JPS6196997A - ヒトアポリポプロテインe様蛋白の産生方法 - Google Patents
ヒトアポリポプロテインe様蛋白の産生方法Info
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- JPS6196997A JPS6196997A JP59216987A JP21698784A JPS6196997A JP S6196997 A JPS6196997 A JP S6196997A JP 59216987 A JP59216987 A JP 59216987A JP 21698784 A JP21698784 A JP 21698784A JP S6196997 A JPS6196997 A JP S6196997A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、組換えDNA技術によるヒトアポリポプロテ
ィ7 E (Apolipoprotein ]!i
)様蛋白の微生物学的産生方法に関する。
ィ7 E (Apolipoprotein ]!i
)様蛋白の微生物学的産生方法に関する。
(従来の技術)
血漿中に存在する主要な脂質としては、コレステロール
、リン脂質、トリグリセリド及び遊離脂肪酸が挙げられ
るが、このうちの前三者は蛋白と結合して存在する。水
に不溶の脂質が可溶化されたこの脂質−蛋白複合体はリ
ポ蛋白と呼ばれ、脂質と蛋白の割合により、種々の重さ
のものを形成する。このリポ蛋白は、球形粒子状の構造
をなし、中核部分に極性のないトリグリセリド、コレス
テロールエステルが存在シ、極性のあるリン脂質、遊離
コレステロールが蛋白とともに表層を形成すると考えら
れている。
、リン脂質、トリグリセリド及び遊離脂肪酸が挙げられ
るが、このうちの前三者は蛋白と結合して存在する。水
に不溶の脂質が可溶化されたこの脂質−蛋白複合体はリ
ポ蛋白と呼ばれ、脂質と蛋白の割合により、種々の重さ
のものを形成する。このリポ蛋白は、球形粒子状の構造
をなし、中核部分に極性のないトリグリセリド、コレス
テロールエステルが存在シ、極性のあるリン脂質、遊離
コレステロールが蛋白とともに表層を形成すると考えら
れている。
このリボ蛋白中に含まれる蛋白は、アポリボプロティン
と呼ばれ、現在IO種類以上が知られている。アポリポ
プロティンは、リボ蛋白を構成するのに必要であるばか
りでなく、リボ蛋白の代謝においても重要な役割を果た
す。このアポリポプロティンのひとつとして、アポリポ
プロティンEが知られている。そしてこのアポリポプロ
ティンEは体内の諸細胞がレセプターを介してリボ蛋白
をとり込む場合に、認識標となることが知られている。
と呼ばれ、現在IO種類以上が知られている。アポリポ
プロティンは、リボ蛋白を構成するのに必要であるばか
りでなく、リボ蛋白の代謝においても重要な役割を果た
す。このアポリポプロティンのひとつとして、アポリポ
プロティンEが知られている。そしてこのアポリポプロ
ティンEは体内の諸細胞がレセプターを介してリボ蛋白
をとり込む場合に、認識標となることが知られている。
さらに、このアポリポプロティンEの主要なサブクラス
としてKJ、E3、z4Aが見出されておシ、E3が正
常人由来であるのに対し、Eλ及びipは■型窩脂血症
の患者から見出され、非正常型であると考えられている
( T)16 Jour−nal of Biolog
ical Chemistry 、 Vol、2 !
j 。
としてKJ、E3、z4Aが見出されておシ、E3が正
常人由来であるのに対し、Eλ及びipは■型窩脂血症
の患者から見出され、非正常型であると考えられている
( T)16 Jour−nal of Biolog
ical Chemistry 、 Vol、2 !
j 。
Aj、/7!ター/m、/り10)。
このアポリポプロティンE3を欠植するが、又はEコも
しくはEμを有する人は、高脂血症になシ、さらに動脈
硬化に至る場合が多い。
しくはEμを有する人は、高脂血症になシ、さらに動脈
硬化に至る場合が多い。
このような場合、患者に正常なE3を投与することによ
り、正常なアポリボプロティン凡の機能を回復させるこ
とができる。
り、正常なアポリボプロティン凡の機能を回復させるこ
とができる。
このアポリポプロティンEを遺伝子工学的手法によシ得
るために、アポリポプロティンEをコードするDNAが
必要となる。しかしながら完全なアポリポプロティンE
を得るために必要な完全長のcDNA断片は、いまだに
得られていなかった。
るために、アポリポプロティンEをコードするDNAが
必要となる。しかしながら完全なアポリポプロティンE
を得るために必要な完全長のcDNA断片は、いまだに
得られていなかった。
本発明者らは、先に、上記完全長cDNA断片を得(%
願昭5?−ムiり10参照)、今般、これを用いてアポ
リポプロティンEを産生ずる本発明方法に到達した。
願昭5?−ムiり10参照)、今般、これを用いてアポ
リポプロティンEを産生ずる本発明方法に到達した。
すなわち、本発明の要旨は、ヒトアポリボプロティンE
又はそれと同様の生理活性を有するヒトアポリボプロテ
ィンE様物質をコードするDNAを含有するDNA断片
を発現用ベクターのプロモータの下流に存在するクロー
ニング部位に導入し、ついで上記DNA断片を導入した
ベクターを宿・主微生物に導入して同宿主を培養し、産
生ずる蛋白を取−得することを特徴とするも ヒトアボリ□ボブロチインE様蛋白の産穣方法にある。
又はそれと同様の生理活性を有するヒトアポリボプロテ
ィンE様物質をコードするDNAを含有するDNA断片
を発現用ベクターのプロモータの下流に存在するクロー
ニング部位に導入し、ついで上記DNA断片を導入した
ベクターを宿・主微生物に導入して同宿主を培養し、産
生ずる蛋白を取−得することを特徴とするも ヒトアボリ□ボブロチインE様蛋白の産穣方法にある。
(発明の構成)
以下、本発明の詳細な説明する。
まず、本発明において用いるI)NA断片のヒトアポリ
ボプロティンE3をコードするDNAを含有するDIN
A断片は、次のような方法によって調製される。すなわ
ち、ヒト肝臓切片、小腸上皮細胞、血液中のマクロファ
ージ又は腎臓切片等をグアジニルチオシアネートととも
にホモジナイズし、(6al平衡密度勾配超遠心によっ
て全RNAを分離する( Chirgwinら、Bio
−chemistry、 / r 、 jJ Y4L
−jjタタ、lり7り)。
ボプロティンE3をコードするDNAを含有するDIN
A断片は、次のような方法によって調製される。すなわ
ち、ヒト肝臓切片、小腸上皮細胞、血液中のマクロファ
ージ又は腎臓切片等をグアジニルチオシアネートととも
にホモジナイズし、(6al平衡密度勾配超遠心によっ
て全RNAを分離する( Chirgwinら、Bio
−chemistry、 / r 、 jJ Y4L
−jjタタ、lり7り)。
ついで、常法によシこれをオリゴ(dT)セルロースカ
ラムクロマトグラフィーで精製し、ポリ(A)含有RN
Aを単離する( m RN A原料)。
ラムクロマトグラフィーで精製し、ポリ(A)含有RN
Aを単離する( m RN A原料)。
(Mo1ecu1ar and(!ellu’lar
Biology 、 2 、 / A / −i’yo
、iりr2)によって、c D N A ラ()5 ’
)−を得□る。すなわち、pBRJ22とSV弘0のハ
イブリッドプラスミドを用いて、ベクタープライマーと
オリゴ(dG)テールリンカ−を得る。
Biology 、 2 、 / A / −i’yo
、iりr2)によって、c D N A ラ()5 ’
)−を得□る。すなわち、pBRJ22とSV弘0のハ
イブリッドプラスミドを用いて、ベクタープライマーと
オリゴ(dG)テールリンカ−を得る。
このベクタープライマーと上記mR’NA共存下に逆転
写酵素を作用させてcDMAを合成し、その後制限酵素
H1nd Iで消化し、ついで上記リンカ−を用いて環
化させる。その後、mRNA部分をDNAで置換して、
cDNA断片含有プラスミドを得る。
写酵素を作用させてcDMAを合成し、その後制限酵素
H1nd Iで消化し、ついで上記リンカ−を用いて環
化させる。その後、mRNA部分をDNAで置換して、
cDNA断片含有プラスミドを得る。
ついで、常法によシ、これを用いて大腸菌(geche
richia coli )等をアンピシリン耐性に形
質転換する。その後、プローブとして、アポリボプロテ
ィン五のアミノ酸配列2/に一ハ―位 Met−Glu−G4u−Met−Gl−7に対応する
塩基配列の一部もしくは全部を含む合成オリゴヌクレオ
チド又は少くとも該塩基配列を含む合成オリゴヌクレオ
チドを用いて、これと相補性のある配列を含むクローン
を選択する。こうして得られるクローン中よシ、適切な
制限酵素で切断して、最も長いcDNAが挿入されてい
るプラスミドを有するクローンを選択する。 ゛ そのクローンより得られるcDNA断片は、Mazam
とG11bertの方法(Methods in Kn
zy −m010g7. A j 、 IAタター!t
O,/910 )によって塩基配列が決定される。
richia coli )等をアンピシリン耐性に形
質転換する。その後、プローブとして、アポリボプロテ
ィン五のアミノ酸配列2/に一ハ―位 Met−Glu−G4u−Met−Gl−7に対応する
塩基配列の一部もしくは全部を含む合成オリゴヌクレオ
チド又は少くとも該塩基配列を含む合成オリゴヌクレオ
チドを用いて、これと相補性のある配列を含むクローン
を選択する。こうして得られるクローン中よシ、適切な
制限酵素で切断して、最も長いcDNAが挿入されてい
るプラスミドを有するクローンを選択する。 ゛ そのクローンより得られるcDNA断片は、Mazam
とG11bertの方法(Methods in Kn
zy −m010g7. A j 、 IAタター!t
O,/910 )によって塩基配列が決定される。
本発明方法において発現用ベクターのクローニング部位
に導入されるDNA断片は、アポリボプロティンE又は
アポリボプロティンEと同様の生理活性を有するアポリ
ボプロティンE様物質をコードするDNAを含有するD
NA断片である。その−例としてアポリボプロティンE
3をコードするDNAを含有するDNA断片の塩基配列
及びそれから推定されるアミノ酸配列を躬2図に示すが
、本発明に係るDNA断片は必ずしもこれと同一の塩基
配列を有することを要求されず、該DNA断片に含まれ
るDNAによってコードされる物質が、アポリボプロテ
ィンEと同様の生理活性を有するアポリボプロティンE
様物質であれば、該塩基配列の一部が置撲もしくは削除
され、又は塩基が付加された塩基配列であってもよい。
に導入されるDNA断片は、アポリボプロティンE又は
アポリボプロティンEと同様の生理活性を有するアポリ
ボプロティンE様物質をコードするDNAを含有するD
NA断片である。その−例としてアポリボプロティンE
3をコードするDNAを含有するDNA断片の塩基配列
及びそれから推定されるアミノ酸配列を躬2図に示すが
、本発明に係るDNA断片は必ずしもこれと同一の塩基
配列を有することを要求されず、該DNA断片に含まれ
るDNAによってコードされる物質が、アポリボプロテ
ィンEと同様の生理活性を有するアポリボプロティンE
様物質であれば、該塩基配列の一部が置撲もしくは削除
され、又は塩基が付加された塩基配列であってもよい。
なお、非正常型サブクラスE2又はE4(に対応するD
NA断片は、Eコ又はE≠を有する患者由来の肝臓切片
等を用いることにより、得ることができる。
NA断片は、Eコ又はE≠を有する患者由来の肝臓切片
等を用いることにより、得ることができる。
本発明方法において、上記DNA断片は、発現ベクター
のプロモータの下流に存在するクローニング部位に導入
することによって、これを鋳型とする翻訳によシアボリ
ポプロテインE又はアポリボプロティンE様物質、ある
いはこれを含む融合蛋白を得ることができる。
のプロモータの下流に存在するクローニング部位に導入
することによって、これを鋳型とする翻訳によシアボリ
ポプロテインE又はアポリボプロティンE様物質、ある
いはこれを含む融合蛋白を得ることができる。
クローニング部位としては、目的とする異種遺伝子の直
接発現を可能とする制限酵素認誠部 “位が挙げら
れる。具体的には、翻訳開始コドンの直前におる抛旧部
位が好ましく、プロモータ下流にBam H1部位が存
在しないときには、合成リンカ−により同部位を形成で
きる。プロモータとしては・、/ac 1によシ調節可
能なものが好ましく、このようなプロモータとしては、
犬1)%Iの外膜蛋白の/フであるリボプロティンをコ
ードする遺伝子(lpp )のプロモータあるいは31
プロモータと化プロモータとの融合型プロモータである
とプロモータ(Proceedingof Nati
onlLI Academy 5cience 1
0 λ/(/りJ’J)及び特開昭j7−/23弘2
7号公報参照))が好ましい。
接発現を可能とする制限酵素認誠部 “位が挙げら
れる。具体的には、翻訳開始コドンの直前におる抛旧部
位が好ましく、プロモータ下流にBam H1部位が存
在しないときには、合成リンカ−により同部位を形成で
きる。プロモータとしては・、/ac 1によシ調節可
能なものが好ましく、このようなプロモータとしては、
犬1)%Iの外膜蛋白の/フであるリボプロティンをコ
ードする遺伝子(lpp )のプロモータあるいは31
プロモータと化プロモータとの融合型プロモータである
とプロモータ(Proceedingof Nati
onlLI Academy 5cience 1
0 λ/(/りJ’J)及び特開昭j7−/23弘2
7号公報参照))が好ましい。
宿主倣生物としては、通常大腸菌例えばHB10/、’
JM104等を用いることができ、培養、蛋白の取得は
常法により行うことができる。
JM104等を用いることができ、培養、蛋白の取得は
常法により行うことができる。
(発明の効果)
本発明方法によれば、ヒトアポリボプロティンE様蛋白
を効率よく表現させることができ、得られる蛋白(アポ
リボプロチインEλ、E3又はE4Cなど)を抗原とし
て、常法により抗血清を得、これを用いてアポリボプロ
ティン正常型E3の欠損又は非正常型(E2、Ell)
の存在を検出できる。
を効率よく表現させることができ、得られる蛋白(アポ
リボプロチインEλ、E3又はE4Cなど)を抗原とし
て、常法により抗血清を得、これを用いてアポリボプロ
ティン正常型E3の欠損又は非正常型(E2、Ell)
の存在を検出できる。
さらに、得られるアポリボプロティンEJi、抗高脂血
症剤、抗動脈硬化剤として用いることもできる。
症剤、抗動脈硬化剤として用いることもできる。
(実施例)
以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明するが
、本発明は、その要旨を茹えない限シ、以下の実施例に
よシ限定されない。
、本発明は、その要旨を茹えない限シ、以下の実施例に
よシ限定されない。
実施例/
A、原料DNA断片の調製
(1) ヒト肝臓切片を液体窒素で破砕した後グアニ
ジニウムチオシアネート水溶液を添加しホモジナイズし
た。得られたホモジネートを、C!hirgwinらの
方法(Biochemistry 、 / r 。
ジニウムチオシアネート水溶液を添加しホモジナイズし
た。得られたホモジネートを、C!hirgwinらの
方法(Biochemistry 、 / r 。
j−タ≠−jコタダ、/り7り)に従って、環化セシウ
ム平衡密度勾配超遠心によって全RNAを分離した。つ
いで、常法によりこれをオリゴ(aT)セルロースカラ
ムクロマトグラフィ−で精製し、ポ’) (A)含有R
NAを単離し。
ム平衡密度勾配超遠心によって全RNAを分離した。つ
いで、常法によりこれをオリゴ(aT)セルロースカラ
ムクロマトグラフィ−で精製し、ポ’) (A)含有R
NAを単離し。
mRNA原料とした。
(2)一方、岡山とElergの方法(Mo1ecul
ar and(1!e11ular Biology
2. / 6/ −/ 70 、 / 912 )によ
り、pBRjλλとBVliOのハイブリッドプラスミ
ドを用いて、ベクタープライマーとオリゴ(aG)テー
ルリンカ−を得た。すなわち、pBR122とS V
4tO(? 77’ ユ= 7ト0,7 / −0,r
、4 )のハイブリッドプラスミドaOOμtを、ウ
シ血清アルブミンを含む緩衝液中制限酵素Kpn Iで
37℃、φ時間消化した。
ar and(1!e11ular Biology
2. / 6/ −/ 70 、 / 912 )によ
り、pBRjλλとBVliOのハイブリッドプラスミ
ドを用いて、ベクタープライマーとオリゴ(aG)テー
ルリンカ−を得た。すなわち、pBR122とS V
4tO(? 77’ ユ= 7ト0,7 / −0,r
、4 )のハイブリッドプラスミドaOOμtを、ウ
シ血清アルブミンを含む緩衝液中制限酵素Kpn Iで
37℃、φ時間消化した。
ついで、常法によりエタノール沈澱によってDNAを回
収し、これをdTTPを含む緩衝液に溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを添加し
て、37℃で3Q分間反応させて、制限酵素Kpn l
の消化末端に約60個のdTデテール付加させた後、エ
タノール沈澱によりDNAを回収した。ついで、このD
NAをウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、%tll
限酵素Hpa l拠よυ消化した(37℃、5時間)。
収し、これをdTTPを含む緩衝液に溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを添加し
て、37℃で3Q分間反応させて、制限酵素Kpn l
の消化末端に約60個のdTデテール付加させた後、エ
タノール沈澱によりDNAを回収した。ついで、このD
NAをウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、%tll
限酵素Hpa l拠よυ消化した(37℃、5時間)。
大きい方のDNA断片を、アガロースゲル電気泳動によ
り精製し、ガラスパウダー法(VOgelsteinら
、Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 U
、S、A、、 76 、6/j−J/り、lり7り)に
よって回収した。その後、このDNAを0℃でオリゴ(
dA)セルロースカラムに付し、水で溶出させた後、エ
タノールで回収し、オリゴ(dT)テールを有するベク
タープライマーを得た。
り精製し、ガラスパウダー法(VOgelsteinら
、Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 U
、S、A、、 76 、6/j−J/り、lり7り)に
よって回収した。その後、このDNAを0℃でオリゴ(
dA)セルロースカラムに付し、水で溶出させた後、エ
タノールで回収し、オリゴ(dT)テールを有するベク
タープライマーを得た。
他方、pBRJ、2uとS V 4! 0 (−w ツ
ブユニット0./り〜0.! 2 )とのハイブリッド
プラスミドiooμfをウシ血清アルブミンを含む緩衝
液中で、制限酵素Pet Iにより消化し九(37℃、
7時間中)。ついで、DNAを回収し、dGTPを含む
緩衝液に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼを添加して、37℃で20分間反応さ
せ、約10〜/jのdGデテール付加させた。回収した
DNA1、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で制限酵
素H1nd Iによシ消化させ(37℃、1時間)、つ
いでアガロースゲル(i、r%)電気泳動に付し、小さ
いオリゴ(dG)テールリンカ−DNAを抽出、回収し
た。
ブユニット0./り〜0.! 2 )とのハイブリッド
プラスミドiooμfをウシ血清アルブミンを含む緩衝
液中で、制限酵素Pet Iにより消化し九(37℃、
7時間中)。ついで、DNAを回収し、dGTPを含む
緩衝液に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼを添加して、37℃で20分間反応さ
せ、約10〜/jのdGデテール付加させた。回収した
DNA1、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で制限酵
素H1nd Iによシ消化させ(37℃、1時間)、つ
いでアガロースゲル(i、r%)電気泳動に付し、小さ
いオリゴ(dG)テールリンカ−DNAを抽出、回収し
た。
10ellular Biologyコ、/l、/ −
/70,1912 )によシ、cDNAライブラリーを
得た。
/70,1912 )によシ、cDNAライブラリーを
得た。
すなわち、Tris−HC!1 (pHr、3)、Mg
C1,、KOI、ジチオスレイトール、dATP、ti
TTP。
C1,、KOI、ジチオスレイトール、dATP、ti
TTP。
dGTP及び(”P)dcTPを含む水溶液に上記(1
)で得られたmRNAjOμ?と上記(2)で得られた
ベクタープライマー10μtを添加して、逆転写酵素の
存在下に37℃、20分間、反応させ、プラスミド−c
D N A : mRNA1合成し、これをエタノー
ル沈澱しベレット状で回収した。このベレットをcoc
k、、ジチオスレイトール、ポリ(A)、(32p)d
QTI及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼを含有する緩衝液に溶解し、37℃、io分
間反応させ、末端あたりa cMpの10−ljの残基
を付加させた。
)で得られたmRNAjOμ?と上記(2)で得られた
ベクタープライマー10μtを添加して、逆転写酵素の
存在下に37℃、20分間、反応させ、プラスミド−c
D N A : mRNA1合成し、これをエタノー
ル沈澱しベレット状で回収した。このベレットをcoc
k、、ジチオスレイトール、ポリ(A)、(32p)d
QTI及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼを含有する緩衝液に溶解し、37℃、io分
間反応させ、末端あたりa cMpの10−ljの残基
を付加させた。
ついで、回収したオリゴCab)テールプラスミド−c
D N A : m RN Aを含有するベレットを
ウシ血清アルブミンを含む緩衝液に溶解し、制限酵素H
1nd Iで37℃、7時間消化し、エタノール沈澱に
よシ、Hlnd I消化オリゴ(aC)テールcDNA
:mRNAプラスミドを回収した。これ全前記(2)で
得られたオリゴ(dG)テールリンカ−DNAを含む緩
衝液に溶解し、65℃、2分間インキュベートし、さら
にψλ℃、30分間保持し、0℃に冷却した。ついで、
β−MADにコチンアデニンジヌクレチド)存在下、大
腸菌(E。
D N A : m RN Aを含有するベレットを
ウシ血清アルブミンを含む緩衝液に溶解し、制限酵素H
1nd Iで37℃、7時間消化し、エタノール沈澱に
よシ、Hlnd I消化オリゴ(aC)テールcDNA
:mRNAプラスミドを回収した。これ全前記(2)で
得られたオリゴ(dG)テールリンカ−DNAを含む緩
衝液に溶解し、65℃、2分間インキュベートし、さら
にψλ℃、30分間保持し、0℃に冷却した。ついで、
β−MADにコチンアデニンジヌクレチド)存在下、大
腸菌(E。
coli ) D kJ A !J lj−セを加しテ
、−夜インキユペートした。その後、dATP、dTT
P。
、−夜インキユペートした。その後、dATP、dTT
P。
dGTP、dcTP、β−N AD、 E、coliD
NAリガーゼ、E、 cadi D N Aポリメラー
ゼ及びE、coli RNase Hを添加して、この
混合物を72℃、1時間、次いで室温で/時間インキュ
ベートした後、冷却し、反応を停止させ目的とするc
D N A 1eft片含有プラスミドを得た。
NAリガーゼ、E、 cadi D N Aポリメラー
ゼ及びE、coli RNase Hを添加して、この
混合物を72℃、1時間、次いで室温で/時間インキュ
ベートした後、冷却し、反応を停止させ目的とするc
D N A 1eft片含有プラスミドを得た。
(4) ついで、このプラスミドを用いて常法により
、大腸菌(ム洩)HB10/を形質転換させた。
、大腸菌(ム洩)HB10/を形質転換させた。
その後、プローブとして、アポリポプロティンEのアミ
ノ酸配列2/l−222位Met−Glu−Glu−M
et−Glyに相当する参種類の合成オリゴヌクレオチ
ドj’ −0CCAT (ニ)TC! (:)TO(!
AT−J’−67、/りto)によってスクリーニング
を行ない、これと相補性のある配列を含むクローンを選
択した。約ioo、oooの形質転換体中、約50個の
クローンが選択され、このうちの/ぴ個のクローンにつ
いて数称の制限酵素により処理し、そのうちの3つのク
ローンが共通の制限酵素認識部位をもつことが判明した
。
ノ酸配列2/l−222位Met−Glu−Glu−M
et−Glyに相当する参種類の合成オリゴヌクレオチ
ドj’ −0CCAT (ニ)TC! (:)TO(!
AT−J’−67、/りto)によってスクリーニング
を行ない、これと相補性のある配列を含むクローンを選
択した。約ioo、oooの形質転換体中、約50個の
クローンが選択され、このうちの/ぴ個のクローンにつ
いて数称の制限酵素により処理し、そのうちの3つのク
ローンが共通の制限酵素認識部位をもつことが判明した
。
そのうちで最も犬、きなりローンpYAFi10を選択
し、このクローンの塩基配列をMazamとG11be
rtの方法により決定した。
し、このクローンの塩基配列をMazamとG11be
rtの方法により決定した。
第1図は上記クローンの塩基配列決定のために作成した
制限酵素切断地図を示す(AT片の塩基配列及びそれよ
り想定されるアミノ酸配列を示す(アミノ酸残基数:3
/7)。
制限酵素切断地図を示す(AT片の塩基配列及びそれよ
り想定されるアミノ酸配列を示す(アミノ酸残基数:3
/7)。
このDNA断片は、正常人由来のアポリポプロティンE
3に相当する。
3に相当する。
B、ヒトアポリポプロテインB様蛋白の産生(37℃、
2時間)、/、7 kl)の断片を得る。ついでBat
j /で処理しく37℃、lJr分)、ついで肋!旧
リンカ−をT≠(37℃、2時間)汐、プラスミドpB
R322を抛旧消化(37℃、2時間)及びB、 A、
P処理(37℃、1時間)して得られる断片とT≠DN
Aリガーゼを用いて連結する(l≠℃、16時間)。つ
いで、大腸菌HB10/を形資転換し、形質転換株より
プラスミドphAPEを得た(第3図)。
2時間)、/、7 kl)の断片を得る。ついでBat
j /で処理しく37℃、lJr分)、ついで肋!旧
リンカ−をT≠(37℃、2時間)汐、プラスミドpB
R322を抛旧消化(37℃、2時間)及びB、 A、
P処理(37℃、1時間)して得られる断片とT≠DN
Aリガーゼを用いて連結する(l≠℃、16時間)。つ
いで、大腸菌HB10/を形資転換し、形質転換株より
プラスミドphAPEを得た(第3図)。
(11) プラスミドp h A P FX−/の構
築(第弘図)上記プラスミドphAPEを、制限酵素F
ok Iで消化しく37℃、2時間)、612bp断片
を得、合成り N A、リンカ−ok 1 ↓ をTfDNAI7ガーゼの存在下に連結しくt℃、16
時間)、制限酵素にミ旧、8oc Mで消化しく37℃
、2時間)、J77bp断片を得る。
築(第弘図)上記プラスミドphAPEを、制限酵素F
ok Iで消化しく37℃、2時間)、612bp断片
を得、合成り N A、リンカ−ok 1 ↓ をTfDNAI7ガーゼの存在下に連結しくt℃、16
時間)、制限酵素にミ旧、8oc Mで消化しく37℃
、2時間)、J77bp断片を得る。
一方、上記プラスミドphAPEを制限酵素性l、シH
1で消化しく37℃、2時間)、&rObp断片を得る
。ついで、この2つの断片をTψDNAリガーゼで連結
しく/4!’C1f時間)、さらK Bam Hl テ
ffi化して約10!Obp断片を得た。他方、プラス
ミドp B RJ JコをBam HIで消化しく37
℃、2時間)、BAPで処理し、ついで上記約10!O
bp断片を導入してプラスミドp h A P W−り
を得た。
1で消化しく37℃、2時間)、&rObp断片を得る
。ついで、この2つの断片をTψDNAリガーゼで連結
しく/4!’C1f時間)、さらK Bam Hl テ
ffi化して約10!Obp断片を得た。他方、プラス
ミドp B RJ JコをBam HIで消化しく37
℃、2時間)、BAPで処理し、ついで上記約10!O
bp断片を導入してプラスミドp h A P W−り
を得た。
(iiD プラスミドル工N−tacの構築(第5図
)プラスミドル工N−頁一〇 (Experiment
a1Ml!LnipulatiOn of Gene
FJxpreselon、 Editedby M、■
nouye 、 / 91 J 、Academic
Preee 。
)プラスミドル工N−頁一〇 (Experiment
a1Ml!LnipulatiOn of Gene
FJxpreselon、 Editedby M、■
nouye 、 / 91 J 、Academic
Preee 。
p/j参照、下記プラスミドル工Nlll31も同様)
を制限酵素Aatll、BamHIで消化しく37℃、
2時間)、約7000bpの断片を得る。一方、プラス
ミドpDRjl10(P、−L Biochemica
ls よシ入手可能)を制限酵素p些■、BamHI
で消化しく37℃、2時間)約100 bp断片を得る
。ついで、この二つの断片をT≠DNAリガーゼで連結
しく7μ℃、/ダ時間)、プラスミドル工N−j;aC
を得た。
を制限酵素Aatll、BamHIで消化しく37℃、
2時間)、約7000bpの断片を得る。一方、プラス
ミドpDRjl10(P、−L Biochemica
ls よシ入手可能)を制限酵素p些■、BamHI
で消化しく37℃、2時間)約100 bp断片を得る
。ついで、この二つの断片をT≠DNAリガーゼで連結
しく7μ℃、/ダ時間)、プラスミドル工N−j;aC
を得た。
(iv) プラスミドphAKP−2の構築(第を図
)上記プラスミドp h A ’E P −/を制限酵
素BamHIで消化しく37℃、2時間)、制限酵素B
amH7消化及びBAP処理を行なったP工N−tac
とT≠DNAリガーゼで連結して(/44℃、/4C時
間)プラスミドphApp−2を得た。なお、第6図中
のQa IQ遺伝子はl!acIを大量に生産する遺伝
子である。
)上記プラスミドp h A ’E P −/を制限酵
素BamHIで消化しく37℃、2時間)、制限酵素B
amH7消化及びBAP処理を行なったP工N−tac
とT≠DNAリガーゼで連結して(/44℃、/4C時
間)プラスミドphApp−2を得た。なお、第6図中
のQa IQ遺伝子はl!acIを大量に生産する遺伝
子である。
(V) プラスミドp h A W P −jの構築
(第1図)上記プラスミドp h A FXP −/を
シH1で消化(37℃、2時間)して得られる / / / Obp断片をS1ヌクレアーゼ処理しく3
7℃、30分)で得られる断片とプラスミドルエト−1
cをBamHI、S1ヌクレアーゼ、BAP処理して得
られる。断片とをT≠DNAリガーゼで連結してphA
PE−3を得る。
(第1図)上記プラスミドp h A FXP −/を
シH1で消化(37℃、2時間)して得られる / / / Obp断片をS1ヌクレアーゼ処理しく3
7℃、30分)で得られる断片とプラスミドルエト−1
cをBamHI、S1ヌクレアーゼ、BAP処理して得
られる。断片とをT≠DNAリガーゼで連結してphA
PE−3を得る。
(vD プラスミドphAPE−4’の構築(第r図
)プラスミドpUcI (Gene /9 Jjり(l
りt、2)参照)を制限酵素上R1、独旧で消化しく3
7℃、2時間)、さらにBAP処理後、ついで、第を図
に示す合成リンカ−と、T≠DNAリガーゼの存在下で
連結させ(37℃、l≠時間)pUclrxbaヲ4る
。ついでこれを匹旧 テ消化しく37℃、2時間)、B
AP処理して得られる断片と、BamHlでプラスミド
phAMF−/を消化して得られる/100bp断片と
をT4I)NjlJガーゼを用いて連結し、p U C
−h A K P −/を得る。
)プラスミドpUcI (Gene /9 Jjり(l
りt、2)参照)を制限酵素上R1、独旧で消化しく3
7℃、2時間)、さらにBAP処理後、ついで、第を図
に示す合成リンカ−と、T≠DNAリガーゼの存在下で
連結させ(37℃、l≠時間)pUclrxbaヲ4る
。ついでこれを匹旧 テ消化しく37℃、2時間)、B
AP処理して得られる断片と、BamHlでプラスミド
phAMF−/を消化して得られる/100bp断片と
をT4I)NjlJガーゼを用いて連結し、p U C
−h A K P −/を得る。
さらにこれを制限酵素Xba [、Hlnd 1で消化
しく37℃、2時間)、約1100bpのフラグメント
を得、これを、プラスミドル工NllB1の兜I、抛a
i部位間に挿入してphAPIn−≠を得た。
しく37℃、2時間)、約1100bpのフラグメント
を得、これを、プラスミドル工NllB1の兜I、抛a
i部位間に挿入してphAPIn−≠を得た。
b)蛋白の産生
本発明に係るDNA断片を含有する上記プラスミドp
h A K P−2、p h A E P −J及びp
hAEP−≠を用いて大腸菌EBYO/を形質転換し、
得られる形質°転換株をMターOA培地で培養すること
により、蛋白を産生させた。電気泳動によりヒトアポリ
ボプロティンE様蛋白の産生が確認された。
h A K P−2、p h A E P −J及びp
hAEP−≠を用いて大腸菌EBYO/を形質転換し、
得られる形質°転換株をMターOA培地で培養すること
により、蛋白を産生させた。電気泳動によりヒトアポリ
ボプロティンE様蛋白の産生が確認された。
第1図は本発明に係るDNA断片が挿入され係るDNA
断片の塩基配列及びそれより想定されるアミノ酸配列を
示す。 第3〜r図は、それぞれプラスミドphAPK。 phAPK /%p工N−tac1phAI’Fi−
λ、phAI’に−J、phAPK−参の構築工程の概
略図である。 図面のj’T’T71r’”′″−+:)4H更なし)
第2図 (キの1) AGG GCG CTG ATG GACGA
G ACに Al(j ハハtjシバし 11(
Val Thr Phe Leu Ala Gly
Cys Gln AlaGTCACA TTCCTG
GCA GGA TGCCAG GCCPro Glu
Leu Arg Gln Gin Thr Glu
TrpCCCGAG CTG CGCCAG CA、G
ACCGAG TGGArg Phe Trp As
p Tyr Leu Arg Trp VatCGCT
TT TGG GAT TACCTG CGCTGG
GTGLeu Ser Ser Gln Vol
Thr Gln Glu LeuCTCAGCT
CCCAG GTCACCCAG GAA CTGLy
s Ala Tyr Lys Ser Glu Leu
Glu GluA八G へGCCTAC’ AAA
TCG GAA CTG GAG 044図面の
z’r’:’シ(内′、τにこチ更なlj図面の?−r
’芭(内゛、−:ミ二更なし)第 20 (1す3) Leu Gly Pro Leu Val Glu G
ln Gly Arg V(IICTG GGG CC
CCTG GTG GAA CAG GGCCGCGT
GGln Pro Leu Gln Glu Arg
Ala Gin A10 TrpCAG CCG CT
A、CAG GAG CGG GCCCAG GCCT
GGAla Lys Leu Glu Glu Gln
Ala Gln Gln l1eGCCAAG CT
G GAG GAG CAG GCCCAG CAG
ATALeu Lys Ser Trp Phe Gl
u Pro Leu Val GluCTCAAG A
GCTGG TTCGAG CCCCTG GTG G
AAArg Ala Ala Thr Val Gl
y Ser Leu Alc+ GlyCGG GCC
GCCACT GTG GGCTCCCTG GCCG
GCGly Glu、 A−rg Leu Arg A
la Arg Met Glu GluGGCGAG
CGG CTG CGCGCG CGG ATG GA
G GAGArg Leu Gln AIc+ Glu
Ala Phe Gln Ala ArgCGCCT
G CAG GCCGAG GCCTTCCAG GC
CCGCAsp Met Gln Arg Gln T
rp Ala Gly Leu ValGACATG
CAG CGCCAG TGG GCCGGG CTG
GTGy、s図 プラスミド′ プラ
ス之ドヘ勺700θbpFIST バー
k 勺600Obp Ivrた第 6図 phAEP−/ plN−及C第
1図 phAEP−1plN−tac 図面の浄芭(内容に変更なし) 昂8図(”ter)I ) 1紐HI pLlc−hAEp−1
断片の塩基配列及びそれより想定されるアミノ酸配列を
示す。 第3〜r図は、それぞれプラスミドphAPK。 phAPK /%p工N−tac1phAI’Fi−
λ、phAI’に−J、phAPK−参の構築工程の概
略図である。 図面のj’T’T71r’”′″−+:)4H更なし)
第2図 (キの1) AGG GCG CTG ATG GACGA
G ACに Al(j ハハtjシバし 11(
Val Thr Phe Leu Ala Gly
Cys Gln AlaGTCACA TTCCTG
GCA GGA TGCCAG GCCPro Glu
Leu Arg Gln Gin Thr Glu
TrpCCCGAG CTG CGCCAG CA、G
ACCGAG TGGArg Phe Trp As
p Tyr Leu Arg Trp VatCGCT
TT TGG GAT TACCTG CGCTGG
GTGLeu Ser Ser Gln Vol
Thr Gln Glu LeuCTCAGCT
CCCAG GTCACCCAG GAA CTGLy
s Ala Tyr Lys Ser Glu Leu
Glu GluA八G へGCCTAC’ AAA
TCG GAA CTG GAG 044図面の
z’r’:’シ(内′、τにこチ更なlj図面の?−r
’芭(内゛、−:ミ二更なし)第 20 (1す3) Leu Gly Pro Leu Val Glu G
ln Gly Arg V(IICTG GGG CC
CCTG GTG GAA CAG GGCCGCGT
GGln Pro Leu Gln Glu Arg
Ala Gin A10 TrpCAG CCG CT
A、CAG GAG CGG GCCCAG GCCT
GGAla Lys Leu Glu Glu Gln
Ala Gln Gln l1eGCCAAG CT
G GAG GAG CAG GCCCAG CAG
ATALeu Lys Ser Trp Phe Gl
u Pro Leu Val GluCTCAAG A
GCTGG TTCGAG CCCCTG GTG G
AAArg Ala Ala Thr Val Gl
y Ser Leu Alc+ GlyCGG GCC
GCCACT GTG GGCTCCCTG GCCG
GCGly Glu、 A−rg Leu Arg A
la Arg Met Glu GluGGCGAG
CGG CTG CGCGCG CGG ATG GA
G GAGArg Leu Gln AIc+ Glu
Ala Phe Gln Ala ArgCGCCT
G CAG GCCGAG GCCTTCCAG GC
CCGCAsp Met Gln Arg Gln T
rp Ala Gly Leu ValGACATG
CAG CGCCAG TGG GCCGGG CTG
GTGy、s図 プラスミド′ プラ
ス之ドヘ勺700θbpFIST バー
k 勺600Obp Ivrた第 6図 phAEP−/ plN−及C第
1図 phAEP−1plN−tac 図面の浄芭(内容に変更なし) 昂8図(”ter)I ) 1紐HI pLlc−hAEp−1
Claims (6)
- (1)ヒトアポリポプロテインB又はそれと同様の生理
活性を有するヒトアポリポプロテインE様物質をコード
するDNAを含有するDNA断片を、発現用ベクターの
プロモータの下流に存在するクローニング部位に導入し
、ついで上記DNA断片を導入したベクターを宿主微生
物に導入して同宿主を培養し、産生する蛋白を取得する
ことを特徴とするヒトアポリポプロテインE様蛋白の産
生方法。 - (2)プロモータがlac I により調節可能なもので
あることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法
。 - (3)プロモータがリポプロテイン遺伝子のプロモータ
又は¥tac¥プロモータであることを特徴とする特許
請求の範囲第2項記載の方法。 - (4)クローニング部位が翻訳開始部位の直前に存在す
るBamH I 部位であることを特徴とする特許請求の
範囲第1項記載の方法。 - (5)宿主微生物が大腸菌であることを特徴とする特許
請求の範囲第1項記載の方法。 - (6)ヒトアポリポプロテインがヒトアポリポプロテイ
ンE3であることを特徴とする特許請求の範囲第1項記
載の方法。
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59216987A JP2546820B2 (ja) | 1984-10-16 | 1984-10-16 | ヒトアポリポプロテインe様蛋白の産生方法 |
AU47513/85A AU587989B2 (en) | 1984-10-16 | 1985-09-17 | DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins |
CA000491878A CA1284774C (en) | 1984-10-16 | 1985-09-30 | Dna fragments, expression vectors, hosts and process for production of apolipoprotein e |
DK467385A DK467385A (da) | 1984-10-16 | 1985-10-11 | Dna-fragmenter |
EP85402014A EP0205715B1 (en) | 1984-10-16 | 1985-10-16 | Dna fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins |
DE8585402014T DE3585953D1 (de) | 1984-10-16 | 1985-10-16 | Dna-fragmente, expressionsvektoren, proteine, wirte und verfahren zur herstellung der proteine. |
US07/288,470 US5116739A (en) | 1984-10-16 | 1988-12-22 | Process for the production of human apolipoprotein e, and transformed hosts and products thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59216987A JP2546820B2 (ja) | 1984-10-16 | 1984-10-16 | ヒトアポリポプロテインe様蛋白の産生方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6196997A true JPS6196997A (ja) | 1986-05-15 |
JP2546820B2 JP2546820B2 (ja) | 1996-10-23 |
Family
ID=16697038
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59216987A Expired - Lifetime JP2546820B2 (ja) | 1984-10-16 | 1984-10-16 | ヒトアポリポプロテインe様蛋白の産生方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2546820B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017534255A (ja) * | 2014-09-12 | 2017-11-24 | ホワイトヘッド インスティテュート フォー バイオメディカル リサーチ | アポリポタンパク質eを発現する細胞及びその使用 |
-
1984
- 1984-10-16 JP JP59216987A patent/JP2546820B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
ARTERIOSCLEROSIS=1984 * |
BOL,CELL,BIOL=1982 * |
J.BIOL.CHEM=1982 * |
J.BIOL.NATL.ACAD.SCI.USA=1983 * |
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1982 * |
MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY=1982 * |
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE USA=1983 * |
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1982 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017534255A (ja) * | 2014-09-12 | 2017-11-24 | ホワイトヘッド インスティテュート フォー バイオメディカル リサーチ | アポリポタンパク質eを発現する細胞及びその使用 |
US11261453B2 (en) | 2014-09-12 | 2022-03-01 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Cells expressing apolipoprotein E and uses thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2546820B2 (ja) | 1996-10-23 |
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