JPH0466454B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ インターロイキン−２（IL−２）の治療をも
たらすために患者に非経腸投与される医薬を製造
するための、医薬として許容される水性ビヒクル
中に再構成される組換IL−２組成物であつて、 (a) 58位のシステイン及び105位のシステインが
選択的に酸化されてシスチンが形成されること
により活性化された微生物的に生産された組換
IL−２の医療的有効量： (b) 前記酸化された微生物的に生産されたIL−
２の安定性に不都合な影響を与えない医薬とし
て許容される水溶性担体：及び (c) 前記酸化された微生物的に生産されたIL−
２の水溶性を確保するために十分な量の界面活
性剤： を含んで成る無菌凍結乾燥混合物であることを特
徴とする組成物。

２ 前記酸化された微生物的に生産されたIL−
２中の非−IL−２蛋白質の含量が５重量％未満
であり、そして前記界面活性剤がドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）又はデオキシコール酸ナトリウ
ムであることを特徴とする請求の範囲第１項記載
の組成物。

３ 前記ドデシル硫酸ナトリウムが１mgのIL−
２当り100〜250μｇ存在することを特徴とする請
求の範囲第２項記載の組成物。

４ 前記選択的に酸化された微生物的に生産され
た組換IL−２が混合物の0.02重量％〜3.85重量％
を占めることを特徴とする請求の範囲第１項〜第
３項のいずれか１項に記載の組成物。

５ 前記組織IL−２がdes−alalL−2_ser125であ
り、そして前記水溶性担体がマンニトールである
ことを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のい
ずれか１項に記載の組成物。

明細書 この発明は医薬の分野に関する。さらに詳しく
は、これは微生物的に製造されたインターロイキ
ン−２の医薬製剤に関する。

インターロイキン−２、すならち正常な末梢血
リンパ球により生産され、そして植物レクチン、
抗原、又は他の刺激物質に暴露された後抗原又は
マイトジエンで刺激されたＴ細胞の増殖を誘導す
るリンホカインは、Morgan、D.A等、Sciense
（1976）193：1007−1008により最初に記載され
た。そして、刺激されたＴリンパ球の増殖を誘導
するその能力のためにＴ細胞増殖因子と呼ばれる
が、今やその増殖因子性に加えて、このものはイ
ン−ビトロ及びイン−ビボで免疫系細胞の種々の
機能を調節することが認識され、そしてインター
ロイキン−２（IL−２）と称されている。IL−２
は、免疫細胞の相互作用及び機能を中介する、リ
ンパ球により生産される幾つかのメツセンジヤー
−制御分子の１つである。

IL−２は最初ヒト末梢血リンパ球（PBL）又
は他のIL−２生産性セルラインを培養すること
により作られた。例えば、米国特許No.4401756を
参照のこと。組換DNA技法はPBL及びIL−２生
産セルラインの代替物を提供した。タニグチ、
T.等、Nature（1983）302：305−310、及び
Devos、R.、Nucleic Acids Research（1983）
11：4307−4323はヒトIL−２遺伝子のクローニ
ング及び微生物中でのその発現を報告した。

1983年11月14日に許可されたベルギー特許No.
898016は、野生型又は天然分子の125位に通常存
在するシステインが除去され又はセリンのごとき
中性アミノ酸により置き変えらえているIL−２
のムテインを記載している。これらのムテインは
IL−２生物活性を有する。このベルギー特許は、
該組換ムテインがこれらを水性ビヒクルと混合
し、そして静脈内、皮下等に注射することにより
天然IL−２と同様に製剤化されそして投与され
得ることを記載している。

この発明の１つの観点は、IL−２療法をもた
らすために患者に非経腸的に投与するために医薬
として許容される水性ビヒクル中に再構成
（reconstitute）することができるIL−２組成物
に関し、この組成物は： (a) 非−IL−２蛋白質を実質的に含有しない酸
化された微生物内に生産された組換IL−２の
医療的に有効な量： (b) 該微生物に生産されたIL−２の安定性に不
都合な影響を与えない医薬として許要された水
溶性担体：及び、 (c) 前記微生物的に生産された組換IL−２の水
溶性を確保するのに十分な量の界面活性剤、例
えばアルカリ金属硫酸塩、例えばドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）、アルカリ金属サルコシネ
ート、又はデオキシコール酸ナトリウム： を含んで成る。

好ましくは、組換IL−２が選択的に酸化され、
分子が生物的に活性であるように58位及び105位
のシステインがジスルフイド結合を形成する。

この発明の他の観点は患者に治療をもたらす医
薬組成物であり、この組成物は： (a) 上記の混合物と： (b) 該混合物が溶解している医薬として許容され
る水性非径腸ビヒクル： を含んで成り、この溶液はml当り約0.01mg〜約２
mgの範囲の微生物的に生産された組換IL−２を
含有する。

第１図は、微生物的に生産された組換IL−２
を処理しそして精製するための好ましい方法の流
れ図である。

ここで、使用する場合、“IL−２”なる語は、
(a)58位及び105位のシステインのジスルフイド結
合を含む天然ヒトインターロイキン−２のアミノ
酸配列と少なくとも実質的に同一なアミノ酸配列
を有し、そして(b)天然ヒト−インターロイキン−
２と共通の生物学的活性を有する蛋白質をコード
するヒトインターロイキン−2DNA配列又は該ヒ
ト−インターロイキン−2DNA配列の変形物によ
り形質転換された微生物により生産される非グリ
コシル化蛋白質を意味する。アミノ酸配列の実質
上同一とは、配列が同一であるか、あるいは合成
蛋白質と天然ヒト−インターロイキン−２との間
の不都合な機能的非類似性を惹起しない１個又は
それより多くのアミノ酸の変化（欠失、付加、置
換）により異なることを意味する。このような蛋
白質の例は、1983年２月３日に出願されたヨーロ
ツパ特許出願No.83101035.0（1983年10月19日公開
No.91539）、及び1982年12月22日に出願されたヨー
ロツパ特許出願No.82307036.2（1983年９月14日公
開No.88195）に記載されている組換IL−２；ベル
ギー特許No.893.016に対応する1983年10月13日に
出願されたヨーロツパ特許出願No.83306221.9
（1984年５月30日公開No.109748）に記載されてい
る組組IL−２ムテイン；並びにこの出願に記載
されている組換IL−２である。

ここで使用する場合、“形質転換された微生物”
なる語は、天然ヒト−インターロイキン−２活性
を有する蛋白質を生産するために遺伝子操作され
ている微生物を意味する。形質転換された微生物
の例は前記ヨーロツパ特許出願公開No.88198、No.
91539、及びNo.109748に記載されている。IL−２
を生産するために細菌が好ましい。この発明にお
いて有用な典型的な形質転換された微生物は、プ
ラスミドpLWIにより形質転換されたE.コリ（E.
coli）Ｋ−12株MM294（1983年８月４日にシス
タ・コーポレーシヨンによりブタペスト条約の規
定のもとにアメリカン・タイプ・カルチユアー・
コレクシヨンに寄託されており、そして受託番号
39405を有する）である。合成組換IL−２はま
た、適切に形質転換された酵母及び哺乳動物細胞
によつても生産され得る。E.コリが特に好ましい
宿主生物である。

形質転換された微生物を、適当な増殖培地中
で、典型的には680nｍにて少なくとも約30、そ
して好ましくは680nｍにおいて約20〜約40の光
学濃度に増殖せしめる。増殖培地の組成は関与す
る特定の微生物に依存するであろう。培地は、微
生物の栄養的要求を満たす化合物を含有する水性
培地である。増殖培地は典型的には資化性の炭素
及び窒素源、エネルギー源、マグネシウム、カリ
ウム及びナトリウムイオン、並びに場合によつて
はアミノ酸、及びプリン及びピリミジン塩基を含
有するであろう。〔Prview of Medical
Biology、Lange Medical Publications、第14
版80〜95頁（1980）を参照のこと。〕trpプローモ
ーターを用いる発現ベクターにおいては、培地中
のトリプトフアン濃度が、IL−２発現が望まれ
る時点で制限されるように注意深く調節される。
E.コリのための増殖培地は当業者においてよく知
られている。好ましい増殖培地は1985年２月12日
に許可された米国特許No.4499188に記載されてい
る。

培養物から細胞を収得した後、これらを必要で
あれば約20〜500mg／ml、好ましくは80〜100mg／
ml（680nｍにおいて、OD40〜200、好ましくは
160〜200）に、濾過、遠心分離、又は他の常法に
より濃縮する。

濃縮に続き、微生物の細胞膜を破壊する。この
破壊の主たる目的は次の抽出及び可溶化段階を促
進することである。この方法のこの段階において
は、常用の細胞破砕技法、例えばホモジナイズ、
超音波処理、又は加圧循環を使用することができ
る。好ましい方法はマントン−ガウリン
（Manton−Gaulin）ホモジナイザーを用いる超
音波処理又はホモジナイズである。破砕段階の終
点は光学濃度によりモニターすることができ、懸
濁液の光学濃度が典型的には約65％〜85％低下す
る。いずれにしても、無傷の細胞が可溶化段階に
持ち込まれないように実質上すべての細胞を破壊
すべきである。所望により、破砕の前に濃縮物の
液相のPHを、次の段階において、組換IL−２蛋
白質を細胞破片中に不溶性複合体として残しなが
らE.コリ蛋白質の除去を促進するレベルに調整す
る。PHは適当な緩衝液を添加することによつてそ
のように調整することができる。ほとんどの場
合、約８〜約8.5の範囲のPHが使用されよう。

第１図に示すように、破砕段階に続く回収工程
の段階は、IL−２の還元状態に維持しながら良
好な収率で、高レベルの純度（好ましくは約95％
以上、そしてさらに好ましくは約98％以上）に、
E.コリ蛋白質からIL−２を分離するために主とし
て設計される。同時に、これらの精製工程はさら
に、相まつて、最終生成物中に発熱物質を、患者
に非径腸的に投与するために許容されると信じら
れるレベルに低下せしめる。

細胞を破砕した後、破砕物の液相から粒状物を
分離し、そして抽出のための最適PHに緩衝化され
た水性媒体中に再懸濁することができる。場合に
よつては粒状物をこの段階で緩衝液により洗浄し
てその中の水曜性E.コリ蛋白質を除去することが
できる。ともかく、抽出にかけられる細胞懸濁中
の蛋白質濃度は通常約５〜約60mg／ml、好ましく
は20〜40mg／mlの範囲である。

粒状細胞材料からのE.コリ蛋白質の抽出は、破
砕と交互に、又は破砕後にそれに続いて行うこと
ができる。これは、好ましくは破砕に続く段階と
して行われる。抽出剤はチヤオトロピツタ剤
（chaotropic agent）（すなわち、水素結合を解離
せしめ、そして蛋白質の３次構造に影響を与える
緩和な蛋白質変性剤）の水溶液である。抽出剤は
細胞破片から多量のE.コリ蛋白質を選択的に除去
し、細胞破片と会合している（含有されているか
又は結合している）組換IL−２の少なくとも実
質的な部分を残す。この選択性は、組換IL−２
の疎水性、及びこの蛋白質はその電点に近いPHに
おいて還元された不溶性の状態にあるという事実
により促進される。さらに、組換IL−２の実質
的な部分は、E.コリ中で高レベルで発現される他
のクローン化蛋白質の場合と同様に、有意な大き
さの封入体（inclusion body）としてイン−ビボ
に存在するであろう。抽出剤の例は、尿素及び塩
酸グアニジンである（可溶化剤としてSDSを使用
する場合、塩酸グアニジンを使用すべきでない。
尿素が好ましい。抽出混合物中のチヤオトロピツ
ク剤の濃度は使用される特定の薬剤及び抽出混合
物中の細胞性材料の量に依存するであろう。尿素
の場合、約3.5M〜4.5M、好ましくは約4Mの濃
度（最終）が25℃における回分法において使用さ
れるであろう。抽出が長時間にわたつて連続的に
行われる場合、一層低い濃度を用いるのが好まし
いであろう。抽出においては通常20℃〜25℃の範
囲の温度が使用され、便宜上室温が使用されるで
あろう。溶液と粒状物との間の接触を増強し、そ
してそうすることによつて細胞破片から非−IL
−２蛋白質を抽出するために必要な時間を短縮す
るために、混合が典型的に用いられるであろう。
SDS−PAGEを用いて、上清について抽出工程の
速度分析が行われ、そして15〜30分間までに抽出
が本質上完結することが見出された。

抽出に続き、混合物を固相と液相に分離する。
次に、固相を、還元剤及び可溶化剤を含有する中
性水性緩衝液と接触せしせむことにより固相中の
組換IL−２を可溶化する。疎水性組換IL−２を
可溶化するために適切な疎水性−親水性バランス
を有する生理的に許容される界面活性剤（洗剤）
を用いることができる。０〜14個の炭素原子を含
有するアルカリ金属硫酸塩及びアルカリ金属アル
キルサルコシネートが好ましい可溶化剤であり、
SDS及びサルコシルが特に好ましい。

可溶化において使用される化溶化剤の量は特定
の薬剤に依存するであろう。SDS又はサイコシル
を使用する場合、SDS／サルコシルと固相蛋白質
との好ましい比率（Ｗ／Ｗ）は約0.5：１〜1.4：
１である。可溶化剤にまた、可溶化されたIL−
２が有意な程度に酸化されるのを防止するために
十分な量の還元剤を含有する。蛋白質還元剤、例
えばジチオスレイトール（DTT）及び２−メル
カプトエタノールを使用することができる。
DTTのごとき還元剤の媒体中での濃度は通常約
５〜20mMの範囲であろう。可溶化は典型的には
20℃〜25℃の範囲の温度において、固相と可溶化
媒体との間の接触を促進するために混合しながら
行う。一層高い温度は不所望のE.コリ蛋白質を可
溶化するであろう。サンプルが15分間置かれ又は
溶液が半透明になつた時に可溶化が完了したと考
えられる。可溶化の完了後不要物を分離する。

IL−２が可溶化された後、場合によつてはLI
−２を水性溶液から還元条件下で２−ブタノール
又は２−メチル−２−ブタノールにより抽出し
て、IL−２と非常に近い分子量を有する幾らか
の汚染物を著しく含有する追加のE.コリ蛋白質を
除去する。水性溶液及びブタノールが実質上不混
和性である条件（例えば、0.05〜0.15の範囲のイ
オン強度）を用いる。有機抽出の実施において、
必要であれば、水性溶液の蛋白質濃度を好ましく
は約６mg／ml未満、好ましくは約0.5〜４mg／ml
に調整する。還元剤（例えばDTT）の存在下で
抽出を行うことによつて還元条件を維持する。ブ
タノールは一般に可溶化されたIL−２の水性溶
液に約１：１〜約３：１（抽出剤：水溶液）の範
囲の、好ましくは約１：１の容量比において添加
されるであろう。温度は一般に20℃〜100℃の範
囲であり、そしてPHは一般に約４〜９、好ましく
は約５〜６であろう。溶液とブタノールとの間の
接触時間は臨界的ではなく、そして数分間のオー
ダーの比較的短い時間を用いることができる。抽
出が完了した後、水相及びブタノール相を分離
し、そしてブタノール相からIL−２を分離する。
ブタノール相からIL−２を分離するための好ま
しい方法は酸沈澱である。これは、有機相が溶解
するまで（有機相の容量に対して約２〜３容量の
緩衝液）ブタノール相を水性緩衝液（PH7.5）に
加え、そして次にPHを約5.5〜7.0、好ましくは6.0
〜6.2に低下せしめてIL−２を沈澱せしめること
により行われる。

この方法の次の段階は、組換IL−２を抽出の
後に残留するE.コリ汚染物から分離し、そして最
適には可溶化剤からも分離することである。ゲル
濾過クロマトグラフイー、RP−HPLC、又はゲ
ル濾過クロマトグラフイーとRP−HPLCとの組
合わせが使用される。ゲル濾過クロマトグラフイ
ーは好ましくは、発熱成分、及び組換IL−２よ
り高いか又は低い分子量を有する蛋白質汚染物を
除去する２段階において行われる。（組換IL−２
は約15.5Kダルトンの分子量を有する。）これら
の汚染物からのIL−２分離を可能にするために
溶液を画分することができるゲルは商業的に入手
可能である。セフアクリルＳ−200は高い分子量
の成分を除去するために好ましいゲルであり、そ
してセフアデツクスＧ−25、Ｇ−75又はＧ−100
ゲルは低分子量汚染物を除去するために好まし
い。ゲル濾過な典型的には、約0.1〜10％の可溶
化剤及び約１〜10mM還元剤を含有する緩衝化溶
液（PH5.5〜7.0）中で行われる。カラムは、所望
の成分を適切に分けることができるような大きさ
にされるであろう。

RP−HPLCはゲル濾過に代るものである。さ
らに、RP−HPLCは、組換IL−２に近い分子量
を有しそしてそれ故にゲル濾過によつては完全に
除去され得ない分子を除去することができる。さ
らに、RP−HPLCによつて細菌エンドトキシン
のごとき汚染物を効果的に除去される。従つて、
RP−HPLCはゲル濾過後の最終精製段階として
も使用され得る。蛋白質の良好な分離をもたらす
支持体（固定相）がまたゲル濾過後の最終精製段
階として使用され得る。蛋白質の良好な分離をも
たらす支持体（固定相）をRP−HPLCにおいて
使用することができる。Ｃ−４、Ｃ−８又はＣ−
18の300オングストローム孔径支持体が好ましい
支持体の例である。IL−２を溶液状に維持する
ため、分離は約2.5以下、通常は2.1〜2.3の酸性PH
において行われる。これに関し、可溶化（ゲル濾
過）からの溶液のPHは好ましくはこの範囲に調整
されるであろう。溶液をRP−HPLCカラムに負
荷し、そして固定相に吸着せしめる。酢酸又はト
リフルオロ酢酸のごとき有機酸とプロパノール又
はアセトニトリルのごとき有機溶剤とを含んで成
るグラジエント溶剤形を用いてカラムから組換
IL−２を溶出する。酢酸−プロパノール、トリ
フルオロ酢酸−プロパノール、及びトリフルオロ
酢酸−アセトニトリルが好ましい溶剤系である。
組換IL−２は酢酸−プロパノール系において約
40％プロパノールで、トリフルオロ酢酸−プロパ
ノール系において約50％プロパノールで、そして
トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系において約
62％アセトニトリルで溶出する。便宜上、溶離液
の有機溶剤含量は、組換体IL−２が溶出する溶
剤濃度より幾分低いレベルまで急速に上昇せし
め、次に約0.1：〜1.0％／分の範囲のゆるやかな
グラジエント変化により溶出する。

組換IL−２がクロマトグラフイー段階から回
収されるとすぐ、これを凍結乾し、そして還元剤
（組換IL−２を還元状態に保つため）及び可溶化
剤（それを溶液状に保つため）を含有する中性水
性緩衝液中に再懸濁せしめる。組換体IL−２は
この形で安定であり、そしてさらに処理するた
め、及び使用前に製剤化するために貯蔵すること
ができる。

その他のそして好ましい方法は、組換IL−２
を、それがゲル濾過により分離された後に制御さ
れた条件下で選択的に酸化し、そして酸化された
生成物をRP−HPCLにより又はRP−HPLCに続
くゲル濾過により精製することである。これは、
ゲル濾過にもかかわらず存在し続ける汚染物、及
び不所望の酸化生成物の効果的な除去をもたら
す。好ましい酸化方法は、組換IL−２蛋白質と
実質上のアミノ酸配列を有する十分に還元された
微生物的に生産された合成組換IL−２蛋白質
（該配列は、有用な蛋白質中では58位及び105位に
おいて分子内結合してシスチンを構成するシステ
インを含有する）を、制御された態様において選
択的に酸化することによつて該システインを選択
的に酸化して58位及び105位にシスチンを形成す
ることである。ベルギー特許No.898016中に記載さ
れそしてクレームされているような組換IL−２
が使用される場合、制御されたそして選択的な酸
化の効率が改良される。この場合、125位のシス
テインが除去され、又は中性アミノ酸により置き
換えられており、従つてIL−２のダイマー又は
ポリマーを形成することができる酸化の間の125
位のシステインによる正しくない分子内結合及
び／又は分子間結合が回避される。この方法にお
いては、十分に還元された微生物的に生産された
合成組換IL−２蛋白質を好ましくはｏ−ヨード
ソベンゾエートを反応せしめる。この酸化剤はシ
ステインを水性媒体中で、該システインのpKaよ
り少なくとも約0.5PHユニツト低いPHにおいて酸
化し、この場合、反応混合物中の合成蛋白質の濃
度は約５mg／mlより低く、そしてｏ−ヨードソン
ベンゾエートと蛋白質とのモル比は少なくとも化
学量論的であり、但し、ｏ−ヨードソンベンゾエ
ートは反応の末期において過剰に存在する。この
選択的酸化は生物学的に活性な分子を生成せしめ
る。選択的に酸化された生成物のRP−HPLC精
製は上記の条件下で、還元剤の不存在下、及び上
記のゲル濾過において使用したのと同じ濃度又は
それより低い濃度での洗剤の存在下で行われる。

クロマトグラフ段階後の組換IL−２の純度は
95％以上、そして通常約98％以上である。この高
度に純粋な物質は、100000ユニツトのIL−２活
性剤当り約5nｇ未満のエンドトキシン、通常約
0.01nｇ未満のエンドトキシンを含有する。

この発明に従う組換IL−２の製剤化は、精製
され選択的に酸化されたIL−２を用いる別個の
操作として、又は選択的に酸化されたIL−２の
精製と一体化された操作において行うことができ
る。後者の場合、製剤化のための出発材料は、選
択的に酸化された生成物の逆相高速液体クロマト
グラフイー（RP−HPLC）処理からの組換IL−
２含有生成物であり、好ましくは選択的に酸化さ
れた組換IL−２を含むRP−HPLC生成物（プー
ル物とも称する）は水−有機溶剤混合物中組換
IL−２の溶液を含んで成るであろう。有機溶剤
の種類はRP−HPLCにおいて使用される溶剤系
に依存するであろう。使用され得る系の列は酢酸
又はトリフルオロ酢酸のごとき有機酸とプロパノ
ール又はアセトニトリルのごとき有機溶剤との組
合わせである。

このようなRP−HPLCプール物から組換体IL
−２を製剤化する第１段階は、組換IL−２の水
中への溶解性を増強するSDS又はサルコシルのご
とき洗剤を含有する水性緩衝液中にプール物を再
懸濁（希釈）することにより混合物を水性するこ
とである。この希釈の後、有機相を組換体IL−
２含有水性相から除去し、そして適当な緩衝液を
用いる透析濾過（dia−filtration）により洗剤濃
度を低下せしめる。SDSを使用する場合、SDSを
約100〜250、好ましくは約200μｇ／mgIL−２の
レベルに低下せしめる。透析濾過の後、IL−２
濃度を約0.01〜２mg／mlの範囲の濃度に調整し、
そして水溶性担体を所望のレベルに加える。この
担体は典型的には、それが溶液中に約１〜10重量
％、好ましくは約５重量％で存在するように添加
されるであろう。添加される担体の正確な量は臨
界的ではない。医薬錠剤の製造において使用され
る常用の固体増量剤を担体として使用することが
できる。これらの材料は水溶性であり、IL−２
と反応せず、そしてそれ自体安定である。これら
は好ましくは水に対して非−感受性（すなわち、
非吸湿性）である。添加され得る担体の例はラク
トース、マンニトール、及び他の還元糖例えばソ
ルビトール、小麦、トウモロコシ、米、及びバイ
レシヨに由来する澱粉及び澱粉加水分解物、ミク
ロクリスタリンセルロース、並びにアルブミン、
例えばヒト血清アルブミンである。マンニトール
が好ましい。

担体は製剤に嵩を加え、単位投与量の溶液が容
器、例えば無菌バイアル中で凍結乾燥された場合
に凍結乾燥された残渣が肉眼により明瞭に識別で
きるようにする。これに関し、好ましい担体であ
るマンニトールは、水に感受性でない美的に許容
される（白色、結晶性）残渣をもたらす。水に対
するマンニトールの非感受性は製剤の安定性を増
強するであろう。

担体を添加した後、単位投与量（すなわち、投
与当り0.01〜２mg、好ましくは0.2〜0.3mgのIL−
２をもたらす容量）の溶液を容器に分配し、此の
容器にスロツト栓をかぶせ、そして常用な凍結乾
燥条件及び用いて凍結乾燥する。

凍結乾燥された無菌性成分物は(1)組換IL−２、
(2)担体（マンニトール）、(3)洗剤（SDS）、及び(4)
混合物が再構成（reconstitute）された場合に生
理的PHをもたらす少量の緩衝剤の混合物から成
る。組換IL−２は典型的には混合物の約0.015重
量％〜3.85重量％を占め、さらに好ましくは混合
物の約0.4％〜0.6％を占めるであろう。この生成
物の貯蔵試験は、IL−２がこの形態中で２℃〜
８℃において３箇月より長期間安定であることを
示す。

凍結乾燥された混合物は、常用の非経腸的水性
注射剤、例えば注射用水、リンゲル注射剤、グル
コース注射剤、グルコース及び塩注射剤等をバイ
アルに注入することによつて再構成することがで
きる。過剰の発泡を防止するため注射剤はバイア
ルの側壁に対して与えられうるべきである。バイ
アルに添加される注射剤の量は典型的には１〜５
ml、好ましくは１〜２mlの範囲である。

再構成された製剤は、ヒト又は他の哺乳動物に
対して、それらにIL−２療法をもたらすために
非経腸投与するのに適当である。このような療法
は種々の免疫調節微候、例えばＴ細胞変異誘発、
細胞毒性Ｔ細胞の誘導、ナチユラルキラー細胞活
性の増大、IFN−ｒの誘導、細胞性免疫の回復又
は増強（例えば、免疫不全状態の治療）、及び細
胞性（cell mediafed）抗腫瘍活性の増大のため
に適当である。

次の例はこの発明をさらに説明する。この例
は、いかなる態様においても発明を限定すること
を意図しない。

例 この例において使用する組換IL−２はdes−ala
IL−2_ser125である。このIL−２のアミノ酸配列
は、天然分子の最初のアラニンを欠き、そして
125位のシステインガセリンに変えられている点
において天然ヒトIL−２のアミノ酸配列と異る。
このIL−２を生産するE.コリのサンプルは、シタ
ス・コーポレーシヨンにより、アメリカン・タイ
プ・カルチユアー・コレクシヨン、12301パーク
ラウンドライブ、ロツクビル、メリーランド、米
国、に1983年９月26日に受託番号No.39452として、
そしてブタペスト条約の規定のもとに1984年３月
６日に受託番号No.39626として寄託されている。

60％２−プロパノール、６％酢酸中329mgのRP
−HPLC精製された酸化されたIL−２生成物（蛋
白質濃度0.94mg／mlを、50mM酢酸ナトリウム、
1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、0.1％
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（PH5.5）中に10
倍に希釈した。

次にIL−２溶液を、10平方フイートの中空繊
維カートリツジ（各目分子量カツトオフ10000ダ
ルトン）を用いて600mlの容量に濃縮し、そして
次に、50mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、
0.1％SDS（PH5.5）に対して３容量透析濾過した。
次にこの材料を5μｇSDS／mlを含有する10mMリ
ン酸ナトリウムに対して、残留SDSが131μｇ
SDS／mg蛋白質の値に達するまでさらに透析濾過
した。約255mgのIL−２が0.6mg／mlの濃度で回収
された（425ml）。

222mgのみを、次のように行つた製剤化のため
に用いた：370mlのIL−２溶液（222mg、0.6mg／
ml）を10mMリン酸ナトリウム（PH7.5）及び20
％マンニトールにより希釈して最終濃度を次のよ
うにした： 0.25mg／mlIL−２ ５％マンニトール10mMリン酸ナトリウム（PH7.5）中 次に、この溶液を0.2ミクロンフイルターを通
して無菌濾過し、無菌バイアル（1.2ml充填容量）
に充填し、そして凍結乾燥した。

こうして製造された製剤はヒトにおいて臨床的
に使用され、そして連続静脈内注入として投与さ
れた場合２百万ユニツト／m²までの投与において
許用され、又は静脈内もしくは筋肉内ボルス
（bolus）として投与された場合百万ユニツト／Kg
まで許容された。組換IL−２の使用についての
適当な指標には次のものが含まれる： (1) 後天的な、先天的な、又は化学的療法、免疫
療法もしくは照射により誘導された免疫不全状
態の治療： (2) ウイルス性、寄生性、癌性、真菌性、原生動
物性、又はミコバクテリウム性もしくはその他
の感染性疾患の療法におけり細胞性免疫応答の
増強： (3) 感染性、癌性、リウマチ性又は自己免疫性疾
患の治療におけるエキソービボ（ex vivo）で
の細胞の増強された応答の誘導： (4) リウマトイド又は他の炎症性関節炎症の治
療： (5) 異常免疫応答の疾患、例えば多発性硬化症、
全身性紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、又は肝炎の治
療： (6) 造血系腫瘍、又は造血組織の前癌性もしくは
再生不良性異常の抑制： (7) 天然に存在する、投与された天然の、化学的
に合成もしくは修飾された、又は組織操作によ
るワクチン、あるいは医療目的に投与される他
のい抗原に対する細胞性又は液性応答の誘導に
おけるアシユバントとしての使用： (8) 神経伝達調整剤としてのもしくは精神活性剤
としての、医療目的のエンケフアリンとして
の、又は中枢神経系機能の調節剤としての使
用： (9) 上記の疾患状態の治療のための局所適用にお
いて： (10) 細胞毒性化学治療又は直接療法もしくはアジ
ユバント環境における癌性もしくは前癌性疾患
の治療における照射もしくは手術と組合わせ
て： (11) 直接抗ウイルス性、抗真菌性、抗細菌性、
もしくは抗原性動物活性を有する薬剤と組合わ
せて、又は典型及び非典型m.ツベルクロシス
の薬剤治療と組合わせて： (12) 他の免疫調節剤、リンホカイン（例えばIL
−１、IL−３、CSF−１、α−インターフエ
ロン、及びｒ−インターフエロン）、天然のも
しくは誘導性の抗細胞性毒素、癌性、感染性、
自己免疫性又はリウマチ性疾患の治療における
悪性細胞の溶解又は静止を中介する分子と組合
わせて：そして (13) 感染性疾患に対する予防。