KR19990011970A - 포스포리불로키나제를 융합파트너로 이용하는 재조합 인간 부갑상선호르몬의 발현벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포스포리불로키나제(phosphoribulokinase)를 융합파트너로 이용하는 재조합 발현벡터 및 그를 이용한 인간 부갑상선호르몬의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 로도박터 스페어로이드스 (Rhodobacter sphaeroides)의 포스포리불로키나제 유전자 단편 혹은 그의 돌연변이체를 융합파트너로서 함유하는 L-arabinose 유도성 벡터에, 유로키나제 절단부위의 뉴클레오티드 서열을 포함한 인간 부갑상선호르몬의 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 발현벡터, 그로부터 형질전환된 재조합 미생물 및 전기 미생물을 L-arabinose가 첨가된 배지에서 배양함으로써 인간 부갑상선호르몬을 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제조된 재조합 인간 PTH는 천연형 인간 PTH의 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 L-arabinose로 발현을 유도함으로써, 천연형 인간 PTH가 지닌 활성을 그대로 유지하고 있는 재조합 인간 PTH를 정확한 유도 조절을 통하여 고수율로 제조할 수 있다.

Description

포스포리불로키나제(phosphoribulokinase)를 융합파트너로 이용하는 재조합 인부갑상선호르몬의 발현벡터
본 발명은 포스포리불로키나제(phosphoribulokinase)를 융합파트너로 이용하는 재조합 발현벡터 및 그를 이용한 인간 부갑상선호르몬의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 로도박터 스페어로이드스(Rhodobacter sphaeroides)의 포스포리불로키나제 유전자 단편 혹은 그의 돌연변이체를 융합파트너로서 함유하는 L-arabinose 유도성 벡터에, 유로키나제 절단부위의 뉴클레오티드 서열을 포함한 인간 부갑상선호르몬의 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 발현벡터, 그로부터 형질전환된 재조합 미생물 및 전기 미생물을 L-arabinose가 첨가된 배지에서 배양함으로써 인간 부갑상선호르몬을 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
골다공증 (osteoporosis)은 뼈의 질량이 정상인 경우보다 휠씬 더 많이 감소하여 뼈의 조직이 약해져서 작은 충격에도 쉽게 뼈가 부러지는 등의 부작용을 나타내는 질병이다. 의학, 생물학 등의 발전에 힘입어 노령 인구가 계속 증가하고 있어 골다공증 환자도 계속 늘어날 것이므로, 핵가족화 경향에 따라 혼자 사는 노인의 수가 점점 늘어나는 현 시점에서 골다공증은 커다란 사회문제로까지 대두되고 있다.
일반적으로, 정상적인 뼈 조직의 경우, 뼈조직을 파괴하는 세포인 골흡수세포(osteoclast)와 뼈조직을 생성하는 세포인 골생성세포(osteoblast)의 활성이 서로 균형을 이루어 항상 뼈조직을 개조(remodeling)하고 있다. 정상인의 경우에도 나이가 많아짐에 따라 골흡수세포의 기능이 골생성세포의 기능을 능가하게 되어, 골밀도의 전반적인 감소현상이 나타나는데, 골다공증 환자의 경우는 이러한 골흡수세포와 골생성세포간의 군형 파괴가 정상인에 비해 훨씬 더 심하다.
골흡수세포와 골생성세포간의 균형이 파괴되는 원인에 대하여는 명확하게 알려져 있지 않으나, 폐경기 이후의 여성들에게 많이 나타나는 타잎 1 골다공증의 경우에는 폐경후 나타나는 여성 호르몬인 에스트로젠(estrogen)의 분비감소에 그 원인이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 타잎 1 골다공증 치료에는 에스트로젠을 투여하고 있으나, 에스트로젠 투여시 유방암, 자궁내막암 등의 발병률이 높아지는 등의 부작용이 있어, 많은 환자들이 에스트로젠 사용을 꺼리고 있는 실정이다. 또한, 타잎 1 골다공증과는 다른 원인에 의해 발병되는 것으로 알려진 타잎 2 골다공증에는 에스트로젠의 사용으로 치료효과를 볼수도 없다.
전기 타잎 1 골다공증의 치료제인 에스트로젠이 지닌 단점을 보완하고, 에스트로젠으로 치료효과를 얻을 수 없는 타잎 2 골다공증의 치료제로, 골흡수 세포의 기능을 억제하여 뼈조직의 재흡수(resorption)를 저해하는 작용을 나타내는 칼시토닌(calcitonin)이 사용되고 있다. 그러나, 에스트로젠이나 칼시토닌 모두 이미 손실된 뼈질량을 증가시켜 주는 효과는 없고, 다만 골밀도가 더이상 감소하지 않도록 예방하는 기능만을 갖고 있기 때문에, 효과적인 골다공증 치료제로는 부적당하다.
따라서, 최근에는 부갑상선호르몬(parathyroid hormone: PTH)이 골밀도 감소의 예방 뿐만 아니라, 골밀도 증대 효과도 초래하며 그와 더불어 부작용이 보고된 바 없어, 골다공증의 우수한 치료제로서 주목받고 있다. 부갑상선호르몬은 부갑상선의 주세포에서 생성된 아미노산 115개로 구성된 preproPTH(preproparathyroid hormone)가 소포체를 거치면서 절단되어 아미노산 92개로 된 펩타이드 proPTH로 변형되고, 이어 골지(Golgi) 기관을 거치면서 또 다시 절단되어 아미노산 84개로 이루어진 성숙한(mature) PTH로 되는 일련의 과정을 거쳐 합성되고 혈중으로 분비된 다음, 표적기관인 뼈와 신장으로 이동되는데 분비된 다음의 반감기는 18분에 불과하다.
PTH는 골세포막의 Ca2+펌프를 활성화시켜 골액 내 CaHPO4를 외액으로 운반케함으로써, 수분 내에 혈중 Ca2+농도를 증가시킨다. 아울러, PTH가 계속 분비되면, 전기 호르몬이 이미 형성되어 있는 골흡수세포를 활성화시키고 골흡수세포의 신생도 자극하여 골생성세포의 활동을 일시적으로 억압함으로써, 골에의 Ca2+침착을 억제하고, Ca2+의 유리(release)를 촉진하여, 혈중으로의 Ca2+과 PO4 3-분비를 증가시키기도 한다. 한편, PTH는 혈중 Ca2+농도에 의한 되먹이기(feedback) 기전으로 분비가 조절된다. 즉, 혈중 Ca2+농도가 단시간내에 10% 감소하면 PTH의 분비는 2배로 증가하지만, 장기간에 걸치 Ca2+농도가 낮은 상황에서는 1%의 Ca2+농도 감소에 PTH의 분비는 2배로 늘어나는 강력한 되먹이기 기전으로 조절되고 있다. 이와 같은 PTH의 생체내 조절기능과는 달리, PTH를 외부에서 간헐적으로 소량씩 투여할 경우 골 형성을 촉진시키는 것으로 보고되djT는데(참조: Tam, C.S. et al., Endocrinology, 110:506-512(1982)), 이러한 골 형성 촉진기능이 바로 PTH를 골다공증 치료제로 이용할 수 있는 근거가 되고 있다. PTH의 골 형성 촉진기능에 대한 정확한 기전은 규명되어 있지 않았으나, 투여된 PTH에 의한 생체내 PTH 분비의 억제, 골형성세포에 대한 직접적인 기능 촉진, IGF-1(insulin-like growth factor-1) 또는 TGF-β(transforming growth factor-β) 등의 성장인자(growth factor)를 통한 간접적인 골형성 촉진 등의 가설들이 제시되고 있다.
그러나, 이러한 PTH를 이용하여 골다공증을 치료하기 위해서는 PTH를 장기간에 걸쳐 투여하는 것이 필요한데, 아직까지는 PTH의 대량 생산방법이 확립되어 있지 못하였으므로, 골다공증의 치료제의 실용화에 많은 어려움이 있었다. 이에, 본 발명자들은 유전공학적 기법을 이용한 재조합 미생물로부터 PTH를 대량 제조하려는 연구를 진행하면서, PTH 아미노 말단의 Ser-Val-Ser 아미노산 서열이 PTH의 생물학적 활성에 필수적인 인자로 알려져 있으므로, 단백질 발현의 숙주로 널리 사용되고 있는 대장균에서의 PTH 발현시 아미노 말단의 메티오닌 제거에 중점을 두었다.
재조합 단백질 발현의 숙주로 널리 사용되고 있는 대장균에는 발현 단백질의 아미노 말단의 번역개시 메티오닌을 제거하는 효소인 메티오닌 특이 아미노 펩티다제가 존재하고 있으나, 외래 단백질이 대장균내에서 대량으로 발현될 때에는 아미노 말단의 메티오닌이 제대로 제거되지 않는 경우가 종종 나타나고 있는데, 이러한 현상은 아미노 말단의 아미노산 서열이 생물학적 활성에 큰 영향을 미치는 PTH와 같은 단백질의 대장균 발현체계를 구축하고자 할 때에는 반드시 해결되어야 할 사항이다.
전술한 문제를 해결하기 위하여 주로 다음의 3가지 방법이 이용될 수 있다: 첫째는, 목적 단백질의 아미노 말단에 분비 tls호서열을 융합시킨 형태로 발현시킴으로써, 목적 단백질을 아미노 말단이 절단된(processing) 형태로 대장균의 페리플라즘(periplasm)이나 배양배지로 분비되게 하는 방법인데, 이 방법에는 세포내 활성을 이용하여 성숙된 단백질을 얻을 수 있다는 장점이 있으나, 발현 수율이 비교적 낮다는 단점이 있다. 둘째는, 목적 단백질을 대장균에서 단독 발현시켜, 아미노 말단에 메치오닌이 붙어 있는 상태로 대장균으로부터 분리한 다음, 이를 아미노 펩티다제로 절단하여 성숙한 단백질을 얻는 방법인데, 이 방법은 아미노 말단의 메치오닌이 제거된 단백질과 메치오닌이 부착된 단백질간의 분리 정제가 어렵기 때문에 단백질 정제 공정이 복잡하다는 단점을 가지고 있다. 셋째는, 목적 단백질을 다른 단백질과의 융합 형태로 발현시켜 융합단백질을 대장균으로부터 분리한 다음, 효소 또는 화학 물질을 이용하여 융합단백질로부터 융합된 파트너를 제거하여 성숙한 목적 단백질을 제조하는 방법인데, 이 방법은 아미노 말단의 메치오닌이 제거된 목적 단백질을 제공할 뿐만 아니라, 목적 단백질의 발현 효율도 증대시킨다는 장점을 지니고 있다.
한편, 융합단백질로부터 목적 단백질을 절단하는 방법은 화학 물질을 이용한 절단 방법과 효소를 이용한 절단 방법으로 크게 구분될 수 있다. 이중, 화학물질을 이용한 절단 방법은 값이 저렴한 화학 물질을 이용하므로 비용 절감의 장점을 갖고 있으나, 절단 부위에 대한 특이성이 낮아 절단시 목적 단백질 이외에 다양한 종류의 다른 부산물이 생성되기 때문에, 이들 부산물로부터 목적 단백질을 분리 및 정제하는 공정이 추가로 요구되는 단점을 갖고 있다. 이에 반하여, 효소를 이용한 절단 방법은 절단 부위에 대한 특이성이 우수하여 화학물질을 이용한 절단방법이 지니고 있는 문제점을 해결할 수 있으나, 사용하는 효소의 가격이 비싸므로 이 방법을 산업적 규모로 이용하는데에는 문제가 있다. 결국, 재조합 단백질의 대량 생산공정을 연구하고 있는 대부분의 연구자들은 융합단백질로부터 목적 단백질을 절단하기 위한 효소를 경제적으로 이용하려는 시도를 하여 왔다. 그러나, 이러한 목적으로 현재 개발되어 이용되고 있는 단백질 분해효소인 Factor Xa, 트롬빈, 엔테로키나제 등은 대량으로 수득하는 데에 한계가 있어, 효소를 이용한 절단 방법은 여러 가지 장점에도 불구하고 산업적 수준에서 널리 이용되지 못하고 있는 실wjd에 있다. 따라서, 효소를 이용한 절단 방법에 효율적으로 이용될 수 있는 보다 경제적으로 대량생산이 가능한 제 3의 효소가 절실히 요구되어 왔다. 혈전 용해제로 사용되고 있는 세린계 단백질 분해 효소인 유로키나제(two chain urokinase type plasminogen activator)의 경우, 대량 생산공정이 이미 개발되어 있으며, 특히 대장균과 같은 원핵생물의 발현 체계를 이용하여 활성이 있는 유로키나제를 대량 제조할수 있어(참조: W.E. Holmes et al., Bio/Technology, 3:923-929(1985)), 전기 Factor Xa 등의 다른 효소들에 비하여 보다 경제적으로 유로키나제를 대량으로 생산하여 수득할 수 있으므로, 이 효소를 이용하여 융합단백질로부터 경제적으로 목적 단백질을 절단, 분리하는 것이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 실제 단백질내에서 유로키나제에 의한 특이적 절단 부위가 되는 아미노산 서열을 결정하고자 노력한 결과, 융합단백질의 목적 단백질과 융합파트너 사이에 특이적인 유로키나제 절단 부위의 아미노산 서열인 -X-Gly-Arg(이때, X는 Pro, Thr, Ile, Phe, 또는 Leu)이 존재할 때, 절단 효율이 우수하였으며, 그 중에서도 -Thr-Gly-Arg이 존재할 때 절단 효율이 가장 우수함을 발견한 바 있다(참조: 대한민국 특허공개 제 97-6495호).
이와 같은 배경하에서, 본 발명자들은 재조합 대장균으로부터 아미노 말단인 메치오닌이 제거된 PTH를 대량 제조하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 로도박터 스페어로이드스(Rhodobacter sphaeroides)의 포스포리불로키나제(이하, 편의상 'PRK'라 함)의 유전자 단편 혹은 그의 돌연변이체를 융합파트너로 함유하는 L-arabinose 유도성 벡터에, 유로키나제에 의한 특이적 절단부위의 유전자 및 대장균에서의 코돈을 사용하도록 제조한 인간 PTH의 유전자를 삽입하여 발현벡터를 제조하고 대장균을 형질전환시킨 다음, 그로부터 융합단백질을 분리하여 유로키나제로 절단함으로써, 천연형 인간 PTH의 활성을 지닌 재조합 PTH를 대량으로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 PRK의 유전자 단편 혹은 그의 돌연변이체를 함유한 L-arabinose 유도성 벡터에, 유로키나제에 의한 특이적 절단 부위의 뉴클레오티드 서열을 포함한 PTH의 유전자를 제조한 재조합 발현벡터 및 그로부터 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발aud의 다른 목적은 전기 형질전환된 재조합 미생물을 L-arabinose가 첨가된 배지에서 배양함으로써 인간 PTH를 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
제 1도는 발현벡터pMA의 유전자 지도를 나타낸다.
제 2도는 인간 부갑상선호르몬(PTH)의 유전자를 제조하기 위한 올리고머들의 염기서열을 나타낸다.
제 3도는 합성된 올리고머들의 연결과정을 나타내는 도식이다.
제 4도는 발현벡터 pPRK의 유전자 지도를 나타낸다.
제 5도는 본 발명의 PRK 유전자 절편을 PCR을 통해 증폭한 다음, 아가로스 젤 전기영동한 결과이다.
제 6도는 인간 성장호르몬(hGH)의 융합단백질 발현벡터 p153hGH의 유전자 지도를 나타낸다.
제 7도는 인간 PTH의 융합단백질 발현벡터 pAI5UP의 유전자 지도를 나타낸다.
제 8도는 본 발명의 재조합 인간 부갑상선호르몬 발현벡터인 p153PTH를 제조하는 과정을 나타낸다.
제 9도는 p153PTH로 형질전환된 대장균의 L-arabinose유도에 의한 PRK 단편으로 융합된 인간 부갑상선호르몬 단백질의 발현 양상을 나타내는 전기영동 사진이다.
제 10도는 p153PTH로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 융합단백질을 분리하는 과정에서의 시료들을 SDS-PAGE한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제 11도는 153PTH 융합단백질의 봉입체를 유로키나제로 절단하여 SDS-PAGE한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제 12도는 p153PTH를 변형하여 본 발명의 인간 부갑상선호르몬의 발현 벡터인 pm153PTH를 구축하는 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제 13도는 pm153PTH로 형질전환된 대장균의 L-arabinose 유도에 의한 융합단백질의 발현 양상을 나타내는 전기영동 사진이다.
제 14도는 pm153PTH로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 융합단백질을 분리하는 과정에서의 시료들을 SDS-PAGE한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제 15도는 153PTH와 m153PTH의 융합단백질의 봉입체들을 유로키나제로 절단하여 SDS-PAGE한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제 16도는 153PTH와 m153PTH53PTH에서 발현된 봉입체들의 유로키나제 절단 효율을 비교하기 위하여 각 반응물을 전기 영동한 결과를 나타내는 사진이다.
제 17도는 정제된 인간 PTH를 SDS-PAGE한 결과를 나타내는 사진이다.
제 18(A)도는 정제된 인간 PTH의 수용체에 대한 결합력 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
제 18(B)도는 정제된 인간 PTH의 세포내 cAMP 생성촉진 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
우선, 인간의 PTH 유전자는 천연형 인간 PTH의 아미노산 서열로 번역되며 대장균에서 코돈 사용 빈도가 높은 염기서열을 가지도록 제조하였다. 또한, 융합단백질로부터 목적 단백질을 용이하게 분리하기 위하여, 융합파트너와 목적 단백질 사이에 유로키나제에 의해 특이적으로 절단되는 아미노산 서열 즉, -X-Gly-Arg(이때, X는 Pro, Thr, Ile, Phe, 또는 Leu)을, 가장 바람직하게는 -Thr-Gly-Arg을 포함하도록 유로키나제 절단 부위(참조: 대한민국 특허공개 제 97-6495호)를 합성하여 인간 PTH 유전자 앞에 위치하도록 하였다.
그런 다음, 전기 유로키나제 절단부위-인간 PTH 유전자와, PRK의 아미노 말단에서부터 153개의 아미노산을 암호화하는 DNA 단편을 포함하는 발현벡터 p153PTH를 제조하였다. 이어, 전기 발현벡터로부xj PRK 유전자 절편을 분리하고, PRK 아미노산 서열의 일부를 변형시킨 다음, 다시 인간 PTH 유전자와 조합한 발현벡터 pm153PTH를 제조하였다.
상기 발현벡터들은 PRK 단편들 중 그 크기가 아미노 말단에서부터 153개의 아미노산을 가지는 PRK 단편을 융합 파트너로 사용하였는 바, 이들 발현 벡터로 형질전환된 미생물에서 다량의 융합단백질(PRK 단편이 융합된 인간 PTH)이 발현됨을 확인하였다. 이때, pm153PTH의 경우 p153PTH와 비교하여 같거나 혹은 약간 증가한 발현량을 보여, 새로 도입된 아미노산 치환에 의한 발현 감소는 일어나지 않았음을 알 수 있었다. 한편, 전술한 유로키나제 절단부위-인간 PTH 유전자와 PRK의 전체 유전자를 포함하는 발현벡터도 융합단백질을 발현할 수 있었다.
아울러, 일부 아미노산이 변형된 PRK 단편을 융합시킨 인간 PTH의 융합 단백질 및 아미노산 변형이 없는 PRK 단편을 융합시킨 인간 PTH의 융합단백질dmf 각각 유로키나제로 절단한 결과, 아미노산이 변형된 PRK 단편을 융합시킨 인간 PTH의 융합단백질에서는 유로키나제에 의한 비특이적인 반응이 감소하여 같은 양의 융합단백질과 같은 조건하에서의 절단 반응으로부터 더 많은 양의 PTH를 얻을 수 있음을 확인하였다.
상기에서 발현된, PRK가 융합된 인간 PTH는 형질전환체 내에서 봉입체(inclusion body) 형태로 분리됨을 확인하고, 그 봉dlq체를 수득하여 유로키나제를 처리하고, PRK/PTH 융합단백질로부터 재조합 인간 PTH를 분리 및 정제하였다.
한편, 생체내에서 PTH는 콩팥 및 무기질화한 골로부터 칼슘의 재흡수를 촉진하여, 혈중 칼슘 농도를 증대시킴으로써 칼슘의 항상성을 조절하는 활성을 가지고 있는데, 전기 활성은 PTH가 골세포나 콩팥세포의 표면에 있는 고친화성 수용체에 결합하여 수용체와 연관되어 있는 아데닐레이트 사이클레이즈(adenylate cyclase)를 활성화시킴으로써, ATP로부터 형성된 세포내 2차 신호 전달 물질인 cAMP(cyclic AMP)에 의해 매개되는 것으로 보고되어 있다(참조: Donahue, H.J. et al., Endocrinology, 126:1471 -1477(1990)). 이러한 보고와 관련하여, 본 발명자들은 상기에서 정제된 재조합 인간 PTH가 전연 PTH의 활성을 지니고 있는지 확인하기 위하여, 골세포 또는 콩팥 세포에 존재하는 수용체 (receptor)에 대한 PTH의 결합력과 세포내 cAMP 형성 촉진정도를 측정하였다. 그 결과, 상기에서 제조된 재조합 인간 PTH는 수용체 결합력 및 세포내 cAMP 생성 촉진능력을 가지고 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 재조합 발현벡터 p153PTH 또는 pm153PTH로 형질전환된 미생물을 배양하여 L-arabinose로 발현을 유도함으로써, 천연형 인간 PTH가 지닌 활성을 그대로 유지하고 있는 재조합 인간 PTH를 정확한 유도 조절을 통하여 고수율로 제조할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발병을 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예들은 오로지 본 발병을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발aud의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 발현벡터 ΔpMA의 제조
살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymuriumLT2) 균주에서 DNA를 추출하고 이를 EcoRI 제한효소로 처리한 다음, pUC19 벡터에 삽입하여 pUC-살모넬라 라이브러리를 제조하였다. pUC-살모넬라 라이브러리를 대장균 DH5α 균주(E. coliDH5F' endA1 hsdR17(rk-mk+) supE44 thi-1 recA1 gyrA(Nalr) U169D(lacZAY-argF) deoR)에 도입시켜, 형질전환된 대장균 골로니를 얻었다. 한편, 아라비노즈 오페론 중의 araB-C 조절부위와 araC 단백질의 아미노 말단 3번째 아미노산까지를 포함할 수 있는 염기서열에 대한 15mer인 5'-GCCATCGTCTTACTC-3'와 14mer인 5'-GCGTTTCAGCCATG-3' 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이들을 탐침자(probe)로 사용하는 콜로니 혼성화(colony hybridization)를 실시하여 전기에서 제조된 pUC-살모넬라 라이브러리로부터 araB-A 및 araC 유전자를 포함하는 클론을 선별하였다.
이렇게 선별된 플라스미드 pUC-ara을 Aval 제한효소로 처리하고, 클레노우(Klenow) 효소로 평활말단화한 다음, SalI 제한효소로 처리하여 2.52kbp의 DNA 단편을 얻었다. 별도로, pUC119(참조: Maniatis et al., Molecular Cloning 2nd ed., 1989) 벡터를 HindIII 제한효소로 처리하고, 클레노우(Klenow) 효소로 평활말단화한 다음, SalI 제한효소를 처리하여 3.18kbp의 DNA 단편을 얻었다. 이들 두 단편 즉, 2.52kbp의 DNA 단편과 3.18kbp의 DNA 단편을 T4 DNA 연결효소로 연결하여, 5.7kbp의 pUC-araBC 벡터를 제조하였다. 이로부터 단일가닥의 DNA를 얻은 다음, araB 프로모터의 하단에 위치하는 araB단백질 구조유전자의 번역개시부호에 NdeI 제한효소가 자르는 염기서열인 5'-CATATG-3'가 삽입되고, araB 프로모터의 샤인-달가노 염기서열이 5'-TAAGGAGG-3'으로 변형되도록, 부위특이적 돌연변이를 야기시켰다.
이렇게 변형된 ara클론에 다시 EcoRI과 PvuII 제한효소를 처리하여, araB-C 유전자를 함유하는 2.61kbp의 DNA 절편을 얻었다. 한편, pUC18으로부터 유래한 228bp의 다클론부위를 포함한 MpKL10 벡터에 NdeI 제한효소를 처리하고, 클레노우 효소로 평활말단화하여 T4 DNA 연결효소로 재결합시킴으로써 이 벡터 내에 존재하는 NdeI 제한효소 인식 부위를 제거하였다. 이 벡터를 EcoR1과 PvuIl 제한효소로 처리하여, 다클론부위, 전사종결신호, 앰피실린저항성 유전자 및 대장균내 DNA 복제 오리진을 포함하는 2.7kbp의 DNA 단편을 얻었다.
상기에서 얻은 2.61kbp의 DNA 단편과 2.7kbp의 DNA 단편을 연결시킨 다음, NdeI과 EcoRI 제한효소로 처리하고, NcoI 제한효소 인식부위를 포함하며 양 말단에 각각 NdeI 및 EcoRI 절단부위 연결 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 이중가닥을 T4 DNA 연결효소로 도입하여 약 5.32kbp의 벡터pMA를 제조하였다. (참조: 대한민국 특허공고 제 97-5585호). 이렇게 제조된pMA의 유전자 지도를 제 1도에 나타내었다.
실시예 2: 인간 PTH 유전자의 제조
천연형 인간 PTH의 아미노산 서열로 번역되며 대장균에서 코돈 사용 빈도가 높은 염기서열을 가지는 인간 PTH 유전자를 제조하기 위하여, 먼저 PTH 센스(sense)와 안티센스(antisense) 가닥에 해당하는 12개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(참조: 제 2도). 전기 12개의 올리고머들을 선택적으로 말단에 인산화(phosphorylation), 결합(annealing), 용출(elution) 및 T4 DNA 연결 효소를 이용하여 올리고머들을 연결하였다. 먼저, 자체적인 연결을 막기 위하여, 올리고머 #2, #4, #5, #8, #9, #12 및 #13의 말단을 인산화시키고, #1:#2, #3:#4, #5:#6, #7:#8, #9:#10, #11:#12 및 #13:#14를 한 쌍으로 하여 결합시킨 다음, 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하여 정확히 결합된 이중가닥의 올리고머들 I, II, III, IV, V, VI 및 VII만을 용출하였다. 이중가닥 올리고머 VII의 3' 말단은 XbaI 제한효소 절단부위의 접착말단(cohesive end)을 갖고 있어, 발현벡터의 XbaI 부위로 쉽게 클로닝될 수 있다.
전기에서 용출한 이중가닥 올리고머의 말단을 인산화시킨 후, 이중가닥의 II와 III, IV와 V, VI와 VII을 각각 T4 DNA 연결효소로 연결한 다음, 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하여 정확히 연결된 II/III, IV/V, VI/VII를 용출하였다. 이어, II/III, IV/V 및 VI/VII 3가지 단편의 말단을 인산화시키고 I과 II/III, IV/V와 Vl/VII을 T4 DNA 연결효소를 이용하여 연결, 또 다시 I/II/III과 IV/V/VI/VIl를 연곁하여, 최종적으로 유로키나제 절단부위를 포함하면서 대장균에서의 코돈 사용 빈도가 높은 염기 서열을 가지는 인간 PTH 유전자를 합성하였다(참조: 제 3도). 제 3도에서 괄호안의 숫자는 염기의 수를 나타낸다. 상기에서 이중가닥 올리고머 I은 유로키나제 절단부위의 합성에 대한 것으로 하기에 상세히 기재되어 있다.
융합단백질로부터 PTH를 용이하게 분리하기 위하여, 다음과 같이 유로키나제 절단부위를 합성하여 융합파트너와 PTH 유전자 사이에 위치하도록 하였다. 유로키나제 절단부위에 Gly-Thr-Gly-Arg을 포함하도록 하면서(참조: 대한민국 특허공개 제 97-6495호), 전기 서열 앞에 비교적 작은 분자량의 아미노산을 덧붙여 가변성(flexibility)을 부여하였다. 또한, 5' 부분은 어떠한 목적(target) 유전자라도 그의 개방 해독틀(open reading frame)에 맞게 용이하게 융합할 수 있도록, 평활말단(blunt end)으로 시작되는 3개의 제한효소 SmaI, ScaI 및 PvuII 인식 부위를 포함하도록 제조하였으며, 유로키나제 절단부위와 인간 PTH의 연결부분에는 BglII 제한효소 부위가 위치하도록 제조하였다. 이러한 조건을 만족시키는 센스 올리고머 #1과 안티센스 올리고머 #2를 합성하여 이들을 결합시킨 다음, 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하여 정확히 결합된 이중가닥의 올리고머 I을 용출하였다. 이중가닥 올리고머 I은 양끝이 모두 평활 단면이므로, 결합하기 전에 #2 올리고머만을 인산화시켜, 올리고머 I의 이량체(dimer) 및 삼량체(trimer) 등의 형성을 방지하였다. 이중가닥의 올리고머 I이 상술한 바와 같이 합성된 인간 PTH 유전자 앞에 위치하도록 T4 DNA 연결효소를 이용하여 연결하였다.
실시예 3: PRK 유전자를 포함하는 발현벡터 pPRK의 제조
로도박터 스페어로이드스(Rhodobacter sphaeroides) 균주로부터 염색체 DNA를 분리한 다음, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하여 PRK 유전자를 증폭하였다. 이 때, 실시예 1에서 제조된 L-arabinose 유도성 발현벡터인pMA로의 서브클로닝을 용이하게 하기 위하여, PRK의 아미노 말단 부위에 해당하는 프라이머에는 번역개시코돈과 NdeI 제한효소 절단부위를, 그리고 PRK의 카르복실 말단에 해당하는 프라이머에는 번역종결코돈과 XbaI 제한효소 절단부위를 도입하여, 각각 5' 및 3' 말단 프라이머로 사용하였다(5' 말단 프라이머: 5'-GGAGCTGAATACATATGAGCAAG-3'; 3' 말단 프라이머: 5' -CCCCCGGGTCTAGATCAGGCCA-3').
PCR 반응산물을 1% 아가로즈 젤 전기영동하여, 873bp에 해당하는 PRK 유전자를 분리하고, NdeI과 XbaI 제한효소로 절단한 다음, NdeI과 XbaI 제한효소로 처리한pMA 벡터 절편에 서브클로닝하여 발현벡터 pPRK를 제조하였다(참조 : 제 4도). 이 발현벡터로 대장균 MC1061(E. coliMC1061, F-araD139(ara-leu)7696 galE15 galK16(lac) X74rpsL(Strr) hsdR2(rk -mk +) mcrAmcrB1)을 형질전환시키고, 그 형질전환체로부터 분자량이 32kDa인 PRK 단백질이 발현됨을 확인하였다(참조: 동일자 출원하는 포스포리불로키나제(phosphoribulokinase)를 융합파트너로 이용하는 대장균용 융합단백질 발현벡터 참조).
실시예 4: PRK 유전자의 절편화
전체 PRK 유전자를 융합 파트너로 이용하는 경우, 융합파트너 부분의 비중이 커서 최종적인 목적단백질의 수율이 낮아지는 단점이 있으므로, 융합파트너의 크기를 줄여 목적 단백질의 수율을 증대하기 위해 PRK의 크기를 다양하게 감소시켰다. 아직 PRK의 구조가 밝혀져 있지 않기 때문에, 츄 및 파스맨(Chou Fasman)의 방법(참조: Adv. Enzymol, 47:45-148(1978); Annu. Rev. Biochem., 47:251-276(1978))에 근거한 컴퓨터 프로그램(PROSIS, Hitachi, JAPAN)을 이용하여 PRK 단백질의 2차 구조를 예측한 후, 단백질의 구조적 안정성을 파괴하지 않도록 α-헬릭스(α-helix)나 β-가닥(β-strand) 등의 2차 구조가 형성되지 않을 것으로 예상되는 2 부위(각각 PRK의 아미노 말단으로부터 113 및 153번 아미노산까지의 부위, 이하에서는 편의상 각각 '113PRK' 및 '153PRK' 라 함)를 선정하였다.
각 크기의 PRK 유전자를 증폭하기 위하여, 5' 말단 프라이머로는 실시예 3에서 사용하였던 5' 말단 프라이머를 사용하였으며, 3' 말단 프라이머로는 각각 아미노산 113번 또는 153번 부위에 해당하는 염기서열에 서브클로닝이 용이하도록 BamHI 제한효소 절단부위를 첨가한 올리고뉴클레오티드를 사용하였다(113PRK용 3' 말단 프라이머: 5'-ggtgaaggatccgggcgccacgccggt-3'; 153PRK용 3' 말단 프라이머: 5'-cggaacggatccgatcttgaggtcggc-3').
PCR 증폭된 각각의 PRK 유전자 절편들을 NdeI과 BamHI 제한효소로 절단한 후, 1% 아가로즈 젤 전기영동하여 분리하였다(참조: 제 5도). 제 5도에서, 제 1레인은 153PRK, 제 2레인은 113PRK의 PCR 산물을 각각 나타내고, 제 M레인은 DNA 크기마커로서 HindIII로 절단된 λDNA를 나타낸다.
상기에서 분리된 113PRK 및 153PRK의 PCR 산물(유전자 절편)을 NdeI과 BamHI 제한효소로 절단한 다음, 이와 동일한 효소로 절단된pMA에 삽입하여 p113PRK 및 p153PRK를 제조하였다. 전기 발현벡터 p113PRK 및 p153PRK로 대장균 MC1061(E. coliMC1061, F-araD139(ara-leu)7696 galE15 galK16(lac)X74rpsL(Strr) hsdR2(rk -mk +) mcrA mcrB1)을 형질전환시켜 제조된 미생물을 배양하여 PRK 단백질의 발현을 확인한 결과, 단백질 113PRK 및 153PRK는 단백질 발현에 어떠한 영향도 받지 않고, 대량으로 발현됨을 알 수 있었다. 따라서, 단백질 113PRK 및 153PRK을 암호화하는 유전자 단편은 융합 파트너로 적절히 이용될 수 있음을 확인하였다(참조: 동일자 출원하는 ''포스포리불로키나제(phosphoribulokinase)를 융합파트너로 이용하는 대장균용 융합단백질 발현벡터 참조).
실시예 5: PTH 발현벡터 p153PTH의 제조 및 발현
대장균의 복제개시 억제 단백질인 IciA 단백질 중 아미노 말단부터 166번 아미노산까지를 암호화하는 DNA 단편을 융합파트너로 사용하며 유로키나제 절단부위를 포함하는 인간성장호르몬 발현벡터인 pAI5UG(참조: 대한민국 특허공개 제 97-6505호)를 NdeI, BamHI으로 절단하여 얻은, Thr-G1y-Arg의 유로키나제(편의상 'UK'라 함) 절단부위와 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 절편에, 전기 실시예 4에서 정제한 153PRK 유전자 절편을 서브클로닝하여, 발현벡터 p153hGH를 제조하였다(참조: 제 6도, 동일자 출원하는 포스포리불로키나제(phosphoribulokinase)를 융합파트너로 이용하는 대장균용 융합단백질 발현벡터 참조).
한편, 대장균의 복제개시 억제 단백질인 IciA 유전자 중 아미노 말단 166번째 아미노산 코돈 부위에 SmaI 제한효소 절단부위를 삽입시킨 ΔpMA5S(참조: 대한민국 특허공개 제 97-6505호, KCCM-10072)를 SmaI과 XbaI 제한효소로 절단하여 500bp의 IciA 유전자 절편을 포함하는 벡터 절편을 얻었다. 여기에 전기 실시예 2에서 합성된 유로키나제 절단부위를 포함하는 인간 PTH 유전자를 서브클로닝하여 araB 프로모터 체계하에서 발현 조절이 가능하며 IciA 단백질의 아미노 말단 166 아미노산 단편과의 융합 형태로 인간 PTH를 발현하는 벡터 pAI5UP를 제조하였다(참조: 제 7도, 대한민국 특허공개 제 97-6497호, KCCM-10071).
전기 벡터 pAI5UP를 BamHI과 HindIII 제한효소로 처리하여 유로키나제 절단부위를 포함하는 인간 PTH 유전자 절편을 얻은 다음, BamHI과 HindIII 제한효소로 처리한 p153hGH의 벡터 절편에 서브클로닝하여, 아미노 말단부터 153번 아미노산까지로 구성된 153PRK을 융합파트너로 사용하며, 유로키나제 절단 부위를 갖는 인간 PTH 융합단백질을 araB 프로모터 체계하에서 발현하는 벡터 p153PTH를 제조하였다(참조:제 8도).
전기 발현벡터 p153PTH로 대장균 MC1061(F-araD139 D(ara-leu)7696 galE15 galK16 D(lac)X74 rpsL(Strr) hsdR2(rk-mk+) mcrA mcrB1)을 형질전환시키고, 그 형질전환체를 앰피실린이 포함된 LB 액체 배양액(배양액 1L당 5g의 NaCl, 5g의 효모추출물, 10g의 박토 트립톤, 50mg의 앰피실린이 포함)에 접종하고, 37℃에서 180rpm으로 하루동안 진탕 배양하였다. 포화된 배양액을 다시 앰피실린이 포함된 신선한 LB 액체 배양액에 최종 1% 농도가 되게 접종하여 진탕 배양한 다음, 배양 세포의 농도가 600nm에서 0.5의 흡광도에 도달했을 때 최종 농도 1%의 L-arabinose를 배양액에 첨가하여, 153PRK/PTH(이하, 편의상 '153PTH'라 함) 융합단백질의 발현을 유도한 후 20 시간 정도 진탕 배양을 계속하였다.
대장균 배양체의 총단백질을 SDS-PAGE 방법으로 분석한 결과, L-arabinose 유도에 의하여 대장균내에서 약 26kDa의 153PTH 융합단백질이 높은 효율로 발현됨을 확인하였다(참조: 제 9도). 제 9도에서, 제 1 및 2 레인 p153PTH로 형질전환된 대장균주 MC1061을 1% L-arabinose로 유도하여 20시간 배양한 후의 총 단백량을 나타내고; 제 M레인은 표준 단백질 마커(BRL 16040-016, USA)를 나타낸다.
전술한 발gus벡터 p153PTH로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) MC1061를 대장균(Escherichia coli) MC1061:p153PTH로 명명하고, 1997년 7월 9일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 미생물보존센타(KCCM)에 기탁 번호 KCCM-10101으로 기탁하였다.
실시예 6: 153PTH 융합단백질 봉입체의 분리 및 절단
실시예 5에서와 같이 p153PTH로 형질전환된 대장균 MC1061(KCCM-10101)을 L-arabinose로 발현 유도하였을 때 발현되는 153PTH 융합단백질이 봉dlq체(inclusion body)를 형성하는지 조사하였다. 원심분리하여 수득한 대장균 배양체를 트리스 완충용액(0.1mM EDTA 및 25% 수크로스를 함유한 50mM 트리스 완충용액, pH 7.8)에 현탁시킨 다음, fl소자임(lysozyme)을 첨가하고 얼음 위에서 1.5 시간동안 반응시켰다. 여기에 MgCl2와 DNaseI을 첨가하여 1.5 시간동안 더 반응시킨 다음, 1% 데옥시콜린산(deoxycholic acid)과 1.6% Nonidet P-40를 함유한 완충용액을 첨가하여, 얼음 위에서 15분 동안 교반하고 초음파 파쇄(sonication)로 세포를 파쇄하였다. 전기 세포 파쇄액을 원심분리하여 각각 수용성 분획과 봉입체 분획으로 분리하고, 봉입체 분획을 0.5% 트리톤 X-100 용액으로 총 4회 세척하였다. 이렇게 하여 얻은 봉입체를 8M 우레아 (urea)용액에 넣고 4℃에서 서서히 교반하여 변성(denaturation)시켰다. 봉입체 분리 과정의 각 단계에서 재취한 시료들을 SDS-PAGE로 분석하였다(참조: 제 10도).
제 10도에서, 제 2레인은 세포 파쇄액, 제 3 레인은 세포 파쇄액의 상등액, 제 4∼7레인은 봉입체의 세척액, 제 8레인은 변성된 봉입체를 각각 나타낸다. 제 1레인과 9레인은 표준 단백질 마커로서 각각 BRL 16040-016(분자량 순으로 열거하면, 43kD, 29kD, 18.4kD, 14.3kD, 6.2kD, 3.4kD)과 NEB 7707L 분자량순으로 열거하면, 175kD, 83kD, 62kD, 47.5kD, 32.5kD, 25kD, 16.5kD, 6.5kD)을 나타낸다. 제 10도에서 보듯이, 153PTH 융합단백질은 대장균 내에서 상당량 발현되어, 모두 봉입체 형태로 분리됨을 알 수 있있다.
분리한 153PTH 융합단백질의 양을 결정한 다음, 153PTH 융합단백질 100μg에 유로키나제 0.5μg을 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 반응시켜, 절단된 정도를 SDS-PAGE로 분석하였다(참조: 제 11도). 제 11도에서, 제 1레인은 대조구로서 유로키나제를 첨가하지 않은 것이며, 제 2레인은 유로키나제를 첨가한 것을 나타낸다. M 레인은 표준 단백질 마커이다(NEB 7707L, 분자량순으로 열거하면 175kD, 83kD, 62kD, 47.5kD, 32.5kD, 25kD, 16.5kD, 6.5kD). 153PTH 융합단백질을 유로키나제로 절단할 경우, 153개의 아미노산에 해당하는 분자량을 가지는 융합파트너와 84개의 아미노산에 해당하는 분자량을 가지는 목적단백질인 PTH 단백질이 나와야 한다. 그러나, 제 11도에서 보듯이, 약 10kD의 PTH 단백질은 예상대로 보이고 있으나, 약 17kD으로 예상되는 융합파트너 153PRK의 단백질 단편은 거의 보이지 않는 대신, 그보다 작은 크기의 여러 단백질 단편들이 나타났다. 이는 153PRK 내부에 존재하는 12개의 알지닌(arginine) 잔기 중 일부에서 유로키나제에 의한 비특이적인 절단이 일어나고 있음을 의미한다.
실시예 7: 발현벡터 pm153PTH의 제조 및 발현
153PRK내에서 일어나는 유로키나제에 의한 부수적인 절단을 줄이기 위하여, 이러한 부수적 절단이 일어날 수 있는 부위에 존재하는 알지닌 잔기를 제거하였다. 153PTH를 유로키나제로 절단할 때 생성되는 단백질 단편들의 크기를 고려할 때, PRK의 아미노 말단에서부터 각각 30, 31, 58, 59, 94 및 96번째의 알지닌 잔기에서 부수적 절단이 일어날 가능성이 있을 것으로 예상하여, 이들 알지닌 잔기들을 다른 아미노산으로 치환하고자 하였다.
이를 위하여, 우선 발현벡터 p153PTH를 SacII와 HindIII 제한효소로 절단하여 분리한 153PTH 유전자 절편을, pBlueScript SK(+)(Stratagene, USA)를 SacII와 HindIII 제한효소로 처리하여 얻은 벡터 절편에 삽입하여, 단일 가닥 DNA를 얻을 수 있는 pSK(+)153PTH라는 돌연변이용 플라스미드를 얻었다(참조: 제 12도). pSK (+)153PTH를 대장균주 CJ236에 형질전환시킨 다음, 쿤켈(Kunkel) 등의 방법(참조: Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492(1985))으로 부위특이적 돌연변이를 수행하였다. 이때 사용된 돌연변이 유발용 DNA 단편(mutamer)은 다음과 같다.
30/31 돌연변이 유발용 DNA 단편 :
5'-ccttgaccccctcgc(c/g)cacgaagatctggtcgaac-3';
58/59 돌연변이 유발용 DNA 단편 :
5' -gcccgccgcatagc(g/c)cacgtccagctcggccttc-3';
94/96 돌연변이 유발용 DNA 단편 :
5' -gacgtaggtcc(c/g)cgtcaccccctgcccggtctcgcc-3'.
이로부터 30, 58, 94 번째의 알지닌이 각각 발린으로, 59, 96 번째의 알지닌이 각각 글리신으로 치환된 돌연변이를 제조하여 pSK(+)m153PTH라 명명하였다. pSK(+) m153PTH를 NdeI/BamHI으로 절단하여 얻은 돌연변이 153PRK 절편과, 발현벡터 p153PTH를 NdeI/BamHI으로 처리하여 얻은 유로키나제/PTH가 포함된 벡터 절편을 T4 연결효소로 연결하여, 발현벡터 pm153PTH를 제조하였다(참조:제 12도).
발현벡터 pm153PTH로 대장균 MC1061(F-araD139 D(ara-leu)7696 galE15 galK16 D(lac)X74 rpsL(Strr) hsdR2(rk-mk+) mcrA mcrB1)을 형질전환시키고, 그 형질전환체를 실시예 5에 기술한 방법대로 배양하여, m153PRK/PTH(이하, 편의상 'm153PTH'라 함) 융합단백질의 발현을 SDS-PAGE로 확인하였다(참조: 제13도). 제 13도에서, 제 1레인은 발현벡터 p153PTH로 형질전환된 대장균주 MC1061을 1% 아라비노즈로 유도하여 20시간 배양한 후의 총 단백질, 제 2레인은 발현벡터 pm153 PTH로 형질전환된 대장균주 MC1061을 1% 아라비노즈로 유도하여 20시간 배양한 후의 총 단백질, 제 3레인은 발현벡터 pm153PTH로 형질전환된 대장균주 MC1061을 아라비노즈로 유도하기 전의 총 단백질을 각각 SDS-PAGE 분석한 결과이다. 제 M레인은 표준 단백질 마커이다(NEB 7707L, 분자량순으로 열거하면, 83kD, 62kD, 47.5kD, 32.5kD, 25kD, 16.5kD, 6.5kD). 제 13도에서 보듯이, pm153PTH의 경우 p153PTH와 비교하여 같거나 혹은 약간 증가한 발현량을 보여 새로 도입된 아미노산 치환에 의한 발현 감소는 일어나지 않았음을 확인하였다.
전술한 발현벡터 pm153PTH로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) MC1061를 대장균(Escherichia coli) MC1061:pm153PTH로 명명하고, 1997년 7월 9일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 미생물보존센타(KCCM)에 기탁번호 KCCM-10102로 기탁하였다.
실시예 8: m153PTH 융합단백질 봉입체의 분리 및 절단
상기의 m153PTH 융합단백질이 대장균내에서 발현되어 어떤 형태로 존재 하는지 알아보기 위하여, 실시예 6에서와 같은 방법대로 봉입체 분리과정 중의 각 시료들을 SDS-PAGE로 분석하였다(참조: 제 14도). 제 14도에서, 제 2레인 세포 파쇄액, 제 3레인은 세포 파쇄액의 상등액, 제 4∼7레인은 봉입체의 세척액, 제 8레인은 변성된 봉입체를 각각 나타낸다. 제 1레인과 9레인은 표준 단백질 마커로서 각각 BRL 16040-016(분자량순으로 열거하면, 43kD, 29kD, 18.4kD, 14.3kD, 6.2kD, 3.4kD)과 NEB 7707L(분자량순으로 열거하면, 175kD, 83kD, 62kD, 47.5kD, 32.5kD, 25kD, 16.5kD, 6.5kD)을 나타낸다. 제 14도에서 보듯이, 153PTH 융합단백질과 마찬가지로 m153PTH 융합단백질도 세포내에서 봉입체를 형성함을 알 수 있었다.
실시예 6에서와 마찬가지로 분리한 융합단백질의 양을 결정한 다음, 153PTH 또는 m153PTH 융합단백질 100μg에 유로키나제 0.5μg을 각각 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 반응시켜, 절단된 정도를 SDS-PAGE로 분석하였다(참조: 제 15도). 제 15도에서, 홀수 레인은 대조구로서 유로키나제를 첨가하지 않은 것이며, 짝수 레인은 유로키나제를 첨가한 것을 나타내는데; 제 1 및 2레인은 153PTH, 제 3 및 4레인은 m153PTH를 나타낸다. 제 M레인은 표준 단백질 마커이다(NEB 7707L, 분자량순으로 열거하면, 175kD, 83kD, 62kD, 47.5kD, 32.5kD, 25kD, 16.5kD, 6.5kD). 제 15도에서 보듯이, m153PTH 융합단백질의 유로키나제 절단은 153PTH 융합단백질의 그것과 비교하여 볼 때, 유로키나제에 의한 비 특이적인 반응이 감소하여 같은 양의 융합단백질과 같은 조건하에서의 절단 반응으로부터 더 많은 양의 PTH를 얻을 수 있음을 확인하였다.
아울러, 유로키나제에 의한 153PTH와 m153PTH 융합단백질의 절단 시간에 따른 절단 효율을 비교하기 위하여, 융합단백질과 유로키나제의 농도비가 200:1이 되도록 한 다음, 25℃에서 절단 반응을 시키면서, 시간별로 시료를 재취하여 시간에 따른 절단 정도를 SDS-PAGE로 분석하였다(참조: 제 16도). 제16도에서, 제 1레인은 유로키나제에 의한 절단 시간이 20분, 제 2레인은 30분, 제 3레인은 60분, 제 4레인은 2시간 30분, 제 5레인은 3시간 10분, 제 6레인은 3시간 45분, 제 7레인은 6시간 시점에서의 시료를 각각 나타낸다.
제 16도에서 보듯이, m153PTH 융합단백질은 반응 60분만에 거의 완전히 절단된 양상을 보이는 반면, 153PTH 융합단백질은 6시간이 지나도 완전히 잘려진 양상을 보이지 않았다.
상기 절단 비교실험으로부터 m153PTH 융합단백질의 경우, 153PTH에 비하여 시간당 및 사용하는 유로키나제당 얻어지는 PTH의 수율이 증가하였음을 확인하였다.
실시예 9: 재조합 인간 PTH의 정제
전기 실시예 8과 같이 분리한 봉입체에 존재하는 m153PTH 융합단백질의 양을 측정한 다음, 트리스 완충용액으로 단백질 농도가 1 mg/ml이 되도록 조정하였다. 이 용액에 단백질 분해효소인 유로키나제를 넣고 25℃에서 반응시켜, 융합단백질로부터 PTH를 분리하였다. 제 17도는 분리된 PTH 단백질을 이온교환수지 및 C18역상 HPLC 크로마토그래피법을 이용하여 정제하고, 이를 SDS-PAGE(4-20% gradient 젤)로 분석한 결과인데, 제 1레인은 l5 μg의 정제된 PTH, 제 2레인은 7.5 μg의 정제된 PTH, 제 3레인은 3.75 μg의 정제된 PTH를 각각 나타낸다. M 레인은 표준 단백질의 분자량 마커이다(Novex LC 5677, 분자량순으로 열거하면, 200kD, 116.3kD, 97.4kD, 66.3kD, 55.4kD, 36.5kD, 31kD, 21.5kD, 14.4kD, 6kD, 3.5kD). 제 17도에서 보듯이, 인간 재조합 PTH가 순수하게 정제되djT음을 알 수 있었다.
실시예 : 재조합 인간 PTH의 활성 측정
UMR106 세포주(rat osteoblast-like osteosarcoma cell line)는 골생성세포(osteoblast)의 특성을 연구하는 재료로서 많이 이용되고 있는데, 골생성 세포의 특징인 알칼리성 포스포타제(alkaline phosphatase)의 활성이 높으며, 타잎 1 콜라겐을 생산하는 것으로 알려져 있다(참조: Meika A. Fang et al., Endocrinology, 131(5):2113-2119(1992); Cheryl 0. Quinn et al., The Journal of Biological Chemistry, 265(36):22342-22347(1990)). 따라서, 실시예 9에서 정제한 재조합 인간 PTH (rhPTH(1-84))의 시험관내 생물학적 활성은 UMR106 세포주(ATCC CRL 1661)를 이용하여 PTH의 수용체에 대한 결합력 시험과 세포내 cAMP 생성 촉진 시험으로 측정하였다. 대조군으로는 합성 인간 PTH(shPTH(1-84), Sigma Chemical Co., USA)를 사용하였으며, 아미노 말단과 카르복실 말단을 가진 완전한 PTH만이 검출되는 Allegro Intact PTH RIA kit (Nichols Institute, San Juan Capistrano, USA)를 사용하여 PTH를 정량하였다(참조: Samuel R. Nussbaum et al., Clinical Chemistry, 33(8):1364-1367(1987)). 아울러, UMR106 세포주는 0.2% 소디움 바이카보네이트 및 10% FBS(fetal bovine serum, 56℃에서 30분간 열처리한 것)를 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다(참조: Ronald J. Midura et al., Journal of Biological Chemistry, 269(18):13200-13206(1994)) .
실시예 10-1: PTH의 수용체에 대한 결합력 시험
PTH의 수용체에 대한 결합력 시험은 다음과 같이 진행하였다(참조: Chohei Sh igeno et al., The Journal of Biological Chemistry, 263(8):3864-3871(1988)): 24 공(wel1) 배양용기에 공당 105개의 UMR106 세포주를 접종하여 4 내지 8 일간 배양하였는데, 이때 배지는 이틀마다 한 번씩, 시험하기 3일전 부터는 매일 교체하였다. 한편, 카르복실 말단의 티로신 잔기에 방사성 동위원소125I이 표지된 (Nle8,18Tyr34)-소 (bovine)의 PTH(1-34)-NH2(bPTH(1-34))(참조: Gino V. Segre et al., JBC, 254(15):6980-6986(1979))를 제조하기 위하여, 반응 촉매제로서 클로라민 T(chloramine T, Sigma Chemica1 Co., USA)를 사용하여 bPTH(1-34)을 Na125I로 요오드화 반응(iodination)시켰다. 요오드화 반응물을 C18tpv-팩(SepPak) 칼럼에 주입하고 요오드화된 bPTH를 50% ACN(acetonitrile) /0.1% TFA(trifluoroacetic acid)로 용출시켜, 반응하지 않은125I를 제거한 다음, 분리한 bPTH로부터 ACN을 제거하였다.
상기에서 제조한125I이 표지된 (Nle8,18Tyr34)-bPTH(1-34)를 리간드로 사용하여, 이 리간드가 수용체에 결합하는 것을 rhPTH(1-84) 및 shPTH(1-84)가 경쟁적으로 저해하는 정도를 비교함으로써, PTH의 수용체에 대한 결합력을 측정하였다. 리간드와 전기 PTH들을 결합 완충용액(100mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl2, 5% 말혈청 및 0.5% FBS를 함유한 50mM 트리스, pH 7.7)에 각각 희석하였다. 한편, 상기에서 배양한 24공 배양용기를 얼음 위에서 냉각시키고 1ml의 결합 완충용액으로 2회 세척한 후, 30000 내지 50000cpm의 리간드와 농도를 달리한 경쟁 PTH를 최종 부피가 0.3ml되게 첨가하였다. 각 호르몬의 희석물은 3개의 공에 동시 처리하였으며, 15℃에서 4시간 흡착시켰다. 반응이 끝난 후 0.5ml의 결합 완충용액으로 4회 세척하여, 결합하지 않은 방사능을 제거하였다. 세포에 결합한 방사능을 0.5ml의 0.5M NaOH를 가하여 실온에서 16 내지 18시간 추출하고, 0.5ml의 결합 완충용액으로 재차 세척한 세척물을 합쳐 감마 계수기(γ-counter)로 방사능을 측정하였다.
전기에서 측정한 결합된 방사능 측정치에서 1mM의 각 경쟁호르몬을 사용하여 측정한 비특이적 결합의 측정치를 감해 주어, 특이적 결합의 측정치를 결정하였다. 측정 결과는 최대 특이적 결합의 백분율로 표시하였으며, 곡선 (curve)의 최적화 및 각 경쟁 호르몬들의 결합력을 비교하는 중요한 지표가 되는 IC50(50% inhibitory concentra tion, 리간드의 결합을 50% 저해시키는데에 필요한 호르몬의 농도)의 값은 Biosoft사의 fig.P program을 사용하여 결정하였다. shPTH(1-84)와 rhPTH(1-84)의 IC50값은 각각 18.6±1.5 및 17.3±3.1nM (평균치±표준편차)로 나타났으며, 그 중 하나의 실험결과를 제 18(A)도에 나타내었다. 제 18(A)도에서 보듯이, 재조합 PTH는 합성 PTH와 대등한 수용체 결합력을 가지고 있음을 알 수 있있다.
실시예 10-2: 세포내 cAMP 생성 촉진 시험
세포내 cAMP 생성 촉진시험은 다음과 같이 진행하였다(참조: Thomas J. Gardella et a1., JBC, 265(26):15854-15859(1990)). 실시예 10-1에서 4 내지 8 일간 24공 배양용기에서 배양한 UMR106 세포를 얼음 위에서 15분간 냉각시킨 후, 0.25ml의 cAMP 완충용액(2mM 3-isobutyl-methylxanthine, 1mg/ml BSA, 35mM HEPES를 함유한 DMEM, pH 7.4)으로 1회 세척하였다. 그런 다음, 0.1ml의 cAMP 완충용액을 가한 후, 0.1ml의 각각 다른 용도의 호르몬이 희석된 cAMP 완충용액을 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시키고, 완충액을 제거하였다. 이어, -70℃에서의 동결 및 실온에서의 해동을 각각 20분간 3회 반복하여 세포를 파괴하고, lm1의 50mM HC1을 각 공에 가한 다음, -20℃에서 16 내지 18 시간 동안 세포내 cAMP를 추출하여, 그 추출물에 있는 cAMP를 cAMP RIA kit(New England Nuclear, Du Pont, USA)를 사용하여 정량하였다. 곡선의 최적화 및 EC50(세포내 cAMP의 생성을 50% 촉진시키는데 필요한 호르몬의 농도)의 값은 Biosoft사의 fig.P program을 사용하여 결정하였다. shPTH(1-84) 및 rhPTH(1-84)의 EC50수치는 각각 1.9±0.1와 1.3±0.2mM(평균치 ±표준편차)로 나타났으며, 그 중 하나의 실험결과를 제 18(B)도에 나타내었다. 제 18(B)도에서 보듯이, 재조합 PTH는 합성 PTH와 대등한 아데닐레이트 사이클레이즈 (adenylate cyclase) 촉진 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발aud은 PRK 유전자 단편 혹은 그의 돌연변이체를 융합 파트너로 함유한 L-arabinose 유도성 벡터에, 유로키나제 절단부위의 뉴클레오티드 서열을 포함한 PTH의 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 발현벡터, 그로부터 형질 전환된 재조합 미생물 및 전기 미생물을 L-arabinose가 첨가된 배지에서 배양함으로써, 인간 부갑상선호르몬을 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서 제조한 재조합 인간 PTH는 cjs연형 인간 PTH의 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물을 이용하여 L-arabinose로 발현을 유도함으로써, 천연형 인간 PTH가 지닌 활성을 그대로 유지하고 있는 재조합 인간 PTH를 정확한 유도조절을 통하여 고수율로 제조할 수 있다.

Claims (13)

  1. 로도박터 스페어로이드스(Rhodobacter sphaeroides)의 포스포리불로키나제(phosphoribulokinase)의 유전자 전체 또는 DNA 단편을 융합파트너로 함유하는 L-arabinose 유도성 발현벡터에, 유로키나제 절단부위를 포함하는 인간 부갑상선호르몬 유전자를 삽입하여 제조된 융합단백질의 발현벡터.
  2. 제 1항에 있어서,
    융합파트너로 포스포리불로키나제 유전자 전체를 함유하는 L-아라비노즈 유도성 발현벡터는 다음과 같은 유전자 지도로 표시되는 pPRK인 것을 특징으로 하는 발현벡터:
  3. 제 1항에 있어서,
    포스포리불로키나제의 유전자 단편은 포스포리불로키나제의 아미노 말단으로부터 113개 또는 153개 아미노산을 암호화하고 있는 DNA 단편인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  4. 제 1항에 있어서,
    유로키나제 절단부위는 하기와 같은 아미노산 서열로 부터 유추되는 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
    -X-Gly-Arg
    상기에서,
    X는 Pro, Thr, Ile, Phe 또는 Leu이다.
  5. 제 4항에 있어서,
    유로키나제 절단부위는 -Thr-G1y-Arg의 아미노산 서열로부터 유추되는 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  6. 제 1항에 있어서,
    인간 부갑상선 호르몬의 유전자는 하기와 같은 DNA 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 발현벡터:
  7. 로도박터 스페어로이드스(Rhodobacter sphaeroides)의 포스포리불로 키나제(phosphoribulokinase)의 아미노 말단으로부터 153개 아미노산을 암호화하고 있는 DNA 단편, 유로키나제 절단부위 -Thr-Gly-Arg을 암호화하는 DNA 단편 및 인간 부갑상선호르몬 유전자를 일련의 순서로 포함하고 있는 발현벡터 p153PTH.
  8. 로도박터 스페어로이드스(Rhodobacter sphaeroides)의 포스포리불로키나제(phosphoribulokinase)의 아미노 말단으로부터 153개 아미노산을 암호화하고 있는 DNA 단편에 포스포리불로키나제의 30, 31, 58, 59, 94 및 96번째 알지닌(arginine) 잔기의 일부가 다른 아미노산으로 치환되도록 부위특이적 돌연변이를 유발시킨 DNA 단편, 유로키나제 절단부위 -X-Gly-Arg(이때, X는 Pro, Thr, Ile, Phe 또는 Leu)를 암호화하는 DNA 단편 및 인간 부갑상선호르몬 유전자를 일련의 순서로 포함하고 있는 발현벡터.
  9. 로도박터 스페어로이드스(Rhodobacter sphaeroides)의 포스포리불로키나제(phosphoribulokinase)의 아미노 말단으로부터 153개 아미노산을 암호화하고 있는 DNA 단편에 포스포리불로키나제의 30, 58 및 94번째 알지닌(arginine)이 발린(valine)으로, 59 및 96번째 알지닌이 글리신(glycine)으로 치환되도록 부위특이적 돌연변이를 유발시킨 DNA 단편, 유로키나제 절단부위 -Thr-Gly-Arg을 암호화하는 DNA 단편 및 인간 부갑상선호르몬 유전자를 일련의 순서로 포함하고 있는 발현벡터 pm153PTH.
  10. 제 7항의 발현벡터 p153PTH로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) MC1061: p153PTH(KCCM-10101).
  11. 제 9항의 발현벡터 pm153PTH로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) MC1061: pm153PTH(KCCM-10102 ).
  12. 제 10항의 형질전환된 대장균(Escherichia coli) MC1061:p153PTH(KCCM-10101)을 배양하여 L-아라비노즈로 인간 부갑상선 호르몬의 발현을 유도하고 이를 수득하는 공정을 포함하는 인간 부갑상선 호르몬의 제조방법.
  13. 제 11항의 형질전환된 대장균(Escherichia coli) MC1061:pm153PTH (KCCM-10102)을 배양하여 L-아라비노즈로 인간 부갑상선 호르몬의 발현을 유도하고 이를 수득하는 공정을 포함하는 인간 부갑상선 호르몬의 제조방법.
    제 1항의 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여, L-아라비노즈로 발현을 유도한 다음, 발현된 포스포리불로키나제 및 인간 부갑상선호르몬의 융합단백질에 유로키나제를 처리하여, 인간 부갑상선호르몬을 수득하는 공정을 포함하는 인간 부갑상선호르몬의 제조방법.
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