JPH0678239B2 - インターロイキン−２を含有する医薬組成物 - Google Patents
インターロイキン−２を含有する医薬組成物Info
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- JPH0678239B2 JPH0678239B2 JP3288739A JP28873991A JPH0678239B2 JP H0678239 B2 JPH0678239 B2 JP H0678239B2 JP 3288739 A JP3288739 A JP 3288739A JP 28873991 A JP28873991 A JP 28873991A JP H0678239 B2 JPH0678239 B2 JP H0678239B2
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- C07K14/55—IL-2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は医薬の分野に関する。
さらに詳しくは、これは微生物的に製造されたインター
ロイキン−２の医薬製剤に関する。
さらに詳しくは、これは微生物的に製造されたインター
ロイキン−２の医薬製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】インターロイキン−２、すなわち正常な
末梢血リンパ球により生産され、そして植物レクチン、
抗原、又は他の刺激物質に暴露された後抗原又はマイト
ジェンで刺激されたＴ細胞の増殖を誘導するリンホカイ
ンは、Morgan、D.A.等、Sciense (1976) 193：1007-100
8 により最初に記載された。
末梢血リンパ球により生産され、そして植物レクチン、
抗原、又は他の刺激物質に暴露された後抗原又はマイト
ジェンで刺激されたＴ細胞の増殖を誘導するリンホカイ
ンは、Morgan、D.A.等、Sciense (1976) 193：1007-100
8 により最初に記載された。
【０００３】そして、刺激されたＴリンパ球の増殖を誘
導するその能力のためにＴ細胞増殖因子と呼ばれるが、
今やその増殖因子性に加えて、このものはイン−ビトロ
及びイン−ビボで免疫系細胞の種々の機能を調節するこ
とが認識され、そしてインターロイキン−２（ＩＬ−
２）と称されている。ＩＬ−２は、免疫細胞の相互作用
及び機能を仲介する、リンパ球により生産される幾つか
のメッセンジャー−制御分子の１つである。
導するその能力のためにＴ細胞増殖因子と呼ばれるが、
今やその増殖因子性に加えて、このものはイン−ビトロ
及びイン−ビボで免疫系細胞の種々の機能を調節するこ
とが認識され、そしてインターロイキン−２（ＩＬ−
２）と称されている。ＩＬ−２は、免疫細胞の相互作用
及び機能を仲介する、リンパ球により生産される幾つか
のメッセンジャー−制御分子の１つである。
【０００４】ＩＬ−２は最初ヒト末梢血リンパ球（ＰＢ
Ｌ）又は他のＩＬ−２生産性セルラインを培養すること
により作られた。例えば、米国特許No.4,401,756を参照
のこと。組換ＤＮＡ技法はＰＢＬ及びＩＬ−２生産セル
ラインの代替物を提供した。タニグチ、T.等、Nature
(1983) 302 : 305-310 、及び Devos、R.、Nucleic Aci
ds Research（1983) 11：4307−4323はヒトＩＬ−２遺
伝子のクローニング及び微生物中でのその発現を報告し
た。
Ｌ）又は他のＩＬ−２生産性セルラインを培養すること
により作られた。例えば、米国特許No.4,401,756を参照
のこと。組換ＤＮＡ技法はＰＢＬ及びＩＬ−２生産セル
ラインの代替物を提供した。タニグチ、T.等、Nature
(1983) 302 : 305-310 、及び Devos、R.、Nucleic Aci
ds Research（1983) 11：4307−4323はヒトＩＬ−２遺
伝子のクローニング及び微生物中でのその発現を報告し
た。
【０００５】1983年11月14日に許可されたベルギー特許
No.898,016は、野生型又は天然分子の１２５位に通常存
在するシステインが除去され又はセリンのごとき中性ア
ミノ酸により置き換えられているＩＬ−２のムテインを
記載している。これらのムテインはＩＬ−２生物活性を
有する。このベルギー特許は、該組換ムテインがこれら
を水性ビヒクルと混合し、そして静脈内、皮下等に注射
することにより天然ＩＬ−２と同様に製剤化されそして
投与され得ることを記載している。
No.898,016は、野生型又は天然分子の１２５位に通常存
在するシステインが除去され又はセリンのごとき中性ア
ミノ酸により置き換えられているＩＬ−２のムテインを
記載している。これらのムテインはＩＬ−２生物活性を
有する。このベルギー特許は、該組換ムテインがこれら
を水性ビヒクルと混合し、そして静脈内、皮下等に注射
することにより天然ＩＬ−２と同様に製剤化されそして
投与され得ることを記載している。
【０００６】
【本発明の概要】この本発明の１つの観点は、ＩＬ−２
療法をもたらすために患者に非経腸的に投与するために
医薬として許容される水性ビヒクル中に再構成（recons
titute)することができるＩＬ−２組成物に関し、この
組成物は： (a) 非−ＩＬ−２蛋白質を実質的に含有しない酸化され
た微生物的に生産された組換ＩＬ−２の医療的に有効な
量： (b) 該微生物的に生産されたＩＬ−２の安定性に不都合
な影響を与えない医薬として許容される水溶性担体：及
び、 (c) 前記微生物的に生産された組換ＩＬ−２の水溶性を
確保するのに十分な量の界面活性剤、例えばアルカリ金
属硫酸塩、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、
アルカリ金属サルコシネート、又はデオキシコール酸ナ
トリウム： を含んで成る。
療法をもたらすために患者に非経腸的に投与するために
医薬として許容される水性ビヒクル中に再構成（recons
titute)することができるＩＬ−２組成物に関し、この
組成物は： (a) 非−ＩＬ−２蛋白質を実質的に含有しない酸化され
た微生物的に生産された組換ＩＬ−２の医療的に有効な
量： (b) 該微生物的に生産されたＩＬ−２の安定性に不都合
な影響を与えない医薬として許容される水溶性担体：及
び、 (c) 前記微生物的に生産された組換ＩＬ−２の水溶性を
確保するのに十分な量の界面活性剤、例えばアルカリ金
属硫酸塩、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、
アルカリ金属サルコシネート、又はデオキシコール酸ナ
トリウム： を含んで成る。
【０００７】好ましくは、組換ＩＬ−２が選択的に酸化
され、分子が生物的に活性であるように５８位及び１０
５位のシステインがジスルフィド結合を形成する。この
発明の他の観点は患者に治療をもたらす医薬組成物であ
り、この組成物は： (a) 上記の混合物と： (b) 該混合物が溶解している医薬として許容される水性
非経腸ビヒクル： を含んで成り、この溶液はml当たり約0.01mg〜約２mgの
範囲の微生物的に生産された組換ＩＬ−２を含有する。
図１は、微生物的に生産された組換ＩＬ−２を処理しそ
して精製するための好ましい方法の流れ図である。
され、分子が生物的に活性であるように５８位及び１０
５位のシステインがジスルフィド結合を形成する。この
発明の他の観点は患者に治療をもたらす医薬組成物であ
り、この組成物は： (a) 上記の混合物と： (b) 該混合物が溶解している医薬として許容される水性
非経腸ビヒクル： を含んで成り、この溶液はml当たり約0.01mg〜約２mgの
範囲の微生物的に生産された組換ＩＬ−２を含有する。
図１は、微生物的に生産された組換ＩＬ−２を処理しそ
して精製するための好ましい方法の流れ図である。
【０００８】
【具体的な記載】ここで使用する場合、“ＩＬ−２”な
る語は、(a) ５８位及び１０５位のシステインのジスル
フィド結合を含む天然ヒトインターロイキン−２のアミ
ノ酸配列と少なくとも実質的に同一なアミノ酸配列を有
し、そして(b) 天然−ヒトインターロイキン−２と共通
の生物学的活性を有する蛋白質をコードするヒトインタ
ーロイキン−２ＤＮＡ配列又は該ヒト−インターロイキ
ン−２ＤＮＡ配列の変形物により形質転換された微生物
により生産される非グリコシル化蛋白質を意味する。
る語は、(a) ５８位及び１０５位のシステインのジスル
フィド結合を含む天然ヒトインターロイキン−２のアミ
ノ酸配列と少なくとも実質的に同一なアミノ酸配列を有
し、そして(b) 天然−ヒトインターロイキン−２と共通
の生物学的活性を有する蛋白質をコードするヒトインタ
ーロイキン−２ＤＮＡ配列又は該ヒト−インターロイキ
ン−２ＤＮＡ配列の変形物により形質転換された微生物
により生産される非グリコシル化蛋白質を意味する。
【０００９】アミノ酸配列の実質上同一とは、配列が同
一であるか、あるいは合成蛋白質と天然ヒト−インター
ロイキン−２との間の不都合な機能的非類似性を惹起し
ない１個又はそれより多くのアミノ酸の変化（欠失、付
加、置換）により異なることを意味する。このような蛋
白質の例は、1983年２月３日に出願されたヨーロッパ特
許出願No.83101035.0 (1983 年10月19日公開 No.9153
9)、及び1982年12月22日に出願されたヨーロッパ特許出
願No.82307036.2 (1983 年９月14日公開No.88195) に記
載されている組換ＩＬ−２；ベルギー特許No.893,016に
対応する1983年10月13日に出願されたヨーロッパ特許出
願No.83306221.9 (1984 年５月30日公開No.109748)に記
載されている組換ＩＬ−２ムテイン；並びにこの出願に
記載されている組換ＩＬ−２である。
一であるか、あるいは合成蛋白質と天然ヒト−インター
ロイキン−２との間の不都合な機能的非類似性を惹起し
ない１個又はそれより多くのアミノ酸の変化（欠失、付
加、置換）により異なることを意味する。このような蛋
白質の例は、1983年２月３日に出願されたヨーロッパ特
許出願No.83101035.0 (1983 年10月19日公開 No.9153
9)、及び1982年12月22日に出願されたヨーロッパ特許出
願No.82307036.2 (1983 年９月14日公開No.88195) に記
載されている組換ＩＬ−２；ベルギー特許No.893,016に
対応する1983年10月13日に出願されたヨーロッパ特許出
願No.83306221.9 (1984 年５月30日公開No.109748)に記
載されている組換ＩＬ−２ムテイン；並びにこの出願に
記載されている組換ＩＬ−２である。
【００１０】ここで使用する場合、“形質転換された微
生物”なる語は、天然ヒト−インターロイキン−２活性
を有する蛋白質を生産するために遺伝子操作されている
微生物を意味する。形質転換された微生物の例は前記ヨ
ーロッパ特許出願公開No.88,198 、No.91,539 、及びN
o.109,748に記載されている。ＩＬ−２を生産するため
に細菌が好ましい。
生物”なる語は、天然ヒト−インターロイキン−２活性
を有する蛋白質を生産するために遺伝子操作されている
微生物を意味する。形質転換された微生物の例は前記ヨ
ーロッパ特許出願公開No.88,198 、No.91,539 、及びN
o.109,748に記載されている。ＩＬ−２を生産するため
に細菌が好ましい。
【００１１】この発明において有用な典型的な形質転換
された微生物は、プラスミドｐＬＷＩにより形質転換さ
れたE.コリ (E.coli) Ｋ−１２株 MM294 (1983年８月４
日にシタス・コーポレーションによりブタペスト条約の
規定のもとにアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレ
クションに寄託されており、そして受託番号39,405を有
する) である。合成組換ＩＬ−２はまた、適切に形質転
換された酵母及び哺乳動物細胞によっても生産され得
る。E.コリが特に好ましい宿主生物である。
された微生物は、プラスミドｐＬＷＩにより形質転換さ
れたE.コリ (E.coli) Ｋ−１２株 MM294 (1983年８月４
日にシタス・コーポレーションによりブタペスト条約の
規定のもとにアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレ
クションに寄託されており、そして受託番号39,405を有
する) である。合成組換ＩＬ−２はまた、適切に形質転
換された酵母及び哺乳動物細胞によっても生産され得
る。E.コリが特に好ましい宿主生物である。
【００１２】形質転換された微生物を、適当な増殖培地
中で、典型的には６８０nmにて少なくとも約３０、そし
て好ましくは６８０nmにおいて約２０〜約４０の光学濃
度に増殖せしめる。増殖培地の組成は関与する特定の微
生物に依存するであろう。培地は、微生物の栄養的要求
を満たす化合物を含有する水性培地である。増殖培地は
典型的には資化性の炭素及び窒素源、エネルギー源、マ
グネシウム、カリウム及びナトリウムイオン、並びに場
合によってはアミノ酸、及びプリン及びピリミジン塩基
を含有するであろう〔Review of Medical Biology 、La
nge Medical Publications、第１４版 8９〜９５頁(198
0)を参照のこと。〕。
中で、典型的には６８０nmにて少なくとも約３０、そし
て好ましくは６８０nmにおいて約２０〜約４０の光学濃
度に増殖せしめる。増殖培地の組成は関与する特定の微
生物に依存するであろう。培地は、微生物の栄養的要求
を満たす化合物を含有する水性培地である。増殖培地は
典型的には資化性の炭素及び窒素源、エネルギー源、マ
グネシウム、カリウム及びナトリウムイオン、並びに場
合によってはアミノ酸、及びプリン及びピリミジン塩基
を含有するであろう〔Review of Medical Biology 、La
nge Medical Publications、第１４版 8９〜９５頁(198
0)を参照のこと。〕。
【００１３】ｔｒｐプロモーターを用いる発現ベクター
においては、培地中のトリプトファン濃度が、ＩＬ−２
発現が望まれる時点で制限されるように注意深く調節さ
れる。E.コリのための増殖培地は当業者においてよく知
られている。好ましい増殖培地は1985年２月12日に許可
された米国特許No.4,499,188に記載されている。
においては、培地中のトリプトファン濃度が、ＩＬ−２
発現が望まれる時点で制限されるように注意深く調節さ
れる。E.コリのための増殖培地は当業者においてよく知
られている。好ましい増殖培地は1985年２月12日に許可
された米国特許No.4,499,188に記載されている。
【００１４】培養物から細胞を収得した後、これらを必
要であれば約２０〜５００mg／ml、好ましくは８０〜１
００mg／ml（６８０nmにおいて、ＯＤ４０〜２００、好
ましくは１６０〜２００）に、濾過、遠心分離、又は常
法により濃縮する。
要であれば約２０〜５００mg／ml、好ましくは８０〜１
００mg／ml（６８０nmにおいて、ＯＤ４０〜２００、好
ましくは１６０〜２００）に、濾過、遠心分離、又は常
法により濃縮する。
【００１５】濃縮に続き、微生物の細胞膜を破壊する。
この破壊の主たる目的は次の抽出及び可溶化段階を促進
することである。この方法のこの段階においては、常用
の細胞破壊技法、例えばホモジナイズ、超音波処理、又
は加圧循環を使用することができる。好ましい方法はマ
ントン−ガウリン(Manton-Gaulin) ホモジナイザーを用
いる超音波処理又はホモジナイズである。
この破壊の主たる目的は次の抽出及び可溶化段階を促進
することである。この方法のこの段階においては、常用
の細胞破壊技法、例えばホモジナイズ、超音波処理、又
は加圧循環を使用することができる。好ましい方法はマ
ントン−ガウリン(Manton-Gaulin) ホモジナイザーを用
いる超音波処理又はホモジナイズである。
【００１６】破砕段階の終点は光学濃度によりモニター
することができ、懸濁液の光学濃度が典型的には約６５
％〜８５％低下する。いずれにしても、無傷の細胞が可
溶化段階に持ち込まれないように実質上すべての細胞を
破壊すべきである。所望により、破砕の前に濃縮物の液
相のpHを、次の段階において、組換ＩＬ−２蛋白質を細
胞破片中に不溶性複合体として残しながらE.コリ蛋白質
の除去を促進するレベルに調整する。pHは適当な緩衝液
を添加することによってそのように調整することができ
る。ほとんどの場合、約８〜約8.5 の範囲のが使用され
よう。
することができ、懸濁液の光学濃度が典型的には約６５
％〜８５％低下する。いずれにしても、無傷の細胞が可
溶化段階に持ち込まれないように実質上すべての細胞を
破壊すべきである。所望により、破砕の前に濃縮物の液
相のpHを、次の段階において、組換ＩＬ−２蛋白質を細
胞破片中に不溶性複合体として残しながらE.コリ蛋白質
の除去を促進するレベルに調整する。pHは適当な緩衝液
を添加することによってそのように調整することができ
る。ほとんどの場合、約８〜約8.5 の範囲のが使用され
よう。
【００１７】図１に示すように、破砕段階に続く回収工
程の段階は、ＩＬ−２を還元状態に維持しながら良好な
収率で、高レベルの純度（好ましくは約９５％以上、そ
してさらに好ましくは約９８％以上）に、E.コリ蛋白質
からＩＬ−２を分離するために主として設計される。同
時に、これらの精製工程はさらに、相まって、最終生成
物中の発熱物質を、患者に非経腸的に投与するために許
容されると信じられるレベルに低下せしめる。
程の段階は、ＩＬ−２を還元状態に維持しながら良好な
収率で、高レベルの純度（好ましくは約９５％以上、そ
してさらに好ましくは約９８％以上）に、E.コリ蛋白質
からＩＬ−２を分離するために主として設計される。同
時に、これらの精製工程はさらに、相まって、最終生成
物中の発熱物質を、患者に非経腸的に投与するために許
容されると信じられるレベルに低下せしめる。
【００１８】細胞を破砕した後、破砕物の液相から粒状
物を分離し、そして抽出のための最適pHに緩衝化された
水性媒体中に再懸濁することができる。場合によっては
粒状物をこの段階で緩衝液により洗浄してその中の水溶
性E.コリ蛋白質を除去することができる。ともかく、抽
出にかけられる細胞懸濁液中の蛋白質濃度は通常約５〜
約６０mg／ml、好ましくは２０〜４０mg／mlの範囲であ
る。
物を分離し、そして抽出のための最適pHに緩衝化された
水性媒体中に再懸濁することができる。場合によっては
粒状物をこの段階で緩衝液により洗浄してその中の水溶
性E.コリ蛋白質を除去することができる。ともかく、抽
出にかけられる細胞懸濁液中の蛋白質濃度は通常約５〜
約６０mg／ml、好ましくは２０〜４０mg／mlの範囲であ
る。
【００１９】粒状細胞材料からのE.コリ蛋白質の抽出
は、破砕と交互に、又は破砕後にそれに続いて行うこと
ができる。これは、好ましくは破砕に続く段階として行
われる。抽出剤はチャオトロピック剤（chaotropic age
nt)(すなわち、水素結合を解離せしめ、そして蛋白質の
３次構造に影響を与える穏和な蛋白質変性剤）の水溶液
である。抽出剤は細胞破片から多量のE.コリ蛋白質を選
択的に除去し、細胞破片と会合している（含有されてい
るか又は結合している）組換ＩＬ−２の少なくとも実質
的な部分を残す。
は、破砕と交互に、又は破砕後にそれに続いて行うこと
ができる。これは、好ましくは破砕に続く段階として行
われる。抽出剤はチャオトロピック剤（chaotropic age
nt)(すなわち、水素結合を解離せしめ、そして蛋白質の
３次構造に影響を与える穏和な蛋白質変性剤）の水溶液
である。抽出剤は細胞破片から多量のE.コリ蛋白質を選
択的に除去し、細胞破片と会合している（含有されてい
るか又は結合している）組換ＩＬ−２の少なくとも実質
的な部分を残す。
【００２０】この選択性は、組換ＩＬ−２の疎水性、及
びこの蛋白質はその等電点に近いpHにおいて還元された
不溶性の状態にあるという事実により促進される。さら
に、組換ＩＬ−２の実質的な部分は、E.コリ中で高レベ
ルで発現される他のクローン化蛋白質の場合と同様に、
有意な大きさの封入体（inclusion body) としてイン−
ビボに存在するであろう。抽出剤の例は、尿素及び塩酸
グアニジンである（可溶化剤としてＳＤＳを使用する場
合、塩酸グアニジンを使用すべきでない）。尿素が好ま
しい。
びこの蛋白質はその等電点に近いpHにおいて還元された
不溶性の状態にあるという事実により促進される。さら
に、組換ＩＬ−２の実質的な部分は、E.コリ中で高レベ
ルで発現される他のクローン化蛋白質の場合と同様に、
有意な大きさの封入体（inclusion body) としてイン−
ビボに存在するであろう。抽出剤の例は、尿素及び塩酸
グアニジンである（可溶化剤としてＳＤＳを使用する場
合、塩酸グアニジンを使用すべきでない）。尿素が好ま
しい。
【００２１】抽出混合物中のチャオトロピック剤の濃度
は使用される特定の薬剤及び抽出混合物中の細胞性材料
の量に依存するであろう。尿素の場合、約 3.5〜4.5
Ｍ、好ましくは約４Ｍの濃度（最終）が２５℃における
回分法において使用されるであろう。抽出が長時間にわ
たって連続的に行われる場合、一層低い濃度を用いるの
が好ましいであろう。抽出においては通常２０℃〜２５
℃の範囲の温度が使用され、便宜上室温が使用されるで
あろう。
は使用される特定の薬剤及び抽出混合物中の細胞性材料
の量に依存するであろう。尿素の場合、約 3.5〜4.5
Ｍ、好ましくは約４Ｍの濃度（最終）が２５℃における
回分法において使用されるであろう。抽出が長時間にわ
たって連続的に行われる場合、一層低い濃度を用いるの
が好ましいであろう。抽出においては通常２０℃〜２５
℃の範囲の温度が使用され、便宜上室温が使用されるで
あろう。
【００２２】溶液と粒状物との間の接触を増強し、そし
てそうすることによって細胞破片から非−ＩＬ−２蛋白
質を抽出するために必要な時間を短縮するために、混合
が典型的に用いられるであろう。SDS-PAGEを用いて、上
清について抽出工程の速度分析が行われ、そして１５〜
３０分間までに抽出が本質上完結することが見出され
た。
てそうすることによって細胞破片から非−ＩＬ−２蛋白
質を抽出するために必要な時間を短縮するために、混合
が典型的に用いられるであろう。SDS-PAGEを用いて、上
清について抽出工程の速度分析が行われ、そして１５〜
３０分間までに抽出が本質上完結することが見出され
た。
【００２３】抽出に続き、混合物を固相と液相に分離す
る。次に、固相を、還元剤及び可溶化剤を含有する中性
水性緩衝液と接触せしめることにより固相中の組換ＩＬ
−２を可溶化する。疎水性組換ＩＬ−２を可溶化するた
めに適切な疎水性−親水性バランスを有する生理的に許
容される界面活性剤（洗剤）を用いることができる。１
０〜１４個の炭素原子を含有するアルカリ金属硫酸塩及
びアルカリ金属アルキルサルコシネートが好ましい可溶
化剤であり、ＳＤＳ及びサルコシルが特に好ましい。
る。次に、固相を、還元剤及び可溶化剤を含有する中性
水性緩衝液と接触せしめることにより固相中の組換ＩＬ
−２を可溶化する。疎水性組換ＩＬ−２を可溶化するた
めに適切な疎水性−親水性バランスを有する生理的に許
容される界面活性剤（洗剤）を用いることができる。１
０〜１４個の炭素原子を含有するアルカリ金属硫酸塩及
びアルカリ金属アルキルサルコシネートが好ましい可溶
化剤であり、ＳＤＳ及びサルコシルが特に好ましい。
【００２４】可溶化において使用される可溶化剤の量は
特定の薬剤に依存するであろう。ＳＤＳ又はサルコシル
を使用する場合、ＳＤＳ／サルコシルと固相蛋白質との
好ましい比率（Ｗ／Ｗ）は約 0.5 :１〜1.4 : １であ
る。可溶化剤にはまた、可溶化されたＩＬ−２が有意な
程度に参加されるのを防止するために十分な量の還元剤
を含有する。蛋白質還元剤、例えばジチオスレイトール
（ＤＴＴ）及び２−メルカプトエタノールを使用するこ
とができる。ＤＴＴのごとき還元剤の媒体中での濃度は
通常約５〜２０mMの範囲であろう。
特定の薬剤に依存するであろう。ＳＤＳ又はサルコシル
を使用する場合、ＳＤＳ／サルコシルと固相蛋白質との
好ましい比率（Ｗ／Ｗ）は約 0.5 :１〜1.4 : １であ
る。可溶化剤にはまた、可溶化されたＩＬ−２が有意な
程度に参加されるのを防止するために十分な量の還元剤
を含有する。蛋白質還元剤、例えばジチオスレイトール
（ＤＴＴ）及び２−メルカプトエタノールを使用するこ
とができる。ＤＴＴのごとき還元剤の媒体中での濃度は
通常約５〜２０mMの範囲であろう。
【００２５】可溶化は典型的には２０℃〜２５℃の範囲
の温度において、固相と可溶化媒体との間の接触を促進
するために混合しながら行う。一層高い温度は不所望の
E.コリ蛋白質を可溶化するであろう。サンプルが１５分
間置かれ又は溶液が半透明になった時可溶化が完了した
と考えられる。可溶化の完了後不要物を分離する。
の温度において、固相と可溶化媒体との間の接触を促進
するために混合しながら行う。一層高い温度は不所望の
E.コリ蛋白質を可溶化するであろう。サンプルが１５分
間置かれ又は溶液が半透明になった時可溶化が完了した
と考えられる。可溶化の完了後不要物を分離する。
【００２６】ＩＬ−２が可溶化される後、場合によって
はＩＬ−２を水性溶液から還元条件下で２−ブタノール
又は２−メチル−２−ブタノールにより抽出して、ＩＬ
−２と非常に近い分子量を有する幾らかの汚染物を著し
く含有する追加のE.コリ蛋白質を除去する。水性溶液及
びブタノールが実質上不混和性である条件（例えば、0.
05〜0.15の範囲のイオン強度) を用いる。有機抽出の実
施において、必要であれば、水性溶液の蛋白質濃度を好
ましくは約６mg／ml未満、好ましくは約 0.5〜４mg／ml
に調整する。
はＩＬ−２を水性溶液から還元条件下で２−ブタノール
又は２−メチル−２−ブタノールにより抽出して、ＩＬ
−２と非常に近い分子量を有する幾らかの汚染物を著し
く含有する追加のE.コリ蛋白質を除去する。水性溶液及
びブタノールが実質上不混和性である条件（例えば、0.
05〜0.15の範囲のイオン強度) を用いる。有機抽出の実
施において、必要であれば、水性溶液の蛋白質濃度を好
ましくは約６mg／ml未満、好ましくは約 0.5〜４mg／ml
に調整する。
【００２７】還元剤（例えばＤＴＴ）の存在下で抽出を
行うことによって還元条件を維持する。ブタノールは一
般に可溶化されたＩＬ−２の水性溶液に約１：１〜約
３：１（抽出剤：水溶液）の範囲の、好ましくは約１：
１の容量比において添加されるであろう。温度は一般に
２０℃〜１００℃の範囲であり、そしてpHは一般に約４
〜９、好ましくは約５〜６であろう。溶液とブタノール
との間の接触時間は臨界的ではなく、そして数分間のオ
ーダーの比較的短い時間を用いることができる。
行うことによって還元条件を維持する。ブタノールは一
般に可溶化されたＩＬ−２の水性溶液に約１：１〜約
３：１（抽出剤：水溶液）の範囲の、好ましくは約１：
１の容量比において添加されるであろう。温度は一般に
２０℃〜１００℃の範囲であり、そしてpHは一般に約４
〜９、好ましくは約５〜６であろう。溶液とブタノール
との間の接触時間は臨界的ではなく、そして数分間のオ
ーダーの比較的短い時間を用いることができる。
【００２８】抽出が完了した後、水相及びブタノール相
を分離し、そしてブタノール相からＩＬ−２を分離す
る。ブタノール相からＩＬ−２を分離するための好まし
い方法は酸沈澱である。これは、有機相が溶解するまで
（有機相の容量に対して約２〜３容量の緩衝液）ブタノ
ール相を水性緩衝液(pH 7.5)に加え、そして次にpHを約
5.5〜7.0 、好ましくは 6.0〜6.2 に低下せしめてＩＬ
−２を沈澱せしめることにより行われる。
を分離し、そしてブタノール相からＩＬ−２を分離す
る。ブタノール相からＩＬ−２を分離するための好まし
い方法は酸沈澱である。これは、有機相が溶解するまで
（有機相の容量に対して約２〜３容量の緩衝液）ブタノ
ール相を水性緩衝液(pH 7.5)に加え、そして次にpHを約
5.5〜7.0 、好ましくは 6.0〜6.2 に低下せしめてＩＬ
−２を沈澱せしめることにより行われる。
【００２９】この方法の次の段階は、組換ＩＬ−２を抽
出の後に残留するE.コリ汚染物から分離し、そして最適
には可溶化剤からも分離することである。ゲル濾過クロ
マトグラフィー、RP−HPLC、又はゲル濾過クロマトグラ
フィーとRP−HPLCとの組合わせが使用される。ゲル濾過
クロマトグラフィーは好ましくは、発熱成分、及び組換
ＩＬ−２より高いか又は低い分子量を有する蛋白質汚染
物を除去する２段階において行われる（組換ＩＬ−２は
約15.5Ｋダルトンの分子量を有する。）。
出の後に残留するE.コリ汚染物から分離し、そして最適
には可溶化剤からも分離することである。ゲル濾過クロ
マトグラフィー、RP−HPLC、又はゲル濾過クロマトグラ
フィーとRP−HPLCとの組合わせが使用される。ゲル濾過
クロマトグラフィーは好ましくは、発熱成分、及び組換
ＩＬ−２より高いか又は低い分子量を有する蛋白質汚染
物を除去する２段階において行われる（組換ＩＬ−２は
約15.5Ｋダルトンの分子量を有する。）。
【００３０】これらの汚染物からのＩＬ−２分離を可能
にするために溶液を画分することができるゲルは商業的
に入手可能である。セファクリルＳ-200は高い分子量の
成分を除去するために好ましいゲルであり、そしてセフ
ァデックスＧ−25、Ｇ−75又はＧ-100ゲルは低分子量汚
染物を除去するために好ましい。ゲル濾過は典型的に
は、約 0.1〜1.0 ％の可溶化剤及び約１〜１０mM還元剤
を含有する緩衝化溶液（pH 5.5〜7.0)中で行われる。カ
ラムは、所望の成分を適切に分けることができるような
大きさにされるであろう。
にするために溶液を画分することができるゲルは商業的
に入手可能である。セファクリルＳ-200は高い分子量の
成分を除去するために好ましいゲルであり、そしてセフ
ァデックスＧ−25、Ｇ−75又はＧ-100ゲルは低分子量汚
染物を除去するために好ましい。ゲル濾過は典型的に
は、約 0.1〜1.0 ％の可溶化剤及び約１〜１０mM還元剤
を含有する緩衝化溶液（pH 5.5〜7.0)中で行われる。カ
ラムは、所望の成分を適切に分けることができるような
大きさにされるであろう。
【００３１】RP−HPLCはゲル濾過に代わるものである。
さらに、RP−HPLCは、組換ＩＬ−２に近い分子量を有し
そしてそれ故にゲル濾過によっては完全に除去され得な
い分子を除去することができる。さらに、RP−HPLCによ
って細菌エンドトキシンのごとき汚染物も効果的に除去
される。従って、RP−HPLCはゲル濾過後の最終精製段階
として使用され得る。
さらに、RP−HPLCは、組換ＩＬ−２に近い分子量を有し
そしてそれ故にゲル濾過によっては完全に除去され得な
い分子を除去することができる。さらに、RP−HPLCによ
って細菌エンドトキシンのごとき汚染物も効果的に除去
される。従って、RP−HPLCはゲル濾過後の最終精製段階
として使用され得る。
【００３２】蛋白質の良好な分離をもたらす支持体（固
定相）がまたゲル濾過後の最終精製段階として使用され
得る。蛋白質の良好な分離をもたらす支持体（固定相）
をRP−HPLCにおいて使用することができる。Ｃ−４、Ｃ
−８又はＣ−１８の３００オングストローム孔径支持体
が好ましい支持体の例である。ＩＬ−２を溶液状に維持
するため、分離は約 2.5以下、通常は 2.1〜2.3 の酸性
pHにおいて行われる。
定相）がまたゲル濾過後の最終精製段階として使用され
得る。蛋白質の良好な分離をもたらす支持体（固定相）
をRP−HPLCにおいて使用することができる。Ｃ−４、Ｃ
−８又はＣ−１８の３００オングストローム孔径支持体
が好ましい支持体の例である。ＩＬ−２を溶液状に維持
するため、分離は約 2.5以下、通常は 2.1〜2.3 の酸性
pHにおいて行われる。
【００３３】これに関し、可溶化（ゲル濾過）からの溶
液のpHは好ましくはこの範囲に調整されるであろう。溶
液をRP−HPLCカラムに負荷し、そして固定相に吸着せし
める。酢酸又はトリフルオロ酢酸のごとき有機酸とプロ
パノール又はアセトニトリルのごとき有機溶剤とを含ん
でなるグラジエント溶剤系を用いてカラムから組換ＩＬ
−２を溶出する。
液のpHは好ましくはこの範囲に調整されるであろう。溶
液をRP−HPLCカラムに負荷し、そして固定相に吸着せし
める。酢酸又はトリフルオロ酢酸のごとき有機酸とプロ
パノール又はアセトニトリルのごとき有機溶剤とを含ん
でなるグラジエント溶剤系を用いてカラムから組換ＩＬ
−２を溶出する。
【００３４】酢酸−プロパノール、トリフルオロ酢酸−
プロパノール、及びトリフルオロ酢酸−アセトニトリル
が好ましい溶剤系である。組換ＩＬ−２は酢酸−プロパ
ノール系において約４０％プロパノールで、トリフルオ
ロ酢酸−プロパノール系において約５０％プロパノール
で、そしてトリフルオロ酢酸−アセトニトリル系におい
て約６２％アセトニトリルで溶出する。
プロパノール、及びトリフルオロ酢酸−アセトニトリル
が好ましい溶剤系である。組換ＩＬ−２は酢酸−プロパ
ノール系において約４０％プロパノールで、トリフルオ
ロ酢酸−プロパノール系において約５０％プロパノール
で、そしてトリフルオロ酢酸−アセトニトリル系におい
て約６２％アセトニトリルで溶出する。
【００３５】便宜上、溶離液の有機溶剤含量は、組換体
ＩＬ−２が溶出する溶剤濃度より幾分低いレベルまで急
速に上昇せしめ、次に約 0.1％〜1.0 ％／分の範囲のゆ
るやかなグラジエント変化により溶出する。
ＩＬ−２が溶出する溶剤濃度より幾分低いレベルまで急
速に上昇せしめ、次に約 0.1％〜1.0 ％／分の範囲のゆ
るやかなグラジエント変化により溶出する。
【００３６】組換ＩＬ−２がクロマトグラフィー段階か
ら回収されるとすぐ、これを凍結乾燥し、そして還元剤
（組換ＩＬ−２を還元状態に保つため）及び可溶化剤
（それを溶液状に保つため）を含有する中性水性緩衝液
中に再懸濁せしめる。組換体ＩＬ−２はこの形で安定で
あり、そしてさらに処理するため、及び使用前に製剤化
するために貯蔵することができる。
ら回収されるとすぐ、これを凍結乾燥し、そして還元剤
（組換ＩＬ−２を還元状態に保つため）及び可溶化剤
（それを溶液状に保つため）を含有する中性水性緩衝液
中に再懸濁せしめる。組換体ＩＬ−２はこの形で安定で
あり、そしてさらに処理するため、及び使用前に製剤化
するために貯蔵することができる。
【００３７】その他のそして好ましい方法は、組換ＩＬ
−２を、それがゲル濾過により分離された後に制御され
た条件下で選択的に酸化し、そして酸化された生成物を
RP−HPLCにより又はRP−HPLCに続くゲル濾過により精製
することである。これは、ゲル濾過にもかかわらず存在
し続ける汚染物、及び不所望の酸化生成物の効果的な除
去をもたらす。
−２を、それがゲル濾過により分離された後に制御され
た条件下で選択的に酸化し、そして酸化された生成物を
RP−HPLCにより又はRP−HPLCに続くゲル濾過により精製
することである。これは、ゲル濾過にもかかわらず存在
し続ける汚染物、及び不所望の酸化生成物の効果的な除
去をもたらす。
【００３８】好ましい酸化方法は、組換ＩＬ−２蛋白質
と実質上のアミノ酸配列を有する十分に還元された微生
物的に生産された合成組換ＩＬ−２蛋白質（該配列は、
有用な蛋白質中では５８位及び１０５位において分子内
結合してシスチンを構成するシステインを含有する）
を、制御された態様において選択的に酸化することによ
って該システインを選択的に酸化して５８位及び１０５
位にシスチンを形成することである。
と実質上のアミノ酸配列を有する十分に還元された微生
物的に生産された合成組換ＩＬ−２蛋白質（該配列は、
有用な蛋白質中では５８位及び１０５位において分子内
結合してシスチンを構成するシステインを含有する）
を、制御された態様において選択的に酸化することによ
って該システインを選択的に酸化して５８位及び１０５
位にシスチンを形成することである。
【００３９】ベルギー特許No.898,106中に記載されそし
てクレームされているような組換ＩＬ−２が使用される
場合、制御されたそして選択的な酸化の効率が改良され
る。この場合、１２５位のシステインが除去され、又は
中性アミノ酸により置き換えられており、従ってＩＬ−
２のダイマー又はポリマーを形成することができる酸化
の間の１２５位のシステインによる正しくない分子内結
合及び／又は分子間結合が回避される。
てクレームされているような組換ＩＬ−２が使用される
場合、制御されたそして選択的な酸化の効率が改良され
る。この場合、１２５位のシステインが除去され、又は
中性アミノ酸により置き換えられており、従ってＩＬ−
２のダイマー又はポリマーを形成することができる酸化
の間の１２５位のシステインによる正しくない分子内結
合及び／又は分子間結合が回避される。
【００４０】この方法においては、十分に還元された微
生物的に生産された合成組換ＩＬ−２蛋白質を好ましく
はｏ−ヨードソベンゾエートと反応せしめる。この酸化
剤はシステインを水性媒体中で、該システインのｐＫａ
より少なくとも約0.5 pHユニット低いpHにおいて酸化
し、この場合、反応混合物中の合成蛋白質の濃度は約５
mg／mlより低い。そしてｏ−ヨードソベンゾエートと蛋
白質とのモル比は少なくとも化学量論的であり、但し、
ｏ−ヨードソベンゾエートは反応の末期において過剰に
存在する。
生物的に生産された合成組換ＩＬ−２蛋白質を好ましく
はｏ−ヨードソベンゾエートと反応せしめる。この酸化
剤はシステインを水性媒体中で、該システインのｐＫａ
より少なくとも約0.5 pHユニット低いpHにおいて酸化
し、この場合、反応混合物中の合成蛋白質の濃度は約５
mg／mlより低い。そしてｏ−ヨードソベンゾエートと蛋
白質とのモル比は少なくとも化学量論的であり、但し、
ｏ−ヨードソベンゾエートは反応の末期において過剰に
存在する。
【００４１】この選択的酸化は生物学的に活性な分子を
生成せしめる。選択的に酸化された生成物のRP−HPLC精
製は上記の条件下で、還元剤の不存在下、及び上記のゲ
ル濾過において使用したのと同じ濃度又はそれより低い
濃度での洗剤の存在下で行われる。
生成せしめる。選択的に酸化された生成物のRP−HPLC精
製は上記の条件下で、還元剤の不存在下、及び上記のゲ
ル濾過において使用したのと同じ濃度又はそれより低い
濃度での洗剤の存在下で行われる。
【００４２】クロマトグラフ段階後の組換ＩＬ−２の純
度は約９５％以上、そして通常約９８％以上である。こ
の高度に純粋な物質は、100,000 ユニットのＩＬ−２活
性剤当たり約５ng未満のエンドトキシン、通常約0.01ng
未満のエンドトキシンを含有する。
度は約９５％以上、そして通常約９８％以上である。こ
の高度に純粋な物質は、100,000 ユニットのＩＬ−２活
性剤当たり約５ng未満のエンドトキシン、通常約0.01ng
未満のエンドトキシンを含有する。
【００４３】この発明に従う組換ＩＬ−２の製剤化は、
精製された選択的に酸化されたＩＬ−２を用いる別個の
操作として、又は選択的に酸化されたＩＬ−２の精製と
一体化された操作において行うことができる。後者の場
合、製剤化のための出発材料は、選択的に酸化された生
成物の逆相高速液体クロマトグラフィー（RP−HPLC）処
理からの組換ＩＬ−２含有生成物であり、好ましくは選
択的に酸化された組換えRP−HPLC生成物（プール物とも
称する）は水−有機溶剤混合物中組換ＩＬ−２の溶液を
含んで成るであろう。
精製された選択的に酸化されたＩＬ−２を用いる別個の
操作として、又は選択的に酸化されたＩＬ−２の精製と
一体化された操作において行うことができる。後者の場
合、製剤化のための出発材料は、選択的に酸化された生
成物の逆相高速液体クロマトグラフィー（RP−HPLC）処
理からの組換ＩＬ−２含有生成物であり、好ましくは選
択的に酸化された組換えRP−HPLC生成物（プール物とも
称する）は水−有機溶剤混合物中組換ＩＬ−２の溶液を
含んで成るであろう。
【００４４】有機溶剤の種類は、RP−HPLCにおいて使用
される溶剤系に依存するであろう。使用され得る系の例
は、酢酸又はトリフルオロ酢酸のごとき有機酸とプロパ
ノール又はアセトニトリルのごとき有機溶剤との組合わ
せである。
される溶剤系に依存するであろう。使用され得る系の例
は、酢酸又はトリフルオロ酢酸のごとき有機酸とプロパ
ノール又はアセトニトリルのごとき有機溶剤との組合わ
せである。
【００４５】このようなRP−HPLCプール物から組換体Ｉ
Ｌ−２を製剤化する第１段階は、組換ＩＬ−２の水中へ
の溶解性を増強するＳＤＳ又はサルコシルのごとき洗剤
を含有する水性緩衝液中にプール物を再懸濁（稀釈）す
ることにより混合物を水性にすることである。この稀釈
の後、有機相を組換体ＩＬ−２含有水性相から除去し、
そして適当な緩衝液を用いる透析濾過(diafiltration)
により洗剤濃度を低下せしめる。ＳＤＳを使用する場
合、ＳＤＳを約 100〜250 、好ましくは約 200μg/mgＩ
Ｌ−２のレベルに低下せしめる。
Ｌ−２を製剤化する第１段階は、組換ＩＬ−２の水中へ
の溶解性を増強するＳＤＳ又はサルコシルのごとき洗剤
を含有する水性緩衝液中にプール物を再懸濁（稀釈）す
ることにより混合物を水性にすることである。この稀釈
の後、有機相を組換体ＩＬ−２含有水性相から除去し、
そして適当な緩衝液を用いる透析濾過(diafiltration)
により洗剤濃度を低下せしめる。ＳＤＳを使用する場
合、ＳＤＳを約 100〜250 、好ましくは約 200μg/mgＩ
Ｌ−２のレベルに低下せしめる。
【００４６】透析濾過の後、ＩＬ−２濃度を約0.01〜２
mg／mlの範囲の濃度に調整し、そして水溶性担体を所望
のレベルに加える。この担体は典型的には、それが溶液
中に約１〜１０重量％、好ましくは約５重量％で存在す
るように添加されるであろう。添加される担体の正確な
量は臨界的ではない。医薬錠剤の製造において使用され
る常用の固体増量剤を担体として使用することができ
る。これらの材料は水溶性であり、ＩＬ−２と反応せ
ず、そしてそれ自体安定である。
mg／mlの範囲の濃度に調整し、そして水溶性担体を所望
のレベルに加える。この担体は典型的には、それが溶液
中に約１〜１０重量％、好ましくは約５重量％で存在す
るように添加されるであろう。添加される担体の正確な
量は臨界的ではない。医薬錠剤の製造において使用され
る常用の固体増量剤を担体として使用することができ
る。これらの材料は水溶性であり、ＩＬ−２と反応せ
ず、そしてそれ自体安定である。
【００４７】これらは好ましくは水に対して非−感受性
（すなわち、非吸湿性）である。添加され得る担体の例
はラクトース、マンニトール、及び他の還元糖例えばソ
ルビトール、小麦、トウモロコシ、米、及びバレイショ
に由来する澱粉及び澱粉加水分解物、ミクロクリスタリ
ンセルロース、並びにアルブミン、例えばヒト血清アル
ブミンである。マンニトールが好ましい。
（すなわち、非吸湿性）である。添加され得る担体の例
はラクトース、マンニトール、及び他の還元糖例えばソ
ルビトール、小麦、トウモロコシ、米、及びバレイショ
に由来する澱粉及び澱粉加水分解物、ミクロクリスタリ
ンセルロース、並びにアルブミン、例えばヒト血清アル
ブミンである。マンニトールが好ましい。
【００４８】担体は製剤に嵩を加え、単位投与量の溶液
が容器、例えば無菌バイアル中で凍結乾燥された場合に
凍結乾燥された残渣が肉眼により明瞭に識別できるよう
にする。これに関し、好ましい担体であるマンニトール
は、水に感受性でない美的に許容される（白色、結晶
性）残渣をもたらす。水に対するマンニトールの非感受
性は製剤の安定性を増強するであろう。
が容器、例えば無菌バイアル中で凍結乾燥された場合に
凍結乾燥された残渣が肉眼により明瞭に識別できるよう
にする。これに関し、好ましい担体であるマンニトール
は、水に感受性でない美的に許容される（白色、結晶
性）残渣をもたらす。水に対するマンニトールの非感受
性は製剤の安定性を増強するであろう。
【００４９】担体を添加した後、単位投与量（すなわ
ち、投与当たり0.01〜２mg、好ましくは 0.2〜0.3 mgの
ＩＬ−２をもたらす容量）の溶液を容器に分配し、此の
容器にスロット栓をかぶせ、そして常用な凍結乾燥条件
及び装置を用いて凍結乾燥する。
ち、投与当たり0.01〜２mg、好ましくは 0.2〜0.3 mgの
ＩＬ−２をもたらす容量）の溶液を容器に分配し、此の
容器にスロット栓をかぶせ、そして常用な凍結乾燥条件
及び装置を用いて凍結乾燥する。
【００５０】凍結乾燥された無菌生成物は(1) 組換ＩＬ
−２、(2) 担体（マンニトール）、(3) 洗剤（ＳＤ
Ｓ）、及び (4)混合物が再構成 (reconstitute) された
場合に生理的pHをもたらす少量の緩衝剤の混合物から成
る。組換ＩＬ−２は典型的には混合物の約 0.015重量％
〜3.85重量％を占め、さらに好ましくは混合物の約 0.4
％〜 0.6％を占めるであろう。この生成物の貯蔵試験
は、ＩＬ−２がこの形態中で２℃〜８℃において３箇月
より長期間安定であることを示す。
−２、(2) 担体（マンニトール）、(3) 洗剤（ＳＤ
Ｓ）、及び (4)混合物が再構成 (reconstitute) された
場合に生理的pHをもたらす少量の緩衝剤の混合物から成
る。組換ＩＬ−２は典型的には混合物の約 0.015重量％
〜3.85重量％を占め、さらに好ましくは混合物の約 0.4
％〜 0.6％を占めるであろう。この生成物の貯蔵試験
は、ＩＬ−２がこの形態中で２℃〜８℃において３箇月
より長期間安定であることを示す。
【００５１】凍結乾燥された混合物は、常用の非経腸的
水性注射剤、例えば注射用水、リンゲル注射剤、グルコ
ース注射剤、グルコース及び塩注射剤等をバイアルに注
入することによって再構成することができる。過剰の発
泡を防止するため注射剤はバイアルの側壁に対して与え
られるべきである。バイアルに添加される注射剤の量は
典型的には１〜５ml、好ましくは１〜２mlの範囲であ
る。
水性注射剤、例えば注射用水、リンゲル注射剤、グルコ
ース注射剤、グルコース及び塩注射剤等をバイアルに注
入することによって再構成することができる。過剰の発
泡を防止するため注射剤はバイアルの側壁に対して与え
られるべきである。バイアルに添加される注射剤の量は
典型的には１〜５ml、好ましくは１〜２mlの範囲であ
る。
【００５２】再構成された製剤は、ヒト又は他の哺乳動
物に対して、それらにＩＬ−２療法をもたらすために非
経腸投与するのに適当である。このような療法は種々の
免疫調節徴候、例えばＴ細胞変異誘発、細胞毒性Ｔ細胞
の誘導、ナチュラルキラー細胞活性の増大、IFN-γの誘
導、細胞性免疫の回復又は増強（例えば、免疫不全状態
の治療）、及び細胞性(cell mediafed) 抗腫瘍活性の増
大のために適当である。次の例はこの発明をさらに説明
する。この例は、いかなる態様においても発明を限定す
ることを意図しない。
物に対して、それらにＩＬ−２療法をもたらすために非
経腸投与するのに適当である。このような療法は種々の
免疫調節徴候、例えばＴ細胞変異誘発、細胞毒性Ｔ細胞
の誘導、ナチュラルキラー細胞活性の増大、IFN-γの誘
導、細胞性免疫の回復又は増強（例えば、免疫不全状態
の治療）、及び細胞性(cell mediafed) 抗腫瘍活性の増
大のために適当である。次の例はこの発明をさらに説明
する。この例は、いかなる態様においても発明を限定す
ることを意図しない。
【００５３】
【実施例】例 この例において使用する組換ＩＬ−２は des-ala IL-２
Ser125である。このＩＬ−２のアミノ酸配列は、天然分
子の最初のアラニンを欠き、そして１２５位のシステイ
ンがセリンに変えられている点において天然ヒトＩＬ−
２のアミノ酸配列と異なる。
Ser125である。このＩＬ−２のアミノ酸配列は、天然分
子の最初のアラニンを欠き、そして１２５位のシステイ
ンがセリンに変えられている点において天然ヒトＩＬ−
２のアミノ酸配列と異なる。
【００５４】このＩＬ−２を生産するE.コリのサンプル
は、シタス・コーポレーションにより、アメリカン・タ
イプ・カルチュアー・コレクション、12301 パークラウ
ンドライブ、ロックビル、メリーランド、米国、に1983
年９月26日に受託番号No.39452として、そしてブタペス
ト条約の規定のもとに1984年３月６日に受託番号No.396
26として寄託されている。
は、シタス・コーポレーションにより、アメリカン・タ
イプ・カルチュアー・コレクション、12301 パークラウ
ンドライブ、ロックビル、メリーランド、米国、に1983
年９月26日に受託番号No.39452として、そしてブタペス
ト条約の規定のもとに1984年３月６日に受託番号No.396
26として寄託されている。
【００５５】６０% ２−プロパノール、６％酢酸中３２
９mgのRP−HPLC精製された酸化されたＩＬ−２生成物
（蛋白質濃度 0.94mg/mlを、５０mM酢酸ナトリウム、１
mMエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、0.1 ％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ)(pH5.5)中に１０倍に稀釈し
た。
９mgのRP−HPLC精製された酸化されたＩＬ−２生成物
（蛋白質濃度 0.94mg/mlを、５０mM酢酸ナトリウム、１
mMエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、0.1 ％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ)(pH5.5)中に１０倍に稀釈し
た。
【００５６】次にＩＬ−２溶液を、１０平方フィートの
中空繊維カートリッジ（名目分子量カットオフ10,000ダ
ルトン) を用いて６００mlの容量に濃縮し、そして次
に、５０mM酢酸ナトリウム、１mMＥＤＴＡ、0.1 ％ＳＤ
Ｓ (pH 5.5) に対して３容量透析濾過した。次に、この
材料を５μg ＳＤＳ／mlを含有する１０mMリン酸ナトリ
ウムに対して、残留ＳＤＳが１３１μg ＳＤＳ／mg蛋白
質の値に達するまでさらに透析濾過した。約２５５mgの
ＩＬ−２が 0.6mg／mlの濃度で回収された（４２５ml)
。
中空繊維カートリッジ（名目分子量カットオフ10,000ダ
ルトン) を用いて６００mlの容量に濃縮し、そして次
に、５０mM酢酸ナトリウム、１mMＥＤＴＡ、0.1 ％ＳＤ
Ｓ (pH 5.5) に対して３容量透析濾過した。次に、この
材料を５μg ＳＤＳ／mlを含有する１０mMリン酸ナトリ
ウムに対して、残留ＳＤＳが１３１μg ＳＤＳ／mg蛋白
質の値に達するまでさらに透析濾過した。約２５５mgの
ＩＬ−２が 0.6mg／mlの濃度で回収された（４２５ml)
。
【００５７】２２２mgのみを、次のように行った製剤化
のために用いた：３７０mlのＩＬ−２溶液 (222mg 、0.
6 mg／ml) を１０mMリン酸ナトリウム (pH 7.5) 及び２
０％マンニトールにより稀釈して最終濃度を次のように
した：１０mMリン酸ナトリウム (pH 7.5) 中 0.25mg/ml
ＩＬ−２及び５％マンニトール 次に、この溶液を 0.2ミクロンフィルターを通して無菌
濾過し、無菌バイアル（1.2ml 充填容量) に充填し、そ
して凍結乾燥した。
のために用いた：３７０mlのＩＬ−２溶液 (222mg 、0.
6 mg／ml) を１０mMリン酸ナトリウム (pH 7.5) 及び２
０％マンニトールにより稀釈して最終濃度を次のように
した：１０mMリン酸ナトリウム (pH 7.5) 中 0.25mg/ml
ＩＬ−２及び５％マンニトール 次に、この溶液を 0.2ミクロンフィルターを通して無菌
濾過し、無菌バイアル（1.2ml 充填容量) に充填し、そ
して凍結乾燥した。
【００５８】こうして製造された製剤はヒトにおいて臨
床的に使用され、そして連続静脈内注入として投与され
た場合２百万ユニット／m2までの投与において許容さ
れ、又は静脈内もしくは筋肉内ボルス(bolus) として投
与された場合百万ユニット／kgまで許容された。組換Ｉ
Ｌ−２の使用についての適当な指標には次のものが含ま
れる：
床的に使用され、そして連続静脈内注入として投与され
た場合２百万ユニット／m2までの投与において許容さ
れ、又は静脈内もしくは筋肉内ボルス(bolus) として投
与された場合百万ユニット／kgまで許容された。組換Ｉ
Ｌ−２の使用についての適当な指標には次のものが含ま
れる：
【００５９】1) 後天的な、先天的な、又は化学的療
法、免疫療法もしくは照射により誘導された免疫不全状
態の療法: 2) ウイルス性、寄生性、癌性、真菌性、原生動物性、
又はミコバクテリウム性もしくはその他の感染性疾患の
療法における細胞性免疫応答の増強: 3) 感染性、癌性、リウマチ性又は自己免疫性疾患の治
療におけるエキソ−ビボ(ex vivo) での細胞の増強され
た応答の誘導: 4) リウマトイド又は他の炎症性関節炎症の治療:
法、免疫療法もしくは照射により誘導された免疫不全状
態の療法: 2) ウイルス性、寄生性、癌性、真菌性、原生動物性、
又はミコバクテリウム性もしくはその他の感染性疾患の
療法における細胞性免疫応答の増強: 3) 感染性、癌性、リウマチ性又は自己免疫性疾患の治
療におけるエキソ−ビボ(ex vivo) での細胞の増強され
た応答の誘導: 4) リウマトイド又は他の炎症性関節炎症の治療:
【００６０】5) 異状免疫応答の疾患、例えば多発性硬
化症、全身性紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、又は肝炎の治
療: 6) 造血系腫瘍、又は造血組織の前癌性もしくは再生不
良性異状の抑制: 7) 天然に存在する、投与された天然の、化学的に合成
もしくは修飾された、又は組換操作によるワクチン、あ
るいは医療目的に投与される他の抗原に対する細胞性又
は液性応答の誘導におけるアジュバントとしての使用: 8) 神経伝達調節剤としてのもしくは精神活性剤として
の、医療目的のエンケファリンとしての、又は中枢神経
系機能の調節剤としての使用:
化症、全身性紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、又は肝炎の治
療: 6) 造血系腫瘍、又は造血組織の前癌性もしくは再生不
良性異状の抑制: 7) 天然に存在する、投与された天然の、化学的に合成
もしくは修飾された、又は組換操作によるワクチン、あ
るいは医療目的に投与される他の抗原に対する細胞性又
は液性応答の誘導におけるアジュバントとしての使用: 8) 神経伝達調節剤としてのもしくは精神活性剤として
の、医療目的のエンケファリンとしての、又は中枢神経
系機能の調節剤としての使用:
【００６１】9) 上記の疾患状態の治療のための局所適
用において: 10) 細胞毒性化学療法又は直接療法もしくはアジュバン
ト環境における癌性もしくは前癌性疾患の治療における
照射もしくは手術と組合わせて: 11) 直接抗ウイルス性、抗真菌性、抗細菌性、もしくは
抗原性動物活性を有する薬剤と組合わせて、又は典型及
び非典型ｍ．ツベルクロシスの薬剤治療と組合わせて:
用において: 10) 細胞毒性化学療法又は直接療法もしくはアジュバン
ト環境における癌性もしくは前癌性疾患の治療における
照射もしくは手術と組合わせて: 11) 直接抗ウイルス性、抗真菌性、抗細菌性、もしくは
抗原性動物活性を有する薬剤と組合わせて、又は典型及
び非典型ｍ．ツベルクロシスの薬剤治療と組合わせて:
【００６２】12) 他の免疫調節剤、リンホカイン (例え
ばＩＬ−１、ＩＬ−３、CSF-１、α−インターフェロ
ン、及びγ−インターフェロン）、天然のもしくは誘導
性の抗細胞性毒素、癌性、感染性、自己免疫性又はリウ
マチ性疾患の治療における悪性細胞の溶解又は静止を仲
介する分子と組合わせて: そして 13) 感染性疾患に対する予防。
ばＩＬ−１、ＩＬ−３、CSF-１、α−インターフェロ
ン、及びγ−インターフェロン）、天然のもしくは誘導
性の抗細胞性毒素、癌性、感染性、自己免疫性又はリウ
マチ性疾患の治療における悪性細胞の溶解又は静止を仲
介する分子と組合わせて: そして 13) 感染性疾患に対する予防。
【図１】図１は本発明の医薬組成物の製造工程の１例を
示す。
示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） 7804−4Ｂ
Claims (2)
- 【請求項１】 患者にＩＬ−２療法をもたらすための医
薬組成物であって、 (a) 非−ＩＬ−２蛋白質を実質上含有しない選択的に酸
化されそして活性化された微生物的に生産された組換Ｉ
Ｌ−２の医療的有効量、ここで、組換ＩＬ−２とは、５
８位及び１０５位のシステインのジスルフィド結合を含
む天然ヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列と少な
くとも実質的に同一なアミノ酸配列を有し、そして天然
−ヒトインターロイキン−２と共通の生物学的活性を有
する蛋白質をコードするヒトインターロイキン−２ＤＮ
Ａ配列又は該ヒト−インターロイキン−２ＤＮＡ配列の
変形物により形質転換された微生物により生産される非
グリコシル化蛋白質を意味する： (b) 前記酸化された微生物的に生産されたＩＬ−２の安
定性に不都合な影響を与えない医薬として許容される水
溶性担体：及び (c) 前記酸化された微生物的に生産されたＩＬ−２の水
溶性を確保するために十分な量の界面活性剤: 並びに (d) 前記 (a), (b) 及び (c)が溶解される医薬として許
容される水性非経腸的注射剤： の無菌溶液であることを特徴とする組成物。 - 【請求項２】 前記組成物が0.01〜２mg／mlの組換ＩＬ
−２を含有することを特徴とする請求項１に記載の組成
物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59435084A | 1984-03-28 | 1984-03-28 | |
| US594350 | 1984-03-28 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50151985A Division JPS61500790A (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-25 | 微生物的に製造されたインターロイキン―２を含有する組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05170660A JPH05170660A (ja) | 1993-07-09 |
| JPH0678239B2 true JPH0678239B2 (ja) | 1994-10-05 |
Family
ID=24378529
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50151985A Granted JPS61500790A (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-25 | 微生物的に製造されたインターロイキン―２を含有する組成物 |
| JP3288739A Expired - Lifetime JPH0678239B2 (ja) | 1984-03-28 | 1991-11-05 | インターロイキン−２を含有する医薬組成物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50151985A Granted JPS61500790A (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-25 | 微生物的に製造されたインターロイキン―２を含有する組成物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0211835B1 (ja) |
| JP (2) | JPS61500790A (ja) |
| DE (1) | DE3575072D1 (ja) |
| WO (1) | WO1985004328A1 (ja) |
Families Citing this family (18)
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|---|---|---|---|---|
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| US4690915A (en) * | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
| CA1297003C (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-10 | Jack H. Nunberg | Composition and method for treating animals |
| DE3537461A1 (de) * | 1985-10-22 | 1987-04-23 | Hoechst Ag | Derivat des interleukin-2, seine herstellung und verwendung |
| JPH0645551B2 (ja) * | 1986-01-07 | 1994-06-15 | 塩野義製薬株式会社 | インタ−ロイキン−２組成物 |
| US4933433A (en) * | 1986-01-31 | 1990-06-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant interleukin-2 composition and process for making it |
| US4879111A (en) * | 1986-04-17 | 1989-11-07 | Cetus Corporation | Treatment of infections with lymphokines |
| US4894227A (en) * | 1986-08-01 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Composition of immunotoxins with interleukin-2 |
| CA1292686C (en) * | 1986-10-27 | 1991-12-03 | Ze'ev Shaked | Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation process |
| EP0284249A1 (en) * | 1987-03-13 | 1988-09-28 | Interferon Sciences, Inc. | Lyophilized lymphokine composition |
| US4938956A (en) * | 1987-04-01 | 1990-07-03 | International Minerals & Chemical Corp. | Synergistic immunostimulating composition and method |
| US4863726A (en) * | 1987-05-29 | 1989-09-05 | Cetus Corporation | Combination therapy using immunotoxins with interleukin-2 |
| EP0315300A3 (en) * | 1987-11-05 | 1989-08-02 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Treatment of tuberculous and nontuberculous mycobacterial infection |
| FR2639232A1 (fr) * | 1988-10-21 | 1990-05-25 | Sanofi Sa | Medicaments contenant une interleukine-2 glycosylee |
| ZA902663B (en) * | 1989-04-07 | 1991-12-24 | Syntex Inc | Interleukin-1 formulation |
| FR2684878B1 (fr) * | 1991-12-12 | 1994-02-11 | Roussel Uclaf | Composition pharmaceutique stabilisee d'il2 humaine recombinante non glycosylee sous forme reduite et son procede de preparation. |
| TW570805B (en) | 1998-09-01 | 2004-01-11 | Hoffmann La Roche | Water-soluble pharmaceutical composition in an ionic complex |
| JP7038655B2 (ja) * | 2015-10-22 | 2022-03-18 | イルトゥー・ファルマ | Ｉｌ－２医薬組成物 |
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| JPS58116498A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｉｌ‐２をコードする新規伝令ｒｎａの製造法 |
| JPS5910598A (ja) * | 1982-03-17 | 1984-01-20 | インタ−イエダ・リミテツド | 安定なインタ−フエロンβ組成物およびインタ−フエロンβの安定化方法 |
| JPS5910524A (ja) * | 1982-07-08 | 1984-01-20 | Toray Ind Inc | インタ−フエロン組成物およびその製造法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4738927A (en) | 1982-03-31 | 1988-04-19 | Ajinomoto Co. Inc. | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| IE56026B1 (en) | 1982-10-19 | 1991-03-27 | Cetus Corp | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
-
1985
- 1985-03-25 WO PCT/US1985/000501 patent/WO1985004328A1/en active IP Right Grant
- 1985-03-25 EP EP85901824A patent/EP0211835B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-25 JP JP50151985A patent/JPS61500790A/ja active Granted
- 1985-03-25 DE DE8585901824T patent/DE3575072D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-11-05 JP JP3288739A patent/JPH0678239B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58116498A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｉｌ‐２をコードする新規伝令ｒｎａの製造法 |
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| JPS5910524A (ja) * | 1982-07-08 | 1984-01-20 | Toray Ind Inc | インタ−フエロン組成物およびその製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0211835A1 (en) | 1987-03-04 |
| EP0211835B1 (en) | 1990-01-03 |
| JPH05170660A (ja) | 1993-07-09 |
| JPS61500790A (ja) | 1986-04-24 |
| JPH0466454B2 (ja) | 1992-10-23 |
| DE3575072D1 (de) | 1990-02-08 |
| WO1985004328A1 (en) | 1985-10-10 |
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