JPS6196997A - ヒトアポリポプロテインｅ様蛋白の産生方法 - Google Patents
ヒトアポリポプロテインｅ様蛋白の産生方法Info
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- JPS6196997A JPS6196997A JP59216987A JP21698784A JPS6196997A JP S6196997 A JPS6196997 A JP S6196997A JP 59216987 A JP59216987 A JP 59216987A JP 21698784 A JP21698784 A JP 21698784A JP S6196997 A JPS6196997 A JP S6196997A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、組換えＤＮＡ技術によるヒトアポリポプロテ
ィ７ Ｅ （Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ］！ｉ
）様蛋白の微生物学的産生方法に関する。
ィ７ Ｅ （Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ］！ｉ
）様蛋白の微生物学的産生方法に関する。
（従来の技術）
血漿中に存在する主要な脂質としては、コレステロール
、リン脂質、トリグリセリド及び遊離脂肪酸が挙げられ
るが、このうちの前三者は蛋白と結合して存在する。水
に不溶の脂質が可溶化されたこの脂質−蛋白複合体はリ
ポ蛋白と呼ばれ、脂質と蛋白の割合により、種々の重さ
のものを形成する。このリポ蛋白は、球形粒子状の構造
をなし、中核部分に極性のないトリグリセリド、コレス
テロールエステルが存在シ、極性のあるリン脂質、遊離
コレステロールが蛋白とともに表層を形成すると考えら
れている。
、リン脂質、トリグリセリド及び遊離脂肪酸が挙げられ
るが、このうちの前三者は蛋白と結合して存在する。水
に不溶の脂質が可溶化されたこの脂質−蛋白複合体はリ
ポ蛋白と呼ばれ、脂質と蛋白の割合により、種々の重さ
のものを形成する。このリポ蛋白は、球形粒子状の構造
をなし、中核部分に極性のないトリグリセリド、コレス
テロールエステルが存在シ、極性のあるリン脂質、遊離
コレステロールが蛋白とともに表層を形成すると考えら
れている。
このリボ蛋白中に含まれる蛋白は、アポリボプロティン
と呼ばれ、現在ＩＯ種類以上が知られている。アポリポ
プロティンは、リボ蛋白を構成するのに必要であるばか
りでなく、リボ蛋白の代謝においても重要な役割を果た
す。このアポリポプロティンのひとつとして、アポリポ
プロティンＥが知られている。そしてこのアポリポプロ
ティンＥは体内の諸細胞がレセプターを介してリボ蛋白
をとり込む場合に、認識標となることが知られている。
と呼ばれ、現在ＩＯ種類以上が知られている。アポリポ
プロティンは、リボ蛋白を構成するのに必要であるばか
りでなく、リボ蛋白の代謝においても重要な役割を果た
す。このアポリポプロティンのひとつとして、アポリポ
プロティンＥが知られている。そしてこのアポリポプロ
ティンＥは体内の諸細胞がレセプターを介してリボ蛋白
をとり込む場合に、認識標となることが知られている。
さらに、このアポリポプロティンＥの主要なサブクラス
としてＫＪ、Ｅ３、ｚ４Ａが見出されておシ、Ｅ３が正
常人由来であるのに対し、Ｅλ及びｉｐは■型窩脂血症
の患者から見出され、非正常型であると考えられている
（ Ｔ）１６ Ｊｏｕｒ−ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 Ｖｏｌ、２ ！
ｊ 。
としてＫＪ、Ｅ３、ｚ４Ａが見出されておシ、Ｅ３が正
常人由来であるのに対し、Ｅλ及びｉｐは■型窩脂血症
の患者から見出され、非正常型であると考えられている
（ Ｔ）１６ Ｊｏｕｒ−ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 Ｖｏｌ、２ ！
ｊ 。
Ａｊ、／７！ター／ｍ、／り１０）。
このアポリポプロティンＥ３を欠植するが、又はＥコも
しくはＥμを有する人は、高脂血症になシ、さらに動脈
硬化に至る場合が多い。
しくはＥμを有する人は、高脂血症になシ、さらに動脈
硬化に至る場合が多い。
このような場合、患者に正常なＥ３を投与することによ
り、正常なアポリボプロティン凡の機能を回復させるこ
とができる。
り、正常なアポリボプロティン凡の機能を回復させるこ
とができる。
このアポリポプロティンＥを遺伝子工学的手法によシ得
るために、アポリポプロティンＥをコードするＤＮＡが
必要となる。しかしながら完全なアポリポプロティンＥ
を得るために必要な完全長のｃＤＮＡ断片は、いまだに
得られていなかった。
るために、アポリポプロティンＥをコードするＤＮＡが
必要となる。しかしながら完全なアポリポプロティンＥ
を得るために必要な完全長のｃＤＮＡ断片は、いまだに
得られていなかった。
本発明者らは、先に、上記完全長ｃＤＮＡ断片を得（％
願昭５？−ムｉり１０参照）、今般、これを用いてアポ
リポプロティンＥを産生ずる本発明方法に到達した。
願昭５？−ムｉり１０参照）、今般、これを用いてアポ
リポプロティンＥを産生ずる本発明方法に到達した。
すなわち、本発明の要旨は、ヒトアポリボプロティンＥ
又はそれと同様の生理活性を有するヒトアポリボプロテ
ィンＥ様物質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片
を発現用ベクターのプロモータの下流に存在するクロー
ニング部位に導入し、ついで上記ＤＮＡ断片を導入した
ベクターを宿・主微生物に導入して同宿主を培養し、産
生ずる蛋白を取−得することを特徴とするも ヒトアボリ□ボブロチインＥ様蛋白の産穣方法にある。
又はそれと同様の生理活性を有するヒトアポリボプロテ
ィンＥ様物質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片
を発現用ベクターのプロモータの下流に存在するクロー
ニング部位に導入し、ついで上記ＤＮＡ断片を導入した
ベクターを宿・主微生物に導入して同宿主を培養し、産
生ずる蛋白を取−得することを特徴とするも ヒトアボリ□ボブロチインＥ様蛋白の産穣方法にある。
（発明の構成）
以下、本発明の詳細な説明する。
まず、本発明において用いるＩ）ＮＡ断片のヒトアポリ
ボプロティンＥ３をコードするＤＮＡを含有するＤＩＮ
Ａ断片は、次のような方法によって調製される。すなわ
ち、ヒト肝臓切片、小腸上皮細胞、血液中のマクロファ
ージ又は腎臓切片等をグアジニルチオシアネートととも
にホモジナイズし、（６ａｌ平衡密度勾配超遠心によっ
て全ＲＮＡを分離する（ Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏ
−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ／ ｒ 、 ｊＪ Ｙ４Ｌ
−ｊｊタタ、ｌり７り）。
ボプロティンＥ３をコードするＤＮＡを含有するＤＩＮ
Ａ断片は、次のような方法によって調製される。すなわ
ち、ヒト肝臓切片、小腸上皮細胞、血液中のマクロファ
ージ又は腎臓切片等をグアジニルチオシアネートととも
にホモジナイズし、（６ａｌ平衡密度勾配超遠心によっ
て全ＲＮＡを分離する（ Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏ
−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ／ ｒ 、 ｊＪ Ｙ４Ｌ
−ｊｊタタ、ｌり７り）。
ついで、常法によシこれをオリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラムクロマトグラフィーで精製し、ポリ（Ａ）含有ＲＮ
Ａを単離する（ ｍ ＲＮ Ａ原料）。
ラムクロマトグラフィーで精製し、ポリ（Ａ）含有ＲＮ
Ａを単離する（ ｍ ＲＮ Ａ原料）。
（Ｍｏ１ｅｃｕ１ａｒ ａｎｄ（！ｅｌｌｕ’ｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ 、 ２ 、 ／ Ａ ／ −ｉ’ｙｏ
、ｉりｒ２）によって、ｃ Ｄ Ｎ Ａ ラ（）５ ’
）−を得□る。すなわち、ｐＢＲＪ２２とＳＶ弘０のハ
イブリッドプラスミドを用いて、ベクタープライマーと
オリゴ（ｄＧ）テールリンカ−を得る。
Ｂｉｏｌｏｇｙ 、 ２ 、 ／ Ａ ／ −ｉ’ｙｏ
、ｉりｒ２）によって、ｃ Ｄ Ｎ Ａ ラ（）５ ’
）−を得□る。すなわち、ｐＢＲＪ２２とＳＶ弘０のハ
イブリッドプラスミドを用いて、ベクタープライマーと
オリゴ（ｄＧ）テールリンカ−を得る。
このベクタープライマーと上記ｍＲ’ＮＡ共存下に逆転
写酵素を作用させてｃＤＭＡを合成し、その後制限酵素
Ｈ１ｎｄ Ｉで消化し、ついで上記リンカ−を用いて環
化させる。その後、ｍＲＮＡ部分をＤＮＡで置換して、
ｃＤＮＡ断片含有プラスミドを得る。
写酵素を作用させてｃＤＭＡを合成し、その後制限酵素
Ｈ１ｎｄ Ｉで消化し、ついで上記リンカ−を用いて環
化させる。その後、ｍＲＮＡ部分をＤＮＡで置換して、
ｃＤＮＡ断片含有プラスミドを得る。
ついで、常法によシ、これを用いて大腸菌（ｇｅｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）等をアンピシリン耐性に形
質転換する。その後、プローブとして、アポリボプロテ
ィン五のアミノ酸配列２／に一ハ―位 Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇ４ｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌ−７に対応する
塩基配列の一部もしくは全部を含む合成オリゴヌクレオ
チド又は少くとも該塩基配列を含む合成オリゴヌクレオ
チドを用いて、これと相補性のある配列を含むクローン
を選択する。こうして得られるクローン中よシ、適切な
制限酵素で切断して、最も長いｃＤＮＡが挿入されてい
るプラスミドを有するクローンを選択する。 ゛ そのクローンより得られるｃＤＮＡ断片は、Ｍａｚａｍ
とＧ１１ｂｅｒｔの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｋｎ
ｚｙ −ｍ０１０ｇ７． Ａ ｊ 、 ＩＡタター！ｔ
Ｏ，／９１０ ）によって塩基配列が決定される。
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）等をアンピシリン耐性に形
質転換する。その後、プローブとして、アポリボプロテ
ィン五のアミノ酸配列２／に一ハ―位 Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇ４ｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌ−７に対応する
塩基配列の一部もしくは全部を含む合成オリゴヌクレオ
チド又は少くとも該塩基配列を含む合成オリゴヌクレオ
チドを用いて、これと相補性のある配列を含むクローン
を選択する。こうして得られるクローン中よシ、適切な
制限酵素で切断して、最も長いｃＤＮＡが挿入されてい
るプラスミドを有するクローンを選択する。 ゛ そのクローンより得られるｃＤＮＡ断片は、Ｍａｚａｍ
とＧ１１ｂｅｒｔの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｋｎ
ｚｙ −ｍ０１０ｇ７． Ａ ｊ 、 ＩＡタター！ｔ
Ｏ，／９１０ ）によって塩基配列が決定される。
本発明方法において発現用ベクターのクローニング部位
に導入されるＤＮＡ断片は、アポリボプロティンＥ又は
アポリボプロティンＥと同様の生理活性を有するアポリ
ボプロティンＥ様物質をコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ断片である。その−例としてアポリボプロティンＥ
３をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片の塩基配列
及びそれから推定されるアミノ酸配列を躬２図に示すが
、本発明に係るＤＮＡ断片は必ずしもこれと同一の塩基
配列を有することを要求されず、該ＤＮＡ断片に含まれ
るＤＮＡによってコードされる物質が、アポリボプロテ
ィンＥと同様の生理活性を有するアポリボプロティンＥ
様物質であれば、該塩基配列の一部が置撲もしくは削除
され、又は塩基が付加された塩基配列であってもよい。
に導入されるＤＮＡ断片は、アポリボプロティンＥ又は
アポリボプロティンＥと同様の生理活性を有するアポリ
ボプロティンＥ様物質をコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ断片である。その−例としてアポリボプロティンＥ
３をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片の塩基配列
及びそれから推定されるアミノ酸配列を躬２図に示すが
、本発明に係るＤＮＡ断片は必ずしもこれと同一の塩基
配列を有することを要求されず、該ＤＮＡ断片に含まれ
るＤＮＡによってコードされる物質が、アポリボプロテ
ィンＥと同様の生理活性を有するアポリボプロティンＥ
様物質であれば、該塩基配列の一部が置撲もしくは削除
され、又は塩基が付加された塩基配列であってもよい。
なお、非正常型サブクラスＥ２又はＥ４（に対応するＤ
ＮＡ断片は、Ｅコ又はＥ≠を有する患者由来の肝臓切片
等を用いることにより、得ることができる。
ＮＡ断片は、Ｅコ又はＥ≠を有する患者由来の肝臓切片
等を用いることにより、得ることができる。
本発明方法において、上記ＤＮＡ断片は、発現ベクター
のプロモータの下流に存在するクローニング部位に導入
することによって、これを鋳型とする翻訳によシアボリ
ポプロテインＥ又はアポリボプロティンＥ様物質、ある
いはこれを含む融合蛋白を得ることができる。
のプロモータの下流に存在するクローニング部位に導入
することによって、これを鋳型とする翻訳によシアボリ
ポプロテインＥ又はアポリボプロティンＥ様物質、ある
いはこれを含む融合蛋白を得ることができる。
クローニング部位としては、目的とする異種遺伝子の直
接発現を可能とする制限酵素認誠部 “位が挙げら
れる。具体的には、翻訳開始コドンの直前におる抛旧部
位が好ましく、プロモータ下流にＢａｍ Ｈ１部位が存
在しないときには、合成リンカ−により同部位を形成で
きる。プロモータとしては・、／ａｃ １によシ調節可
能なものが好ましく、このようなプロモータとしては、
犬１）％Ｉの外膜蛋白の／フであるリボプロティンをコ
ードする遺伝子（ｌｐｐ ）のプロモータあるいは３１
プロモータと化プロモータとの融合型プロモータである
とプロモータ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ Ｎａｔｉ
ｏｎｌＬＩ Ａｃａｄｅｍｙ ５ｃｉｅｎｃｅ １
０ λ／（／りＪ’Ｊ）及び特開昭ｊ７−／２３弘２
７号公報参照））が好ましい。
接発現を可能とする制限酵素認誠部 “位が挙げら
れる。具体的には、翻訳開始コドンの直前におる抛旧部
位が好ましく、プロモータ下流にＢａｍ Ｈ１部位が存
在しないときには、合成リンカ−により同部位を形成で
きる。プロモータとしては・、／ａｃ １によシ調節可
能なものが好ましく、このようなプロモータとしては、
犬１）％Ｉの外膜蛋白の／フであるリボプロティンをコ
ードする遺伝子（ｌｐｐ ）のプロモータあるいは３１
プロモータと化プロモータとの融合型プロモータである
とプロモータ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ Ｎａｔｉ
ｏｎｌＬＩ Ａｃａｄｅｍｙ ５ｃｉｅｎｃｅ １
０ λ／（／りＪ’Ｊ）及び特開昭ｊ７−／２３弘２
７号公報参照））が好ましい。
宿主倣生物としては、通常大腸菌例えばＨＢ１０／、’
ＪＭ１０４等を用いることができ、培養、蛋白の取得は
常法により行うことができる。
ＪＭ１０４等を用いることができ、培養、蛋白の取得は
常法により行うことができる。
（発明の効果）
本発明方法によれば、ヒトアポリボプロティンＥ様蛋白
を効率よく表現させることができ、得られる蛋白（アポ
リボプロチインＥλ、Ｅ３又はＥ４Ｃなど）を抗原とし
て、常法により抗血清を得、これを用いてアポリボプロ
ティン正常型Ｅ３の欠損又は非正常型（Ｅ２、Ｅｌｌ）
の存在を検出できる。
を効率よく表現させることができ、得られる蛋白（アポ
リボプロチインＥλ、Ｅ３又はＥ４Ｃなど）を抗原とし
て、常法により抗血清を得、これを用いてアポリボプロ
ティン正常型Ｅ３の欠損又は非正常型（Ｅ２、Ｅｌｌ）
の存在を検出できる。
さらに、得られるアポリボプロティンＥＪｉ、抗高脂血
症剤、抗動脈硬化剤として用いることもできる。
症剤、抗動脈硬化剤として用いることもできる。
（実施例）
以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明するが
、本発明は、その要旨を茹えない限シ、以下の実施例に
よシ限定されない。
、本発明は、その要旨を茹えない限シ、以下の実施例に
よシ限定されない。
実施例／
Ａ、原料ＤＮＡ断片の調製
（１） ヒト肝臓切片を液体窒素で破砕した後グアニ
ジニウムチオシアネート水溶液を添加しホモジナイズし
た。得られたホモジネートを、Ｃ！ｈｉｒｇｗｉｎらの
方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 ／ ｒ 。
ジニウムチオシアネート水溶液を添加しホモジナイズし
た。得られたホモジネートを、Ｃ！ｈｉｒｇｗｉｎらの
方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 ／ ｒ 。
ｊ−タ≠−ｊコタダ、／り７り）に従って、環化セシウ
ム平衡密度勾配超遠心によって全ＲＮＡを分離した。つ
いで、常法によりこれをオリゴ（ａＴ）セルロースカラ
ムクロマトグラフィ−で精製し、ポ’） （Ａ）含有Ｒ
ＮＡを単離し。
ム平衡密度勾配超遠心によって全ＲＮＡを分離した。つ
いで、常法によりこれをオリゴ（ａＴ）セルロースカラ
ムクロマトグラフィ−で精製し、ポ’） （Ａ）含有Ｒ
ＮＡを単離し。
ｍＲＮＡ原料とした。
（２）一方、岡山とＥｌｅｒｇの方法（Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄ（１！ｅ１１ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
２． ／ ６／ −／ ７０ 、 ／ ９１２ ）によ
り、ｐＢＲｊλλとＢＶｌｉＯのハイブリッドプラスミ
ドを用いて、ベクタープライマーとオリゴ（ａＧ）テー
ルリンカ−を得た。すなわち、ｐＢＲ１２２とＳ Ｖ
４ｔＯ（？ ７７’ ユ＝ ７ト０，７ ／ −０，ｒ
、４ ）のハイブリッドプラスミドａＯＯμｔを、ウ
シ血清アルブミンを含む緩衝液中制限酵素Ｋｐｎ Ｉで
３７℃、φ時間消化した。
ａｒ ａｎｄ（１！ｅ１１ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
２． ／ ６／ −／ ７０ 、 ／ ９１２ ）によ
り、ｐＢＲｊλλとＢＶｌｉＯのハイブリッドプラスミ
ドを用いて、ベクタープライマーとオリゴ（ａＧ）テー
ルリンカ−を得た。すなわち、ｐＢＲ１２２とＳ Ｖ
４ｔＯ（？ ７７’ ユ＝ ７ト０，７ ／ −０，ｒ
、４ ）のハイブリッドプラスミドａＯＯμｔを、ウ
シ血清アルブミンを含む緩衝液中制限酵素Ｋｐｎ Ｉで
３７℃、φ時間消化した。
ついで、常法によりエタノール沈澱によってＤＮＡを回
収し、これをｄＴＴＰを含む緩衝液に溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを添加し
て、３７℃で３Ｑ分間反応させて、制限酵素Ｋｐｎ ｌ
の消化末端に約６０個のｄＴデテール付加させた後、エ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収した。ついで、このＤ
ＮＡをウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、％ｔｌｌ
限酵素Ｈｐａ ｌ拠よυ消化した（３７℃、５時間）。
収し、これをｄＴＴＰを含む緩衝液に溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを添加し
て、３７℃で３Ｑ分間反応させて、制限酵素Ｋｐｎ ｌ
の消化末端に約６０個のｄＴデテール付加させた後、エ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収した。ついで、このＤ
ＮＡをウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、％ｔｌｌ
限酵素Ｈｐａ ｌ拠よυ消化した（３７℃、５時間）。
大きい方のＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によ
り精製し、ガラスパウダー法（ＶＯｇｅｌｓｔｅｉｎら
、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
、Ｓ、Ａ、、 ７６ 、６／ｊ−Ｊ／り、ｌり７り）に
よって回収した。その後、このＤＮＡを０℃でオリゴ（
ｄＡ）セルロースカラムに付し、水で溶出させた後、エ
タノールで回収し、オリゴ（ｄＴ）テールを有するベク
タープライマーを得た。
り精製し、ガラスパウダー法（ＶＯｇｅｌｓｔｅｉｎら
、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
、Ｓ、Ａ、、 ７６ 、６／ｊ−Ｊ／り、ｌり７り）に
よって回収した。その後、このＤＮＡを０℃でオリゴ（
ｄＡ）セルロースカラムに付し、水で溶出させた後、エ
タノールで回収し、オリゴ（ｄＴ）テールを有するベク
タープライマーを得た。
他方、ｐＢＲＪ、２ｕとＳ Ｖ ４！ ０ （−ｗ ツ
ブユニット０．／り〜０．！ ２ ）とのハイブリッド
プラスミドｉｏｏμｆをウシ血清アルブミンを含む緩衝
液中で、制限酵素Ｐｅｔ Ｉにより消化し九（３７℃、
７時間中）。ついで、ＤＮＡを回収し、ｄＧＴＰを含む
緩衝液に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼを添加して、３７℃で２０分間反応さ
せ、約１０〜／ｊのｄＧデテール付加させた。回収した
ＤＮＡ１、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で制限酵
素Ｈ１ｎｄ Ｉによシ消化させ（３７℃、１時間）、つ
いでアガロースゲル（ｉ、ｒ％）電気泳動に付し、小さ
いオリゴ（ｄＧ）テールリンカ−ＤＮＡを抽出、回収し
た。
ブユニット０．／り〜０．！ ２ ）とのハイブリッド
プラスミドｉｏｏμｆをウシ血清アルブミンを含む緩衝
液中で、制限酵素Ｐｅｔ Ｉにより消化し九（３７℃、
７時間中）。ついで、ＤＮＡを回収し、ｄＧＴＰを含む
緩衝液に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼを添加して、３７℃で２０分間反応さ
せ、約１０〜／ｊのｄＧデテール付加させた。回収した
ＤＮＡ１、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で制限酵
素Ｈ１ｎｄ Ｉによシ消化させ（３７℃、１時間）、つ
いでアガロースゲル（ｉ、ｒ％）電気泳動に付し、小さ
いオリゴ（ｄＧ）テールリンカ−ＤＮＡを抽出、回収し
た。
１０ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙコ、／ｌ、／ −
／７０，１９１２ ）によシ、ｃＤＮＡライブラリーを
得た。
／７０，１９１２ ）によシ、ｃＤＮＡライブラリーを
得た。
すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣ！１ （ｐＨｒ、３）、Ｍｇ
Ｃ１，、ＫＯＩ、ジチオスレイトール、ｄＡＴＰ、ｔｉ
ＴＴＰ。
Ｃ１，、ＫＯＩ、ジチオスレイトール、ｄＡＴＰ、ｔｉ
ＴＴＰ。
ｄＧＴＰ及び（”Ｐ）ｄｃＴＰを含む水溶液に上記（１
）で得られたｍＲＮＡｊＯμ？と上記（２）で得られた
ベクタープライマー１０μｔを添加して、逆転写酵素の
存在下に３７℃、２０分間、反応させ、プラスミド−ｃ
Ｄ Ｎ Ａ ： ｍＲＮＡ１合成し、これをエタノー
ル沈澱しベレット状で回収した。このベレットをｃｏｃ
ｋ、、ジチオスレイトール、ポリ（Ａ）、（３２ｐ）ｄ
ＱＴＩ及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼを含有する緩衝液に溶解し、３７℃、ｉｏ分
間反応させ、末端あたりａ ｃＭｐの１０−ｌｊの残基
を付加させた。
）で得られたｍＲＮＡｊＯμ？と上記（２）で得られた
ベクタープライマー１０μｔを添加して、逆転写酵素の
存在下に３７℃、２０分間、反応させ、プラスミド−ｃ
Ｄ Ｎ Ａ ： ｍＲＮＡ１合成し、これをエタノー
ル沈澱しベレット状で回収した。このベレットをｃｏｃ
ｋ、、ジチオスレイトール、ポリ（Ａ）、（３２ｐ）ｄ
ＱＴＩ及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼを含有する緩衝液に溶解し、３７℃、ｉｏ分
間反応させ、末端あたりａ ｃＭｐの１０−ｌｊの残基
を付加させた。
ついで、回収したオリゴＣａｂ）テールプラスミド−ｃ
Ｄ Ｎ Ａ ： ｍ ＲＮ Ａを含有するベレットを
ウシ血清アルブミンを含む緩衝液に溶解し、制限酵素Ｈ
１ｎｄ Ｉで３７℃、７時間消化し、エタノール沈澱に
よシ、Ｈｌｎｄ Ｉ消化オリゴ（ａＣ）テールｃＤＮＡ
：ｍＲＮＡプラスミドを回収した。これ全前記（２）で
得られたオリゴ（ｄＧ）テールリンカ−ＤＮＡを含む緩
衝液に溶解し、６５℃、２分間インキュベートし、さら
にψλ℃、３０分間保持し、０℃に冷却した。ついで、
β−ＭＡＤにコチンアデニンジヌクレチド）存在下、大
腸菌（Ｅ。
Ｄ Ｎ Ａ ： ｍ ＲＮ Ａを含有するベレットを
ウシ血清アルブミンを含む緩衝液に溶解し、制限酵素Ｈ
１ｎｄ Ｉで３７℃、７時間消化し、エタノール沈澱に
よシ、Ｈｌｎｄ Ｉ消化オリゴ（ａＣ）テールｃＤＮＡ
：ｍＲＮＡプラスミドを回収した。これ全前記（２）で
得られたオリゴ（ｄＧ）テールリンカ−ＤＮＡを含む緩
衝液に溶解し、６５℃、２分間インキュベートし、さら
にψλ℃、３０分間保持し、０℃に冷却した。ついで、
β−ＭＡＤにコチンアデニンジヌクレチド）存在下、大
腸菌（Ｅ。
ｃｏｌｉ ） Ｄ ｋＪ Ａ ！Ｊ ｌｊ−セを加しテ
、−夜インキユペートした。その後、ｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ。
、−夜インキユペートした。その後、ｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ。
ｄＧＴＰ、ｄｃＴＰ、β−Ｎ ＡＤ、 Ｅ、ｃｏｌｉＤ
ＮＡリガーゼ、Ｅ、 ｃａｄｉ Ｄ Ｎ Ａポリメラー
ゼ及びＥ、ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈを添加して、この
混合物を７２℃、１時間、次いで室温で／時間インキュ
ベートした後、冷却し、反応を停止させ目的とするｃ
Ｄ Ｎ Ａ １ｅｆｔ片含有プラスミドを得た。
ＮＡリガーゼ、Ｅ、 ｃａｄｉ Ｄ Ｎ Ａポリメラー
ゼ及びＥ、ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈを添加して、この
混合物を７２℃、１時間、次いで室温で／時間インキュ
ベートした後、冷却し、反応を停止させ目的とするｃ
Ｄ Ｎ Ａ １ｅｆｔ片含有プラスミドを得た。
（４） ついで、このプラスミドを用いて常法により
、大腸菌（ム洩）ＨＢ１０／を形質転換させた。
、大腸菌（ム洩）ＨＢ１０／を形質転換させた。
その後、プローブとして、アポリポプロティンＥのアミ
ノ酸配列２／ｌ−２２２位Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍ
ｅｔ−Ｇｌｙに相当する参種類の合成オリゴヌクレオチ
ドｊ’ −０ＣＣＡＴ （ニ）ＴＣ！ （：）ＴＯ（！
ＡＴ−Ｊ’−６７、／りｔｏ）によってスクリーニング
を行ない、これと相補性のある配列を含むクローンを選
択した。約ｉｏｏ、ｏｏｏの形質転換体中、約５０個の
クローンが選択され、このうちの／ぴ個のクローンにつ
いて数称の制限酵素により処理し、そのうちの３つのク
ローンが共通の制限酵素認識部位をもつことが判明した
。
ノ酸配列２／ｌ−２２２位Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍ
ｅｔ−Ｇｌｙに相当する参種類の合成オリゴヌクレオチ
ドｊ’ −０ＣＣＡＴ （ニ）ＴＣ！ （：）ＴＯ（！
ＡＴ−Ｊ’−６７、／りｔｏ）によってスクリーニング
を行ない、これと相補性のある配列を含むクローンを選
択した。約ｉｏｏ、ｏｏｏの形質転換体中、約５０個の
クローンが選択され、このうちの／ぴ個のクローンにつ
いて数称の制限酵素により処理し、そのうちの３つのク
ローンが共通の制限酵素認識部位をもつことが判明した
。
そのうちで最も犬、きなりローンｐＹＡＦｉ１０を選択
し、このクローンの塩基配列をＭａｚａｍとＧ１１ｂｅ
ｒｔの方法により決定した。
し、このクローンの塩基配列をＭａｚａｍとＧ１１ｂｅ
ｒｔの方法により決定した。
第１図は上記クローンの塩基配列決定のために作成した
制限酵素切断地図を示す（ＡＴ片の塩基配列及びそれよ
り想定されるアミノ酸配列を示す（アミノ酸残基数：３
／７）。
制限酵素切断地図を示す（ＡＴ片の塩基配列及びそれよ
り想定されるアミノ酸配列を示す（アミノ酸残基数：３
／７）。
このＤＮＡ断片は、正常人由来のアポリポプロティンＥ
３に相当する。
３に相当する。
Ｂ、ヒトアポリポプロテインＢ様蛋白の産生（３７℃、
２時間）、／、７ ｋｌ）の断片を得る。ついでＢａｔ
ｊ ／で処理しく３７℃、ｌＪｒ分）、ついで肋！旧
リンカ−をＴ≠（３７℃、２時間）汐、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２を抛旧消化（３７℃、２時間）及びＢ、 Ａ、
Ｐ処理（３７℃、１時間）して得られる断片とＴ≠ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結する（ｌ≠℃、１６時間）。つ
いで、大腸菌ＨＢ１０／を形資転換し、形質転換株より
プラスミドｐｈＡＰＥを得た（第３図）。
２時間）、／、７ ｋｌ）の断片を得る。ついでＢａｔ
ｊ ／で処理しく３７℃、ｌＪｒ分）、ついで肋！旧
リンカ−をＴ≠（３７℃、２時間）汐、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２を抛旧消化（３７℃、２時間）及びＢ、 Ａ、
Ｐ処理（３７℃、１時間）して得られる断片とＴ≠ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結する（ｌ≠℃、１６時間）。つ
いで、大腸菌ＨＢ１０／を形資転換し、形質転換株より
プラスミドｐｈＡＰＥを得た（第３図）。
（１１） プラスミドｐ ｈ Ａ Ｐ ＦＸ−／の構
築（第弘図）上記プラスミドｐｈＡＰＥを、制限酵素Ｆ
ｏｋ Ｉで消化しく３７℃、２時間）、６１２ｂｐ断片
を得、合成り Ｎ Ａ、リンカ−ｏｋ １ ↓ をＴｆＤＮＡＩ７ガーゼの存在下に連結しくｔ℃、１６
時間）、制限酵素にミ旧、８ｏｃ Ｍで消化しく３７℃
、２時間）、Ｊ７７ｂｐ断片を得る。
築（第弘図）上記プラスミドｐｈＡＰＥを、制限酵素Ｆ
ｏｋ Ｉで消化しく３７℃、２時間）、６１２ｂｐ断片
を得、合成り Ｎ Ａ、リンカ−ｏｋ １ ↓ をＴｆＤＮＡＩ７ガーゼの存在下に連結しくｔ℃、１６
時間）、制限酵素にミ旧、８ｏｃ Ｍで消化しく３７℃
、２時間）、Ｊ７７ｂｐ断片を得る。
一方、上記プラスミドｐｈＡＰＥを制限酵素性ｌ、シＨ
１で消化しく３７℃、２時間）、＆ｒＯｂｐ断片を得る
。ついで、この２つの断片をＴψＤＮＡリガーゼで連結
しく／４！’Ｃ１ｆ時間）、さらＫ Ｂａｍ Ｈｌ テ
ｆｆｉ化して約１０！Ｏｂｐ断片を得た。他方、プラス
ミドｐ Ｂ ＲＪ ＪコをＢａｍ ＨＩで消化しく３７
℃、２時間）、ＢＡＰで処理し、ついで上記約１０！Ｏ
ｂｐ断片を導入してプラスミドｐ ｈ Ａ Ｐ Ｗ−り
を得た。
１で消化しく３７℃、２時間）、＆ｒＯｂｐ断片を得る
。ついで、この２つの断片をＴψＤＮＡリガーゼで連結
しく／４！’Ｃ１ｆ時間）、さらＫ Ｂａｍ Ｈｌ テ
ｆｆｉ化して約１０！Ｏｂｐ断片を得た。他方、プラス
ミドｐ Ｂ ＲＪ ＪコをＢａｍ ＨＩで消化しく３７
℃、２時間）、ＢＡＰで処理し、ついで上記約１０！Ｏ
ｂｐ断片を導入してプラスミドｐ ｈ Ａ Ｐ Ｗ−り
を得た。
（ｉｉＤ プラスミドル工Ｎ−ｔａｃの構築（第５図
）プラスミドル工Ｎ−頁一〇 （Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａ１Ｍｌ！ＬｎｉｐｕｌａｔｉＯｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ＦＪｘｐｒｅｓｅｌｏｎ、 Ｅｄｉｔｅｄｂｙ Ｍ、■
ｎｏｕｙｅ 、 ／ ９１ Ｊ 、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｅｅ 。
）プラスミドル工Ｎ−頁一〇 （Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａ１Ｍｌ！ＬｎｉｐｕｌａｔｉＯｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ＦＪｘｐｒｅｓｅｌｏｎ、 Ｅｄｉｔｅｄｂｙ Ｍ、■
ｎｏｕｙｅ 、 ／ ９１ Ｊ 、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｅｅ 。
ｐ／ｊ参照、下記プラスミドル工Ｎｌｌｌ３１も同様）
を制限酵素Ａａｔｌｌ、ＢａｍＨＩで消化しく３７℃、
２時間）、約７０００ｂｐの断片を得る。一方、プラス
ミドｐＤＲｊｌ１０（Ｐ、−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ よシ入手可能）を制限酵素ｐ些■、ＢａｍＨＩ
で消化しく３７℃、２時間）約１００ ｂｐ断片を得る
。ついで、この二つの断片をＴ≠ＤＮＡリガーゼで連結
しく７μ℃、／ダ時間）、プラスミドル工Ｎ−ｊ；ａＣ
を得た。
を制限酵素Ａａｔｌｌ、ＢａｍＨＩで消化しく３７℃、
２時間）、約７０００ｂｐの断片を得る。一方、プラス
ミドｐＤＲｊｌ１０（Ｐ、−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ よシ入手可能）を制限酵素ｐ些■、ＢａｍＨＩ
で消化しく３７℃、２時間）約１００ ｂｐ断片を得る
。ついで、この二つの断片をＴ≠ＤＮＡリガーゼで連結
しく７μ℃、／ダ時間）、プラスミドル工Ｎ−ｊ；ａＣ
を得た。
（ｉｖ） プラスミドｐｈＡＫＰ−２の構築（第を図
）上記プラスミドｐ ｈ Ａ ’Ｅ Ｐ −／を制限酵
素ＢａｍＨＩで消化しく３７℃、２時間）、制限酵素Ｂ
ａｍＨ７消化及びＢＡＰ処理を行なったＰ工Ｎ−ｔａｃ
とＴ≠ＤＮＡリガーゼで連結して（／４４℃、／４Ｃ時
間）プラスミドｐｈＡｐｐ−２を得た。なお、第６図中
のＱａ ＩＱ遺伝子はｌ！ａｃＩを大量に生産する遺伝
子である。
）上記プラスミドｐ ｈ Ａ ’Ｅ Ｐ −／を制限酵
素ＢａｍＨＩで消化しく３７℃、２時間）、制限酵素Ｂ
ａｍＨ７消化及びＢＡＰ処理を行なったＰ工Ｎ−ｔａｃ
とＴ≠ＤＮＡリガーゼで連結して（／４４℃、／４Ｃ時
間）プラスミドｐｈＡｐｐ−２を得た。なお、第６図中
のＱａ ＩＱ遺伝子はｌ！ａｃＩを大量に生産する遺伝
子である。
（Ｖ） プラスミドｐ ｈ Ａ Ｗ Ｐ −ｊの構築
（第１図）上記プラスミドｐ ｈ Ａ ＦＸＰ −／を
シＨ１で消化（３７℃、２時間）して得られる ／ ／ ／ Ｏｂｐ断片をＳ１ヌクレアーゼ処理しく３
７℃、３０分）で得られる断片とプラスミドルエト−１
ｃをＢａｍＨＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＢＡＰ処理して得
られる。断片とをＴ≠ＤＮＡリガーゼで連結してｐｈＡ
ＰＥ−３を得る。
（第１図）上記プラスミドｐ ｈ Ａ ＦＸＰ −／を
シＨ１で消化（３７℃、２時間）して得られる ／ ／ ／ Ｏｂｐ断片をＳ１ヌクレアーゼ処理しく３
７℃、３０分）で得られる断片とプラスミドルエト−１
ｃをＢａｍＨＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＢＡＰ処理して得
られる。断片とをＴ≠ＤＮＡリガーゼで連結してｐｈＡ
ＰＥ−３を得る。
（ｖＤ プラスミドｐｈＡＰＥ−４’の構築（第ｒ図
）プラスミドｐＵｃＩ （Ｇｅｎｅ ／９ Ｊｊり（ｌ
りｔ、２）参照）を制限酵素上Ｒ１、独旧で消化しく３
７℃、２時間）、さらにＢＡＰ処理後、ついで、第を図
に示す合成リンカ−と、Ｔ≠ＤＮＡリガーゼの存在下で
連結させ（３７℃、ｌ≠時間）ｐＵｃｌｒｘｂａヲ４る
。ついでこれを匹旧 テ消化しく３７℃、２時間）、Ｂ
ＡＰ処理して得られる断片と、ＢａｍＨｌでプラスミド
ｐｈＡＭＦ−／を消化して得られる／１００ｂｐ断片と
をＴ４Ｉ）ＮｊｌＪガーゼを用いて連結し、ｐ Ｕ Ｃ
−ｈ Ａ Ｋ Ｐ −／を得る。
）プラスミドｐＵｃＩ （Ｇｅｎｅ ／９ Ｊｊり（ｌ
りｔ、２）参照）を制限酵素上Ｒ１、独旧で消化しく３
７℃、２時間）、さらにＢＡＰ処理後、ついで、第を図
に示す合成リンカ−と、Ｔ≠ＤＮＡリガーゼの存在下で
連結させ（３７℃、ｌ≠時間）ｐＵｃｌｒｘｂａヲ４る
。ついでこれを匹旧 テ消化しく３７℃、２時間）、Ｂ
ＡＰ処理して得られる断片と、ＢａｍＨｌでプラスミド
ｐｈＡＭＦ−／を消化して得られる／１００ｂｐ断片と
をＴ４Ｉ）ＮｊｌＪガーゼを用いて連結し、ｐ Ｕ Ｃ
−ｈ Ａ Ｋ Ｐ −／を得る。
さらにこれを制限酵素Ｘｂａ ［、Ｈｌｎｄ １で消化
しく３７℃、２時間）、約１１００ｂｐのフラグメント
を得、これを、プラスミドル工ＮｌｌＢ１の兜Ｉ、抛ａ
ｉ部位間に挿入してｐｈＡＰＩｎ−≠を得た。
しく３７℃、２時間）、約１１００ｂｐのフラグメント
を得、これを、プラスミドル工ＮｌｌＢ１の兜Ｉ、抛ａ
ｉ部位間に挿入してｐｈＡＰＩｎ−≠を得た。
ｂ）蛋白の産生
本発明に係るＤＮＡ断片を含有する上記プラスミドｐ
ｈ Ａ Ｋ Ｐ−２、ｐ ｈ Ａ Ｅ Ｐ −Ｊ及びｐ
ｈＡＥＰ−≠を用いて大腸菌ＥＢＹＯ／を形質転換し、
得られる形質°転換株をＭターＯＡ培地で培養すること
により、蛋白を産生させた。電気泳動によりヒトアポリ
ボプロティンＥ様蛋白の産生が確認された。
ｈ Ａ Ｋ Ｐ−２、ｐ ｈ Ａ Ｅ Ｐ −Ｊ及びｐ
ｈＡＥＰ−≠を用いて大腸菌ＥＢＹＯ／を形質転換し、
得られる形質°転換株をＭターＯＡ培地で培養すること
により、蛋白を産生させた。電気泳動によりヒトアポリ
ボプロティンＥ様蛋白の産生が確認された。
第１図は本発明に係るＤＮＡ断片が挿入され係るＤＮＡ
断片の塩基配列及びそれより想定されるアミノ酸配列を
示す。 第３〜ｒ図は、それぞれプラスミドｐｈＡＰＫ。 ｐｈＡＰＫ ／％ｐ工Ｎ−ｔａｃ１ｐｈＡＩ’Ｆｉ−
λ、ｐｈＡＩ’に−Ｊ、ｐｈＡＰＫ−参の構築工程の概
略図である。 図面のｊ’Ｔ’Ｔ７１ｒ’”′″−＋：）４Ｈ更なし）
第２図 （キの１） ＡＧＧ ＧＣＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ＧＡＣＧＡ
Ｇ ＡＣに Ａｌ（ｊ ハハｔｊシバし １１（
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ
Ｃｙｓ Ｇｌｎ ＡｌａＧＴＣＡＣＡ ＴＴＣＣＴＧ
ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣＣＡＧ ＧＣＣＰｒｏ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
ＴｒｐＣＣＣＧＡＧ ＣＴＧ ＣＧＣＣＡＧ ＣＡ、Ｇ
ＡＣＣＧＡＧ ＴＧＧＡｒｇ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ａｓ
ｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｒｐ ＶａｔＣＧＣＴ
ＴＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＴＡＣＣＴＧ ＣＧＣＴＧＧ
ＧＴＧＬｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｖｏｌ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ ＬｅｕＣＴＣＡＧＣＴ
ＣＣＣＡＧ ＧＴＣＡＣＣＣＡＧ ＧＡＡ ＣＴＧＬｙ
ｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ ＧｌｕＡ八Ｇ へＧＣＣＴＡＣ’ ＡＡＡ
ＴＣＧ ＧＡＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ０４４図面の
ｚ’ｒ’：’シ（内′、τにこチ更なｌｊ図面の？−ｒ
’芭（内゛、−：ミ二更なし）第 ２０ （１す３） Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｖ（ＩＩＣＴＧ ＧＧＧ ＣＣ
ＣＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＧＣＣＧＣＧＴ
ＧＧｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｇｉｎ Ａ１０ ＴｒｐＣＡＧ ＣＣＧ ＣＴ
Ａ、ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＧＧ ＧＣＣＣＡＧ ＧＣＣＴ
ＧＧＡｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｎ ｌ１ｅＧＣＣＡＡＧ ＣＴ
Ｇ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＣＣＣＡＧ ＣＡＧ
ＡＴＡＬｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ ＧｌｕＣＴＣＡＡＧ Ａ
ＧＣＴＧＧ ＴＴＣＧＡＧ ＣＣＣＣＴＧ ＧＴＧ Ｇ
ＡＡＡｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌｃ＋ ＧｌｙＣＧＧ ＧＣＣ
ＧＣＣＡＣＴ ＧＴＧ ＧＧＣＴＣＣＣＴＧ ＧＣＣＧ
ＧＣＧｌｙ Ｇｌｕ、 Ａ−ｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｌａ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ＧｌｕＧＧＣＧＡＧ
ＣＧＧ ＣＴＧ ＣＧＣＧＣＧ ＣＧＧ ＡＴＧ ＧＡ
Ｇ ＧＡＧＡｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ＡＩｃ＋ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ ＡｒｇＣＧＣＣＴ
Ｇ ＣＡＧ ＧＣＣＧＡＧ ＧＣＣＴＴＣＣＡＧ ＧＣ
ＣＣＧＣＡｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｔ
ｒｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ ＶａｌＧＡＣＡＴＧ
ＣＡＧ ＣＧＣＣＡＧ ＴＧＧ ＧＣＣＧＧＧ ＣＴＧ
ＧＴＧｙ、ｓ図 プラスミド′ プラ
ス之ドヘ勺７００θｂｐＦＩＳＴ バー
ｋ 勺６００Ｏｂｐ Ｉｖｒた第 ６図 ｐｈＡＥＰ−／ ｐｌＮ−及Ｃ第
１図 ｐｈＡＥＰ−１ｐｌＮ−ｔａｃ 図面の浄芭（内容に変更なし） 昂８図（”ｔｅｒ）Ｉ ） １紐ＨＩ ｐＬｌｃ−ｈＡＥｐ−１
断片の塩基配列及びそれより想定されるアミノ酸配列を
示す。 第３〜ｒ図は、それぞれプラスミドｐｈＡＰＫ。 ｐｈＡＰＫ ／％ｐ工Ｎ−ｔａｃ１ｐｈＡＩ’Ｆｉ−
λ、ｐｈＡＩ’に−Ｊ、ｐｈＡＰＫ−参の構築工程の概
略図である。 図面のｊ’Ｔ’Ｔ７１ｒ’”′″−＋：）４Ｈ更なし）
第２図 （キの１） ＡＧＧ ＧＣＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ＧＡＣＧＡ
Ｇ ＡＣに Ａｌ（ｊ ハハｔｊシバし １１（
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ
Ｃｙｓ Ｇｌｎ ＡｌａＧＴＣＡＣＡ ＴＴＣＣＴＧ
ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣＣＡＧ ＧＣＣＰｒｏ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
ＴｒｐＣＣＣＧＡＧ ＣＴＧ ＣＧＣＣＡＧ ＣＡ、Ｇ
ＡＣＣＧＡＧ ＴＧＧＡｒｇ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ａｓ
ｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｒｐ ＶａｔＣＧＣＴ
ＴＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＴＡＣＣＴＧ ＣＧＣＴＧＧ
ＧＴＧＬｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｖｏｌ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ ＬｅｕＣＴＣＡＧＣＴ
ＣＣＣＡＧ ＧＴＣＡＣＣＣＡＧ ＧＡＡ ＣＴＧＬｙ
ｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ ＧｌｕＡ八Ｇ へＧＣＣＴＡＣ’ ＡＡＡ
ＴＣＧ ＧＡＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ０４４図面の
ｚ’ｒ’：’シ（内′、τにこチ更なｌｊ図面の？−ｒ
’芭（内゛、−：ミ二更なし）第 ２０ （１す３） Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｖ（ＩＩＣＴＧ ＧＧＧ ＣＣ
ＣＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＧＣＣＧＣＧＴ
ＧＧｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｇｉｎ Ａ１０ ＴｒｐＣＡＧ ＣＣＧ ＣＴ
Ａ、ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＧＧ ＧＣＣＣＡＧ ＧＣＣＴ
ＧＧＡｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｎ ｌ１ｅＧＣＣＡＡＧ ＣＴ
Ｇ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＣＣＣＡＧ ＣＡＧ
ＡＴＡＬｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ ＧｌｕＣＴＣＡＡＧ Ａ
ＧＣＴＧＧ ＴＴＣＧＡＧ ＣＣＣＣＴＧ ＧＴＧ Ｇ
ＡＡＡｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌｃ＋ ＧｌｙＣＧＧ ＧＣＣ
ＧＣＣＡＣＴ ＧＴＧ ＧＧＣＴＣＣＣＴＧ ＧＣＣＧ
ＧＣＧｌｙ Ｇｌｕ、 Ａ−ｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｌａ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ＧｌｕＧＧＣＧＡＧ
ＣＧＧ ＣＴＧ ＣＧＣＧＣＧ ＣＧＧ ＡＴＧ ＧＡ
Ｇ ＧＡＧＡｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ＡＩｃ＋ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ ＡｒｇＣＧＣＣＴ
Ｇ ＣＡＧ ＧＣＣＧＡＧ ＧＣＣＴＴＣＣＡＧ ＧＣ
ＣＣＧＣＡｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｔ
ｒｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ ＶａｌＧＡＣＡＴＧ
ＣＡＧ ＣＧＣＣＡＧ ＴＧＧ ＧＣＣＧＧＧ ＣＴＧ
ＧＴＧｙ、ｓ図 プラスミド′ プラ
ス之ドヘ勺７００θｂｐＦＩＳＴ バー
ｋ 勺６００Ｏｂｐ Ｉｖｒた第 ６図 ｐｈＡＥＰ−／ ｐｌＮ−及Ｃ第
１図 ｐｈＡＥＰ−１ｐｌＮ−ｔａｃ 図面の浄芭（内容に変更なし） 昂８図（”ｔｅｒ）Ｉ ） １紐ＨＩ ｐＬｌｃ−ｈＡＥｐ−１
Claims (6)
- （１）ヒトアポリポプロテインＢ又はそれと同様の生理
活性を有するヒトアポリポプロテインＥ様物質をコード
するＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を、発現用ベクターの
プロモータの下流に存在するクローニング部位に導入し
、ついで上記ＤＮＡ断片を導入したベクターを宿主微生
物に導入して同宿主を培養し、産生する蛋白を取得する
ことを特徴とするヒトアポリポプロテインＥ様蛋白の産
生方法。 - （２）プロモータがｌａｃ I により調節可能なもので
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
。 - （３）プロモータがリポプロテイン遺伝子のプロモータ
又は￥ｔａｃ￥プロモータであることを特徴とする特許
請求の範囲第２項記載の方法。 - （４）クローニング部位が翻訳開始部位の直前に存在す
るＢａｍＨ I 部位であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法。 - （５）宿主微生物が大腸菌であることを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - （６）ヒトアポリポプロテインがヒトアポリポプロテイ
ンＥ３であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59216987A JP2546820B2 (ja) | 1984-10-16 | 1984-10-16 | ヒトアポリポプロテインｅ様蛋白の産生方法 |
| AU47513/85A AU587989B2 (en) | 1984-10-16 | 1985-09-17 | DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins |
| CA000491878A CA1284774C (en) | 1984-10-16 | 1985-09-30 | Dna fragments, expression vectors, hosts and process for production of apolipoprotein e |
| DK467385A DK467385A (da) | 1984-10-16 | 1985-10-11 | Dna-fragmenter |
| DE8585402014T DE3585953D1 (de) | 1984-10-16 | 1985-10-16 | Dna-fragmente, expressionsvektoren, proteine, wirte und verfahren zur herstellung der proteine. |
| EP85402014A EP0205715B1 (en) | 1984-10-16 | 1985-10-16 | Dna fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins |
| US07/288,470 US5116739A (en) | 1984-10-16 | 1988-12-22 | Process for the production of human apolipoprotein e, and transformed hosts and products thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59216987A JP2546820B2 (ja) | 1984-10-16 | 1984-10-16 | ヒトアポリポプロテインｅ様蛋白の産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6196997A true JPS6196997A (ja) | 1986-05-15 |
| JP2546820B2 JP2546820B2 (ja) | 1996-10-23 |
Family
ID=16697038
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59216987A Expired - Lifetime JP2546820B2 (ja) | 1984-10-16 | 1984-10-16 | ヒトアポリポプロテインｅ様蛋白の産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2546820B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017534255A (ja) * | 2014-09-12 | 2017-11-24 | ホワイトヘッド インスティテュート フォー バイオメディカル リサーチ | アポリポタンパク質ｅを発現する細胞及びその使用 |
-
1984
- 1984-10-16 JP JP59216987A patent/JP2546820B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| ARTERIOSCLEROSIS=1984 * |
| BOL,CELL,BIOL=1982 * |
| J.BIOL.CHEM=1982 * |
| J.BIOL.NATL.ACAD.SCI.USA=1983 * |
| JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1982 * |
| MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY=1982 * |
| PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE USA=1983 * |
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1982 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017534255A (ja) * | 2014-09-12 | 2017-11-24 | ホワイトヘッド インスティテュート フォー バイオメディカル リサーチ | アポリポタンパク質ｅを発現する細胞及びその使用 |
| US11261453B2 (en) | 2014-09-12 | 2022-03-01 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Cells expressing apolipoprotein E and uses thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2546820B2 (ja) | 1996-10-23 |
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