RU2260049C2 - Рекомбинантная плазмидная днк pes3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека - Google Patents

Рекомбинантная плазмидная днк pes3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека Download PDF

Info

Publication number
RU2260049C2
RU2260049C2 RU2003122739/13A RU2003122739A RU2260049C2 RU 2260049 C2 RU2260049 C2 RU 2260049C2 RU 2003122739/13 A RU2003122739/13 A RU 2003122739/13A RU 2003122739 A RU2003122739 A RU 2003122739A RU 2260049 C2 RU2260049 C2 RU 2260049C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
csf
pes3
recombinant
plasmid
dna
Prior art date
Application number
RU2003122739/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2003122739A (ru
Inventor
А.Г. Габибов (RU)
А.Г. Габибов
Н.А. Пономаренко (RU)
Н.А. Пономаренко
И.И. Воробьев (RU)
И.И. Воробьев
А.В. Демин (RU)
А.В. Демин
нов В.А. Марть (RU)
В.А. Мартьянов
А.М. Шустер (RU)
А.М. Шустер
Д.И. Баирамашвили (RU)
Д.И. Баирамашвили
А.И. Мирошников (RU)
А.И. Мирошников
Original Assignee
Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН
Закрытое Акционерное Общество "Мастерклон"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Закрытое Акционерное Общество "Мастерклон" filed Critical Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН
Priority to RU2003122739/13A priority Critical patent/RU2260049C2/ru
Publication of RU2003122739A publication Critical patent/RU2003122739A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2260049C2 publication Critical patent/RU2260049C2/ru

Links

Images

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pES3-7, которая имеет молекулярную массу 3,63 МДа (5907 п.о.) и состоит из Ndel/Notl-фрагмента ДНК, содержащего последовательность искусственного гена рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, гена β-лактамазы, и Ndel/Notl-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7. Плазмида pES3-7 содержит в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pES3-7 клеток E.coli к ампициллину и уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта Ndel: Xbal - 38 п.о., Hpal - 1332 п.о., Pstl - 4065 п.о., Pvul - 4190 п.о., Xhol - 5363 п.о. Полученной плазмидой трансформируют клетки Escherichia coli и получают штамм Е.coli BL21(DE3)/pES3-7 - суперпродуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Изобретение позволяет получать рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор с высоким выходом (в количестве 20-30% от суммарного содержания белка клеток) и по упрощенной технологии. 2 н.п. ф-лы, 2 ил.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии, и может быть использовано для получения полипептида с последовательностью рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.
Полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (Г-КСФ), синонимы: колониестимулирующий фактор-3, плюрипоэтин, относится к белковому семейству колониестимулирующих факторов, включающему также гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и макрофагальный колониестимулирующий фактор. Г-КСФ секретируется активированными моноцитами, макрофагами и нейтрофилами. Г-КСФ человека представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 20-25 кДа. Пептидная часть Г-КСФ представлена двумя вариантами: 174 и 177 аминокислотных остатков, получаемых за счет альтернативного сплайсинга матричной РНК. Оба варианта содержат по 5 цистеиновых аминокислотных остатков и два внутримолекулярных дисульфидных мостика. Г-КСФ - гемопоэтический фактор роста, стимулирует рост клеток костного мозга на последних стадиях дифференциации, значительно увеличивая количество лейкоцитов, главным образом, нейтрофилов, в периферической крови.
[Nagata S., Tsuchiya M., Asano S., Kaziro Y., Yamazaki Т., Yamamoto О., Hirata Y., Kubota N., Oheda M., Nomura H., Ono M. // Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor. Nature, 1986, v.319, p.415-418. Nagata S., Tsuchiya M., Asano S., Yamamoto О., Hirata Y., Kubota N., Oheda M., Nomura H., Yamazaki Т. // The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor. EMBO I., 1986, v.5(3), p.575-581.]
Г-КСФ осуществляет свое действие через связывание со специфическим рецептором [Fukunaga R., Seto Y., Mizushima S., Nagata S. // Three different mRNAs encoding human granulocyte colony-stimulating factor receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, v.87, p.8702-8706].
Лекарственные формы Г-КСФ (синонимы - Нейпоген (Ф.Хоффманн-Ля Рош Лтд.) и Граноцит (Авентис)) широко используются в медицине для терапии нейтропении у больных, получающих цитостатические средства для лечения немиелоидных злокачественных заболеваний; для купирования побочных эффектов миелосупрессивной химиотерапии; для терапии наследственной, периодической и злокачественной нейтропении; для сокращения продолжительности периода нейтропении и ее клинических последствий у больных, готовящихся к трансплантации костного мозга.
Известен способ получения рекомбинантного Г-КСФ, основанный на получении рекомбинантного Г-КСФ в трансформированных дрожжевых клетках Saccharomyces cerevisiae [Gillis S., Urdal D.L., Clevenger W., Klinke R., Sassenfeld H., Price V., Cosman D. // Production of recombinant human colony stimulating factors in yeast. Behring Inst. Mitt., 1988, p.1-7]. При таком подходе удается получить Г-КСФ человека в правильной конформации с хорошей физиологической активностью. Недостатками этого способа является снижение выхода за счет деградации целевого белка внутриклеточными протеазами.
Известен также способ получения Г-КСФ, включающий экспрессию в клетках Escherichia coli, заключающийся в секреции клетками бактерий рекомбинантного Г-КСФ в виде растворимого белка в периплазматичекое пространство [заявка РСТ WO 01/00549, МКИ C 12 N 15/70, опубл. 2001]. Способ обеспечивает возможность получения правильной конформации белка без рефолдинга. Недостатком является экспрессия Г-КСФ с дополнительным пептидом на N-конце для устранения токсического действия белка, что делает необходимым отрезание специфической протеазой этого пептида.
Известен наиболее близкий к заявленному способ получения Г-КСФ, включающий экспрессию в клетках Escherichia coli, заключающийся в быстром биосинтезе клетками бактерий рекомбинантного Г-КСФ в виде нерастворимых «телец включения» [патент РФ №2113483, МКИ C 12 N 15/27, опубл. 1/21]. В этом способе проводят конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pGGF8, кодирующей конститутивный синтез полипептида со свойствами Г-КСФ человека, и штамма Escherichia coli SG20050/pGGF8, обеспечивающего синтез этого пептида с уровнем экспрессии не ниже 10% суммарного клеточного белка. Недостатком этого способа является длительность процесса (16 часов) конститутивной экспрессии, что снижает технологичность процесса.
Изобретение решает задачу конструирования плазмиды, детерминирующей синтез рекомбинантного белка, и создания высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный Г-КСФ с высоким выходом (до 30% от суммарного содержания белка клеток) и по упрощенной технологии (за 6 часов).
Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pES3-7, имеющей молекулярную массу 3,63 МДа (5907 п.о.) и состоящей из NdeI/NotI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/NotI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность искусственного гена рекомбинантного Г-КСФ. Плазмида pES3-7 содержит в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных этой плазмидой клеток Е.coli к ампициллину. Плазмида pES3-7 содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: XbaI - 38 п.о., HpaI - 1332 п.о., PstI - 4065 п.о., PvuI - 4190 п.о., XhoI - 5363 п.о. Для решения задачи также используется штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pES3-7, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pES3-7 - продуцент рекомбинантного Г-КСФ и обеспечивающий синтез рекомбинантного Г-КСФ в количестве 20-30% от суммарного содержания белка клеток.
Преимущества предлагаемого изобретения заключаются, во-первых, в использовании при химико-ферментативном синтезе гена Г-КСФ максимально широкого набора кодонов, являющихся оптимальными для продукции белка в Escherichia coli; расположение которых в синтетическом гене устраняет возможность образования на синтезируемой мРНК протяженных "шпилек", потенциально ингибирующих трансляцию. На фиг.1 приведена аминокислотная последовательность Г-КСФ и соответствующая ей нуклеотидная последовательность гена: верхняя строка - природная кДНК Г-КСФ, нижняя строка - синтезированный искусственный ген. Во-вторых, - применение для биосинтеза рекомбинантного белка оптимальных регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию: Т7-Iac промотора для предотвращения базальной экспрессии гена до момента начала индукции и высокого уровня транскрипции соответствующей мРНК при индукции, высокоэффективного терминатора транскрипции Т7, и блока стоп-кодонов, исключающих биосинтез удлиненных вариантов рекомбинантного Г-КСФ. Преимущества предлагаемого штамма E.coli заключается в использовании бактерий с фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo рекомбинантного Г-КСФ и загрязнения выделяемого белка наиболее активными протеазами E.coli.
Конструирование нового гена, кодирующего Г-КСФ человека, осуществляют на основе плазмиды рЕТ22b(+). Искусственный ген, кодирующий Г-КСФ, фланкированный сайтами рестриктаз NdeI и NotI, получают химико-ферментативным синтезом набора олигонуклеотидных фрагментов с последующей их сборкой и амплификацией при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Перед лигированием для генерации липких концов амплификат и векторную плазмиду обрабатывают рестриктазами NdeI и NotI. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток Е.coli DH5α. Отбор положительных клонов проводят при помощи ПЦР с использованием специфических праймеров с последующим рестриктным анализом выделенной плазмидной ДНК рестриктазами NdeI и NotI. Структуру гена, кодирующего рекомбинантный Г-КСФ, определяют секвенированием по методу Сенгера. Она должна полностью соответствовать нуклеотидной последовательности исходного искусственного гена Г-КСФ (фиг.1).
Рекомбинантная плазмидная ДНК pES3-7, кодирующая полипептид Г-КСФ, характеризуется следующими признаками:
- имеет молекулярную массу 3,63 МДа;
- кодирует полипептид Г-КСФ;
- состоит из: NdeI/NotI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+), содержащей промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/NotI - фрагмента ДНК, включающего искусственный ген Г-КСФ;
- имеет уникальную совокупность признаков: промотор и терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7, усилитель трансляции гена 10 бактериофага Т7; искусственный ген, кодирующий Г-КСФ; ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pES3-7 клеток Е.coli к ампициллину; уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: XbaI - 38 п.о., Hpal - 1332 п.о., PstI - 4065 п.o., PvuI - 4190 п.o., XhoI - 5363 п.о.
Для получения штамма-продуцента рекомбинантного Г-КСФ плазмидную ДНК pES3-7 используют для трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) и проводят отбор клонов, сохраняющих уровень биосинтеза рекомбинантного полипептида не ниже 20-30% от суммарного клеточного белка в течение по крайней мере шести последовательных пассирований. Для этого клоны трансформированных плазмидой pES3-7 клеток Е.coli BL21(DE3) выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) с добавлением ампициллина до 100 мкг/мл и раствора глюкозы до 1% в течение 12-14 часов, инокулируют новую порцию питательной среды в соотношении 1:100, растят культуру до достижения оптической плотности 1 О.Е., индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом, и растят еще 3-6 часов. Получение из клеток продуцента рекомбинантного Г-КСФ включает следующие стадии: отделение бактерий от культуральной среды, их разрушение одним из обычно применяемых способов; отмывку буферными растворами телец включения от водорастворимых компонентов клетки; солюбилизацию и восстановление целевого белка, его рефолдинг и окончательную очистку.
Полученный штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pES3-7 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YT-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки: клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам: клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы(bla).
Преимущества предлагаемого штамма-продуцента заключается в использовании бактерий с фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo рекомбинантного Г-КСФ и загрязнения выделяемого белка наиболее активными протеазами E.coli.
Клетки Е.coli BL21(DE3)/pES3-7 являются суперпродуцентом. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом происходит эффективный биосинтез рекомбинантного Г-КСФ, который накапливается в клетках в количестве более 20% суммарного белка бактерий.
На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность и кодируемая ею аминокислотная последовательность NdeI/NotI-фрагмента плазмиды pES3-7; на фиг.2 - физическая карта плазмиды pES3-7.
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pES3-7.
Нуклеотидную последовательность, соответствующую гену Г-КСФ, получают химико-ферментативным синтезом. Для этого теоретически расчитанную последовательность ДНК разбивают на перекрывающиеся фрагменты размером около 50 п.о. Химический синтез олигонуклеотидов, соответствующих этим фрагментам, выполняют твердофазным фосфоамидитным методом при помощи, например, ДНК-синтезатора ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов -5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Полученные олигонуклеотиды подвергают 5'-концевому фосфорилированию с использованием Т4 полинуклеотидкиназы (Fennentas, Литва). Для этого олигонуклеотиды в количестве 20 пмоль смешивают с ферментом в количестве 10 ед. в буферном растворе, содержащем 50 мМ Tris-HCl (pH 7.6 при 25°С), 10 мМ MgCl2, 5 мМ дитиотреита, 1 мМ спермидина, 0.1 мМ АТФ и 0.1 мМ ЭДТА. Реакцию ведут 30 минут, полинуклеотид киназу инактивируют нагреванием до 65°С в течение 10 мин.
Фосфорилированные олигонуклестиды смешивают в эквимолярном соотношении в 50 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATR, 10 мМ дитиотреита, прогревают до 65°С, медленно охлаждают до 37°С в течение часа и добавляют 10 ед.ак. Т4-ДНК-лигазы. Реакцию лигирования ДНК проводят 4 ч при 37°С. 0.1 мкл полученного раствора используют в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы Pfu и специфических праймеров:
Figure 00000002
Проводят 25 циклов амплификации (95°С, 20 с; 62°С, 40 с; 72°С, 60 с) для синтеза полноразмерного фрагмента ДНК, содержащего последовательность гена Г-КСФ, фланкированного сайтами узнавания рестриктаз NdeI и NotI. Продукт амплификации гидролизуют рестриктазами NdeI и NotI, очищают электрофорезом в 5% акриламидном геле, полосу ДНК величиной около 550 п.о. выделяют из геля методом электроэлюции и осаждают ДНК из раствора этанолом.
Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ-22b(+) (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой NdeI (10 ед.акт.), осаждают ДНК этанолом, растворяют в 40 мкл буфура R (10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл BSA) и обрабатывают рестриктазой Notl (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Полученный фрагмент ДНК величиной 5,4 т.п.о. после электрофоретического разделения в 1% агарозном геле выделяют из геля методом электроэлюции и осаждают ДНК из раствора этанолом.
1 мкг полученного векторного фрагмента лигируют с 2 пмоль NdeI/NotI-фрагмента размером 550 п.о., содержащего синтетический ген рекомбинантного Г-КСФ, в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATR, 10 мМ дитиотреита) с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
1 мкл полученной лигазной смеси используют для электротрансформации компетентных клеток Е.coli BL21(DE3), которую проводят, например, при помощи аппарата для электротрансформации ВТХ 600 (ВТХ, США) при зазоре между пластинами электропорационной кюветы 1 мм и напряжении разряда 1.4 кВ. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой SOC, растят 1 час на +37°С и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.
Первичный отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, проводят методом "ПЦР с клонов" с использованием специфических праймеров:
Figure 00000003
Проводят 25 циклов амплификации (95°С, 20 с; 62°С, 40 с; 72°С, 60 с), с последующим электрофоретическим анализом ПЦР продуктов в 1% агарозном геле на наличие ПЦР-продукта длиной около 550 п.н. Отобранные клоны используют для подроста в жидкой среде и выделения плазмидной ДНК плазмиды, которую анализируют на наличие вставки с помощью эндонуклеаз рестрикции NdeI и NotI с последующим разделением продуктов гидролиза в 5% полиакриламидном геле. Окончательное строение плазмид, содержащих NdeI/NotI-фрагмент около 550 п.о., подтверждают определением нуклеотидной последовательности методом секвенирования по Сенгеру. По данным секвенирования отбирают ту плазмиду, нуклеотидная и соответствующая ей аминокислотная последовательности NdeI/NotI-фрагмента которой полностью идентичны первоначально запланированной (фиг.1). Проводят трансформацию клеток Е.coli BL21(DE3) выбранной плазмидой, как описано выше, петлей переносят 5-10 колоний в 5 мл жидкой среды 2xYT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А550 0,7-0,8, отбирают аликвоту культуры для последующего анализа, прибавляют индуктор - изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают рост еще 2 ч. Равные аликвоты суспензии клеток, отобранных до внесения индуктора и после завершения роста, центрифугируют, отделяют супернатант и анализируют осадок клеток электрофорезом в ПААГ. Появление отчетливо видимой полосы белка в районе 20 кДа в образце пробы, отобранной после индукции, свидетельствует о способности штамма синтезировать рекомбинантный Г-КСФ при индукции IPTG и полностью подтверждает корректность сборки плазмиды.
Пример 2.
Получение штамма-продуцента Е.coli BL21(DE3)/pES3-7 с рекомбинантным Г-КСФ и определение его продуктивности.
Штамм-продуцент Е.coli BL21(DE3)/pES3-7 получают трансформацией компетентных клеток Е.coli BL21(DE3) плазмидой pES3-7, как описано в примере 1.
Штамм продуцента Е.coli BL21(DE3)/pES3-7 выращивают при 37°С в 100 мл YT-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А550 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 4 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А550 и количество культуры, соответствующее 1 мл с А550 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 с ультразвуком, нагревают 3 мин при 100°С и пробы по 1 мкл используют для электрофореза в 15% ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе целевого белка. По данным сканирования содержание рекомбинантного Г-КСФ составляет 20-30% от всех клеточных белков.

Claims (2)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pES3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, имеющая молекулярную массу 3,63 МДа (5907 п.о.), состоящая из
NdeI/NotI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы и усилитель трансляции гена 10 фага Т7;
NdeI/NotI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность искусственного гена рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, приведенную на фиг.1, и содержащая
ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pES3-7 клеток Е. coli к ампициллину, в качестве генетического маркера,
уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: XbaI - 38 п.о., HpaI - 1332 п.о., PstI - 4065 п.о., PvuI - 4190 п.о., XhoI - 5363 п.о.
2. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pES3-7, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pES3-7, продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.
RU2003122739/13A 2003-07-24 2003-07-24 Рекомбинантная плазмидная днк pes3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека RU2260049C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2003122739/13A RU2260049C2 (ru) 2003-07-24 2003-07-24 Рекомбинантная плазмидная днк pes3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2003122739/13A RU2260049C2 (ru) 2003-07-24 2003-07-24 Рекомбинантная плазмидная днк pes3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2003122739A RU2003122739A (ru) 2005-03-10
RU2260049C2 true RU2260049C2 (ru) 2005-09-10

Family

ID=35364096

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2003122739/13A RU2260049C2 (ru) 2003-07-24 2003-07-24 Рекомбинантная плазмидная днк pes3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2260049C2 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2529363C2 (ru) * 2011-03-02 2014-09-27 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-Технологический Центр "БиоИнвест" РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР ЧЕЛОВЕКА (G-CSF) И РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА рAS017, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ G-CSF В КЛЕТКАХ Escherichia coli
RU2680886C1 (ru) * 2018-05-25 2019-02-28 Илья Александрович Марков Рекомбинантная плазмида pFM-GCSF5, обеспечивающая экспрессию синтетического гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, штамм бактерий Escherichia coli FM-GCSF - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека и способ его получения

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEONG K.J. et al., Secretory production of human granulocyte colony-stimulating factor in Escherichia coli, Protein Expr. Purif., 2001, v.23, n.2, p.311-318. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2529363C2 (ru) * 2011-03-02 2014-09-27 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-Технологический Центр "БиоИнвест" РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР ЧЕЛОВЕКА (G-CSF) И РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА рAS017, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ G-CSF В КЛЕТКАХ Escherichia coli
RU2680886C1 (ru) * 2018-05-25 2019-02-28 Илья Александрович Марков Рекомбинантная плазмида pFM-GCSF5, обеспечивающая экспрессию синтетического гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, штамм бактерий Escherichia coli FM-GCSF - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека и способ его получения

Also Published As

Publication number Publication date
RU2003122739A (ru) 2005-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR860001230B1 (ko) 이중 가닥 dna의 분할 방법
US5427927A (en) Process for the enzymatic cleavage of recombinant proteins using IgA proteases
HU205384B (en) Process for increased expressin of human interleukin-2 in mammal cells
KR100358948B1 (ko) 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자를 분비하는 대장균
NL8602960A (nl) Humaan mangaansuperoxydedismutase cdna, expressie daarvan in bacterien en werkwijze voor het winnen van enzymatisch actief humaan mangaansuperoxydedismutase.
RU2260049C2 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк pes3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека
RU2316590C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pE-His8-TrxL-Ar2, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД АРЕНИЦИН МОРСКОГО КОЛЬЧАТОГО ЧЕРВЯ Arenicola marina, И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО АРЕНИЦИН
JP4445466B2 (ja) 大腸菌で発現させるためのヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする合成遺伝子
RU2453602C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pЕТ22b(+)/SLURP-1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК SLURP-1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/SLURP-1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА SLURP-1 ЧЕЛОВЕКА
RU2233879C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк pes1-6, кодирующая полипептид соматотропин, и штамм escherichia coli bl 21(de3)/pes1-6-продуцент рекомбинантного соматотропина
EP0218652B1 (en) A dna sequence
RU2258081C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк pes4-4, кодирующая полипептид интерферон альфа-2b человека, и штамм escherichia coli bdees4 - продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2b человека
KR20130141001A (ko) 목적 단백질의 분리 및 정제를 위한 신규한 벡터 시스템
RU2261913C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pES6-1, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ИНТЕРФЕРОН БЕТА-1b ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli BDEES6 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА БЕТА-1b ЧЕЛОВЕКА
WO1992019737A1 (en) Process for producing a monocyte chemotactic factor polypeptide and a strain for the production thereof
SU1703693A1 (ru) Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека
WO2008096368A2 (en) A novel process for production of recombinant human g-csf
RU2426787C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET32M/mTrx-rhIL-11, КОДИРУЮЩАЯ ИНТЕРЛЕЙКИН -11 ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pET32M/mTrx-rhIL-11 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-11
RU2153535C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк psav27, кодирующая синтез растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii, и бактериальный штамм escherichia coli - продуцент растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii
RU2708556C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E.COLI SG 20050/ p280_2GM - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида
WO1988005993A2 (en) Aminopeptidase for removing n-terminal methionine from proteins and proteins prepared therefrom
RU2583307C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/slurp-2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК SLURP-2, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3) pET22b(+)/slurp-2- ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА SLURP-2 ЧЕЛОВЕКА
KR101658081B1 (ko) CysQ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법
RU2271392C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFGM17, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pFGM17 - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА
RU2465315C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPBS-St9, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СОМАТОТРОПИНА, И ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ДЛЯ ПРОДУКЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО СОМАТОТРОПИНА

Legal Events

Date Code Title Description
PC43 Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions

Effective date: 20161202

PD4A Correction of name of patent owner