MXPA02003103A - Peptido c par ala produccion mejorada de insulina y analogos de insulina. - Google Patents
Peptido c par ala produccion mejorada de insulina y analogos de insulina.Info
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Abstract
La invencion se refiere a un precursor de insulina humana o un analogo de insulina de la formula (I): Fus-B(1-30)-RDVP-Yn-A(1-21), mediante el cual Fus es un componente de fusion opcionalmente presente de cualquier secuencia, B (1-30) es la cadena B de la insulina humana, Y representa una cadena de aminoacidos que termina con un aminoacido basico C terminal, n es 2 a 50 e indica la longitud de la cadena de aminoacidos Y, y A (1- 21) es la cadena A de la insulina humana. La cadena A y/o B puede ser modificada por medio de intercambios, deleciones y/o adiciones de aminoacidos. La invencion tambien se refiere a un DNA que codifica para estas. La invencion ademas se refiere a la produccion y el uso del precursor y el DNA asi como a un metodo para producir insulina humana o un analogo de insulina.
Description
PEPTIDO C PARA LA PRODUCCIÓN MEJORADA DE INSULINA Y ANÁLOGOS DE INSULINA
La presente invención se refiere a un derivado sintético del péptido de proinsulina C. La proinsulina que contiene este derivado tiene propiedades que son mejores en diversos sentidos que la proinsulina de mono tradicional, en particular, se mejora la producción final del derivado de insulina particular con la preparación recombinante de éste.
El número de pacientes con diabetes aumenta continuamente en todo el mundo. Hay un aumento proporcionado en la demanda de insulina o derivados de insulina. Así pues, el objetivo es optimizar los procesos existentes en relación con la producción del ingrediente activo. La Patente Europea EP-Bl 0 489 780 propone un proceso para preparar insulina o derivados de esta. Los vectores descritos en esta se utilizan para preparar insulina humana con el plásmido pINT90d o incluso plásmidos iniciales para construir el plásmido pINT302d que se describe en la Solicitud de la Patente Europea EP-Bl 0 821 006 y se utilizan para preparar un derivado de insulina His(B31) His(B32) Gly(A21), o para construir el vector pINT329d, el cual esta descrito en la Solicitud de la Patente Europea EP-A 0 885 961 y se utilizan para preparar el derivado de insulina Lys(B3) Glu(B29) .
Ahora se ha encontrado que los derivados de proinsulina particularmente ventajosos son los de la fórmula I,
Fus-B(l-30) -RDVP-Yn-A(l-21) I)
donde
Fus es una porción de fusión opcionalmente presente de cualquier secuencia conveniente;
B(l-30) es la cadena B de la insulina humana,
Y es una cadena de aminoácidos que termina con un aminoácido básico en el C terminal;
n es desde 2 hasta 50 e indica la longitud de la cadena de aminoácidos Y; y
A(l-21) es la cadena A de la insulina humana,
--_.---> -i •--• í ---!--->-.--* J-U-»..
y la cadena A y/o la cadena B pueden estar modificadas por intercambios, deleciones y/o adiciones de aminoácidos. En este contexto, es sorprendente que se observen ventajas iguales y mutuamente diferentes dependiendo de la composición de la cadena de insulina A o B.
La conexión de la cadena B humana a la cadena A humana a través del péptido C ventajoso, produce una proinsulina que se comporta, en términos del rendimiento de la expresión, como la proinsulina tipo nativa, pero su procesamiento enzimático para la insulina puede ser controlado con mayor facilidad de modo que no se produzcan trazas disruptivas de la cadena B extendida por arginina y tengan que ser retiradas durante la preparación del producto farmacéutico causando pérdida de fndimiento.
En la conexión de la cadena B con una extensión di- hlstidina C-terminal a la cadena A de la insulina humana que contiene glicina en la posición A21 utilizando el péptido C, de acuerdo con la invención, se encuentra un rendimiento de expresión que es de aproximadamente 20% mayor que los rendimientos que se pueden obtener con el plásmido pINT90d y un rendimiento que ya es casi cinco
veces mayor que el observado con el plásmido pINT302d. Además, el control del procesamiento enzimático se simplifica en la misma forma como la ya descrita.
En la conexión de una cadena B modificada con Lys(B3) Glu(B29) a la cadena A de la insulina humana a través del péptido C modificado se encuentran propiedades de plegado mejoradas del derivado de proinsulina en comparación con la proinsulina codificada por pINT329d. El rendimiento de la proteína de fusión cruda se incrementa y llega al mismo nivel que el encontrado con el plásmido pINT90d. Además, se simplifica el control del procesamiento enzimático.
Una modalidad particularmente ventajosa del péptido C novedoso se caracteriza por la siguiente secuencia de aminoácidos :
CGCGATGTTCCTCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGCGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTG R D V P Q V E L G G G P G A G S L Q P L -GCGCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGC (SEQ ID NO. : 1) A L E G S L Q K R (SEQ ID NO.: 2)
Del mismo modo se indica una de las múltiples secuencias de DNA posibles que codifican para el péptido C indicado.
Un aspecto de la invención es un precursor de insulina humana o de un análogo de insulina de la fórmula I
Fus-B(l-30)-RDVP-YnA(l-21) (I)
donde
Fus es una porción de fusión opcionalmente presente de cualquier secuencia conveniente;
B(l-30) es la cadena B de la insulina humana,
Y es una cadena de aminoácidos que termina con un aminoácido básico en el C terminal;
n es desde 2 hasta 50 e indica la longitud de la cadena de aminoácidos Y; y
A (1-21) es la cadena A de la insulina humana,
y la cadena A y/o la cadena B puede ser modificada por intercambios, deleciones y/o adiciones de aminoácidos, en particular donde Yn es los aminoácidos 5 a 35 del péptido C de la insulina humana o de mono, de preferencia donde Yn es los aminoácidos 11 a 35 de la insulina humana.
Otro aspecto de la invención son los precursores ya descritos, donde la cadena B de la insulina humana comprende las modificaciones Lys(B3) Glu(B29) o donde las cadenas B y A de la insulina humana comprenden las modificaciones His(B31) His(B32) Gly(A21).
Otro aspecto de la invención es un DNA que codifica para un precursor como ya se describió.
Del mismo modo, un aspecto de la invención es un vector que comprende un DNA que codifica para un precursor como el ya descrito, de preferencia en donde el vector es un vector de expresión adecuado para la expresión en E. coli.
Otro aspecto de la invención es una célula E. coli que comprende un vector como ya se describió.
Otro aspecto de la invención es un proceso para la preparación de un precursor como ya se describió, donde (a) se introduce un DNA, como el ya descrito, en un vector como ya se describió
(b) el vector de (a) se introduce en una célula de E. coli
(c) la célula E. coli de (b) que comprende el vector de (a) se utiliza para la expresión; y
(d) se aisla el precursor del sobrenadante del cultivo.
Otro aspecto de la invención es un proceso para preparar un DNA como ya se describió, donde
(a) este DNA se produce comenzando a partir de cDNA de insulina humana o de mono por medio de la PCR y otras técnicas de la biología molecular, y
¡b) se aisla.
Otro aspecto de la invención es un proceso para preparar insulina humana o un análogo de la insulina, donde (a) Un precursor como ya se describió se produce por el proceso como ya se describió
(b) el precursor de (a) se doble bajo condiciones adecuadas de modo que se puedan formar los puentes disulfuro como en la insulina humana, y la parte RDVP-Yn y, según sea adecuado, la porción de fusión Fus se someten a deleción enzimática; y
(c) se purifica la insulina humana o el análogo de la insulina.
Otro aspecto de la invención es el uso de un precursor ya descrito para la preparación de insulina o un análogo de insulina, de preferencia donde la preparación de insulina o un análogo de insulina toma lugar por el proceso como ya se describió.
Otro aspecto de la invención es el uso de un DNA ya descrito para preparar un precursor ya descrito.
Un aspecto de la invención también es el uso de un vector ya descrito para preparar un precursor ya descrito.
Otro aspecto de la invención es el uso de una célula E. coli como ya se describió para preparar un precursor antes descrito.
5 La invención ahora será explicada en detalle por medio de ejemplos, sin embargo, sin estar limitada a estos .
Ejemplo 1: Expresión de derivados de proinsulina. 10 La expresión toma lugar como se describe en EP-Bl 0
489 780. En este caso es posible introducir modificaciones sobre la fermentación en grandes volúmenes . 15 No obstante, siempre se mantienen las mismas condiciones para comparar las tasas de expresión.
La siguiente fórmula de fermentación general se 20 aplica a las operaciones a escalas mayores, las cuales se describen como ejemplo para un volumen de 7.5 litros :
25
-.»--_«._»^.^___r-?_-«--_.
Volumen de fermentación: 7.5 1 Condiciones de la esterilización: 121°C, 20 minutos, a pH 3.5, ajustado a 7.0 con NH3 después de la esterilización. Temperatura de fermentación: 37°C Control de pH: pH 7.0, ajuste con amoniaco acuoso al 25% Velocidad del agitador: 1500 rpm Aereación: 15 Sl/min (2 wm) Duración: aproximadamente 24 horas Alimentación: solución al 65% de glucosa se dosificó a una velocidad constante de 12 gl"1 hf1 cuando la OTR llegó a 200 mmol h . Precultivo: se inoculó un cultivo en agitación con una ampolleta se semilla y se incubó a 37°C, 250 rpm durante 3-4 h hasta que la DO A540 fue de ~1 Inoculación: los fermentadores fueron inoculados con aproximadamente 40 mL del precultivo Inducción: a una DO A540 de > 40 y 40 mg/L (300 mg/fermentador) ácido indolpropiónico disuelto en aproximadamente 10 mL de una solución acuosa de Na2C?3 (con 0.17 g de Na2C03)
Los significados en este caso son Si = condiciones normales litro, vvm = volumen/volumen/minuto y OTR = tasa de transferencia de oxígeno.
Medio de fermentación:
Número de la fórmula GAI 100/95-000: Cantidad g/L
1-hidrato de glucosa, D(+) min 80% 44 1-hidrato del ácido cítrico 3.48 Sulfato de amonio min 95% 6.0 Ácido fosfórico, orto, 85% 2.99 Fosfato ácido de dipotasio 1.18 Sulfato de sodio 3.0 7-hidrato de sulfato de magnesio, mínimo 98% 2.0 Sulfato de hierro (III) x H20 0.5 Solución de oligoelementos: RL 1/85-000 1.0 mL HCl de tiamina 0.005 Desmophen 3600 0.5
Solución de oligoelementos:
RL 1/85-000 Cantidad g/L
Sulfato de cobre (II) 5-hidratado 1.6 Yoduro de potasio 4.10 Molibdato de amonio 4-hidratado 8.0 Sulfato de manganeso (II) 1-hidrato 12.3 Sulfato de zinc 7-hidrato 16 Ácido bórico 20
Cantidad en el matraz con agitación:
Cantidad g/1
Extracto de levadura 8.0 Glucosa 1.0 NaCl 3.5 KH2P04 1.32 K2HP04 3.68
Ejemplo 2: Preparación de las insulinas
Las insulinas se preparan por los métodos conocidos como se describen o sugieren en, por ejemplo, EP-Bl D 489 780 o EP-A 0 895 961. El método descrito en EP-Bl 0 668 282 (véase el Ejemplo 2) es preferido para el plegado y tratamiento de la proteína de fusión particular. Además es posible que la mezcla sea filtrada de acuerdo con EP 0 288 809 después del plegado y antes de otro tratamiento.
Ejemplo 3: Construcción del plásmido pINT358d que codifica para la proinsulina humana, B-RDVP C11-.35-derivada con la cadena C.
Se preparó el plásmido utilizando los cebadores Tir e Insull descritos en EP-Bl 0 489 780. Además se sintetizaron dos nuevas secuencias de cebadores.
El cebador PINT358ÍIII tiene la siguiente secuencia:
5' -CCC AAG ACC CGC GAT GTT CCT CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT - 3' (SEQ ID NO. :3) B28 B29 B30 Arg Asp Val Pro 011012 013014 015 016017 018 (SEQ ID NO.: 4)
El cebador PINT358revII tiene la secuencia:
5'-CAGCTCCACCTGAGGAACATCGCGGGTCTTGGGTGTGTAG-3' (SEQ ID NO.: 5) Se realizó una PCR de acuerdo con EP-Bl 0 489 780 con cada uno de los pares de cebadores Tir/PINT359revII e Insull/PINT358fIII y con DNA del plásmido pINT90d como plantilla. Las alícuotas de los productos de las dos reacciones fueron combinadas y empleadas junto con el par de cebadores Tir/Insull en una tercera PCR. El producto de esta reacción se digiere dos veces con las enzimas Sall/Ncol, y el producto de esta digestión de restricción, después de la purificación, se inserta en el vector DNA, abierto con Ncol/Sall, del plásmido pINT91d, que del mismo modo esta descrito en EP-Bl 0 489 780. El plásmido construido de este modo se denomina pINT358d. La estructura se confirma por el análisis de la secuencia del DNA. Las células competentes de E. coli se transforman con DNA del plásmido. La expresión de la proinsulinas en bacterias toma lugar como en el Ejemplo 1. Después del plegado como en el Ejemplo 2, la proinsulina se convierte enzimáticamente en la insulina y se purifica más como se describe en EP-Bl 0 347 781. Además es posible, mediante la comparación con el método proveniente del pINT90d recolectar además una fracción marginal en el paso de cromatografía de intercambio iónico, debido a que esta no esta contamina con la insulina Arg(B31).
Ejemplo 4: Construcción del plásmido pINT362d para preparar la Lys (B3) Glu (B29) -RDVP-Cn-35-proinsulina
Necesarios para la construcción del plásmido son el DNA de los plásmidos pINT329d y pINT358d como plantilla y los cebadores Tir e Insull. Además, se sintetizan dos nuevos cebadores, Salforward y 329rev.
El cebador Salforward tiene la secuencia:
TACACACCCGAGACCCGCGATGTTCCTCAGG - 3' (SEQ ID NO. : 6)
La sección de la secuencia impresa en negritas en esta indica la secuencia que híbrida con el plásmido pINT358d, mientras que la parte restante es homologa con las secuencias de la sección que codifica la cadena B del plásmido pINT329d.
El cebador 329rev tiene la siguiente secuencia:
5' - CCTGAGGAACATCGCGGGTCTCGGGTGTGTAG - 3' (SEQ ID NO.: 7)
La sección impresa en negritas de ésta indica la región homologa con la hebra antisentido que forma el extremo de la cadena B y describe el triplete para arginina en el plásmido pINT329d. La secuencia restante híbrida con el plásmido pINT358d. Se efectúan dos procesos PCR. En estos, el DNA del plásmido pINT329d sirve como plantilla para el par de cebadores Tir/329rev 5 y el pINT358d DNA sirve como plantilla para el par Salforward/Insull .
Ambas reacciones producen fragmentos que se traslapan por la secuencia del cebador Salforward. De
10 este modo es posible combinar los dos fragmentos en una tercera PCR y, con la ayuda de los cebadores Tir e Insull, unirlos para obtener una secuencia de DNA que codifique el análogo de insulina. Este producto de reacción se disocia con enzimas de restricción Ncol/Sall
15 y luego se inserta en el fragmento vector pINT91d abierto con Sall/Ncol. Las células competentes de la cepa K12 MM294 de E. coli se transforman con la mezcla de ligación adecuada. El DNA plasmídico se aisla de los transformantes y se caracteriza. El plásmido correcto se
20 denomina pINT362d.
El rendimiento de la proteína de fusión cruda después de la expresión se encuentra comparable con pINT90d. No obstante, el rendimiento del plegado se 25 encuentra en aproximadamente 40% mejor que con pINT329d.
___I____M___^.-----.'>-.----»-- .
La estructura de la proteína de fusión codificada por pINT362d es como sigue:
MATTSTGNSAR FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPET RDVPQVELGGGPG Proteína cadena B cadena C de fusión AGSLQPLALEGSLQKR GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 8) Cadena C (cont) cadena A
Ejemplo 5: Construcción del plásmido pINT349d para preparar His(B31) His(B32) Gly (A21) -RDVP-Cn-35-proinsulina
En primer lugar se prepara el plásmido pINT140d cuyo DNA codifica el análogo de la insulina GLy(A21) insulina.
Necesarios para estos son dos oligonucleótidos que se utilizan como cebadores en una PCR: el oligonucleótido Tir se utiliza como cebador sentido y el oligonucleótido 140drev se utiliza como cebador antisentido:
140drev 5' - AAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTA - 3' (SEQ ID NO.: 9) Stop Stop Gly Cys Tyr A21 A20 Al9 Se emplean dos cebadores en una PCR normal con DNA del plásmido pINT90d. El producto de reacción se hace reaccionar como se describe en EP-Bl 0 489 780 con las enzimas de restricción Ncol y Salí y luego se inserta en el vector abierto pINT69d correspondientemente abierto. El resultado es el plásmido pINT140d que se vuelve a aislar después de la transformación en E. coli K12 MM294 y se caracteriza por el análisis de restricción y de secuencias .
Se efectúan dos PCR comenzando a partir del DNA del plásmido pINT140d. La primera reacción utiliza el cebador Tir y, como cebador inverso, PINT349a con la siguiente secuencia :
Val Gln Pro Val Asp Arg His His Thr Lys Pro Thr Tyr (SEQ ID NO.: 10) 5' - CACCTGAGGAACATCGCGGTGGTGGGTCTTGGGTGTGTAG - 3' (SEQ ID NO.: 11) C12 011 * * * * * * B30 B29 B28 B27 B26
Las secuencias en la presente marcadas con un asterisco designan los codones para los aminoácidos recién insertados.
La segunda PCR se realizó con los cebadores Inull y PINT349b.
El cebador PINT349b tiene la secuencia:
Pro Lys Thr His His Arg Asp Val Pro Gln Val Glu Leu (SEQ ID NO.: 12) 5' - ACCCAAGACCCACCACCGCGATGTTCCTCAGGTGGAGCTG - 3' (SEQ ID NO. : 13) B28 B29 B30 * * * * * * 011 012 013014
Desde la posición 34 hasta la posición 1 de la secuencia del DNA, el cebador es complementario para PINT349a. Por tanto, es posible unir los productos de reacción de las dos PCR en una tercera PCR con los cebadores Tir e Insull para obtener el fragmento de DNA que codifique para el derivado de proinsulina necesario. El producto de esta reacción se hace reaccionar como se describe con las enzimas Ncol y Salí y se inserta en el fragmento de vector pINT91d abierto con las enzimas y transformado en E. coli K12. Después de la caracterización de los plásmidos a partir de los transformantes, las construcciones de plásmido correctas se denominan pINT349d.
La expresión de la proteína de fusión muestra un aumento distinto en rendimiento de la proteína de fusión. El rendimiento es sorprendentemente aproximadamente 20% mayor que el que se puede obtener con pINT90d y es aproximadamente cinco veces mayor que el obtenido con el plásmido pINT30d. Además, la tasa de plegado es comparable con la tasa obtenida con la preproinsulina de mono codificada por pINT90d.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH
<120> PÉPTIDO C PARA LA PRODUCCIÓN MEJORADA DE INSULINA Y ANÁLOGOS DE INSULINA
<130> 1999/L059
<140> 19947456.7 <141> 1999-10-02
<160> 13
<170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 87 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: DNA que codifica para la variante del péptido C <400> 1 cgcgatgttc ctcaggtgga gctgggcggg ggccctggcg caggcagcct gcagcccttg 60 gcgctggagg ggtccctgca gaagcgc 87
<210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Secuencia arti f icial
<220> <223> Descripción de la secuencia artif icial : Insulina del péptido C variante
<400> 2 Arg Asp Val Pro Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg 20 25
<210> 3 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial 358 ÍI I I
<400> 3 cccaagaccc gcgatgttcc tcaggtggag ctgggcgggg gccct 45
<210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia parcial de la proteína a partir de PINT 358ÍIII
<400> 4 Arg Asp Val Pro 1
<210> 5 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 358revII
<400> 5 cagctccacc tgaggaacat cgcgggtctt gggtgtgtag 40
<210> 6 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia arti ficial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial Salforward
<400> 6 tacacacccg agacccgcga tgttcctcag g 31
<210> 7 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial
<400> 7 cctgaggaac atcgcgggtc tcgggtgtgt ag 32
<210> 8 <211> 91 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial Precursor de la insulina variante
<400> 8 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His
1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Asp Val Pro Gln Val Glu 25 40 45 Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu 50 55 60 Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He 65 70 75 80 Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 90
<210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial 140drev
<400> 9 aaaggtcgac tattagccgc agta 24
<210> 10 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial Secuencia parcial de la proteína a partir de PINT 349a <400> 10 Val Gln Pro Val Asp Arg His His Thr Lys Pro Thr Tyr 1 5 10
<210> 11 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia arti f icial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial
<400> 11 cacctgagga acatcgcggt ggtgggtctt gggtgtgtag 40
<210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Secuencia arti f icial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial Secuencia parcial de la proteína a partir de PINT 3496 <400> 12 Pro Lys Thr His His Arg Asp Val Pro Gln Val Glu Leu 1 5 10
<210> 13 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial Cebador PINT 349b
<400> 13 acccaagacc caccaccgcg atgttcctca ggtggagctg 40
Claims (1)
- REIVINDICACIONES Un precursor de insulina humana o de un análogo de insulina de la fórmula I: Fus-B(l-30) -RDVP-Yn-A(l-21) (I) ; donde Fus es una porción de fusión opcionalmente presente de cualquier secuencia conveniente; B(l-30) es la cadena B de la insulina humana, Y es una cadena de aminoácidos que termina con un aminoácido básico en el C terminal; n es desde 2 hasta 50 e indica la longitud de la cadena de aminoácidos Y; y A (1-21) es la cadena A de la insulina humana, y la cadena A y/o la B pueden ser modificadas por intercambios, deleciones y/o adiciones de aminoácidos . El precursor como se reclama en la reivindicación 1, donde Yn es los aminoácidos 5 a 35 del péptido C de la insulina humana o de mono. El precursor como se reclama en la reivindicación 1, donde Yn es los aminoácidos 11 a 35 de la insulina humana. El precursor como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la cadena B de la insulina humana comprende las modificaciones Lys(B3)Glu (B29) . El precursor como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las cadenas B y A de la insulina humana comprenden las modificaciones His(B31)His(B32)Gly(A21) . Un DNA que codifica para un precursor como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. Un vector que comprende un DNA como se reclama en la reivindicación 6. El vector como se reclama en la reivindicación 7, en donde el vector es un vector de expresión conveniente para la expresión en E. coli. Una célula de E. coli que comprende un vector como se reclama en la reivindicación 8. Un proceso para preparar un precursor como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde: a) Un DNA, como se reclama en la reivindicación 6 se introduce en un vector como se reclama en la reivindicación 7; b) el vector de (a) se introduce en una célula de E.c oli c) la célula E. coli de (b) que comprende el vector de (a) se utiliza para la expresión; y d) se aisla el precursor del sobrenadante del cultivo. Un proceso para preparar un DNA como se reclama en la reivindicación 6, donde: a) el DNA como se reclama en la reivindicación 6 se produce comenzando a partir de cDNA de la insulina humana o de mono por medio de PCR y otras técnicas de la biología molecular, y b) se aisla Un proceso para preparar insulina humana o un análogo de insulina, donde: a) Se produce un precursor por el proceso como se reclama en la reivindicación 10; b) el precursor de (a) se pliega en condiciones convenientes de modo los puentes disulfuro puedan formarse como la insulina humana, y la parte RDVP-Yn y, según sea adecuado, la proteína de fusión Fus se delecionan enzimáticamente; y (c) se purifica la insulina humana o el análogo de insulina. 13. El uso de un precursor como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para preparar insulina o un análogo de insulina. 14. El uso como se reclama en la reivindicación 13, donde la insulina o un análogo de insulina se preparan por el proceso como se reclama en la reivindicación 12. 15. El uso de un DNA como se reclama en la reivindicación 6 para preparar un precursor como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 16. El uso de un vector como se reclama en la reivindicación 8 para preparar un precursor como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 17. El uso de una célula de E. coli como se reclama en la reivindicación 9 para preparar un precursor como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 18. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 ó 17, en donde el precursor se prepara por el proceso de la reivindicación 10.
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