ES2295054T3 - Peptido c para la produccion mejorada de insulina y analogos de insulina. - Google Patents

Peptido c para la produccion mejorada de insulina y analogos de insulina. Download PDF

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ES2295054T3
ES2295054T3 ES00960664T ES00960664T ES2295054T3 ES 2295054 T3 ES2295054 T3 ES 2295054T3 ES 00960664 T ES00960664 T ES 00960664T ES 00960664 T ES00960664 T ES 00960664T ES 2295054 T3 ES2295054 T3 ES 2295054T3
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insulin
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Paul Habermann
Johann Ertl
Johannes Meiwes
Gerhard Seipke
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Sanofi Aventis Deutschland GmbH
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Sanofi Aventis Deutschland GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

Precursor de insulina humana o de un análogo de insulina de la fórmula I Fus-B(1-30)-RDVP-Yn-A(1-21) (I); en donde Fus es una parte de fusión opcionalmente presente de secuencia arbitraria; B(1-30) es la cadena B de insulina humana, Y representa una cadena de aminoácidos que termina con un aminoácido de carácter básico C-terminal; n es igual a 2 hasta 50 e indica la longitud de la cadena de aminoácidos Y; y A(1-21) es la cadena A de insulina humana, y la cadena A y/o la cadena B pueden estar modificadas por intercambios, deleciones y/o adiciones de aminoácidos.

Description

Péptido C para la producción mejorada de insulina y análogos de insulina.
La presente invención se refiere a un derivado sintético del péptido C de proinsulina. Proinsulina, que contiene este derivado, tiene, de una forma distinta, mejores propiedades que la proinsulina de mono habitual, en particular mejora el rendimiento final del respectivo derivado de insulina en su preparación por tecnología genética.
El número de enfermedades de diabetes aumenta constantemente en todo el mundo. De manera proporcional a ello aumenta la demanda de insulina o derivados de la insulina. Con ello, existe la misión de optimizar los procedimientos existentes en relación con el rendimiento de principio activo. En la patente europea EP-B1 0 489 780 se propone un procedimiento para la preparación de insulina o derivados de la misma. Los vectores allí descritos sirven para la preparación de insulina humana con el plásmido pINT90d o como plásmidos de partida para la construcción del plásmido pINT302d descrito en la solicitud de patente europea EP-A 0 821 006, que sirve para la preparación de un derivado de His(B31) His(B32) Gly(A21)-insulina, o para la construcción del vector pINT329d descrito en la solicitud de patente europea EP-A 0 885 961, que sirve para la preparación del derivado de Lys(B3) Glu(B29)-
insulina.
Se ha encontrado ahora, que derivados de proinsulina particularmente ventajosos son los de la fórmula 1,
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1 
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en donde
Fus
es una parte de fusión, opcionalmente presente, de secuencia arbitraria;
B(1-30)
es la cadena B de insulina humana,
Y
representa una cadena de aminoácidos que termina con un aminoácido de carácter básico C-terminal;
n
es igual a 2 hasta 50 e indica la longitud de la cadena de aminoácidos Y; y
A(1-21)
es la cadena A de insulina humana,
y la cadena A y/o la cadena B pueden estar modificadas por intercambios, deleciones y/o adiciones de aminoácidos. Sorprendentemente, en este caso se observan, en función de la composición de la cadena A o B de la insulina, ventajas iguales o distintas entre sí.
Si se une la cadena B humana con la cadena A humana a través del péptido C ventajoso, entonces resulta una proinsulina, que se comporta, respecto al rendimiento de expresión, como proinsulina de tipo salvaje, cuyo procesamiento enzimático para dar insulina se puede controlar, sin embargo, más fácilmente, de manera que no se forman trazas perturbadoras de la cadena B prolongada en arginina, que deben separarse en la preparación de medicamentos, con lo que aparecen pérdidas de rendimiento.
Si se une una cadena B, prolongada en di - histidina en posición C-terminal con la cadena A de insulina humana, que en la posición A21 contiene glicina, con el péptido C de acuerdo con la invención, entonces se observa un rendimiento de expresión aprox. un 20% más elevado en comparación con los rendimientos que se pueden alcanzar con el plásmido pINT90d y un rendimiento casi cinco veces más elevado que el observado con el plásmido pINT302d. Además, se simplifica asimismo el control del procesamiento enzimático, tal como se describió antes.
Si se une una cadena B, modificada con Lys(B3)Glu(B29), con la cadena A de insulina humana a través del péptido C modificado, entonces se observan propiedades de plegamiento mejoradas del derivado de proinsulina en comparación con la proinsulina codificada por pINT329d. El rendimiento en proteína de fusión bruta está incrementado y alcanza un mismo nivel que el que se observa con el plásmido pINT90d. Además, se simplifica el control del procesamiento enzimático.
\newpage
Una forma de realización particularmente ventajosa del nuevo péptido C se caracteriza por la secuencia de aminoácidos siguiente:
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2
Asimismo se indica una de muchas secuencias de ADN posibles, que codifica el péptido C indicado.
Un objeto de la invención es un precursor de insulina humana o de un análogo de insulina de la fórmula 1
3
en donde
Fus
es una parte de fusión, opcionalmente presente, de secuencia arbitraria;
B(1-30)
es la cadena B de insulina humana,
Y
representa una cadena de aminoácidos que termina con un aminoácido de carácter básico C-terminal;
n
es igual a 2 hasta 50 e indica la longitud de la cadena de aminoácidos Y; y
A(1-21)
es la cadena A de insulina humana,
y la cadena A y/o la cadena B pueden estar modificadas por intercambios, deleciones y/o adiciones de aminoácidos, en particular en donde Y_{n} representa los aminoácidos 5 a 35 del péptido C de insulina humana o de mono, de preferencia en donde Y_{n} representa los aminoácidos 11 a 35 de insulina humana.
Otro objeto de la invención son precursores tal como se han descrito antes, en donde la cadena B de insulina humana contiene las modificaciones Lys(B3) Glu(B29), o en donde las cadenas B y A de insulina humana contienen las modificaciones His(B31) His(B32) Gly(A21).
Además de ello, objeto de la invención es un ADN que codifica un precursor tal como se describe arriba.
Es asimismo objeto de la invención un vector, que contiene un ADN que codifica un precursor tal como se describe antes, preferiblemente caracterizado porque el vector es un vector de expresión adecuado para la expresión en E. coli.
Otro objeto de la invención es una célula de E. coli, que contiene un vector tal como se describe antes.
Otro objeto de la invención es un procedimiento para la preparación de un precursor tal como se ha descrito antes, en el que
(a)
un ADN tal como se ha descrito antes se incorpora en un vector tal como se ha descrito antes;
(b)
el vector de (a) se introduce en una célula de E. coli;
(c)
la célula de E. coli de (b) que contiene el vector de (a) se utiliza para la expresión; y
(d)
el precursor se aísla del sobrenadante del cultivo.
Además de ello, es objeto de la invención un procedimiento para la preparación de un ADN tal como se ha descrito antes, en el que
(a)
partiendo del ADNc de la insulina humana o de mono, mediante PCR y otras técnicas de biología molecular se genera este ADN y
(b)
se aísla.
Otro objeto de la invención es un procedimiento para la preparación de insulina humana o de un análogo de insulina, en el que
(a)
se produce un precursor tal como se describe antes conforme al procedimiento tal como se describe antes;
(b)
el precursor conforme a (a) se pliega en condiciones adecuadas, de tal manera que se pueden formar puentes disulfuro como en la insulina humana, y se separan enzimáticamente la parte RDVP-Y_{n} y, eventualmente, la parte de fusión Fus; y
(c)
se purifica la insulina humana o el análogo de insulina.
Otro objeto de la invención es el uso de un precursor tal como se ha descrito antes para la preparación de insulina o de un análogo de insulina, preferiblemente en donde la preparación de insulina o de un análogo de insulina se realiza conforme al procedimiento tal como se describe antes.
Además, es objeto de la invención el uso de un ADN tal como se ha descrito antes para la preparación de un precursor tal como se describe antes.
También es objeto de la invención el uso de un vector tal como se ha descrito antes para la preparación de un precursor tal como se describe antes.
Otro objeto de la invención es el uso de una célula de E. coli tal como se ha descrito antes para la preparación de un precursor tal como se describe antes.
La invención se explica ahora más detalladamente con ayuda de los Ejemplos, pero sin limitarla a ellos.
Ejemplo 1 Expresión de derivados de proinsulina
La expresión se efectúa como se describe en el documento EP-B1 0 489 780. Con ello, en el caso de la fermentación en gran volumen se pueden introducir modificaciones. Al comparar las tasas de expresión se mantienen, sin embargo, siempre las mismas condiciones.
Para trabajar a mayores escalas sirve la siguiente receta de fermentación general, la cual se describe a título de ejemplo para un volumen de 7,5 litros:
Volumen de fermentación
: {}\hskip0.5mm 7,5 l
Condiciones de esterilización
: 121°C, 20 minutos, a pH 3,5, tras esterilización ajustado a 7,0 con {}\hskip2mm NH_{3}.
Temperatura de la fermentación
: {}\hskip0.5mm 37°C
Regulación del pH
: {}\hskip0.5mm pH 7,0, ajuste con agua amoniacal al 25%
Número de revoluciones del agitador
: {}\hskip0.5mm 1500 rpm
Ventilación
: {}\hskip0.5mm 15 Nl/min (2 vvm)
Duración
: {}\hskip0.5mm aprox. 24 h
Alimentación
: {}\hskip0.5mm glucosa al 65% se aportó dosificadamente a partir de un valor OTR de {}\hskip2mm 200 mmoll^{-1}h^{-1} con una velocidad constante de 12 gl^{-1}h^{-1}
Cultivo previo
: {}\hskip0.5mm un cultivo de sacudimiento se inoculó con una ampolla de siembra y {}\hskip2mm se incubó durante 3 - 4 h a 37°C, 250 rpm hasta una DO A_{540} \sim 1.
Inoculación
: {}\hskip0.5mm los fermentadores se inocularon con aproximadamente 40 ml de cultivo {}\hskip2mm previo.
Inducción
: {}\hskip0.5mm a una A_{540} de \geq 40 con 40 mg/l (300 mg/fermentador) de ácido indol- {}\hskip2mm propiónico disueltos en aprox. 10 ml de una solución acuosa de Na_{2}CO_{3} {}\hskip2mm (con 0,17 g de Na_{2}CO_{3}).
En este caso, significan Nl = litros normales, vvm = volumen/volumen/minuto y OTR = Oxygen Transfer Rate (velocidad de transferencia de oxígeno).
Medios de fermentación
4 
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Solución de elementos traza
6 
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Medio en el matraz de sacudimiento
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Ejemplo 2 Preparación de insulinas
La preparación de insulinas se efectúa conforme a métodos conocidos, tales como se describe o discuten, p. ej., en el documento EP-B1 0 489 780 o EP-A 0 885 961. Para el plegamiento y el tratamiento de la respectiva proteína de fusión se prefiere en este caso el método descrito en el documento EP-B1 0 668 282 (véase el Ejemplo 2). En este caso, tras el plegamiento de manera correspondiente al documento EP 0 288 809, la tanda se puede filtrar antes del tratamiento ulterior.
Ejemplo 3 Construcción del plásmido pINT358d que codifica la proinsulina B - RDVP C_{11-35}- A humana derivatizada en relación con la cadena C
Para la preparación del plásmido se utilizaron los cebadores Tir e Insu11 descritos en el documento EP-B1 0 489 780. Adicionalmente se sintetizaron dos nuevas secuencias de cebadores.
El cebador PINT358flll tiene la siguiente secuencia:
8
El cebador PINT358revll tiene la secuencia:
80
Con ADN del plásmido pINT90d como matriz se lleva a cabo en cada caso una PCR con los pares de cebadores Tir/PINT358revll e Insu11/PINT358fIII de manera correspondiente al documento EP-B1 0 489 780. Se combinan partes alícuotas de los productos de las dos reacciones y se emplean junto con el par de cebadores Tir/Insu11 en una tercera PCR. El producto de esta reacción se digiere doblemente con las enzimas SalI/NcoI y el producto de esta digestión de restricción se inserta, después de la purificación, en el ADN del vector abierto con NcoI/SalI del plásmido pINT91d descrito asimismo en el documento EP-B1 0 489 780. El plásmido, así construido, recibe la denominación pINT358d. La estructura se confirma mediante análisis de la secuencia de ADN. Células de E. coli competentes se transforman con ADN del plásmido. La expresión de la proinsulina en bacterias se efectúa conforme al Ejemplo 1. Después del plegamiento conforme al Ejemplo 2 se efectúa la reacción enzimática de la proinsulina para dar insulina y purificación ulterior conforme al documento EP-B1 0 347 781. En este caso, en comparación con el procedimiento derivado de pINT90d, en la etapa de cromatografía de intercambio de iones se puede recoger adicionalmente una fracción de borde, ya que ésta no está contaminada con Arg(B31) - insulina.
Ejemplo 4 Construcción del plásmido pINT362d para la preparación de Lys(B3)Glu(B29) - RDVP -C_{11-35}-proinsulina
Para la construcción del plásmido se necesitan ADN de los plásmidos pINT329d y pINT358d como matriz y los cebadores Tir e Insu11. Adicionalmente se sintetizan dos nuevos cebadores Salforward y 329rev.
El cebador Salforward tiene la secuencia:
9
En este caso, el tramo de secuencia en negrillas se hibrida con el plásmido pINT358d, mientras que la parte restante es homóloga a secuencias del tramo del plásmido pINT329d que codifica la cadena B.
El cebador 329rev tiene la siguiente secuencia:
10
En este caso, el tramo en negrillas marca la región que es homóloga a la cadena antisentido, que forma el extremo de la cadena B y describe el triplete para arginina en el plásmido pINT329d. La secuencia restante se hibrida con el plásmido pINT358d. Se llevan a cabo dos tandas de PCR. En este caso, el ADN del plásmido pINT329d sirve como matriz para el par de cebadores Tir/329rev y el ADN de pINT358d sirve como matriz para el par Salforward/In- su11.
Las dos reacciones resultan en fragmentos, que se solapan en torno a la secuencia del cebador Salforward. Con ello, los dos fragmentos se pueden reunir en una tercera PCR y se combinan, con ayuda de los cebadores Tir e Insu11, para formar una secuencia de ADN que codifica el análogo de insulina. Este producto de reacción se disocia con las enzimas de restricción NcoI/SalI y, a continuación, se inserta en el fragmento de vector de pINT91d abierto con SalI/NcoI. Células competentes de la cepa K12 MM294 de E. coli se transforman con la tanda de ligamiento correspondiente. El ADN del plásmido se aísla de transformantes y se caracteriza. El plásmido correcto recibe la denominación pINT362d.
Después de la expresión se observa un rendimiento bruto de proteína de fusión equiparable a pINT90d. Sin embargo, el rendimiento de plegamiento observado es aproximadamente 40% mejor en comparación con pINT329d.
La estructura de la proteína de fusión, codificada por pINT362d, es como sigue:
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11
Ejemplo 5 Construcción del plásmido pINT349d para la preparación de His(B31) His(B32) Gly(A21)- RDVP -C_{11-35}-proinsulina
Primeramente se prepara el plásmido pINT140d, cuyo ADN codifica el análogo de insulina Gly (A21)-insulina.
Para ello, se necesitan como cebador dos oligonucleótidos para uso en una PCR:
El oligonucleótido Tir se utiliza como cebador "sentido" y el oligonucleótido 140drev se utiliza como cebador "antisentido":
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12
Los dos cebadores se emplean en una PCR estándar con ADN del plásmido pINT90d. El producto de la reacción se hace reaccionar, de manera correspondiente al documento EP-B1 0 489 780, con las enzimas de restricción NcoI y SalI y, a continuación, se emplean en el vector pINT69d abierto de manera correspondiente. Se forma el plásmido pINT140d, el cual, tras la transformación en K12 MM294 de E. coli, se vuelve a aislar y se caracteriza mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia.
Partiendo del ADN del plásmido pINT140d se llevan a cabo dos tandas por PCR. La primera reacción utiliza el cebador Tir y como cebador inverso PINT349a con la segunda secuencia:
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En este caso, las secuencias marcadas con un asterisco designan los codones para los aminoácidos recien introducidos.
\newpage
La segunda PCR se lleva a cabo con los cebadores Inu11 y PINT349b. El cebador PINT349b tiene la secuencia:
14
Desde la posición 34 a la posición 1 de la secuencia de ADN el cebador es complementario a PINT349a. Por lo tanto, los productos de reacción de las dos PCRs se reúnen, en una tercera PCR, con los cebadores Tir e Insu11, para dar el fragmento de ADN, que codifica el derivado de proinsulina deseado. El producto de esta reacción se hace reaccionar, como se describe, con las enzimas NcoI y SalI y se emplea en el fragmento de vector pINT91d abierto con estas enzimas y se transforma según K12 de E. coli. Después de la caracterización de los plásmidos a partir de transformantes las construcciones de plásmidos correctos reciben la denominación pINT349d.
La proteína de fusión se expresa de modo que se manifiesta un claro aumento del rendimiento en proteína de fusión. El rendimiento es, sorprendentemente, aprox. un 20% más alto que el que se puede obtener con pINT90d y es aprox. 5 veces mayor que con el plásmido pINT30d. La tasa de plegamiento es en este caso equiparable a la tasa alcanzada por pre-propinsulina de mono, codificada por pINT90d.
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH
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<120> Péptido C para la preparación mejorada de insulina y análogos de insulina
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<130> 1999/L059
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<140> 19947456.7
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<141> 1999-10-02
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<160> 13
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<170> PatentIn Ver.2.1
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<210> 1
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<211> 87
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN que codifica la variante de péptido C
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15 
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<211> 29
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<212> PRT
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<223> Descripción de la secuencia artificial: variante de C-Pep-insulina
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16 
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<211> 45
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador PINT 358fIII
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia parcial de la proteína de PINT 358fIII
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<210> 5
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cctgaggaac atcgcgggtc tcgggtgtgt ag 
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 140drev
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskip
aaaggtcgac tattagccgc agta 
\hfill
24 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia parcial de la proteína de PINT 349a
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<400> 10
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\sa{Val Gln Pro Val Asp Arg His His Thr Lys Pro Thr Tyr}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 329a
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskip
cacctgagga acatcgcggt ggtgggtctt gggtgtgtag 
\hfill
40 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia parcial de la proteína de PINT 349b
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<400> 12
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\sa{Pro Lys Thr His His Arg Asp Val Pro Gln Val Glu Leu} 1 5 10
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<210> 13
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador PINT 349b
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskip
acccaagacc caccaccgcg atgttcctca ggtggagctg 
\hfill
40 
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Claims (18)

1. Precursor de insulina humana o de un análogo de insulina de la fórmula I
18
en donde
Fus
es una parte de fusión opcionalmente presente de secuencia arbitraria;
B(1-30)
es la cadena B de insulina humana,
Y
representa una cadena de aminoácidos que termina con un aminoácido de carácter básico C-terminal;
n
es igual a 2 hasta 50 e indica la longitud de la cadena de aminoácidos Y; y
A(1-21)
es la cadena A de insulina humana,
y la cadena A y/o la cadena B pueden estar modificadas por intercambios, deleciones y/o adiciones de aminoácidos.
2. Precursor conforme a la reivindicación 1, en donde Y_{n} representa los aminoácidos 5 a 35 del péptido C de insulina humana o de mono.
3. Precursor conforme a la reivindicación 1, en donde Y_{n} representa los aminoácidos 11 a 35 del péptido C de insulina humana.
4. Precursor conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la cadena B de insulina humana contiene las modificaciones Lys(B3)Glu(B29).
5. Precursor conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las cadenas B y A de insulina humana contienen la modificación His(B31)His(B32)Gly(A21).
6. ADN, que codifica un precursor conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Vector, que contiene un ADN conforme a la reivindicación 6.
8. Vector conforme a la reivindicación 7, caracterizado porque el vector es un vector de expresión adecuado para la expresión en E. coli.
9. Célula de E. coli, que contiene un vector conforme a la reivindicación 8.
10. Procedimiento para la preparación de un precursor conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que
a)
un ADN conforme a la reivindicación 6 se incorpora en un vector conforme a la reivindicación 7;
b)
el vector de (a) se introduce en una célula de E. coli;
c)
la célula de E. coli de (b) que contiene el vector de (a) se utiliza para la expresión; y
d)
el precursor se aísla del sobrenadante del cultivo.
11. Procedimiento para la preparación de un ADN conforme a la reivindicación 6, en el que
a)
partiendo del ADNc de la insulina humana o de mono, mediante PCR y otras técnicas de biología molecular, se genera el ADN conforma a la reivindicación 6 y
b)
se aísla.
12. Procedimiento para la preparación de insulina humana o de un análogo de insulina, en el que
a)
se genera un precursor conforme al procedimiento según la reivindicación 10;
b)
el precursor conforme a (a) se pliega en condiciones adecuadas de tal manera que se pueden formar puentes disulfuro como en la insulina humana, y se separan enzimáticamente la parte RDVP-Y_{n} y, eventualmente, la parte de fusión Fus; y
c)
se purifica la insulina humana o el análogo de insulina.
13. Uso de un precursor conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de insulina o de un análogo de insulina.
14. Uso conforme a la reivindicación 13, en donde la preparación de insulina o de un análogo de insulina se efectúa conforme al procedimiento de la reivindicación 12.
15. Uso de un ADN conforme a la reivindicación 6 para la preparación de un precursor conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5.
16. Uso de un vector conforme a la reivindicación 8 para la preparación de un precursor conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5.
17. Uso de una célula de E. coli conforme a la reivindicación 9 para la preparación de un precursor conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5.
18. Uso conforme a una de las reivindicaciones 15, 16 ó 17, en donde la preparación del precursor se efectúa conforme al procedimiento de la reivindicación 10.
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