeholdende divalente metalioner med en atomradius på 0,69-0,80 Å 20 til denaturering af varmelabile proteiner, især carbon syreanhydrase. Efter hurtig afkøling til vinder stuetemperatur blev de udfældede proteiner fjernet ved filtrering og centrifugering, og den SOD-holdige opløsning renset ved ionbytterchromatografi, præparativ 25 electrophorese og/eller gelfiltrering. Ved denne frem gangsmåde angives opnået et udbytte af SOD på ca. 0,01% (vægt/vol.) på basis af pakkede røde blodlegemer.
Ved erstatning af opvarmningstrinnet i den ovennævnte fremgangsmåde med en fraktionering ved hjælp af l^HPO^ 30 og acetone, og ved efterfølgende chromatografering af 146800 2 den aktive del af de fraktionerede opløselige proteiner på di-ethylaminoethyleéllulose (DEAE-cellulose) ved pH 7,4 blev der af pakkede blodlegemer fra okser opnået et udbytte af SOD på 0,006% (vægt/vol.) med en aktivitet på 3300 enh./mg, 5 svarende til 60% af den tilstedeværende SOD-aktivitet.
De ovennævnte flertrinsfremgangsmåder er imidlertid ikke anvendelige i kommerciel målestok, dels på grund af de mange trin, som komplicerer udførelsen, dels på grund af de store mængder organiske opløsningsmidler og even-lo tuelt K^HPO^, som må anvendes.
Ifølge dansk patentskrift nr. 133 246 har man søgt at eliminere fældningen af hæmoglobin med chloroform/ethanol og fraktioneringen med K^HPO^ og acetone til fjernelse af carbonsyreanhydrase ved (a) at indstille hæmolysatet 15 til en pH-værdi på ca. 6 og en ionstyrke under ca. 0,01 M og føre opløsningen gennem en søjle af en ionbytterhar-piks med svagt basiske grupper, fortrinsvis DEAE-cellulose, hvorved SOD adsorberes på harpiksen, (b) at vaske kolonnen fri for hæmoglobin med en pufferopløsning med samme 2o pH og ionstyrke, og (c) at eluere det adsorberede SOD fra kolonnen med et vandigt medium med en pH-værdi på 5,7-6,3 og en ionstyrke, der stiger gradvis eller i trinvise gradienter fra under ca. 0,02 M til over ca.
0,03 M, idet SOD elueres fra den fraktion af eluatet, 25 der begynder ved den første ionstyrke, hvor forholdet mellem absorbansværdierne Aog ^80 n^r maksimum, og slutter ved den første ionstyrke, hvor Cu- og Zn-indholdene og forholdet A2g5/A2gg a^a£er samtidigt.
Ved denne fremgangsmåde angives ud fra pakkede røde 3o blodlegemer opnået et udbytte af SOD på 0,01-0,013% (vægt/vol.) med en aktivitet på 2500 enh./mg eller næsten op til 75% af den samlede SOD-aktivitet, der oprindeligt forekom i hæmolysatet. Denne fremgangsmåde 146800 3 er imidlertid heller ikke egnet i kommerciel målestok, da den omfatter chromatografi af store væskevolumener, hvilket kræver tilsvarende store chromatografisøjler.
Endvidere er mere end 99,8% af de proteiner, som chro-5 matograferes, uønskede proteiner, hvilket begrænser søjlens levetid og chromatografihastigheden.
Ifølge dansk patentskrift nr. 134 914 har man erstattet fældningen af hæmoglobin med chloroform/ethanol og fraktioneringen med Κ2ΗΡ0^ og acetone til fjernelse af lo carbonsyreanhydrase med et enkelt opvarmningstrin, hvor hæmolysatet ved en pH-værdi mellem 5 og 8 opvarmes til en temperatur på 60-80°C, således at hæmoglobinet samt carbonsyreanhydrasen og de andre varmelabile proteiner udfældes, hvorefter blandingen afkøles, de ud-15 fældede proteiner skilles fra, og SOD udskilles fra su-pematanten, f.eks. ved udfældning med acetone eller, fortrinsvis, ved ionbytterchromatografi på DEAE-cellulose under samme betingelser som ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde. Herved opnås naturligvis en simplifice-2o ring af fremgangsmåden, men den er alligevel ikke tilfredsstillende, da der i opvarmningstrinnet sker et tab af SOD. I patentskriftet angives efter varmefældningen en oprensning på 40-50 gange og et udbytte af SOD på 70-90% af det, der var til stede i udgangsblodet.
25 Briggs and Fee (Biochim. et Biophys. Acta, 537 (1978), side 86-99) erstattede fældningerne af hæmoglobin og af varmelabile proteiner med en chargebehandling af hæmolysatet først med carboxymethylcellulose (CM-cellulose) ved pH 6 og derpå med "mixed bed" ionbytter under kontrol af 3o pH-værdien til nær ved neutral. Den resulterende opløsning blev behandlet med DEAE-cellulose, som blev overført til en søjle og først vasket med store mængder 2 mM Na-phosphatpuffer for at eluere resterende hæmoglobin og derpå elueret med 0,1 M Na-phosphatpuffer under opsamling 4 1ΛAS 00 af aktive fraktioner. Disse blev kombineret og igen chargebehandlet med hhv. "mixed bed" ionbytter og CM-cellulose til fjernelse af yderligere ledsageproteiner.
Den SOD-holdige opløsning blev igen sat på en søjle af 5 DEAE-cellulose og blev elueret med en lineær gradient fra 2 til 100 mM Na-phosphatpuffer, og de aktive fraktioner blev kombineret, koncentreret ved ultrafiltrering og tinderkastet gelfiltrering på "Biogel P-100". Chroma-tograferingen og gelfiltreringen blev gentaget til op-10 nåelse af et rent præparat.
Denne fremgangsmåde er helt uegnet til brug i kommerciel målestok, da den er meget kompliceret på grund af de mange trin, og der skal bruges uforholdsmæssigt store mængder ionbyttere, i første rensningstrin således 2,5 kg CM-15 cellulose og 0,5 kg "mixed bed" ionbytter til 2 liter hæmo-lysat. Desuden er udbyttet af SOD ved denne fremgangsmåde kun 21% af det teoretisk opnåelige, og der sker allerede i CM-cellulose-rensningstrinnet et tab på ca. 25% af den totale SOD-aktivitet, 20 Den eneste fremgangsmåde til udvinding af SOD fra blod, der indtil nu har fundet anvendelse i praksis, er den tidligere beskrevne, hvorved hæmolysatet fældes med chloroform/etha-nol, og supematanten underkastes fraktionering med K^HPO^ og acetone, hvorpå den aktive del chromatograferes på DEAE-25 cellulose. Herved opnås i reglen ca. 40 mg ren SOD pr. liter pakkede blodceller mod teoretisk ca. 100 mg/l.
Det har nu ifølge opfindelsen vist sig, at det er muligt at gennemføre såvel hæmolysen af blodcellerne som fældningen af hæmoglobinet i et trin under bevarelse af den tota-30 le SOD-aktivitet og aktiviteten af andre ønskede enzymer, især 144800 5 catalase og carbonsyreanhydrase, således at disse kan udvindes på en måde, som er velegnet til udførelse i kommerciel målestok.
Dette opnås med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er 5 ejendommelig ved, at helt eller delvis isolerede blodceller tilsættes en alkanol med 2-4 carbonatomer, fortrinsvis ethanol, til en koncentration på 10-70 volumenpct. og får lov at stå til hæmolyse af blodcellerne og denaturering af hæmoglobinet, hvorpå der tilsættes vand op til mindst omkring det 10 dobbelte volumen, og bundfaldet af cellerester, hæmoglobin og andre denaturerede proteiner fjernes fra suspensionen, hvorefter de ønskede enzymer isoleres fra den opnåede opløsning.
Fremgangsmåden gennemføres mest praktisk på den måde, at de helt eller delvis isolerede blodceller, f.eks. blod 15 som efter henstand er fradekanteret hovedparten af plasmaet, tilsættes et lige så stort volumen 96% ethanol under kraftig omrøring. Efter henstand under omrøring i omkring en time fortyndes op til det dobbelte volumen med deionise-ret vand, og omrøringen fortsættes i l/2-l time. Derefter 20 centrifugeres suspensionen, og kagen af hæmoglobin og cellerester vaskes med lidt vand. Der fås herved en klar rødlig opløsning indeholdende bl.a. SOD, catalase og carbonsyreanhydrase .
Fra denne opløsning kan carbonsyreanhydrasen let isoleres ved 25 affinitetschromatografi på en harpiks, der specifikt adsorbe-rer carbonsyreanhydrase, men ikke de andre ønskede enzymer.
Et eksempel på en sådan harpiks er den tværbundne agarose, "Sepharose" ®, substitueret med glycyl-tyrosin-azo-benzensulfonidamidgrupper. Efter vask af harpiksen kan 30 carbonsyreanhydrasen elueres med vandig kaliumthio- cyanatopløsning som beskrevet af J.T. Johansen (Carls-berg Research Communications Vol. 41, 73 - 81 (1976)).
6 144800
Opløsningen, hvorfra carbonsyreanhydrasen er fjernet, indeholder stadig SOD og catalase. Det har ifølge opfindelsen vist sig, at man ved anvendelse af den fremgangsmåde til isolering af SOD fra vandige opløsninger, der 5 er genstand for dansk patentansøgning nr. 168780, kan isolere såvel SOD som catalase fra opløsningen i et enkelt trin ved, at opløsningen ved en pH-værdi på 4,7- 5.5 underkastes chromatografi på en kationbytterharpiks med samme polaritet som SOD i det anvendte pH-område, 10 hvorefter SOD og catalase elueres fra harpiksen med en pufferopløsning, der har pH-værdi i området 4,7-7,5 og ionstyrke i området 0,01-1,OM, idet SOD elueres ved lavest pH og/eller lavest ionstyrke. Der kan på kendt måde anvendes en pH-gradient og/eller en ionstyrkegradient inden 15 for disse områder, således at SOD elueres først. Fortrinsvis elueres SOD først med en pufferopløsning med pH 4,7- 5.5 og ionstyrke 0,02-0,2M, hvorefter catalasen elueres med en pufferopløsning med pH 6,5-7,5 og ionstyrke 0,1-1,OM. Derefter kan de SOD-holdige og de catalaseholdige frak-20 tioner hver for sig oprenses yderligere på kendt måde.
Som eksempler på anvendelige kationbytterharpikser ved den ovenstående chromatografering kan nævnes carboxyme-thylcelluloser, såsom de der forhandles under navnene "CM-23", og "CM-52M af Whatman Ltd. Storbritannien, og 25 under navnet "CM-Sephacel"^' af Pharmacia Fine Chemicals AB, Sverige, tværbundne dextraner substitueret med carboxy-methylgrupper, såsom den, der forhandles under navnet "CM-Sephadex" ^ af Pharmacia Fine Chemicals AB, tværbundne dextraner substitueret med sulfopropylgrupper 30 såsom den, der forhandles under navnet "SP-Sephadex"^ af Pharmacia Fine Chemicals AB, og tværbundne agaroser substitueret med carboxymethylgrupper, såsom den der forhandles under navnet "CM-Sepharose^-CL 6B" af Pharmacia Fine Chemicals AB.
146800 7
Efter elueringerne kan søjlen regenereres ved skylning med base, vand, syre og vand og efterfølgende ækvilibre-ring med den ønskede puffer.
Chromatograferingen af opløsningen på kationbytterharpiks 5 kan eventuelt gennemføres chargevis ved udrøring af ion-byttergranulatet i opløsningen, men den gennemføres mest fordelagtigt som en søjleprocedure, der er lettere at arbejde med i større målestok og sikrer, at alt enzymet ad-sorberes på ionbytteren.
10 Før den videre oprensning af de to vundne opløsninger har det på dette stadium vist sig hensigtsmæssigt at koncentrere dem begge ved ultrafiltrering.
SOD-opløsningen kan derefter passende underkastes en diafiltrering under anvendelse af en phosphatpuffer med lille 15 ionstyrke for at fjerne lavmolekylære urenheder.
Den afsluttende rensning af SOD-opløsningenkan hensigtsmæssigt foretages ved chromatografi på DEAE-cellulose.
Herved fås en klar opløsning, hvorfra det rene SOD eventuelt kan isoleres i fast form ved frysetørring.
20 Det har vist sig, at man på den ovenfor beskrevne måde under anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan opnå et udbytte af helt rent SOD på omkring 60 mg pr. liter pakkede blodlegemer svarende til ca. 60% af de teoretisk mulige ca. 100 mg/l.
25 Catalaseopløsningen kan passende renses ved fraktioneret fældning med ammoniumsulfat.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved det efterfølgende eksempel.
8 144800
EKSEMPEL
Hæmolyse og fældning af hæmoglobin
Til 7 liter dekanteret Liod, der endnu indeholdt ca. 2 1 plasma og således svarede til ca. 5 1 pakkede blodceller, 5 sattes 7 i 96% ethanol under kraftig omrøring. Efter 1 time tilsattes 15 1 deioniseret vand, og omrøringen fortsattes i 30 minutter.
Suspensionen blev centrifugeret i en MSE kurvcentrifuge ved omkring 2000 omdr./min., og hæmoglobinkagen blev vas-10 ket med 2 1 vand, før centrifugen blev tømt. Der blev opnået 29,5 1 supernatant.
Isolering af carbonsyreanhydrase
Supernatanten blev påsat en 10 x 12 cm søjle af affinitetsmatrixen "Sepharose"-glycyl-tyrosin-azobenzensulfonamid, 15 der specifikt adsorberer carbonsyreanhydrase, men ikke ad- sorberer SOD og catalase. Efter vask af affinitetsmatrixen blev carbonsyreanhydrasen elueret med vandig 0,2 M kalium-thiocyanatopløsning indeholdende 0,05 M "Tris"-sulfat og med pH 6,5.
20· Isolering af SOD og catalase
Opløsningen, der indeholdt SOD og catalase, blev indstillet til pH 4,75 med 1M eddikesyre, og den blev sendt igennem en søjle med diameter 20 cm, pakket med 2 1 "CM-23" ækvilibreret i 20 mM Na-acetat-puffer, pH = 4,8. Gennem-25 strømningshastigheden var ca. 15 1 pr. time. Ionbytteren blev derpå vasket med 15 1 20 mM Na-acetat-puffer, pH = 4,8.
Søjlen blev elueret med en lineær gradient af 3 1 100 mM og 3 1 200 mM Na-acetat, pH = 4,8, ved en gennemstrømningshastighed på 1,5 1 pr. time. SOD elueredes ved omkring 30 150 mM Na-acetat« 144800 9
Catalase blev elueret med 0,1 M Na-phosphat-puffer, pH = 7,0.
De SOD-holdige og de catalase-holdige fraktioner blev hver for sig hældt sammen og koncentreret til ca. 250 ml ved ultraf i1trering.
5 SOD-rensning SOD-opløsningen blev diafiltreret under anvendelse af en 10 mM Na-phosphat-puffer, pH = 7,5, og yderligere renset ved chromatografi på en søjle (5x8 cm) af DEAE-cellu-lose (forhandlet under navnet "DE-52" af Whatman Ltd., 10 England), ækvilibreret i 10 mM Na-phosphat-puffer, pH = 7,5. Søjlen blev udviklet med en lineær gradient af 2 x 600 ml 10 mM Na-phosphat-puffer, pH = 7,5, indeholdende 0 —> 0,125 M NaCl. Gennemstrømningshastigheden var 110 ml pr. time, og der opsamledes fraktioner på 10 ml.
15 De SOD-holdige fraktioner blev hældt sammen. Specifik aktivitet og absorptionsspektrum viste, at ensymet var rent.
Catalase-rensning
Catalaseopløsningen fra ultrafiltreringen renses ved 20 (NH^)2S0^-fraktionering.
Regenerering af t,CM-23t,-sø jlen
Efter elueringen af catalasen sendes 3 1 0,5 m NaOH-opløs-ning igennem søjlen efterfulgt af 3 1 vand. Derpå sendes 3 1 0,5 M saltsyre igennem søjlen efterfulgt af 3 1 vand 25 og 3 1 0,2 M Na-acetat-puffer, pH = 4,8, Søjlen behandles derefter med 20 mM Na~acetat-puffer, pH s 4,8, indtil eluatets konduktivitet og pH-værdi er de samme som pufferens. Søjlen er herefter klar til brug igen.
10 U4800
Resultater
En oversigt over de gennemførte oprensningstrin og de opnåede udbytter af SOD, catalase og carbonsyrearihydrase findes i den nedenstående tabel.
144800 11 f-ι <D _ ^
0 P O O
h ρ^ o σ\
H H
O) P"—' O X5 H p
O
Η I
ρ ø q 0) Φ >,CQ „ „
Ό w ø,~n O O
S ri ri bO O O
ri OXS s O O
U ri |f~" H O
ø cd d HH
P u cd
Ή _______ Il —I..... .....— ........... I
Η ø p la p^ O O- M 2 ω
cd p— H
ri H
H p
CD
ui 0 cd ra·'-'
q cd bO O O
d H £i Q Q
!>i ø>—' vo -et
P P Hi H
q cd
3 O
<D
q__
ra <D
p ri -p o p^-v o cm σ\ σι H Ρ ^ o co (s is q P'-' h pp cd 'd . o ^ <3
bO
H O
0 --N
ai q bo _ ø o S en o o o H CO'—' co o CT\ CT\
0 ICi ΙΛ ΛΙ W
o IA O
LA IA CM IA
·> ø q » ·> _ _
Q SØ -q-cricr» CM H CM O O
O 3 P H CM CM p
CO HH <H I
, OH Cd ti h q o 0 bop q o q <3 bO CD bo P ø 0
ti IPlAOøohO bO
H ØH H S Ofl bOO
ti -PH bO OH o ri L
ai q h q q ø ø = to h bp =
ri øtNcdHpraiA , qqcM
0 x q O bO 0 CM *Η H ØH LA
q ø + bod ø ra ri q icdø qq i <d ri q bo Pph S p oi p£|
bO d HødbOøqi^UbObOØHSPbO
o qoHqis-'HriPø.risflriraHHsq
0 Η O P HH H 0 p H HØ Hft H
bo pp q æq qq q h ø cd q qn coo øq q h ø ra ø p5 høø h<d øø q i hø •η HHPHP qrap q ·ό 3 rippo-oq
ri 0 P HH ØøHho&SHHØHO <S) H
ø r-qøE-iHo>coracoøi*!opcQca<D
rH
o CQ ······*#
Η Η CM ΪΌ -i in ^ IS CO

Claims (4)

144800
1. Fremgangsmåde til udvinding af enzymer, fortrinsvis Cu,Zn-superoxid-dismutase (SOD), catalase og carbonsyre-anhydrase, fra blod, hvorved blodcellerne lyseres, og 5 de ønskede enzymer isoleres fra den opnåede opløsning, kendetegnet ved, at helt eller delvis isolerede blodceller tilsættes en alkanol med 2-4 carbon-atomer, fortrinsvis ethanol, til en koncentration på 10-70 volumenpct. og får lov at stå til hæmolyse af 10 blodcellerne og denaturering af hæmoglobinet, hvorpå der tilsættes vand op til mindst omkring det dobbelte volumen, og bundfaldet af cellerester, hæmoglobin og andre denaturerede proteiner fjernes fra suspensionen, hvorefter de ønskede enzymer isoleres fra den opnåede 15 opløsning.
2. Fremgangsmåde ifølge kravl, kendetegnet ved, at SOD og catalase isoleres fra opløsningen ved, at denne ved en pH-værdi på 4,7-5,5 underkastes chro-matografi på en kationbytterharpiks med samme polari- 20 tet som SOD i det anvendte pH-område, hvorefter SOD og catalase elueres fra harpiksen med en pufferopløsning, der har pH-værdi i området 4,7-7,5 og ionstyrke i området 0,01-1,OM, idet SOD elueres ved lavest pH og/eller lavest ionstyrke.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at 50D elueres fra kationbytterharpiksen med en pufferopløsning med pH 4,7-5,5 og ionstyrke 0,02-0,2M, hvorefter catalasen elueres med en pufferopløsning med pH 6,5-7,5 og ionstyrke 0,1-1,OM.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, k ende- tegnet ved, at der som kationbytterharpiks anvendes carboxymethylcelluloser eller tværbundne dex-
DK168880A 1980-04-21 1980-04-21 Fremgangsmaade til udvinding af enzymer,fortrinsvis cu,zn-superoxid-dismutase (sod),catalase og carbonsyreanhydrase,fra blod DK144800C (da)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK168880A DK144800C (da) 1980-04-21 1980-04-21 Fremgangsmaade til udvinding af enzymer,fortrinsvis cu,zn-superoxid-dismutase (sod),catalase og carbonsyreanhydrase,fra blod
US06/149,393 US4341867A (en) 1980-04-21 1980-05-13 Process for recovering enzymes from blood
EP80301615A EP0038393B2 (en) 1980-04-21 1980-05-16 Process for recovering enzymes from blood
JP6516080A JPS56148287A (en) 1980-04-21 1980-05-16 Recovery of enzyme from blood
DE8080301615T DE3066356D1 (en) 1980-04-21 1980-05-16 Process for recovering enzymes from blood
AT80301615T ATE6077T1 (de) 1980-04-21 1980-05-16 Verfahren zur gewinnung von enzymen aus blut.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK168880A DK144800C (da) 1980-04-21 1980-04-21 Fremgangsmaade til udvinding af enzymer,fortrinsvis cu,zn-superoxid-dismutase (sod),catalase og carbonsyreanhydrase,fra blod
DK168880 1980-04-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK168880A DK168880A (da) 1981-10-22
DK144800B true DK144800B (da) 1982-06-07
DK144800C DK144800C (da) 1982-10-25

Family

ID=8107219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK168880A DK144800C (da) 1980-04-21 1980-04-21 Fremgangsmaade til udvinding af enzymer,fortrinsvis cu,zn-superoxid-dismutase (sod),catalase og carbonsyreanhydrase,fra blod

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4341867A (da)
EP (1) EP0038393B2 (da)
JP (1) JPS56148287A (da)
AT (1) ATE6077T1 (da)
DE (1) DE3066356D1 (da)
DK (1) DK144800C (da)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3410159A1 (de) * 1984-03-20 1985-09-26 Alfred Dipl.-Biochem. 7400 Tübingen Gärtner Verfahren zur gewinnung von cu(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)zn(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)superoxiddismutase aus roten blutzellen von wirbeltieren
CA1232850A (en) * 1985-01-17 1988-02-16 Albert D. Friesen Purification of superoxide dismutase
US4940659A (en) * 1987-02-20 1990-07-10 Monoclonetics International, Inc. Screening extra-cellular body fluids for superoxide dismutase (SOD-1) for determining fetal trisomy 21 down syndrome
JPH01235588A (ja) * 1988-03-15 1989-09-20 Ube Ind Ltd 赤血球由来Ｃｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼを製造する方法
US4917108A (en) * 1988-06-29 1990-04-17 Mault James R Oxygen consumption meter
WO1990005181A1 (de) * 1988-11-07 1990-05-17 Cl-Pharma Aktiengesellschaft REINIGUNG VON Cu/Zn-SUPEROXIDDISMUTASE
JPH02139733U (da) * 1989-04-25 1990-11-21
FR2693208A1 (fr) * 1992-07-02 1994-01-07 Inocosm Laboratoires Procédé d'obtention d'une composition enzymatique d'origine végétale ainsi que composition obtenue par la mise en Óoeuvre de ce procédé.
US6150507A (en) * 1995-03-23 2000-11-21 Biopure Corporation Method for producing a purified hemoglobin product
US5691453A (en) * 1995-06-07 1997-11-25 Biopure Corporation Separation of polymerized hemoglobin from unpolymerized hemoglobin on hydroxyapatite using HPLC
US20010044588A1 (en) * 1996-02-22 2001-11-22 Mault James R. Monitoring system
US5836300A (en) * 1996-03-11 1998-11-17 Mault; James R. Metabolic gas exchange and noninvasive cardiac output monitor
US6135107A (en) * 1996-03-11 2000-10-24 Mault; James R. Metabolic gas exchange and noninvasive cardiac output monitor
US6309360B1 (en) 1997-03-17 2001-10-30 James R. Mault Respiratory calorimeter
CA2320238C (en) 1998-02-05 2011-08-23 James R. Mault Metabolic calorimeter employing respiratory gas analysis
EP1102564A1 (en) 1998-08-03 2001-05-30 MAULT, James R. Method and apparatus for respiratory gas analysis employing measurement of expired gas mass
US6406435B1 (en) 1998-11-17 2002-06-18 James R. Mault Method and apparatus for the non-invasive determination of cardiac output
JP2003527881A (ja) 1999-05-10 2003-09-24 ジェームズ アール モールト 気道ベース心臓血液搏出量モニタおよび該モニタの使用方法
US6899684B2 (en) * 1999-08-02 2005-05-31 Healthetech, Inc. Method of respiratory gas analysis using a metabolic calorimeter
US6468222B1 (en) 1999-08-02 2002-10-22 Healthetech, Inc. Metabolic calorimeter employing respiratory gas analysis
EP1217942A1 (en) 1999-09-24 2002-07-03 Healthetech, Inc. Physiological monitor and associated computation, display and communication unit
WO2001028495A2 (en) 1999-10-08 2001-04-26 Healthetech, Inc. Indirect calorimeter for weight control
US6612306B1 (en) 1999-10-13 2003-09-02 Healthetech, Inc. Respiratory nitric oxide meter
US6629934B2 (en) 2000-02-02 2003-10-07 Healthetech, Inc. Indirect calorimeter for medical applications
US6482158B2 (en) 2000-05-19 2002-11-19 Healthetech, Inc. System and method of ultrasonic mammography
CA2409501A1 (en) * 2000-05-25 2001-11-29 Healthetech, Inc. Physiological monitoring using wrist-mounted device
WO2001093743A2 (en) * 2000-06-07 2001-12-13 Healthetech, Inc. Breath ketone analyzer
CA2413657A1 (en) * 2000-06-16 2001-12-20 Healthetech, Inc. Speech recognition capability for a personal digital assistant
US6620106B2 (en) 2000-09-29 2003-09-16 Healthetech, Inc. Indirect calorimetry system
US6607387B2 (en) 2000-10-30 2003-08-19 Healthetech, Inc. Sensor system for diagnosing dental conditions
US20020138213A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-26 Mault James R. System and method of metabolic rate measurement
US20030023181A1 (en) * 2001-07-26 2003-01-30 Mault James R. Gas analyzer of the fluorescent-film type particularly useful for respiratory analysis
US20030130595A1 (en) * 2001-08-13 2003-07-10 Mault James R. Health improvement systems and methods
US20030130567A1 (en) * 2002-01-09 2003-07-10 Mault James R. Health-related devices and methods
US20030105407A1 (en) * 2001-11-30 2003-06-05 Pearce, Edwin M. Disposable flow tube for respiratory gas analysis
US20030152607A1 (en) * 2002-02-13 2003-08-14 Mault James R. Caloric management system and method with voice recognition
WO2003084395A1 (en) * 2002-04-01 2003-10-16 Healthetech, Inc. System and method of determining an individualized drug administration dosage
USD478660S1 (en) 2002-07-01 2003-08-19 Healthetech, Inc. Disposable mask with sanitation insert for a respiratory analyzer
US8273347B2 (en) 2003-05-13 2012-09-25 Depuy Spine, Inc. Autologous treatment of degenerated disc with cells
US7429378B2 (en) * 2003-05-13 2008-09-30 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of high affinity anti-MMP inhibitors
US20040229878A1 (en) * 2003-05-13 2004-11-18 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of specific inhibitors of P38 kinase
US7553827B2 (en) * 2003-08-13 2009-06-30 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of cycline compounds
US7344716B2 (en) * 2003-05-13 2008-03-18 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of specific inhibitors of pro-inflammatory cytokines
US8361467B2 (en) 2003-07-30 2013-01-29 Depuy Spine, Inc. Trans-capsular administration of high specificity cytokine inhibitors into orthopedic joints
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
US8882668B2 (en) 2007-11-19 2014-11-11 Elizabeth S. Thompson Method and process for body composition management
US20090162351A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of inhibitors of p38 MAP kinase
US8986696B2 (en) * 2007-12-21 2015-03-24 Depuy Mitek, Inc. Trans-capsular administration of p38 map kinase inhibitors into orthopedic joints
CN107041863A (zh) * 2017-04-21 2017-08-15 北京汉方淑华美容化妆品有限公司 一种抗皱乳液及其制备方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB720232A (en) 1952-08-07 1954-12-15 Armour & Co Preparation of catalase
US3335068A (en) 1963-07-22 1967-08-08 Novo Terapeutisk Labor As Process in the recovery of plasminogen from a blood component of mammalian animals
IL32097A (en) * 1968-05-13 1973-08-29 Diagnostic Data Inc Isolation of orgotein from blood
US3579495A (en) * 1970-04-24 1971-05-18 Diagnostic Data Inc Isolation of orgotein from blood
US3763137A (en) * 1971-12-07 1973-10-02 Diagnostic Data Inc Isolation of orgotein from red blood cells
US3813289A (en) * 1972-07-19 1974-05-28 Diagnostic Data Inc Orgotein from red blood cells
SE7513987L (sv) 1975-12-11 1977-06-12 Paul Goran Sigvard Lindroos Sett att behandla vetskor innehallande blodsubstanser

Also Published As

Publication number Publication date
US4341867A (en) 1982-07-27
EP0038393A1 (en) 1981-10-28
JPS56148287A (en) 1981-11-17
ATE6077T1 (de) 1984-02-15
JPS6253147B2 (da) 1987-11-09
DE3066356D1 (en) 1984-03-08
EP0038393B2 (en) 1988-12-07
EP0038393B1 (en) 1984-02-01
DK144800C (da) 1982-10-25
DK168880A (da) 1981-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK144800B (da) Fremgangsmaade til udvinding af enzymer fortrinsvis cu,znsuperoxid-dismutase (sod) catalas og carbonsyreanhydrase fra blod
US4086222A (en) Method of isolating albumin from blood products
JPH0133158B2 (da)
EP0208215B1 (en) Purification of blood clotting factors and other blood proteins on non-carbohydrate sulfated matrices
US5679776A (en) Process for preparing a concentrate of blood coagulation factor VIII-von willebrand factor complex from total plasma
JP3438735B2 (ja) 上清ｉｖ、特にｉｖ−４またはコーンフラクションｖまたはそれと類似の上清または画分からヒトアルブミンを単離する方法
JP3768485B2 (ja) 血清アルブミンの精製方法
WO2011085598A1 (zh) 从血浆组分四沉淀中制备高纯ApoA-Ⅰ的生产工艺
JPH0533239B2 (da)
DK167271B1 (da) Fremgangsmaade til fremstilling af et antithrombin iii- eller antithrombin iii-haperinoid-koncentrat
Bjork et al. Fractionation of snake venom by the gel-filtration method
US4388406A (en) Process for isolating Cu,Zn-superoxide dismutase from aqueous solutions containing said enzyme together with accompanying proteins
US4390628A (en) Process for isolating Cu, Zn-superoxide dismutase from aqueous solutions containing said enzyme together with accompanying proteins
Lanzillo et al. Large-scale purification of angiotensin I-converting enzyme from human plasma utilizing an immunoadsorbent affinity gel
JPH0151997B2 (da)
EP0188053A2 (en) Purification of superoxide dismutase
WO2002008249A1 (fr) Procede de purification de la proteine de liaison a l&#39;ion calcium
JPS58159420A (ja) インタ−ロイキン２の精製法
Hagihara et al. CRYSTALLINE CYTOCHROME C IV. CRYSTALLIZATION OF BEEF KIDNEY CYTOCHROME C
WO1982002834A1 (en) Process for recovering interferon
CA1076026A (en) Method of isolating albumin from blood products
JPH0361440B2 (da)
CN112778411A (zh) 一种天然β2-微球蛋白的提取方法
JP2722140B2 (ja) ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法
EP0170162A2 (en) Method for the purification of leukocytosis-promoting factor haemagglutinin

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed
B1 Patent granted (law 1993)
PBP Patent lapsed