JP3480836B2 - ヒト副甲状腺ホルモンの組換え発現ベクター - Google Patents
ヒト副甲状腺ホルモンの組換え発現ベクターInfo
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-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【０００１】（技術分野）
本発明は、ホスホリブロキナーゼを融合パートナーとし
て利用する発現ベクターおよび、それを用いたヒト副甲
状腺ホルモンの製造方法に関する。より具体的には、本
発明はロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａ
ｃｔｅｒｓ ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のホスホリブロキ
ナーゼ遺伝子断片、あるいはその突然変異体を融合パー
トナーとして含有するＬ-アラビノースの誘導性ベクタ
ーに、ウロキナーゼ特異的切断部位を含むヒト副甲状腺
ホルモン遺伝子を挿入して製造した組換え発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された組換え微生物、お
よび該微生物をＬ-アラビノースの含有培地で培養する
ことにより、ヒト副甲状腺ホルモンを大量製造する方法
に関する。
て利用する発現ベクターおよび、それを用いたヒト副甲
状腺ホルモンの製造方法に関する。より具体的には、本
発明はロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａ
ｃｔｅｒｓ ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のホスホリブロキ
ナーゼ遺伝子断片、あるいはその突然変異体を融合パー
トナーとして含有するＬ-アラビノースの誘導性ベクタ
ーに、ウロキナーゼ特異的切断部位を含むヒト副甲状腺
ホルモン遺伝子を挿入して製造した組換え発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された組換え微生物、お
よび該微生物をＬ-アラビノースの含有培地で培養する
ことにより、ヒト副甲状腺ホルモンを大量製造する方法
に関する。
【０００２】（背景技術）
骨粗しょう症は、骨の質量が正常より顕著に減少して骨
の組織が弱まり、軽い衝撃にも骨折等の有害な影響を来
す疾患である。医学や生物学等の発展のため、老人人口
が増加するにつれて骨粗しょう症の患者も増えてきてい
る。かつ、核家族化の傾向に従い一人暮らしの老人が増
えている今日、骨粗しょう症は重要な社会問題になって
いる。
の組織が弱まり、軽い衝撃にも骨折等の有害な影響を来
す疾患である。医学や生物学等の発展のため、老人人口
が増加するにつれて骨粗しょう症の患者も増えてきてい
る。かつ、核家族化の傾向に従い一人暮らしの老人が増
えている今日、骨粗しょう症は重要な社会問題になって
いる。
【０００３】一般に、正常な骨の組織の場合には、骨を
破壊する細胞の破骨細胞と、骨を生成する細胞の骨芽細
胞の活性が、互いに均衡をなして、常に骨の組織を改造
している。正常人の場合にも、年を取るにつれて、破骨
細胞の機能が骨芽細胞の機能を上回るようになり、骨密
度が全般的に減少するが、骨粗しょう症の患者の場合に
は、その破骨細胞と骨芽細胞の活性間の均衡破壊が正常
人に比べて遙かに激しい。
破壊する細胞の破骨細胞と、骨を生成する細胞の骨芽細
胞の活性が、互いに均衡をなして、常に骨の組織を改造
している。正常人の場合にも、年を取るにつれて、破骨
細胞の機能が骨芽細胞の機能を上回るようになり、骨密
度が全般的に減少するが、骨粗しょう症の患者の場合に
は、その破骨細胞と骨芽細胞の活性間の均衡破壊が正常
人に比べて遙かに激しい。
【０００４】破骨細胞と骨芽細胞の活性間の均衡破壊の
原因については明確に知られていないが、閉経期以後の
女性たちに多く見られるタイプ１骨粗しょう症の場合に
は、女性ホルモンであるエストロゲンの閉経後の分泌減
少に起因することが知られている。従って、タイプ１骨
粗しょう症の治療にはエストロゲンを投与しているが、
乳癌、子宮内膜癌等の発病率が高まる等の副作用のた
め、エストロゲンの使用を好まない患者が多い。また、
タイプ１骨粗しょう症とは異なる原因により発病すると
知られているタイプ２骨粗しょう症には、エストロゲン
の使用では治療効果が得られない。
原因については明確に知られていないが、閉経期以後の
女性たちに多く見られるタイプ１骨粗しょう症の場合に
は、女性ホルモンであるエストロゲンの閉経後の分泌減
少に起因することが知られている。従って、タイプ１骨
粗しょう症の治療にはエストロゲンを投与しているが、
乳癌、子宮内膜癌等の発病率が高まる等の副作用のた
め、エストロゲンの使用を好まない患者が多い。また、
タイプ１骨粗しょう症とは異なる原因により発病すると
知られているタイプ２骨粗しょう症には、エストロゲン
の使用では治療効果が得られない。
【０００５】前記タイプ１骨粗しょう症の治療剤である
エストロゲンの短所を補完し、エストロゲンで治療効果
を得られないタイプ２骨粗しょう症を治療する薬剤とし
ては、破骨細胞の活性を抑制して骨組織の吸収を阻害す
る作用をするカルシトニンが用いられる。しかしなが
ら、エストロゲンとカルシトニンは両方とも既に損失さ
れた骨質量を増加させる効果はなく、単に骨密度がそれ
以上減少しないように予防する機能のみを有しているた
め、効果的な骨粗しょう症の治療剤としては不適当であ
る。
エストロゲンの短所を補完し、エストロゲンで治療効果
を得られないタイプ２骨粗しょう症を治療する薬剤とし
ては、破骨細胞の活性を抑制して骨組織の吸収を阻害す
る作用をするカルシトニンが用いられる。しかしなが
ら、エストロゲンとカルシトニンは両方とも既に損失さ
れた骨質量を増加させる効果はなく、単に骨密度がそれ
以上減少しないように予防する機能のみを有しているた
め、効果的な骨粗しょう症の治療剤としては不適当であ
る。
【０００６】最近、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）が骨密
度の減少を予防するだけでなく、骨密度を増大する効果
がある上、副作用も報告されていないため、骨粗しょう
症の優秀な治療剤として注目されている。副甲状腺の主
細胞で生産され、アミノ酸１１５個からなるプレプロ副
甲状腺ホルモン（プレプロＰＴＨ）は、小胞体を経なが
ら切断されてアミノ酸９２個からなるプロＰＴＨに変形
する。続いて、プロＰＴＨは、ゴルジ器官を経ながら再
び切断されてアミノ酸８４個からなる成熟ＰＴＨにな
る。上記過程を経て合成されたＰＴＨは、血中に分泌さ
れた後、標的器官である骨と腎臓に輸送される。分泌さ
れたＰＴＨの半減期は１８分にすぎない。
度の減少を予防するだけでなく、骨密度を増大する効果
がある上、副作用も報告されていないため、骨粗しょう
症の優秀な治療剤として注目されている。副甲状腺の主
細胞で生産され、アミノ酸１１５個からなるプレプロ副
甲状腺ホルモン（プレプロＰＴＨ）は、小胞体を経なが
ら切断されてアミノ酸９２個からなるプロＰＴＨに変形
する。続いて、プロＰＴＨは、ゴルジ器官を経ながら再
び切断されてアミノ酸８４個からなる成熟ＰＴＨにな
る。上記過程を経て合成されたＰＴＨは、血中に分泌さ
れた後、標的器官である骨と腎臓に輸送される。分泌さ
れたＰＴＨの半減期は１８分にすぎない。
【０００７】ＰＴＨは、骨細胞膜のＣａ2+ポンプを活性
化して骨からのＣａＨＰＯ4の移動を促進することによ
り、数分以内に血中Ｃａ2+濃度を増加させる。更に、Ｐ
ＴＨが分泌し続けると既に形成されている破骨細胞を活
性化し、新しい破骨細胞の生成を促進し、骨芽細胞の活
動を一時的に抑えることにより、骨でのＣａ2+沈着を抑
制して、Ｃａ2+の放出を促進し、血中へのＣａ2+およ
び、ＰＯ4 3-の分泌をも増加させる。一方、ＰＴＨは血
中Ｃａ2+濃度による強力なフィードバックメカニズムで
分泌が調節される。すなわち、血中のＣａ2+濃度が短時
間に１０％減少すると、ＰＴＨの分泌は２倍に増加す
る。長時間にわたって血中Ｃａ2+濃度が低い状況では、
１％のＣａ2+濃度減少によってもＰＴＨの分泌は２倍に
増加する。このようなＰＴＨの生体内調節機能とは別
に、ＰＴＨを外部から間欠的に小量づつ投与する場合、
骨形成を促進することが報告された（参照：Ｔａｍ、
Ｃ．Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１０：５
０６-５１２（１９８２））。このような骨形成の促進
機能が、ＰＴＨを骨粗しょう症の治療剤として用いる根
拠となっている。ＰＴＨの骨形成の促進機能について正
確なメカニズムは知られていないが、投与されたＰＴＨ
による（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＰＴＨ分泌の抑制、骨芽細胞
に対する直接的な機能促進、インスリン様成長因子-１
（ＩＧＦ-１）、及び形質転換成長因子-β（ＴＧＦ-
β）等の成長因子を介した間接的な骨形成促進等の仮説
が提示されている。
化して骨からのＣａＨＰＯ4の移動を促進することによ
り、数分以内に血中Ｃａ2+濃度を増加させる。更に、Ｐ
ＴＨが分泌し続けると既に形成されている破骨細胞を活
性化し、新しい破骨細胞の生成を促進し、骨芽細胞の活
動を一時的に抑えることにより、骨でのＣａ2+沈着を抑
制して、Ｃａ2+の放出を促進し、血中へのＣａ2+およ
び、ＰＯ4 3-の分泌をも増加させる。一方、ＰＴＨは血
中Ｃａ2+濃度による強力なフィードバックメカニズムで
分泌が調節される。すなわち、血中のＣａ2+濃度が短時
間に１０％減少すると、ＰＴＨの分泌は２倍に増加す
る。長時間にわたって血中Ｃａ2+濃度が低い状況では、
１％のＣａ2+濃度減少によってもＰＴＨの分泌は２倍に
増加する。このようなＰＴＨの生体内調節機能とは別
に、ＰＴＨを外部から間欠的に小量づつ投与する場合、
骨形成を促進することが報告された（参照：Ｔａｍ、
Ｃ．Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１０：５
０６-５１２（１９８２））。このような骨形成の促進
機能が、ＰＴＨを骨粗しょう症の治療剤として用いる根
拠となっている。ＰＴＨの骨形成の促進機能について正
確なメカニズムは知られていないが、投与されたＰＴＨ
による（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＰＴＨ分泌の抑制、骨芽細胞
に対する直接的な機能促進、インスリン様成長因子-１
（ＩＧＦ-１）、及び形質転換成長因子-β（ＴＧＦ-
β）等の成長因子を介した間接的な骨形成促進等の仮説
が提示されている。
【０００８】ところが、ＰＴＨを利用して骨粗しょう症
を治療するには、ＰＴＨを長期間に渡って投与する必要
があるが、今まではＰＴＨの大量生産方法が確立してい
なかったため、骨粗しょう症の治療剤としてＰＴＨを実
用化するのは非常に困難であった。故に、本発明者らは
遺伝子工学的方法を利用して組換え微生物よりＰＴＨを
大量製造するための研究を行い、ＰＴＨアミノ末端のＳ
ｅｒ-Ｖａｌ-Ｓｅｒアミノ酸配列がＰＴＨの生物学的活
性に必須であることが報告されているため、大腸菌での
ＰＴＨ発現時、アミノ末端のメチオニン残基の除去に努
力した。
を治療するには、ＰＴＨを長期間に渡って投与する必要
があるが、今まではＰＴＨの大量生産方法が確立してい
なかったため、骨粗しょう症の治療剤としてＰＴＨを実
用化するのは非常に困難であった。故に、本発明者らは
遺伝子工学的方法を利用して組換え微生物よりＰＴＨを
大量製造するための研究を行い、ＰＴＨアミノ末端のＳ
ｅｒ-Ｖａｌ-Ｓｅｒアミノ酸配列がＰＴＨの生物学的活
性に必須であることが報告されているため、大腸菌での
ＰＴＨ発現時、アミノ末端のメチオニン残基の除去に努
力した。
【０００９】組換えタンパク質発現の宿主として幅広く
用いられている大腸菌には、発現タンパク質のアミノ末
端の翻訳開始のメチオニンを除去する酵素であるメチオ
ニン特異的アミノペプチダーゼがある。ところが、外来
タンパク質が大腸菌内で大量発現する際にはアミノ末端
のメチオニンが完全に除去されない場合がある。このよ
うな現状はアミノ末端のアミノ酸配列が生物学的活性に
大きな影響を及ぼすＰＴＨのようなタンパク質の発現系
を構築するためには、必ず解決されるべきな事項であ
る。
用いられている大腸菌には、発現タンパク質のアミノ末
端の翻訳開始のメチオニンを除去する酵素であるメチオ
ニン特異的アミノペプチダーゼがある。ところが、外来
タンパク質が大腸菌内で大量発現する際にはアミノ末端
のメチオニンが完全に除去されない場合がある。このよ
うな現状はアミノ末端のアミノ酸配列が生物学的活性に
大きな影響を及ぼすＰＴＨのようなタンパク質の発現系
を構築するためには、必ず解決されるべきな事項であ
る。
【００１０】前述の問題を解決するため、主に次の３つ
の方法が用いられる：第一、目的タンパク質のアミノ末
端に分泌シグナル配列を融合させた形態で発現させるこ
とにより、目的タンパク質をアミノ末端の切断（ｐｒｏ
ｃｅｓｓｉｎｇ）された形態で大腸菌のペリプラズムや
培養培地に分泌されるようにする方法である。当該方法
は細胞内活性を利用して成熟タンパク質を得ることがで
きるのが長所である反面、発現収率が比較的低いのが短
所である。第二は、目的タンパク質を大腸菌で単独発現
させ、アミノ末端にメチオニンが付いている状態で大腸
菌から分離し、これをアミノペプチダーゼで切断して成
熟タンパク質を得る方法である。当該方法は、アミノ末
端のメチオニンが除去されたタンパク質とメチオニンが
付いているタンパク質との分離が難しいため、タンパク
質の精製工程が複雑であるのが短所である。第三は、目
的タンパク質を他のタンパク質との融合形態で発現さ
せ、融合タンパク質を大腸菌より分離した後、酵素、ま
たは化学物質を用いて融合タンパク質より融合されたパ
ートナーを除去することにより、成熟目的タンパク質を
製造する方法である。当該方法はアミノ末端のメチオニ
ンが除去された目的タンパク質を提供するだけでなく、
目的タンパク質の発現効率も増大させることが長所であ
る。
の方法が用いられる：第一、目的タンパク質のアミノ末
端に分泌シグナル配列を融合させた形態で発現させるこ
とにより、目的タンパク質をアミノ末端の切断（ｐｒｏ
ｃｅｓｓｉｎｇ）された形態で大腸菌のペリプラズムや
培養培地に分泌されるようにする方法である。当該方法
は細胞内活性を利用して成熟タンパク質を得ることがで
きるのが長所である反面、発現収率が比較的低いのが短
所である。第二は、目的タンパク質を大腸菌で単独発現
させ、アミノ末端にメチオニンが付いている状態で大腸
菌から分離し、これをアミノペプチダーゼで切断して成
熟タンパク質を得る方法である。当該方法は、アミノ末
端のメチオニンが除去されたタンパク質とメチオニンが
付いているタンパク質との分離が難しいため、タンパク
質の精製工程が複雑であるのが短所である。第三は、目
的タンパク質を他のタンパク質との融合形態で発現さ
せ、融合タンパク質を大腸菌より分離した後、酵素、ま
たは化学物質を用いて融合タンパク質より融合されたパ
ートナーを除去することにより、成熟目的タンパク質を
製造する方法である。当該方法はアミノ末端のメチオニ
ンが除去された目的タンパク質を提供するだけでなく、
目的タンパク質の発現効率も増大させることが長所であ
る。
【００１１】なお、融合タンパク質より目的タンパク質
を得る方法は、化学物質を用いた切断方法と酵素を用い
た切断方法とに大きく分けることができる。このうち、
化学物質を用いた切断方法は、低価の化学物質を用いる
ため、費用節減の長所があるが、切断部に対する特異性
が低いため、切断時に目的タンパク質以外の様々な種類
の副産物が生じ、当該副産物より目的タンパク質を分離
および、精製する工程が追加要求されるとの短所があ
る。反面、酵素を用いた切断方法は切断部位に対する特
異性に優れ、化学物質を用いた切断方法の問題点を解決
することができるが、用いられる酵素が高価であるた
め、この方法を産業的規模で活用するのは無理である。
を得る方法は、化学物質を用いた切断方法と酵素を用い
た切断方法とに大きく分けることができる。このうち、
化学物質を用いた切断方法は、低価の化学物質を用いる
ため、費用節減の長所があるが、切断部に対する特異性
が低いため、切断時に目的タンパク質以外の様々な種類
の副産物が生じ、当該副産物より目的タンパク質を分離
および、精製する工程が追加要求されるとの短所があ
る。反面、酵素を用いた切断方法は切断部位に対する特
異性に優れ、化学物質を用いた切断方法の問題点を解決
することができるが、用いられる酵素が高価であるた
め、この方法を産業的規模で活用するのは無理である。
【００１２】組換えタンパク質の大量生産の工程を研究
している多くの研究者らは、融合タンパク質より目的タ
ンパク質を切断するための酵素を経済的に用いようと試
してきた。ところが、このような目的で、現在開発され
て用いられているタンパク質の分解酵素であるＸａ因
子、トロンビン、エンテロキナーゼ等は大量生産には限
界があり、酵素を用いた切断方法は、様々の長所にもか
かわらず、産業的な水準では広く利用されていないのが
実情である。従って、酵素を用いた切断方法により効率
的に用いられる、すなわち経済的に大量生産できる第３
の酵素が切実に要求されてきた。血栓溶解剤といて用い
られているセリンプロテアーゼであるウロキナーゼ（２
本鎖のウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ
ー）の場合、大量生産の工程が既に開発されており、大
腸菌のような原核生物の発現系を用いて活性のあるウロ
キナーゼを大量製造することができ（参照：Ｗ．Ｅ．Ｈ
ｏｌｍｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：９
２３-９２９（１９８５））、前記Ｘａ因子等の他酵素
に比べ、より経済的にウロキナーゼを大量生産して取得
するに成功した。故に、ウロキナーゼは融合タンパク質
より経済的に目的タンパク質を切断、分離する候補とし
て提案されてきた。
している多くの研究者らは、融合タンパク質より目的タ
ンパク質を切断するための酵素を経済的に用いようと試
してきた。ところが、このような目的で、現在開発され
て用いられているタンパク質の分解酵素であるＸａ因
子、トロンビン、エンテロキナーゼ等は大量生産には限
界があり、酵素を用いた切断方法は、様々の長所にもか
かわらず、産業的な水準では広く利用されていないのが
実情である。従って、酵素を用いた切断方法により効率
的に用いられる、すなわち経済的に大量生産できる第３
の酵素が切実に要求されてきた。血栓溶解剤といて用い
られているセリンプロテアーゼであるウロキナーゼ（２
本鎖のウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ
ー）の場合、大量生産の工程が既に開発されており、大
腸菌のような原核生物の発現系を用いて活性のあるウロ
キナーゼを大量製造することができ（参照：Ｗ．Ｅ．Ｈ
ｏｌｍｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：９
２３-９２９（１９８５））、前記Ｘａ因子等の他酵素
に比べ、より経済的にウロキナーゼを大量生産して取得
するに成功した。故に、ウロキナーゼは融合タンパク質
より経済的に目的タンパク質を切断、分離する候補とし
て提案されてきた。
【００１３】こうした状況下、本発明者らはタンパク質
内でウロキナーゼによる特異的切断部位になるアミノ酸
配列を決定し、融合タンパク質の目的タンパク質と融合
パートナーとの間に特異的なウロキナーゼの切断部位の
アミノ酸配列である-Ｘ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ（式中、ＸはＰ
ｒｏ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＬｅｕを表す）
が存在する場合に切断効率が優秀であり、その中でも、
-Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇが存在する際に切断効率がもっ
とも優秀であることを発見した（参照：大韓民国特許公
開第９７-６４９５号）。
内でウロキナーゼによる特異的切断部位になるアミノ酸
配列を決定し、融合タンパク質の目的タンパク質と融合
パートナーとの間に特異的なウロキナーゼの切断部位の
アミノ酸配列である-Ｘ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ（式中、ＸはＰ
ｒｏ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＬｅｕを表す）
が存在する場合に切断効率が優秀であり、その中でも、
-Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇが存在する際に切断効率がもっ
とも優秀であることを発見した（参照：大韓民国特許公
開第９７-６４９５号）。
【００１４】（発明の開示）
本発明者らは、組換え大腸菌よりアミノ末端のメチオニ
ンが除去されたＰＴＨを大量製造するために鋭意努力し
た結果、ロドバクター・スフェロイデスのホスホリブロ
キナーゼ（以下、’ＰＲＫ’）の遺伝子断片、あるいは
その突然変異体を融合パートナーとして含有するＬ-ア
ラビノース誘導性ベクターに、ウロキナーゼによる特異
的切断部位を有し、大腸菌でのユニバーサルコードンを
使用するヒトＰＴＨ遺伝子を挿入して発現ベクターを構
築し、大腸菌を該発現ベクターで形質転換させ、形質転
換細胞から融合タンパク質を分離し、ウロキナーゼで融
合タンパク質を切断することにより、天然のヒトＰＴＨ
の活性を有する組換えＰＴＨを大量製造することができ
ることを確認し、本発明を完成するに至った。
ンが除去されたＰＴＨを大量製造するために鋭意努力し
た結果、ロドバクター・スフェロイデスのホスホリブロ
キナーゼ（以下、’ＰＲＫ’）の遺伝子断片、あるいは
その突然変異体を融合パートナーとして含有するＬ-ア
ラビノース誘導性ベクターに、ウロキナーゼによる特異
的切断部位を有し、大腸菌でのユニバーサルコードンを
使用するヒトＰＴＨ遺伝子を挿入して発現ベクターを構
築し、大腸菌を該発現ベクターで形質転換させ、形質転
換細胞から融合タンパク質を分離し、ウロキナーゼで融
合タンパク質を切断することにより、天然のヒトＰＴＨ
の活性を有する組換えＰＴＨを大量製造することができ
ることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１５】従って、本発明の主な目的は、ＰＲＫ遺伝
子断片、あるいはその突然変異体を含有するＬ-アラビ
ノース誘導性ベクターに、ウロキナーゼ特異的切断部位
を含むヒトＰＴＨ遺伝子を挿入して製造した組換え発現
ベクターを提供することである。本発明の他の目的は、
上記発現ベクターで形質転換された組換え微生物を提供
することである。本発明のもう一つの目的は、前記形質
転換された組換え微生物をＬ-アラビノース含有培地で
培養することにより、ヒトＰＴＨを大量製造する方法を
提供することである。
子断片、あるいはその突然変異体を含有するＬ-アラビ
ノース誘導性ベクターに、ウロキナーゼ特異的切断部位
を含むヒトＰＴＨ遺伝子を挿入して製造した組換え発現
ベクターを提供することである。本発明の他の目的は、
上記発現ベクターで形質転換された組換え微生物を提供
することである。本発明のもう一つの目的は、前記形質
転換された組換え微生物をＬ-アラビノース含有培地で
培養することにより、ヒトＰＴＨを大量製造する方法を
提供することである。
【００１６】まず、ヒトＰＴＨ遺伝子は、天然型ヒトＰ
ＴＨのアミノ酸配列に翻訳され、大腸菌で使用頻度の高
いコドンを含む塩基配列を有するように調製した。ま
た、融合タンパク質から所望のタンパク質を容易に取得
するため、融合パートナーと所望のタンパク質との間に
ウロキナーゼ特異的切断部位、すなわち-Ｘ-Ｇｌｙ-Ａ
ｒｇ（式中、ＸはＰｒｏ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ま
たはＬｅｕを表す）のアミノ酸配列、最も好ましくは-
Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇのアミノ酸配列が位置するよう
に、ウロキナーゼ特異的切断部位（参照：大韓民国特許
公開第９７-６４９５号）を合成し、ヒトＰＴＨ遺伝子
の前に挿入した。
ＴＨのアミノ酸配列に翻訳され、大腸菌で使用頻度の高
いコドンを含む塩基配列を有するように調製した。ま
た、融合タンパク質から所望のタンパク質を容易に取得
するため、融合パートナーと所望のタンパク質との間に
ウロキナーゼ特異的切断部位、すなわち-Ｘ-Ｇｌｙ-Ａ
ｒｇ（式中、ＸはＰｒｏ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ま
たはＬｅｕを表す）のアミノ酸配列、最も好ましくは-
Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇのアミノ酸配列が位置するよう
に、ウロキナーゼ特異的切断部位（参照：大韓民国特許
公開第９７-６４９５号）を合成し、ヒトＰＴＨ遺伝子
の前に挿入した。
【００１７】次に、前記ウロキナーゼ特異的切断部位‐
ヒトＰＴＨ遺伝子と、ＰＲＫのアミノ末端から１５３個
のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクター
ｐ１５３ＰＴＨを調製した。続いて、前記発現ベクター
よりＰＲＫ遺伝子断片を単離し、ＰＲＫアミノ酸配列の
一部を改変した後、再びヒトＰＴＨ遺伝子と融合させ、
発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨを調製した。
ヒトＰＴＨ遺伝子と、ＰＲＫのアミノ末端から１５３個
のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクター
ｐ１５３ＰＴＨを調製した。続いて、前記発現ベクター
よりＰＲＫ遺伝子断片を単離し、ＰＲＫアミノ酸配列の
一部を改変した後、再びヒトＰＴＨ遺伝子と融合させ、
発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨを調製した。
【００１８】上記の発現ベクターは、ＰＲＫのうち、そ
のアミノ末端から１５３個のアミノ酸を有するＰＲＫ断
片を融合パートナーとして用いているため、当該発現ベ
クターで形質転換された微生物において多量の融合タン
パク質（ＰＲＫ断片に融合したヒトＰＴＨ）が発現され
た。この際、ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌
は、ｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌に比べて、
同一またはやや増加した量の融合タンパク質を発現し、
アミノ酸置換は融合タンパク質の発現に影響しないこと
が示唆された。一方、前述のウロキナーゼ特異的切断部
位‐ヒトＰＴＨ遺伝子と、ＰＲＫの完全長遺伝子を含む
発現ベクターもまた、融合タンパク質を発現することが
できた。
のアミノ末端から１５３個のアミノ酸を有するＰＲＫ断
片を融合パートナーとして用いているため、当該発現ベ
クターで形質転換された微生物において多量の融合タン
パク質（ＰＲＫ断片に融合したヒトＰＴＨ）が発現され
た。この際、ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌
は、ｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌に比べて、
同一またはやや増加した量の融合タンパク質を発現し、
アミノ酸置換は融合タンパク質の発現に影響しないこと
が示唆された。一方、前述のウロキナーゼ特異的切断部
位‐ヒトＰＴＨ遺伝子と、ＰＲＫの完全長遺伝子を含む
発現ベクターもまた、融合タンパク質を発現することが
できた。
【００１９】さらに、部分的に改変されたＰＲＫ断片と
ヒトＰＴＨからなる融合タンパク質、および天然型ＰＲ
Ｋ断片とヒトＰＴＨからなる融合タンパク質を各々ウロ
キナーゼで切断した結果、部分的に改変されたＰＲＫ断
片とヒトＰＴＨからなる融合タンパク質では、ウロキナ
ーゼによる非特異的な反応が減少し、同量の融合タンパ
ク質を用いる同一条件での切断反応から、遥かに多くの
ＰＴＨが得られることが示された。
ヒトＰＴＨからなる融合タンパク質、および天然型ＰＲ
Ｋ断片とヒトＰＴＨからなる融合タンパク質を各々ウロ
キナーゼで切断した結果、部分的に改変されたＰＲＫ断
片とヒトＰＴＨからなる融合タンパク質では、ウロキナ
ーゼによる非特異的な反応が減少し、同量の融合タンパ
ク質を用いる同一条件での切断反応から、遥かに多くの
ＰＴＨが得られることが示された。
【００２０】ＰＲＫに融合したヒトＰＴＨは形質転換体
内で封入体の形態で発現された。その封入体を単離して
ウロキナーゼで処理した後、ＰＲＫ／ＰＴＨ融合タンパ
ク質から組換えヒトＰＴＨを分離および精製した。
内で封入体の形態で発現された。その封入体を単離して
ウロキナーゼで処理した後、ＰＲＫ／ＰＴＨ融合タンパ
ク質から組換えヒトＰＴＨを分離および精製した。
【００２１】一方では、生体内においてＰＴＨは腎臓お
よび無機質化した骨からのカルシウムの再吸収を促進
し、血中カルシウム濃度を増加させることにより、カル
シウムの恒常性を調節する活性を有しているが、前記活
性は、ＰＴＨが骨細胞や腎臓細胞の表面にある高親和性
受容体に結合し、該受容体に結合しているアデニル酸シ
クラーゼを活性化することにより、ＡＴＰから生じた細
胞内の２次シグナル伝達物質であるｃＡＭＰ（cyclic A
MP）により媒介されると報告されている（参照：Donahu
e、H.J.et al.,Endocrinology,126:1471-1477(1990)）。
このような報告に基き、本発明者らは、上述のように精
製された組換えヒトＰＴＨが天然ＰＴＨの活性を有して
いるかどうかを調べるため、骨細胞または腎臓細胞に存
在する受容体に対するＰＴＨの結合力と細胞内ｃＡＭＰ
形成の刺激度を測定した。その結果、上述のように調製
された組換えヒトＰＴＨは、受容体に結合して細胞内ｃ
ＡＭＰ生産を刺激することができることが分かった。
よび無機質化した骨からのカルシウムの再吸収を促進
し、血中カルシウム濃度を増加させることにより、カル
シウムの恒常性を調節する活性を有しているが、前記活
性は、ＰＴＨが骨細胞や腎臓細胞の表面にある高親和性
受容体に結合し、該受容体に結合しているアデニル酸シ
クラーゼを活性化することにより、ＡＴＰから生じた細
胞内の２次シグナル伝達物質であるｃＡＭＰ（cyclic A
MP）により媒介されると報告されている（参照：Donahu
e、H.J.et al.,Endocrinology,126:1471-1477(1990)）。
このような報告に基き、本発明者らは、上述のように精
製された組換えヒトＰＴＨが天然ＰＴＨの活性を有して
いるかどうかを調べるため、骨細胞または腎臓細胞に存
在する受容体に対するＰＴＨの結合力と細胞内ｃＡＭＰ
形成の刺激度を測定した。その結果、上述のように調製
された組換えヒトＰＴＨは、受容体に結合して細胞内ｃ
ＡＭＰ生産を刺激することができることが分かった。
【００２２】従って、本発明の組換え発現ベクターｐ１
５３ＰＴＨまたはｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された微
生物を培養し、Ｌ-アラビノースで発現を誘導すること
により、天然型ヒトＰＴＨの有する活性をそのまま維持
している組換えヒトＰＴＨを、正確な誘導調節を通して
高収率で調製することができる。
５３ＰＴＨまたはｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された微
生物を培養し、Ｌ-アラビノースで発現を誘導すること
により、天然型ヒトＰＴＨの有する活性をそのまま維持
している組換えヒトＰＴＨを、正確な誘導調節を通して
高収率で調製することができる。
【００２３】以下、実施例を通して本発明をさらに具体
的に説明する。但し、これらの実施例は、本発明の技術
的範囲を限定するものではない。 〔実施例１〕発現ベクターΔｐＭＡの構築 サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhymuri
um）LT2株よりＤＮＡを単離し、これをＥｃｏＲＩ制限
酵素で消化した後、ｐＵＣ１９ベクターに挿入してｐＵ
Ｃ-サルモネラライブラリーを調製した。ｐＵＣ-サルモ
ネラライブラリーを大腸菌ＤＨ５α株（E.coli DH5α
F’endA1 hsdR17(rk-mk+)supE44thi-1 recA1 gyrA(Nai
r)U169D(lacZAY-argF)deoR）に導入し、形質転換された
大腸菌コロニーを得た。一方、アラビノースオペロン中
のａｒａＢ-Ｃの調節部位とａｒａＣタンパク質のアミ
ノ末端３個のアミノ酸を含む塩基配列に対して相補的な
２種のオリゴヌクレオチド、すなわち１５量体である
5’-GCCATCGTCTTACTC-3’（配列番号１５）と１４量体
である5’-GCGTTTCAGCCATG-3’（配列番号１６）を合成
した。これらをプローブとして使用するコロニーハイブ
リダイゼーションを実施し、上述のように調製されたｐ
ＵＣ-サルモネラライブラリーからａｒａＢ-Ａおよびａ
ｒａＣ遺伝子を含むクローンを選択した。
的に説明する。但し、これらの実施例は、本発明の技術
的範囲を限定するものではない。 〔実施例１〕発現ベクターΔｐＭＡの構築 サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhymuri
um）LT2株よりＤＮＡを単離し、これをＥｃｏＲＩ制限
酵素で消化した後、ｐＵＣ１９ベクターに挿入してｐＵ
Ｃ-サルモネラライブラリーを調製した。ｐＵＣ-サルモ
ネラライブラリーを大腸菌ＤＨ５α株（E.coli DH5α
F’endA1 hsdR17(rk-mk+)supE44thi-1 recA1 gyrA(Nai
r)U169D(lacZAY-argF)deoR）に導入し、形質転換された
大腸菌コロニーを得た。一方、アラビノースオペロン中
のａｒａＢ-Ｃの調節部位とａｒａＣタンパク質のアミ
ノ末端３個のアミノ酸を含む塩基配列に対して相補的な
２種のオリゴヌクレオチド、すなわち１５量体である
5’-GCCATCGTCTTACTC-3’（配列番号１５）と１４量体
である5’-GCGTTTCAGCCATG-3’（配列番号１６）を合成
した。これらをプローブとして使用するコロニーハイブ
リダイゼーションを実施し、上述のように調製されたｐ
ＵＣ-サルモネラライブラリーからａｒａＢ-Ａおよびａ
ｒａＣ遺伝子を含むクローンを選択した。
【００２４】上記のように選択されたプラスミドｐＵＣ
-ａｒａをＡｖａＩ制限酵素で消化し、クレノウ酵素で
平滑末端化した後、ＳａｌＩ制限酵素で処理して２．５
２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、ｐＵＣ１１９（参
照：Maniatis et al.、Molecular Cloning 2nd ed.,198
9）ベクターをＨｉｎｄIIIで消化し、クレノウ酵素で平
滑末端化した後、ＳａｌＩで処理して３．１８ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。こうして得られた２つの断片、すな
わち２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片と３．１８ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、５．７ｋｂｐ
のｐＵＣ-ａｒａＢＣベクターを調製した。こうして得
たベクターから一本鎖ＤＮＡを得た後、ａｒａＢプロモ
ーターの下流に位置するａｒａＢタンパク質の構造遺伝
子の翻訳開始コドンにＮｄｅＩ制限部位のヌクレオチド
配列である5’-CATATG-3’(配列番号１７）を挿入し、
ａｒａＢプロモーターのシャイン‐ダルガノヌクレオチ
ド配列が5’-TAAGGAGG-3’（配列番号１８）に変換され
るように、部位特異的突然変異を行った。
-ａｒａをＡｖａＩ制限酵素で消化し、クレノウ酵素で
平滑末端化した後、ＳａｌＩ制限酵素で処理して２．５
２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、ｐＵＣ１１９（参
照：Maniatis et al.、Molecular Cloning 2nd ed.,198
9）ベクターをＨｉｎｄIIIで消化し、クレノウ酵素で平
滑末端化した後、ＳａｌＩで処理して３．１８ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。こうして得られた２つの断片、すな
わち２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片と３．１８ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、５．７ｋｂｐ
のｐＵＣ-ａｒａＢＣベクターを調製した。こうして得
たベクターから一本鎖ＤＮＡを得た後、ａｒａＢプロモ
ーターの下流に位置するａｒａＢタンパク質の構造遺伝
子の翻訳開始コドンにＮｄｅＩ制限部位のヌクレオチド
配列である5’-CATATG-3’(配列番号１７）を挿入し、
ａｒａＢプロモーターのシャイン‐ダルガノヌクレオチ
ド配列が5’-TAAGGAGG-3’（配列番号１８）に変換され
るように、部位特異的突然変異を行った。
【００２５】このように改変されたａｒａクローンを再
びＥｃｏＲＩとＰｖｕＩＩで消化し、ａｒａＢ-Ｃ遺伝
子を含む２．６１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、ｐ
ＵＣ１８からの２２８ｂｐの多クローニング部位を含む
ＭｐＫＬ１０ベクターをＮｄｅＩで消化し、クレノウ酵
素で平滑末端化してＴ４ＤＮＡリガーゼで再連結させる
ことにより、該ベクター内に存在するＮｄｅＩ制限部位
を除去した。こうして得たベクターをＥｃｏＲＩとＰｖ
ｕＩＩで消化し、多クローニング部位、転写終結シグナ
ル、アンピシリン抵抗性遺伝子および大腸菌内ＤＮＡ複
製起点を含む２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
びＥｃｏＲＩとＰｖｕＩＩで消化し、ａｒａＢ-Ｃ遺伝
子を含む２．６１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、ｐ
ＵＣ１８からの２２８ｂｐの多クローニング部位を含む
ＭｐＫＬ１０ベクターをＮｄｅＩで消化し、クレノウ酵
素で平滑末端化してＴ４ＤＮＡリガーゼで再連結させる
ことにより、該ベクター内に存在するＮｄｅＩ制限部位
を除去した。こうして得たベクターをＥｃｏＲＩとＰｖ
ｕＩＩで消化し、多クローニング部位、転写終結シグナ
ル、アンピシリン抵抗性遺伝子および大腸菌内ＤＮＡ複
製起点を含む２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００２６】上記で得られた２．６１ｋｂｐのＤＮＡ断
片と２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結した後、ＮｄｅＩ
とＥｃｏＲＩで消化し、ＮｃｏＩ制限部位を含み、両末
端に各々ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を有する二
本鎖オリゴヌクレオチドにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、約５．３２ｋｂｐのベクターΔｐＭＡを構築し
た（参照：大韓民国特許公告第９７-５５８５号）。こ
のように構築されたΔｐＭＡの遺伝子地図を図１に示し
た。
片と２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結した後、ＮｄｅＩ
とＥｃｏＲＩで消化し、ＮｃｏＩ制限部位を含み、両末
端に各々ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を有する二
本鎖オリゴヌクレオチドにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、約５．３２ｋｂｐのベクターΔｐＭＡを構築し
た（参照：大韓民国特許公告第９７-５５８５号）。こ
のように構築されたΔｐＭＡの遺伝子地図を図１に示し
た。
【００２７】〔実施例２〕ヒトＰＴＨ遺伝子の調製
天然型ヒトＰＴＨをコードし、大腸菌で使用頻度が高い
コドンを含むヌクレオチド配列を有するヒトＰＴＨ遺伝
子を調製するため、まず、ＰＴＨのセンス鎖とアンチセ
ンス鎖に相当する１２個のオリゴヌクレオチド（配列番
号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号
５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号
９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列
番号１３；配列番号１４）を合成した（参照：図２）。
前記１２個のオリゴマーを選択的に、リン酸化、アニー
リング、溶出（elution）、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結した。まず、自己連結を防ぐために、オリ
ゴマー＃２，＃４，＃５，＃８，＃９，＃１２および＃
１３の末端をリン酸化し、ＤＮＡアニーリングを行って
＃１：＃２，＃３：＃４，＃５：＃６，＃７：＃８，＃
９：＃１０，＃１１：＃１２および、＃１３：＃１４の
対を生成させた。次いで、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動して正しくアニールされた二本鎖のオリゴマー等
I、II、III、IV、V、VIおよびVIIのみを溶出した。二本
鎖オリゴマーVIIの３’末端はＸｂａＩ制限部位の付着
末端を有し、発現ベクターのＸｂａＩ部位に容易にクロ
ーニングすることができる。
コドンを含むヌクレオチド配列を有するヒトＰＴＨ遺伝
子を調製するため、まず、ＰＴＨのセンス鎖とアンチセ
ンス鎖に相当する１２個のオリゴヌクレオチド（配列番
号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号
５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号
９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列
番号１３；配列番号１４）を合成した（参照：図２）。
前記１２個のオリゴマーを選択的に、リン酸化、アニー
リング、溶出（elution）、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結した。まず、自己連結を防ぐために、オリ
ゴマー＃２，＃４，＃５，＃８，＃９，＃１２および＃
１３の末端をリン酸化し、ＤＮＡアニーリングを行って
＃１：＃２，＃３：＃４，＃５：＃６，＃７：＃８，＃
９：＃１０，＃１１：＃１２および、＃１３：＃１４の
対を生成させた。次いで、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動して正しくアニールされた二本鎖のオリゴマー等
I、II、III、IV、V、VIおよびVIIのみを溶出した。二本
鎖オリゴマーVIIの３’末端はＸｂａＩ制限部位の付着
末端を有し、発現ベクターのＸｂａＩ部位に容易にクロ
ーニングすることができる。
【００２８】こうして溶出した二本鎖オリゴマーの末端
をリン酸化した後、IIとIII、IVとV、VIとVIIを各々Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで連結し、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動して、正しく連結されたII／III、IV／V、VI／VI
IのＤＮＡ断片を溶出した。続いて、II／III、IV／V、V
I／VIIの３つの断片の末端をリン酸化し、IとII／III、
IV／VとVI／VIIをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、再びI
／II／IIIとIV／V／VI／VIIを連結し、最終的にウロキ
ナーゼ特異的切断部位を含み、大腸菌での使用頻度が高
いコドンを含む塩基配列を有するヒトＰＴＨ遺伝子を合
成した（参照：図３）。図３で、括弧内の数字は塩基数
を示す。二本鎖オリゴマーIはウロキナーゼ特異的切断
部位を含み、その合成については、下記で詳細に記載す
る。
をリン酸化した後、IIとIII、IVとV、VIとVIIを各々Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで連結し、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動して、正しく連結されたII／III、IV／V、VI／VI
IのＤＮＡ断片を溶出した。続いて、II／III、IV／V、V
I／VIIの３つの断片の末端をリン酸化し、IとII／III、
IV／VとVI／VIIをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、再びI
／II／IIIとIV／V／VI／VIIを連結し、最終的にウロキ
ナーゼ特異的切断部位を含み、大腸菌での使用頻度が高
いコドンを含む塩基配列を有するヒトＰＴＨ遺伝子を合
成した（参照：図３）。図３で、括弧内の数字は塩基数
を示す。二本鎖オリゴマーIはウロキナーゼ特異的切断
部位を含み、その合成については、下記で詳細に記載す
る。
【００２９】融合タンパク質からＰＴＨを容易に分離す
るため、次のようにして、ウロキナーゼ特異的切断部位
を合成して、融合パートナーとＰＴＨ遺伝子の間に挿入
した。このウロキナーゼ特異的切断部位はＧｌｙ-Ｔｈ
ｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇを含み（参照：大韓民国特許公開第９
７-６４９５号）、前記配列の前に比較的小分子量のア
ミノ酸を付加して柔軟性（flexibility）を与えた。ま
た、５’末端は、いずれの標的遺伝子であってもそのオ
ープンリーディングフレームに合わせて容易に融合でき
るように、平滑末端を与える３個の制限酵素、Ｓｍａ
Ｉ、ＳｃａＩおよびＰｖｕIIの認識部位を含んでいた。
ウロキナーゼ特異的切断部位とヒトＰＴＨ遺伝子の連結
部位にはＢｇｌII制限部位を配置した。このような条件
を満足させるセンスオリゴマー＃１とアンチセンスオリ
ゴマー＃２を合成して連結させた後、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行い、正しくアニールした二本鎖オリ
ゴマーIを溶出した。二本鎖オリゴマーIは両末端ともに
平滑であるため、アニーリングの前に＃２オリゴマーの
みをリン酸化させ、オリゴマーIの二量体や三量体の形
成を防止した。二本鎖オリゴマーIは、上述のように、
合成されたヒトＰＴＨ遺伝子の前に位置するようにＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結した。
るため、次のようにして、ウロキナーゼ特異的切断部位
を合成して、融合パートナーとＰＴＨ遺伝子の間に挿入
した。このウロキナーゼ特異的切断部位はＧｌｙ-Ｔｈ
ｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇを含み（参照：大韓民国特許公開第９
７-６４９５号）、前記配列の前に比較的小分子量のア
ミノ酸を付加して柔軟性（flexibility）を与えた。ま
た、５’末端は、いずれの標的遺伝子であってもそのオ
ープンリーディングフレームに合わせて容易に融合でき
るように、平滑末端を与える３個の制限酵素、Ｓｍａ
Ｉ、ＳｃａＩおよびＰｖｕIIの認識部位を含んでいた。
ウロキナーゼ特異的切断部位とヒトＰＴＨ遺伝子の連結
部位にはＢｇｌII制限部位を配置した。このような条件
を満足させるセンスオリゴマー＃１とアンチセンスオリ
ゴマー＃２を合成して連結させた後、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行い、正しくアニールした二本鎖オリ
ゴマーIを溶出した。二本鎖オリゴマーIは両末端ともに
平滑であるため、アニーリングの前に＃２オリゴマーの
みをリン酸化させ、オリゴマーIの二量体や三量体の形
成を防止した。二本鎖オリゴマーIは、上述のように、
合成されたヒトＰＴＨ遺伝子の前に位置するようにＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結した。
【００３０】〔実施例３〕ＰＲＫ遺伝子を含む発現ベク
ターｐＰＲＫの構築 ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaer
oides）菌株から染色体ＤＮＡを単離し、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、ＰＲＫ遺伝子を増幅し
た。この際、実施例１で調製したＬ-アラビノース誘導
性発現ベクターであるΔｐＭＡへのＰＲＫ遺伝子のサブ
クローニングを容易にするため、ＰＲＫのアミノ末端領
域に相当するプライマーに翻訳開始コドンとＮｄｅＩ制
限部位を、また、ＰＲＫのカルボキシ末端領域に相当す
るプライマーに翻訳終結コドンとＸｂａＩ制限部位を導
入し、各々５’および３’プライマーとして用いた：
５’プライマー：5’-GGAGCTGAATACATATGAGCAAG-3’
（配列番号１９）；３’プライマー：5’ーCCCCCGGGTCTA
GATCAGGCCA-3’（配列番号２０）。
ターｐＰＲＫの構築 ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaer
oides）菌株から染色体ＤＮＡを単離し、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、ＰＲＫ遺伝子を増幅し
た。この際、実施例１で調製したＬ-アラビノース誘導
性発現ベクターであるΔｐＭＡへのＰＲＫ遺伝子のサブ
クローニングを容易にするため、ＰＲＫのアミノ末端領
域に相当するプライマーに翻訳開始コドンとＮｄｅＩ制
限部位を、また、ＰＲＫのカルボキシ末端領域に相当す
るプライマーに翻訳終結コドンとＸｂａＩ制限部位を導
入し、各々５’および３’プライマーとして用いた：
５’プライマー：5’-GGAGCTGAATACATATGAGCAAG-3’
（配列番号１９）；３’プライマー：5’ーCCCCCGGGTCTA
GATCAGGCCA-3’（配列番号２０）。
【００３１】ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気
泳動した後に、８７３ｂｐのＰＲＫ遺伝子を単離し、Ｎ
ｄｅＩとＸｂａIで消化した後、ＮｄｅＩとＸｂａＩで
処理したΔｐＭＡベクターの断片にサブクローニングす
ることにより、発現ベクターｐＰＲＫを構築した（参
照：図４）。こうして構築した発現ベクターで大腸菌Ｍ
Ｃ１０６１（E.coli MC1061,F-araD139 Δ(ara-leu)769
6 galE15 galK16Δ(lac)X74rpsL(Strr) hsdR2(rk-mk+)
mcrA mcrB1）を形質転換し、その形質転換体から３２ｋ
Ｄａの分子量を有するＰＲＫタンパク質が発現されるこ
とを確認した。
泳動した後に、８７３ｂｐのＰＲＫ遺伝子を単離し、Ｎ
ｄｅＩとＸｂａIで消化した後、ＮｄｅＩとＸｂａＩで
処理したΔｐＭＡベクターの断片にサブクローニングす
ることにより、発現ベクターｐＰＲＫを構築した（参
照：図４）。こうして構築した発現ベクターで大腸菌Ｍ
Ｃ１０６１（E.coli MC1061,F-araD139 Δ(ara-leu)769
6 galE15 galK16Δ(lac)X74rpsL(Strr) hsdR2(rk-mk+)
mcrA mcrB1）を形質転換し、その形質転換体から３２ｋ
Ｄａの分子量を有するＰＲＫタンパク質が発現されるこ
とを確認した。
【００３２】〔実施例４〕ＰＲＫ遺伝子の断片化
完全長ＰＲＫ遺伝子を融合パートナーとして用いる場
合、融合パートナー部分が大きいために、最終的に所望
のタンパク質の収率が低くなるという短所があるので、
融合パートナーを小さくして所望のタンパク質の収率を
増大するため、ＰＲＫの大きさを様々に減少させた。ま
だＰＲＫの構造が明らかになっていないため、Chou & F
asmanの方法（参照：Adv.Enzymol,47:45-148(1978):Ann
u.Rev.Biochem.,47:251-276(1978)）に基づくコンピュ
ータープログラム（PROSIS,Hitachi,JAPAN）を用いてＰ
ＲＫタンパク質の２次構造を予測した後、タンパク質の
構造的安定性を破壊しないようにαーヘリックス（α-h
elix）やβー鎖（β-strand）等の２次構造が形成され
ないと予想される２つの領域（各々ＰＲＫのアミノ末端
から１１３および１５３番目のアミノ酸までを含む領
域、以下、各々「１１３ＰＲＫ」および「１５３ＰＲ
Ｋ」という）を選定した。
合、融合パートナー部分が大きいために、最終的に所望
のタンパク質の収率が低くなるという短所があるので、
融合パートナーを小さくして所望のタンパク質の収率を
増大するため、ＰＲＫの大きさを様々に減少させた。ま
だＰＲＫの構造が明らかになっていないため、Chou & F
asmanの方法（参照：Adv.Enzymol,47:45-148(1978):Ann
u.Rev.Biochem.,47:251-276(1978)）に基づくコンピュ
ータープログラム（PROSIS,Hitachi,JAPAN）を用いてＰ
ＲＫタンパク質の２次構造を予測した後、タンパク質の
構造的安定性を破壊しないようにαーヘリックス（α-h
elix）やβー鎖（β-strand）等の２次構造が形成され
ないと予想される２つの領域（各々ＰＲＫのアミノ末端
から１１３および１５３番目のアミノ酸までを含む領
域、以下、各々「１１３ＰＲＫ」および「１５３ＰＲ
Ｋ」という）を選定した。
【００３３】ＰＲＫ遺伝子断片を増幅するため、５’プ
ライマーとしては実施例３で使用した５’プライマーを
使用し、３’プライマーとしては、各々アミノ酸１１３
番および１５３番を含むヌクレオチド配列に相当し、サ
ブクローニングが容易にできるようにＢａｍＨＩ制限部
位を含むオリゴヌクレオチドを使用した（１１３ＰＲＫ
増幅用３’プライマー：5’-GGTGAAGGATCCGGGCGCCACGCC
GGTー3’（配列番号２１）：１５３ＰＲＫ増幅用５’プ
ライマー：5’-CGGAACGGATCCGATCTTGAGGTCGGCー3’（配
列番号２２））（参照：図５）。
ライマーとしては実施例３で使用した５’プライマーを
使用し、３’プライマーとしては、各々アミノ酸１１３
番および１５３番を含むヌクレオチド配列に相当し、サ
ブクローニングが容易にできるようにＢａｍＨＩ制限部
位を含むオリゴヌクレオチドを使用した（１１３ＰＲＫ
増幅用３’プライマー：5’-GGTGAAGGATCCGGGCGCCACGCC
GGTー3’（配列番号２１）：１５３ＰＲＫ増幅用５’プ
ライマー：5’-CGGAACGGATCCGATCTTGAGGTCGGCー3’（配
列番号２２））（参照：図５）。
【００３４】こうして増幅されたＰＲＫ遺伝子断片をＮ
ｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した後、１％アガロースゲル
電気泳動を行って単離した。こうして単離した１１３Ｐ
ＲＫおよび１５３ＰＲＫのＰＣＲ産物（遺伝子断片）を
ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した後、同一の酵素で消化
されたΔｐＭＡに挿入してｐ１１３ＰＲＫおよびｐ１５
３ＰＲＫを構築した。前記発現ベクター、すなわちｐ１
１３ＰＲＫおよびｐ１５３ＰＲＫで大腸菌ＭＣ１０６１
（E.coli MC1061,F-araD139 Δ(ara-leu)7696 galE15 g
alK16Δ(lac)X74rpsL(Strr)hsdR2(rk-mk+)mcrA mcrB1）
を形質転換して培養した。その結果、タンパク質１１３
ＰＲＫおよび１５３ＰＲＫは正常に大量発現されること
が分かった。従って、タンパク質１１３ＰＲＫおよび１
５３ＰＲＫをコードする遺伝子断片は、融合パートナー
として適切に用いることができることが確認された。
ｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した後、１％アガロースゲル
電気泳動を行って単離した。こうして単離した１１３Ｐ
ＲＫおよび１５３ＰＲＫのＰＣＲ産物（遺伝子断片）を
ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した後、同一の酵素で消化
されたΔｐＭＡに挿入してｐ１１３ＰＲＫおよびｐ１５
３ＰＲＫを構築した。前記発現ベクター、すなわちｐ１
１３ＰＲＫおよびｐ１５３ＰＲＫで大腸菌ＭＣ１０６１
（E.coli MC1061,F-araD139 Δ(ara-leu)7696 galE15 g
alK16Δ(lac)X74rpsL(Strr)hsdR2(rk-mk+)mcrA mcrB1）
を形質転換して培養した。その結果、タンパク質１１３
ＰＲＫおよび１５３ＰＲＫは正常に大量発現されること
が分かった。従って、タンパク質１１３ＰＲＫおよび１
５３ＰＲＫをコードする遺伝子断片は、融合パートナー
として適切に用いることができることが確認された。
【００３５】〔実施例５〕発現ベクターｐ１５３ＰＴＨ
の構築およびＰＴＨの発現 大腸菌の複製開始抑制タンパク質であるＩｃｉＡタンパ
ク質のうち、アミノ末端から１６６番アミノ酸までをコ
ードするＤＮＡ断片を融合パートナーとして用い、ウロ
キナーゼ特異的制限部位を含むヒトＧＨの発現ベクター
ｐＡＩ５ＵＧ（参照：大韓民国特許公開第９７-６５０
５号）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｔｈｒ-
Ｇｌｙ-Ａｒｇのウロキナーゼ（以下、「ＵＫ」）制限
部位とヒトＧＨ遺伝子を含むベクター断片を得た。実施
例４で単離した１５３ＰＲＫ遺伝子断片を、こうして得
られたベクター中にサブクローニングし、発現ベクター
ｐ１５３ｈＧＨを構築した（参照：図６）。
の構築およびＰＴＨの発現 大腸菌の複製開始抑制タンパク質であるＩｃｉＡタンパ
ク質のうち、アミノ末端から１６６番アミノ酸までをコ
ードするＤＮＡ断片を融合パートナーとして用い、ウロ
キナーゼ特異的制限部位を含むヒトＧＨの発現ベクター
ｐＡＩ５ＵＧ（参照：大韓民国特許公開第９７-６５０
５号）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｔｈｒ-
Ｇｌｙ-Ａｒｇのウロキナーゼ（以下、「ＵＫ」）制限
部位とヒトＧＨ遺伝子を含むベクター断片を得た。実施
例４で単離した１５３ＰＲＫ遺伝子断片を、こうして得
られたベクター中にサブクローニングし、発現ベクター
ｐ１５３ｈＧＨを構築した（参照：図６）。
【００３６】一方、大腸菌の複製開始抑制タンパク質で
あるＩｃｉＡをコードするＩｃｉＡ遺伝子のうち、アミ
ノ末端から１６６番アミノ酸のコドンの部位にＳｍａＩ
制限部位を挿入したΔｐＭＡ５Ｓ（参照：大韓民国特許
公開第９７-６５０５号、ＫＣＣＭ-１００７２）をＳｍ
ａＩとＸｂａＩで消化し、５００ｂｐのＩｃｉＡ遺伝子
断片を含むベクター断片を得た。実施例２で合成したウ
ロキナーゼ特異的切断部位を含むヒトＰＴＨ遺伝子を、
こうして得られたベクター断片中にサブクローニング
し、ａｒａＢプロモーター系の制御下でＩｃｉＡタンパ
ク質のアミノ末端１６６アミノ酸断片との融合形態でヒ
トＰＴＨを発現できるベクターｐＡＩ５ＵＰを構築した
（参照：図７、大韓民国特許公開第９７-６４９７号、
ＫＣＣＭ-１００７１）。
あるＩｃｉＡをコードするＩｃｉＡ遺伝子のうち、アミ
ノ末端から１６６番アミノ酸のコドンの部位にＳｍａＩ
制限部位を挿入したΔｐＭＡ５Ｓ（参照：大韓民国特許
公開第９７-６５０５号、ＫＣＣＭ-１００７２）をＳｍ
ａＩとＸｂａＩで消化し、５００ｂｐのＩｃｉＡ遺伝子
断片を含むベクター断片を得た。実施例２で合成したウ
ロキナーゼ特異的切断部位を含むヒトＰＴＨ遺伝子を、
こうして得られたベクター断片中にサブクローニング
し、ａｒａＢプロモーター系の制御下でＩｃｉＡタンパ
ク質のアミノ末端１６６アミノ酸断片との融合形態でヒ
トＰＴＨを発現できるベクターｐＡＩ５ＵＰを構築した
（参照：図７、大韓民国特許公開第９７-６４９７号、
ＫＣＣＭ-１００７１）。
【００３７】こうして構築されたベクターｐＡＩ５ＵＰ
をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで消化し、ウロキナーゼ特
異的切断部位を含むヒトＰＴＨ遺伝子断片を得た。こう
して得た断片を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIでｐ１５３
ｈＧＨを消化して調製されるベクター断片にサブクロー
ニングし、アミノ末端から１５３番アミノ酸までで構成
された１５３ＰＲＫを融合パートナーとし、ウロキナー
ゼ特異的切断部位を含むヒトＰＴＨ融合タンパク質を、
ａｒａＢプロモーター系の制御下で発現するベクターｐ
１５３ＰＴＨを構築した（参照：図８）。
をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで消化し、ウロキナーゼ特
異的切断部位を含むヒトＰＴＨ遺伝子断片を得た。こう
して得た断片を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIでｐ１５３
ｈＧＨを消化して調製されるベクター断片にサブクロー
ニングし、アミノ末端から１５３番アミノ酸までで構成
された１５３ＰＲＫを融合パートナーとし、ウロキナー
ゼ特異的切断部位を含むヒトＰＴＨ融合タンパク質を、
ａｒａＢプロモーター系の制御下で発現するベクターｐ
１５３ＰＴＨを構築した（参照：図８）。
【００３８】こうして構築した発現ベクターｐ１５３Ｐ
ＴＨで大腸菌ＭＣ１０６１（F-araD139 Δ(ara-leu)769
6 galE15 galK16 D(lac)X74 rpsL(Strr)hsdR2(rk-mk+)m
crAmcrB1）を形質転換し、その形質転換体をアンピシリ
ンを含むＬＢ液体培地（培地１Ｌ当たり５ｇのＮａＣ
ｌ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのバクトトリプトン、５
０ｍｇのアンピシリンが含まれる）にまき、３７℃で１
８０ｒｐｍに一夜振とう培養した。コンフルエントの培
地を再びアンピシリンの含まれた新鮮なＬＢ液体培地に
最終１％の濃度になるまでまき、６００ｎｍで０．５の
吸光度に達するまで振とう培養した。次いで、最終濃度
１％のＬ-アラビノースを培養液に添加して１５３ＰＲ
Ｋ／ＰＴＨ（以下、「１５３ＰＴＨ」）融合タンパク質
の発現を誘導した後、約２０時間振とう培養を続けた。
ＴＨで大腸菌ＭＣ１０６１（F-araD139 Δ(ara-leu)769
6 galE15 galK16 D(lac)X74 rpsL(Strr)hsdR2(rk-mk+)m
crAmcrB1）を形質転換し、その形質転換体をアンピシリ
ンを含むＬＢ液体培地（培地１Ｌ当たり５ｇのＮａＣ
ｌ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのバクトトリプトン、５
０ｍｇのアンピシリンが含まれる）にまき、３７℃で１
８０ｒｐｍに一夜振とう培養した。コンフルエントの培
地を再びアンピシリンの含まれた新鮮なＬＢ液体培地に
最終１％の濃度になるまでまき、６００ｎｍで０．５の
吸光度に達するまで振とう培養した。次いで、最終濃度
１％のＬ-アラビノースを培養液に添加して１５３ＰＲ
Ｋ／ＰＴＨ（以下、「１５３ＰＴＨ」）融合タンパク質
の発現を誘導した後、約２０時間振とう培養を続けた。
【００３９】大腸菌培養細胞の総タンパク質をＳＤＳ-
ＰＡＧＥで分析した結果、Ｌ-アラビノース誘導により
大腸菌内で約２６ｋＤａの１５３ＰＴＨ融合タンパク質
が高効率で発現されることが分かった（参照：図９）。
図９で、第１レーンおよび第２レーンはｐ１５３ＰＴＨ
で形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６１を１％のＬ-ア
ラビノースで誘導し、２０時間培養した後の総タンパク
質を示し；Ｍレーンは標準タンパク質マーカー（ＢＲＬ
１６０４０-０１６、ＵＳＡ）を示す。
ＰＡＧＥで分析した結果、Ｌ-アラビノース誘導により
大腸菌内で約２６ｋＤａの１５３ＰＴＨ融合タンパク質
が高効率で発現されることが分かった（参照：図９）。
図９で、第１レーンおよび第２レーンはｐ１５３ＰＴＨ
で形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６１を１％のＬ-ア
ラビノースで誘導し、２０時間培養した後の総タンパク
質を示し；Ｍレーンは標準タンパク質マーカー（ＢＲＬ
１６０４０-０１６、ＵＳＡ）を示す。
【００４０】発現ベクターｐ１５３ＰＴＨで形質転換さ
れた大腸菌（Escherichia coli）ＭＣ１０６１を大腸菌
（Escherichia coli）ＭＣ１０６１：ｐ１５３ＰＴＨと
命名し、１９９７年７月９日に、国際寄託機関である社
団法人韓国種菌協会附設微生物保存センター（ＫＣＣ
Ｍ）（大韓民国ソウル特別市西大門区新村洞１３４番
地）に、ＫＣＣＭー１０１０１として寄託されている。
れた大腸菌（Escherichia coli）ＭＣ１０６１を大腸菌
（Escherichia coli）ＭＣ１０６１：ｐ１５３ＰＴＨと
命名し、１９９７年７月９日に、国際寄託機関である社
団法人韓国種菌協会附設微生物保存センター（ＫＣＣ
Ｍ）（大韓民国ソウル特別市西大門区新村洞１３４番
地）に、ＫＣＣＭー１０１０１として寄託されている。
【００４１】〔実施例６〕：１５３ＰＴＨ融合タンパク
質の封入体の分離および切断 実施例５のように、Ｌ-アラビノースで発現誘導した間
に、ｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌ＭＣ１０６
１（ＫＣＣＭ-１０１０１）中に発現される１５３ＰＴ
Ｈ融合タンパク質が封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏ
ｄｙ）を形成するか調べた。遠心分離して収得した培養
大腸菌をトリス緩衝液（０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび、
２５％の蔗糖を含む５０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．
８）に懸濁した。リゾチームを該細胞に添加し、氷浴で
１．５時間インキュベートした。その後、ＭｇＣｌ2と
ＤＮａｓｅＩを該細胞に加え、さらに１．５時間反応さ
せた。さらにその後、１％のデオキシコール酸と１．６
％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ-４０を含む緩衝液を該細胞に
添加し、氷浴で１５分間攪拌し、超音波破砕（ｓｏｎｉ
ｃａｔｉｏｎ）で細胞を溶解した。前記細胞溶解液を遠
心分離し、封入体画分と水性画分に分け、封入体画分を
０．５％のトリトンＸ-１００溶液で４回洗浄した。こ
のようにして得られた封入体を８Ｍの尿素（ｕｒｅａ）
溶液に入れ、４℃で徐々に攪拌し、変性させた。封入体
の分離過程中に採取したアリコートをＳＤＳ-ＰＡＧＥ
で分析した（参照：図１０）。
質の封入体の分離および切断 実施例５のように、Ｌ-アラビノースで発現誘導した間
に、ｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌ＭＣ１０６
１（ＫＣＣＭ-１０１０１）中に発現される１５３ＰＴ
Ｈ融合タンパク質が封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏ
ｄｙ）を形成するか調べた。遠心分離して収得した培養
大腸菌をトリス緩衝液（０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび、
２５％の蔗糖を含む５０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．
８）に懸濁した。リゾチームを該細胞に添加し、氷浴で
１．５時間インキュベートした。その後、ＭｇＣｌ2と
ＤＮａｓｅＩを該細胞に加え、さらに１．５時間反応さ
せた。さらにその後、１％のデオキシコール酸と１．６
％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ-４０を含む緩衝液を該細胞に
添加し、氷浴で１５分間攪拌し、超音波破砕（ｓｏｎｉ
ｃａｔｉｏｎ）で細胞を溶解した。前記細胞溶解液を遠
心分離し、封入体画分と水性画分に分け、封入体画分を
０．５％のトリトンＸ-１００溶液で４回洗浄した。こ
のようにして得られた封入体を８Ｍの尿素（ｕｒｅａ）
溶液に入れ、４℃で徐々に攪拌し、変性させた。封入体
の分離過程中に採取したアリコートをＳＤＳ-ＰＡＧＥ
で分析した（参照：図１０）。
【００４２】図１０で、第２レーンは細胞溶解液、第３
レーンは細胞溶解液の上清を、第４〜７レーンは封入体
の洗浄液を、第８レーンは変性された封入体を各々示
す。第１レーンと第９レーンは標準タンパク質マーカー
として、各々ＢＲＬ １６０４０-０１６（分子量順に
列挙すると、４３ｋＤ、２９ｋＤ、１８．４ｋＤ、１
４．３ｋＤ、６．２ｋＤ、３．４ｋＤ）とＮＥＢ ７７
０７Ｌ（分子量順に列挙すると、１７５ｋＤ、８３ｋ
Ｄ、６２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５ｋ
Ｄ、１６．５ｋＤ、６．５ｋＤ、）を示す。図１０のよ
うに、１５３ＰＴＨ融合タンパク質は大腸菌内で相当量
発現され、全て封入体の形態で分離されることが分かっ
た。
レーンは細胞溶解液の上清を、第４〜７レーンは封入体
の洗浄液を、第８レーンは変性された封入体を各々示
す。第１レーンと第９レーンは標準タンパク質マーカー
として、各々ＢＲＬ １６０４０-０１６（分子量順に
列挙すると、４３ｋＤ、２９ｋＤ、１８．４ｋＤ、１
４．３ｋＤ、６．２ｋＤ、３．４ｋＤ）とＮＥＢ ７７
０７Ｌ（分子量順に列挙すると、１７５ｋＤ、８３ｋ
Ｄ、６２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５ｋ
Ｄ、１６．５ｋＤ、６．５ｋＤ、）を示す。図１０のよ
うに、１５３ＰＴＨ融合タンパク質は大腸菌内で相当量
発現され、全て封入体の形態で分離されることが分かっ
た。
【００４３】分離した１５３ＰＴＨ融合タンパク質の定
量を行った後、１５３ＰＴＨ融合タンパク質１００μｇ
にウロキナーゼを０．５μｇ添加し２５℃で１時間反応
させ、切断の程度をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した（参
照：図１１）。図１１では、第１レーンはコントロール
としてウロキナーゼを添加していない１５３ＰＴＨ融合
タンパク質を示し、第２レーンはウロキナーゼを添加し
た１５３ＰＴＨ融合タンパク質を示す。Ｍレーンは標準
タンパク質サイズマーカーである（ＮＥＢ ７７０７
Ｌ、分子量順に列挙すると、１７５ｋＤ、８３ｋＤ、６
２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５ｋＤ、１
６．５ｋＤ、６．５ｋＤ、）。１５３ＰＴＨ融合タンパ
ク質をウロキナーゼで切断する場合、１５３個のアミノ
酸に相当する分子量を有する融合パートナーと、８４個
のアミノ酸に相当する分子量を有する目的タンパク質で
あるＰＴＨタンパク質が得られるべきである。図１１に
示されるように、予想に従い、約１０ｋＤのＰＴＨタン
パク質は現れることがわかった。しかしながら、約１７
ｋＤの１５３ＰＲＫのタンパク質フラグメント、すなわ
ち融合パートナーはほとんど現れず、より小さいサイズ
のタンパク質フラグメントが現れることが示された。こ
れは、ウロキナーゼによる非特異的切断が１５３ＰＲＫ
の１２個のアルギニン残基の数カ所で起こったことを示
唆する。
量を行った後、１５３ＰＴＨ融合タンパク質１００μｇ
にウロキナーゼを０．５μｇ添加し２５℃で１時間反応
させ、切断の程度をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した（参
照：図１１）。図１１では、第１レーンはコントロール
としてウロキナーゼを添加していない１５３ＰＴＨ融合
タンパク質を示し、第２レーンはウロキナーゼを添加し
た１５３ＰＴＨ融合タンパク質を示す。Ｍレーンは標準
タンパク質サイズマーカーである（ＮＥＢ ７７０７
Ｌ、分子量順に列挙すると、１７５ｋＤ、８３ｋＤ、６
２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５ｋＤ、１
６．５ｋＤ、６．５ｋＤ、）。１５３ＰＴＨ融合タンパ
ク質をウロキナーゼで切断する場合、１５３個のアミノ
酸に相当する分子量を有する融合パートナーと、８４個
のアミノ酸に相当する分子量を有する目的タンパク質で
あるＰＴＨタンパク質が得られるべきである。図１１に
示されるように、予想に従い、約１０ｋＤのＰＴＨタン
パク質は現れることがわかった。しかしながら、約１７
ｋＤの１５３ＰＲＫのタンパク質フラグメント、すなわ
ち融合パートナーはほとんど現れず、より小さいサイズ
のタンパク質フラグメントが現れることが示された。こ
れは、ウロキナーゼによる非特異的切断が１５３ＰＲＫ
の１２個のアルギニン残基の数カ所で起こったことを示
唆する。
【００４４】〔実施例７〕：発現ベクターｐｍ１５３Ｐ
ＴＨの構築およびそれを用いた発現 １５３ＰＲＫのウロキナーゼによる追加的な切断を減ら
すため、このような追加的な切断が起こりうる部位に位
置するアルギニン残基を除去した。１５３ＰＴＨのウロ
キナーゼによる切断で、生成されるタンパク質断片の大
きさを考慮すると、ＰＲＫのアミノ末端から各々３０、
３１、５８、５９、９４および、９６番目のアルギニン
残基で追加的な切断が生じる可能性があると予想し、こ
れらのアルギニン残基を他のアミノ酸で置換しようとし
た。
ＴＨの構築およびそれを用いた発現 １５３ＰＲＫのウロキナーゼによる追加的な切断を減ら
すため、このような追加的な切断が起こりうる部位に位
置するアルギニン残基を除去した。１５３ＰＴＨのウロ
キナーゼによる切断で、生成されるタンパク質断片の大
きさを考慮すると、ＰＲＫのアミノ末端から各々３０、
３１、５８、５９、９４および、９６番目のアルギニン
残基で追加的な切断が生じる可能性があると予想し、こ
れらのアルギニン残基を他のアミノ酸で置換しようとし
た。
【００４５】まず、発現ベクターｐ１５３ＰＴＨをＳａ
ｃＩＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で切断して分離した
１５３ＰＴＨ遺伝子フラグメントを、ｐＢｌｕｅＳｃｒ
ｉｐｔ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）
をＳａｃＩＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で処理するこ
とによって調製したベクターのフラグメントに挿入し、
一本鎖のＤＮＡを得ることのできるｐＳＫ（＋）１５３
ＰＴＨという突然変異用のプラスミドを得た（参照：図
１２）。大腸菌ＣＪ２３６をｐＳＫ（＋）１５３ＰＴＨ
で形質転換させた後、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）等の方
法（参照：Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８-４９２
（１９８５））で部位特異的な突然変異を行った。この
際、用いられたミュータマー（ｍｕｔａｍｅｒ）は次の
ようである。
ｃＩＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で切断して分離した
１５３ＰＴＨ遺伝子フラグメントを、ｐＢｌｕｅＳｃｒ
ｉｐｔ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）
をＳａｃＩＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で処理するこ
とによって調製したベクターのフラグメントに挿入し、
一本鎖のＤＮＡを得ることのできるｐＳＫ（＋）１５３
ＰＴＨという突然変異用のプラスミドを得た（参照：図
１２）。大腸菌ＣＪ２３６をｐＳＫ（＋）１５３ＰＴＨ
で形質転換させた後、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）等の方
法（参照：Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８-４９２
（１９８５））で部位特異的な突然変異を行った。この
際、用いられたミュータマー（ｍｕｔａｍｅｒ）は次の
ようである。
【００４６】３０／３１ミュータマー：
５’-ｃｃｔｔｇａｃｃｃｃｃｔｃｇｃ（ｃ／ｇ）ｃａ
ｃｇａａｇａｔｃｔｇｇｔｃｇａａｃー３’（配列番号
２３）； ５８／５９ミュータマー： ５’ーｇｃｃｃｇｃｃｇｃａｔａｇｃ（ｇ／ｃ）ｃａｃ
ｇｔｃｃａｇｃｔｃｇｇｃｃｔｔｃー３’（配列番号２
４）； ９４／９６ミュータマー： ５’-ｇａｃｇｔａｇｇｔｃｃ（ｃ／ｇ）ｃｇｔｃａｃ
ｃｃｃｃｔｇｃｃｃｇｇｔｃｔｃｇｃｃー３’（配列番
号２５）。
ｃｇａａｇａｔｃｔｇｇｔｃｇａａｃー３’（配列番号
２３）； ５８／５９ミュータマー： ５’ーｇｃｃｃｇｃｃｇｃａｔａｇｃ（ｇ／ｃ）ｃａｃ
ｇｔｃｃａｇｃｔｃｇｇｃｃｔｔｃー３’（配列番号２
４）； ９４／９６ミュータマー： ５’-ｇａｃｇｔａｇｇｔｃｃ（ｃ／ｇ）ｃｇｔｃａｃ
ｃｃｃｃｔｇｃｃｃｇｇｔｃｔｃｇｃｃー３’（配列番
号２５）。
【００４７】これから３０、５８、９４番目のアルギニ
ンが各々バリンで、５９、９６番目のアルギニンが各々
グリシンで置換された変異ベクターを製造し、ｐＳＫ
（＋）ｍ１５３ＰＴＨと命名した。ｐＳＫ（＋）ｍ１５
３ＰＴＨをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断することによっ
て得られる変異１５３ＰＲＫのフラグメントと、発現ベ
クターｐ１５３ＰＴＨをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで処理し
て得られたウロキナーゼ／ＰＴＨが含まれたベクターフ
ラグメントをＴ４リガーゼで連結し、発現ベクターｐｍ
１５３ＰＴＨを製造した（参照：図１２）。
ンが各々バリンで、５９、９６番目のアルギニンが各々
グリシンで置換された変異ベクターを製造し、ｐＳＫ
（＋）ｍ１５３ＰＴＨと命名した。ｐＳＫ（＋）ｍ１５
３ＰＴＨをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断することによっ
て得られる変異１５３ＰＲＫのフラグメントと、発現ベ
クターｐ１５３ＰＴＨをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで処理し
て得られたウロキナーゼ／ＰＴＨが含まれたベクターフ
ラグメントをＴ４リガーゼで連結し、発現ベクターｐｍ
１５３ＰＴＨを製造した（参照：図１２）。
【００４８】大腸菌ＭＣ１０６１（Ｆ-ａｒａＤ１３９
Δ（ａｒａ-ｌｅｕ）７６９６ ｇａｌＥ１５ ｇａｌ
Ｋ１６ Ｄ（ｌａｃ）Ｘ７４ ｒｐｓＬ（Ｓｔｒr）ｈ
ｓｄＲ２（ｒｋ-ｍｋ+） ｍｃｒＡ ｍｃｒＢ１）を発
現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換させ、当該形質
転換体を実施例５と同様の方法で培養した。ｍ１５３Ｐ
ＲＫ／ＰＴＨ（以下、’ｍ１５３ＰＴＨ’）融合タンパ
ク質が発現されたことをＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認した
（参照：図１３）。図１３で、第１レーンは発現ベクタ
ーｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６
１を１％のアラビノースで誘導して２０時間培養した後
の総タンパク質を、第２レーンは発現ベクターｐｍ１５
３ＰＴＨで形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６１を１％
のアラビノースで誘導して２０時間培養した後の総タン
パク質を、第３レーンは発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨ
で形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６１をアラビノース
で誘導する前の総タンパク質を各々ＳＤＳ-ＰＡＧＥで
分析した結果である。Ｍレーンは標準タンパク質サイズ
マーカーである（ＮＥＢ７７０７Ｌ（分子量順に列挙す
ると、８３ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋ
Ｄ、２５ｋＤ、１６．５ｋＤ、６．５ｋＤ）。図１３に
示されるように、ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換した大腸
菌は、ｐ１５３ＰＴＨで形質転換した大腸菌に比べて同
一、あるいはやや増加した発現量を見せ、新たに導入さ
れたアミノ酸置換による発現の減少は起こらないことが
分かった。前記の発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨで形質
転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＭＣ１０６１を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１：ｐｍ１５３ＰＴＨと命名し、
１９９７年７月９日に、社団法人韓国種菌協会附設微生
物保存センター（ＫＣＣＭ）（大韓民国ソウル特別市西
大門区新村洞１３４番地）に、ＫＣＣＭー１０１０２と
して寄託されている。
Δ（ａｒａ-ｌｅｕ）７６９６ ｇａｌＥ１５ ｇａｌ
Ｋ１６ Ｄ（ｌａｃ）Ｘ７４ ｒｐｓＬ（Ｓｔｒr）ｈ
ｓｄＲ２（ｒｋ-ｍｋ+） ｍｃｒＡ ｍｃｒＢ１）を発
現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換させ、当該形質
転換体を実施例５と同様の方法で培養した。ｍ１５３Ｐ
ＲＫ／ＰＴＨ（以下、’ｍ１５３ＰＴＨ’）融合タンパ
ク質が発現されたことをＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認した
（参照：図１３）。図１３で、第１レーンは発現ベクタ
ーｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６
１を１％のアラビノースで誘導して２０時間培養した後
の総タンパク質を、第２レーンは発現ベクターｐｍ１５
３ＰＴＨで形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６１を１％
のアラビノースで誘導して２０時間培養した後の総タン
パク質を、第３レーンは発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨ
で形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６１をアラビノース
で誘導する前の総タンパク質を各々ＳＤＳ-ＰＡＧＥで
分析した結果である。Ｍレーンは標準タンパク質サイズ
マーカーである（ＮＥＢ７７０７Ｌ（分子量順に列挙す
ると、８３ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋ
Ｄ、２５ｋＤ、１６．５ｋＤ、６．５ｋＤ）。図１３に
示されるように、ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換した大腸
菌は、ｐ１５３ＰＴＨで形質転換した大腸菌に比べて同
一、あるいはやや増加した発現量を見せ、新たに導入さ
れたアミノ酸置換による発現の減少は起こらないことが
分かった。前記の発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨで形質
転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＭＣ１０６１を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１：ｐｍ１５３ＰＴＨと命名し、
１９９７年７月９日に、社団法人韓国種菌協会附設微生
物保存センター（ＫＣＣＭ）（大韓民国ソウル特別市西
大門区新村洞１３４番地）に、ＫＣＣＭー１０１０２と
して寄託されている。
【００４９】〔実施例８〕：ｍ１５３ＰＴＨの融合タン
パク質封入体の分離および切断 上記ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質が大腸菌内でどのよ
うに発現されるかを調べるため、実施例６と同様の方法
で封入体の分離過程中で採取したアリコートをＳＤＳ-
ＰＡＧＥで分析した（参照：図１４）。図１４では、第
２レーンは細胞溶解液、第３レーンは細胞溶解液の上清
を、第４〜７レーンは封入体の洗浄液を、第８レーンは
変性された封入体を各々示す。第１レーンと第９レーン
は標準タンパク質サイズマーカーとして、各々ＢＲＬ
１６０４０-０１６（分子量順に列挙すると、４３ｋ
Ｄ、２９ｋＤ、１８．４ｋＤ、１４．３ｋＤ、６．２ｋ
Ｄ、３．４ｋＤ）とＮＥＢ ７７０７Ｌ（分子量順に列
挙すると、１７５ｋＤ、８３ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５
ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５ｋＤ、１６．５ｋＤ、６．５
ｋＤ、）を示す。図１４のように、１５３ＰＴＨ融合タ
ンパク質と同様に、ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質も細
胞内で封入体を形成することが分かった。
パク質封入体の分離および切断 上記ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質が大腸菌内でどのよ
うに発現されるかを調べるため、実施例６と同様の方法
で封入体の分離過程中で採取したアリコートをＳＤＳ-
ＰＡＧＥで分析した（参照：図１４）。図１４では、第
２レーンは細胞溶解液、第３レーンは細胞溶解液の上清
を、第４〜７レーンは封入体の洗浄液を、第８レーンは
変性された封入体を各々示す。第１レーンと第９レーン
は標準タンパク質サイズマーカーとして、各々ＢＲＬ
１６０４０-０１６（分子量順に列挙すると、４３ｋ
Ｄ、２９ｋＤ、１８．４ｋＤ、１４．３ｋＤ、６．２ｋ
Ｄ、３．４ｋＤ）とＮＥＢ ７７０７Ｌ（分子量順に列
挙すると、１７５ｋＤ、８３ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５
ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５ｋＤ、１６．５ｋＤ、６．５
ｋＤ、）を示す。図１４のように、１５３ＰＴＨ融合タ
ンパク質と同様に、ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質も細
胞内で封入体を形成することが分かった。
【００５０】実施例６と同様の方法で分離した融合タン
パク質の定量を行った後、１５３ＰＴＨ、あるいはｍ１
５３ＰＴＨ融合タンパク質１００μｇに０．５μｇのウ
ロキナーゼを各々添加して２５℃で１時間反応させた。
切断の程度をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した（参照：図１
５）。図１５では、奇数のレーンはコントロールとして
ウロキナーゼを添加していない融合タンパク質を示し、
偶数のレーンはウロキナーゼを添加した融合タンパク質
を示す。なお、第１および、２一レーンは１５３ＰＴＨ
を、第３および、４レーンはｍ１５３ＰＴＨを示す。Ｍ
レーンは標準タンパク質サイズマーカーである（ＮＥＢ
７７０７Ｌ、分子量順に列挙すると、１７５ｋＤ、８
３ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５
ｋＤ、１６．５ｋＤ、６．５ｋＤ、）。図１５に示すよ
うに、ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質のウロキナーゼ切
断によれば、１５３ＰＴＨ融合タンパク質の同切断と比
較すると、ウロキナーゼによる非特異的切断が減少し
た。従って、同量の融合タンパク質を使用し、同一の反
応条件下では、１５３ＰＴＨ融合タンパク質よりもｍ１
５３ＰＴＨ融合タンパク質の方がより多い量のＰＴＨが
得られることを確認した。
パク質の定量を行った後、１５３ＰＴＨ、あるいはｍ１
５３ＰＴＨ融合タンパク質１００μｇに０．５μｇのウ
ロキナーゼを各々添加して２５℃で１時間反応させた。
切断の程度をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した（参照：図１
５）。図１５では、奇数のレーンはコントロールとして
ウロキナーゼを添加していない融合タンパク質を示し、
偶数のレーンはウロキナーゼを添加した融合タンパク質
を示す。なお、第１および、２一レーンは１５３ＰＴＨ
を、第３および、４レーンはｍ１５３ＰＴＨを示す。Ｍ
レーンは標準タンパク質サイズマーカーである（ＮＥＢ
７７０７Ｌ、分子量順に列挙すると、１７５ｋＤ、８
３ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５
ｋＤ、１６．５ｋＤ、６．５ｋＤ、）。図１５に示すよ
うに、ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質のウロキナーゼ切
断によれば、１５３ＰＴＨ融合タンパク質の同切断と比
較すると、ウロキナーゼによる非特異的切断が減少し
た。従って、同量の融合タンパク質を使用し、同一の反
応条件下では、１５３ＰＴＨ融合タンパク質よりもｍ１
５３ＰＴＨ融合タンパク質の方がより多い量のＰＴＨが
得られることを確認した。
【００５１】さらに、ウロキナーゼによる１５３ＰＴＨ
とｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質の切断時間による切断
効率を比較するため、融合タンパク質とウロキナーゼの
濃度比が２００：１になるようにし、２５℃で切断反応
させた。アリコートを時間により採取し、ＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥで分析した（参照：図１６）。図１６では、第１レ
ーンはウロキナーゼによる切断時間が２０分、第２レー
ンは３０分、第３レーンは６０分、第４レーンは１５０
分、第５レーンは１９０分、第６レーンは２２５分、第
７レーンは３６０分の時点での試料を各々示す。
とｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質の切断時間による切断
効率を比較するため、融合タンパク質とウロキナーゼの
濃度比が２００：１になるようにし、２５℃で切断反応
させた。アリコートを時間により採取し、ＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥで分析した（参照：図１６）。図１６では、第１レ
ーンはウロキナーゼによる切断時間が２０分、第２レー
ンは３０分、第３レーンは６０分、第４レーンは１５０
分、第５レーンは１９０分、第６レーンは２２５分、第
７レーンは３６０分の時点での試料を各々示す。
【００５２】図１６のように、ｍ１５３ＰＴＨ融合タン
パク質は反応６０分でほとんど完全に切断されるが、１
５３ＰＴＨ融合タンパク質は６時間が経過しても完全に
切断されなかった。上記切断比較実験より、ｍ１５３Ｐ
ＴＨ融合タンパク質の場合には１５３ＰＴＨ融合タンパ
ク質に比べ、時間および、ウロキナーゼ当たり得られる
ＰＴＨの収率が増加することを確認した。
パク質は反応６０分でほとんど完全に切断されるが、１
５３ＰＴＨ融合タンパク質は６時間が経過しても完全に
切断されなかった。上記切断比較実験より、ｍ１５３Ｐ
ＴＨ融合タンパク質の場合には１５３ＰＴＨ融合タンパ
ク質に比べ、時間および、ウロキナーゼ当たり得られる
ＰＴＨの収率が増加することを確認した。
【００５３】〔実施例９〕：組換えヒトＰＴＨの精製
実施例８と同様な方法で、分離した封入体に存在する、
ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質の定量を行い、トリス緩
衝液でタンパク質の濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように希
釈した。当該溶液にウロキナーゼ（プロテアーゼ）を添
加し２５℃で反応させ、融合タンパク質よりＰＴＨを分
離した。図１７は、分離されたＰＴＨタンパク質をイオ
ン交換樹脂および、Ｃ18逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィ
ーで精製し、これをＳＤＳ-ＰＡＧＥ（４-２０％ グラ
ジエントゲル）で分析した結果である。図１７におい
て、第１レーンは１５μｇの精製されたＰＴＨを、第２
レーンは７．５μｇの精製されたＰＴＨを、第３レーン
は３．７５μｇの精製されたＰＴＨを各々示す。Ｍレー
ンは標準タンパク質サイズマーカーである（Ｎｏｖｅｘ
ＬＣ ５６７７、分子量順に列挙すると、２００ｋ
Ｄ、１１６．３ｋＤ、９７．４ｋＤ、６６．３ｋＤ、５
５．４ｋＤ、３６．５ｋＤ、３１ｋＤ、２１．５ｋＤ、
１４．４ｋＤ、６ｋＤ、３．５ｋＤ）。図１７に示され
るように、ヒト組換えＰＴＨが単離された形態で純化さ
れことが分かった。
ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質の定量を行い、トリス緩
衝液でタンパク質の濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように希
釈した。当該溶液にウロキナーゼ（プロテアーゼ）を添
加し２５℃で反応させ、融合タンパク質よりＰＴＨを分
離した。図１７は、分離されたＰＴＨタンパク質をイオ
ン交換樹脂および、Ｃ18逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィ
ーで精製し、これをＳＤＳ-ＰＡＧＥ（４-２０％ グラ
ジエントゲル）で分析した結果である。図１７におい
て、第１レーンは１５μｇの精製されたＰＴＨを、第２
レーンは７．５μｇの精製されたＰＴＨを、第３レーン
は３．７５μｇの精製されたＰＴＨを各々示す。Ｍレー
ンは標準タンパク質サイズマーカーである（Ｎｏｖｅｘ
ＬＣ ５６７７、分子量順に列挙すると、２００ｋ
Ｄ、１１６．３ｋＤ、９７．４ｋＤ、６６．３ｋＤ、５
５．４ｋＤ、３６．５ｋＤ、３１ｋＤ、２１．５ｋＤ、
１４．４ｋＤ、６ｋＤ、３．５ｋＤ）。図１７に示され
るように、ヒト組換えＰＴＨが単離された形態で純化さ
れことが分かった。
【００５４】〔実施例１０〕：組換えヒトＰＴＨの活性
測定 ＵＭＲ１０６細胞系（ラットコ骨髄細胞様骨肉腫細胞
系）は、骨芽細胞の特性を研究する材料として多く用い
られており、該細胞系は骨芽細胞の特徴であるアルカリ
ホスファターゼの活性が高く、タイプ１コラーゲンを生
産すると知られている（参照：Ｍｅｉｋａ Ａ．Ｆａｎ
ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３
１（５）：２１１３-２１１９（１９９２）；Ｃｈｅｒ
ｙｌ Ｏ．Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．， ２６５（３６）：２２３４２-２２３４
７（１９９０））。従って、実施例９で精製した組換え
ヒトＰＴＨ（ｒｈＰＴＨ（１-８４））の試験管内（ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ）活性は、ＵＭＲ１０６細胞株（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ １６６１）を用いてＰＴＨの受容体に対す
る結合性試験と細胞内ｃＡＭＰの生成促進試験で測定し
た。これに関し、コントロールとしては、合成ヒトＰＴ
Ｈ（ｓｈＰＴＨ（１-８４）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用い、アミノ末端とカルボ
キシル末端を有する完全なＰＴＨのみが検出される”Ａ
ｌｌｅｇｒｏ Ｉｎｔａｃｔ ＰＴＨＲＩＡ ｋｉｔ
（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓａｎ Ｊｕ
ａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＵＳＡ）”を用い、ＰＴ
Ｈを定量した（参照：Ｓａｍｕｅｌ Ｒ．Ｎｕｓｓｂａ
ｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，３３（８）：１３６４-１３６７（１９８
７））。一方、ＵＭＲ１０６細胞株は、０．２％の重炭
酸ナトリウムおよび、１０％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂ
ｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、５６℃で３０分間熱処理した
もの）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）で３７℃、５
％のＣＯ2の条件で培養した（参照：Ｒｏｎａｌｄ
Ｊ．Ｍｉｄｕｒａｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．， ２６９（１８）：１３２００ー１３２０６
（１９９４））。
測定 ＵＭＲ１０６細胞系（ラットコ骨髄細胞様骨肉腫細胞
系）は、骨芽細胞の特性を研究する材料として多く用い
られており、該細胞系は骨芽細胞の特徴であるアルカリ
ホスファターゼの活性が高く、タイプ１コラーゲンを生
産すると知られている（参照：Ｍｅｉｋａ Ａ．Ｆａｎ
ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３
１（５）：２１１３-２１１９（１９９２）；Ｃｈｅｒ
ｙｌ Ｏ．Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．， ２６５（３６）：２２３４２-２２３４
７（１９９０））。従って、実施例９で精製した組換え
ヒトＰＴＨ（ｒｈＰＴＨ（１-８４））の試験管内（ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ）活性は、ＵＭＲ１０６細胞株（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ １６６１）を用いてＰＴＨの受容体に対す
る結合性試験と細胞内ｃＡＭＰの生成促進試験で測定し
た。これに関し、コントロールとしては、合成ヒトＰＴ
Ｈ（ｓｈＰＴＨ（１-８４）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用い、アミノ末端とカルボ
キシル末端を有する完全なＰＴＨのみが検出される”Ａ
ｌｌｅｇｒｏ Ｉｎｔａｃｔ ＰＴＨＲＩＡ ｋｉｔ
（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓａｎ Ｊｕ
ａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＵＳＡ）”を用い、ＰＴ
Ｈを定量した（参照：Ｓａｍｕｅｌ Ｒ．Ｎｕｓｓｂａ
ｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，３３（８）：１３６４-１３６７（１９８
７））。一方、ＵＭＲ１０６細胞株は、０．２％の重炭
酸ナトリウムおよび、１０％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂ
ｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、５６℃で３０分間熱処理した
もの）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）で３７℃、５
％のＣＯ2の条件で培養した（参照：Ｒｏｎａｌｄ
Ｊ．Ｍｉｄｕｒａｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．， ２６９（１８）：１３２００ー１３２０６
（１９９４））。
【００５５】〔実施例１０−１〕：ＰＴＨ受容体に対す
る結合性試験 ＰＴＨ受容体に対する結合性試験は、次のように実施し
た（参照：Ｃｈｏｈｅｉ Ｓｈｉｇｅｎｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６３（８）：３
８６４-３８７１（１９８８））：２４ウェルプレート
当たり１０5個のＵＭＲ１０６細胞株をまき、４ないし
８日間培養した。この際、培地は２日に１回ずつ、試験
の３日前からは毎日交替した。なお、カルボキシ末端の
チロシン残基をラジオアイソトープの125Ｉで標識した
（Ｎｌｅ8,18Ｔｙｒ34）-ウシＰＴＨ（１-３４）-ＮＨ2
（ｂＰＴＨ（１-３４））（参照：Ｇｉｎｏ Ｖ．Ｓｅ
ｒｇｅｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，２５４（１５）：６９８
０-６９８６（１９７９））を調製するため、触媒とし
てクロラミンＴ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．、ＵＳＡ）を用い、ｂＰＴＨ（１-３４）をＮａ125
Ｉでヨウ素化した。ヨウ素化の反応物をＣ18Ｓｅｐ-Ｐ
ａｋ カラムに注入し、ヨウ素化されたｂＰＴＨを５０
％のＡＣＮ（アセトニトリル）／０．１％ ＴＦＡ（ト
リフルオロ酢酸）で溶出させ、遊離の125Ｉを除去し
た。なお、分離されたｂＰＴＨよりＡＣＮを除去した。
る結合性試験 ＰＴＨ受容体に対する結合性試験は、次のように実施し
た（参照：Ｃｈｏｈｅｉ Ｓｈｉｇｅｎｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６３（８）：３
８６４-３８７１（１９８８））：２４ウェルプレート
当たり１０5個のＵＭＲ１０６細胞株をまき、４ないし
８日間培養した。この際、培地は２日に１回ずつ、試験
の３日前からは毎日交替した。なお、カルボキシ末端の
チロシン残基をラジオアイソトープの125Ｉで標識した
（Ｎｌｅ8,18Ｔｙｒ34）-ウシＰＴＨ（１-３４）-ＮＨ2
（ｂＰＴＨ（１-３４））（参照：Ｇｉｎｏ Ｖ．Ｓｅ
ｒｇｅｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，２５４（１５）：６９８
０-６９８６（１９７９））を調製するため、触媒とし
てクロラミンＴ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．、ＵＳＡ）を用い、ｂＰＴＨ（１-３４）をＮａ125
Ｉでヨウ素化した。ヨウ素化の反応物をＣ18Ｓｅｐ-Ｐ
ａｋ カラムに注入し、ヨウ素化されたｂＰＴＨを５０
％のＡＣＮ（アセトニトリル）／０．１％ ＴＦＡ（ト
リフルオロ酢酸）で溶出させ、遊離の125Ｉを除去し
た。なお、分離されたｂＰＴＨよりＡＣＮを除去した。
【００５６】125Ｉで標識した（Ｎｌｅ8,18Ｔｙｒ34）-
ｂＰＴＨ（１-３４）をリガンドとして用い、当該受容
体へのリガンド結合に対する、ｒｈＰＴＨ（１-８４）
およびｓｈＰＴＨ（１-８４）の競争阻害を比較するこ
とによって、ＰＴＨの受容体への結合親和性を側定し
た。リガンドおよび、上記ＰＴＨを結合緩衝液（１００
ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣ
ｌ2、５％のウマ血清および、０．５％のＦＢＳを含む
５０ｍＭのＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．７））で
各々希釈した。一方、上記の培養後、得られた２４ウェ
ルプレートを氷浴で冷却し、１ｍｌの結合緩衝液で２回
洗浄した後、３００００ないし５００００ｃｐｍのリガ
ンドおよび、種々の濃度の競争ＰＴＨを、最終体積が
０．３ｍｌになるまで添加した。続いて、各ホルモンの
希釈液を３ウェルに同時に添加し、１５℃で４時間吸着
させた。反応後、ウェルを０．５ｍｌの結合緩衝液で４
回洗浄し、結合していない放射活性同位体を除去した。
０．５ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨを添加し、細胞に結合
した放射活性同位体を室温で１６ないし１８時間抽出し
た。抽出で得られた液と、０．５ｍｌの結合緩衝液によ
り洗浄した後に得られた液とを合わせ、ガンマカウンタ
ーで放射活性を測定した。
ｂＰＴＨ（１-３４）をリガンドとして用い、当該受容
体へのリガンド結合に対する、ｒｈＰＴＨ（１-８４）
およびｓｈＰＴＨ（１-８４）の競争阻害を比較するこ
とによって、ＰＴＨの受容体への結合親和性を側定し
た。リガンドおよび、上記ＰＴＨを結合緩衝液（１００
ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣ
ｌ2、５％のウマ血清および、０．５％のＦＢＳを含む
５０ｍＭのＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．７））で
各々希釈した。一方、上記の培養後、得られた２４ウェ
ルプレートを氷浴で冷却し、１ｍｌの結合緩衝液で２回
洗浄した後、３００００ないし５００００ｃｐｍのリガ
ンドおよび、種々の濃度の競争ＰＴＨを、最終体積が
０．３ｍｌになるまで添加した。続いて、各ホルモンの
希釈液を３ウェルに同時に添加し、１５℃で４時間吸着
させた。反応後、ウェルを０．５ｍｌの結合緩衝液で４
回洗浄し、結合していない放射活性同位体を除去した。
０．５ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨを添加し、細胞に結合
した放射活性同位体を室温で１６ないし１８時間抽出し
た。抽出で得られた液と、０．５ｍｌの結合緩衝液によ
り洗浄した後に得られた液とを合わせ、ガンマカウンタ
ーで放射活性を測定した。
【００５７】前記測定の結合放射活性の測定値から１ｍ
Ｍの各競争ホルモンを用いて測定した非特異的結合の測
定値を引き、特異的結合の測定値を決定した。測定結果
は、最大特異的結合に対する百分率で示し、曲線）の最
適化および、各競争ホルモンの結合力を比較する重要な
指標になるＩＣ50（５０％ 阻害濃度、リガンドの結合
を５０％阻害するに必要なホルモン濃度）の値は、Ｂｉ
ｏｓｏｆｔ社のｆｉｇ．Ｐ ｐｒｏｇｒａｍに従って測
定した。ｓｈＰＴＨ（１-８４）とｒｈＰＴＨ（１-８
４）のＩＣ50の値は、各々１８．６±１．５および、１
７．３±３．１ｎＭ（平均値±標準偏差）として示し、
その一つの実験結果を図１８（Ａ）で示した。図１８
（Ａ）のように、組換えＰＴＨは合成ＰＴＨと同様な受
容体に対する結合活性を有していることが分かった。
Ｍの各競争ホルモンを用いて測定した非特異的結合の測
定値を引き、特異的結合の測定値を決定した。測定結果
は、最大特異的結合に対する百分率で示し、曲線）の最
適化および、各競争ホルモンの結合力を比較する重要な
指標になるＩＣ50（５０％ 阻害濃度、リガンドの結合
を５０％阻害するに必要なホルモン濃度）の値は、Ｂｉ
ｏｓｏｆｔ社のｆｉｇ．Ｐ ｐｒｏｇｒａｍに従って測
定した。ｓｈＰＴＨ（１-８４）とｒｈＰＴＨ（１-８
４）のＩＣ50の値は、各々１８．６±１．５および、１
７．３±３．１ｎＭ（平均値±標準偏差）として示し、
その一つの実験結果を図１８（Ａ）で示した。図１８
（Ａ）のように、組換えＰＴＨは合成ＰＴＨと同様な受
容体に対する結合活性を有していることが分かった。
【００５８】〔実施例１０−２〕：細胞内ｃＡＭＰの生
成促進試験 細胞内ｃＡＭＰの生成促進試験は、次のように実施した
（参照：ＴｈｏｍａｓＪ．Ｇａｒｄｅｌｌａ ｅｔ ａ
ｌ．， ＪＢＣ， ２６５（２６）：１５８５４―１５
８５９（１９９０））。実施例１０-１で、４ないし８
日間２４ウェルプレートで培養したＵＭＲ１０６細胞を
氷浴で１５分間冷却させた後、０．２５ｍｌのｃＡＭＰ
緩衝液（２ｍＭ ３-イソブチル-メチルキサンチン、１
ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＤＭ
ＥＭ、ｐＨ７．４）で１回洗浄した。続いて、０．１ｍ
ｌのｃＡＭＰ緩衝液をプレートに添加し、種々の濃度の
各ホルモンを含むｃＡＭＰ緩衝液０．１ｍｌを添加し
た。その後、反応を３７℃で２０分間で行い、緩衝液を
除去した。さらにその後、-７０℃での凍結および室温
での解凍を各々２０分間３回繰り返して細胞を破壊し
た。１ｍｌの５０ｍＭのＨＣｌをプレートの各ウェルに
加え、-２０℃で１６ないし１８時間細胞内ｃＡＭＰを
抽出し、その抽出物にあるｃＡＭＰをｃＡＭＰ ＲＩＡ
ｋｉｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｄ
ｕ Ｐｏｎｔ，ＵＳＡ）で定量した。曲線の最適化およ
び、ＥＣ50（細胞内ｃＡＭＰの生成を５０％促進するに
必要なホルモン濃度）の値は、Ｂｉｏｓｏｆｔ社のｆｉ
ｇ．Ｐ ｐｒｏｇｒａｍを用いて決定した。ｓｈＰＴＨ
（１-８４）および、ｒｈＰＴＨ（１-８４）のＥＣ50値
は、各々１．９±０．１と１．３±０．２ｍＭ（平均値
±標準偏差）として得られ、その一つの実験結果を図１
８（Ｂ）に示した。図１８（Ｂ）から、組換えＰＴＨは
合成ＰＴＨと同様なアデニレートサイクラーゼ促進活性
を有していることが分かった。
成促進試験 細胞内ｃＡＭＰの生成促進試験は、次のように実施した
（参照：ＴｈｏｍａｓＪ．Ｇａｒｄｅｌｌａ ｅｔ ａ
ｌ．， ＪＢＣ， ２６５（２６）：１５８５４―１５
８５９（１９９０））。実施例１０-１で、４ないし８
日間２４ウェルプレートで培養したＵＭＲ１０６細胞を
氷浴で１５分間冷却させた後、０．２５ｍｌのｃＡＭＰ
緩衝液（２ｍＭ ３-イソブチル-メチルキサンチン、１
ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＤＭ
ＥＭ、ｐＨ７．４）で１回洗浄した。続いて、０．１ｍ
ｌのｃＡＭＰ緩衝液をプレートに添加し、種々の濃度の
各ホルモンを含むｃＡＭＰ緩衝液０．１ｍｌを添加し
た。その後、反応を３７℃で２０分間で行い、緩衝液を
除去した。さらにその後、-７０℃での凍結および室温
での解凍を各々２０分間３回繰り返して細胞を破壊し
た。１ｍｌの５０ｍＭのＨＣｌをプレートの各ウェルに
加え、-２０℃で１６ないし１８時間細胞内ｃＡＭＰを
抽出し、その抽出物にあるｃＡＭＰをｃＡＭＰ ＲＩＡ
ｋｉｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｄ
ｕ Ｐｏｎｔ，ＵＳＡ）で定量した。曲線の最適化およ
び、ＥＣ50（細胞内ｃＡＭＰの生成を５０％促進するに
必要なホルモン濃度）の値は、Ｂｉｏｓｏｆｔ社のｆｉ
ｇ．Ｐ ｐｒｏｇｒａｍを用いて決定した。ｓｈＰＴＨ
（１-８４）および、ｒｈＰＴＨ（１-８４）のＥＣ50値
は、各々１．９±０．１と１．３±０．２ｍＭ（平均値
±標準偏差）として得られ、その一つの実験結果を図１
８（Ｂ）に示した。図１８（Ｂ）から、組換えＰＴＨは
合成ＰＴＨと同様なアデニレートサイクラーゼ促進活性
を有していることが分かった。
【００５９】（産業上の利用の可能性）
以上詳細に説明し、立証した通り、本発明はＰＲＫ遺伝
子断片、あるいはその突然変異体を融合パートナーとし
て含有するＬ-ａｒａｂｉｎｏｓｅ誘導性ベクターに、
ウロキナーゼの切断部のヌクレオチド配列を含むＰＴＨ
遺伝子を挿入して製造した組換え発現ベクター、それで
形質転換された組換え微生物および、前記微生物をＬ-
ａｒａｂｉｎｏｓｅの添加された培地で培養することに
より、ヒト副甲状腺ホルモンを大量製造する方法に関す
る。本発明で製造した組換えヒトＰＴＨは天然型ヒトＰ
ＴＨの活性を有していることを確認した。従って、本発
明の組換え発現ベクターで形質転換された微生物を用
い、Ｌ-ａｒａｂｉｎｏｓｅで発現を誘導することによ
り天然型ヒトＰＴＨの有する活性をそのまま維持してい
る組換えヒトＰＴＨを正確な誘導調節を通し、高収率で
製造することができる。
子断片、あるいはその突然変異体を融合パートナーとし
て含有するＬ-ａｒａｂｉｎｏｓｅ誘導性ベクターに、
ウロキナーゼの切断部のヌクレオチド配列を含むＰＴＨ
遺伝子を挿入して製造した組換え発現ベクター、それで
形質転換された組換え微生物および、前記微生物をＬ-
ａｒａｂｉｎｏｓｅの添加された培地で培養することに
より、ヒト副甲状腺ホルモンを大量製造する方法に関す
る。本発明で製造した組換えヒトＰＴＨは天然型ヒトＰ
ＴＨの活性を有していることを確認した。従って、本発
明の組換え発現ベクターで形質転換された微生物を用
い、Ｌ-ａｒａｂｉｎｏｓｅで発現を誘導することによ
り天然型ヒトＰＴＨの有する活性をそのまま維持してい
る組換えヒトＰＴＨを正確な誘導調節を通し、高収率で
製造することができる。
【００６０】
【配列表】
［図面の簡単な説明］
【図１】発現ベクターΔｐＭＡの遺伝子地図を示す図で
ある。
ある。
【図２】ヒトＰＴＨ遺伝子を調製するためのオリゴマー
の塩基配列（配列番号１；配列番号２；配列番号３；配
列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列
番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配
列番号１２；配列番号１３；配列番号１４）を示す図で
ある。
の塩基配列（配列番号１；配列番号２；配列番号３；配
列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列
番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配
列番号１２；配列番号１３；配列番号１４）を示す図で
ある。
【図３】合成されたオリゴマーの連結過程を示す図であ
る。
る。
【図４】発現ベクターｐＲＫの遺伝子地図を示す図であ
る。
る。
【図５】本発明のＰＲＫ遺伝子断片をＰＣＲによって増
幅する手法を示す図である。
幅する手法を示す図である。
【図６】ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の融合タンパク質
を発現する発現ベクターｐ１５３ｈＧＨの遺伝子地図を
示す図である。
を発現する発現ベクターｐ１５３ｈＧＨの遺伝子地図を
示す図である。
【図７】ＰＴＨの融合タンパク質を発現する発現ベクタ
ーｐＡＩ５ＵＰの遺伝子地図を示す図である。
ーｐＡＩ５ＵＰの遺伝子地図を示す図である。
【図８】本発明の組換えヒトＰＴＨを発現する発現ベク
ターｐ１５３ＰＴＨを調製する構築手法を示す図であ
る。
ターｐ１５３ＰＴＨを調製する構築手法を示す図であ
る。
【図９】ｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌の、Ｌ
-アラビノース誘導による、ＰＲＫ断片で融合されたヒ
トＰＴＨタンパク質の発現を示す電気泳動パターンの写
真である。
-アラビノース誘導による、ＰＲＫ断片で融合されたヒ
トＰＴＨタンパク質の発現を示す電気泳動パターンの写
真である。
【図１０】ｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌から
発現された融合タンパク質を単離する過程で得られた試
料のＳＤＳ-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。
発現された融合タンパク質を単離する過程で得られた試
料のＳＤＳ-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。
【図１１】１５３ＰＴＨ融合タンパク質の封入体の、ウ
ロキナーゼで消化した後のＳＤＳ-ＰＡＧＥパターンを
示す写真である。
ロキナーゼで消化した後のＳＤＳ-ＰＡＧＥパターンを
示す写真である。
【図１２】ｐ１５３ＰＴＨを改変することにより、本発
明のヒトＰＴＨの発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨを調製
する構築手法を示す図である。
明のヒトＰＴＨの発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨを調製
する構築手法を示す図である。
【図１３】ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌
の、Ｌ-アラビノース誘導による、融合タンパク質の発
現を示す電気泳動パターンの写真である。
の、Ｌ-アラビノース誘導による、融合タンパク質の発
現を示す電気泳動パターンの写真である。
【図１４】ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌か
ら発現された融合タンパク質を単離する過程で得られた
試料のＳＤＳ-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。
ら発現された融合タンパク質を単離する過程で得られた
試料のＳＤＳ-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。
【図１５】１５３ＰＴＨおよびｍ１５３ＰＴＨ融合タン
パク質の封入体の、ウロキナーゼで消化した後のＳＤＳ
-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。
パク質の封入体の、ウロキナーゼで消化した後のＳＤＳ
-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。
【図１６】１５３ＰＴＨおよびｍ１５３ＰＴＨの封入体
のウロキナーゼ消化効率を比較するための、各反応物の
電気泳動パターンを示す写真である。
のウロキナーゼ消化効率を比較するための、各反応物の
電気泳動パターンを示す写真である。
【図１７】精製されたヒトＰＴＨのＳＤＳ-ＰＡＧＥパ
ターンを示す写真である。
ターンを示す写真である。
【図１８Ａ】精製されたヒトＰＴＨとその受容体の結合
を示すグラフである。
を示すグラフである。
【図１８Ｂ】精製されたヒトＰＴＨが細胞内ｃＡＭＰ生
産を刺激することを示すグラフである。
産を刺激することを示すグラフである。
フロントページの続き
(72)発明者 チュン，ソー−イル
大韓民国 463−050 キョンギ‐ド，ソ
ンナム，セオヒュン−ドン，ヒュンダイ
アパートメント 112−902
(56)参考文献 米国特許5171670（ＵＳ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (13)
- 【請求項１】 ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏ
ｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のホスホリ
ブロキナーゼタンパク質のアミノ末端から１１３番目の
アミノ酸まで若しくはアミノ末端から１５３番目のアミ
ノ酸までを含む領域をコードするホスホリブロキナーゼ
遺伝子断片、または該ホスホリブロキナーゼタンパク質
の３０、５８、５９、９４、及び／若しくは９６番目の
アルギニンが他のアミノ酸で置換されたタンパク質をコ
ードするその突然変異型遺伝子を融合パートナーとして
含有するＬ-アラビノース誘導性ベクターに、下記のア
ミノ酸配列： - Ｘ - Ｇｌｙ - Ａｒｇ（上記式中、ＸはＰｒｏ、Ｔｈｒ、
Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、あるいはＬｅｕを表す） をコードする ウロキナーゼ特異的切断部位のためのＤＮ
Ａ配列を含むヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を挿入して製
造した、組換え発現ベクター。 - 【請求項２】 Ｌ-アラビノース誘導性ベクターが、下
記の遺伝子地図で示表されるｐＰＲＫである請求項１記
載の組換え発現ベクター。 - 【請求項３】 ホスホリブロキナーゼ遺伝子断片が、ホ
スホリブロキナーゼのアミノ末端から１１３個から１５
３個のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片である請求項１
記載の組換え発現ベクター。 - 【請求項４】 ウロキナーゼ特異的切断部位が、-Ｔｈ
ｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列である、請求項１記載の組換え発現ベクター。 - 【請求項５】 ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子が、下記の
ＤＮＡ配列を有する、請求項１記載の組換え発現ベクタ
ー： - 【請求項６】 ロドバクター・スフェロイデスのホスホ
リブロキナーゼのアミノ末端から１５３個のアミノ酸を
コードするＤＮＡ断片、ウロキナーゼ特異的切断部位の
-Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-ＡｒｇをコードするＤＮＡ断片、およ
びヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を含む組換え発現ベクタ
ーｐ１５３ＰＴＨ。 - 【請求項７】 ロドバクター・スフェロイデスのホスホ
リブロキナーゼのアミノ末端から１５３個のアミノ酸を
コードし、その３０、３１、５８、５９、９４、および
９６番目の位置にあるアルギニン残基の一部が突然変異
して他のアミノ酸で置換されたＤＮＡ断片、ウロキナー
ゼ特異的切断部位の-Ｘ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ（式中、ＸはＰ
ｒｏ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、あるいはＬｅｕを表
す）をコードするＤＮＡ断片、およびヒト副甲状腺ホル
モン遺伝子を連続して含む組換え発現ベクター。 - 【請求項８】 ロドバクター・スフェロイデスのホスホ
リブロキナーゼのアミノ末端から１５３個のアミノ酸を
コードし、その３０、５８および、９４番目のアルギニ
ン残基が部位特異的に突然変異してバリンに置換し、５
９、および９６番目のアルギニン残基がグリシンに置換
されたＤＮＡ断片、ウロキナーゼ特異的切断部位の-Ｔ
ｈｒ-Ｇｌｙ-ＡｒｇをコードするＤＮＡ断片、およびヒ
ト副甲状腺ホルモン遺伝子を連続して含む組換え発現ベ
クターｐｍ１５３ＰＴＨ。 - 【請求項９】 請求項６記載の組換え発現ベクターｐ１
５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌ＭＣ１０６１：ｐ１
５３ＰＴＨ（ＫＣＣＭ-１０１０１）。 - 【請求項１０】 請求項８記載の組換え発現ベクターｐ
ｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌ＭＣ１０６１：
ｐｍ１５３ＰＴＨ（ＫＣＣＭ-１０１０２）。 - 【請求項１１】 請求項９記載の形質転換された大腸菌
ＭＣ１０６１：ｐ１５３ＰＴＨ（ＫＣＣＭ-１０１０
１）を培養し、Ｌ-アラビノースでヒト副甲状腺ホルモ
ンの発現を誘導し、これを回収する工程を含む、ヒト副
甲状腺ホルモンの製造方法。 - 【請求項１２】 請求項１０記載の形質転換された大腸
菌ＭＣ１０６１：ｐｍ１５３ＰＴＨ（ＫＣＣＭ-１０１
０２）を培養し、Ｌ-アラビノースでヒト副甲状腺ホル
モンの発現を誘導し、これを回収する工程を含む、ヒト
副甲状腺ホルモンの製造方法。 - 【請求項１３】 請求項１記載の組換え発現ベクターで
形質転換された組換え微生物を培養し、Ｌ-アラビノー
スでヒト副甲状腺ホルモンの発現を誘導し、発現された
ホスホリブロキナーゼおよびヒト副甲状腺ホルモンの融
合タンパク質をウロキナーゼ処理することにより、ヒト
副甲状腺ホルモンを回収する工程を含む、ヒト副甲状腺
ホルモンの製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1997/35230 | 1997-07-25 | ||
| KR1019970035230A KR100230578B1 (ko) | 1997-07-25 | 1997-07-25 | 포스포리불로키나제를 융합파트너로 이용하는 재조합 인간 부갑상선호르몬의 발현벡터 |
| PCT/KR1998/000146 WO1999005277A1 (en) | 1997-07-25 | 1998-06-05 | A recombinant expression vector of human parathyroid hormone using phosphoribulokinase as a fusion partner |
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|---|---|
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ID=19515755
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000504251A Expired - Fee Related JP3480836B2 (ja) | 1997-07-25 | 1998-06-05 | ヒト副甲状腺ホルモンの組換え発現ベクター |
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|---|---|---|---|---|
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