BG61895B2 - хомогенен човешки интерлевкин 2 - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до човешки интерлевкин 2(ИЛ-2), получен от индуцирани човешки злокачествениклетки и пречистен до хомогенност, като се използва многостепенна високоефективна течна хроматография (HPLC). Пречистеният ИЛ-2 проявява силна активност, като увеличава дълготрайното култивиране in vitro на антигенни специфични ефекторни Т-лимфоцитии стимулира модулирането на лимфоцитната реактивоспособност.

Description

Това е продължение на заявка № 06/653 165, заявена на 24.09.1984 г., която е разделена от заявка Ne: 06/418 927, заявена на 16.09. 1982 г., сега патент US 4 490 289.

Предшестващо състояние на техниката

Интерлевкин-2 (ИЛ-2) е разтворим протеин, който е способен да модулира лимфоцитната реактивност и да увеличава продължителното in vitro култивиране на антигенспецифични ефекторни Т-лимфоцити (митогенеза) и досега е бил получаван чрез стимулиране на лимфоцитни клетки от мишка, плъх или човек с митоген. Например в Morgan et al., в “Selective in vitro Growth of T-Lymphocytes from Normal Human Bone Marrows”, 193 Science 1007 (1976) и Ruscetti et al., в “Functional and Morphological Characterization of Human T Cells Continuously Grown in vitro”, 119 The Journal of Immunology 131 (1977), дискутират метод за култивиране на утаени нормални човешки лимфоцити в среда на Roswell Park Memorial Unstitute (съкратено RPMI), съдържаща автологичен серум и митогенен фитохемаглутинин (ФХА). Gillis и Smith в “Long Term Culture of Tumor-Specific Cytotoxic T Cells” 268, Nature, 154 (1977) съобщават получаването на миши ИЛ-2 чрез стимулиране на клетки от далак на нормални DBA/2 мишки с митогенен конканавалин A (Con А) в културална среда RPMI 1640, съдържаща зародишен говежди серум (FCS).

Farrar et al. в “Biological Relationship of Thymocyte Mitogenic Factor and Factor Enhancing Humoral and Cell-Mediated Immune Responses” 121 The Journal of Immunology 1353 (1978), също разкриват получаване на ИЛ-2 от клетки на миши далак, инкубирани с Con А в културална тьканна среда, която съдържа нормален миши серум (NMS). Gillis et al. описват производство на ИЛ-2 от клетки от далак на мишка и плъх, култивирани в RPMI 1640 тъканна културална среда, обогатена с горещо инактивиран FCS, пеницилин Γ и гентамицин. Клетките от далак на мишка и плъх се стиму лират чрез различни митогени, включително Con А, ФХА и Phytolacca americana митоген (РКМ), както е описано в “T-Cell Growth Factor: Parameters of Production and a Quantative Microassay for Activity”, 120 The Journal of Immunology 2027 (1978).

ИЛ-2 е получен от човешки периферни кръвни мононуклеарни клетки чрез култивиране на клетките в среда на RPM1 1640, обогатена с автологичен човешки серум, пеницилин Γ, гентамицин, пресен L-глутамин и ФХА (Gillis et al., “Biochemical Characterization of Lymphocyte Regulatory Molecules-II. Purification of a Class of Rat and Human Lymphokines,

124 The Journal of Immunology 1954, (1980).

(Gillis et al., “Biochemical Chaaracterization of Lymphocyte Regulatory Molecules-III, The Isolation and Phenotypic Characterization of Interleukin-2 Producing T Cell Lymphomas”,

125 The Journal of Immunology, 2570, (1980) идентифицират получаването на ИЛ-2 от Т клетка на левкемийни и лимфомни клетъчни линии, специално радиационно-индуцирана далачна лимфома на мишка B10.BR (LBRM33), култивирана в среда RPMI 1640, добавена с горещо инактивиран FCS, 2.5x10'⁵М 2мер-каптоетанол, буфер на N-2-хидрокси-пиперазин-Х1‘Х1-2-етиленсулфонова киселина (Hepes), пеницилин, стрептомицин и пресен L-глутамин. Културите се стимулират с различни митогени, включително и с II Con А и ФХА.

Известно е, че ИЛ-2, пречистен от тези нормални Т-лимфоцити от мишка, плъх и човек, запазва различни видове биологични активности включително следните: 1) Значително повишаване на тимоцитната митогенеза, известно от Watson et al., “Biochemical Characterization of Lymphocyte Regulatory Molecules1 Purification of a Class of Murine Lymphokines”, 150 Journal of Experimental Medicine 849, (1979) и Gillis et al., supra, 124, Journal of Immunology, 1954 (1980); 2) Подпомагане продължителната in vitro пролиферация на антигенни специфични хелперни или килърни Тклетъчни линии, известно от Gillis et al., supra, 268, Nature 154 (1977) и Watson, “Continuous Proliferation of Murine Antigen Specicfic Helper T Lymphocytes in Culture”, 150 Journal of Ex perimental Medicine 1510 (1979); 3) Индуциране на цитотиксична Т-лимфоцитна (CTL) реактивност и плакообразуващи клетъчни отговори в култури от оголени клетки от далак на мишка Watson et al.,, supra, 150 Journal of Experimental Medicine 849 (1979) и Gillis et al., supra, 124, The Journal of Immunology, 1954 (1980). Съответно тези идентифицирани биологични активности на ИЛ-2 показват, че е полезен за повишаване на имунните отговори и за възстановяване имунодефицитните Тклетъчни популации (оголени клетки от далак на мишка) до нормалните нива на клетката и хуморалния имунитет. Освен това тези резултати предполагат, че производството на ИЛ-2 и отговорът са важни параметри на имунологичните функции, които могат да бъдат полезни в клиничната диагностика на анормален имунитет. Нещо повече, фактът, че човешкият ИЛ-2 прави възможна in vitro пролиферацията на антигенни специфични килърни Т-клетки от човек, мишка и плъх потвърждава значението на човешкия ИЛ-2 като реагент за изследване.

Цитираните статии на Morgan et al., 193 Science 1007 (1976), Ruscetti etal., 119 The Journal of Immunology 131 (1977) и Gillis et al. 124, The Journal of Immunology, 1954 (1980), дискутират производството на ИЛ-2 в кондиционирана среда от човешки далак и периферен кръвен лимфоцит, която е стимулирана с лектин. Този начин на производство и техники обаче води до получаването на ИЛ-2 с ниски концентрации и до неговото пречистване, изискващо фракциониране на големи обеми кондиционирана среда, съдържаща ИЛ-2, за да се получат много малки количества реактивоспособен човешки ИЛ-2. Вследствие на това, не са налични достатъчни количества концентриран човешки ИЛ-2 за in vivo опити, нито за ефективно изследване за окончателното молекулно охарактеризиране на тази лимфоцитна регулаторна молекула.

В US 4 401 756, отнасящ се до “Метод за получаване на човешки интерлевкин 2” на Steven Gillis, се описва получаването на човешки ИЛ-2 чрез индуциране на злокачествена туморна клетъчна линия като линията Jurkat-FHCRC с Т-клетъчен митоген, напри мер фитохемаглутнин (ФХА), съответно в присъствие на форболов естер като форболов миристат (РМА). Частично пречистване на ИЛ2 се постига чрез процедура, включваща утаяване с амониев сулфат/диализа, гелфилтрационна хроматография (на цефадекс Г-100), йонообменна хроматография с DEAE целулоза, изоелектрично фокусиране в хоризонтален слой и аналитична SDS-полиакриламидна гелелектрофореза. По-голямата част от биологичната активност на ИЛ-2 се елуира електрофоретично от протеиновата лента (една от девет до шестнадесет отделни ленти, наблюдавани върху гела) и има молекулно тегло, приблизително 14 000 D. Съответни данни са описани във Frank et al., J.Immunol. 127, 2361 (1981), и Watson et al., Lumphokines 6, 95 (1982).

Mier и Gallo, J.Immumol. 128, 1122 (1982) и Lymphokines 6, 137 (1982) са описали пречистването на ИЛ-2 от нормални лимфоцити за получаването на “почти хомогенен материал”, како се използва препаративна SDS-гелелектрофореза като последен стадий след последователност от процедури на анионообменна хроматография и гелфилтрация. Техният продукт има молекулно тегло от 13 000 при SDSPAGE и 20-25 000 D при гелфилтрация и изоелектрична точка 6,8. Този материал е много нестабилен дори при -70°С и изисква добавянето на BSA или полиетиленгликол за запазване на активността.

В Stadler и Oppenheim, Lymphokines 6, 117, (1982) се описва ИЛ-2, пречистен от периферни кръвни мононуклеарни клетки, клетки от сливици и далак, които проявяват пълна хомогенност след пречистване с колонна хроматография, гелфилтрация и електрофокусиране. Намерени са три компонента на зареждане с pl 6,5, 7,2 и 8,2 и хетерогенността вероятно се дължи на разлики в степента на гликозилиране. В посочената литература, на стр. 127 Robb и Smith са наблюдавали единичен вид заряд на ИЛ-2, получен от Jurkat-клетъчна линия, имаща pl 8,2 (Mol.Immunol. 1981, под печат).

Техническа същност на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до човешки ИЛ-2, получен от индуцирани човешки хдокачествени клетки, които се пречистват до пълна хомогенност, като се използва многостепенна реверсивно-фазова високоефективна течна хроматография (HPLC). Използваната процедура за получаване на хомогенен продукт на ИЛ-2 съгласно изобретението включва пропускане на суровия продукт ИЛ-2 през реверсивно-фазова колона за HPLC, в която е използван силициев диоксид, свързан с метил или октил, елуиране на протеина с градиент н-пропанол в буфер, обединяване на активните фракции, както е определено в анализа, и пропускане на обединените активни фракции през реверсивно-фазова HPLC колона с дифенилсвързан силициев диоксид. В тези случаи, когато използваният суров продукт е с относително нисък титър, може да е необходимо да се повторят един или повече пъти стадиите на HPLC, за да се получи пречистване до хомогенност.

Суровите ИЛ-2 продукти се получават лесно чрез култивиране на злокачествени човешки неопластични клетки, като човешки левкемийни и лимфомни клетки, in vitro в серум, съдържащ среда, обогатена с различни добавки. Култивирането се стимулира с Т-клетъчен митоген като ФХА, при което се продуцира супернатант, който съдържа ИЛ-2. След известен период от време, например приблизително 24 h инкубиране, супернатантата се събира и обработва до пречистване на ИЛ-2 в по-концентрирана форма. Желателно е също да се използва форболов естер като форболов миристатацетат (РМА) като индуциращ агент или самостоятелно, или в комбинация с Т-клетъчен митоген като ФХА или Con А, за да се повиши продукцията на ИЛ-2. (За повече подробности виж Gillis et al., J.Exp.Med 1:52, 1701, 1980).

Клетъчни линии, които могат да бъдат използвани за получаването на суров човешки ИЛ-2, включват различни Т и В-клетъчни линии и различни Т-лимфомаклетъчни линии. Клетъчните линии се продуцират или чрез спонтанно появяване, витална инфекция, или чрез химически карциноген. Предпочитана клетъчна линия за тази цел е идентифицирана от Gillis et al., supra, като Jurkat-FHCRC левкемична човешка Т-клетъчна линия, за предпочи тане субклон на този вид, означен като H33HJJA1. Методът може също да се използва за пречистване на ИЛ-2, получен от периферни кръвни лимфоцити.

Културалната среда, използвана за получаване на суров човешки ИЛ-2 във връзка с посочените клетъчни линии може да се състои от търговски достъпна среда като Daibecco Modified Eagle Medium, RPMI среда и среда на Click. Добавките, които могат да бъдат използвани индивидуално или в комбинация с културалната среда, включват пеницилин, стрептомицин, гентамицин, пресен L-глутамин, HEEPES буфер, NaHCO₃, говежди зародишен серум (FCS) или нормален човешки серум. Първоначалната клетъчна плътност, особено когато се използват клетки на Jurkat-FHCRC, трябва да е от 5 х 10⁵ клетки/ml до 1 х 10⁷ клетки/ml, за предпочитане около 1 х ΙΟ' клетки/ml.

Условията на култивиране включват температура от порядъка на 35°-38°С, pH 7,07,4 и влажна атмосфера приблизително от 5 до 10% въглероден диоксид във въздуха. Може да се използва концентрация на ФХА митогена от около 0,5% об. до 2,0% об., за предпочитане 1% об.

Количеството на ИЛ-2, продуциран чрез стимулиране на злокачествени човешки клетки с растителен митоген, се изменя с времето. Пикови нива на ИЛ-2 се достигат приблизително за 16 до 24 h след стимулирането с ФХА. Изследването на ИЛ-2 за контролиране процеса на получаване на клетъчната култура включва определяне възможността на пробата да индуцира пролиферацията на Т-клетъчната линия. Т-клетъчната пролиферация се определя чрез измерване на инкорпорирането на тритиирантимидин. Една единица активност се дефинира с числото микролитри, присъстващи в ямка с Т-клетъчна култура, която индуцира 50% максимално тироидиново инкорпориране. Описани са специфични подробности за опитната процедура в Gillis et al., J. Imr.unol. 120, 2027 (1978) и в US заявка 249 905.

Получаването на подходящ изходен материал за осъществяване стадиите на HPLC пречистването съгласно изобретението включва утаяване на супернатантите, съдържащи

ИЛ-2, получени чрез центрофугиране на произведените индуцирани клетки посредством прибавяне на амониев сулфат до 85% насищане. Такова прибавяне е изпълнено чрез постепенно добавяне на сух амониев сулфат към супернатанта при леко разбъркване. Прибавянето на амониев сулфат за утаяване се извършва за продължителен период от време, например около 12 h. При достигане на 85% насищане слабото разбъркване продължава на студено за още един допълнителен период. Утаеният протеин се обработва чрез центрофугиране и получените пелети се ресуспендират в стерилна двойнодестилирана вода.

В един алтернативен аспект на метода ресуспендираният суров ИЛ-2 се подлага на йонообменна хроматография. Подходяща колона за тази цел е карбоксиметилирана (СМ) биогел А смола (LKB Productor, Broma Sweden) . За предпочитане колоната се обработва предварително с разтвор на зародишен говежди серум за блокиране на неспецифичните свързващи места в смолата преди прилагането на пробата, съдържаща ИЛ-2. Елуирането от колоната се извършва с буферен солев градиент. Подходящ градиент за тази цел е 50 тМ 0,5М натриев хлорид в HEPES с pH 5,5. Провежда се окончателно промиване с 0,5 М NaClHEEPES pH 5,5, за да се осигури елуирането на цялото количество активен ИЛ-2.

Обединените активни фракции от посочените стадии на йонообменната хроматография осигуряват предпочитания изходен материал за HPLC процедурите, които формират технологичния аспект на настоящото изобретение. В един алтернативен вариант на изобретението, когато е достъпна супернатанта с достатъчно висок титър от стадия с амониевия сулфат, е възможно този материал да се използва директно в първия стадий на колонната HPLC. Обаче в този случай може да е необходимо да се повторят един или двата стадия на HPLC, за да се достигне пълна хомогенност на продукта ИЛ-2.

Стадиите на HPLC в настоящия метод използват реверсивно-фазова, метил-, октил-, или дифенилсвързана силициева колона, която има размер на порите с достатъчен диаметър, за да се използва за протеините, например най малко около 150 А. Подходящият реверсивнофазови HPLC колони, които могат да се използват за процедурата на изобретението са търговски продукти. Особено предпочитани за тази цел са Protesil линията от колони, търговски достъпни от Whatman Separations Inc., Clifton, N.J.

Например, Whdtman Protesil 300 метил е колона, която съдържа триметилсилилни групи, ковалентно свързани чрез силиций-кислород-силициева връзка към повърхност от силикагел с диаметър на порите от 300 А, който е класифициран като среден размер на частиците от 8 μ. По подобен начин октилната колона Whattman Protesil Magnum има октилни групи, ковалентно свързани към силикагел с диаметър на порите 150 А, докато Whatman Protesil дифенилната колона има дифенилни групи, ковалентно свързани към повърхността на силикагел с 300 А.

Елуирането на протеините от HPLC колоните може да се осъществи по известен от нивото на техниката метод. Подходящ процес на елуиране за отделяне на свързани протеини от метилната или октилна колона, използвани в първия стадий на HPLC от метода, включва използването на градиент от нарастваща концентрация на водно-смесим нисш алканол, за предпочитане н-пропанол. Предпочитан градиент за тази цел е от 0 до 60% об./об. градиент в пиридиноцетна киселина с pH 4,0.

Подобни условия на елуиране могат да бъдат използвани заедно с дифенилната колона, прилагана във втория стадий, с изключение на това, че градиентът от нисш алканол е 20-60% об./об. Елуираният протеин може подходящо да бъде контролиран със системи за анализ, известни от нивото на техниката, например чрез използване на автоматизирана флуоресцентна система за анализ, описана от Stein и Moschera, Methods Enzymol. 78, 435, (1981).

След провеждане на стадиите на HPLC процеса или в два стадия, или когато е използван суров продукт с нисък титър, с едно или повече повтаряния на първия и/или втория стадий се получава ИЛ-2, пречистен до хомогенност. като единичен симетричен пик на био активност с добър добив.

Способността да се получи хомогенен ИЛ-2 позволява за първи път определянето на аминокиселинния състав и последователността на тази молекула. Тази информация е важна при подпомагане клонирането на човешкия ИЛ-2 ген и за основното производство на големи количества от чист рекомбинантен ИЛ-2 за клинични изследвания, предимно за широко разпространена медицинска употреба на това вещество. Нещо повече, наличността на хомогенен ИЛ-2 ще позволи точни биологични изследвания на неговата активност, свободен от онечиствания на различни видове лимфокин, които са известни като ко-продуцирани с ИЛ2 по време на посочения процес. Докато в нивото на техниката се претендира за получаване на високопречистен или почти хомогенен ИЛ-2 продукт, опитите показват, че когато материал, означава като материал с единична лента върху SDS-PAGE аналитична електрофореза, се използва като изходен материал в настоящия HPLC процес върху метилна или октилна колона, лентата се разделя на голям брой протеинови пикове, които не са свързани с активността на ИЛ-2. На основата на тези наблюдения се счита, че тези препарати са с не повече от 10% чистота и в някои случаи дори са с по-малко от 1 % чистота.

Опитите с частично пречистени ИЛ-2 препарати, получени от Jurkat-FHCRC клетъчна линия, са показали, че частично пречистеният лимфокин не предизвиква пролиферацията на пресни периферни кръвни лимфоцити, но индуцира пролиферация в Т-лимфоцитни популации, предварително стимулирани с лектини или специфични антигени. Освен това е установено, че частично пречистен човешки ИЛ-2 поддържа пролиферацията не само на човешки антигенспецифични ефекторни Т-клетки, но също и на миши антигенспецифични ефекторни Т-клетки. Така продуцираният JurkatFHCRC човешки ИЛ-2, дори частично пречистен, може да е полезен реагент за употреба при растежа на клонални човешки и миши Тклетки с различни антигени и ефекторни спесификации и сега е търговски артикул за такава употреба. Хомогенният ИЛ-2 съгласно изобретението може също да се използва по подо бен начин.

Методът и продуктът на настоящото изобретение се илюстрират със следващите примери.

Пример 1. Получаване на интерлевкин 2(ИЛ-2)

Клетки НЗЗНа-JAJ (ATCC#CRL-8163, депозирани на 26.08.1982 г.), които са клонирани от родителска Jurkat-FHCRC клетъчна линия, се развиват в среда на RPMI 1640, обогатена с 10% зародишен говежди серум, 50 U/ml пеницилин, 50 pg/ml стрептомицин, 50 pg/ml гентамицин и 300 pg/ml пресен Lглутамин. Клетките растат в обеми по 150 ml в Т-колби по 175 cm² (Coming Plastics) при 37°С във влажна атмосфера с 5% СО2 във въздуха. Клетки с плътност на насищане 8-10 х 10⁵ клетки/ml се събират, центрофугират и ресуспендират в прясна среда RPMI 1640 ез серум, но съдържаща 50 U/ml пеницилин, 50 pg/ml стрептомицин, 50 pg/ml гентамицин и 300pg/ml пресен L-глутамин. Клетките се ресуспендират до концентрация от 2 х 10⁶ клетки/ml. Тези клетки след това се поставят в пресни колби Т 175 cm² (със 150 ml обем и се стимулират чрез прибавянето на 1 % ФХА на обем (Gibco Diagnostics) и 10 ng/ml формобов миристатацетат (РМА, Sigma Chemical Corp. St.Louis, Mo). След 24 h инкубиране при 37°C във влажна атмосфера от 5% С02 във въздуха индуцираните клетки се събират и центрофугират и супернатантите се запазват като суров изходен материал.

Обединените супернатанти от три клетъчнокултурални фракции (от 1 до 3), съдържащи всяка 900 ml, 900 ml и 1050 ml, или общо 2 850 ml супернатанта, обедненият материал с обща активност, на 7.125 х 10⁶ Units, както е определена по метода на Gillis et al., J.Immunol., 120, 2027 (1978), се обработва чрез степенно прибавяне на сух амониев сулфат до 85% насищане при слабо разбъркване. Прибавянето на амониев сулфат се провежда за период от 12 h. Щом като разтворът достигне 85% насищане, разбъркването продължава при 4°С допълнително още 24 h. Наличният протеин в супернатантата се пелетизира чрез центрофугиране 30 min при 10,000xG. Супернатантите се отдекантират и отстраняват. Пеле тите се ресуспендират до 40 ml с двойнодестилирана стерилна вода и полученият разтвор съдържа 205000 U/ml ИЛ-2 или общо 8,2 х 10⁶ Units. Обичайно е тоталната активност да се повишава в някои от стадиите на концентрация и пречистване.

Провеждат се допълнителни серии от процеса, както е систематизирано в таблица 1.

Таблица 1

Фракция	Супернатант обем ml	Обединена активност U/ml	Общо Units х 106	Ресуспендиран обем ml	Актив- ност U/ml	Обща активност U х 106
4 5	1200 ---1_ 250 ---Г	6500	9,425	55	200 000	11
6 7	1200 ---1 700 ---*	6500	12,35	80	163,840	13,107

(Свързаните серии са обединени)

Пример 2. Йонообменна хроматография на СМ биогел А колона

А. Подготвяне на колоната.

Смола за колона (СМ биогел A, LKB Productor, Broma, Sweden) се буферира в 0,05 М NaCl-HEPES с pH 5,5, колоната (100 ml) се излива и после един обем от колоната от 100 ml 0,05 М NaCl-HEPES с pH 5,5, съдържаща 10% FCS, се прилага към колоната. Това се прави, за да се блокират неспецифичните свързващи места, които могат да ограничат активността на човешкия ИЛ-2. След това се елуират серумните протеини, които са се свързали към колоната, чрез прибавяне на 5 колонни обема 0,5 М NaCl-HEPES с pH 5,5. След то-ва колоната отново се буферира с 10 обема 0,05 М NaCl.

Б. Използване на пробата и хроматография.

Обединените ресуспензии от протеин, утаен с амониев сулфат, състоящ се от фракции 1 -5 от пример 1, се прилагат на СМ колона. След това колоната се промива с 2 колонни обема от 0,05 М NaCl-HEPES с pH 5,5. Към колоната се прилага 500 ml низходящ солеви градиент от 50 mM NaCl-HEPES с pH 5,5. След прилагането на градиента колоната се проми45 ва с 200 ml 0,5 М NaCl-HEPES с pH 5,5, за да се осигури наистина елуирането от колоната на всичкия свързан ИЛ-2. Получават се фракции, всяка от по 5 ml. Всяка трета фракция се анализира за ИЛ-2 активност. Определя се пи30 ковата активност и активните фракции се утаяват. Така се получава пул от 36 ml, имащ активност от 983,040 U/ml или обща активност от 35.39 х 10⁶ Units.

Втора фракция от СМ колона с ресус35 пендираните преципитати от амониев сулфат от обединените фракции 6 и 7 на пример 1 осигурява обединени фракции, имащи обем 215 ml, активност 80 000 U/ml и тотална активност 17,2 х 10⁶ Units.

Приготвя се партида А за следващо пречистване чрез смесване на 36 ml, получени от първия цикъл, и порция от 130 ml от втория цикъл и така се получават 866 ml суров ИЛ-2, имащ общо 10,4 х 10⁶ Units, когато се анализира при получаването.

Пример 3. Реверсивно-фазова високоефективна течна хроматография с октилна колона.

Партида А, получена в пример 2, се изпомпва директно към 9,4 х 250 mm октилна колона Magnium 9 Protesil (Whatman Separa tions Inc., Clifton, N.J.), като се използва маркираща обогателителна техника. След това колоната се промива с 50 ml буфер от 0,9 М оцетна киселина/0,2 М пиридин с pH 4,0. Елуирането на протеините се изпълнява с пропускане на градиент от 0-60% об./об. н-пропанол над 8 h в 0,9 М оцетна киселина/0,2 М пиридинов pH 4 буфер. Автоматизирана флуоресцентна детекционна система, която използва флуорескамин, контролира протеина в ефлуентите на колоната (Stein et al., supra). Извличането на биологичната активност е 7,13 х 10⁶ Units (приблизително 70%).

Пример 4. Реверсивно-фазова високоефективна течна хроматография с дифенилна колона.

Фракциите, съдържащи главните пикове на активността, получени в пример 3, се обединяват, разреждат се 1:1 (об./об.) с 0,9 М оцетна киселина/0,2 М пиридин с pH 4,0 и се изпомпват в 4,6 х 250 mm Whatman Protesil дифенилна колона. Протеините се елуират с 20-60% н-пропанолов градиент от 0,9 М оцетна киселина/0,2 М пиридин, с pH 4,0 буфер над 6 1/2 h. Тази процедура дава симетричен пик, $ съответстващ на ИЛ-2 активността. Извличането на активността в този етап е по-висока от 60%. Пълната хомогенност на този продукт се потвърждава чрез аналитична SDSPAGE електрофореза и две дименсионални гелелектрофорези, които водят до получаване на единична ивица и съответно на единично петно.

Проби от този материал се подлагат на 15 аминокиселинен анализ осъществен с флуорескаминово доказване (виж Stein et al.. Arch. Biochem.Biophys., 155,203 (1973). Патипептидът се хидролизира за 24 и 48 h при 104°С в постоянно кипяща НС1, съдържаща 0.1% тиогликолова киселина. Резултатите са резюмирани по-долу в таблица 2.

Таблица 2

Аминокикиселинен състав на 24 часа 24 часа 48 часа ИЛ-2

Asp	12.3	11.8	11.8	12
Thr	8.6	9.6	7.4	10
Ser	7.5	5.2	7.3	8
Glu	18.3	15.4	16.0	16-17
Pro	9.7	10.7	-	8-9
Gly	7.5	6.3	10.8	8
Ala	7.5	6.0	8.4	7
Cys				4-5*
Vai	5.0	5.5	5.2	6
Met	4.3	3.3	3.1	4
Пе	5.0	7.5	6.3	7
Leu	13.7	19.4	16.0	16
Tyr	2.4	1.7	4.2	3
Phe	4.6	4.1	6.4	5
His	4.4	3.8	4.9	4
Lys	7.9	8.6	7.9	8
Arg	3.9	3.9	7.5	4
				общо 130-133
* 24-часова хидролиза на отделна проба

Хомогенният човешки ИЛ-2, получен, както е описано по-горе, има специфична активност около 1.4 х 10⁹U/mg и pl 5.68.

Claims (2)

1. Патентни претенции

   1. Човешки интерлевкин-2 като хомогенен протеин, който има специфична активност около 1,4 х 10’ U/mg, pl около 5,68 и представлява следния аминокиселинен състав:

   Asp - 12

   Thr - 10

   Ser - 8

   Glu - 16-17

   Pro - 8-9

   Gly - 8

   Ala - 7

   Cys - 4-5

   Vai - 6

   Met - 4 lie - 7

   Leu - 16

   Tyr - 3

   Phe - 5

   His - 4

   Lys - 8

   Arg - 4
2. 2. Човешки интерлевкин-2 съгласно претенция 1 като хомогенен протеин.

   Издание на Патентното ведомство на Република България

   1113 София, бул. Д-р Γ. М. Димитров 52-Б

   Експерт: Св.Йорданова

   Пор. № 39118

   Редактор: Н.Божинова