JP2003079380A - ペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 目的ペプチドの製造。 【効果】 本発明の製造方法は、目的とするペプチドの
Ｎ末端のＭｅｔ残基を取り除く必要がなく、ＰＴＨ（１
−３４）との融合タンパク質を用いるため、目的とする
ペプチドを高発現させることができるので、医薬用等の
ペプチドを工業的に大量に製造するのに有利である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、目的ペプチドのＮ
末端にＰＴＨ（上皮小体ホルモンまたは副甲状腺ホルモ
ン；parathyroid hormone）のＮ末端から１ないし３４
番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するペプチド（以下、単にＰＴＨ（１−３
４）と称する場合がある）を付加した融合タンパク質を
製造し、次いで該融合タンパク質のペプチド結合をタン
パク質分解酵素により切断することを特徴とする該ペプ
チドの製造法などに関する。

【０００２】

【従来の技術】生理活性ペプチドを大量に取得するため
に、目的とするペプチドをコードするＤＮＡ（遺伝子）
をＤＮＡ組換え技術を用いてベクターに組み込み、微生
物に形質転換させることによって発現させる試みが多く
行われている。しかし、ペプチドが発現菌細胞内のプロ
テアーゼの作用によって分解を受けやすく、目的とする
ペプチドが得られないことが多い。そのため融合タンパ
ク質の形で発現させることがしばしば行われている。イ
タクラらはβ−ガラクトシダーゼのＣ末端にメチオニン
を介したソマトスタチンを連結した融合タンパク質を大
腸菌に発現させた後、ブロムシアンで切断する方法を報
告している（Science, 198, 1056, (1977)）。しかし、
この化学的な切断法では分子内にメチオニン残基をもつ
ペプチドには適用できない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＤＮＡ組換え技術を用
いて大腸菌に目的タンパク質を発現させる場合、そのＮ
末端領域をコードする塩基配列によっては目的タンパク
質の発現量が低くなる（特願２０００−２２９０６４
号）。そのため目的ペプチドを融合タンパク質のＮ末端
領域に配置した場合、そのＮ末端領域をコードする塩基
配列によって融合タンパク質の発現量が大きく影響され
ることがある。さらに、融合タンパク質のＮ末端のアミ
ノ酸配列により翻訳開始コドンに由来するメチオニンが
付加する場合があり（J. Bacteriol.、169、751、198
7）、そのメチオニンを除去する操作が必要となる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、目的ペプ
チドを効率良く製造する方法について鋭意検討を加えた
ところ、ＤＮＡ組換え技術を用いて目的ペプチドを大腸
菌で発現させる場合、発現量の比較的高い副甲状腺ホル
モンのＮ末端側の３４アミノ酸残基からなるＰＴＨ（１
−３４）のＣ末端に、タンパク質分解酵素の切断部位を
介して目的ペプチドを連結した融合タンパク質として発
現させた。特に、タンパク質分解酵素としてエンテロキ
ナーゼを用いた場合に、該酵素がＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓという特定の数残基のアミノ酸配列
を認識して、そのＣ末端側のペプチド結合を切断するた
め、汎用性が高いと考え、該融合タンパク質のペプチド
結合をタンパク質分解酵素により切断し、該目的ペプチ
ドを効率良く製造できることを見い出した。さらにこれ
らに基づいて鋭意研究した結果、本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）ＰＴＨ（para
thyroid hormone）のＮ末端から１ないし３４番目のア
ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するペプチドのＣ末端にタンパク質分解酵素の切断
部位を介して目的ペプチドを連結した融合タンパク質
を、タンパク質分解酵素によるペプチド結合の切断反応
に付すことを特徴とする該目的ペプチドまたはその塩の
製造法、（２）ＰＴＨ（parathyroid hormone）のＮ末
端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同一または実
質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドのＣ末端
にタンパク質分解酵素の切断部位を介して目的ペプチド
を連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有す
るベクターで形質転換された形質転換体を培養して融合
タンパク質を発現させ、発現させた融合タンパク質をタ
ンパク質分解酵素によるペプチド結合の切断反応に付す
ことを特徴とする該目的ペプチドまたはその塩の製造
法、（３）タンパク質分解酵素がエンテロキナーゼであ
る上記（１）または（２）記載の製造法、（４）タンパ
ク質分解酵素の切断部位が配列番号：７で表されるアミ
ノ酸配列を有する上記（３）記載の製造法、（５）タン
パク質分解酵素がファクターＸａである上記（１）また
は（２）記載の製造法、（６）タンパク質分解酵素の切
断部位が配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有す
る上記（５）記載の製造法、（７）タンパク質分解酵素
がトロンビンである上記（１）または（２）記載の製造
法、（８）タンパク質分解酵素の切断部位が配列番号：
１３で表されるアミノ酸配列を有する上記（７）記載の
製造法、（９）目的ペプチドがアペリンである上記
（１）または（２）記載の製造法、（１０）アペリンが
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するペプ
チドである上記（９）記載の製造法、（１１）目的ペプ
チドがＧＰＲ８リガンドである上記（１）または（２）
記載の製造法、（１２）ＧＰＲ８リガンドが配列番号：
２７で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドであ
る上記（１１）記載の製造法、（１３）目的ペプチドが
ＺＡＱリガンドである上記（１）または（２）記載の製
造法、（１４）ＺＡＱリガンドが配列番号：４１で表わ
されるアミノ酸配列を含有するペプチドである上記（１
３）記載の製造法、（１５）ＰＴＨ（parathyroid horm
one）のＮ末端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプ
チドのＣ末端にタンパク質分解酵素の切断部位を介して
目的ペプチドを連結した融合タンパク質またはその塩、
（１６）目的ペプチドがアペリンである上記（１５）記
載の融合タンパク質またはその塩、（１７）アペリンが
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するペプ
チドである上記（１６）記載の融合タンパク質またはそ
の塩、（１８）融合タンパク質が配列番号：２５で表わ
されるアミノ酸配列を含有する上記（１５）記載の融合
タンパク質またはその塩、（１９）目的ペプチドがＧＰ
Ｒ８リガンドである上記（１５）記載の融合タンパク質
またはその塩、（２０）ＧＰＲ８リガンドが配列番号：
２７で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドであ
る上記（１９）記載の融合タンパク質またはその塩、
（２１）融合タンパク質が配列番号：３９で表わされる
アミノ酸配列を含有する上記（１５）記載の融合タンパ
ク質またはその塩、（２２）目的ペプチドがＺＡＱリガ
ンドである上記（１５）記載の融合タンパク質またはそ
の塩、（２３）ＺＡＱリガンドが配列番号：４１で表わ
されるアミノ酸配列を含有するペプチドである上記（２
２）記載の融合タンパク質またはその塩、（２４）融合
タンパク質が配列番号：５３で表わされるアミノ酸配列
を含有する上記（１５）記載の融合タンパク質またはそ
の塩、（２５）上記（１５）記載の融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２６）配列番号：
２６、配列番号：４０または配列番号：５４で表わされ
る塩基配列を含有する上記（２５）記載のＤＮＡ、（２
７）上記（１５）記載の融合タンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有するベクター、（２８）上記（２７）記載の
ベクターで形質転換された形質転換体、（２９）目的ペ
プチドを連結した融合タンパク質を製造するための、Ｐ
ＴＨ（parathyroid hormone）のＮ末端から１ないし３
４番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドまたはそれをコードするＤ
ＮＡの使用、（３０）ＰＴＨ（parathyroid hormone）
のＮ末端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドま
たはそれをコードするＤＮＡを用いることを特徴とする
目的ペプチドを連結した融合タンパク質またはその塩を
製造法、および（３１）ＰＴＨ（parathyroid hormon
e）のＮ末端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチ
ドのＣ末端にタンパク質分解酵素の切断部位を介して目
的ペプチドを連結した融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａを含有するベクターで形質転換された形質転換体を培
養し、該融合タンパク質またはその塩を生成せしめるこ
とを特徴とする該融合タンパク質またはその塩の製造法
など、さらには、（３２）ＰＴＨ（parathyroid hormon
e）のＮ末端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチ
ドのＣ末端にタンパク質分解酵素の切断部位を介して目
的ペプチドを連結した融合タンパク質を、該タンパク質
分解酵素によるペプチド結合の切断反応に付すことを特
徴とする該目的ペプチドまたはその塩の製造法などに関
する。

【０００６】本発明の方法において目的とするペプチド
（単に「目的ペプチド」と称する場合がある）は、本発
明の方法において用いるタンパク質分解酵素の切断部位
を分子内にもたないペプチドであれば、いずれでもよ
い。通常、目的ペプチドとしては、約１０個〜１００個
程度、好ましくは約２０個〜１００個程度のアミノ酸残
基を有するペプチドが用いられ、その具体例としてたと
えば、アペリン（Biochem. Biophys. Res. Commun., 25
1, 471-476,（1998））、ＧＰＲ８リガンド、ＺＡＱリ
ガンド、インシュリン、エンドセリン、心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド、ソマトスタチン、バソプレッシン、カ
ルシトニン、骨形成因子、インシュリノトロピン、アン
ジオテンシン、ブラジキニン、エンケファリン、エンド
ルフィン、各種オピオイドペプチド類および上記のペプ
チドフラグメント等が挙げられる。上記アペリンとして
は、例えばＷＯ ９９／３３９７６に記載の「配列番
号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を含有する受容体タンパク質に結合
能を有するポリペプチド」などがあげられる。具体的に
は、ＷＯ ９９／３３９７６に記載の 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドま
たはその部分ペプチド、 配列番号：１５、配列番号：３８、配列番号：４０ま
たは配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もし
くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部
分配列を含有するポリペプチドなどが用いられる。 ＷＯ ９９／３３９７６に記載の配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するポリペプチドとしては、配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列と約５０〜９９．９％（好ましくは７０〜
９９．９％、より好ましくは８０〜９９．９％、さらに
好ましくは９０〜９９．９％）の相同性を有するアミノ
酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有す
るポリペプチドなどが用いられる。ＷＯ ９９／３３９
７６に記載の配列番号：１５、配列番号：３８、配列番
号：４０または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
前駆体の部分配列を含有するポリペプチドとしては、
配列番号：１５、配列番号：３８、配列番号：４０また
は配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有する前
駆体の部分配列を含有するポリペプチドの他、配列番
号：１５で表される前駆体の部分ペプチドと実質的に同
質の活性を有するポリペプチド、配列番号：３８で表
されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチドと実質的に同
質の活性を有するポリペプチド、配列番号：４０で表
されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチドと実質的に同
質の活性を有するポリペプチドまたは配列番号：４２
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチドと実質的
に同質の活性を有するポリペプチドなどが挙げられる。
実質的に同質の活性としては、例えばレセプター結合活
性、シグナル伝達活性などが挙げられる。実質的に同質
とは、レセプター結合活性などが性質的に同質であるこ
とを示す。したがって、レセプター結合活性の強さなど
の強弱、ポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっ
ていてもよい。アペリンとしては、具体的には、ＷＯ
９９／３３９７６に記載の配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号：１５
で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号：３８
で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号：４０
で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号：４２
で表されるアミノ酸配列の部分配列を含有するマウス
脳、ラット脳、ブタ脳、ブタ小腸、ウシ視床下部、ウシ
胃、ヒト視床下部またはヒト肺由来のポリペプチドなど
が挙げられる。さらに、配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号：１５で表
されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号：３８で表
されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号：４０で表
されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号：４
２で表されるアミノ酸配列の部分配列などと同一もしく
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド
もしくはその部分ペプチドに対して１もしくは複数個の
アミノ酸が置換、欠失、付加あるいは挿入されているア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドは実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドとして挙げられる。
例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしく
はその部分配列、配列番号：１５で表されるアミノ酸
配列の部分配列、配列番号：３８で表されるアミノ酸
配列の部分配列、配列番号：４０で表されるアミノ酸
配列の部分配列、または配列番号：４２で表されるア
ミノ酸配列の部分配列中の１個以上７個以下、好ましく
は１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下
のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で
表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番
号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番
号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番
号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または
配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列に１
個以上２０個以下、好ましくは１個以上１５個以下、よ
り好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加した
（または挿入された）アミノ酸配列、配列番号：１で
表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番
号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番
号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番
号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または
配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列中の
１個以上７個以下、好ましくは１個以上５個以下、より
好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が他のアミノ酸
で置換されたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなど
である。さらに、アペリンもしくは部分ペプチドには、
ＧｌｎのＮ端側が生体内で切断され、該Ｇｌｎがピログ
ルタミン酸化したものなども含まれる。前駆体とは、上
記のアペリンをその部分配列として含有するタンパク質
であればいかなるものであってもよく、具体的には、配
列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ
酸配列を含有するタンパク質などが挙げられる。また、
アペリンの分子量は約１０００〜１００００ダルトン、
好ましくは約１０００〜約５０００ダルトン、より好ま
しくは、約１０００〜約３０００ダルトンである。より
具体的には、アペリンとしては、（１）配列番号：１で
表されるアミノ酸配列の第１番目から第１２番目のアミ
ノ酸配列を有するペプチド、（２）配列番号：１で表さ
れるアミノ酸配列の第１番目から第１３番目のアミノ酸
配列を有するペプチド、（３）配列番号：１で表される
アミノ酸配列の第１番目から第１４番目のアミノ酸配列
を有するペプチド、（４）配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列の第１番目から第１５番目のアミノ酸配列を有
するペプチド、（５）配列番号：１で表されるアミノ酸
配列の第１番目から第１６番目のアミノ酸配列を有する
ペプチド、（６）配列番号：１５、３８、４０または４
２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するペプチド
などが好ましい。配列番号：１５、３８、４０または４
２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するポリペプ
チドとして具体的には、（ａ）配列番号：１５、３８、
４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６番目から
第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）配
列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ
酸配列の第４０番目から第７７番目のアミノ酸配列を有
するペプチド、（ｃ）配列番号：１５、３８、４０また
は４２で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７
番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｄ）配列番
号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配
列の第４７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有する
ペプチド、（ｅ）配列番号：１５、３８、４０または４
２で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第７７番目
のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｆ）配列番号：１
５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第
６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ドまたはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタ
ミン酸化したもの、（ｇ）配列番号：１５、３８、４０
または４２で表されるアミノ酸配列の第１番目から第２
５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｈ）配列番
号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配
列の第６番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペ
プチド、（ｉ）配列番号：１５、３８、４０または４２
で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第６４番目の
アミノ酸配列を有するペプチド、（ｊ）配列番号：１
５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第
６１番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、（ｋ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表
されるアミノ酸配列の第４３番目から第７７番目のアミ
ノ酸配列を有するペプチド、（ｌ）配列番号：１５、３
８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４１番
目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｍ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表され
るアミノ酸配列の第６６番目から第７７番目のアミノ酸
配列を有するペプチド、（ｎ）配列番号：１５、３８、
４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６７番目か
ら第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｏ）
配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミ
ノ酸配列の第６４番目から第７７番目のアミノ酸配列を
有するペプチド、（ｐ）配列番号：１５、３８、４０ま
たは４２で表されるアミノ酸配列の第６３番目から第７
７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｑ）配列番
号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配
列の第６５番目から第７６番目のアミノ酸配列を有する
ペプチド、（ｒ）配列番号：１５、３８、４０または４
２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７５番目
のアミノ酸配列を有するペプチド、などがあげられ、な
かでも配列番号：１５、３８、４０または４２で表され
るアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸
配列を有するペプチドまたはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇ
ｌｎ）がピログルタミン酸化したものまたは配列番号：
１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の
第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプ
チドが好ましく用いられる。特に、配列番号：１５、３
８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６５番
目から第７７番目のアミノ酸配列で表わされるペプチド
またはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミ
ン酸化したもの（pGlu Arg Pro Arg LeuSer His Lys Gl
y Pro Met Pro Phe）が好ましい。さらにpGlu Arg Pro
Arg LeuSer His Lys Gly Pro Met Pro Pheで表されるア
ミノ酸配列の部分アミノ酸配列を有するペプチドも本発
明の（ポリ）ペプチドとして好ましく用いられる。より
好ましくは、例えばBiochem. Biophys. Res. Commun.,
251, 471-476,（1998）に記載のアペリン−３６（本願
明細書の配列番号：１で表されるアミノ酸配列で表され
るポリペプチド）、アペリン−１３（本願明細書の配列
番号：１の第２４〜３６番目のアミノ酸配列で表される
ポリペプチド）、アペリン−１３のＮ末端のアミノ酸
（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したペプチドなどがあ
げられ、その受容体であるＡＰＪ（O'Dowd. B.F., et a
l., Gene, 436, 355-359, 1993）に対し、リガンド活性
を有するペプチドであれば、如何なるものであっていて
もよい。なお、ＷＯ ９９／３３９７６に記載の配列番
号：１、配列番号：１５、配列番号：３８、配列番号：
４０および配列番号：４２は、それぞれ本願明細書の配
列番号：配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：
６３、配列番号：６４および配列番号：６５に対応して
いる。

【０００７】上記ＧＰＲ８リガンドとしては、７回膜貫
通型受容体タンパク質ＧＰＲ８（O'Dowd, B. F. et a
l.、GenomiCs、28巻、84-91頁、1995年）に対するリガ
ンド活性、例えば、ＧＰＲ８との結合活性、ＧＰＲ８発
現細胞に対する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃa²⁺遊離、細胞内ｃ
ＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、
ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性
などを促進する活性等）を有するポリペプチドであれ
ば、いかなるものであってもよい。上記ＧＰＲ８リガン
ドとして、配列番号：２７で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番
号：２７で表されるアミノ酸配列と約６０％以上（好ま
しくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、
より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％
以上、最も好ましくは約９５％以上）の相同性を有する
アミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：２７で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有
するペプチドとしては、例えば、配列番号：２７で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有
し、配列番号：２７で表わされるアミノ酸配列を有する
ペプチドと実質的に同質の性質を有するペプチドなどが
好ましい。また、ＧＰＲ８リガンドとしては、配列番
号：２７で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列
番号：２７で表されるアミノ酸配列に１または２個以上
（好ましくは、１〜４０個程度、より好ましくは１〜３
０個程度、なかでも好ましくは１〜２０個程度）のアミ
ノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：２７で表さ
れるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、
１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度）のア
ミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、また
はそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプ
チドなども用いられる。より具体的には、ＧＰＲ８リガ
ンドとしては、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列
を有するペプチドが用いられる。

【０００８】上記ＺＡＱリガンドとして、配列番号：４
１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸
配列としては、例えば、配列番号：４１で表されるアミ
ノ酸配列と約６０％以上（好ましくは約７０％以上、さ
らに好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％
以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約
９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げ
られる。配列番号：４１で表わされるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、
例えば、配列番号：４１で表わされるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：４１で表
わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質
の性質を有するペプチドなどが好ましい。実質的に同質
の活性としては、例えば、ＺＡＱ受容体に対する結合活
性、ＺＡＱ受容体を介するシグナル情報伝達作用などが
挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的
に同質であることを示す。したがって、ＺＡＱ受容体に
対する結合活性、ＺＡＱ受容体を介するシグナル情報伝
達作用などの活性が同等（例、約０．５〜２倍）である
ことが好ましいが、これらの活性の程度やペプチドの分
子量などの量的要素は異なっていてもよい。これらの活
性の測定は、公知の方法またはそれに準じた方法によっ
て行うことができる。また、ＺＡＱリガンドとしては、
配列番号：４１で表されるアミノ酸配列中の１または
２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましく
は１〜２０個程度）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配
列、配列番号：４１で表されるアミノ酸配列に１また
は２個以上（好ましくは、１〜４０個程度、より好まし
くは１〜３０個程度、なかでも好ましくは１〜２０個程
度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：
４１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好
ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個
程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸
配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含
有するペプチドなども用いられる。より具体的には、Ｚ
ＡＱリガンドとしては、配列番号：４１で表されるアミ
ノ酸配列を有するペプチドが用いられる。目的ペプチド
は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ
末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するアペリ
ン−３６、配列番号：２７で表わされるアミノ酸配列を
含有するＧＰＲ８リガンド、配列番号：４１で表わされ
るアミノ酸配列を含有するＺＡＱリガンドをはじめとす
る、本発明の目的ペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシ
ル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯ
Ｏ^-)である。

【０００９】ＰＴＨ（１−３４）として具体的には、配
列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するＰＴＨのＮ
末端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドであれ
ば如何なるものであってもよく、さらに具体的には、配
列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的
に同一のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられ
る。例えば、ＰＴＨ（１−３４）としては、配列番号：
３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドの他に、
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するペプ
チドと実質的に同質の性質を有するペプチド、即ち、該
ペプチドのＣ末端に、タンパク質分解酵素の切断部位を
介して目的ペプチドを連結した融合タンパク質を、タン
パク質分解酵素によるペプチド結合の切断反応に付した
場合に、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有す
るペプチドを用いた場合と同様に目的ペプチドを効率良
く製造せしめる性質を有するペプチドであれば如何なる
ものであっていてもよい。より具体的には、配列番号：
３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上５個以下、好
ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失したアミノ
酸配列、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列に１個
以上５個以下、好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸
が付加した（または挿入された）アミノ酸配列、あるい
は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上
５個以下、好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が他
のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するペプチ
ドなどがあげられる。

【００１０】ペプチドまたは後述の融合タンパク質の塩
としては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ
金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられる
が、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シ
ュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホ
ン酸）との塩などが用いられる。

【００１１】本発明方法で用いられる融合タンパク質
（融合ペプチドを含む）は後述の融合タンパク質をコー
ドするＤＮＡを含有するベクターで形質転換体を培養し
て融合タンパク質を発現させることにより製造すること
ができる。また、該融合タンパク質はＰＴＨ（１−３
４）のＣ末端に、タンパク質分解酵素の切断部位を介し
て目的ペプチドが結合したものであれば、特に如何なる
ものであってもよいが、目的ペプチドがアペリン−３６
の場合、具体的には、例えば、Ser Val Ser Glu Ile Gl
n Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Va
l His Asn Phe Asp Asp Asp Asp Lys Leu Val Gln Pro
Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gl
y Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser
His Lys Gly Pro Met Pro Phe（配列番号：２５）で表
されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげら
れる。配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有す
るタンパク質は、ＰＴＨ（１−３４）のアミノ酸配列
（Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu GlyL
ys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg
Lys Lys Leu Gln AspVal His Asn Phe；配列番号：
３）のＣ末端にエンテロキナーゼ切断部位をコードする
アミノ酸配列（Asp Asp Asp Asp Lys；配列番号：７）
が結合し、さらにそのＣ末端に、目的ペプチド（アペリ
ン−３６）をコードするアミノ酸配列（Leu Val Gln Pr
o Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly
Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Se
r His Lys Gly Pro Met Pro Phe；配列番号：１）が結
合していることを示す。また実施例１で使用した配列番
号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
は、ＰＴＨ（１−３４）のアミノ酸配列（Ser Val Ser
Glu Ile Gln LeuMet His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu ArgLys Lys Leu Gl
n Asp Val His Asn Phe；配列番号：３）のＣ末端に、
リンカー（Gly Ser Gly Ser Gly；配列番号：５７）を
介してエンテロキナーゼ切断部位をコードするアミノ酸
配列（Asp Asp Asp Asp Lys；配列番号：７）が結合
し、さらにそのＣ末端に、目的ペプチド（アペリン−３
６）をコードするアミノ酸配列（Leu Val Gln Pro Arg
Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly GlyArg
Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His L
ys Gly Pro Met ProPhe；配列番号：１）が結合してい
ることを示す。

【００１２】目的ペプチドがＧＰＲ８リガンドの場合、
具体的には、例えば、Ser Val SerGlu Ile Gln Leu Met
His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg V
alGlu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn
Phe Asp Asp Asp Asp LysTrp Tyr Lys His Val Ala Ser
Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala Ala GlyLeu Le
u Met Gly Leu（配列番号：３９）で表されるアミノ酸
配列を含有するタンパク質などがあげられる。配列番
号：３９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
は、ＰＴＨ（１−３４）のアミノ酸配列（Ser Val Ser
Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu GlyLys His Leu Asn
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu G
ln AspVal His Asn Phe；配列番号：３）のＣ末端にエ
ンテロキナーゼ切断部位をコードするアミノ酸配列（As
p Asp Asp Asp Lys；配列番号：７）が結合し、さらに
そのＣ末端に、目的ペプチド（ＧＰＲ８リガンド）をコ
ードするアミノ酸配列（Trp Tyr Lys His Val Ala Ser
Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala Ala GlyLeu Leu
Met Gly Leu；配列番号：２７）が結合していることを
示す。また実施例２で使用した配列番号：Ａで表される
アミノ酸配列を含有するタンパク質は、ＰＴＨ（１−３
４）のアミノ酸配列（Ser Val Ser Glu Ile Gln LeuMet
His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg V
al Glu Trp Leu ArgLys Lys Leu Gln Asp Val His Asn
Phe；配列番号：３）のＣ末端に、リンカー（Gly Ser G
ly Ser Gly；配列番号：５７）を介してエンテロキナー
ゼ切断部位をコードするアミノ酸配列（Asp Asp Asp As
p Lys；配列番号：７）が結合し、さらにそのＣ末端
に、目的ペプチド（ＧＰＲ８リガンド）をコードするア
ミノ酸配列（Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Ty
r His Thr Val Gly Arg Ala Ala Gly Leu Leu Met Gly
Leu；配列番号：２７）が結合していることを示す。

【００１３】目的ペプチドがＺＡＱリガンドの場合、具
体的には、例えば、Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met
His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Va
l Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn
Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cy
s Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly Thr Cys Cys
Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Th
r Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly
Ser His Lys Val Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His Hi
s Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg
Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp Leu Ly
s Asn Ile Asn Phe（配列番号：５３）で表されるアミ
ノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。配列
番号：５３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク
質は、ＰＴＨ（１−３４）のアミノ酸配列（Ser Val Se
r Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu GlyLys His Leu A
sn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu
Gln AspVal His Asn Phe；配列番号：３）のＣ末端に
エンテロキナーゼ切断部位をコードするアミノ酸配列
（Asp Asp Asp Asp Lys；配列番号：７）が結合し、さ
らにそのＣ末端に、目的ペプチド（ＺＡＱリガンド）を
コードするアミノ酸配列（Ala Val Ile Thr Gly Ala Cy
s Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly Thr Cys Cys
Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Th
r Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly
Ser His Lys Val Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His Hi
s Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg
Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp Leu Ly
s Asn Ile Asn Phe；配列番号：４１）が結合している
ことを示す。また実施例３で使用した配列番号：４３で
表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質は、ＰＴＨ
（１−３４）のアミノ酸配列（Ser Val Ser Glu Ile Gl
n Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Va
l His Asn Phe；配列番号：３）のＣ末端に、リンカー
（Gly Ser Gly Ser Gly；配列番号:５７）を介してエン
テロキナーゼ切断部位をコードするアミノ酸配列（Asp
Asp Asp Asp Lys；配列番号：７）が結合し、さらにそ
のＣ末端に、目的ペプチド（ＺＡＱリガンド）をコード
するアミノ酸配列（Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu
Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly ThrCys Cys Ala Ile
Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Thr Pro L
eu GlyArg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His
Lys Val Pro Phe Phe Arg LysArg Lys His His Thr Cys
Pro Cys Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg Phe ProAs
p Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp Leu Lys Asn Ile
Asn Phe；配列番号：４１）が結合していることを示
す。なお本発明の実施例では、該融合タンパク質をタン
パク質分解酵素で切断する際に、融合タンパク質の立体
障害によりタンパク質分解酵素で融合タンパク質が切断
できなくなるのを防ぐために、Ala、Gly、Serなど分子
量の小さいアミノ酸残基から選ばれる１〜５個程度のリ
ンカーと呼ばれる配列（例、Gly Ser Gly Ser Gly；配
列番号：５７など）をタンパク質切断部位をコードする
アミノ酸配列のＮ末端側に挿入した融合タンパク質が使
用された。

【００１４】本発明方法で用いられる融合タンパク質
（融合ペプチドを含む）をコードするＤＮＡは、全塩基
配列を化学的に合成してもよい。その場合の製造法とし
ては、例えば、公知のホスホアミダイド法、リン酸トリ
エステル法、ジエステル法、ハイドロジェンホスホネー
ト法などを用いて、短いものなら一度に、長いものでは
分割して合成した後にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
して作成することが可能である。このようにして得られ
る融合タンパク質をコードするＤＮＡの具体例として
は、目的ペプチドがアペリン−３６の場合、例えば、TC
TGTGTCCGAGATTCAGTTAATGCATAACCTTGGCAAACATTTGAACTCGA
TGGAGCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAGTTGCAGGATGTGCACAATTTT
GATGACGACGACAAGCTGGTGCAGCCCAGAGGGTCAAGGAATGGGCCAGG
GCCCTGGCAGGGAGGTCGGAGGAAATTCCGCCGCCAGCGGCCCCGCCTCT
CCCATAAGGGACCCATGCCTTTC（配列番号：２６）で表わさ
れる塩基配列を含有するＤＮＡなどがあげられる。配列
番号：２６で表される塩基配列で表されるＤＮＡはＰＴ
Ｈ（１−３４）をコードする塩基配列（TCTGTGTCCGAGAT
TCAGTTAATGCATAACCTTGGCAAACATTTGAACTCGATGGAGCGTGTAG
AATGGCTGCGTAAGAAGTTGCAGGATGTGCACAATTTT；配列番号：
４）の３’末端に、エンテロキナーゼ切断部位をコード
する塩基配列（GATGACGACGACAAG；配列番号：８）が結
合し、さらにその３’末端に、目的ペプチド（アペリン
−３６）をコードする塩基配列（CTGGTGCAGCCCAGAGGGTC
AAGGAATGGGCCAGGGCCCTGGCAGGGAGGTCGGAGGAAATTCCGCCGCC
AGCGGCCCCGCCTCTCCCATAAGGGACCCATGCCTTTC；配列番
号：２）が結合していることを示す。

【００１５】目的ペプチドがＧＰＲ８リガンドの場合、
例えば、TCTGTGTCCGAGATTCAGTTAATGCATAACCTTGGCAAACAT
TTGAACTCGATGGAGCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAGTTGCAGGATGT
GCACAATTTTGATGACGACGACAAGTGGTATAAACATGTGGCGAGCCCGC
GTTATCATACCGTGGGCCGTGCGGCGGGCCTGCTGATGGGCCTG（配列
番号：４０）で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡな
どがあげられる。配列番号：４０で表される塩基配列で
表されるＤＮＡはＰＴＨ（１−３４）をコードする塩基
配列（TCTGTGTCCGAGATTCAGTTAATGCATAACCTTGGCAAACATTT
GAACTCGATGGAGCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAGTTGCAGGATGTGC
ACAATTTT；配列番号：４）の３’末端に、エンテロキナ
ーゼ切断部位をコードする塩基配列（GATGACGACGACAA
G；配列番号：８）が結合し、さらにその３’末端に、
目的ペプチド（ＧＰＲ８リガンド）をコードする塩基配
列（TGGTATAAACATGTGGCGAGCCCGCGTTATCATACCGTGGGCCGTG
CGGCGGGCCTGCTGATGGGCCTG；配列番号：３４）が結合し
ていることを示す。

【００１６】目的ペプチドがＺＡＱリガンドの場合、例
えば、TCTGTGTCCGAGATTCAGTTAATGCATAACCTTGGCAAACATTT
GAACTCGATGGAGCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAGTTGCAGGATGTGC
ACAATTTTGATGACGACGACAAGGCGGTGATTACCGGTGCGTGCGAACGT
GATGTGCAGTGCGGTGCGGGTACCTGCTGCGCGATTAGCCTGTGGCTGCG
TGGTCTGCGTATGTGCACCCCGCTGGGTCGTGAAGGTGAAGAATGCCATC
CGGGTAGCCATAAAGTGCCGTTCTTCCGTAAACGTAAACATCATACCTGC
CCGTGCCTGCCGAACCTGCTGTGCAGCCGTTTCCCGGATGGTCGTTATCG
TTGCAGCATGGATCTGAAAAACATTAACTTT（配列番号：５４）
で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどがあげられ
る。配列番号：５４で表される塩基配列で表されるＤＮ
ＡはＰＴＨ（１−３４）をコードする塩基配列（TCTGTG
TCCGAGATTCAGTTAATGCATAACCTTGGCAAACATTTGAACTCGATGGA
GCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAGTTGCAGGATGTGCACAATTTT；配
列番号：４）の３’末端に、エンテロキナーゼ切断部位
をコードする塩基配列（GATGACGACGACAAG；配列番号：
８）が結合し、さらにその３’末端に、目的ペプチド
（ＺＡＱリガンド）をコードする塩基配列（GCGGTGATTA
CCGGTGCGTGCGAACGTGATGTGCAGTGCGGTGCGGGTACCTGCTGCGCG
ATTAGCCTGTGGCTGCGTGGTCTGCGTATGTGCACCCCGCTGGGTCGTGA
AGGTGAAGAATGCCATCCGGGTAGCCATAAAGTGCCGTTCTTCCGTAAAC
GTAAACATCATACCTGCCCGTGCCTGCCGAACCTGCTGTGCAGCCGTTTC
CCGGATGGTCGTTATCGTTGCAGCATGGATCTGAAAAACATTAACTTT；
配列番号：４２）が結合していることを示す。なお、本
発明の実施例で用いられた塩基配列（配列番号：１０、
配列番号：３０、配列番号：４４）は、ＰＴＨ（１−３
４）をコードする塩基配列（TCTGTGTCCGAGATTCAGTTAATG
CATAACCTTGGCAAACATTTGAACTCGATGGAGCGTGTAGAATGGCTGCG
TAAGAAGTTGCAGGATGTGCACAATTTT；配列番号：４）の３’
末端に、リンカー（Gly Ser Gly Ser Gly；配列番号：
５７）をコードする塩基配列（GGTTCTGGTTCTGGT；配列
番号：５８）を介して、エンテロキナーゼ切断部位をコ
ードする塩基配列（GATGACGACGACAAG；配列番号：８）
が結合し、さらにその３’末端に、目的ペプチド（アペ
リン−３６、ＧＰＲ８リガンド、ＺＡＱリガンド）をコ
ードする塩基配列（配列番号：２、配列番号：３４、配
列番号：４２）が結合していることを示す。なお本発明
の実施例では、上記のとおり、融合タンパク質をタンパ
ク質分解酵素で切断する際に、融合タンパク質の立体障
害によりタンパク質分解酵素で融合タンパク質が切断で
きなくなるのを防ぐために、Ala、Gly、Serなど分子量
の小さいアミノ酸残基から選ばれる１〜５個程度のリン
カーと呼ばれる配列（例、Gly Ser Gly Ser Gly；配列
番号：５７など）をコードするＤＮＡ鎖（例、GGTTCTGG
TTCTGGTなど；配列番号：５８）を、エンテロキナーゼ
切断部位をコードする塩基配列の５’末端側に挿入した
塩基配列が使用された。

【００１７】５’末端にＡＴＧを有し、その下流に該融
合タンパク質をコードする領域、ついで翻訳終止コドン
を有するＤＮＡ（プラスミド）は、化学合成で、あるい
は遺伝子工学的に製造された公知の該タンパク質のｃＤ
ＮＡ、もしくは、染色体由来の該タンパク質のＤＮＡを
加工することにより製造することができる。また、ＰＴ
Ｈ（１−３４）のＣ末端に、タンパク質分解酵素の切断
部位を介して目的ペプチド（アペリン−３６、ＧＲＰ８
リガンド、ＺＡＱリガンド等）を連結した融合タンパク
質をコードするＤＮＡを、従来の遺伝子技術、例えば部
位特異的突然変異誘発技術を用いて目的ペプチド（アペ
リン−３６、ＧＰＲ８リガンド、ＺＡＱリガンド等）の
ムテインをコードするＤＮＡに変換することができる。
部位特異的突然変異誘発技術は周知であり、アール・エ
フ・レイサー（Lather, R. F.）及びジェイ・ピー・レ
コック（Lecoq, J. P）、ジェネティック・エンジニア
リング（Genetic Engineering）、アカデミックプレス
社（１９８３年）第３１−５０頁に示されている。オリ
ゴヌクレオチドを用いた変異誘発はエム・スミス（Smit
h, M.）及びエス・ギラム（Gillam, S.）、ジェネティ
ック・エンジニアリング：原理と方法、プレナムプムス
社（１９８１年）３巻、１−３２頁に示されている。

【００１８】また、融合タンパク質をコードするＤＮＡ
を含有するベクターとして用いられるプラスミドとして
は、例えば大腸菌（Escherichia coli）由来のpＢＲ３
２２〔ジーン(Gene)，２，９５(１９７７)〕，pＢＲ３
１３〔ジーン，２，７５(１９７７)〕，pＢＲ３２４，p
ＢＲ３２５〔ジーン，４，１２４(１９７８)〕，pＢＲ
３２７，pＢＲ３２８〔ジーン，９，２８７(１９８
０)〕，pＢＲ３２９〔ジーン，１７，７９(１９８
２)〕，pＫＹ２２８９〔ジーン，３，１(１９７８)〕，
pＫＹ ２７００〔生化学，５２，７７０(１９８０)〕，
pＡＣＹＣ１７７，pＡＣＹＣ１８４〔ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)，１３
４，１１４１(１９７８)〕，ｐＲＫ２４８、ｐＲＫ６４
６、pＤＦ〔メソッズ・イン・エン ジーモロジー(Metho
ds in Enzymology)，６８，２６８(１９７９)〕、pＵＣ
１８、pＵＣ１９〔ヤニシューペロンら、ジーン(Gen
e)、３３、１０３(１９８５)〕などがあげられる。ま
た、バクテリオファージ、例えばλファージを使用した
λgt系のλgt・λＣ〔Proc. Nat. Acad. Sci. USA．７
１、４５７９(１９７４)〕、λgt・λＢ〔Proc. Nat. A
cad. Sci. USA. ７２、３４６１(１９７５)〕、λＤａ
ｍ〔ジーン、１、２５５(１９７７)〕やシャロンベクタ
ー〔サイエンス、(Science)、１９６、１６１(１９７
７)；ジャーナル・オブ・ビロロジー(Journal of Virol
ogy)、２９、５５５(１９７９)〕、繊維状ファージＭ１
３を使用したmp系のＭ１３mp１８、Ｍ１３mp１９〔ヤニ
シューペロンら、ジーン(Gene)、３３、１０３(１９８
５)〕ベクターなどもあげられる。

【００１９】上記ＤＮＡは、ＡＴＧの上流にプロモータ
ーを有しているのが好ましく、該プロモーターは、形質
転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌(Esche
richia coli)ではTrpプロモーター、lacプロモーター、
rec Ａプロモーター、λＰＬプロモーター、lppプロモ
ーター、Ｔ７プロモーターなどがあげられる。Ｔ７プロ
モーターの系を用いる場合には、Ｔ７プロモーターとし
ては、Ｔ７ＤＮＡ上で見い出されている１７種のプロモ
ーター〔J. L. Oakley ら、Proc．Natl. Acad. Sci、 U
SA，７４：４２６６−４２７０(１９７７)、M. D. Ros
a, Cell１６：８１５−８２５(１９７９)、N. Panayota
tos ら、Nature，２８０：３５(１９７９)、J. J. Dunn
ら、J. Mol. Biol.、１６６：４７７−５３５(１９８
３)〕のいずれでもよいがφ１０プロモーター〔A. H. R
osenberg ら、Gene、５６：１２５−１３５(１９８
７)〕が好ましい。転写ターミネーターとしては、大腸
菌の系で作動するターミネーター、好ましくはＴφター
ミネーター〔F. W. Studier ら、J. Mol. Biol.，１８
９：１１３−１３０(１９８６)〕が用いられる。Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼＤＮＡとしてはＴ７ＤＮＡ〔F. W. St
udier ら、J. Mol. Biol.，１８９：１１３−１３０(１
９８６)〕をあげることが出来る。ベクターは上記ベク
ターにＴ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターを組み込
んで構築されるのが好ましく、このようなベクターとし
ては、pＥＴ−１、pＥＴ−２、pＥＴ− ３、pＥＴ−
４、pＥＴ−５〔A. H. Rosenberg、 Gene ５６：１２５
−１３５(１９８７)〕、pＴＢ９６０−２〔ＥＰ−Ａ−
４９９９９０〕などをあげることができるが、好ましく
はpＴＢ９６０−２が用いられる。

【００２０】本発明の形質転換体は、上記方法で得られ
る発現用プラスミドを公知の方法〔例、コーエンS, N,
ら、プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス(Pro. Natl. Acad. Sci. USA.)、６
９、２１１０(１９７２)〕で宿主を形質転換することに
より製造することができる。形質転換される微生物の宿
主としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属
菌などがあげられる。上記エシェリヒア属菌の例として
は、エシェリヒア・コリ（E. coli）があげられ、具体
的にはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２
ＤＨ１〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.)、６０、１６０(１９６８)〕、ＪＭ−１０３〔ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ、(Nucleic Acids Res
earch)、９、３０９(１９８１)〕、Ｊ Ａ２２１〔ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal o
fMolecular Biology)、１２０、５１７(１９７８)〕、
ＨＢ１０１〔ジャーナル・オ ブ・モレ キュラー・バイ
オロジー、４１、４５９(１９６９)〕、Ｃ６００〔ジェ
ネティックス(Genetics)、３９、４４０(１９５４)〕、
Ｎ４８３０〔セル(Cell)、２５、７１３(１９８１)〕、
Ｋ−１２ＭＭ２９４〔プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、７３、４１
７４(１９７６)〕ＢＬ−２１などがあげられる。Ｔ７プ
ロモーターの系を用いる場合には、その形質転換体の宿
主としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ(Ｔ７ＤＮ
Ａ１)〔F. W. Studierら、J. Mol. Biol.１８９：１１
３−１３０(１９８６)〕を組み込んだ大腸菌株、例えば
ＭＭ２９４、ＤＨ−１、Ｃ６００、ＪＭ１０９、ＢＬ２
１、あるいはＴ７ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ(Ｔ７ＤＮ
Ａ１)を他のプラスミドと共に組込んだ大腸菌株など、
ならいずれでもよい。好ましくはＴ７ＤＮＡ１を組み込
んだλファージが溶原化したＭＭ２９４株およびＢＬ２
１株が用いられる。この場合Ｔ７ＤＮＡ１のプロモータ
ーとしては、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド(ＩＰＴＧと略することがある。)で発現が
誘導されるlacプロモーターが用いられる。融合タンパ
ク質は、上述の形質転換体を培地に培養し、産生された
融合タンパク質を採取することにより製造することがで
きる。培地のpＨは約６〜８が望ましい。

【００２１】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー、J.、 エクスペリメンツ・イン・モレキュラ
ー・ジェネテイクス(Experiments in Molecular Geneti
cs)、４３１−４３３(Cold Spring Horbor Laborator
y、New York １９７２)〕、２×ＹＴ培地〔メシング、
メソッド・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymo
logy)、１０１、２０(１９８３)〕ＬＢ培地などがあげ
られるが、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地が好
ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働か
せるために、例えば３β−インドリルアクリル酸やイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドのような薬
剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場
合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、
必要により、通気や撹拌を加えることもできる。λcＩt
sリプレッサーと、λＰＬ−プロモーターを含有する発
現ベクターとを有する組換え体を使用する場合には、培
養は約１５〜３６℃、好ましくは約３０℃〜３６℃の温
度で行い、λcＩtsリプレッサーの不活化は約３７℃〜
４２℃で行うのが好ましい。またrecＡプロモーターを
より効率良く働かせるため、すなわちrecＡ遺伝子発現
抑制機能を低下せしめるため、必要によりマイトマイシ
ンＣ、ナルジキシン酸などのような薬剤を添加したり、
紫外線を照射する、あるいは培養液のｐＨをアルカリ側
に変化させてもよい。融合タンパク質は、上記形質転換
体を培養し、培養物中に該融合タンパク質を生成、蓄積
せしめ、これを採取することにより製造することができ
る。

【００２２】Ｔ７プロモーターの系を用いている場合に
は、(１)lacプロモーターの下流に連結されているＴ７
ＤＮＡ(ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ)を発現させる時はＩ
ＰＴＧなどを添加する、もしくは(２)λＰＬプロモータ
ーの下流に連結されているＴ７ＤＮＡ（ＲＮＡポリメラ
ーゼＤＮＡ）を発現させる時は培養の温度を上昇させる
ことなどにより、生成するＴ７ファージＲＮＡポリメラ
ーゼ１により特異的にＴ７プロモーターを作動させる。
培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば緩衝液に懸濁
したのち、例えば、タンパク質変性剤処理、超音波処理
やリゾチームなどの酵素処理、グラスビーズ処理、フレ
ンチプレス処理、凍結融解処理などを行って菌体を破砕
し、遠心分離など公知の方法によって上清を得る。上記
により得られた上清から、融合タンパク質を単離するに
は、通常知られているタンパク質の精製法に従えばよ
い。例えば、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロ
マトグラフィー、電気泳動等を適切に組み合せて行うこ
とができる。

【００２３】ペプチド結合の切断反応に用いるタンパク
質分解酵素としては、タンパク質分解酵素として知られ
ているものであればいずれでもよいが、使用する「タン
パク質分解酵素の切断部位」の該「タンパク質分解酵
素」を用いるのがよい。また、タンパク質分解酵素の切
断部位を切断し得るタンパク質分解酵素であれば、使用
する「タンパク質分解酵素の切断部位」の該「タンパク
質分解酵素」以外のタンパク質分解酵素であってもよ
い。さらに、将来見いだされる新規なタンパク質分解酵
素を使用してもよい。より具体的には、ペプチド結合の
切断反応に用いるタンパク質分解酵素としては、例え
ば、エンテロキナーゼ、ファクターＸA、トロンビンな
どが好ましく、特にエンテロキナーゼが好ましく用いら
れる。融合タンパク質１ｍｇあたりタンパク質分解酵素
の使用量は０．０１ユニットから１００ユニット、好ま
しくは０．１ユニットから１０ユニットである。エンテ
ロキナーゼを用いる場合には、ＰＴＨ（１−３４）のＣ
末端にエントロキナーゼ切断部位を示す配列（Asp Asp
Asp Asp Lys；配列番号：７）を連結する。また、この
場合、目的ペプチドは配列番号：７で表されるアミノ酸
配列を有さないものであることが好ましい。ファクター
Ｘａを用いる場合には、ＰＴＨ（１−３４）のＣ末端に
ファクターＸａ切断部位を示す配列（Ile Glu Gly Arg
（配列番号：１１）（塩基配列：ATTGAAGGCCGC（配列番
号：１２）を有するＤＮＡによりコードされる））を、
トロンビンを用いる場合には、ＰＴＨ（１−３４）のＣ
末端にトロンビン切断部位を示す配列（Gly Pro Arg
（配列番号：１３）（塩基配列: GGCCCGCGC（配列番
号：１４）を有するＤＮＡによりコードされる））を連
結する。また、ファクターＸａを用いる場合、目的ペプ
チドは配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有さな
いものであることが好ましく、トロンビンを用いる場
合、目的ペプチドは配列番号：１３で表されるアミノ酸
配列を有さないものであることが好ましい。タンパク質
分解酵素によるペプチド結合の切断反応の反応温度は約
０℃〜６０℃の間であれば、いずれでもよく、約０℃〜
４０℃の間がより好ましい。用いる反応緩衝液として
は、特に限定はされないが、例えば、トリス−塩酸緩衝
液、トリス−酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液
などがあげられる。該反応におけるｐＨは、ｐＨ１〜１
２の間いずれでもよいが、ｐＨ４〜８の間が好ましい。
該切断反応により切り出される目的ペプチドを単離する
には、通常知られているペプチドの精製法に従えばよ
い。例えば、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー、アフイニティークロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、薄層クロ
マトグラフィー、電気泳動等を適宜組み合せて行うこと
ができる。また、該目的ペプチドは、必要によりこれを
凍結乾燥により粉末とすることもできる。凍結乾燥に際
しては、ソルビトール、マンニトール、デキストロー
ス、マルトース、トレハロース、グリセロールなどの安
定化剤を加えることができる。

【００２４】本発明の製造法で得られた目的ペプチドの
Ｃ末端は、アミド（−ＣＯＮＨ₂）、カルボキシル基
（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ^-）、ア
ルキルアミド（−ＣＯＮＨＲ）またはエステル（−ＣＯ
ＯＲ）であってもよい。エステルまたはアルキルアミド
のＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、
イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル
基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シク
ロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_{6 -12}ア
リール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなど
のフェニル−Ｃ_1-2アルキル、もしくはα−ナフチルメ
チルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキルなどのＣ_7-14
アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用される
ピバロイルオキシメチル基などがあげられる。本発明の
目的ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル
またはその塩は滅菌水、ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）、生理食塩水その他公知の生理学的に許容される担
体と混合することができ、安全な医薬として、哺乳動物
（例、ヒト、サル、ウシなど）に対して非経口的に又は
局所に投与することができる。たとえば、その１日投与
量は１人あたり、約０.０１mｇ−５０mｇ、好ましく
は、約０.１mｇ−１０mｇを、静注または筋注などによ
り非経口的に投与することができる。本発明の目的ペプ
チドを含有する製剤は、塩、希釈剤、アジュバント、他
の担体、バッファー、結合剤、界面活性剤、保存剤のよ
うな生理的に許容される他の活性成分も含有していても
よい。非経口的投与製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に
許容される溶媒との懸濁液アンプル、または生理学的に
許容される希釈液で用時希釈して使用しうる滅菌粉末
(通常ペプチド溶液を凍結乾燥して得られる)アンプルと
して提供される。

【００２５】本明細書および図面において、アミノ酸、
ペプチド、保護基、活性基、その他に関し略号で表示す
る場合、それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ（Commission on
Biochemical Nomenclature）による略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に
あげる。また、アミノ酸などに関し光学異性体がある場
合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン AＴＰ ：アデノシン三リン酸

【００２６】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 ［配列番号：１］アペリン−３６のアミノ酸配列を示
す。 ［配列番号：２］アペリン−３６をコードする合成ＤＮ
Ａの塩基配列を示す。 ［配列番号：３］ＰＴＨ（１−３４）のアミノ酸配列を
示す。 ［配列番号：４］ＰＴＨ（１−３４）をコードする合成
ＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：５］ＰＴＨ（１−８４）のアミノ酸配列を
示す。 ［配列番号：６］ＰＴＨ（１−８４）をコードする合成
ＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：７］エンテロキナーゼ切断配列を表すアミ
ノ酸配列を示す。 ［配列番号：８］エンテロキナーゼ切断配列をコードす
る合成ＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：９］後述の実施例１で用いられたＰＴＨ
（１−３４）−アペリン−３６融合タンパク質のアミノ
酸配列を示す。 ［配列番号：１０］後述の実施例１で用いられたＰＴＨ
（１−３４）−アペリン−３６融合タンパク質をコード
する合成ＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：１１］ファクターＸａ切断配列を表すアミ
ノ酸配列を示す。 ［配列番号：１２］ファクターＸａ切断配列をコードす
る合成ＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：１３］トロンビン切断配列を表すアミノ酸
配列を示す。 ［配列番号：１４］トロンビン切断配列をコードする合
成ＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：１５］後述の実施例１で用いられたＤＮＡ
オリゴマー＃１の塩基配列を示す。 ［配列番号：１６］後述の実施例１で用いられたＤＮＡ
オリゴマー＃２の塩基配列を示す。 ［配列番号：１７］後述の実施例１で用いられたＤＮＡ
オリゴマー＃３の塩基配列を示す。 ［配列番号：１８］後述の実施例１で用いられたＤＮＡ
オリゴマー＃４の塩基配列を示す。 ［配列番号：１９］後述の実施例１で用いられたＤＮＡ
オリゴマー＃５の塩基配列を示す。 ［配列番号：２０］後述の実施例１で用いられたＤＮＡ
オリゴマー＃６の塩基配列を示す。 ［配列番号：２１］後述の実施例１で用いられたＤＮＡ
オリゴマー＃７の塩基配列を示す。 ［配列番号：２２］後述の実施例１で用いられたＤＮＡ
オリゴマー＃８の塩基配列を示す。 ［配列番号：２３］後述の実施例１で用いられたＤＮＡ
オリゴマー＃９の塩基配列を示す。 ［配列番号：２４］後述の実施例１で用いられたＤＮＡ
オリゴマー＃１０の塩基配列を示す。 ［配列番号：２５］ＰＴＨ（１−３４）のＣ末端に、エ
ンテロキナーゼ切断部位をコードするアミノ酸配列が結
合し、さらにそのＣ末端に、アペリン−３６をコードす
るアミノ酸配列が結合した融合タンパク質のアミノ酸配
列を示す。 ［配列番号：２６］配列番号：２５で表されるアミノ酸
配列をコードする合成ＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：２７］ＧＰＲ８に対するリガンドポリペプ
チド（ヒト型・１−２３）のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：２８］ＧＰＲ８に対するリガンドポリペプ
チド（ヒト型・１−２３）をコードする合成ＤＮＡの塩
基配列を示す。 ［配列番号：２９］後述の実施例２で用いられたＰＴＨ
（１−３４）−ＧＰＲ８リガンドポリペプチド（ヒト型
・１−２３）融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：３０］後述の実施例２で用いられたＰＴＨ
（１−３４）−ＧＰＲ８リガンドポリペプチド（ヒト型
・１−２３）融合タンパク質をコードする合成ＤＮＡの
塩基配列を示す。 ［配列番号：３１］実施例２−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：３２］実施例２−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：３３］実施例２−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：３４］実施例２−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：３５］実施例２−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：３６］実施例２−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：３７］実施例２−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：３８］実施例２−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：３９］ＰＴＨ（１−３４）のＣ末端に、エ
ンテロキナーゼ切断部位をコードするアミノ酸配列が結
合し、さらにそのＣ末端に、ＧＰＲ８リガンドポリペプ
チド（ヒト型・１−２３）をコードするアミノ酸配列が
結合した融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：４０］配列番号：３９で表されるアミノ酸
配列をコードする合成ＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：４１］ヒトＺＡＱリガンドのアミノ酸配列
を示す。 ［配列番号：４２］ＺＡＱリガンドをコードする合成Ｄ
ＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：４３］後述の実施例３で用いられたＰＴＨ
（１−３４）−ヒトＺＡＱリガンド融合タンパク質のア
ミノ酸配列を示す。 ［配列番号：４４］後述の実施例３で用いられたＰＴＨ
（１−３４）−ヒトＺＡＱリガンド融合タンパク質をコ
ードする合成ＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：４５］実施例３−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：４６］実施例３−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：４７］実施例３−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：４８］実施例３−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：４９］実施例３−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：５０］実施例３−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：５１］実施例３−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：５２］実施例３−１において構造遺伝子の
製造に用いたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。 ［配列番号：５３］ＰＴＨ（１−３４）のＣ末端に、エ
ンテロキナーゼ切断部位をコードするアミノ酸配列が結
合し、さらにそのＣ末端に、ヒトＺＡＱリガンドをコー
ドするアミノ酸配列が結合した融合タンパク質のアミノ
酸配列を示す。 ［配列番号：５４］配列番号：５３で表されるアミノ酸
配列をコードする合成ＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：５５］実施例２−５で用いた合成プライマ
ーの塩基配列を示す。 ［配列番号：５６］実施例２−５で用いた合成プライマ
ーの塩基配列を示す。 ［配列番号：５７］リンカー配列を表すアミノ酸配列を
示す。 ［配列番号：５８］リンカー配列をコードする合成ＤＮ
Ａの塩基配列を示す。 〔配列番号：５９〕実施例３−５−１で用いられたプラ
イマ-ZAQC Salの塩基配列を示す。 〔配列番号：６０〕実施例３−５−１で用いられたプラ
イマ-ZAQC Speの塩基配列を示す。 ［配列番号：６１］ウシ由来アペリンのアミノ酸配列を
示す。 ［配列番号：６２］マウス由来アペリンの前駆体のアミ
ノ酸配列を示す。 ［配列番号：６３］ラット由来アペリンの前駆体のアミ
ノ酸配列を示す。 ［配列番号：６４］ヒト由来アペリンの前駆体のアミノ
酸配列を示す。 ［配列番号：６５］ウシ由来アペリンの前駆体のアミノ
酸配列を示す。

【００２７】後述の実施例１で得られたエシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴ
ＣＰＴＨＡ１０Ｌは受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３１２
として、２０００年９月２８日付で茨城県つくば市東１
丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン
ター（旧 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所）
に、また２０００年９月１９日付で受託番号ＩＦＯ １
６４７５として大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７
番８５号（郵便番号５３２−８６８６） 財団法人発酵
研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。後述の実施例２で
得られたエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＭＭ
２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＴＨｈＧＰＲ８Ｌは受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５８６として、２００１年５月１
０日付で茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術
総合研究所 特許生物寄託センターに、また２００１年
３月１５日付で受託番号ＩＦＯ １６５８９として大阪
府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号
５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に
寄託されている。後述の実施例３で用いたｐＴＣｈ１Ｚ
ＡＱを保持するエシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣｈ１ＺＡＱは受託番
号ＦＥＲＭＢＰ−７５７１として、２００１年４月２７
日付で茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵
便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合
研究所 特許生物寄託センターに、また２００１年１月
１６日から受託番号ＩＦＯ１６５２７として大阪府大阪
市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２
−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託さ
れている。後述の実施例３で得られたエシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣ
ＰＴＨｈ１ＺＡＱは受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５８４
として、２００１年５月１０日付で茨城県つくば市東１
丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン
ターに、また２００１年３月１５日付で受託番号ＩＦＯ
１６５８６として大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目
１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人
発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。

【００２８】

【発明の実施の形態】アペリン−３６、ヒトＧＰＲ８リ
ガンドおよびヒトＺＡＱリガンドを例として実施例を以
下に示すが、本発明の製造法はこれらに限定されるもの
ではない。

【実施例】

【００２９】実施例１ アペリン−３６の製造 実施例１−１ ＰＴＨ（１−３４）−アペリン−３６を
コードするＤＮＡの製造 （ａ）ＤＮＡ断片の合成 以下に示す１０種のＤＮＡオリゴマー（アマシャム・フ
ァルマシア・バイオテク社、配列番号：１５〜２４）を
用いて、以下のとおり、公知の方法に準じてＰＴＨ（１
−３４）−アペリン−３６の構造遺伝子を調製した。 ＃１： 5'-TATGTCTGTGTCCGAGATTCAGTTAATGCATAACCTTGG
CAAACAT（配列番号：１５） ＃２： 5'-TTGAACTCCATGGAGCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAG
TTGCAGGATGT（配列番号：１６） ＃３： 5'-GCACAATTTTGGTTCTGGTTCTGGTGATGACGACGACAA
GCTGGTTCAACCG（配列番号：１７） ＃４： 5'-CGTGGTTCTCGTAATGGTCCGGGTCCATGGCAAGGTGGT
CGTCGTAAATT（配列番号：１８） ＃５： 5'-TCGTCGTCAACGTCCGCGTCTGTCTCATAAAGGTCCGAT
GCCGTTTTAAG（配列番号：１９） ＃６： 5'-TGGAGTTCAAATGTTTGCCAAGGTTATGCATTAACTGAA
TCTCGGACACAGACA（配列番号：２０） ＃７： 5'-AAAATTGTGCACATCCTGCAACTTCTTACGCAGCCATTC
TACACGCTCCA（配列番号：２１） ＃８： 5'-GAGAACCACGCGGTTGAACCAGCTTGTCGTCGTCATCAC
CAGAACCAGAACC（配列番号：２２） ＃９： 5'-TGACGACGAAATTTACGACGACCACCTTGCCATGGACCC
GGACCATTAC（配列番号：２３） ＃１０： 5'-GATCCTTAAAACGGCATCGGACCTTTATGAGACAGAC
GCGGACGT（配列番号：２４） （ｂ）ＤＮＡオリゴマーのリン酸化 ５’側になるべき＃１（配列番号：１５）および＃１０
（配列番号：２４）を除いた８種のＤＮＡオリゴマー
（＃２〜＃９、配列番号：１６〜２３）各々を、２５μ
ｌのリン酸化反応液〔ＤＮＡオリゴマー１０μｇ、５０
mＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pＨ７．６、１０mＭ ＭｇＣ
ｌ₂、１mＭスペルミジン、１０mＭジチオスレイトール
（以後ＤＴＴと略記）、０.１mｇ／mlウシ血清アルブミ
ン（以後ＢＳＡと略記）、１mＭ ＡＴＰ、１０ユニット
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）〕中で３７
℃、１時間反応させ、各オリゴマーの５’末端をリン酸
化した。フェノール処理を行った後、２倍量のエタノー
ルを加え、−７０℃に冷却した後、遠心でＤＮＡを沈殿
させた。 （ｃ）ＤＮＡフラグメントの連結 上記（ａ）で得られたＤＮＡフラグメントと＃１（配列
番号：１５）および＃１０（配列番号：２４）を１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
に加え、１２０μｌとした。この混合液を９０℃で１０
分間保った後、室温まで徐冷しアニーリングを行った
後、DNA Ligation Kit ver.2（宝酒造）を用いてライゲ
ーション反応を行った。アニーリング液３０μｌにＩＩ
液３０μｌを加え、よく混合した後、Ｉ液６０μｌを加
え、３７℃、１時間反応させ、ライゲーションを行っ
た。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍量の
エタノールを加え、−７０℃に冷却した後、遠心でＤＮ
Ａを沈殿させた。この様にして得られたＤＮＡフラグメ
ントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）による
リン酸化を行った後、以下の(ｄ)に供した。 （ｄ）ＰＴＨ（１−３４）−アペリン−３６発現ベクタ
ーの構築 発現用ベクターを以下のように作製した。ｐＴＣＩＩ
（特開２０００−１７８２９７号に記載）をＮｄｅＩお
よびＢａｍＨＩ（宝酒造）で３７℃、２時間消化した
後、１％アガロースゲル電気泳動により４.３ｋｂのＤ
ＮＡ断片をQIAquickGel Extraction Kit（キアゲン社）
を用いて抽出し、２５μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。こ
のｐＴＣＩＩのＮｄｅＩ、ＢaｍＨＩ断片と上記により
調製したＰＴＨ（１−３４）−アペリン−３６の構造遺
伝子をDNA ligation kit ver.2（宝酒造）を用いてライ
ゲーション反応を行った。この反応液を１０μｌ用いて
大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡）を形質転
換し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒
天培地上に播き、３７℃で１晩培養し、生じたテトラサ
イクリン耐性コロニーを選んだ。この形質転換体をＬＢ
培地で一晩培養し、QIAprep8 Miniprep Kit（キアゲン
社）を用いてプラスミドを調製し，得られたプラスミド
をpＴＣＰＴＨＡ１０Ｌと命名した。pＴＣＰＴＨＡ１０
Ｌ中のＰＴＨ（１−３４）−アペリン−３６構造遺伝子
部分の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社モデル
３７７ＤＮＡシーケンサーを用いて確認した。プラスミ
ドpＴＣＰＴＨＡ１０Ｌで大腸菌（Escherichia coli）
ＭＭ２９４（ＤＥ３）を形質転換し、ＰＴＨ（１−３
４）−ｈＡ１０Ｌ発現株Escherichia coli ＭＭ２９４
（ＤＥ３）／pＴＣＰＴＨＡ１０Ｌを得た。 （ｅ）ＰＴＨ（１−３４）−アペリン−３６の製造 Escherichia coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＴＣＰＴ
ＨＡ１０Ｌを５．０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含む
ＬＢ培地１Ｌ（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、
０．５％塩化ナトリウム）を用いて２Ｌ容フラスコ中で
３７℃、８時間振とう培養した。得られた培養液を１９
Ｌの主発酵培地（１．６８％リン酸１水素ナトリウム、
０．３％リン酸２水素カリウム、０．１％塩化アンモニ
ウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグ
ネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第
１鉄、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ
糖、１．５％ハイケースアミノ）を仕込んだ５０Ｌ容発
酵槽へ移植して、３０℃で通気攪拌を開始した。培養液
の濁度が５００クレット単位になったところで、イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度が
１２ｍｇ／Ｌになるように添加し、さらに６時間培養を
行った。培養終了後、培養液を遠心分離し、約３８０ｇ
の湿菌体を取得し、−８０℃で保存した。

【００３０】実施例１−２ ＰＴＨ（１−３４）−アペ
リン−３６の精製 実施例１−１で得た菌体２００ｇに７Ｍグアニジン塩酸
塩、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pＨ８.０）溶液４０
０ｍｌを加え、約４時間攪拌した後、遠心分離（１００
００ｒｐｍ、６０分）を行い、得られた上清を５０mＭ
リン酸緩衝液１５Ｌ（pＨ６.０）で希釈した。一晩１０
℃で静置した後、５０mＭリン酸緩衝液（pＨ６.０）で
平衡化した SP-Sepharose（５ｃｍＩＤ×１０ｃｍＬ、
アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）に通液し、
吸着、洗浄した後、６００ｍＭＮａＣｌ／５０mＭリン
酸緩衝液（pＨ６.０）で溶出し、ＰＴＨ（１−３４）−
アペリン−３６画分を得た。この画分を、５０mＭリン
酸緩衝液＋３Ｍ尿素（pＨ６．０）で平衡化したＳＰ−
５ＰＷ（５５mmＩＤ×３００mmＬ、東ソー）に通液し、
吸着、洗浄した後、３５ｍｌ／分の流速で２０−６０％
Ｂ（Ｂ＝５０mＭリン酸緩衝液＋１Ｍ ＮａＣｌ＋３Ｍ尿
素、pＨ６．０）の段階勾配で１００分間の溶出を行
い、ＰＴＨ（１−３４）−アペリン−３６画分（溶出時
間約５０分）を得た。この画分を、さらに０.１％トリ
フルオロ酢酸で平衡化したＯＤＳ−１２０Ｔ（２１.５m
mＩＤ×３００mmＬ、昭和電工）に通液し、吸着、洗浄
した後、５ｍｌ／分の流速で２０−５０％Ｂ（Ｂ：８０
％アセトニトリル／ ０.１％トリフルオロ酢酸）の段階
勾配で６０分間の溶出を行い、ＰＴＨ（１−３４）−ア
ペリン−３６画分（溶出時間約５５分）をプールした
後、凍結乾燥を行い、ＰＴＨ（１−３４）−アペリン−
３６凍結乾燥粉末約４０mｇを得た。精製段階各工程の
サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析（ゲル：PEPTIDE PA
GE MINI (TEFCO)；還元条件：１００℃・１分）した結
果を図１に示す。

【００３１】実施例１−３ タンパク質分解酵素切断に
よるアペリン−３６の調製 実施例１−２で得たＰＴＨ（１−３４）−アペリン−３
６凍結乾燥粉末２０mｇを２０ｍｌの５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）溶液に溶解した後、エンテロキナーゼ
（Ｎｏｖａｇｅｎ社）１３単位を加え、２５℃で１７時
間反応した。反応終了後、反応液をｐＨ６．０に調整
し、５０mＭリン酸緩衝液＋３Ｍ尿素（pＨ６．０）で平
衡化したＳＰ−５ＰＷ（２１．５mmＩＤ×１５０mmＬ、
東ソー）に通液し、吸着、洗浄した後、６ｍｌ／分の流
速で０−６０％Ｂ（Ｂ＝５０mＭリン酸緩衝液＋１Ｍ Ｎ
ａＣｌ＋３Ｍ尿素、pＨ６．０）の段階勾配で６０分間
の溶出を行い、アペリン−３６画分（溶出時間約３５
分）を得た。この画分を、さらに０.１％トリフルオロ
酢酸で平衡化したＯＤＳ−１２０Ｔ（２１.５mmＩＤ×
３００mmＬ、昭和電工）に通液し、吸着、洗浄した後、
５ｍｌ／分の流速で２０−５０％Ｂ（Ｂ：８０％アセト
ニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸）の段階勾配で５
０分間の溶出を行い、アペリン−３６画分（溶出時間約
４０分）をプールした後、凍結乾燥を行い、アペリン−
３６凍結乾燥粉末約５mｇを得た。各段階のサンプルを
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析（ゲル：PEPTIDE PAGE MINI (T
EFCO)；還元条件：１００℃・１分）した結果を図２に
示す。

【００３２】実施例１−４ アペリン−３６の特徴の決
定 （ａ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した（酸加水分解
（６Ｎ塩酸−４％チオグリコール酸、１１０℃２４、４
８時間加水分解））。その結果、アペリン−３６のＤＮ
Ａ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表
１）。

【００３３】

【表１】

【００３４】（ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（Ｐ
Ｅアプライドバイオシステムズ モデル４９２）を用い
て決定した（アペリン−３６ １００ｐｍｏｌを用いて
分析を行った）。その結果、アペリン−３６のＤＮＡ塩
基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した
（表２）。

【００３５】

【表２】

【００３６】実施例１−５ 生物活性測定 実施例１−３で取得したアペリン−３６を用いて、特願
平１０−２７１６４６号に記載の方法（サイトセンサ
ー）で活性を測定し、合成品と同等の活性を有すること
を確認した。

【００３７】実施例２ ヒトＧＰＲ８リガンド（ｈＧＰ
Ｒ８Ｌ）の製造 実施例２−１ ＰＴＨ（１−３４）−ｈＧＰＲ８Ｌをコ
ードするＤＮＡの製造 （ａ）ＤＮＡ断片の合成 以下に示す８種のＤＮＡオリゴマー（配列表中、配列番
号：３５〜４２）を用いて、以下のとおりＰＴＨ（１−
３４）−ｈＧＰＲ８Ｌの構造遺伝子を調製した。 ＃１： 5'-TATGTCTGTGTCCGAGATTCAGTTAATGCATAACCTTGG
CAAACAT（配列番号：３５） ＃２： 5'-TTGAACTCCATGGAGCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAG
TTGCAGGATGT（配列番号：３６） ＃３： 5'-GCACAATTTTGGTTCTGGTTCTGGTGATGACGACGACAA
GTGGTATAAACATGTGG（配列番号：３７） ＃４： 5'-CGAGCCCGCGTTATCATACCGTGGGCCGTGCGGCGGGCC
TGCTGATGGGCCTGTGAG（配列番号：３８） ＃５： 5'-TGGAGTTCAAATGTTTGCCAAGGTTATGCATTAACTGAA
TCTCGGACACAGACA（配列番号：３９） ＃６： 5'-AAAATTGTGCACATCCTGCAACTTCTTACGCAGCCATTC
TACACGCTCCA（配列番号：４０） ＃７： 5'-CGCGGGCTCGCCACATGTTTATACCACTTGTCGTCGTCA
TCACCAGAACCAGAACC（配列番号：４１） ＃８： 5'-GATCCTCACAGGCCCATCAGCAGGCCCGCCGCACGGCCC
ACGGTATGATAA（配列番号：４２）

【００３８】（ｂ）ＤＮＡオリゴマーのリン酸化 ５’になるべき＃１（配列番号：３５）および＃８（配
列番号：４２）を除いた６種のＤＮＡオリゴマー（＃２
〜＃７、配列番号：３６〜４１）各々を、２５μｌのリ
ン酸化反応液〔ＤＮＡオリゴマー１０μｇ、５０mＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、pＨ７.６、 １０mＭ ＭｇＣl₂、 １m
Ｍスペルミジン、１０mＭジチオスレイトール（以後Ｄ
ＴＴと略記）、０.１mｇ／mｌウシ血清アルブミン（以
後ＢＳＡと略記）、１mＭ ＡＴＰ、１０ユニットＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）〕中で３７℃、１時
間反応させ、各オリゴマーの５’末端をリン酸化した。
フェノール処理を行った後、２倍量のエタノールを加
え、−７０℃に冷却した後、遠心でＤＮＡを沈殿させ
た。

【００３９】（ｃ）ＤＮＡフラグメントの連結 上記（ａ）で得られたＤＮＡフラグメントと＃１（配列
番号：３５）および＃８（配列番号：４２）を合わせ１
２０μｌとした。この混合液を９０℃で１０分間保った
後、室温まで徐冷しアニーリングを行った後、DNA Liga
tion Kit ver.2（宝酒造）を用いてライゲーション反応
を行った。アニーリング液３０μｌにＩＩ液３０μｌを
加えよく混合した後、Ｉ液６０μｌを加え、３７℃、１
時間反応させ、ライゲーションを行った。フェノール処
理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加
え、−７０℃に冷却した後、遠心でＤＮＡを沈殿させ
た。この様にして得られたＤＮＡフラグメントをＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）によるリン酸化を行
った後、以下の（ｄ）に供した。

【００４０】（ｄ）ＰＴＨ（１−３４）−ｈＧＰＲ８Ｌ
発現ベクターの構築 発現用ベクターとしては、ＷＯ００／４０６１０に記載
されているｐＴＣＩＩをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（宝
酒造）で３７℃、２時間消化した後、１％アガロースゲ
ル電気泳動により４.４ｋｂのＤＮＡ断片をQIAquick Ge
l Extraction Kit（キアゲン社）を用いて抽出し、２５
μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このｐＣＴＩＩのＮｄｅ
Ｉ、ＢａｍＨＩ断片と上記により調製したＰＴＨ（１−
３４）−ｈＧＰＲ８Ｌの構造遺伝子をDNA ligation kit
ver.2（宝酒造）を用いてライゲーション反応を行っ
た。この反応液を１０μｌ用いて大腸菌ＪＭ１０９コン
ピテントセル（東洋紡）を形質転換し、１０μｇ／ｍｌ
のテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、３７
℃で１晩培養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニー
を選んだ。この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養し、QI
Aprep8 Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプラスミ
ドｐＴＣＰＴＨｈＧＰＲ８Ｌを調製した。このＰＴＨ
（１−３４）−ｈＧＰＲ８Ｌ構造遺伝子部分の塩基配列
をアプライドバイオシステムズ社モデル３７７ＤＮＡシ
ーケンサーを用いて確認した。プラスミドｐＴＣＰＴＨ
ｈＧＰＲ８Ｌで大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）を形質転換
し、ＰＴＨ（１−３４）−ｈＧＰＲ８Ｌ発現株ＭＭ２９
４（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＴＨｈＧＰＲ８Ｌを得た。

【００４１】（ｅ）ＰＴＨ（１−３４）−ｈＧＰＲ８Ｌ
の製造 大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＴＨｈＧＰＲ８
Ｌを５．０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地
に２０ｍｌ（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０５
％塩化ナトリウム）を用いて２００ｍｌ容フラスコ中で
３７℃、８時間振とう培養した。得られた培養液１．５
ｍｌを３０ｍｌの主発酵培地（１．６８％リン酸１水素
ナトリウム、０．３％リン酸２水素カリウム、０．１％
塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０
２５％硫酸マグネシウム、０．０００２５％、塩酸チア
ミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込
んだ２００ｍｌ容フラスコへ移植して、３７℃で振とう
培養を開始した。培養液の濁度が１５０クレット単位に
なったところで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシドの最終濃度が１０ｍｇ／Ｌになるように添加
し、さらに３時間培養を行った。この操作を６本同時に
行った。培養終了後、培養液（１８０ｍｌ）を遠心分離
し、約０．７ｇ湿菌体を取得し、−８０℃で保存した。

【００４２】実施例２−２ ＰＴＨ（１−３４）−ｈＧ
ＰＲ８Ｌの精製 実施例２−１で得た菌体０．７ｇに10mM EDTA (pH6) ２
０ｍｌを加えた後、超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯ
ＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０）した後、遠心分離
（１５０００ｒｐｍ、１５分）を行った。沈殿物に再び
同様の操作を行った。沈殿物に８Ｍ尿素溶液５ｍｌを加
えて２時間攪拌した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、
１５分）を行った。上清を０．１％ ＴＦＡで平衡化し
たＣ４Ｐ−５０（１ｃｍ×２５ｃｍ、昭和電工）に通液
し、吸着、洗浄した後、１−１００％Ｂ（Ｂ：８０％ア
セトニトリル／ ０.１％トリフルオロ酢酸）の段階勾配
(流速２ｍｌ／分)で溶出を行った。ＰＴＨ（１−３４）
−ｈＧＰＲ８Ｌ画分（溶出時間約３０分）をプールした
後、凍結乾燥を行い、ＰＴＨ（１−３４）−ｈＧＰＲ８
Ｌ凍結乾燥粉末約１ｍｇを得た。

【００４３】実施例２−３ ｈＧＰＲ８Ｌの精製 実施例２−２で得たＰＴＨ（１−３４）−ｈＧＰＲ８Ｌ
凍結乾燥粉末０．８mｇを０．８ｍｌの５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）溶液に溶解した後、エンテロキナーゼ
（Ｎｏｖａｇｅｎ社）０．８単位を加え、２５℃で２０
時間反応した。反応終了後、０.１％トリフルオロ酢酸
で平衡化したＣ４Ｐ−５０（４．６mm×２５０mm、昭和
電工）に通液し、吸着、洗浄した後、２０−５０％Ｂ
（Ｂ：８０％アセトニトリル／ ０.１％トリフルオロ酢
酸）の段階勾配を０．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、
ｈＧＰＲ８Ｌ画分（溶出時間約３０分）をプールした
後、凍結乾燥を行い、ｈＧＰＲ８Ｌ凍結乾燥粉末約０．
１２ｍｇを得た。

【００４４】実施例２−４ ｈＧＰＲ８Ｌの特徴の決定 （ａ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（Ｐ
Ｅアプライドバイオシステムズ モデル４９２）を用い
て決定した。その結果、ｈＧＰＲ８ＬのＤＮＡ塩基配列
から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した。

【表３】

【００４５】実施例２−５ 生物活性測定 （１）ヒト脳由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒト
ＧＰＲ８ ｃＤＮＡの増幅 ヒト脳由来poly (A) ⁺RNA（クローンテック）を鋳型と
して、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行なっ
た。逆転写反応は、RNA PCR ver 2.1キット（宝酒造）
に含まれる試薬を使用した。次にこの逆転写生成物を鋳
型として用い、配列番号：５５および配列番号：５６で
表される合成プライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を
行なった。合成プライマーは受容体タンパク質に翻訳さ
れる領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その
際に遺伝子の５’側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基
配列が付加され、３’側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する
塩基配列が付加されるように、５’側および３’側にそ
れぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成
は、ｃＤＮＡ鋳型５μｌ、合成ＤＮＡプライマー各0.4
μＭ、0.8ｍＭ ｄＮＴＰｓ、Ｐｆｕポリメラーゼ（ス
トラタジーン）０．５μｌおよび酵素に付属のバッファ
ーで、総反応量は５０μｌとした。増幅のためのサイク
ルはサーマルサイクラー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）を用い、９４℃・６０秒の加熱の後、９４℃・６０
秒、６５℃・６０秒、７２℃・１５０秒のサイクルを３
５回繰り返した。増幅産物の確認は、０．８％アガロー
スゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によっ
て行なった。 （２）ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクロー
ニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読による
増幅ｃＤＮＡ配列の確認 （１）で行なったＰＣＲ反応液を０．８％の低融点アガ
ロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみ
そりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノ
ール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行な
ってＤＮＡを回収した。PCR-SCripT^TM Amp SK(+)クロー
ニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収し
たＤＮＡをプラスミドベクターpCR-SCripT Amp SK(+)へ
サブクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Esch
erichia coli) ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡）に
導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクロ
ーンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌを含む
ＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅
菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体ＤＨ５α／
ＧＰＲ８を得た。個々のクローンをアンピシリンを含む
ＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit（キア
ゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製した
ＤＮＡの一部に対して制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩ
による切断を行ない、挿入されている受容体ｃＤＮＡ断
片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応は
DyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit（ＰＥ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケ
ンサーを用いて解読した。 （３）ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞の樹立 ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞の作製参考例２で配列が確認さ
れたヒト脳由来のＧＰＲ８の全長アミノ酸配列をコード
し５’側にＣｌａＩ認識配列を付加し、また３’側にＳ
ｐｅＩ認識配列を付加した遺伝子が導入されたプラスミ
ドによって形質転換された大腸菌のクローンからPlasmi
d Midi KIT（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調
製し、これを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで消化し
てインサートＤＮＡを切り出した。インサートＤＮＡは
電気泳動後、アガロースゲルからカミソリで切り出し、
次に細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホル
ム抽出、エタノール沈殿の操作により回収された。この
インサートＤＮＡをＣｌａＩおよびＳｐｅＩで切断した
動物細胞発現用ベクタープラスミドpAKKO-111H（S.Hinu
mA eT Al.、BioChim. Biophys. ACTA、1219巻、251-259
頁、1994年、記載のpAKKO1.11Hと同一のベクタープラス
ミド）に加え、Ｔ４リガーゼ（宝酒造）を用いてライゲ
ーションを行ない、タンパク質発現用プラスミドｐＡＫ
ＫＯ−ＧＰＲ８を構築した。このプラスミドｐＡＫＫＯ
−ＧＰＲ８で形質転換した大腸菌をＤＨ５α／ｐＡＫＫ
Ｏ−ＧＰＲ８（Escherichia coli ＤＨ５α／ｐＡＫＫ
Ｏ−ＧＰＲ８）と命名した。大腸菌ＤＨ５α／ｐＡＫＫ
Ｏ−ＧＰＲ８を培養後、Plasmid Midi Kit（キアゲン）
を用いてｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８プラスミドＤＮＡを調製
した。これをCellPhect Transfection Kit（アマシャム
ファルマシアバイオテク）を用いて、添付のプロトコー
ルに従ってＣＨＯ ｄｈｆｒ^-細胞に導入した。４．５
μｇのＤＮＡをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、
２４時間前に５ｘ１０⁵または１ｘ１０⁶個のＣＨＯ ｄ
ｈｆｒ^-細胞を播種した直径６ｃｍシャーレに添加し
た。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培
養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児
血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地
中に増殖してくるＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞である形質転
換細胞のコロニー４７クローンを選択した。 （４）全長ヒトＧＰＲ８タンパク質ｍＲＮＡの発現量の
高いＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株の選択 （３）で樹立されたＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株４７クロー
ンの全長ＧＰＲ８タンパク質ｍＲＮＡの発現量をCytost
ar T Plate（アマシャムファルマシアバイオテク）を用
い、添付のプロトコールに従って以下のように測定し
た。ＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株の各クローンをCytostar T
Plateに１ウェル当たり２．５ｘ１０⁴個ずつ播種して
２４時間培養した後、１０％ホルマリンによって細胞を
固定した。各ウェルに０．２５％ Triton X-100を添加
して細胞の透過性をあげた後、³⁵Ｓラベルした配列番
号：５のｒｉｂｏｐｒｏｂｅを加えてハイブリダイズさ
せた。２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを各ウェルに加え
て遊離のｒｉｂｏｐｒｏｂｅを消化し、プレートをよく
洗浄した後、ハイブリダイズしたｒｉｂｏｐｒｏｂｅの
放射活性をTopcounterで測定した。放射活性の高い細胞
株は、ｍＲＮＡ発現量が高い。ｍＲＮＡ発現量の高い３
クローン（＃１７、４１および４６）を以下の実験に用
いたが、特にクローン番号１７を用いた。 （５）ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ
産生量の測定 （４）で作製したＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞およびｍｏｃｋ
ＣＨＯ細胞を２４穴プレートに５ｘ１０⁴ 細胞／ウ
ェルで播種し、４８時間培養した。細胞を０．２ｍＭ
３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％ ＢＳ
Ａと２０ｍＭＨＥＰＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ
７．４）で洗浄した（以下、０．２ｍＭ ３−イソブチ
ル−メチルキサンチンと０．０５％ ＢＳＡと２０ｍＭ
ＨＥＰＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）
を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後０．５ｍｌの反
応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温した。反
応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バ
ッファーを細胞に加えた後、試料と２μＭフォルスコリ
ンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加
え、３７℃で２４分間反応させた。１００μｌの２０％
過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置
くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出した。抽出液中のｃ
ＡＭＰ量は、ｃＡＭＰ ＥＩＡキット（アマシャムファ
ルマシアバイオテク）を用いて測定した。実施例２−３
で取得したｈＧＰＲ８Ｌを用いて、ｃＡＭＰ産生量を測
定した結果、合成品と同等の活性を有することを確認し
た。

【００４６】実施例３ ヒトＺＡＱリガンド（ｈＺＡＱ
リガンド）の製造 実施例３−１ ＰＴＨ（１−３４）−ｈＺＡＱリガンド
をコードするＤＮＡの製造 （ａ）ＤＮＡ断片の合成 以下に示す８種のＤＮＡオリゴマー（配列番号：４５〜
５２）を用いて、以下のとおりＰＴＨ（１−３４）−ｈ
ＺＡＱリガンドのＮ末端部分の構造遺伝子を調製した。 ＃１： 5'-TATGTCTGTGTCCGAGATTCAGTTAATGCATAACCTTGG
CAAACAT（配列番号：４５） ＃２： 5'-TTGAACTCCATGGAGCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAG
TTGCAGGATGT（配列番号：４６） ＃３： 5'-GCACAATTTTGGTTCTGGTTCTGGTGATGACGACGACAA
GG（配列番号：４７） ＃４： 5'-CGGTGATTACCGGTGCGTGCGAACGTGATGTGCAGTGCG
GTGCGGGTAC（配列番号：４８） ＃５： 5'-TGGAGTTCAAATGTTTGCCAAGGTTATGCATTAACTGAA
TCTCGGACACAGACA（配列番号：４９） ＃６： 5'-AAAATTGTGCACATCCTGCAACTTCTTACGCAGCCATTC
TACACGCTCCA（配列番号：５０） ＃７： 5'-CACCGCCTTGTCGTCGTCATCACCAGAACCAGAACC
（配列番号：５１） ＃８： 5'-CGCACCGCACTGCACATCACGTTCGCACGCACCGGTAAT
（配列番号：５２）

【００４７】（ｂ）ＤＮＡオリゴマーのリン酸化 ５’になるべき＃１（配列番号：４５）および＃8（配
列番号：５２）を除いた６種のＤＮＡオリゴマー（＃２
〜＃７）各々を、２５μｌのリン酸化反応液〔ＤＮＡオ
リゴマー１０μｇ、５０mＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pＨ７.
６、 １０mＭＭｇＣｌ₂、 １mＭスペルミジン、１０mＭ
ジチオスレイトール（以後ＤＴＴと略記）、０.１mｇ／
mlウシ血清アルブミン（以後ＢＳＡと略記）、１mＭ Ａ
ＴＰ、１０ユニットＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝
酒造）〕中で３７℃、１時間反応させ、各オリゴマーの
５’末端をリン酸化した。フェノール処理を行った後、
２倍量のエタノールを加え、−７０℃に冷却した後、遠
心でＤＮＡを沈殿させた。

【００４８】（ｃ）ＤＮＡフラグメントの連結 上記（ａ）で得られたＤＮＡフラグメントと＃１（配列
番号：４５）および＃8（配列番号：５２）を合わせ１
２０μｌとした。この混合液を９０℃で１０分間保った
後、室温まで徐冷しアニーリングを行った後、DNA Liga
tion Kit ver.2（宝酒造）を用いてライゲーション反応
を行った。アニーリング液３０μｌにＩＩ液３０μｌを
加えよく混合した後、Ｉ液６０μｌを加え、３７℃、１
時間反応させ、ライゲーションを行った。フェノール処
理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加
え、−７０℃に冷却した後、遠心でＤＮＡを沈殿させ
た。この様にして得られたＤＮＡフラグメントをＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）によるリン酸化を行
った後、以下の（ｄ）に共した。

【００４９】（ｄ）ＰＴＨ（１−３４）−ｈＺＡＱリガ
ンド発現ベクターの構築 発現用ベクターとして、ｐＴＣｈ１ＺＡＱをＮｄｅＩお
よびＫｐｎＩ（宝酒造）で３７℃、２時間消化した後、
１％アガロースゲル電気泳動により４.４ｋｂのＤＮＡ
断片をQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を
用いて抽出し、２５μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。この
ｐＴＣｈ１ＺＡＱのＮｄｅＩ、ＫｐｎＩ断片と上記によ
り調製したＰＴＨ（１−３４）−ｈＺＡＱリガンドのＮ
末端部分の構造遺伝子をDNA ligation kit ver.2 （宝
酒造）を用いてライゲーション反応を行った。

【００５０】この反応液を１０μｌ用いて大腸菌ＪＭ１
０９コンピテントセル（東洋紡）を形質転換し、１０μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播
き、３７℃で１晩培養し、生じたテトラサイクリン耐性
コロニー選んだ。この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養
し、QIAprep8 Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプ
ラスミドｐＴＣＰＴＨｈ１ＺＡＱを調製した。このＰＴ
Ｈ（１−３４）−ｈＺＡＱＬ−１構造遺伝子部分の塩基
配列をアプライドバイオシステムズ社モデル３７７ＤＮ
Ａシーケンサーを用いて確認した。プラスミドｐＴＣＰ
ＴＨｈ１ＺＡＱを用いて大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）を
形質転換し、ＰＴＨ（１−３４）−ｈＺＡＱＬ−１発現
株ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＴＨｈ１ＺＡＱを得
た。

【００５１】（ｅ）ＰＴＨ（１−３４）−ｈＺＡＱリガ
ンドの製造 大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＴＨｈ１ＺＡＱ
を５．０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地に
２０ｍｌ（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５
％塩化ナトリウム）を用いて２００ｍｌ容フラスコ中で
３７℃、８時間振とう培養した。得られた培養液１．５
ｍｌを３０ｍｌの主発酵培地（１．６８％リン酸１水素
ナトリウム、０．３％リン酸２水素カリウム、０．１％
塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０
２５％硫酸マグネシウム、０．０００２５％、塩酸チア
ミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込
んだ２００ｍｌ容フラスコへ移植して、３７℃で振とう
培養を開始した。培養液の濁度が１５０クレット単位に
なったところで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシドの最終濃度が１０ｍｇ／Ｌになるように添加
し、さらに３時間培養を行った。この操作を６本同時に
行った。培養終了後、培養液（１８０ｍｌ）を遠心分離
し、約０．６ｇ湿菌体を取得し、−８０℃で保存した。

【００５２】実施例３−２ ＰＴＨ（１−３４）−ＺＡ
Ｑリガンドの精製 実施例３−１で得た菌体０．６ｇに７Ｍグアニジン塩酸
塩、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pＨ８.０）溶液２ml
を加え、約２時間攪拌した後、遠心分離（１５０００ｒ
ｐｍ、１５分）を行った。上清に０．４Ｍアルギニン、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２ｍＭ ＧＳＳＧ、
１ｍＭ ＧＳＨ（ｐＨ８．０） ５０ｍｌを加えて、４
℃で一晩活性化を行った。活性化の終了した再生液をｐ
Ｈ６．０に調整し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１
ｃｍ×３ｃｍ）に吸着させた後、６００ｍＭ ＮａＣｌ
／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出し、ＰＴ
Ｈ（１−３４）−ＺＡＱＬ−１を含むフラクションをプ
ールした。この画分を、０.１％トリフルオロ酢酸で平
衡化したＣ４Ｐ−５０（２１.５mmＩＤ×３００mmＬ、
昭和電工）に通液し、吸着、洗浄した後、２０−５０％
Ｂ（Ｂ：８０％アセトニトリル／ ０.１％トリフルオロ
酢酸）の段階勾配（６０分）で溶出を行い、ＰＴＨ（１
−３４）−ＺＡＱリガンド画分（溶出時間約３０分）を
プールした後、凍結乾燥を行い、ＰＴＨ（１−３４）−
ＺＡＱリガンド凍結乾燥粉末約１００μｇを得た。

【００５３】実施例３−３ ｈＺＡＱリガンドの精製 実施例３−２で得たPTH(1-34)-hZAQリガンド 凍結乾燥
粉末４０μｇを４０μｌの５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ
ＣａＣｌ₂、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）溶液に溶解した後、エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇ
ｅｎ社）０．８単位を加え、２５℃で２０時間反応し
た。反応終了後、０.１％トリフルオロ酢酸で平衡化し
たＣ４Ｐ−５０（４．６mm×２５０mm、昭和電工）に通
液し、吸着、洗浄した後、２０−５０％Ｂ（Ｂ：８０％
アセトニトリル／ ０.１％トリフルオロ酢酸）の段階勾
配を０．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＺＡＱリガ
ンド画分（溶出時間約３０分）をプールした後、凍結乾
燥を行い、ｈＺＡＱリガンド凍結乾燥粉末約１０μｇを
得た。

【００５４】実施例３−４ ＺＡＱリガンドの特徴の決
定 （ａ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（Ｐ
Ｅアプライドバイオシステムズ モデル４９２）を用い
て決定した。その結果、ＺＡＱリガンドのＤＮＡ塩基配
列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した。

【表４】

【００５５】（ｂ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動を用いた分析 実施例３−３で得られたＺＡＱリガンドを１００ｍＭ
ＤＴＴを添加したＳAｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［Laemml
i、 Nature, 227, 680 (1979)］に懸濁し、９５℃で１
分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬
品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシー・
ブリリアント・ブルー（Coomassie brilliant blue）で
染色した結果、１０ｋＤａに単一のタンパク質バンドが
認められ、本標品は極めて高純度であることが分かっ
た。また、大腸菌での直接発現系を用いて取得した組換
え型ＺＡＱリガンド標品との比較から、両者は分子量的
に同一であることが分かった。

【００５６】実施例３−５ 生物活性測定（ＦＬＩＰＲ
を用いた細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定） （３−５−１）ＺＡＱ受容体をコードするｃＤＮＡのク
ローニングと塩基配列の決定 ヒト脳下垂体ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型と
し、２個のプライマー、プライマー１（5'-GTCGACATGGA
GACCACCATGGGGTTCATGG-3'；配列番号：５９）及びプラ
イマー２（5'-ACTAGTTTATTTTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC-
3'；配列番号：６０）を用いてＰＣＲ反応を行った。該
反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡの１０分の１
量を鋳型として使用し、Advantage2 Polymerase Mix
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１／５０量、プライマー１及び
プライマー２を各０．２μＭ、ｄＮＴＰｓ ２００μ
Ｍ、及び酵素に添付のバッファーを加え、２５μｌの液
量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・２分の後、９４℃・
２０秒、７２℃・１００秒のサイクルを３回、９４℃・
２０秒、６８℃・１００秒のサイクルを３回、９４℃・
２０秒、６４℃・２０秒、６８℃・１００秒のサイクル
を３８回繰り返し、最後に６８℃・７分の伸長反応を行
った。該ＰＣＲ反応後の反応産物をＴＡクローニングキ
ット（Invitrogen社）の処方に従いプラスミドベクター
ｐＣＲ２．１（Invitrogen社）へサブクローニングし
た。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、ｃＤＮＡをもつク
ローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した
後、個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇタン
パク質共役型受容体タンパク質をコードする２種類のｃ
ＤＮＡ配列ＺＡＱＣ及びＺＡＱＴを得た。このｃＤＮＡ
より導き出されるアミノ酸配列を有するタンパク質はい
ずれも同一配列を有したためＺＡＱと命名し、ｃＤＮＡ
配列ＺＡＱＣを含有する形質転換体を大腸菌（Escheric
hia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ＺＡＱＣならびに
ｃＤＮＡ配列ＺＡＱＴを含有する形質転換体を大腸菌Ｄ
Ｈ５α／ｐＣＲ２．１−ＺＡＱＴと命名した。

【００５７】（３−５−２）ＺＡＱ受容体を活性化する
ペプチドの単離 （３−５−２―１）牛乳抽出液の調製 市販の低温殺菌牛乳を用いて、以下の操作を行い抽出液
を調製した。牛乳２literを高速遠心機（ＣＲ２６Ｈ、
Ｒ１０Ａ型ローター：日立株式会社）を用いて、10,000
ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心し、得られた上清をガー
ゼでろ過し、脂質片を取り除いた。上清に最終濃度１Ｍ
になるように酢酸を加え、４℃にて３０分間攪拌し、次
いで高速遠心機（ＣＲ２６Ｈ、Ｒ１０Ａ型ローター：日
立株式会社）を用いて10,000ｒｐｍ、１５分間遠心し上
清をガーゼでろ過し不溶物を除去した。上清に撹拌しな
がら２倍容のアセトンを加え４℃にて３時間攪拌した。
次いで高速遠心機（ＣＲ２６Ｈ、Ｒ１０Ａ型ローター：
日立株式会社）を用いて10,000ｒｐｍ、１５分間遠心
後、得られた上清をガーゼでろ過し不溶物を除去した。
得られた上清をロータリーエバポレーターにかけ、アセ
トンを除去し、最終的に１３５０ｍｌまで濃縮した。得
られた濃縮液を、６７５ｍｌごとに３３８ｍｌのジエチ
ルエーテルと混合し、分液ロート中にて激しく混和し、
２相分離後、水相を得た。得られた水相について同じ操
作をさらに１回繰り返し、清澄な水相を得た。得られた
水相を、ロータリーエバポレーターを用いて８００ｍｌ
まで濃縮し、最終的な抽出液を得た。

【００５８】（３−５−２―２）牛乳抽出液のＣ１８逆
相クロマトグラフィーによる粗分画 オクタデシル基を固定したシリカゲルを充填したカラム
Sep-PAk C18（Waters社）１０ｇをメタノールで膨潤
後、１Ｍ酢酸で平衡化した。このカラムに、（２―１）
で調製した抽出液（牛乳２liter分）を添着した。続い
て、このカラムに、１００ｍｌの１Ｍ酢酸を流しゲルを
洗浄した。次に、このカラムに２００ｍｌの６０％ ア
セトニトリル/0.1％ トリフルオロ酢酸を流し、目的と
する粗ペプチド成分を溶出した。得られた溶出液を、エ
バポレーターを用いて濃縮した後、凍結乾燥機（12EL；
Virtis社）にて凍結乾燥した。

【００５９】（３−５−２−３）牛乳抽出液のスルホプ
ロピルイオン交換クロマトグラフィーによる粗分画 ポリプロピレン製のカラムに１００ｍＭ塩酸中で膨潤さ
せたSP Sephadex C-25（Amersham Pharmacia Biotech
社）を、容量が２ｍｌになるよう充填し、蒸留水及び２
Ｍギ酸アンモニウム（pH 4.0）で洗浄した後、Ｉ液（２
Ｍギ酸アンモニウム：アセトニトリル：水＝１：２５：
７４）で平衡化した。上記（３−５−２−２）で得られ
た凍結乾燥物をＩ液２０ｍｌに溶解し、SP Sephadex C-
25 ２ｍｌにロードした。Ｉ液１０ｍｌで洗浄後、ＩＩ
液（２Ｍギ酸アンモニウム：アセトニトリル：水＝１：
２．５：６．５）、ＩＩＩ液（２Ｍギ酸アンモニウム：
アセトニトリル：水＝１：１：２）、ＩＶ液（２Ｍギ酸
アンモニウム：アセトニトリル：水＝１：０．５：０．
５）各１０ｍｌで順次溶出した。得られたＩ液からＩＶ
液を、それぞれ凍結乾燥機（12EL；Virtis社）にて凍結
乾燥した。

【００６０】（３−５−２―４）牛乳抽出液のTSKGel O
DS80Ts逆相高速液体クロマトグラフィーによる分画 TSKGel ODS-80Ts逆相高速液体クロマトグラフィー用カ
ラム（東ソー株式会社、4.6 mm x 25 cm）を、４０℃に
て、流速１ｍｌ／ｍｉｎでＡ液（0.1％トリフルオロ酢
酸/蒸留水）容量81.7％/Ｂ液（0.1％トリフルオロ酢酸/
60％アセトニトリル）容量8.3％を流し、平衡化した。
上記（３−５−２―３）で得られたＩ液からＩＶ液の凍
結乾燥物を、それぞれ１Ｍ酢酸４ｍｌに溶解しクロマト
グラフィー操作に処した。即ち、凍結乾燥物の溶液４ｍ
ｌを該カラムに添着した後、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、１
分間かけてＡ液容量６７％／Ｂ液容量３３％まで上昇さ
せ、次いで４０分間かけてＡ液容量６７％／Ｂ液容量３
３％からＡ液容量０％／Ｂ液容量１００％まで、Ｂ液濃
度を直線的グラジエントで上昇させた。溶出液を、１ｍ
ｌずつフラクション番号をつけて分取し、各フラクショ
ン２μｌを１５０μｌの０．２％ Bovine Serum Albumi
n（BSA）/蒸留水と混合し凍結乾燥した。この乾燥物を
後述の（３−５−２−５）に記した細胞内Ｃａイオン濃
度上昇活性測定用のアッセイ用サンプルとした。

【００６１】（３−５−２―５）ＦＬＩＰＲを用いた細
胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定 ＺＡＱ安定発現細胞株は以下のようにして調製した。す
なわち、上記（３−５−１）で得たＤＨ５α／ｐＣＲ
２．１−ＺＡＱＣの１クローンを、アンピシリンを含む
ＬＢ培地で振とう培養し、プラスミドｐＣＲ２．１−Ｚ
ＡＱＣを得た。これを制限酵素ＳａｌＩおよびＳｐｅＩ
で処理し、ＺＡＱＣをコードするインサート部分を切り
出した。同様に制限酵素ＳａｌＩおよびＳｐｅＩで処理
したpAKKO−1.11Hと、該インサート部分をLigation Exp
ress Kit（CLONTECH Laboratories， Inc．（CA，US
A））を用いて連結し、大腸菌ＤＨ１０Ｂにエレクトロ
ポーレーション法にて導入した。得られたクローンの有
するプラスミドの構造を、制限酵素処理ならびに配列解
析で確認し、正しい構築のものをＣＨＯ細胞発現用プラ
スミドｐＡＫ−ＺＡＱＣとして使用した。このプラスミ
ドｐＡＫ−ＺＡＱＣをＣＨＯ／ｄｈｆｒ^-細胞（America
n Type Culture Collection）にCellPhect Transfectio
n kit（Amersham Pharmacia Biotech社）を用いて形質
導入することにより取得した。まず、蒸留水１２０μｌ
に溶解したプラスミドＤＮＡ ４μｇに対してBuffer A
（CellPhect TransfectionKitに添付）１２０μｌを添
加し、撹拌し、１０分間静置後、Buffer B（CellPhect
Transfection Kitに添付）２４０μｌを添加し、激しく
撹拌し該ＤＮＡを含有するＤＮＡ−リン酸カルシウム複
合体を形成させた。５ｘ１０⁵個のＣＨＯ／ｄｈｆｒ^-細
胞を６０ｍｍシャーレに播き、１０％のウシ胎児血清
（BIO WHITTAKER 社）を含むＨａｍ'ｓ Ｆ−１２培地
（日水製薬株式会社）中で３７℃、５％炭酸ガス中で１
日間培養した後、該ＤＮＡ−リン酸カルシウム複合体の
懸濁液４８０μｌをシャーレの該細胞上に滴下させた。
これを、３７℃、５％炭酸ガス中にて６時間培養した
後、血清を含まないＨａｍ'ｓ Ｆ−１２培地で２回細胞
を洗浄し、シャーレの該細胞上に１５％グリセロールを
含む緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ、１．４ｍＭ Ｎａ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．１）１．２ｍｌ
を添加し２分間処理した。これを、再度、血清を含まな
いＨａｍ'ｓ Ｆ−１２培地で２回洗浄した後、１０％の
ウシ胎児血清を含むＨａｍ'ｓ Ｆ−１２培地中で３７
℃、５％炭酸ガス中で一晩培養した。該細胞をトリプシ
ン処理により分散させてシャーレから回収し、２ｘ１０
⁴個ずつ６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに植え込み、透析済み
１０％ウシ胎児血清（JRH BIOSCIENCES 社）、１ｍＭ
ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（大日本製薬株式会社）、10
0 units/ml Penicillin、100 μg/ml Streptomycinを含
む Dulbecco's modified Eagle medium (ＤＭＥＭ) 培
地（日水製薬株式会社）中にて３７℃、５％炭酸ガス中
にて培養を開始した。プラスミドの導入された形質転換
ＣＨＯ細胞は該培地中で生育するが、非導入細胞は次第
に死滅していくので、培養開始１日目、および２日目に
培地を交換して死滅細胞を除去した。培養開始８−１０
日後に生育してきた形質転換ＣＨＯ細胞のコロニーを約
２１個選んだ。それぞれ選択された細胞からＲＮＡを市
販のＲＮＡ単離用キットを用いて回収し、以降公知のＲ
Ｔ−ＰＣＲ法によりＺＡＱを高発現するＺＡＱ発現ＣＨ
Ｏ細胞Ｂ−１番クローン(以後ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞と略
称する)を選別した。また、対照としてＥＴＡ（エンド
セリンＡ受容体）発現ＣＨＯ細胞２４番クローン（以後
ＥＴＡ２４細胞と略称する。Journal of Pharmacology
and Experimental Therapeutics, 279巻、675-685頁、1
996年参照）を用いた。上記（３−５−２―４）で得ら
れたアッセイ用サンプルについて、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞
及びＥＴＡ２４細胞における細胞内Ｃａイオン濃度上昇
活性の測定をＦＬＩＰＲ（Molecular Devices社）を用
いて行った。ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞、ＥＴＡ２４細胞共に
１０％透析処理済ウシ胎児血清(以後ｄＦＢＳとする)を
加えたＤＭＥＭで継代培養しているものを用いた。ＺＡ
ＱＣ−Ｂ１細胞、ＥＴＡ２４細胞をそれぞれ１５ｘ１０
⁴ Ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように培地（１０％ ｄＦＢ
Ｓ−ＤＭＥＭ）に懸濁し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート
(Black plate Clear bottom、Coster社)に分注器を用い
て各ウェルに２００μｌずつ植え込み(３．０ｘ１０⁴
Ｃｅｌｌｓ／２００μｌ/ウェル)、５％ ＣＯ₂インキュ
ベーター中にて３７℃で一晩培養した後用いた(以後細
胞プレートとする)。Ｈ／ＨＢＳＳ（ニッスイハンクス
２（日水製薬株式会社）９．８ｇ、炭酸水素ナトリウム
０．３５ｇ、ＨＥＰＥＳ ４．７７ｇ 、水酸化ナトリ
ウム溶液でｐＨ７．４に合わせた後、フィルター滅菌処
理）２０ｍｌ、２５０ｍＭ Probenecid ２００μｌ、ウ
シ胎児血清（FBS）２００μｌを混合した。また、Fluo
3-AM（同仁化学研究所）２バイアル（５０μｇ）をジメ
チルスルフォキサイド４０μｌ、２０％ Pluronic Acid
（Molecular Probes社）４０μｌに溶解し、これを上記
Ｈ／ＨＢＳＳ−Probenecid−ＦＢＳに加え、混和後、８
連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウ
ェル１００μｌずつ分注し、５％ ＣＯ₂インキュベータ
ー中にて３７℃で１時間インキュベートした(色素ロー
ディング)。上記（３−５−２―４）で得られたアッセ
イ用サンプルについて、各フラクションに、2.5 mM Pro
benecid、0.2％ BSAを含むＨ／ＨＢＳＳ１５０μｌを加
えて希釈し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート(V-Bottomプ
レート、Coster社)へ移した(以後、サンプルプレートと
する)。細胞プレートの色素ローディング終了後、Ｈ／
ＨＢＳＳに2.5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファー
でプレートウォッシャー(Molecular Devices社)を用い
て細胞プレートを４回洗浄し、洗浄後１００μｌの洗浄
バッファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレ
ートをＦＬＩＰＲにセットしアッセイを行った（ＦＬＩ
ＰＲにより、サンプルプレートから５０μｌのサンプル
が細胞プレートへと移される）。その結果、上記（３−
５−２−３）ＩＶ液を上記（３−５−２―４）逆相高速
液体クロマトグラフィー分離して得られたフラクション
Ｎｏ．５３にＺＡＱＣ−Ｂ１細胞に特異的な細胞内Ｃａ
イオン濃度上昇活性が見られた。 （３−５−３）ＺＡＱリガンドの活性測定（ＦＬＩＰＲ
を用いた細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定） 実施例３−３で得られた組換え型ＺＡＱリガンド標品に
ついて、上記（３−５−２−５）で得られたＺＡＱ発現
細胞（ＺＡＱＣ−Ｂ１）における細胞内Ｃａイオン濃度
上昇活性の測定をＦＬＩＰＲを用いて行った。また、対
照としてhOT7T175発現細胞(hOT7T175-16；ＷＯ００／２
４８９０に記載)を用いた。ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞、hOT7T
175-16細胞共に１０％透析処理済ウシ胎児血清(以後ｄ
ＦＢＳとする)を加えたＤＭＥＭで継代培養しているも
のを用いた。ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞、hOT7T175-16細胞を
それぞれ１５ｘ１０⁴ Ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように
培地（１０％ｄＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に懸濁し、ＦＬＩＰ
Ｒ用９６穴プレート(Black plate Clear bottom、Coste
r社)に分注器を用いて各ウェルに２００μｌずつ播き
(３．０ｘ１０⁴ Ｃｅｌｌｓ／２００μｌ/ウェル)、５
％ ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃で一晩培養した
後、用いた(以後細胞プレートとする)。Ｈ／ＨＢＳＳ
（ＨＡＮＫＳ' ９．８ｇ、炭酸水素ナトリウム０．３５
ｇ、ＨＥＰＥＳ ４．７７ｇ 、水酸化ナトリウム溶液
でｐＨ７．４に合わせた後、フィルター滅菌処理）２１
ｍｌ、２５０ｍＭ Probenecid ２１０μｌ、ウシ胎児血
清（ＦＢＳ）２１０μｌを混合した。また、Fluo3-AM
２バイアル(５０μｇ)をジメチルスルフォキサイド４２
μｌ、２０％ Pluronic Acid ４２μｌに溶解し、これ
を上記H/HBSS−Probenecid−FBS に加え、混和後、８連
ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェ
ル１００μｌずつ分注し、５％ＣＯ₂インキュベーター
中で３７℃で１時間インキュベートした(色素ローディ
ング)。上記（４−３―３）で得られたアッセイ用サン
プルについて、各フラクションにＨ／ＨＢＳＳに2.5mM
Probenecid 、0.2％ BSAを加えたもの１５０μｌを加え
て溶解しＦＬＩＰＲ用９６穴プレート(V-Bottomプレー
ト、Coster社)へ移した(以後、サンプルプレートとす
る)。細胞プレートの色素ローディング終了後、Ｈ／Ｈ
ＢＳＳに2.5mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプ
レートウォッシャー(Molecular Devices社)を用いて細
胞プレートを４回洗浄し、洗浄後１００μｌの洗浄バッ
ファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレート
をＦＬＩＰＲにセットし、アッセイを行った(ＦＬＩＰ
Ｒにより、サンプルプレートから０．０５ｍｌのサンプ
ルが細胞プレートへと移される)。その結果、ＣＯＳ７
細胞由来の組換え型ＺＡＱリガンド標品および大腸菌で
の直接発現系を用いて取得した組換え型ＺＡＱリガンド
標品と比較して、同等の活性を有していた。

【００６２】

【発明の効果】本発明の製造方法は、目的とするペプチ
ドのＮ末端のＭｅｔ残基を取り除く必要がなく、ＰＴＨ
（１−３４）との融合タンパク質を用いるため、目的と
するペプチドを高発現させることができるので、医薬用
等のペプチドを工業的大量に製造するのに有利である。

【００６３】

【配列表】 [SEQUENCE LISTING] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Method of Production for Peptide <130> P2001-233 <150> JP 2000-331170 <151> 2000-10-30 <150> JP 2001-195522 <151> 2001-06-28 <160> 65 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Human <400> 1 Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly 1 5 10 15 Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly 20 25 30 Pro Met Pro Phe 35 <210> 2 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for Aperin-36 <400> 2 ctggttcaac cgcgtggttc tcgtaatggt ccgggtccat ggcaaggtgg tcgtcgtaaa 60 tttcgtcgtc aacgtccgcg tctgtctcat aaaggtccga tgccgttt 108 <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Human <400> 3 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe 34 <210> 4 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for PTH(1-34) <400> 4 tctgtgtccg agattcagtt aatgcataac cttggcaaac atttgaactc gatggagcgt 60 gtagaatggc tgcgtaagaa gttgcaggat gtgcacaatt tt 102 <210> 5 <211> 84 <212> PRT <213> Human <400> 5 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Pro Gly Ser 35 40 45 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Ser Gln 84 <210> 6 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for PTH(1-84) <400> 6 tctgtgtccg agattcagtt aatgcataac cttggcaaac atttgaactc gatggagcgt 60 gtagaatggc tgcgtaagaa gttgcaggat gtgcacaatt ttgtggcctt aggtgcccca 120 ttggctcctc gtgatcctgg ttcccaaaga ccacgtaaaa aggaagacaa tgtcttagtt 180 gagagccatg aaaaatccct aggcgaggca gacaaggccg atgtgaatgt attaactaaa 240 gctaaatccc ag 252 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 7 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for Enterokinase cleavage sequence <400> 8 gatgacgacg acaag 15 <210> 9 <211> 80 <212> PRT <213> Human <400> 9 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Leu Val Gln Pro 35 40 45 Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys 50 55 60 Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe 65 70 75 80 <210> 10 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for PTH(1-34)-Aperin-36 fusion protein <400> 10 tctgtgtccg agattcagtt aatgcataac cttggcaaac atttgaactc gatggagcgt 60 gtagaatggc tgcgtaagaa gttgcaggat gtgcacaatt ttggttctgg ttctggtgat 120 gacgacgaca agctggtgca gcccagaggg tcaaggaatg ggccagggcc ctggcaggga 180 ggtcggagga aattccgccg ccagcggccc cgcctctccc ataagggacc catgcctttc 240 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Human <400> 11 Ile Glu Gly Arg 1 4 <210> 12 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for Factor Xa cleavage sequence <400> 12 attgaaggcc gc 12 <210> 13 <211> 3 <212> PRT <213> Human <400> 13 Gly Pro Arg 1 3 <210> 14 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for Thrombin cleavage sequence <400> 14 ggcccgcgc 9 <210> 15 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer #1 used in Example 1 <400> 15 tatgtctgtg tccgagattc agttaatgca taaccttggc aaacat 46 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer #2 used in Example 1 <400> 16 ttgaactcca tggagcgtgt agaatggctg cgtaagaagt tgcaggatgt 50 <210> 17 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer #3 used in Example 1 <400> 17 gcacaatttt ggttctggtt ctggtgatga cgacgacaag ctggttcaac cg 52 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer #4 used in Example 1 <400> 18 cgtggttctc gtaatggtcc gggtccatgg caaggtggtc gtcgtaaatt 50 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer #5 used in Example 1 <400> 19 tcgtcgtcaa cgtccgcgtc tgtctcataa aggtccgatg ccgttttaag 50 <210> 20 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer #6 used in Example 1 <400> 20 tggagttcaa atgtttgcca aggttatgca ttaactgaat ctcggacaca gaca 54 <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer #7 used in Example 1 <400> 21 aaaattgtgc acatcctgca acttcttacg cagccattct acacgctcca 50 <210> 22 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer #8 used in Example 1 <400> 22 gagaaccacg cggttgaacc agcttgtcgt cgtcatcacc agaaccagaa cc 52 <210> 23 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer #9 used in Example 1 <400> 23 tgacgacgaa atttacgacg accaccttgc catggacccg gaccattac 49 <210> 24 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer #10 used in Example 1 <400> 24 gatccttaaa acggcatcgg acctttatga gacagacgcg gacgt 45 <210> 25 <211> 75 <212> PRT <213> Human <400> 25 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Asp Asp Asp Asp Lys Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Arg Asn 35 40 45 Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg 50 55 60 Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe 65 70 75 <210> 26 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 <400> 26 tctgtgtccg agattcagtt aatgcataac cttggcaaac atttgaactc gatggagcgt 60 gtagaatggc tgcgtaagaa gttgcaggat gtgcacaatt ttgatgacga cgacaagctg 120 gtgcagccca gagggtcaag gaatgggcca gggccctggc agggaggtcg gaggaaattc 180 cgccgccagc ggccccgcct ctcccataag ggacccatgc ctttc 225 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Human <400> 27 Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu 20 23 <210> 28 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for ligand polypeptide for GPR8 (Human type 1 -23) <400> 28 tggtataaac atgtggcgag cccgcgttat cataccgtgg gccgtgcggc gggcctgctg 60 atgggcctg 69 <210> 29 <211> 67 <212> PRT <213> Human <400> 29 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Trp Tyr Lys His 35 40 45 Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala Ala Gly Leu Leu 50 55 60 Met Gly Leu 65 <210> 30 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for PTH(1-34)-GPR8 ligand polypeptide fusion protein <400> 30 tctgtgtccg agattcagtt aatgcataac cttggcaaac atttgaactc gatggagcgt 60 gtagaatggc tgcgtaagaa gttgcaggat gtgcacaatt ttggttctgg ttctggtgat 120 gacgacgaca agtggtataa acatgtggcg agcccgcgtt atcataccgt gggccgtgcg 180 gcgggcctgc tgatgggcct g 201 <210> 31 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 2 -1 <400> 31 tatgtctgtg tccgagattc agttaatgca taaccttggc aaacat 45 <210> 32 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 2 -1 <400> 32 ttgaactcca tggagcgtgt agaatggctg cgtaagaagt tgcaggatgt 50 <210> 33 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 2 -1 <400> 33 gcacaatttt ggttctggtt ctggtgatga cgacgacaag tggtataaac atgtgg 56 <210> 34 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 2 -1 <400> 34 cgagcccgcg ttatcatacc gtgggccgtg cggcgggcct gctgatgggc ctgtgag 57 <210> 35 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 2 -1 <400> 35 tggagttcaa atgtttgcca aggttatgca ttaactgaat ctcggacaca gaca 54 <210> 36 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 2 -1 <400> 36 aaaattgtgc acatcctgca acttcttacg cagccattct acacgctcca 50 <210> 37 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 2 -1 <400> 37 cgcgggctcg ccacatgttt ataccacttg tcgtcgtcat caccagaacc agaacc 56 <210> 38 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 2 -1 <400> 38 gatcctcaca ggcccatcag caggcccgcc gcacggccca cggtatgata a 51 <210> 39 <211> 62 <212> PRT <213> Human <400> 39 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Asp Asp Asp Asp Lys Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg 35 40 45 Tyr His Thr Val Gly Arg Ala Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu 50 55 60 <210> 40 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 <400> 40 tctgtgtccg agattcagtt aatgcataac cttggcaaac atttgaactc gatggagcgt 60 gtagaatggc tgcgtaagaa gttgcaggat gtgcacaatt ttgatgacga cgacaagtgg 120 tataaacatg tggcgagccc gcgttatcat accgtgggcc gtgcggcggg cctgctgatg 180 ggcctg 186 <210> 41 <211> 86 <212> PRT <213> Human <400> 41 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Val 35 40 45 Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Ile Asn Phe 85 <210> 42 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for ZAQ ligand <400> 42 gcggtgatta ccggtgcgtg cgaacgtgat gtgcagtgcg gtgcgggtac ctgctgcgcg 60 attagcctgt ggctgcgtgg tctgcgtatg tgcaccccgc tgggtcgtga aggtgaagaa 120 tgccatccgg gtagccataa agtgccgttc ttccgtaaac gtaaacatca tacctgcccg 180 tgcctgccga acctgctgtg cagccgtttc ccggatggtc gttatcgttg cagcatggat 240 ctgaaaaaca ttaacttt 258 <210> 43 <211> 130 <212> PRT <213> Human <400> 43 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ala Val Ile Thr 35 40 45 Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala 50 55 60 Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Thr Pro Leu Gly Arg 65 70 75 80 Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Val Pro Phe Phe Arg 85 90 95 Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser 100 105 110 Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp Leu Lys Asn Ile 115 120 125 Asn Phe 130 <210> 44 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for PTH(1-34)-human ZAQ ligand fusion protein <400> 44 tctgtgtccg agattcagtt aatgcataac cttggcaaac atttgaactc gatggagcgt 60 gtagaatggc tgcgtaagaa gttgcaggat gtgcacaatt ttggttctgg ttctggtgat 120 gacgacgaca aggcggtgat taccggtgcg tgcgaacgtg atgtgcagtg cggtgcgggt 180 acctgctgcg cgattagcct gtggctgcgt ggtctgcgta tgtgcacccc gctgggtcgt 240 gaaggtgaag aatgccatcc gggtagccat aaagtgccgt tcttccgtaa acgtaaacat 300 catacctgcc cgtgcctgcc gaacctgctg tgcagccgtt tcccggatgg tcgttatcgt 360 tgcagcatgg atctgaaaaa cattaacttt 390 <210> 45 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 3 -1 <400> 45 tatgtctgtg tccgagattc agttaatgca taaccttggc aaacat 46 <210> 46 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 3 -1 <400> 46 ttgaactcca tggagcgtgt agaatggctg cgtaagaagt tgcaggatgt 50 <210> 47 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 3 -1 <400> 47 gcacaatttt ggttctggtt ctggtgatga cgacgacaa gg 42 <210> 48 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 3 -1 <400> 48 cggtgattac cggtgcgtgc gaacgtgatg tgcagtgcg gtgcgggtac 50 <210> 49 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 3 -1 <400> 49 tggagttcaa atgtttgcca aggttatgca ttaactgaat ctcggacaca gaca 54 <210> 50 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 3 -1 <400> 50 aaaattgtgc acatcctgca acttcttacg cagccattct acacgctcca 50 <210> 51 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 3 -1 <400> 51 caccgccttg tcgtcgtcat caccagaacc agaacc 36 <210> 52 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligomer used for manufacturing a structural gene in Example 3 -1 <400> 52 cgcaccgcac tgcacatcac gttcgcacgc accggtaat 39 <210> 53 <211> 125 <212> PRT <213> Human <400> 53 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg 35 40 45 Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu 50 55 60 Arg Gly Leu Arg Met Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys 65 70 75 80 His Pro Gly Ser His Lys Val Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His 85 90 95 Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly 100 105 110 Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp Leu Lys Asn Ile Asn Phe 115 120 125 <210> 54 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 <400> 54 tctgtgtccg agattcagtt aatgcataac cttggcaaac atttgaactc gatggagcgt 60 gtagaatggc tgcgtaagaa gttgcaggat gtgcacaatt ttgatgacga cgacaaggcg 120 gtgattaccg gtgcgtgcga acgtgatgtg cagtgcggtg cgggtacctg ctgcgcgatt 180 agcctgtggc tgcgtggtct gcgtatgtgc accccgctgg gtcgtgaagg tgaagaatgc 240 catccgggta gccataaagt gccgttcttc cgtaaacgta aacatcatac ctgcccgtgc 300 ctgccgaacc tgctgtgcag ccgtttcccg gatggtcgtt atcgttgcag catggatctg 360 aaaaacatta acttt 375 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 atcgattaca atgcaggccg ctgggcaccc ag 32 <210> 56 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 actagtgccc ttcagcaccg caatatgctg cg 32 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 57 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 58 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA coding for linker sequence <400> 58 ggttctggtt ctggt 15 <210> 59 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ZAQC Sal <400> 59 gtcgacatgg agaccaccat ggggttcatg g 31 <210> 60 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ZAQC Spe <400> 60 actagtttat tttagtctga tgcagtccac ctcttc 36 <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Bovine <400> 61 Leu Val Gln Pro Arg Gly Pro Arg Ser Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly 1 5 10 15 Gly 17 <210> 62 <211> 77 <212> PRT <213> Mouse <400> 62 Met Asn Leu Arg Leu Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ala Val Cys Gly Val Pro Leu Met Leu Pro Pro Asp Gly Thr 20 25 30 Gly Leu Glu Glu Gly Ser Met Arg Tyr Leu Val Lys Pro Arg Thr Ser 35 40 45 Arg Thr Gly Pro Gly Ala Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg 50 55 60 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe 65 70 75 77 <210> 63 <211> 77 <212> PRT <213> Rat <400> 63 Met Asn Leu Ser Phe Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ala Val Cys Gly Val Pro Leu Met Leu Pro Pro Asp Gly Lys 20 25 30 Gly Leu Glu Glu Gly Asn Met Arg Tyr Leu Val Lys Pro Arg Thr Ser 35 40 45 Arg Thr Gly Pro Gly Ala Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg 50 55 60 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe 65 70 75 77 <210> 64 <211> 77 <212> PRT <213> Human <400> 64 Met Asn Leu Arg Leu Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ala Val Cys Gly Gly Ser Leu Met Pro Leu Pro Asp Gly Asn 20 25 30 Gly Leu Glu Asp Gly Asn Val Arg His Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser 35 40 45 Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg 50 55 60 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe 65 70 75 77 <210> 65 <211> 77 <212> PRT <213> Bovine <400> 65 Met Asn Leu Arg Arg Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Cys 1 5 10 15 Leu Ser Ala Val Cys Gly Gly Pro Leu Leu Gln Thr Ser Asp Gly Lys 20 25 30 Glu Met Glu Glu Gly Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln Pro Arg Gly Pro 35 40 45 Arg Ser Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg 50 55 60 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe 65 70 75 77

【図面の簡単な説明】

【図１】 菌体からＰＴＨ−アペリン−３６精製ステッ
プをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。図中、レ
ーン１は分子量マーカー、レーン２は菌体、レーン３は
ＳＰ−セファロース溶出液、レーン４はＳＰ−５ＰＷ溶
出液、レーン５はＯＤＳ−１２０Ｔ溶出液を示す。

【図２】 ＰＴＨ−アペリン−３６をエンテロキナーゼ
で処理し、アペリン−３６精製ステップをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析した結果を示す。図中、レーン１は分子量マ
ーカー、レーン２はＰＴＨ−アペリン−３６融合タンパ
ク質、レーン３はアペリン−３６標準品、レーン４はエ
ンテロキナーゼ処理後のＰＴＨ−アペリン−３６融合タ
ンパク質、レーン５はＳＰ−５ＰＷ溶出液、レーン６は
ＯＤＳ−１２０Ｔ精製品を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA07 DA05 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B064 AG01 CA02 CA19 CB01 CC24 DA01 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA40 DA00 DA30 EA20 FA72 FA74

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＰＴＨ（parathyroid hormone）のＮ末
   端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同一または実
   質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドのＣ末端
   にタンパク質分解酵素の切断部位を介して目的ペプチド
   を連結した融合タンパク質を、タンパク質分解酵素によ
   るペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする該目
   的ペプチドまたはその塩の製造法。
2. 【請求項２】 ＰＴＨ（parathyroid hormone）のＮ末
   端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同一または実
   質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドのＣ末端
   にタンパク質分解酵素の切断部位を介して目的ペプチド
   を連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有す
   るベクターで形質転換された形質転換体を培養して融合
   タンパク質を発現させ、発現させた融合タンパク質をタ
   ンパク質分解酵素によるペプチド結合の切断反応に付す
   ことを特徴とする該目的ペプチドまたはその塩の製造
   法。
3. 【請求項３】 タンパク質分解酵素がエンテロキナーゼ
   である請求項１または請求項２記載の製造法。
4. 【請求項４】 タンパク質分解酵素の切断部位が配列番
   号：７で表されるアミノ酸配列を有する請求項３記載の
   製造法。
5. 【請求項５】 タンパク質分解酵素がファクターＸａで
   ある請求項１または２記載の製造法。
6. 【請求項６】 タンパク質分解酵素の切断部位が配列番
   号：１１で表されるアミノ酸配列を有する請求項５記載
   の製造法。
7. 【請求項７】 タンパク質分解酵素がトロンビンである
   請求項１または２記載の製造法。
8. 【請求項８】 タンパク質分解酵素の切断部位が配列番
   号：１３で表されるアミノ酸配列を有する請求項７記載
   の製造法。
9. 【請求項９】 目的ペプチドがアペリンである請求項１
   または２記載の製造法。
10. 【請求項１０】 アペリンが配列番号：１で表わされる
    アミノ酸配列を含有するペプチドである請求項９記載の
    製造法。
11. 【請求項１１】 目的ペプチドがＧＰＲ８リガンドであ
    る請求項１または２記載の製造法。
12. 【請求項１２】 ＧＰＲ８リガンドが配列番号：２７で
    表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドである請求
    項１１記載の製造法。
13. 【請求項１３】 目的ペプチドがＺＡＱリガンドである
    請求項１または２記載の製造法。
14. 【請求項１４】 ＺＡＱリガンドが配列番号：４１で表
    わされるアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項
    １３記載の製造法。
15. 【請求項１５】 ＰＴＨ（parathyroid hormone）のＮ
    末端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同一または
    実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドのＣ末
    端にタンパク質分解酵素の切断部位を介して目的ペプチ
    ドを連結した融合タンパク質またはその塩。
16. 【請求項１６】 目的ペプチドがアペリンである請求項
    １５記載の融合タンパク質またはその塩。
17. 【請求項１７】 アペリンが配列番号：１で表わされる
    アミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１６記載
    の融合タンパク質またはその塩。
18. 【請求項１８】 融合タンパク質が配列番号：２５で表
    わされるアミノ酸配列を含有する請求項１５記載の融合
    タンパク質またはその塩。
19. 【請求項１９】 目的ペプチドがＧＰＲ８リガンドであ
    る請求項１５記載の融合タンパク質またはその塩。
20. 【請求項２０】 ＧＰＲ８リガンドが配列番号：２７で
    表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドである請求
    項１９記載の融合タンパク質またはその塩。
21. 【請求項２１】 融合タンパク質が配列番号：３９で表
    わされるアミノ酸配列を含有する請求項１５記載の融合
    タンパク質またはその塩。
22. 【請求項２２】 目的ペプチドがＺＡＱリガンドである
    請求項１５記載の融合タンパク質またはその塩。
23. 【請求項２３】 ＺＡＱリガンドが配列番号：４１で表
    わされるアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項
    ２２記載の融合タンパク質またはその塩。
24. 【請求項２４】 融合タンパク質が配列番号：５３で表
    わされるアミノ酸配列を含有する請求項１５記載の融合
    タンパク質またはその塩。
25. 【請求項２５】 請求項１５記載の融合タンパク質をコ
    ードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
26. 【請求項２６】 配列番号：２６、配列番号：４０また
    は配列番号：５４で表わされる塩基配列を含有する請求
    項２５記載のＤＮＡ。
27. 【請求項２７】 請求項１５記載の融合タンパク質をコ
    ードするＤＮＡを含有するベクター。
28. 【請求項２８】 請求項２７記載のベクターで形質転換
    された形質転換体。
29. 【請求項２９】 目的ペプチドを連結した融合タンパク
    質を製造するための、ＰＴＨ（parathyroid hormone）
    のＮ末端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同一ま
    たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドま
    たはそれをコードするＤＮＡの使用。
30. 【請求項３０】 ＰＴＨ（parathyroid hormone）のＮ
    末端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同一または
    実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたは
    それをコードするＤＮＡを用いることを特徴とする目的
    ペプチドを連結した融合タンパク質またはその塩を製造
    法。
31. 【請求項３１】 ＰＴＨ（parathyroid hormone）のＮ
    末端から１ないし３４番目のアミノ酸配列と同一または
    実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドのＣ末
    端にタンパク質分解酵素の切断部位を介して目的ペプチ
    ドを連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有
    するベクターで形質転換された形質転換体を培養し、該
    融合タンパク質またはその塩を生成せしめることを特徴
    とする該融合タンパク質またはその塩の製造法。