ES2306476T3 - Un vector de expresion recombinante de la hormona paratiroidea humana. - Google Patents

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Abstract

Un vector de expresión inducible por L-arabinosa recombinante que contiene un gen de hormona paratiroidea humana conectado por medio de una secuencia de ADN que codifica un sitio de escisión específico de uroquinasa a un fragmento génico de fosforribuloquinasa nativo o modificado de Rhodobacter sphaeroides como compañero de fusión, donde el fragmento génico de la fosforribuloquinasa es un fragmento de ADN que codifica 113 a 153 aminoácidos del extremo amino de la fosforribuloquinasa y donde el fragmento génico de la fosforribuloquinasa modificado tiene una escisión adicional reducida por uroquinasa.

Description

Un vector de expresión recombinante de la hormona paratiroidea humana.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que utiliza fosforribuloquinasa como compañero de fusión y a un procedimiento para preparar hormona paratiroidea humana con él, más específicamente, a un vector de expresión recombinante que se prepara insertando un gen de hormona paratiroidea humana que contiene un sitio de escisión específico de uroquinasa en un vector inducible por L-arabinosa que contiene un fragmento del gen de fosforribuloquinasa de Rhodobacter sphaeroides o su gen mutado como compañero de fusión, un microorganismo recombinante transformado con dicho vector de expresión, y un procedimiento para preparar hormona paratiroidea humana a gran escala cultivando dicho microorganismo en un medio que contiene L-arabinosa.
Descripción de la técnica anterior
La osteoporosis es una enfermedad que causa efectos nocivos tales como fracturas incluso por pequeños impactos que resulta de la reducción de la masa del hueso en comparación con la gente normal y de la debilidad del tejido óseo. El avance de la ciencia médica y la biología conduce a un continuo incremento de la población de edad avanzada, lo que da como resultado un incremento continuo de pacientes que padecen osteoporosis. Por lo tanto, la osteoporosis se convierte en un gran problema social en la actualidad cuando el número de ancianos que viven solos se incrementa gradualmente de acuerdo con una tendencia a una familia nuclear.
En general, en un tejido óseo normal, se logra el equilibrio entre las actividades de los osteoclastos, una célula de destrucción ósea y los osteoblastos, una célula formadora de hueso, lo que da como resultado una constante remodelación del tejido óseo. En un organismo normal, los osteoclastos superan a los osteoblastos en funcionamiento de acuerdo con el aumento de la edad, lo que produce una disminución global de la densidad ósea. En un paciente que padece osteoporosis, semejante rotura del equilibrio entre las actividades de osteoclastos y osteoblastos es mucho mayor que en un caso normal.
Aunque la causa de la rotura del equilibrio entre las actividades de los osteoclastos y los osteoblastos no se conoce claramente, se ha encontrado que la reducción de la secreción de estrógeno, una hormona femenina después de la menopausia ocasiona la osteoporosis de tipo 1 que padecen las mujeres después de la menopausia en gran parte. De este modo, se ha administrado estrógeno para el tratamiento de la osteoporosis de tipo 1, y muchos pacientes se muestran, sin embargo, poco dispuestos al uso de estrógenos debido a sus efectos secundarios, tales como la alta probabilidad de atacar el cáncer de mama, el cáncer de endometrio, etc. Asimismo, no se pueden utilizar estrógenos para el tratamiento de la osteoporosis de tipo 2 que se sabe que está inducida por una causa diferente de la inductora de la osteoporosis de tipo 1.
Se ha utilizado calcitonina que inhibe las actividades de los osteoclastos para suprimir la resorción del tejido óseo como agente que compensa las deficiencias del estrógeno, un agente para el tratamiento de la osteoporosis de tipo 1 y trata la osteoporosis de tipo 2 que no va a ser curada por los estrógenos. No obstante, los estrógenos y la calcitonina no tienen efecto sobre el incremento de la masa ósea que ya se ha perdido y solamente evita un mayor descenso de la densidad ósea. Por lo tanto, son poco apropiados para el tratamiento eficaz de la osteoporosis.
Recientemente, se ha reparado en la hormona paratiroidea (PTH) como un buen agente para el tratamiento de la osteoporosis puesto que la PTH tiene el efecto de incrementar la densidad ósea así como el efecto de evitar la reducción de la densidad ósea y no se ha informado sobre sus efectos secundarios. La hormona preproparatiroidea (preproPTH) que consiste en 115 aminoácidos y es producida en las células principales de la glándula paratiroides es procesada y transformada en proPTH que consiste en 92 aminoácidos mientras viaja a través del retículo endoplásmico. Después, la proPTH es procesada adicionalmente y transformada en PTH madura que consiste en 84 aminoácidos mientras viaja a través del aparato de Golgi. La PTH sintetizada mediante dicho procedimiento es secretada a la sangre y transportada a los órganos diana, esto es, el hueso y el riñón. La PTH secretada tiene una vida media de solamente 18 minutos.
La PTH activa la bomba de Ca^{2+} en la membrana de la célula ósea para promover la movilización de CaHPO_{4} desde el hueso, lo que produce un incremento en el nivel de Ca^{2+} en sangre en algunos minutos. Por otra parte, cuando la PTH es secretada continuamente, activa los osteoclastos que ya existen, estimula la formación de nuevos osteoclastos, e inhibe las actividades de los osteoblastos temporalmente, lo que produce la inhibición del deposito de Ca^{2+} en el hueso y la estimulación de la liberación de Ca^{2+} para incrementar la secreción de Ca^{2+} y de PO_{4}^{3-} en la sangre. Por otra parte, la secreción de PTH está regulada por la concentración de Ca^{2+} en sangre a través de un potente mecanismo de retroalimentación. Esto es, una reducción del 10% de la concentración de Ca^{2+} en sangre en poco tiempo dobla la secreción de PTH. Cuando la concentración de Ca^{2+} en sangre es baja durante mucho tiempo, incluso una reducción del 1% de la concentración de Ca^{2+} en sangre dobla la secreción de PTH.
A diferencia de semejante función reguladora de PTH en un organismo vivo, se ha informado de que la PTH estimula la formación de hueso cuando se administra PTH externa a una pequeña dosis intermitentemente (véase: Tam, C.S. et al., Endocrinology, 110:506-512 (1982)). El uso de PTH para el tratamiento de la osteoporosis se basa en dicha función estimuladora de PTH en la formación de hueso. Aunque el mecanismo de la función estimuladora de PTH en la formación de hueso todavía no se ha comprende claramente, se han sugerido hipótesis tales como la inhibición de la secreción de PTH por la PTH administrada, la estimulación directa de los osteoblastos y la estimulación indirecta de la formación de hueso por el factor de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento 1 de tipo insulina (IGF-1) y el factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta).
Con el fin de tratar la osteoporosis utilizando PTH, se requiere esencialmente la administración de PTH durante largo tiempo. Sin embargo, los procedimientos para la producción en masa de PTH no han sido establecidos hasta ahora, y la aplicación práctica de PTH para el tratamiento de la osteoporosis ha estado en una difícil situación. De este modo, los autores de la presente invención han estudiado la producción en masa de PTH a partir de un microorganismo recombinante empleando la tecnología de la ingeniería genética y han realizado un esfuerzo para eliminar el resto metionina amino terminal durante la expresión de PTH en E. coli puesto que se ha informado de que la secuencia de aminoácidos Ser-Val-Ser en el extremo amino de la PTH es esencial para la actividad biológica de la PTH.
Existe en E. coli una amino peptidasa específica de metionina, una enzima que elimina la metionina de inicio de la traducción del extremo amino de las proteínas expresadas que es ampliamente utilizada como célula anfitriona para la expresión de una proteína recombinante. Sin embargo, cuando se expresan proteínas foráneas en grandes cantidades en E. coli, ocasionalmente no se logra la eliminación de la metionina amino terminal. Semejante fenómeno tiene que ser resuelto para construir un sistema de expresión de una proteína cuya secuencia de aminoácidos en el extremo amino afecta a su propia actividad biológica, p. ej., PTH.
Con el fin de resolver dichos problemas, se pueden utilizar principalmente tres métodos como los siguientes: Primero, se secreta una proteína deseada en el periplasma de E. coli o medio cultivado en una forma procesada en el extremo amino expresando la proteína deseada en una forma fusionada con la secuencia de la señal de secreción en el extremo amino. Dicho método tiene la ventaja de que se obtiene una proteína madura por la actividad intracelular, a la vez que ésta tiene la desventaja de que el rendimiento de la expresión es relativamente bajo. En segundo lugar, solamente después de que la proteína deseada sea expresada en E. coli en una forma anclada a metionina en el extremo amino, ésta es digerida con la aminopeptidasa para obtener una proteína madura. Dicho método tiene la desventaja de que la purificación de la proteína es compleja puesto que la preparación de proteína con la metionina amino terminal eliminada a partir de proteínas con la metionina anclada es difícil. En tercer lugar, después de que la proteína de fusión en la que la proteína deseada está fusionada con otra proteína sea expresada en E. coli y aislada, el compañero fusionado se elimina de la proteína de fusión empleando una enzima o un agente químico para obtener una proteína madura deseada. Dicho método tiene la ventaja de la elevada eficacia de expresión de una proteína deseada así como de la producción de una proteína libre de metionina amino terminal.
Por otra parte, los métodos para obtener una proteína deseada a partir de una proteína de fusión se clasifican en gran parte en métodos de escisión en los que se emplean productos químicos y enzimas. Entre ellos, los métodos de escisión en los que se emplean productos químicos tienen la ventaja del bajo coste debido al uso de productos químicos de bajo precio. Sin embargo tienen la desventaja de que se requiere una etapa adicional para purificar la proteína deseada de los subproductos puesto que el uso de productos químicos da lugar a la producción de diversos subproductos así como la proteína deseada debido a una baja especificidad de los productos químicos en el sitio escindido. Por el contrario, el problema de los métodos de escisión en los que se emplean productos químicos se puede resolver mediante el uso de enzimas debido a su elevada especificidad para el sitio escindido. Sin embargo, los métodos de escisión en los que se emplean enzimas tienen dificultades en la aplicación práctica a escala industrial puesto que el precio de las enzimas es elevado.
Con respecto a esto, se han llevado a cabo en la técnica estudios sobre el uso económico de enzimas que escinden una proteína de fusión. Sin embargo, la producción en masa de Factor Xa, trombina, enteroquinasa, etc. que son enzimas utilizadas para dicho propósito está bastante limitada. De este modo, los métodos de escisión que emplean enzimas no han sido utilizados ampliamente a escala industrial a pesar de sus diversas ventajas. Por consiguiente, existen razones potentes para explorar una tercera enzima que puede ser producida en grandes cantidades económicamente que se pueda utilizar eficazmente para los métodos de escisión en los que se emplean enzimas. Puesto que la producción en masa de uroquinasa (activador de plasminógeno del tipo de dos cadenas de uroquinasa), una serina proteasa utilizada como agente disolvente de trombos ya ha sido desarrollada y se puede preparar uroquinasa activa en grandes cantidades empleando un sistema de expresión de procariotas tal como E. coli (véase: W.E. Holmes et al., Bio/Technology, 3:923-929 (1985)), se puede producir uroquinasa y obtenerla en grandes cantidades económicamente en comparación con otras enzimas tales como el Factor Xa, etc. Naturalmente, se ha propuesto la uroquinasa como candidato potencial para la escisión económica de una proteína de fusión y el aislamiento de una proteína deseada.
En estas circunstancias, los autores de la presente invención han determinado la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión específico de la uroquinasa en una proteína, y han descubierto que la eficacia de escisión es elevada cuando se encuentra presente una secuencia de aminoácidos -X-Gly-Arg (donde, X representa Pro, Thr, Ile, Phe o Leu), un sitio de escisión específico de uroquinasa, entre una proteína deseada y un compañero de fusión de dicha proteína de fusión. Asimismo, han descubierto que la eficacia de unión más alta se puede obtener en presencia de -Thr-Gly-Arg entre las secuencias (véase: Patente Coreana abierta a la inspección pública Núm. 97-6495).
Compendio de la invención
Los autores de la presente invención ha realizado un esfuerzo para preparar PTH libre de metionina amino terminal a partir de E. coli recombinante en grandes cantidades, y ha descubierto que la PTH recombinante que tiene la actividad de la PTH humana nativa se puede preparar a gran escala, mediante un procedimiento que comprende las etapas de: insertar un gen de PTH humana que contiene un sitio de escisión específico de uroquinasa y utiliza el codón universal de E. coli en un vector inducible por L-arabinosa que contiene un fragmento del gen de la fosforribuloquinasa ("PRK") de Rhodobacter sphaeroides o su gen mutado como compañero de fusión para construir un vector de expresión, transformando E. coli con dicho vector de expresión, aislando una proteína de fusión de dicha célula transformante y escindiendo la proteína de fusión con uroquinasa.
Un objeto principal de la invención es, por lo tanto, proporcionar un vector de expresión inducible por L-arabinosa recombinante que contiene un gen de la hormona paratiroidea humana conectado por medio de una secuencia de ADN que codifica un sitio de escisión específico de uroquinasa a un fragmento del gen de la fosforribuloquinasa nativo o modificado de Rhodobacter sphaeroides como compañero de fusión, donde el fragmento del gen de la fosforribuloquinasa es un fragmento de ADN que codifica de 113 a 153 aminoácidos del extremo amino de la fosforribuloquinasa y donde el fragmento del gen de la fosforribuloquinasa modificado tiene reducida la escisión adicional por la uroquinasa.
El otro objeto de la invención es proporcionar un microorganismo recombinante transformado con el vector de expresión mencionado.
Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para preparar PTH humana a gran escala cultivando dicho microorganismo en un medio que contiene L-arabinosa.
Breve descripción de los dibujos
Los objetos anteriores y otros y las características de la presente invención serán evidentes a partir de las siguientes descripciones dadas junto con los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra un mapa génico de un vector de expresión \DeltapMA.
La Figura 2 muestra las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14) de los oligómeros para preparar un gen de PTH humana.
La Figura 3 es un diagrama esquemático que muestra la ligación de los oligómeros sintéticos.
La Figura 4 muestra un mapa génico de un vector de expresión pRK.
La Figura 5 muestra una estrategia para amplificar el fragmento del gen de PRK de la invención mediante PCR.
La Figura 6 muestra un mapa génico de un vector de expresión p153hGH que expresa una proteína de fusión de la hormona de crecimiento humana (hGH).
La Figura 7 muestra un mapa génico de un vector de expresión pAI5UP que expresa una proteína de fusión de PTH.
La Figura 8 muestra una estrategia de construcción para preparar un vector de expresión p153PTH de la invención que expresa PTH humana recombinante.
La Figura 9 es una fotografía que muestra el patrón de electroforesis que muestra la expresión de la proteína PTH humana fusionada con el fragmento PRK en E. coli transformado con p153PTH durante la inducción con L-arabinosa.
La Figura 10 es una fotografía que muestra el patrón de SDS-PAGE de muestras obtenidas durante el aislamiento de una proteína de fusión expresada en E. coli transformada con p153PTH.
La Figura 11 es una fotografía que muestra el patrón de SDS-PAGE de cuerpos de inclusión de la proteína de fusión 153PTH tras la digestión con uroquinasa.
La Figura 12 muestra una estrategia de construcción para preparar un vector de expresión pm153PTH de PTH humana de la invención mediante modificación de p153PTH.
La Figura 13 es una fotografía que muestra el patrón de electroforesis que muestra la expresión de una proteína de fusión en E. coli transformada con pm153PTH durante la inducción por L-arabinosa.
La Figura 14 es una fotografía que muestra el patrón de SDS-PAGE de muestras obtenidas durante el aislamiento de una proteína de fusión expresada en E. coli transformada con pm153PTH.
La Figura 15 es una fotografía que muestra el patrón de SDS-PAGE de cuerpos de inclusión de las proteínas de fusión 153PTH y m153PTH después de la digestión con uroquinasa.
La Figura 16 es una fotografía que muestra el patrón de electroforesis de diversos reaccionantes para comparar la eficacia de la digestión con uroquinasa de los cuerpos de inclusión de 153PTH y m153PTH.
La Figura 17 es una fotografía que muestra el patrón de SDS-PAGE de PTH humana purificada.
La Figura 18(A) es un gráfico que muestra la unión de PTH humana purificada a su receptor.
La Figura 18(B) es un gráfico que muestra que la PTH humana purificada estimula la producción de AMPc intracelular.
Descripción detallada de la invención
Primero se preparó un gen de PTH humana para traducirlo a una secuencia de aminoácidos de PTH humana nativa y para que tuviera una secuencia de nucleótidos cuyos codones se utilizaran frecuentemente en E. coli. Asimismo, con el fin de obtener una proteína deseada a partir de una proteína de fusión fácilmente, se sintetiza un sitio de escisión específico de uroquinasa y se inserta antes del gen de PTH humano de manera que un sitio de escisión específico de uroquinasa, esto es, una secuencia de aminoácidos -X-Gly-Arg (donde, X representa Pro, Thr, Ile, Phe o Leu), muy preferiblemente -Thr-Gly-Arg, se localice entre una proteína deseada y un compañero de fusión (véase: la Publicación de la Patente Coreana abierta a la inspección pública Núm. 97-6495).
Y después, se preparó un vector de expresión p153PTH que contiene el gen de PTH humano con el mencionado sitio de escisión específico de uroquinasa y un fragmento de ADN que codifica 153 aminoácidos del extremo amino terminal de PRK. Luego, se aisló el fragmento del gen PRK de dicho vector de expresión, y se modificó parte de la secuencia de aminoácidos de PRK y se fusionó de nuevo con un gen de PTH humano para preparar un vector de expresión pm153PTH.
Puesto que dichos vectores de expresión utilizaban un fragmento de PRK que codificaba 153 aminoácidos del extremo amino de PRK como compañero de fusión, se expresaron muchas proteínas de fusión (PTH humana fusionada con un fragmento de PRK) en microorganismos transformados con dichos vectores de expresión. Con respecto a esto, E. coli transformada con pm153PTH expresaba una proteína de fusión en las mismas cantidades o ligeramente incrementadas en comparación con E. coli transformada con p153PTH, lo que sugiere que la sustitución de aminoácidos no afecta a la expresión de la proteína de fusión. Por otra parte, el empleo de un vector de expresión que contiene el gen de PTH humano con el sitio de escisión específico de uroquinasa mencionado y un gen PRK completo también permitió la expresión de una proteína de fusión.
Por otra parte, como resultado de la escisión de la proteína de fusión que consistía en un fragmento de PRK parcialmente modificado y PTH humana y la proteína de fusión que consistía en un fragmento de PRK nativo y PTH humana con uroquinasa, respectivamente, se encontró que la proteína de fusión que consistía en un fragmento de PRK parcialmente modificado y PTH humana mostraba una reducción de la reacción no específica por uroquinasa para obtener mucha más PTH en las mismas condiciones que la reacción de escisión utilizando la misma cantidad de proteína de fusión.
La PTH humana fusionada con PRK se expresó en forma de cuerpos de inclusión en los transformantes. Después de aislar los cuerpos de inclusión y tratarlos con uroquinasa, se separó la PTH humana recombinante y se purificó a partir de una proteína de fusión PRK/PTH.
Por otra parte, se ha informado de que la PTH tiene una actividad de regulación de la detención del flujo del calcio promoviendo la resorción de calcio desde el riñón y el hueso mineralizado en el organismo y aumentando la concentración de calcio en la sangre, y dicha actividad está mediada por AMPc (AMP cíclico), una molécula de señalización intracelular secundaria formada a partir de ATP por medio de la unión de PTH a receptores de alta afinidad en la superficie de la célula ósea o las células renales que da como resultado la activación de la adenilato ciclasa asociada con el receptor (véase: Donahue, H.J. et al., Endocrinology, 126:1471-1477 (1990)). Teniendo el conocimiento antedicho, los autores de la presente invención determinaron la afinidad de unión de PTH al receptor presente en la célula ósea o la célula renal y el nivel de estimulación de la formación de AMPc intracelular con el fin de investigar si la PTH humana recombinante purificada antes tiene la actividad de la PTH nativa. Como resultado, se encontró que la PTH humana recombinante preparada antes se podía unir al receptor y estimular la producción de AMPc intracelular.
Por consiguiente, la PTH humana recombinante que tiene actividad de PTH humana nativa puede ser preparada con una elevada eficacia por medio de la regulación precisa de la inducción cultivando un microorganismo transformado con el vector de expresión recombinante de la invención, p153PTH o pm153PTH, e induciendo la expresión de la proteína de fusión por L-arabinosa.
La presente invención se ilustra adicionalmente en los siguientes Ejemplos, que no se deben considerar limitantes del alcance de la invención.
Ejemplo 1 Construcción de un vector de expresión \DeltapMA
Se aisló ADN de Salmonella typhimurium cepa LT2, se digirió con la enzima de restricción EcoRI, y se insertó en un vector pUC19 para preparar una genoteca de pUC-Salmonella. La genoteca de pUC-Salmonella se introdujo en E. coli cepa DH5\alpha (E. coli DH5\alpha F' endA1 hsdR17 (rk^{-}mk^{+}) supE44 thi-recA1 gyra(Nair) U169D(lacZAY-argF) deoR) para obtener colonias de E. coli transformada. Por otra parte, se sintetizaron dos oligonucleótidos complementarios a la secuencia de nucleótidos que contenía un sito regulador araB-C en el operón arabinosa y 3 aminoácidos de la proteína araC desde el extremo amino, esto es, 15 meros de 5'-GCCATCGTCTTACTC-3' (SEQ ID NO: 15) y 14 meros de 5'-GCGTTTCAGCCATG-3' (SEQ ID NO: 16). Se llevó a cabo la hibridación por colonias utilizando los oligonucleótidos como sondas para seleccionar un clon que contuviera los genes araB-A y araC de la genoteca de pUC-Salmonella preparada antes.
El plásmido pUC-ara seleccionado de este modo fue digerido con la enzima de restricción AvaI, sus extremos se volvieron romos mediante la enzima de Klenow y se trató con la enzima de restricción SalI para dar un fragmento de ADN de 2,52 kpb. Por otra parte, se digirió un vector pUC119 (véase: Maniatis et al., Molecular Cloning 2ª Ed., 1989) con HindIII, sus extremos se volvieron romos mediante la enzima de Klenow y se trató con SalI para dar un fragmento de ADN de 3,18 kpb. Los dos fragmentos así obtenidos, esto es, el fragmento de ADN de 2,52 kpb y el fragmento de ADN de 3,18 kpb, se ligaron mediante la ADN ligasa de T4 para preparar un vector pUC-araBC de 5,7 kpb. Después de obtener ADN de hebra sencilla a partir del vector obtenido de este modo, se insertó una secuencia de nucleótidos del sitio de restricción NdeI, 5'-CATATG-3' (SEQ ID NO: 17) en el codón de inicio de la traducción en un gen estructural de la proteína araB localizada aguas abajo del promotor araB, y se llevó a cabo la mutación específica del sitio para transformar una secuencia de nucleótidos de Shine-Dalgarno en el promotor araB en una secuencia 5'-TAAGGAGG-3' (SEQ ID NO: 18).
El clon ara modificado de este modo fue digerido con EcoRI y PvuII de nuevo para dar un fragmento de ADN de 2,61 kpb que contenía un gen araB-C. Por otra parte, un vector MpKL10 que contenía un sitio de clonación múltiple de 228 pb originado a partir de pUC18 fue digerido con NdeI, sus extremos se volvieron romos mediante la enzima de Klenow y se ligaron de nuevo mediante la ADN ligasa de T4 para eliminar un sitio de restricción NdeI de dicho vector. El vector obtenido de este modo se digirió con EcoRI y PvuII para obtener un fragmento de ADN de 2,7 kpb que contenía un sitio de clonación múltiple, una señal de terminación de la transcripción, un gen de resistencia a ampicilina y un origen de replicación de ADN de E. coli.
El fragmento de ADN de 2,61 kpb preparado antes se ligó al fragmento de ADN de 2,7 kpb preparado antes, se digirió con NdeI y EcoRI, y se ligó a un oligonucleótido de doble hebra que contenía un sitio de restricción NcoI y tenía los sitios de restricción NdeI y EcoRI en ambos extremos, respectivamente, por medio de ADN ligasa de T4 para construir un vector \DeltapMA de aproximadamente 5,32 kpb (véase: la Patente Coreana abierta a la inspección pública Núm. 97-5585). En la Figura 1 se muestra un mapa génico del \DeltapMA construido de este modo.
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Ejemplo 2 Preparación de un gen PTH humano
Con el fin de preparar un gen PTH humano que codifica PTH humana nativa y que tiene una secuencia de nucleótidos cuyos codones se utilizan frecuentemente en E. coli, se sintetizaron primero 12 oligonucleótidos (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14) correspondientes a las hebras efectoras y antisentido de PTH (véase: la Figura 2). Los 12 oligómeros se ligaron selectivamente empleando la fosforilación, la hibridación, la elución y la ADN ligasa de T4. Esto es, con el fin de evitar la auto-ligación, se fosforilaron los extremos de los oligómeros núm. 2, núm. 4, núm. 5, núm. 8, núm. 9, núm. 12 y núm. 13 y se llevó a cabo la hibridación del ADN para producir pares de núm. 1:núm. 2, núm. 3:núm. 4, núm. 5:núm. 6, núm. 7:núm. 8, núm. 9:núm. 10, núm. 11:núm. 12 y núm. 13:núm. 14. Después, tras la electroforesis en gel de poliacrilamida, solamente los oligómeros de doble hebra correctamente hibridados, esto es, I, II, III, IV, V, VI y VII, se hicieron eluir. El extremo 3' del oligómero de doble hebra VII tiene un extremo cohesivo del sitio de restricción XbaI, lo que permite la fácil clonación utilizando el sitio XbaI de un vector de expresión.
Los extremos de los oligómeros de doble hebra eluidos de este modo se fosforilaron, y se ligaron II y III, IV y V, VI y VII mediante ADN ligasa de T4, respectivamente. Tras la electroforesis en gel de poliacrilamida, se hicieron eluir los fragmentos de ADN II/III, IV/V y VI/VII correctamente ligados. Después, se fosforilaron los extremos de los tres fragmentos II/III, IV/V y VI/VII, y I y II/III, IV/V y VI/VII mediante la ADN ligasa de T4, respectivamente. Y después, se ligaron I/II/III y IV/V/VI/VII finalmente para sintetizar un gen PTH humano que contenía un sitio de escisión específico de uroquinasa y que tenía una secuencia de nucleótidos cuyos codones son frecuentemente utilizados en E. coli (véase: la Figura 3). En la Figura 3, el número entre paréntesis indica el número de bases. El oligómero de doble hebra 1 contiene un sitio de escisión específico de uroquinasa cuya síntesis se ilustra adicionalmente a continua-
ción.
Con el fin de separar fácilmente la PTH de una proteína de fusión, se sintetizó un sitio de escisión específico de uroquinasa y se insertó entre un compañero de fusión y un gen PTH como sigue. El sitio de escisión específica de uroquinasa contenía Gly-Thr-Gly-Arg (véase: la Publicación de la Patente Coreana abierta a la inspección pública Núm. 97-6495) y se le añadió un aminoácido con un peso molecular relativamente bajo antes de dicha secuencia para proporcionar flexibilidad. Asimismo, el extremo 5' contenía 3 sitios de restricción SmaI, ScaI y PvuII para proporcionar un extremo romo de manera que cualquier gen diana pueda ser fusionado de una manera fácil considerando su marco de lectura abierto. Se localizó un sitio de restricción BglII en el sitio que unía el sitio de escisión específico de uroquinasa al gen PTH humano. Se sintetizaron el oligómero efector núm. 1 y el oligómero antisentido núm. 2 que satisfacían dicha condición y se ligaron. Después de la electroforesis en gel de poliacrilamida, se hizo eluir el oligómero de doble hebra I correctamente hibridado. Puesto que ambos extremos del oligómero de doble hebra I eran romos, solamente se fosforiló un oligómero núm. 2 antes de la hibridación para evitar la formación de dímeros y trímeros del oligómero I. El oligómero de doble hebra I se ligó para que se situara en cabeza con respecto al gen PTH humano sintetizado por medio de ADN ligasa de T4 como se ha mencionado antes.
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Ejemplo 3 Construcción de un vector de expresión pPRK que contiene un gen PRK
Se aisló ADN cromosómico de una cepa de Rhodobacter sphaeroides y se amplificó un gen PRK realizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Con respecto a esto, con el fin de subclonar el gen PRK en el vector de expresión inducible por L-arabinosa (\DeltapMA) preparado en el Ejemplo 1 fácilmente, se introdujeron un codón de iniciación de la traducción y un sitio de restricción NdeI en un cebador correspondiente a la región amino terminal de PRK que se utilizó como cebador 5', y se introdujeron un codón de terminación de la traducción y un sitio de restricción XbaI en un cebador correspondiente a la región carboxi terminal de PRK que se utilizó como cebador 3' (cebador 5': 5'-GGAGCTGAATACATATGAGCAAG-3' (SEQ ID NO: 19); cebador 3': 5'-CCCCCGGGTCTAGAT
CAGGCCA-3' (SEQ ID NO: 20).
Tras la electroforesis en gel de agarosa al 1% del producto de la reacción de la PCR, se aisló un gen PRK de 873 pb, se digirió con NdeI y XbaI, y se subclonó en un fragmento del vector \DeltapMA tratado con NdeI y XbaI para construir un vector de expresión pPRK (véase: la Figura 4). Se transformó E. coli MC1061 (E. coli MC1061, F-araD139 \Delta(ara-leu)7696 galE15 galK16\Delta(lac) X74rpsL(Str^{r}) hsdR2 (rk^{-}mk^{+}) mcrAmcrB1) con el vector de expresión construido de este modo y se confirmó que una proteína PRK que tenía un peso molecular de 32 kDa era expresada a partir del transformante.
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Ejemplo 4 Fragmentación del gen PRK
Puesto que el uso del gen PRK completo como compañero de fusión tiene la desventaja de que el rendimiento de la proteína finalmente deseada es bajo debido a un compañero de fusión grande, el tamaño de PRK se redujo de diferentes maneras para disminuir el tamaño de un compañero de fusión para un rendimiento elevado de la proteína deseada. Puesto que la estructura de PRK todavía no se ha descubierto, se pronosticó la estructura secundaria de la proteína PRK utilizando un programa de ordenador (PROSIS, Hitachi, JAPÓN) basado en el método de Chou y Fasman (véase: Adv. Enzymol., 47:45-148 (1978); Annu. Rev. Biochem., 47:251-276 (1978)). Después, se seleccionaron dos regiones que se había pronosticado que no formaban una estructura secundaria tal como una hélice \alpha o una hebra \beta (regiones que contienen 113 y 153 aminoácidos del extremo amino de PRK que fueron referidas como "113PRK" y "153PRK", respectivamente) para no destruir la estabilidad estructural de la proteína.
Con el fin de amplificar los fragmentos del gen PRK, se utilizó el cebador 5' del Ejemplo 3 como cebador 5', y se utilizaron los oligonucleótidos que corresponden a las secuencias de nucleótidos que contienen 113 y 153 aminoácidos, respectivamente, y contienen un sitio de restricción BamHI para una fácil subclonación, como cebador 3' (cebador 3' para la amplificación de 113PRK: 5'-GGTGAAGGATCCGGGCGCCACGCCGGT-3' (SEQ ID NO: 21); cebador 5' para la amplificación de 153PRK: 5'-CGGAACGGATCCGATCTTGAGGTCGGC-3' (SEQ ID NO: 22)) (véase: la Figura 5).
Los fragmentos del gen PRK amplificados de este modo se digirieron con NdeI y BamHI y se aislaron para realizar la electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Los productos de la PCR de 113PRK y 153PRK (fragmentos génicos) aislados de este modo fueron digeridos con NdeI y BamHI, e insertados en \DeltapMA digerido con las mismas enzimas para construir p113PRK y p153PRK. Se transformó E. coli MC1061 (E. coli MC1061, F^{-} araD139 \Delta(ara-leu)7696 galE15 galK16\Delta(lac) X74rpsL(Str^{r}) hsdR2 (rk^{-}mk^{+}) mcrA mcrB1) con los vectores de expresión mencionados, esto es, p113PRK y p153PRK, respectivamente, y se cultivó. Como resultado, se encontró que las proteínas p113PRK y p153PRK eran expresadas normalmente en grandes cantidades. Por consiguiente, se confirmó que los fragmentos génicos que codificaban las proteínas p113PRK y p153PRK podían ser utilizados apropiadamente como compañero de fusión.
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Ejemplo 5 Construcción de un vector de expresión p153PTH y expresión de PTH
Se digirió un vector de expresión pAI5UG de hGH que contiene un sitio de restricción específico de uroquinasa y un fragmento de ADN que codifica 166 aminoácidos del extremo amino de la proteína IciA que inhibe el inicio de la replicación en E. coli como compañero de fusión (véase: la Publicación de la Patente Coreana abierta a la inspección pública Núm. 97-6505) con NdeI y BamHI para obtener un fragmento vector que contenía un gen hGH y un sitio de restricción de uroquinasa (UK) Thr-Gly-Arg. El fragmento génico 153PRK aislado en el Ejemplo 4 se subclonó en el vector obtenido de este modo para construir un vector de expresión p153hGH (véase: la Figura 6).
Por otra parte, se digirió \DeltapMA5S en el que se había insertado un sitio de restricción SmaI en un sitio del codón de 166 aminoácidos del extremo amino de un gen IciA que codifica la proteína IciA que inhibe el inicio de replicación en E. coli (véase: la Publicación de la Patente Coreana abierta a la inspección pública Núm. 97-6505, KCCM-10072) con SmaI y XbaI para obtener un fragmento vector que contenía un fragmento del gen IciA de 500 pb. El gen PTH humano que contenía un sitio de escisión específico de uroquinasa que fue sintetizado en el Ejemplo 2 se subclonó en el fragmento vector obtenido de este modo para construir un vector pAI5UP que puede expresar la PTH humana en una forma fusionada con un fragmento de la proteína IciA que contiene 166 aminoácidos del extremo amino bajo el control del sistema promotor araB (véase: la Figura 7, Publicación de la Patente Coreana abierta a la inspección pública Núm. 97-6497, KCCM-10071).
El vector pAI5UP construido de este modo se digirió con BamHI y HindIII para dar un fragmento del gen PTH humano que contenía un sitio de escisión específico de uroquinasa. El fragmento obtenido de este modo se subclonó en un fragmento vector preparado digiriendo p153hGH con BamHI y HindIII para construir un vector p153PTH que, bajo el control del sistema promotor araB, puede expresar una proteína de fusión PTH humana que contiene un sitio de escisión específico de uroquinasa y 153PRK (que consiste en 153 aminoácidos del extremo amino de PRK) como compañero de fusión (véase: la Figura 8).
Se transformó E. coli MC1061 (F-araD139 \Delta(ara-leu)7696 galE15 galK16 D(lac)X74 rpsL(Str^{r}) hsdR2(rk^{-}mk^{+}) mcrA mcrB1) con el vector de expresión p153PTH construido de este modo, y el transformante resultante se inoculó en un medio líquido LB que contenía ampicilina (conteniendo 5 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura, 10 g de bactotriptona y 50 mg de ampicilina por 1 litro de medio) y se cultivó a 180 rpm a 37ºC durante 1 día. Se inoculó de nuevo el medio confluyente en medio líquido LB que contenía ampicilina para alcanzar una concentración final de 1% y se cultivó con sacudimiento hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó 0,5. Después, se añadió L-arabinosa al medio cultivado hasta alcanzar una concentración final de 1% para inducir la expresión de una proteína de fusión 153PRK/PTH (en adelante referida como "153PTH" por conveniencia) y las células se cultivaron con sacudimiento durante aproximadamente 20 horas.
Como resultado del análisis SDS-PAGE de las proteínas totales de las células de E. coli cultivadas, se encontró que la proteína de fusión 153PTH de aproximadamente 26 kDa era expresada en E. coli con una alta eficacia durante la inducción con L-arabinosa. (véase: la Figura 9). En la Figura 9, las calles 1 y 2 muestran las proteínas totales de E. coli MC1061 transformada con p153PTH que se había cultivado durante 20 horas tras la inducción con L-arabinosa al 1%; y, la calle M muestra el marcador de proteína normalizado (BRL 16040-016, USA).
Escherichia coli MC1061 transformada con el vector de expresión p153PTH fue denominada Escherichia coli MC1061:p153PTH, y depositada en el Centro de Cultivos de Microorganismos Coreano (KCCM), una autoridad de depósito internacional localizada en 134 Shinchon-Dong, Seodaemun-Ku, Seúl, Corea, con el Núm. de acceso KCCM-10101 el 9 de Julio de 1997.
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Ejemplo 6 Aislamiento y digestión de cuerpos de inclusión de una proteína de fusión 153PTH
Se investigó si las proteínas de fusión 153PTH que habían sido expresadas en E. coli MC1061 transformada con p153PTH(KCCM-10101) durante la inducción con L-arabinosa como en el Ejemplo 5 podían formar cuerpos de inclusión. Las células de E. coli cultivadas que se obtuvieron después de la centrifugación se suspendieron en tampón Tris (tampón Tris 50 mM (pH 7,8) que contenía EDTA 0,1 mM y sacarosa al 25%). Se añadió lisozima a la suspensión celular y se incubó durante 1,5 horas sobre hielo. Después, se añadieron MgCl_{2} y ADNasaI a las células y se incubaron durante 1,5 horas. Y después, se añadió a las células un tampón que contenía ácido desoxicólico al 1% y Nonidet P-40 al 1,6%, y se agitó durante 15 minutos sobre hielo. Y, las células se lisaron mediante ultrasonicación. El producto lisado celular se centrifugó para separar la fracción de los cuerpos de inclusión de la fracción acuosa, y la fracción de los cuerpos de inclusión se lavó con solución de Tritón X-100 al 0,5% cuatro veces. Los cuerpos de inclusión así obtenidos se agitaron en solución de urea 8 M a 4ºC lentamente para la desnaturalización. Se analizaron alícuotas tomadas como muestras durante el aislamiento de los cuerpos de inclusión mediante SDS-PAGE (véase: la Figura 10).
En la Figura 10, las calles 2, 3, 4 a 7 y 8 muestran un producto lisado celular, sobrenadante del producto lisado celular, soluciones lavadas de cuerpos de inclusión y cuerpos de inclusión desnaturalizados, respectivamente; la calle 1 muestra un marcador de tamaño de proteína normalizado de BRL 16040-016 tal como 43kD, 29kD, 18,4kD, 14,3kD, 6,2kD y 3,4kD de acuerdo con el peso molecular; y, la calle 9 muestra un marcador de proteína normalizado de NEB 7707L tal como 175kD, 83kD, 62kD, 47,5kD, 32,5kD, 25kD, 16,5kD y 6,5kD de acuerdo con el peso molecular. Como se muestra en la Figura 10, se reveló que la proteína de fusión 153PTH era expresada en E. coli en grandes cantidades y puede ser aislada en forma de cuerpo de inclusión.
Una vez que la cuantificación de la proteína de fusión 153PTH aislada se hubo llevado a cabo, se añadieron 0,5 \mug de uroquinasa a 100 \mug de la proteína de fusión 153PTH y se hicieron reaccionar a 25ºC durante 1 hora. Después, se investigó el nivel de escisión mediante SDS-PAGE (véase: la Figura 11). En la Figura 11, la calle 1 muestra la proteína de fusión 153PTH sin la adición de uroquinasa como control; la calle 2 muestra la proteína 153PTH con la adición de uroquinasa; y, la calle M muestra el marcador de tamaño de proteína normalizado (NEB7707L, 175kD, 83kD, 62kD, 47,5kD, 32,5kD, 25kD, 16,5kD y 6,5kD de acuerdo con el peso molecular). Cuando la proteína de fusión 153PTH es escindida por uroquinasa, se tienen que producir un compañero de fusión de un peso molecular correspondiente a 153 aminoácidos y una proteína PTH deseada de un peso molecular correspondiente a 84 aminoácidos. Como se muestra en la Figura 11, se encontró que aparecía una proteína PTH de aproximadamente 10 kD según lo esperado. Sin embargo, se reveló que casi no aparecía el fragmento de proteína 153PRK de aproximadamente 17kD esperado, esto es, un compañero de fusión, y aparecían diversos fragmentos de proteína de un tamaño más pequeño. Por lo tanto, se sugirió que se había producido la escisión no específica por la uroquinasa en algunos de los 12 restos arginina de 153PRK.
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Ejemplo 7 Construcción de un vector de expresión pm153PTH y su expresión
Con el fin de reducir la escisión adicional de 153PRK por la uroquinasa, se eliminaron los restos arginina que se localizaban en los posibles sitios de escisión adicional. Considerando el tamaño de los fragmentos de proteína producidos durante la escisión de 153PTH por la uroquinasa, se esperaba que se pudiera producir una escisión adicional en los restos arginina 30º, 31º, 58º, 59º, 94º y 96º del extremo amino de PRK. De este modo, los autores de la presente invención intentaron sustituir aquellos restos arginina por otros aminoácidos.
Esto es, se insertó un fragmento del gen 153PTH que se había aislado después de la digestión de un vector de expresión p153PTH con SacII y HindIII en un fragmento vector que se había preparado digiriendo pBlueScript SK(+) (Stratagene, USA) con SacII y HindIII para dar un plásmido para la mutación, pSK(+)153PTH por medio del cual se obtuvo un ADN de hebra sencilla (véase: la Figura 12). Se transformó E. coli CJ236 con pSK(+)153PTH, y se realizó la mutación específica del sitio de acuerdo con el método de Kunkel et al., (véase: Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:488-492 (1985)). En relación con esto, se utilizaron los siguiente mutámeros:
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1 
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2 
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3
Se preparó un vector mutante en el que las argininas 30ª, 58ª y 94ª estaban sustituidas por valinas y las argininas 59ª y 96ª estaban sustituidas por glicinas utilizando los mutámeros y se denominó pSK(+)m153PTH. Se ligaron un fragmento 53PRK mutado obtenido digiriendo pSK(+)m153PTH con NdeI/BamHI y un fragmento vector que contenía uroquinasa/PTH digiriendo un vector de expresión p153PTH con NdeI/BamHI por medio de ligasa de T4 para construir un vector de expresión pm153PTH (véase: la Figura 12).
Se transformó E. coli MC1061 (F-araD139 \Delta(ara-leu)7696 galE15 galK16 D(lac)X74 rpsL(Str^{r}) hsdR2(rk^{-}mk^{+}) mcrA mcrB1) con el vector de expresión pm153PTH y se cultivó de la misma manera que en el Ejemplo 5. El análisis SDS-PAGE reveló que se expresaba la proteína de fusión m153PRK/PTH (en adelante, referida como "m153PTH") (véase: la Figura 13). En la Figura 13, la calle 1 muestra las proteínas totales de E. coli MC1061 transformada con un vector de expresión p153PTH que se había cultivado durante 20 horas tras la inducción con arabinosa al 1%; la calle 2 muestra las proteínas totales de E. coli MC1061 transformada con un vector de expresión pm153PTH que se había cultivado durante 20 horas tras la inducción con arabinosa al 1%; la calle 3 muestra las proteínas totales de E. coli MC1061 transformada con un vector de expresión pm153PTH antes de la inducción con arabinosa al 1%; y, la calle M muestra un marcador de tamaño de proteína normalizado (NEB7707L, 83kD, 62kD, 47,5kD, 32,5kD, 25kD, 16,5kD y 6,5kD de acuerdo con el peso molecular). Como se muestra en la Figura 13, se encontró que E. coli transformada con pm153PTH expresaba una proteína de fusión en las mismas cantidades o cantidades ligeramente incrementadas en comparación con E. coli transformada con p153PTH, que no muestra una reducción de la expresión por la sustitución de aminoácidos.
Escherichia coli MC1061 transformada con el vector de expresión pm153PTH fue designada Escherichia coli MC1061:pm153PTH, y depositada en el Centro de Cultivos de Microorganismos Coreano (KCCM), una autoridad de depósito internacional localizada en 134 Shinchon-Dong, Seodaemu-Ku, Seúl, Corea, con el Núm. de Acceso KCCM-10102 el 9 de Julio de 1997.
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Ejemplo 8 Aislamiento y digestión de cuerpos de inclusión de una proteína de fusión m153PTH
Con el fin de investigar cómo es expresada la proteína de fusión m153PTH en E. coli, las alícuotas tomadas como muestra durante el aislamiento de los cuerpos de inclusión se analizaron mediante SDS-PAGE de la misma manera que en el Ejemplo 6 (véase: la Figura 14). En la Figura 14, las calles 2, 3, 4 a 7 y 8 muestran el producto lisado celular; el sobrenadante del producto lisado celular, las soluciones lavadas de los cuerpos de inclusión y los cuerpos de inclusión desnaturalizados, respectivamente; la calle 1 muestra el marcador de tamaño de proteínas normalizado de BRL 16040-016 tal como 43kD, 29kD, 18,4kD, 14,3kD, 6,2kD y 3,4kD de acuerdo con el peso molecular; y, la calle 9 muestra el marcador de tamaño de proteínas normalizado de NEB 7707L tal como 175kD, 83kD, 62kD, 47,5kD, 32,5kD, 25kD, 16,5kD y 6,5kD de acuerdo con el peso molecular. Como se muestra en la Figura 14, se reveló que, como una proteína de fusión m153, la proteína de fusión m153PTH formaba cuerpos de inclusión dentro de la célula.
Una vez que se hubo llevado a cabo la cuantificación de la proteína de fusión aislada de la misma manera que en el Ejemplo 6, se añadieron 0,5 \mug de uroquinasa a 100 \mug de proteína de fusión 153PTH o m153PTH y se hicieron reaccionar a 25ºC durante 1 hora. Después, se investigó el nivel de escisión mediante SDS-PAGE (véase: la Figura 15). En la Figura 15, las calles impares muestran una proteína de fusión sin la adición de uroquinasa como control y las calles pares muestran una proteína de fusión con adición de uroquinasa; las calles 1 y 2 muestran una proteína de fusión 153PTH; las calles 3 y 4 muestran una proteína de fusión m153PTH; y, la calle M muestra un marcador de tamaño de proteína normalizado (NEB7707L, 175kD, 83kD, 62kD, 47,5kD, 32,5kD, 25kD, 16,5kD y 6,5kD de acuerdo con el peso molecular). Como se muestra en la Figura 15, se encontró que la escisión no específica por uroquinasa disminuía en la escisión de una proteína de fusión m153PTH en comparación con la de la proteína de fusión 153PTH. Por consiguiente, se podía obtener más PTH a partir de las proteínas de fusión m153PTH que de las proteínas de fusión 153PTH, en las mismas condiciones de reacción así como con el uso de la misma cantidad de proteína de fusión.
Por otra parte, para comparar la eficacia de escisión de las proteínas de fusión 153PTH y m153PTH por la uroquinasa de acuerdo con el tiempo de escisión, la proteína de fusión y la uroquinasa se mezclaron a una razón de concentración de 200:1 y se hicieron reaccionar a 25ºC durante la escisión. Después, se recogieron las alícuotas de acuerdo con el tiempo y se analizaron mediante SDS-PAGE (véase: la Figura 16). En la Figura 16, las calles 1 a 7 muestran las muestras digeridas con uroquinasa durante 20, 30,60, 150, 190, 225 y 360 minutos, respectivamente.
Como se muestra en la Figura 16, se reveló que la proteína de fusión m153PTH era escindida casi completamente después de la reacción durante 60 minutos y la proteína de fusión m153PTH no era escindida completamente ni siquiera después de la reacción durante 6 horas.
A partir de dicho experimento de escisión comparativa, se encontró que la proteína de fusión m153PTH aumentaba el rendimiento de PTH obtenida por tiempo y por uroquinasa utilizada, en comparación con la proteína de fusión 153PTH.
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Ejemplo 9 Purificación de PTH humana recombinante
Se llevó a cabo la cuantificación de la proteína de fusión m153PTH en los cuerpos de inclusión aislados de la misma manera que en el Ejemplo 8 y se diluyó la proteína con tampón Tris hasta alcanzar una concentración de proteína de 1 mg/ml. Se añadió uroquinasa (proteasa) a la solución y se hizo reaccionar a 25ºC para separar la PTH de las proteínas de fusión. Las proteínas PTH separadas se purificaron utilizando una resina de intercambio iónico y una cromatografía HPLC reversa C_{18} y se analizaron mediante SDS-PAGE (gel en gradiente 4-20%), que se muestra en la Figura 17. En la Figura 17, las calles 1 a 3 muestran 15, 7,5 y 3,75 \mug de PTH purificada, respectivamente; y, la calle M muestra el marcador de peso molecular de proteína normalizado (Novex LC 5677, 200kD, 116,3kD, 97,4kD, 66,3kD, 55,4kD, 36,5kD, 31kD, 21,5kD, 14,4kD, 6kD y 3,5kD de acuerdo con el peso molecular). Como se muestra en la Figura 17, se reveló que una PTH recombinante humana era purificada en forma aislada.
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Ejemplo 10 Determinación de la actividad de la PTH recombinante humana
La línea celular UMR106 (línea celular de osteosarcoma de rata de fenotipo osteoblástico) ha sido ampliamente utilizada para estudios de las características de los osteoblastos y se ha sabido que la línea celular muestra una elevada actividad de fosfatasa alcalina, esto es, una de las características de los osteoblastos, y produce colágeno de tipo I (véase: Meika A. Fang et al., Endocrinology, 131(5):2113-2119 (1992); Cheryl O. Quinn et al., The Journal of Biological Chemistry, 265(36):22342-22347 (1990)). De este modo, la actividad in vivo de la PTH recombinante humana (rhPTH(1-84)) purificada en el Ejemplo 9 se determinó mediante un análisis de unión a receptor de PTH y un ensayo de estimulación de la producción de AMPc intracelular utilizando la línea celular UMR 106 (ATCC CRL 1661). En relación con esto, se utilizó PTH humana sintética (shPTH(1-84), Sigma Chemical Co., USA) como control y se llevó a cabo la cuantificación de PTH utilizando ``Allegro Intact PTH RIA kit (Nichols Institute, San Juan Capistrano, USA)) que detecta solamente la PTH intacta que tiene los extremos amino y carboxi (véase: Samuel R. Nussbaum et al., Clinical Chemistry, 33(8):1364-1367(1987)). Por otra parte, se cultivó la línea celular UMR106 en DMEM (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco) que contenía bicarbonato de sodio al 0,2% y FBS al 10% (suero bovino fetal, tratado con calor a 56ºC durante 30 minutos) a 37ºC en un entorno con CO_{2} al 5% (véase: Ronald J. Midura et al., The Journal of Biological Chemistry, 269(18):13200-13206 (1994)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10-1
Un ensayo de unión para el receptor de PTH
Se llevó a cabo un ensayo de unión a un receptor de PTH como sigue: (véase: Chohei Shigeno et al., The Journal of Biological Chemistry, 263(8):3864-3871 (1988)): se añadieron 10^{5} células UMR106 por pocillo a una placa de 24 pocillos y se cultivaron durante 4 a 8 días. Se cambió el medio cada dos días y se cambió diariamente 3 días antes del ensayo. Por otra parte, con el fin de preparar (Nle^{8,18}Tyr^{34}) PTH bovina(1-34)-NH_{2}(bPTH(1-34)) (véase: Gino V. Segre et al., JBC, 254(15):6980-6986 (1979)) que estaba marcada con un isótopo radiactivo, I^{125} en un resto tirosina del extremo carboxi, se yodó bPTH(1-34) con NaI^{125} utilizando cloramina T (Sigma Chemical Co., USA) como catalizador. Los productos de la yodación se cargaron en una columna Sep-Pak C_{18} y se hizo eluir la bPTH yodada con ACN (acetonitrilo) al 50%/TFA (ácido trifluoroacético) al 0,1% para separar el I^{125} libre. Después, se separó el ACN de la bPTH aislada.
Se determinó la afinidad de unión de PTH a su receptor comparando la inhibición competitiva de rhPTH(1-84) y shPTH(1-84) frente a la unión del ligando al receptor utilizando la (Nle^{8,18}Tyr^{34})-bPTH(1-34) marcada con I^{125} como ligando. Los ligandos y las PTH mencionadas se diluyeron con tampón de unión (tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,7) que contenía NaCl 100 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, suero de caballo al 5% y FBS al 0,5%), respectivamente. Por otra parte, la placa de 24 pocillos obtenida tras el cultivo anterior se enfrió con hielo, se lavó con 1 ml del tampón de unión dos veces, y se añadió a un ligando de 30.000 a 50.000 cpm y a una PTH competitiva de diversas concentraciones hasta alcanzar un volumen final de 0,3 ml. Cada diluyente de hormona se añadió a 3 pocillos concurrentemente y se adsorbió a 15ºC durante 4 horas. Después de la reacción, los pocillos se lavaron con 0,5 ml del tampón de unión cuatro veces para separar los isótopos radiactivos libres. Después, se añadieron 0,5 ml de NaOH 0,5M, y se extrajeron los isótopos radiactivos que se unían a las células a la temperatura ambiente durante 16 a 18 horas. La solución obtenida después de la extracción se mezcló con la solución obtenida después de lavar con 0,5 ml del tampón de unión y se sometió a recuento su radiactividad empleando un contador \gamma.
Se determinó la unión específica restando el valor de la unión no específica medido utilizando cada hormona competitiva 1 mM del valor de la radiactividad de unión medida antes. El valor determinado se expresó como el porcentaje frente a la unión específica máxima, y se determinaron la optimización de la curva y la CI_{50} (concentración inhibidora del 50%: concentración de hormona requerida para reducir la unión del ligando en 50%) que es un índice importante para la comparación de la afinidad de unión de cada hormona competitiva de acuerdo con el programa fig-P de Biosoft Co. Los valores de la CI_{50} de shPTH(1-84) y rhPTH(1-84) fueron 18,6 \pm 1,5 y 17,3 \pm 3,1 nM (el valor medio \pm la desviación típica), respectivamente. Uno de los resultados se mostró en la Figura 18(a). Como se muestra en la Figura 18(A), se encontró que la PTH recombinante tenía la misma actividad de unión al receptor que la PTH sintética.
\newpage
Ejemplo 10-2
Un ensayo de estimulación de la producción de AMPc intracelular
Se llevó a cabo un ensayo de estimulación de la producción de AMPc intracelular como sigue (véase: Thomas J. Gardella et al., JBC, 265(26):15854-15859 (1990)): Las células UMR cultivadas en una placa de 24 pocillos durante 4 a 8 días en el Ejemplo 10-1 se enfriaron durante 15 minutos sobre hielo y se lavaron con 0,25 ml de tampón de AMPc (DMEM (pH 7,4) que contenía 3-isobutilmetilxantina 2 mM, 1 mg/ml de BSA y HEPES 35 mM). Y después, se añadieron 0,1 ml de tampón de AMPc a la placa, y se añadieron 0,1 ml de tampón de AMPc que contenía cada hormona de diversas concentraciones. Después, la reacción fue a 37ºC durante 20 minutos y el tampón se separó. Y luego, se repitieron tres veces la congelación a -70ºC y la descongelación a la temperatura ambiente durante 20 minutos, respectivamente, para destruir las células, y se añadió 1 ml de HCl 50 mM a cada pocillo de la placa. Después, se extrajo el AMPc intracelular a -20ºC durante 16 a 18 horas, y se llevó a cabo la cuantificación del AMPc del extracto utilizando el kit cAMP RIA (New England Nuclear, Du Pont, USA). Se determinaron la optimización de la curva y la CE_{50} (concentración de hormona requerida para estimular la producción de AMPc intracelular hasta alcanzar un incremento de 50%) de acuerdo con el programa fig-P de Biosoft Co. Los valores de la CE_{50} de shPTH(1-84) y rhPTH(1-84) fueron 1,9 \pm 0,1 y 1,3 \pm 0,2 mM (el valor medio \pm la desviación típica), respectivamente. Uno de los resultados se mostró en la Figura 18(B). Como se muestra en la Figura 18(B), se encontró que la PTH recombinante tenía la misma actividad estimuladora de la adenilato ciclasa que la PTH sintética.
Como se ha ilustrado claramente y se ha demostrado antes, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que se prepara insertando un gen de PTH humana que contiene un sitio de escisión específico de uroquinasa en un vector inducible por L-arabinosa que contiene un fragmento del gen PRK, un microorganismo recombinante traducido con dicho vector de expresión o su gen mutado como compañero de fusión, y un procedimiento para preparar PTH humana a gran escala cultivando dicho microorganismo en un medio que contiene L-arabinosa. De acuerdo con la invención, se puede preparar una PTH humana recombinante que tiene la misma actividad de la PTH humana nativa con un elevado rendimiento por medio del control preciso de la inducción mediante un procedimiento de fabricación que comprende una etapa de inducción de la expresión de la proteína de fusión en el microorganismo transformado con el vector de expresión recombinante por medio de L-arabinosa.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: MOGAM BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 341, Pojung-Ri, Koosung-Myun
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Yongin-Kun, Kyonggi-Do
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: no aplicable
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Corea
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 449-910
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 02-741-0611
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 0331-262-6622
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UN VECTOR DE EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE LA HORMONA {}\hskip4,5cm PARATIROIDEA HUMANA QUE UTILIZA FOSFORRIBULOQUINA- {}\hskip4,5cm SA COMO COMPAÑERO DE FUSIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 25
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SISTEMA LÓGICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGAGTACT GCAGCTGGAT CCGGTACTGG TAGA 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: SER HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Salmonella typhymurium 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: sonda
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Salmonella typhymurium 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: sonda
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: sitio de restricción de NdeI
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rhodobacter sphaeroides 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: cebador 5'
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rhodobacter sphaeroides 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: cebador 3'
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rhodobacter sphaeroides 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: cebador 3'
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rhodobacter sphaeroides 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: cebador 5'
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rhodobacter sphaeroides 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: mutámero
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rhodobacter sphaeroides 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: mutámero
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rhodobacter sphaeroides 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: mutámero
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
27

Claims (11)

1. Un vector de expresión inducible por L-arabinosa recombinante que contiene un gen de hormona paratiroidea humana conectado por medio de una secuencia de ADN que codifica un sitio de escisión específico de uroquinasa a un fragmento génico de fosforribuloquinasa nativo o modificado de Rhodobacter sphaeroides como compañero de fusión, donde el fragmento génico de la fosforribuloquinasa es un fragmento de ADN que codifica 113 a 153 aminoácidos del extremo amino de la fosforribuloquinasa y donde el fragmento génico de la fosforribuloquinasa modificado tiene una escisión adicional reducida por uroquinasa.
2. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1, donde el vector inducible por L-arabinosa que contiene un gen de fosforribuloquinasa es pPRK cuyo mapa génico se muestra en la Figura 4.
3. El vector de expresión recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sitio de escisión específico de uroquinasa es una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos:
-X-Gly-Arg
donde,
X es Pro, Thr, Ile, Phe o Leu.
4. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 3, donde el sitio de escisión específico de uroquinasa es una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos -Thr-Gly-Arg.
5. El vector de expresión recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el gen de la hormona paratiroidea humana tiene la secuencia de ADN:
28
29
6. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1 que contiene:
(i) un fragmento de ADN que codifica 153 aminoácidos del extremo amino de la fosforribuloquinasa de Rhodobacter sphaeroides;
(ii) un fragmento de ADN que codifica un sitio de escisión específico de uroquinasa -Thr-Gly-Arg; y,
(iii) un gen de la hormona paratiroidea humana.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1, que contiene las siguientes secuencias de ADN de una manera sucesiva:
(i) un fragmento de ADN que codifica 153 aminoácidos del extremo amino de la fosforribuloquinasa de Rhodobacter sphaeroides, donde uno o más de los restos arginina localizados en las posiciones 30, 31, 58, 59, 94 y 96 están sustituidos por diferentes aminoácidos;
(ii) un fragmento de ADN que codifica un sitio de escisión específico de uroquinasa -Thr-Gly-Arg, donde, X es Pro, Thr, Ile, Phe o Leu; y
(iii) un gen de la hormona paratiroidea humana.
\vskip1.000000\baselineskip
8. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1 que contiene las siguientes secuencias de ADN de una manera sucesiva:
(i) un fragmento de ADN que codifica 153 aminoácidos del extremo amino de la fosforribuloquinasa de Rhodobacter sphaeroides, donde los restos arginina de las posiciones 30, 58 y 94 están sustituidos por valina y los restos arginina de las posiciones 59 y 96 están sustituidos por glicina;
(ii) un fragmento de ADN que codifica un sitio de escisión específico de uroquinasa -Thr-Gly-Arg; y
(iii) un gen de la hormona paratiroidea humana.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un microorganismo transformado con un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
10. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 9 que es Escherichia coli MC1061:p153PTH (KCCM-10101) o Escherichia coli MC1061:pm153PTH (KCCM-10102).
11. Un procedimiento para preparar hormona paratiroidea humana que comprende:
(i) cultivar un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 9 o 10;
(ii) inducir la expresión de la hormona paratiroidea humana por medio de L-arabinosa; y
(iii) recuperar la hormona paratiroidea humana.
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