JP2003265191A - ＫｉＳＳ−１ペプチドの製造法 - Google Patents
ＫｉＳＳ−１ペプチドの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩を工業的か
つ大量に製造するのに有利な製造法を提供する。 【解決手段】Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ドのＮ末端にＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋白
質またはペプチドをシステイン残基のアミノ酸側のペプ
チド結合の切断反応に付すことを特徴とするＫｉＳＳ−
１ペプチドまたはその塩の製造法。
つ大量に製造するのに有利な製造法を提供する。 【解決手段】Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ドのＮ末端にＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋白
質またはペプチドをシステイン残基のアミノ酸側のペプ
チド結合の切断反応に付すことを特徴とするＫｉＳＳ−
１ペプチドまたはその塩の製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎ末端にシステイ
ンを有する低分子ペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペ
プチドを連結した融合蛋白質またはポリペプチドを製造
し、次いで該融合蛋白質またはポリペプチドをペプチド
結合の切断反応に付すことにより、ＫｉＳＳ−１ペプチ
ドまたはその塩を製造する方法に関する。
ンを有する低分子ペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペ
プチドを連結した融合蛋白質またはポリペプチドを製造
し、次いで該融合蛋白質またはポリペプチドをペプチド
結合の切断反応に付すことにより、ＫｉＳＳ−１ペプチ
ドまたはその塩を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いて、ペプチドを
製造するに際しては、ペプチドが細胞内で、分解を受け
やすいために、融合蛋白質の形で発現させることがしば
しば行なわれている。融合蛋白質からの目的ペプチドの
切り出しには、ブロムシアンを用い化学的に切断する方
法（イタクラら、Science, 198, 1056(1977)）、ファフ
ターＸaを用い酵素的に切断する方法（ナガイら、Metho
ds in Enzymology, 153,46(1987)）が知られている。さ
らに、蛋白質中のペプチド結合を切断する方法として、
２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸によるアシルシス
テイン結合の切断が知られている（「生化学実験講座」
１，タンパク質の化学II，日本生化学会編，東京化学同
人発行，第２４７〜２５０頁１９７６年）。しかしなが
ら、蛋白質からの目的ペプチドの切り出しについては、
開示されていない。ＷＯ００／２４８９０号およびＷＯ
０１／７５１０４号には、本発明で用いられるＫｉＳＳ
−１ペプチドまたはその塩が開示されている。ＷＯ０１
／４４４６９号には、Ｎ末端にシステインを有する蛋白
質またはペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを
連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該システ
イン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付す
ことを特徴とするＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩の
製造法が開示されており、Ｎ末端にシステインを有する
蛋白質またはペプチドとして、インターフェロン類、イ
ンターロイキン類、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂ
ＦＧＦ）等各種成長因子類、(プロ)ウロキナーゼ類、リ
ンホトキシン、Tumor Necrosis Factor(ＴＮＦ)、β−
ガラトシターゼなどの酵素タンパク類、貯蔵タンパク
類、ストレプトアビシン、プロテインＡ、プロテイン
Ｇ、Tissue Plasminogen Activator(ＴＰＡ)、これらの
ムテイン又はこれらの一部（断片）が例示されている。
製造するに際しては、ペプチドが細胞内で、分解を受け
やすいために、融合蛋白質の形で発現させることがしば
しば行なわれている。融合蛋白質からの目的ペプチドの
切り出しには、ブロムシアンを用い化学的に切断する方
法（イタクラら、Science, 198, 1056(1977)）、ファフ
ターＸaを用い酵素的に切断する方法（ナガイら、Metho
ds in Enzymology, 153,46(1987)）が知られている。さ
らに、蛋白質中のペプチド結合を切断する方法として、
２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸によるアシルシス
テイン結合の切断が知られている（「生化学実験講座」
１，タンパク質の化学II，日本生化学会編，東京化学同
人発行，第２４７〜２５０頁１９７６年）。しかしなが
ら、蛋白質からの目的ペプチドの切り出しについては、
開示されていない。ＷＯ００／２４８９０号およびＷＯ
０１／７５１０４号には、本発明で用いられるＫｉＳＳ
−１ペプチドまたはその塩が開示されている。ＷＯ０１
／４４４６９号には、Ｎ末端にシステインを有する蛋白
質またはペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを
連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該システ
イン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付す
ことを特徴とするＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩の
製造法が開示されており、Ｎ末端にシステインを有する
蛋白質またはペプチドとして、インターフェロン類、イ
ンターロイキン類、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂ
ＦＧＦ）等各種成長因子類、(プロ)ウロキナーゼ類、リ
ンホトキシン、Tumor Necrosis Factor(ＴＮＦ)、β−
ガラトシターゼなどの酵素タンパク類、貯蔵タンパク
類、ストレプトアビシン、プロテインＡ、プロテイン
Ｇ、Tissue Plasminogen Activator(ＴＰＡ)、これらの
ムテイン又はこれらの一部（断片）が例示されている。
【特許文献１】ＷＯ００／２４８９０号
【特許文献２】ＷＯ０１／７５１０４号
【特許文献３】ＷＯ０１／４４４６９号
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来知られている技術
において、融合蛋白質からの目的ペプチドの切り出しに
際し、ブロムシアンを用いる場合には、メチオニンを含
有するペプチドの製造には適用することはできないし、
切り出し時の収率等に問題が多い。このように、融合蛋
白質またはポリペプチドから目的とするペプチドを効率
良く切り出す方法が望まれている。
において、融合蛋白質からの目的ペプチドの切り出しに
際し、ブロムシアンを用いる場合には、メチオニンを含
有するペプチドの製造には適用することはできないし、
切り出し時の収率等に問題が多い。このように、融合蛋
白質またはポリペプチドから目的とするペプチドを効率
良く切り出す方法が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規生理
活性ペプチドであるＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩
を効率良く製造する方法について鋭意検討を加えたとこ
ろ、Ｎ末端にシステインを有する低分子のペプチドのＮ
末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋白質ま
たはポリペプチドを製造し、次いでこれをペプチド結合
を切断する反応に付すことにより、ＫｉＳＳ−１ペプチ
ドまたはその塩を効率良く製造できることを見い出し
た。
活性ペプチドであるＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩
を効率良く製造する方法について鋭意検討を加えたとこ
ろ、Ｎ末端にシステインを有する低分子のペプチドのＮ
末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋白質ま
たはポリペプチドを製造し、次いでこれをペプチド結合
を切断する反応に付すことにより、ＫｉＳＳ−１ペプチ
ドまたはその塩を効率良く製造できることを見い出し
た。
【０００５】すなわち、本発明は、（１）Ｎ末端にシス
テインを有する低分子ペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−
１ペプチドを連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその
塩を該システイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切
断反応に付すことを特徴とするＫｉＳＳ−１ペプチドま
たはその塩の製造法、（２）Ｎ末端にシステインを有す
る低分子ペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを
連結した融合蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ
を有するベクターを保持する形質転換体を培養して融合
蛋白質、ペプチドまたはその塩を発現させ、発現された
融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該システイン残基
のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特
徴とするＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩の製造法、
（３）製造されるＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端がアミ
ドである上記（１）または（２）記載の製造法、（４）
切断反応がＳ−シアノ化反応、次いでアンモノリシスま
たは加水分解反応に付す反応である上記（１）または
（２）記載の製造法、（５）ＫｉＳＳ−１ペプチドが配
列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチド
である上記（１）または（２）記載の製造法、（６）Ｋ
ｉＳＳ−１ペプチドが、配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列のＮ末端から第４０〜５４番目からなるアミノ
酸配列を有するペプチド、配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列のＮ末端から第４５〜５４番目からなるアミ
ノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１で表される
アミノ酸配列のＮ末端から第４６〜５４番目からなるア
ミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号：１で表
されるアミノ酸配列のＮ末端から第４７〜５４番目から
なるアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）ま
たは（２）記載の製造法、（７）Ｎ末端にシステインを
有する低分子ペプチドが、Ｎ末端にシステインを有し、
約１０〜約５０個のアミノ酸残基からなるペプチドであ
る上記（１）または（２）記載の製造法、（８）低分子
ペプチドが、ＫｉＳＳ−１ペプチドを含む前駆体蛋白質
のＣ末端側の部分ペプチドであって、該ＫｉＳＳ−１ペ
プチドのＣ末端アミノ酸に隣接するアミノ酸残基から始
まるアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）ま
たは（２）記載の製造法、（９）Ｎ末端にシステインを
有する低分子ペプチドが、配列番号：３で表されるアミ
ノ酸配列を含有し、そのＮ末端にシステイン残基が付加
したペプチドである上記（１）または（２）記載の製造
法、（１０）Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ドが配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有し、そ
のＮ末端にシステイン残基が付加したペプチドであり、
ＫｉＳＳ−１ペプチドが配列番号：１で表されるアミノ
酸配列を有するペプチドであり、製造されるＫｉＳＳ−
１ペプチドのＣ末端がアミドである配列番号：１で表さ
れるアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）ま
たは（２）記載の製造法、（１１）Ｎ末端にシステイン
を有する低分子ペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプ
チドを連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその塩、
（１２）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有
する上記（１１）記載の融合蛋白質、ペプチドまたはそ
の塩、（１３）上記（１１）記載の融合蛋白質またはペ
プチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（１４）
配列番号：６で表される塩基配列または配列番号：
７で表される塩基配列を有する上記（１３）記載のＤＮ
Ａ、（１５）上記（１３）記載のＤＮＡを有するベクタ
ー、（１６）上記（１５）記載のベクターを含有する形
質転換体、および（１７）ＦＥＲＭ ＢＰ−７８２３で
表示されるエシュリヒア・コリＭＭ２９４（ＤＥ３）／
ｐＴＣ２ＭｅｔＣ２４−１．３を提供する。さらに、本
発明は、（１８）次の〜の工程； Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチドのＮ末端
システインに、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋
白質またはペプチドをコードするＤＮＡを作製する、 該ＤＮＡを有するベクターを作製する、 該ベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白
質、ペプチドまたはその塩を発現させる、 発現された融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該シ
ステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に
付す、 からなる第（２）項記載の製造法、（１９）Ｎ末端にシ
ステインを有する低分子ペプチド（ここで低分子ペプチ
ドとは、目的成熟ペプチドの前駆体蛋白質のＣ末端側の
部分ペプチドをいう）のＮ末端に、目的成熟ペプチドを
連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該システ
イン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付す
ことを特徴とする目的成熟ペプチドまたはその塩の製造
法、（２０）Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ド（ここで低分子ペプチドとは、目的成熟ペプチドの前
駆体蛋白質のＣ末端側の部分ペプチドをいう）のＮ末端
に、目的成熟ペプチドを連結した融合蛋白質またはペプ
チドをコードするＤＮＡを有するベクターを保持する形
質転換体を培養して融合蛋白質、ペプチドまたはその塩
を発現させ、発現された融合蛋白質、ペプチドまたはそ
の塩を該システイン残基のアミノ基側のペプチド結合の
切断反応に付すことを特徴とする目的成熟ペプチドまた
はその塩の製造法、（２１）切断反応がＳ−シアノ化反
応、次いでアンモノリシスまたは加水分解反応に付す反
応である上記（１９）または（２０）記載の製造法、
（２２）目的成熟ペプチドが約１０〜１００個のアミノ
酸残基を含有するペプチドである上記（１９）または
（２０）記載の製造法、（２３）Ｎ末端にシステインを
有する低分子ペプチドが、Ｎ末端にシステインを有し、
約１０〜約５０個のアミノ酸残基からなるペプチドであ
る上記（１９）または（２０）記載の製造法、（２４）
Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチド（ここで低
分子ペプチドとは、目的成熟ペプチドの前駆体蛋白質の
Ｃ末端側の部分ペプチドをいう）のＮ末端に、目的成熟
ペプチドを連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその
塩、（２５）上記（２４）記載の融合蛋白質またはペプ
チドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２６）上
記（２５）記載のＤＮＡを有するベクター、（２７）上
記（２６）記載のベクターを含有する形質転換体、およ
び（２８）次の〜の工程； Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチド（ここで
低分子ペプチドとは、目的成熟ペプチドの前駆体蛋白質
のＣ末端側の部分ペプチドをいう）のＮ末端システイン
に、目的成熟ペプチドを連結した融合蛋白質またはペプ
チドをコードするＤＮＡを作製する、 該ＤＮＡを有するベクターを作製する、 該ベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白
質、ペプチドまたはその塩を発現させる、 発現された融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該シ
ステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に
付す、 からなる第（２０）項記載の製造法を提供する。
テインを有する低分子ペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−
１ペプチドを連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその
塩を該システイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切
断反応に付すことを特徴とするＫｉＳＳ−１ペプチドま
たはその塩の製造法、（２）Ｎ末端にシステインを有す
る低分子ペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを
連結した融合蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ
を有するベクターを保持する形質転換体を培養して融合
蛋白質、ペプチドまたはその塩を発現させ、発現された
融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該システイン残基
のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特
徴とするＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩の製造法、
（３）製造されるＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端がアミ
ドである上記（１）または（２）記載の製造法、（４）
切断反応がＳ−シアノ化反応、次いでアンモノリシスま
たは加水分解反応に付す反応である上記（１）または
（２）記載の製造法、（５）ＫｉＳＳ−１ペプチドが配
列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチド
である上記（１）または（２）記載の製造法、（６）Ｋ
ｉＳＳ−１ペプチドが、配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列のＮ末端から第４０〜５４番目からなるアミノ
酸配列を有するペプチド、配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列のＮ末端から第４５〜５４番目からなるアミ
ノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１で表される
アミノ酸配列のＮ末端から第４６〜５４番目からなるア
ミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号：１で表
されるアミノ酸配列のＮ末端から第４７〜５４番目から
なるアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）ま
たは（２）記載の製造法、（７）Ｎ末端にシステインを
有する低分子ペプチドが、Ｎ末端にシステインを有し、
約１０〜約５０個のアミノ酸残基からなるペプチドであ
る上記（１）または（２）記載の製造法、（８）低分子
ペプチドが、ＫｉＳＳ−１ペプチドを含む前駆体蛋白質
のＣ末端側の部分ペプチドであって、該ＫｉＳＳ−１ペ
プチドのＣ末端アミノ酸に隣接するアミノ酸残基から始
まるアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）ま
たは（２）記載の製造法、（９）Ｎ末端にシステインを
有する低分子ペプチドが、配列番号：３で表されるアミ
ノ酸配列を含有し、そのＮ末端にシステイン残基が付加
したペプチドである上記（１）または（２）記載の製造
法、（１０）Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ドが配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有し、そ
のＮ末端にシステイン残基が付加したペプチドであり、
ＫｉＳＳ−１ペプチドが配列番号：１で表されるアミノ
酸配列を有するペプチドであり、製造されるＫｉＳＳ−
１ペプチドのＣ末端がアミドである配列番号：１で表さ
れるアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）ま
たは（２）記載の製造法、（１１）Ｎ末端にシステイン
を有する低分子ペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプ
チドを連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその塩、
（１２）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有
する上記（１１）記載の融合蛋白質、ペプチドまたはそ
の塩、（１３）上記（１１）記載の融合蛋白質またはペ
プチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（１４）
配列番号：６で表される塩基配列または配列番号：
７で表される塩基配列を有する上記（１３）記載のＤＮ
Ａ、（１５）上記（１３）記載のＤＮＡを有するベクタ
ー、（１６）上記（１５）記載のベクターを含有する形
質転換体、および（１７）ＦＥＲＭ ＢＰ−７８２３で
表示されるエシュリヒア・コリＭＭ２９４（ＤＥ３）／
ｐＴＣ２ＭｅｔＣ２４−１．３を提供する。さらに、本
発明は、（１８）次の〜の工程； Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチドのＮ末端
システインに、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋
白質またはペプチドをコードするＤＮＡを作製する、 該ＤＮＡを有するベクターを作製する、 該ベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白
質、ペプチドまたはその塩を発現させる、 発現された融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該シ
ステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に
付す、 からなる第（２）項記載の製造法、（１９）Ｎ末端にシ
ステインを有する低分子ペプチド（ここで低分子ペプチ
ドとは、目的成熟ペプチドの前駆体蛋白質のＣ末端側の
部分ペプチドをいう）のＮ末端に、目的成熟ペプチドを
連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該システ
イン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付す
ことを特徴とする目的成熟ペプチドまたはその塩の製造
法、（２０）Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ド（ここで低分子ペプチドとは、目的成熟ペプチドの前
駆体蛋白質のＣ末端側の部分ペプチドをいう）のＮ末端
に、目的成熟ペプチドを連結した融合蛋白質またはペプ
チドをコードするＤＮＡを有するベクターを保持する形
質転換体を培養して融合蛋白質、ペプチドまたはその塩
を発現させ、発現された融合蛋白質、ペプチドまたはそ
の塩を該システイン残基のアミノ基側のペプチド結合の
切断反応に付すことを特徴とする目的成熟ペプチドまた
はその塩の製造法、（２１）切断反応がＳ−シアノ化反
応、次いでアンモノリシスまたは加水分解反応に付す反
応である上記（１９）または（２０）記載の製造法、
（２２）目的成熟ペプチドが約１０〜１００個のアミノ
酸残基を含有するペプチドである上記（１９）または
（２０）記載の製造法、（２３）Ｎ末端にシステインを
有する低分子ペプチドが、Ｎ末端にシステインを有し、
約１０〜約５０個のアミノ酸残基からなるペプチドであ
る上記（１９）または（２０）記載の製造法、（２４）
Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチド（ここで低
分子ペプチドとは、目的成熟ペプチドの前駆体蛋白質の
Ｃ末端側の部分ペプチドをいう）のＮ末端に、目的成熟
ペプチドを連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその
塩、（２５）上記（２４）記載の融合蛋白質またはペプ
チドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２６）上
記（２５）記載のＤＮＡを有するベクター、（２７）上
記（２６）記載のベクターを含有する形質転換体、およ
び（２８）次の〜の工程； Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチド（ここで
低分子ペプチドとは、目的成熟ペプチドの前駆体蛋白質
のＣ末端側の部分ペプチドをいう）のＮ末端システイン
に、目的成熟ペプチドを連結した融合蛋白質またはペプ
チドをコードするＤＮＡを作製する、 該ＤＮＡを有するベクターを作製する、 該ベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白
質、ペプチドまたはその塩を発現させる、 発現された融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該シ
ステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に
付す、 からなる第（２０）項記載の製造法を提供する。
【０００６】本発明の方法に用いられるＫｉＳＳ−１ペ
プチドとしては、例えばＷＯ００／２４８９０号に記載
のヒトＫｉＳＳ−１ペプチド、ＷＯ０１／７５１０４号
に記載のマウスまたはラットＫｉＳＳ−１ペプチドが用
いられる。ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドとしては、具体的
には、本願の配列番号：１で表されるアミノ酸配列にお
いて、Ｎ末端から第４７〜５４番目のアミノ酸配列を含
有し、８乃至５４個のアミノ酸残基からなるペプチドな
どがあげられる。「本願の配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列において、Ｎ末端から第４７〜５４番目のアミ
ノ酸配列を含有し、８乃至５４個のアミノ酸残基からな
るペプチド」としては、配列番号：１で表されるアミノ
酸配列において、Ｎ末端から第４７〜５４番目のアミノ
酸配列を含有し、かつ８乃至５４個のアミノ酸残基から
なるペプチドであればいかなるものであってもよいが、
ペプチド活性（例えば、ペプチドと受容体の結合活性、
ペプチドによって引き起こされる受容体発現細胞の細胞
刺激活性など）などが、実質的に同じであることを意味
する。具体的には、本願の配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列で表されるペプチド、本願の配列番号：１
で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から第４７〜
５４番目のアミノ酸配列をＣ末端に有し、８乃至１５個
のアミノ酸残基からなるペプチドなどが用いられる。よ
り具体的には、ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドとしては、
本願の配列番号：１で表されるアミノ酸配列で表される
ペプチド、本願の配列番号：１で表されるアミノ酸配
列のＮ末端から第４０〜５４番目からなるアミノ酸配列
で表されるペプチド、本願の配列番号：１で表される
アミノ酸配列のＮ末端から第４５〜５４番目からなるア
ミノ酸配列で表されるペプチド、本願の配列番号：１
で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４６〜５４番目
からなるアミノ酸配列で表されるペプチド、本願の配
列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４７
〜５４番目からなるアミノ酸配列で表されるペプチドな
どがあげられる。
プチドとしては、例えばＷＯ００／２４８９０号に記載
のヒトＫｉＳＳ−１ペプチド、ＷＯ０１／７５１０４号
に記載のマウスまたはラットＫｉＳＳ−１ペプチドが用
いられる。ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドとしては、具体的
には、本願の配列番号：１で表されるアミノ酸配列にお
いて、Ｎ末端から第４７〜５４番目のアミノ酸配列を含
有し、８乃至５４個のアミノ酸残基からなるペプチドな
どがあげられる。「本願の配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列において、Ｎ末端から第４７〜５４番目のアミ
ノ酸配列を含有し、８乃至５４個のアミノ酸残基からな
るペプチド」としては、配列番号：１で表されるアミノ
酸配列において、Ｎ末端から第４７〜５４番目のアミノ
酸配列を含有し、かつ８乃至５４個のアミノ酸残基から
なるペプチドであればいかなるものであってもよいが、
ペプチド活性（例えば、ペプチドと受容体の結合活性、
ペプチドによって引き起こされる受容体発現細胞の細胞
刺激活性など）などが、実質的に同じであることを意味
する。具体的には、本願の配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列で表されるペプチド、本願の配列番号：１
で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から第４７〜
５４番目のアミノ酸配列をＣ末端に有し、８乃至１５個
のアミノ酸残基からなるペプチドなどが用いられる。よ
り具体的には、ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドとしては、
本願の配列番号：１で表されるアミノ酸配列で表される
ペプチド、本願の配列番号：１で表されるアミノ酸配
列のＮ末端から第４０〜５４番目からなるアミノ酸配列
で表されるペプチド、本願の配列番号：１で表される
アミノ酸配列のＮ末端から第４５〜５４番目からなるア
ミノ酸配列で表されるペプチド、本願の配列番号：１
で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４６〜５４番目
からなるアミノ酸配列で表されるペプチド、本願の配
列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４７
〜５４番目からなるアミノ酸配列で表されるペプチドな
どがあげられる。
【０００７】マウスＫｉＳＳ−１ペプチド（Ａ）として
は、例えば、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列
のＮ末端から第１３４〜１４１番目のアミノ酸配列を含
有し、８ないし５２個のアミノ酸残基からなるペプチド
などが用いられ、具体的には、配列番号：１６で表さ
れるアミノ酸配列のＮ末端から第９０〜１４１番目のア
ミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１６で表さ
れるアミノ酸配列のＮ末端から第１３２〜１４１番目の
アミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１６で表
されるアミノ酸配列のＮ末端から第１２７〜１４１番目
のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。マ
ウスＫｉＳＳ−１ペプチド（Ｂ）としては、例えば、配
列番号：１７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第１
３８〜１４５番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５
２個のアミノ酸残基からなるペプチドなどが用いられ、
具体的には、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から第９４〜１４５番目のアミノ酸配列を有する
ペプチドなどが用いられる。ラットＫｉＳＳ−１ペプチ
ドとしては、例えば、配列番号：１８で表されるアミノ
酸配列のＮ末端から第１１２〜１１９番目のアミノ酸配
列を含有し、８ないし５２個のアミノ酸残基からなるペ
プチドなどが用いられ、具体的には、配列番号：１８
で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第６８〜１１９番
目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１８
で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第１１０〜１１９
番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１
８で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第１０５〜１１
９番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどが挙げられ
る。上記ＫｉＳＳ−１ペプチドは、ＷＯ００／２４８９
０号またはＷＯ０１／７５１０４号に記載のレセプター
蛋白質ＯＴ７Ｔ１７５に対し、リガンド活性を有する。
は、例えば、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列
のＮ末端から第１３４〜１４１番目のアミノ酸配列を含
有し、８ないし５２個のアミノ酸残基からなるペプチド
などが用いられ、具体的には、配列番号：１６で表さ
れるアミノ酸配列のＮ末端から第９０〜１４１番目のア
ミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１６で表さ
れるアミノ酸配列のＮ末端から第１３２〜１４１番目の
アミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１６で表
されるアミノ酸配列のＮ末端から第１２７〜１４１番目
のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。マ
ウスＫｉＳＳ−１ペプチド（Ｂ）としては、例えば、配
列番号：１７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第１
３８〜１４５番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５
２個のアミノ酸残基からなるペプチドなどが用いられ、
具体的には、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から第９４〜１４５番目のアミノ酸配列を有する
ペプチドなどが用いられる。ラットＫｉＳＳ−１ペプチ
ドとしては、例えば、配列番号：１８で表されるアミノ
酸配列のＮ末端から第１１２〜１１９番目のアミノ酸配
列を含有し、８ないし５２個のアミノ酸残基からなるペ
プチドなどが用いられ、具体的には、配列番号：１８
で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第６８〜１１９番
目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１８
で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第１１０〜１１９
番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１
８で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第１０５〜１１
９番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどが挙げられ
る。上記ＫｉＳＳ−１ペプチドは、ＷＯ００／２４８９
０号またはＷＯ０１／７５１０４号に記載のレセプター
蛋白質ＯＴ７Ｔ１７５に対し、リガンド活性を有する。
【０００８】本明細書におけるペプチドはペプチド標記
の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ
末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表さ
れるペプチドのＣ末端は、アミド（-CONH２)、カルボキ
シル基（-COOH)、カルボキシレート(-COO−)、アルキル
アミド（-CONHR）またはエステル(-COOR)であってもよ
い。エステルまたはアルキルアミドのＲとしては、例え
ばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしく
はｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチ
ル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、
フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、
ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル
−Ｃ１−２アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなど
のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキルなどのＣ７−１４ア
ラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピ
バロイルオキシメチル基などがあげられる。さらに、Ｋ
ｉＳＳ−１ペプチドには、Ｎ末端のメチオニン残基のア
ミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどの
Ｃ２−６アルカノイル基などのＣ１ −６アシル基など）
で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成
したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子
内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−Ｓ
Ｈ、−ＣＯＯＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドー
ル基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホ
ルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基など
のＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、ある
いは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプ
チドなども含まれる。本発明のＫｉＳＳ−１ペプチドの
塩としては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカ
リ金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられ
るが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シ
ュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホ
ン酸）との塩などが用いられる。本発明の方法に用いら
れるＮ末端にシステインを有する蛋白質またはペプチド
としては、特定されるものではない。そのＮ末端にシス
テインを有しない蛋白質またはペプチドの場合は、自体
公知の方法によりＮ末端にシステインを有するようにす
ればよい。
の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ
末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表さ
れるペプチドのＣ末端は、アミド（-CONH２)、カルボキ
シル基（-COOH)、カルボキシレート(-COO−)、アルキル
アミド（-CONHR）またはエステル(-COOR)であってもよ
い。エステルまたはアルキルアミドのＲとしては、例え
ばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしく
はｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチ
ル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、
フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、
ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル
−Ｃ１−２アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなど
のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキルなどのＣ７−１４ア
ラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピ
バロイルオキシメチル基などがあげられる。さらに、Ｋ
ｉＳＳ−１ペプチドには、Ｎ末端のメチオニン残基のア
ミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどの
Ｃ２−６アルカノイル基などのＣ１ −６アシル基など）
で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成
したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子
内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−Ｓ
Ｈ、−ＣＯＯＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドー
ル基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホ
ルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基など
のＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、ある
いは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプ
チドなども含まれる。本発明のＫｉＳＳ−１ペプチドの
塩としては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカ
リ金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられ
るが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シ
ュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホ
ン酸）との塩などが用いられる。本発明の方法に用いら
れるＮ末端にシステインを有する蛋白質またはペプチド
としては、特定されるものではない。そのＮ末端にシス
テインを有しない蛋白質またはペプチドの場合は、自体
公知の方法によりＮ末端にシステインを有するようにす
ればよい。
【０００９】該Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプ
チドの「低分子ペプチド」としては、例えば約１０〜５
０個、好ましくは約２０〜４０個、さらに好ましくは約
２０〜３０個アミノ酸残基を有するものが好ましい。な
かでも、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含
有するヒトＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体（例えば、J.Na
tl. Cancer Inst., 88, 1731, 1996；ＷＯ９８／３９４
４８号）の部分ペプチド、配列番号：１６で表される
アミノ酸配列を含有するマウスＫｉＳＳ−１ペプチド前
駆体（Ａ）（ＷＯ０１／７５１０４号）の部分ペプチ
ド、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有す
るマウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体（Ｂ）（ＷＯ０１
／７５１０４号）の部分ペプチド、配列番号：１８で
表されるアミノ酸配列を含有するラットＫｉＳＳ−１ペ
プチド前駆体（ＷＯ０１／７５１０４号）の部分ペプチ
ドなどが用いられ、なかでもこれらＫｉＳＳ−１ペプチ
ド前駆体のＣ末端側の部分ペプチドが好ましい。より好
ましくは、低分子ペプチドとしては、ＫｉＳＳ−１ペプ
チドを含む前駆体蛋白質のＣ末端側の部分ペプチドであ
って、該ＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端アミノ酸に隣接
するアミノ酸残基から始まるアミノ酸配列を有するペプ
チドなどが用いられる。より具体的には、該低分子ペプ
チドとしては、例えば、（１）ＫｉＳＳ−１ペプチドが
ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドである場合は、配列番号：３
で表わされるアミノ酸配列を含有する、ヒトＫｉＳＳ−
１ペプチド前駆体のＣ末端側の部分ペプチドなどが、
（２）ＫｉＳＳ−１ペプチドがマウスＫｉＳＳ−１ペプ
チド（Ａ）である場合は、配列番号：１６で表わされる
アミノ酸配列のＮ末端から第１４２〜１５２番目のアミ
ノ酸配列を有する、マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体
のＣ末端側の部分ペプチドなどが、（３）ＫｉＳＳ−１
ペプチドがマウスＫｉＳＳ−１ペプチド（Ｂ）である場
合は、配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列のＮ末
端から第１４６〜１５６番目のアミノ酸配列を有する、
マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体のＣ末端側の部分ペ
プチドなどが、（４）ＫｉＳＳ−１ペプチドがラットＫ
ｉＳＳ−１ペプチドである場合は、配列番号：１８表わ
されるアミノ酸配列のＮ末端から第１２０〜１３０番目
のアミノ酸配列を有する、ラットＫｉＳＳ−１ペプチド
前駆体のＣ末端側の部分ペプチドなどが好ましく用いら
れる。本発明の方法においては、これらの低分子ペプチ
ドのＮ末端にシステインが連結している。
チドの「低分子ペプチド」としては、例えば約１０〜５
０個、好ましくは約２０〜４０個、さらに好ましくは約
２０〜３０個アミノ酸残基を有するものが好ましい。な
かでも、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含
有するヒトＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体（例えば、J.Na
tl. Cancer Inst., 88, 1731, 1996；ＷＯ９８／３９４
４８号）の部分ペプチド、配列番号：１６で表される
アミノ酸配列を含有するマウスＫｉＳＳ−１ペプチド前
駆体（Ａ）（ＷＯ０１／７５１０４号）の部分ペプチ
ド、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有す
るマウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体（Ｂ）（ＷＯ０１
／７５１０４号）の部分ペプチド、配列番号：１８で
表されるアミノ酸配列を含有するラットＫｉＳＳ−１ペ
プチド前駆体（ＷＯ０１／７５１０４号）の部分ペプチ
ドなどが用いられ、なかでもこれらＫｉＳＳ−１ペプチ
ド前駆体のＣ末端側の部分ペプチドが好ましい。より好
ましくは、低分子ペプチドとしては、ＫｉＳＳ−１ペプ
チドを含む前駆体蛋白質のＣ末端側の部分ペプチドであ
って、該ＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端アミノ酸に隣接
するアミノ酸残基から始まるアミノ酸配列を有するペプ
チドなどが用いられる。より具体的には、該低分子ペプ
チドとしては、例えば、（１）ＫｉＳＳ−１ペプチドが
ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドである場合は、配列番号：３
で表わされるアミノ酸配列を含有する、ヒトＫｉＳＳ−
１ペプチド前駆体のＣ末端側の部分ペプチドなどが、
（２）ＫｉＳＳ−１ペプチドがマウスＫｉＳＳ−１ペプ
チド（Ａ）である場合は、配列番号：１６で表わされる
アミノ酸配列のＮ末端から第１４２〜１５２番目のアミ
ノ酸配列を有する、マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体
のＣ末端側の部分ペプチドなどが、（３）ＫｉＳＳ−１
ペプチドがマウスＫｉＳＳ−１ペプチド（Ｂ）である場
合は、配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列のＮ末
端から第１４６〜１５６番目のアミノ酸配列を有する、
マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体のＣ末端側の部分ペ
プチドなどが、（４）ＫｉＳＳ−１ペプチドがラットＫ
ｉＳＳ−１ペプチドである場合は、配列番号：１８表わ
されるアミノ酸配列のＮ末端から第１２０〜１３０番目
のアミノ酸配列を有する、ラットＫｉＳＳ−１ペプチド
前駆体のＣ末端側の部分ペプチドなどが好ましく用いら
れる。本発明の方法においては、これらの低分子ペプチ
ドのＮ末端にシステインが連結している。
【００１０】本発明方法で用いられる融合蛋白質（融合
ペプチドを含む）をコードするＤＮＡは、(１)全塩基配
列を化学的に合成してもよいし、(２)低分子ペプチドを
コードする塩基配列のＮ末端側にシステインをコードす
る塩基配列を配置し、さらにそのＮ末端側にＫｉＳＳ−
１ペプチドをコードする塩基配列を配置することにより
該ＤＮＡを構築してもよい。また、（３）該ペプチドの
フラグメントを得るのが目的の場合には、所望のフラグ
メントの直後のアミノ酸残基をsite-directedmutagenes
is 等の手法でシステインに置換した該ＤＮＡを構築す
ればよい。上記の(１)の場合の製造法としては、例え
ば、自体公知のホスホアミダイド法、リン酸トリエステ
ル法、ジエステル法、ハイドロジェンホスホネート法な
どを用いて、短いものなら一度に、長いものでは分割し
て合成した後にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結して作
成することが可能である。
ペプチドを含む）をコードするＤＮＡは、(１)全塩基配
列を化学的に合成してもよいし、(２)低分子ペプチドを
コードする塩基配列のＮ末端側にシステインをコードす
る塩基配列を配置し、さらにそのＮ末端側にＫｉＳＳ−
１ペプチドをコードする塩基配列を配置することにより
該ＤＮＡを構築してもよい。また、（３）該ペプチドの
フラグメントを得るのが目的の場合には、所望のフラグ
メントの直後のアミノ酸残基をsite-directedmutagenes
is 等の手法でシステインに置換した該ＤＮＡを構築す
ればよい。上記の(１)の場合の製造法としては、例え
ば、自体公知のホスホアミダイド法、リン酸トリエステ
ル法、ジエステル法、ハイドロジェンホスホネート法な
どを用いて、短いものなら一度に、長いものでは分割し
て合成した後にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結して作
成することが可能である。
【００１１】上記の(２)の場合の製造法としては、例え
ば、Ｃ末端側の蛋白質をコードするＤＡＮは、染色体ま
たはｃＤＮＡから適当な制限酵素で切断し、ベクターに
連結して得るか、もしくはcＤＮＡを取得する。しかる
後にＮ末端がシステインになるように制限酵素で切断す
るか、もしくは、合成ＤＮＡを全蛋白もしくはその一部
の遺伝子の５'−末端に結合しＮ末端がシステインにな
るように改変する。その５'−末端に目的の蛋白質をコ
ードするＤＡＮ(化学合成したものでも、生体よりクロ
ーニングしてきたものでもよい)をつなげる。このよう
にして得られる融合蛋白質をコードするＤＮＡの具体例
としては、例えば式 GGTACTTCTCTGTCTCCGCCGCCGGAATCTTCTGGTTCTCGTCAGCAGCCGGGTCTGTCTGCTCCGCACTCT CGTCAGATCCCGGCTCCGCAGGGTGCTGTTCTGGTTCAGCGTGAAAAAGACCTGCCGAACTACAACTGGAAC TCTTTCGGTCTGCGTTTC（配列番号：２）-TGC または TGT-Ｒ (I) 〔式中、Ｒは配列番号：４で表わされる塩基配列を示
す。〕で表わされる塩基配列（配列番号：６または７）
を含有するＤＮＡなどがあげられる。
ば、Ｃ末端側の蛋白質をコードするＤＡＮは、染色体ま
たはｃＤＮＡから適当な制限酵素で切断し、ベクターに
連結して得るか、もしくはcＤＮＡを取得する。しかる
後にＮ末端がシステインになるように制限酵素で切断す
るか、もしくは、合成ＤＮＡを全蛋白もしくはその一部
の遺伝子の５'−末端に結合しＮ末端がシステインにな
るように改変する。その５'−末端に目的の蛋白質をコ
ードするＤＡＮ(化学合成したものでも、生体よりクロ
ーニングしてきたものでもよい)をつなげる。このよう
にして得られる融合蛋白質をコードするＤＮＡの具体例
としては、例えば式 GGTACTTCTCTGTCTCCGCCGCCGGAATCTTCTGGTTCTCGTCAGCAGCCGGGTCTGTCTGCTCCGCACTCT CGTCAGATCCCGGCTCCGCAGGGTGCTGTTCTGGTTCAGCGTGAAAAAGACCTGCCGAACTACAACTGGAAC TCTTTCGGTCTGCGTTTC（配列番号：２）-TGC または TGT-Ｒ (I) 〔式中、Ｒは配列番号：４で表わされる塩基配列を示
す。〕で表わされる塩基配列（配列番号：６または７）
を含有するＤＮＡなどがあげられる。
【００１２】上記式（Ｉ）はヒトＫｉＳＳ−１ペプチド
を含有するペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列（配列
番号：２）にシステインをコードする塩基配列（TGCま
たはTGT）を介してＲで示される塩基配列（配列番号：
４）が結合していることを示す。ヒトＫｉＳＳ−１ペプ
チドをコードするＤＮＡは、上記式（Ｉ）で表されるＤ
ＮＡや配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有す
るヒトＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体をコードするＤＮＡ
またはその改変ＤＮＡ（例えば、J. Natl. Cancer Ins
t., 88, 1731, 1996；ＷＯ９８／３９４４８号）を用い
て、自体公知の方法に従って製造することもできる。マ
ウスＫｉＳＳ−１ペプチドをコードするＤＮＡは、配列
番号：１６で表されるアミノ酸配列を有するマウスＫｉ
ＳＳ−１ペプチド前駆体（Ａ）をコードするＤＮＡ（配
列番号：１９）またはその改変ＤＮＡ（ＷＯ０１／７５
１０４号）や配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を
有するマウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体（Ｂ）をコー
ドするＤＮＡ（配列番号：２０）またはその改変ＤＮＡ
（ＷＯ０１／７５１０４号）を用いて、自体公知の方法
に従って製造することができる。ラットＫｉＳＳ−１ペ
プチドをコードするＤＮＡは、配列番号：１８で表され
るアミノ酸配列を有するラットＫｉＳＳ−１ペプチド前
駆体をコードするＤＮＡ（配列番号：２１）またはその
改変ＤＮＡ（ＷＯ０１／７５１０４号）を用いて、自体
公知の方法に従って製造することができる。５'末端に
ＡＴＧを有し、その下流に該融合蛋白質をコードする領
域、ついで翻訳終止コドンを有するＤＮＡ(プラスミド)
は、化学合成で、あるいは遺伝子工学的に製造された公
知の該蛋白質のcＤＮＡ、もしくは、染色体由来の該蛋
白質のＤＮＡを加工することにより製造することができ
る。本発明のＮ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ドのＮ末端にＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋白
質またはペプチドをコードするＤＮＡを、従来のＤＮＡ
技術、例えば特定部位指向性変異誘発技術を用いて目的
のムテインをコードするＤＮＡに変換することができ
る。特定部位指向性変異誘発技術は周知であり、アール
・エフ・レイサー(Lather,R. F.)及びジェイ・ピー・レ
コック(Lecoq, J. P.)、ジェネティック・エンジニアリ
ング(Genetic Engineering)、アカデミックプレス社(１
９８３年)第３１−５０頁に示されている。オリゴヌク
レオチドに指示された変異誘発はエム・スミス(Smith,
M.) 及びエス・ギラム(Gillam, S.)、ジェネティック・
エンジニアリング：原理と方法、プレナムプムス社(１
９８１年)３巻 １−３２頁に示されている。
を含有するペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列（配列
番号：２）にシステインをコードする塩基配列（TGCま
たはTGT）を介してＲで示される塩基配列（配列番号：
４）が結合していることを示す。ヒトＫｉＳＳ−１ペプ
チドをコードするＤＮＡは、上記式（Ｉ）で表されるＤ
ＮＡや配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有す
るヒトＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体をコードするＤＮＡ
またはその改変ＤＮＡ（例えば、J. Natl. Cancer Ins
t., 88, 1731, 1996；ＷＯ９８／３９４４８号）を用い
て、自体公知の方法に従って製造することもできる。マ
ウスＫｉＳＳ−１ペプチドをコードするＤＮＡは、配列
番号：１６で表されるアミノ酸配列を有するマウスＫｉ
ＳＳ−１ペプチド前駆体（Ａ）をコードするＤＮＡ（配
列番号：１９）またはその改変ＤＮＡ（ＷＯ０１／７５
１０４号）や配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を
有するマウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体（Ｂ）をコー
ドするＤＮＡ（配列番号：２０）またはその改変ＤＮＡ
（ＷＯ０１／７５１０４号）を用いて、自体公知の方法
に従って製造することができる。ラットＫｉＳＳ−１ペ
プチドをコードするＤＮＡは、配列番号：１８で表され
るアミノ酸配列を有するラットＫｉＳＳ−１ペプチド前
駆体をコードするＤＮＡ（配列番号：２１）またはその
改変ＤＮＡ（ＷＯ０１／７５１０４号）を用いて、自体
公知の方法に従って製造することができる。５'末端に
ＡＴＧを有し、その下流に該融合蛋白質をコードする領
域、ついで翻訳終止コドンを有するＤＮＡ(プラスミド)
は、化学合成で、あるいは遺伝子工学的に製造された公
知の該蛋白質のcＤＮＡ、もしくは、染色体由来の該蛋
白質のＤＮＡを加工することにより製造することができ
る。本発明のＮ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ドのＮ末端にＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋白
質またはペプチドをコードするＤＮＡを、従来のＤＮＡ
技術、例えば特定部位指向性変異誘発技術を用いて目的
のムテインをコードするＤＮＡに変換することができ
る。特定部位指向性変異誘発技術は周知であり、アール
・エフ・レイサー(Lather,R. F.)及びジェイ・ピー・レ
コック(Lecoq, J. P.)、ジェネティック・エンジニアリ
ング(Genetic Engineering)、アカデミックプレス社(１
９８３年)第３１−５０頁に示されている。オリゴヌク
レオチドに指示された変異誘発はエム・スミス(Smith,
M.) 及びエス・ギラム(Gillam, S.)、ジェネティック・
エンジニアリング：原理と方法、プレナムプムス社(１
９８１年)３巻 １−３２頁に示されている。
【００１３】該融合蛋白質をコードする領域を有するＤ
ＮＡを有するプラスミドを製造するにあたって、ベクタ
ーとして用いられるプラスミドとしては、例えば大腸菌
（Escherichia coli）由来のpＢＲ３２２〔ジーン(Gen
e)，２，９５(１９７７)〕，pＢＲ３１３〔ジーン，
２，７５(１９７７)〕，pＢＲ３２４，pＢＲ３２５〔ジ
ーン，４，１２４(１９７８)〕，pＢＲ３２７，pＢＲ３
２８〔ジーン，９，２８７(１９８０)〕，pＢＲ３２９
〔ジーン，１７，７９(１９８２)〕，pＫＹ２２８９
〔ジーン，３，１(１９７８)〕，pＫＹ ２７００〔生化
学，５２，７７０(１９８０)〕，pＡＣＹＣ１７７，pＡ
ＣＹＣ１８４〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J
ournal of Bacteriology)，１３４，１１４１(１９７
８)〕，ｐＲＫ２４８，ｐＲＫ６４６，pＤＦ〔メソッズ
・イン・エン ジーモロジー(Methods inEnzymology)，
６８，２６８(１９７９)〕，pＵＣ１８，pＵＣ１９〔ヤ
ニシューペロンら，ジーン(Gene)，３３，１０３(１９
８５)〕などがあげられる。また、バクテリオファー
ジ、例えばλファージを使用したλgt系のλgt・λＣ
〔Proc.Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.Ａ．７１，４５７９
(１９７４)〕，λgt・λＢ〔Proc.Natl. Acad. Sci.
Ｕ.Ｓ.Ａ. ７２，３４６１(１９７５)〕，λＤam〔ジー
ン，１，２５５(１９７７)〕やシャロンベクター〔サイ
エンス，(Science)，１９６，１６１(１９７７)；ジャ
ーナル・オブ・ビーロロジー(Journal of Virology)，
２９，５５５(１９７９)〕，繊維状ファージを使用した
mp系のmp１８，mp１９〔ヤニシューペロンら，ジーン(G
ene)，３３，１０３(１９８５)〕ベクターなどもあげら
れる。
ＮＡを有するプラスミドを製造するにあたって、ベクタ
ーとして用いられるプラスミドとしては、例えば大腸菌
（Escherichia coli）由来のpＢＲ３２２〔ジーン(Gen
e)，２，９５(１９７７)〕，pＢＲ３１３〔ジーン，
２，７５(１９７７)〕，pＢＲ３２４，pＢＲ３２５〔ジ
ーン，４，１２４(１９７８)〕，pＢＲ３２７，pＢＲ３
２８〔ジーン，９，２８７(１９８０)〕，pＢＲ３２９
〔ジーン，１７，７９(１９８２)〕，pＫＹ２２８９
〔ジーン，３，１(１９７８)〕，pＫＹ ２７００〔生化
学，５２，７７０(１９８０)〕，pＡＣＹＣ１７７，pＡ
ＣＹＣ１８４〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J
ournal of Bacteriology)，１３４，１１４１(１９７
８)〕，ｐＲＫ２４８，ｐＲＫ６４６，pＤＦ〔メソッズ
・イン・エン ジーモロジー(Methods inEnzymology)，
６８，２６８(１９７９)〕，pＵＣ１８，pＵＣ１９〔ヤ
ニシューペロンら，ジーン(Gene)，３３，１０３(１９
８５)〕などがあげられる。また、バクテリオファー
ジ、例えばλファージを使用したλgt系のλgt・λＣ
〔Proc.Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.Ａ．７１，４５７９
(１９７４)〕，λgt・λＢ〔Proc.Natl. Acad. Sci.
Ｕ.Ｓ.Ａ. ７２，３４６１(１９７５)〕，λＤam〔ジー
ン，１，２５５(１９７７)〕やシャロンベクター〔サイ
エンス，(Science)，１９６，１６１(１９７７)；ジャ
ーナル・オブ・ビーロロジー(Journal of Virology)，
２９，５５５(１９７９)〕，繊維状ファージを使用した
mp系のmp１８，mp１９〔ヤニシューペロンら，ジーン(G
ene)，３３，１０３(１９８５)〕ベクターなどもあげら
れる。
【００１４】上記ＤＮＡは、ＡＴＧの上流にプロモータ
ーを有しているのが好ましく、該プロモーターは、形質
転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌(Esche
richia coli)ではtrpプロモーター，lacプロモーター，
rec Ａプロモーター，λＰＬプロモーター，lppプロモ
ーター，Ｔ７プロモーターなど、枯草菌(Bacillus subt
ilis)ではＳＰＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモータ
ー，penＰプロモーターなど、酵母(Saccharomyces cere
visiae)ではＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモータ
ー，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターなど、動
物細胞ではＳＶ４０由来のプロモーターなどがあげられ
る。必要によりＳＤ(シヤインアンドダルガーノ)配列を
プロモーターの下流に挿入してもよい。Ｔ７プロモータ
ーの系を用いる場合には、Ｔ７プロモーターとしては、
Ｔ７ＤＮＡ上で見い出されている１７種のプロモーター
〔J. L. Oakley ら，Proc．Natl. Acad. Sci, Ｕ.Ｓ.
Ａ，７４：４２６６−４２７０(１９７７)，M. D. Ros
a,Cell １６：８１５−８２５(１９７９)，N. Panayota
tos ら，Nature，２８０：３５(１９７９)，J. J. Dunn
ら，J. Mol. Biol.，１６６：４７７−５３５(１９８
３)〕のいずれでもよいがφ１０プロモーター〔A. H. R
osenberg ら，Gene，５６：１２５−１３５(１９８
７)〕が好ましい。
ーを有しているのが好ましく、該プロモーターは、形質
転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌(Esche
richia coli)ではtrpプロモーター，lacプロモーター，
rec Ａプロモーター，λＰＬプロモーター，lppプロモ
ーター，Ｔ７プロモーターなど、枯草菌(Bacillus subt
ilis)ではＳＰＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモータ
ー，penＰプロモーターなど、酵母(Saccharomyces cere
visiae)ではＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモータ
ー，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターなど、動
物細胞ではＳＶ４０由来のプロモーターなどがあげられ
る。必要によりＳＤ(シヤインアンドダルガーノ)配列を
プロモーターの下流に挿入してもよい。Ｔ７プロモータ
ーの系を用いる場合には、Ｔ７プロモーターとしては、
Ｔ７ＤＮＡ上で見い出されている１７種のプロモーター
〔J. L. Oakley ら，Proc．Natl. Acad. Sci, Ｕ.Ｓ.
Ａ，７４：４２６６−４２７０(１９７７)，M. D. Ros
a,Cell １６：８１５−８２５(１９７９)，N. Panayota
tos ら，Nature，２８０：３５(１９７９)，J. J. Dunn
ら，J. Mol. Biol.，１６６：４７７−５３５(１９８
３)〕のいずれでもよいがφ１０プロモーター〔A. H. R
osenberg ら，Gene，５６：１２５−１３５(１９８
７)〕が好ましい。
【００１５】転写ターミネーターとしては、大腸菌の系
で作動するターミネーター、好ましくはＴφターミネー
ター〔F. W. Studier ら，J. Mol. Biol.，１８９：１
１３−１３０(１９８６)〕が用いられる。Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子としてはＴ７遺伝子〔F. W. Studier
ら，J. Mol. Biol.，１８９：１１３−１３０(１９８
６)〕をあげることが出来る。ベクターは上記ベクター
にＴ７プロモーター，Ｔ７ターミネーターを組み込んで
構築されるのが好ましく、このようなベクターとして
は、pＥＴ−１，pＥＴ−２，pＥＴ−３，pＥＴ−４，p
ＥＴ−５〔A. H. Rosenberg, Gene ５６：１２５−１３
５(１９８７)〕、pＴＢ９６０−２〔ＥＰ−Ａ−４９９
９９０〕などをあげることができるが、好ましくはpＴ
Ｂ９６０−２が用いられる。
で作動するターミネーター、好ましくはＴφターミネー
ター〔F. W. Studier ら，J. Mol. Biol.，１８９：１
１３−１３０(１９８６)〕が用いられる。Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子としてはＴ７遺伝子〔F. W. Studier
ら，J. Mol. Biol.，１８９：１１３−１３０(１９８
６)〕をあげることが出来る。ベクターは上記ベクター
にＴ７プロモーター，Ｔ７ターミネーターを組み込んで
構築されるのが好ましく、このようなベクターとして
は、pＥＴ−１，pＥＴ−２，pＥＴ−３，pＥＴ−４，p
ＥＴ−５〔A. H. Rosenberg, Gene ５６：１２５−１３
５(１９８７)〕、pＴＢ９６０−２〔ＥＰ−Ａ−４９９
９９０〕などをあげることができるが、好ましくはpＴ
Ｂ９６０−２が用いられる。
【００１６】本発明の形質転換体は、上記方法で得られ
る発現用プラスミドを自体公知の方法〔例、コーエンS,
N, ら，プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.
Ａ.)，６９，２１１０(１９７２)〕で宿主を形質転換す
ることにより製造することができる。形質転換される微
生物の宿主としては、例えば、エシェリシア(Escherich
ia)属菌，バチリス(Bacillus)属菌，酵母，動物細胞な
どがあげられる。上記エシェリシア属菌の例としては、
エシェリシア・コリ(E. coli)があげられ、具体的には
エシェリシア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１２ＤＨ１
〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl.Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.
Ａ.)，６０，１６０(１９６８)〕，ＪＭ−１０３〔ヌク
レイック・アシッズ・リサーチ，(Nucleic Acids Resea
rch)，９，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal ofMol
ecular Biology)，１２０，５１７(１９７８)〕，ＨＢ
１０１〔ジャーナル・オ ブ・モレ キュラー・バイオロ
ジー，４１，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス(Genetics)，３９，４４０(１９５４)〕，Ｎ４
８３０〔セル(Cell)，２５，７１３(１９８１)〕，Ｋ−
１２ＭＭ２９４〔プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ，７３，４１７４
(１９７６)〕ＢＬ−２１などがあげられる。
る発現用プラスミドを自体公知の方法〔例、コーエンS,
N, ら，プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.
Ａ.)，６９，２１１０(１９７２)〕で宿主を形質転換す
ることにより製造することができる。形質転換される微
生物の宿主としては、例えば、エシェリシア(Escherich
ia)属菌，バチリス(Bacillus)属菌，酵母，動物細胞な
どがあげられる。上記エシェリシア属菌の例としては、
エシェリシア・コリ(E. coli)があげられ、具体的には
エシェリシア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１２ＤＨ１
〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl.Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.
Ａ.)，６０，１６０(１９６８)〕，ＪＭ−１０３〔ヌク
レイック・アシッズ・リサーチ，(Nucleic Acids Resea
rch)，９，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal ofMol
ecular Biology)，１２０，５１７(１９７８)〕，ＨＢ
１０１〔ジャーナル・オ ブ・モレ キュラー・バイオロ
ジー，４１，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス(Genetics)，３９，４４０(１９５４)〕，Ｎ４
８３０〔セル(Cell)，２５，７１３(１９８１)〕，Ｋ−
１２ＭＭ２９４〔プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ，７３，４１７４
(１９７６)〕ＢＬ−２１などがあげられる。
【００１７】上記バチルス属菌としては、例えばバチル
ス・サチルス(Bacillus subtilis)があげられ、具体的
にはバチルス・サチルスＭＩ１１４(ジーン，２４，２
５５(１９８３))，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー(Journal of Biochemistry)，９
５，８７(１９８４)〕などがあげられる。上記酵母とし
ては、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ(Sacchar
omyces cerevisiae)があげられ、具体的には、サッカロ
マイセス・セレビシアエＡＨ２２〔Proc. Natl. Acad.
Sci. ＵＳＡ，７５，１９２９(１９７８)〕，ＸＳＢ５
２−２３Ｃ〔Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，７７
２１７３(１９８０)〕，ＢＨ−６４１Ａ(ＡＴＣＣ ２
８３３９)，２０Ｂ−１２〔Genetics，８５，２３(１９
７６)〕，ＧＭ３Ｃ−２〔Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ，７８ ２２５８(１９８１)〕などがあげられる。
ス・サチルス(Bacillus subtilis)があげられ、具体的
にはバチルス・サチルスＭＩ１１４(ジーン，２４，２
５５(１９８３))，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー(Journal of Biochemistry)，９
５，８７(１９８４)〕などがあげられる。上記酵母とし
ては、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ(Sacchar
omyces cerevisiae)があげられ、具体的には、サッカロ
マイセス・セレビシアエＡＨ２２〔Proc. Natl. Acad.
Sci. ＵＳＡ，７５，１９２９(１９７８)〕，ＸＳＢ５
２−２３Ｃ〔Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，７７
２１７３(１９８０)〕，ＢＨ−６４１Ａ(ＡＴＣＣ ２
８３３９)，２０Ｂ−１２〔Genetics，８５，２３(１９
７６)〕，ＧＭ３Ｃ−２〔Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ，７８ ２２５８(１９８１)〕などがあげられる。
【００１８】動物細胞としては、例えばサル細胞ＣＯＳ
−７〔セル(Cell)，２３，１７５(１９８１)〕，Vero
〔(日本臨床 ２１，１２０９(１９６３)〕，チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ〔ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メデイシン(J.Exp. Med.)，１０８，９
４５(１９８５)〕，マウスＬ細胞〔ジャーナル・オブ・
ナショナル・キャンサー・インスティチュート(J. Nat.
Cancer Inst.)，４，１６５(１９４３)〕，ヒトＦＬ細
胞〔プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティ・フォ
ー・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィシン(Proc. Soc. Exp. Biol. Med.)，９４，５３２
(１９５７)〕，ハムスターＣ細胞などがあげられる。
−７〔セル(Cell)，２３，１７５(１９８１)〕，Vero
〔(日本臨床 ２１，１２０９(１９６３)〕，チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ〔ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メデイシン(J.Exp. Med.)，１０８，９
４５(１９８５)〕，マウスＬ細胞〔ジャーナル・オブ・
ナショナル・キャンサー・インスティチュート(J. Nat.
Cancer Inst.)，４，１６５(１９４３)〕，ヒトＦＬ細
胞〔プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティ・フォ
ー・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィシン(Proc. Soc. Exp. Biol. Med.)，９４，５３２
(１９５７)〕，ハムスターＣ細胞などがあげられる。
【００１９】Ｔ７プロモーターの系を用いる場合には、
その形質転換体の宿主としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子(Ｔ７遺伝子１)〔F. W. Studierら，J. Mol. B
iol.１８９：１１３−１３０(１９８６)〕を組み込んだ
大腸菌株、例えばＭＭ２９４，ＤＨ−１，Ｃ６００，Ｊ
Ｍ１０９，ＢＬ２１，あるいはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子(Ｔ７遺伝子１)を他のプラスミドと共に組込んだ
大腸菌株などが用いられる。好ましくはＴ７遺伝子１を
組み込んだλファージが溶原化したＭＭ２９４株および
ＢＬ２１株が用いられる。この場合Ｔ７遺伝子１のプロ
モーターとしては、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド(ＩＰＴＧと略することがある。)で
発現が誘導されるlacプロモーターが用いられる。
その形質転換体の宿主としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子(Ｔ７遺伝子１)〔F. W. Studierら，J. Mol. B
iol.１８９：１１３−１３０(１９８６)〕を組み込んだ
大腸菌株、例えばＭＭ２９４，ＤＨ−１，Ｃ６００，Ｊ
Ｍ１０９，ＢＬ２１，あるいはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子(Ｔ７遺伝子１)を他のプラスミドと共に組込んだ
大腸菌株などが用いられる。好ましくはＴ７遺伝子１を
組み込んだλファージが溶原化したＭＭ２９４株および
ＢＬ２１株が用いられる。この場合Ｔ７遺伝子１のプロ
モーターとしては、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド(ＩＰＴＧと略することがある。)で
発現が誘導されるlacプロモーターが用いられる。
【００２０】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を宿主として形質転換するには、例え
ばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティック
ス（Molecular and General Genetics), 168, 111(197
9)など公知の方法に従って行なうことができる。酵母菌
を宿主として形質転換するには、例えば、プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA），75, 1929(1978)などの公知の方法に従
って行なうことができる。動物細胞を宿主として形質転
換するには、例えば、ヴィーロロジー(Virology,52, 45
6(1973)などの公知の方法に従って行なうことができ
る。融合蛋白は、上述の形質転換体を培地に培養し、産
生された融合蛋白を採取することにより製造することが
できる。培地のpＨは約６〜８が望ましい。
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を宿主として形質転換するには、例え
ばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティック
ス（Molecular and General Genetics), 168, 111(197
9)など公知の方法に従って行なうことができる。酵母菌
を宿主として形質転換するには、例えば、プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA），75, 1929(1978)などの公知の方法に従
って行なうことができる。動物細胞を宿主として形質転
換するには、例えば、ヴィーロロジー(Virology,52, 45
6(1973)などの公知の方法に従って行なうことができ
る。融合蛋白は、上述の形質転換体を培地に培養し、産
生された融合蛋白を採取することにより製造することが
できる。培地のpＨは約６〜８が望ましい。
【００２１】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experi
ments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York 1972)〕が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、例えば３β−インドリル アクリル酸やイソプロピ
ルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のよう
な薬剤を加えることができる。
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experi
ments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York 1972)〕が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、例えば３β−インドリル アクリル酸やイソプロピ
ルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のよう
な薬剤を加えることができる。
【００２２】宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通
常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
例えばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostia
n, K. L. ら、プロシージングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sc
i.) USA, 77, 4505(1980)〕があげられる。培地のpＨは
約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜
３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹
拌を加える。
常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
例えばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostia
n, K. L. ら、プロシージングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sc
i.) USA, 77, 4505(1980)〕があげられる。培地のpＨは
約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜
３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹
拌を加える。
【００２３】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えば約０.２〜２０％好ましく
は約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエ
ンス(Science)，122, 501(1952)〕，ＤＭＥ培地〔ヴィ
ロロジー(Virology), 8, 396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６
４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション(The Journal of the American
Medical Association)，199, 519(1967)〕，１９９培
地〔プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of t
he Society for the Biologcal Medicine)，73, 1 (195
0)〕などがあげられる。pＨは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約３０〜４０℃、培養時間は約１５〜
６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
る際、培地としては、例えば約０.２〜２０％好ましく
は約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエ
ンス(Science)，122, 501(1952)〕，ＤＭＥ培地〔ヴィ
ロロジー(Virology), 8, 396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６
４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション(The Journal of the American
Medical Association)，199, 519(1967)〕，１９９培
地〔プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of t
he Society for the Biologcal Medicine)，73, 1 (195
0)〕などがあげられる。pＨは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約３０〜４０℃、培養時間は約１５〜
６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２４】融合蛋白質は、上記形質転換体を培養し、
培養物中に該融合蛋白質を生成，蓄積せしめ、これを採
取することにより製造することができる。培地として
は、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミ
ラー，J.，エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジ
ェネテイクス(Experiments in Molecular Genetics)，
４３１−４３３(Cold Spring Horbor Laboratort，New
York１９７２)〕，２×ＹＴ培地〔メシング，メソッド
・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)，
１０１，２０(１９８３)〕ＬＢ培地などがあげられる。
培養物中に該融合蛋白質を生成，蓄積せしめ、これを採
取することにより製造することができる。培地として
は、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミ
ラー，J.，エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジ
ェネテイクス(Experiments in Molecular Genetics)，
４３１−４３３(Cold Spring Horbor Laboratort，New
York１９７２)〕，２×ＹＴ培地〔メシング，メソッド
・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)，
１０１，２０(１９８３)〕ＬＢ培地などがあげられる。
【００２５】培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時
間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。λc
Ｉtsリプレッサーと、λＰＬ−プロモーターを含有する
発現ベクターとを有する組換え体を使用する場合には、
培養は約１５〜３６℃好ましくは約３０〜３６℃の温度
で行い、λc Ｉtsリプレッサーの不活化は約３７〜４２
℃で行うのが好ましい。またrecＡプロモーターをより
効率良く働かせるため、すなわちrecＡ遺伝子発現抑制
機能を低下せしめるため、必要によりマイトマイシン
Ｃ，ナルジキシン酸などのような薬剤を添加したり、紫
外線を照射する、あるいは培養液のｐＨをアルカリ側に
変化させてもよい。Ｔ７プロモーターの系を用いている
場合には、(１)lacプロモーターの下流に連結されてい
るＴ７遺伝子(ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子)を発現させる
時はＩＰＴＧなどを添加する、もしくは(２)λＰＬプロ
モーターの下流に連結されているＴ７遺伝子（ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子）を発現させる時は培養の温度を上昇
させることなどにより、生成するＴ７ファージＲＮＡポ
リメラーゼ１により特異的にＴ７プロモーターを作動さ
せる。
間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。λc
Ｉtsリプレッサーと、λＰＬ−プロモーターを含有する
発現ベクターとを有する組換え体を使用する場合には、
培養は約１５〜３６℃好ましくは約３０〜３６℃の温度
で行い、λc Ｉtsリプレッサーの不活化は約３７〜４２
℃で行うのが好ましい。またrecＡプロモーターをより
効率良く働かせるため、すなわちrecＡ遺伝子発現抑制
機能を低下せしめるため、必要によりマイトマイシン
Ｃ，ナルジキシン酸などのような薬剤を添加したり、紫
外線を照射する、あるいは培養液のｐＨをアルカリ側に
変化させてもよい。Ｔ７プロモーターの系を用いている
場合には、(１)lacプロモーターの下流に連結されてい
るＴ７遺伝子(ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子)を発現させる
時はＩＰＴＧなどを添加する、もしくは(２)λＰＬプロ
モーターの下流に連結されているＴ７遺伝子（ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子）を発現させる時は培養の温度を上昇
させることなどにより、生成するＴ７ファージＲＮＡポ
リメラーゼ１により特異的にＴ７プロモーターを作動さ
せる。
【００２６】培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば
緩衝液に懸濁したのち、例えば、蛋白変性剤処理，超音
波処理やリゾチームなどの酵素処理，グラスビーズ処
理，フレンチプレス処理，凍結融解処理などを行って菌
体を破砕し、遠心分離など公知の方法によって上清を得
る。上記により得られた上清から、融合蛋白質を単離す
るには、通常知られている蛋白質の精製法に従えばよ
い。例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフィ
ー，吸着クロマトグラフィー，高速液体クロマトグラフ
ィー，アフイニティークロマトグラフィー，疎水クロマ
トグラフィー，電気泳動等を適切に組み合せて行うこと
ができる。また、該融合蛋白質は、精製することなく、
あるいは部分精製の状態で、次の反応工程に進んでもよ
い。次に、このようにして得られる融合蛋白質やペプチ
ドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断
反応に付す。該切断反応としては、例えば、Ｓ−シアノ
化反応次いで加水分解反応があげられる。ＫｉＳＳ−１
ペプチドのアミドまたはその塩を最終物として得る場合
には、該切断反応としては、例えば、Ｓ−シアノ化反応
次いでアンモノリシスを行うことがあげられる。該Ｓ−
シアノ化反応は、原料化合物に、Ｓ−シアノ化試薬を作
用させることにより行なう。
緩衝液に懸濁したのち、例えば、蛋白変性剤処理，超音
波処理やリゾチームなどの酵素処理，グラスビーズ処
理，フレンチプレス処理，凍結融解処理などを行って菌
体を破砕し、遠心分離など公知の方法によって上清を得
る。上記により得られた上清から、融合蛋白質を単離す
るには、通常知られている蛋白質の精製法に従えばよ
い。例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフィ
ー，吸着クロマトグラフィー，高速液体クロマトグラフ
ィー，アフイニティークロマトグラフィー，疎水クロマ
トグラフィー，電気泳動等を適切に組み合せて行うこと
ができる。また、該融合蛋白質は、精製することなく、
あるいは部分精製の状態で、次の反応工程に進んでもよ
い。次に、このようにして得られる融合蛋白質やペプチ
ドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断
反応に付す。該切断反応としては、例えば、Ｓ−シアノ
化反応次いで加水分解反応があげられる。ＫｉＳＳ−１
ペプチドのアミドまたはその塩を最終物として得る場合
には、該切断反応としては、例えば、Ｓ−シアノ化反応
次いでアンモノリシスを行うことがあげられる。該Ｓ−
シアノ化反応は、原料化合物に、Ｓ−シアノ化試薬を作
用させることにより行なう。
【００２７】Ｓ−シアノ化試薬としては例えば２−ニト
ロ−５−チオシアノ安息香酸(ＮＴＣＢ)，１−シアノ−
４−ジメチルアミノピリジウム塩(ＤＭＡＰ−ＣＮ)，Ｃ
Ｎ −イオンなどがあげられる。該Ｓ−シアノ化試薬の量
は、モル数で全チオール基の約２倍から５０倍量であれ
ばよく、好ましくは約５倍〜１０倍量である。反応温度
は約０〜８０℃の間であれば、いずれでもよく、約０〜
５０℃の間がより好ましい。用いる溶媒としては、Ｓ−
シアノ化試薬と反応しないものであれば、いずれの緩衝
液でもよいが、例えば、トリス−塩酸緩衝液，トリス−
酢酸緩衝液，リン酸緩衝液，ホウ酸緩衝液，などがあげ
られる。また、有機溶媒は、Ｓ−シアノ化試薬と反応し
ないものであれば、存在していてもよい。該反応は、p
Ｈ１〜１２の間で行なうのが良い。特に、ＮＴＣＢを用
いる場合にはpＨ７〜１０，ＤＭＡＰ−ＣＮを用いる場
合にはＳ−Ｓ交換反応を防止するため、pＨ２〜７の間
が好ましい。また、反応液中には、塩酸グアニジン等の
変性剤が存在していてもよい。
ロ−５−チオシアノ安息香酸(ＮＴＣＢ)，１−シアノ−
４−ジメチルアミノピリジウム塩(ＤＭＡＰ−ＣＮ)，Ｃ
Ｎ −イオンなどがあげられる。該Ｓ−シアノ化試薬の量
は、モル数で全チオール基の約２倍から５０倍量であれ
ばよく、好ましくは約５倍〜１０倍量である。反応温度
は約０〜８０℃の間であれば、いずれでもよく、約０〜
５０℃の間がより好ましい。用いる溶媒としては、Ｓ−
シアノ化試薬と反応しないものであれば、いずれの緩衝
液でもよいが、例えば、トリス−塩酸緩衝液，トリス−
酢酸緩衝液，リン酸緩衝液，ホウ酸緩衝液，などがあげ
られる。また、有機溶媒は、Ｓ−シアノ化試薬と反応し
ないものであれば、存在していてもよい。該反応は、p
Ｈ１〜１２の間で行なうのが良い。特に、ＮＴＣＢを用
いる場合にはpＨ７〜１０，ＤＭＡＰ−ＣＮを用いる場
合にはＳ−Ｓ交換反応を防止するため、pＨ２〜７の間
が好ましい。また、反応液中には、塩酸グアニジン等の
変性剤が存在していてもよい。
【００２８】上記アンモノリシスまたは加水分解反応と
しては、例えばアルカリ処理に付すことがあげられる。
該アルカリ処理としては、原料化合物を含有する水溶液
のpＨを７〜１４に、調整することにより行なわれる。
該ｐＨの調整は、例えばアンモニア、水酸化ナトリウ
ム，アミノ化合物，トリツマベース（トリス〔ヒドロキ
シメチル〕−アミノメタン），リン酸第２ナトリウム，
水酸化カリウム，水酸化バリウム等の溶液を原料化合物
を含有する水溶液に適当量加えて行うが特にアンモニア
などが好ましい。上記反応の際の溶液の濃度としては、
たとえばアンモニアまたはアミノ化合物の場合は約０.
０１〜１５Ｎ好ましくは約０.１〜３Ｎ、水酸化ナトリ
ウムの場合は約０.０１〜２Ｎ好ましくは約０.０５〜１
Ｎ、トリツマベースの場合は約１mＭ〜１Ｍ好ましくは
約２０mＭ〜２００mＭ、リン酸第２ナトリウムの場合は
約１mＭ〜１Ｍ好ましくは約１０mＭ〜１００mＭ、水酸
化カリウムの場合は約０.０１〜４Ｎ好ましくは約０.１
〜２Ｎがあげられる。反応温度は約−２０〜８０℃の間
であればいずれでもよく、約−１０〜５０℃の間がより
好ましい。
しては、例えばアルカリ処理に付すことがあげられる。
該アルカリ処理としては、原料化合物を含有する水溶液
のpＨを７〜１４に、調整することにより行なわれる。
該ｐＨの調整は、例えばアンモニア、水酸化ナトリウ
ム，アミノ化合物，トリツマベース（トリス〔ヒドロキ
シメチル〕−アミノメタン），リン酸第２ナトリウム，
水酸化カリウム，水酸化バリウム等の溶液を原料化合物
を含有する水溶液に適当量加えて行うが特にアンモニア
などが好ましい。上記反応の際の溶液の濃度としては、
たとえばアンモニアまたはアミノ化合物の場合は約０.
０１〜１５Ｎ好ましくは約０.１〜３Ｎ、水酸化ナトリ
ウムの場合は約０.０１〜２Ｎ好ましくは約０.０５〜１
Ｎ、トリツマベースの場合は約１mＭ〜１Ｍ好ましくは
約２０mＭ〜２００mＭ、リン酸第２ナトリウムの場合は
約１mＭ〜１Ｍ好ましくは約１０mＭ〜１００mＭ、水酸
化カリウムの場合は約０.０１〜４Ｎ好ましくは約０.１
〜２Ｎがあげられる。反応温度は約−２０〜８０℃の間
であればいずれでもよく、約−１０〜５０℃の間がより
好ましい。
【００２９】反応時間は、好ましくは、Ｓ−シアノ化反
応は約１〜６０分好ましくは約１５〜３０分が、加水分
解反応は約５分〜１００時間好ましくは１０分〜１５時
間が、アンモノリシスは約５分〜２４時間好ましくは約
１０〜１８０分があげられる。該アミノ化合物として
は、例えば、式 Ｒ１−(ＮＲ２)−Ｈ（式中、Ｒ１およ
びＲ２は同一または異なって、(i)水素原子、(ii)Ｃ
１−２０アルキル基，Ｃ３ −８シクロアルキル基，Ｃ
６−１４アリール(aryl)基またはＣ６−１４アリール−
Ｃ１−３アルキル基（これらは置換基を有していないか
あるいは１〜３個のアミノ基，水酸基などを炭素原子上
に有していてもよい）、(iii)置換されていてもよいア
ミノ基、(iv)水酸基またはＣ１−６アルコキシ基を示
す。）で表される化合物などがあげられる。上記のＳ−
シアノ化およびアンモノリシスまたは加水分解により、
〔図１〕に示される反応が起こると考えられる。本発明
の製造法で得られるＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端は、
前記したようにアミド（-CONH２）、カルボキシル基、
カルボキシレート(-COO−)、アルキルアミド（-CONHR）
またはエステル(-COOR)であってもよく、なかでもアミ
ド、カルボキシル基（-COOH）またはアルキルアミドが
好ましく、特にアミドまたはアルキルアミドが好適であ
る。具体的には、本発明の製造法で得られるＫｉＳＳ−
１ペプチドのＣ末端は、〔図１〕に示される−ＣＯ−Ｘ
であってよい。ＸはＲ１−(ＮＲ２)−（式中、各記号は
前記と同意義を示す。）またはＯＨを示す。上記Ｃ
１−２０アルキルの例としては、例えば、メチル，エチ
ル，プロピル，イソプロピル，ブチル，sec-ブチル，ペ
ンチル，イソペンチル，ネオペンチル，１−エチルペン
チル，ヘキシル，イソヘキシル，ヘプチル，オクチル，
ノナニル，デカニル，ウンデカニル，ドデカニル，テト
ラデカニル，ペンタデカニル，ヘキサデカニル，ヘプタ
デカニル，オクタデカニル，ノナデカニルおよびエイコ
サニルなどがあげられる。上記Ｃ３−８シクロアルキル
の例としては、例えば、シクロプロピル，シクロブチ
ル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロヘプチ
ル，シクロオクチルなどがあげられる。上記Ｃ６−１４
アリールの例としては、フェニル，ナフチル，アンスリ
ル，フェナンスリル，アセナフチレニルなどがあげられ
る。上記Ｃ６−１４アリール−Ｃ１−３アルキルの例と
しては、例えばベンジル，フェネチル，３−フェニルプ
ロピル，(１−ナフチル)メチル，(２−ナフチル)メチル
などがあげられる。上記Ｃ１−６アルコキシの例として
は、例えばメトキシ，エトキシ，プロポキシ，ブトキ
シ，ペンチルオキシ，ヘキシルオキシなどがあげられ
る。
応は約１〜６０分好ましくは約１５〜３０分が、加水分
解反応は約５分〜１００時間好ましくは１０分〜１５時
間が、アンモノリシスは約５分〜２４時間好ましくは約
１０〜１８０分があげられる。該アミノ化合物として
は、例えば、式 Ｒ１−(ＮＲ２)−Ｈ（式中、Ｒ１およ
びＲ２は同一または異なって、(i)水素原子、(ii)Ｃ
１−２０アルキル基，Ｃ３ −８シクロアルキル基，Ｃ
６−１４アリール(aryl)基またはＣ６−１４アリール−
Ｃ１−３アルキル基（これらは置換基を有していないか
あるいは１〜３個のアミノ基，水酸基などを炭素原子上
に有していてもよい）、(iii)置換されていてもよいア
ミノ基、(iv)水酸基またはＣ１−６アルコキシ基を示
す。）で表される化合物などがあげられる。上記のＳ−
シアノ化およびアンモノリシスまたは加水分解により、
〔図１〕に示される反応が起こると考えられる。本発明
の製造法で得られるＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端は、
前記したようにアミド（-CONH２）、カルボキシル基、
カルボキシレート(-COO−)、アルキルアミド（-CONHR）
またはエステル(-COOR)であってもよく、なかでもアミ
ド、カルボキシル基（-COOH）またはアルキルアミドが
好ましく、特にアミドまたはアルキルアミドが好適であ
る。具体的には、本発明の製造法で得られるＫｉＳＳ−
１ペプチドのＣ末端は、〔図１〕に示される−ＣＯ−Ｘ
であってよい。ＸはＲ１−(ＮＲ２)−（式中、各記号は
前記と同意義を示す。）またはＯＨを示す。上記Ｃ
１−２０アルキルの例としては、例えば、メチル，エチ
ル，プロピル，イソプロピル，ブチル，sec-ブチル，ペ
ンチル，イソペンチル，ネオペンチル，１−エチルペン
チル，ヘキシル，イソヘキシル，ヘプチル，オクチル，
ノナニル，デカニル，ウンデカニル，ドデカニル，テト
ラデカニル，ペンタデカニル，ヘキサデカニル，ヘプタ
デカニル，オクタデカニル，ノナデカニルおよびエイコ
サニルなどがあげられる。上記Ｃ３−８シクロアルキル
の例としては、例えば、シクロプロピル，シクロブチ
ル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロヘプチ
ル，シクロオクチルなどがあげられる。上記Ｃ６−１４
アリールの例としては、フェニル，ナフチル，アンスリ
ル，フェナンスリル，アセナフチレニルなどがあげられ
る。上記Ｃ６−１４アリール−Ｃ１−３アルキルの例と
しては、例えばベンジル，フェネチル，３−フェニルプ
ロピル，(１−ナフチル)メチル，(２−ナフチル)メチル
などがあげられる。上記Ｃ１−６アルコキシの例として
は、例えばメトキシ，エトキシ，プロポキシ，ブトキ
シ，ペンチルオキシ，ヘキシルオキシなどがあげられ
る。
【００３０】上記(iii)の置換されていてもよいアミノ
の置換基の例としては、例えばアミノ酸，２〜１０個の
アミノ酸からなるペプチドなどがあげられる。上記アミ
ノ酸としては、Ｌ−体でもＤ−体でもよく、その例とし
ては、例えば、Ala，Arg，Asp，Asn，Glu，Gln，Gly，H
is，Ile，Met，Leu，Lys, Phe，Pro,Ser,Thr, Trp, Ty
r, Val などがあげられる。上記ペプチドの例として
は、例えば、H-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C２H５，H-Val-A
la-Leu-D-Ala-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-OH などがあげ
られる。上記した中でも、Ｒ２としては水素原子、Ｒ１
としては水素原子またはＣ１− ２０アルキル基が好まし
い。該アンモノリシス反応において、アンモニアまたは
アミノ化合物を用いた場合には、対応するアミド体が得
られる。
の置換基の例としては、例えばアミノ酸，２〜１０個の
アミノ酸からなるペプチドなどがあげられる。上記アミ
ノ酸としては、Ｌ−体でもＤ−体でもよく、その例とし
ては、例えば、Ala，Arg，Asp，Asn，Glu，Gln，Gly，H
is，Ile，Met，Leu，Lys, Phe，Pro,Ser,Thr, Trp, Ty
r, Val などがあげられる。上記ペプチドの例として
は、例えば、H-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C２H５，H-Val-A
la-Leu-D-Ala-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-OH などがあげ
られる。上記した中でも、Ｒ２としては水素原子、Ｒ１
としては水素原子またはＣ１− ２０アルキル基が好まし
い。該アンモノリシス反応において、アンモニアまたは
アミノ化合物を用いた場合には、対応するアミド体が得
られる。
【００３１】切り出された目的ペプチドを単離するに
は、通常知られているペプチドの精製法に従えばよい。
例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフィー，
高速液体クロマトグラフィー，アフイニティークロマト
グラフィー，疎水クロマトグラフィー，薄層クロマトグ
ラフィー，電気泳動等を適宜組み合せて行うことができ
る。このようにして得られるＫｉＳＳ−１ペプチドまた
はその塩は、公知の精製手段、例えば、抽出、塩析、分
配、再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液
から単離・精製することもできるが、好ましい例とし
て、例えば、ＳＰ−セファロース（ファルマシア バイ
オテク(株)）、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー(株)）、ある
いはＳＰ−５ＰＷ（東ソー(株)）を介したイオン交換ク
ロマトグラフィーなどによる精製法があげられる。
は、通常知られているペプチドの精製法に従えばよい。
例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフィー，
高速液体クロマトグラフィー，アフイニティークロマト
グラフィー，疎水クロマトグラフィー，薄層クロマトグ
ラフィー，電気泳動等を適宜組み合せて行うことができ
る。このようにして得られるＫｉＳＳ−１ペプチドまた
はその塩は、公知の精製手段、例えば、抽出、塩析、分
配、再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液
から単離・精製することもできるが、好ましい例とし
て、例えば、ＳＰ−セファロース（ファルマシア バイ
オテク(株)）、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー(株)）、ある
いはＳＰ−５ＰＷ（東ソー(株)）を介したイオン交換ク
ロマトグラフィーなどによる精製法があげられる。
【００３２】得られるＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその
塩は、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすること
もできる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール，マンニ
トール，デキストロース，マルトース，トレハロース，
グリセロールなどの安定化剤を加えることができる。
塩は、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすること
もできる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール，マンニ
トール，デキストロース，マルトース，トレハロース，
グリセロールなどの安定化剤を加えることができる。
【００３３】本発明の方法で製造されるＫｉＳＳ−１ペ
プチドまたはその塩は滅菌水，ヒト血清アルブミン(Ｈ
ＳＡ)，生理食塩水その他公知の生理学的に許容される
担体と混合することができ、哺乳動物（例、ヒト）に対
して非経口的に又は局所に投与することができる。たと
えば、その１日投与量は１人あたり、約０.０１〜５０m
g、好ましくは、約０.１〜１０mgを、静注または筋注な
どにより非経口的に投与することができる。本発明の方
法で製造されるＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩を含
有する製剤は、塩，希釈剤，アジュバント，他の担体，
バッファー，結合剤，界面活性剤，保存剤のような生理
的に許容される他の活性成分も含有していてもよい。非
経口的投与製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容され
る溶媒との懸濁液アンプル、または生理学的に許容され
る希釈液で用時希釈して使用しうる滅菌粉末(通常ペプ
チド溶液を凍結乾燥して得られる)アンプルとして提供
される。
プチドまたはその塩は滅菌水，ヒト血清アルブミン(Ｈ
ＳＡ)，生理食塩水その他公知の生理学的に許容される
担体と混合することができ、哺乳動物（例、ヒト）に対
して非経口的に又は局所に投与することができる。たと
えば、その１日投与量は１人あたり、約０.０１〜５０m
g、好ましくは、約０.１〜１０mgを、静注または筋注な
どにより非経口的に投与することができる。本発明の方
法で製造されるＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩を含
有する製剤は、塩，希釈剤，アジュバント，他の担体，
バッファー，結合剤，界面活性剤，保存剤のような生理
的に許容される他の活性成分も含有していてもよい。非
経口的投与製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容され
る溶媒との懸濁液アンプル、または生理学的に許容され
る希釈液で用時希釈して使用しうる滅菌粉末(通常ペプ
チド溶液を凍結乾燥して得られる)アンプルとして提供
される。
【００３４】本発明の製造法によって得られるＫｉＳＳ
−１ペプチドまたはその塩は癌転移抑制活性を有するた
め、あらゆる癌（例えば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大
腸癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、
乳癌等）の予防または治療薬として有用である。また、
ＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩は胎盤機能調節作用
を有するため、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎
児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘
発の予防または治療薬として有用である。なお、本発明
の製造法において、ＫｉＳＳ−１ペプチドを他の目的成
熟ペプチドに代え、さらにＮ末端にシステインを有する
低分子ペプチドを当該目的成熟ペプチドの前駆体蛋白質
のＣ末端側の部分ペプチドに代えることによって、同様
にして、目的成熟ペプチドを製造することができる。他
の目的成熟ペプチドとしては、例えば、約１０〜２００
個、好ましくは約１０〜１００個程度のアミノ酸残基を
含有するペプチドなどが用いられる。当該目的成熟ペプ
チドの前駆体蛋白質のＣ末端側の部分ペプチドとして
は、当該目的成熟ペプチドを含む前駆体蛋白質のＣ末端
側の部分ペプチドであって、当該目的成熟ペプチドのＣ
末端アミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基から始まるア
ミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。また、
当該目的成熟ペプチドの前駆体蛋白質のＣ末端側の部分
ペプチドとしては、例えば、当該目的成熟ペプチドの前
駆体蛋白質のＣ末端側の約１０〜５０個、好ましくは約
２０〜４０個、さらに好ましくは約２０〜３０個のアミ
ノ酸残基を有する部分ペプチドが用いられる。
−１ペプチドまたはその塩は癌転移抑制活性を有するた
め、あらゆる癌（例えば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大
腸癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、
乳癌等）の予防または治療薬として有用である。また、
ＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩は胎盤機能調節作用
を有するため、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎
児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘
発の予防または治療薬として有用である。なお、本発明
の製造法において、ＫｉＳＳ−１ペプチドを他の目的成
熟ペプチドに代え、さらにＮ末端にシステインを有する
低分子ペプチドを当該目的成熟ペプチドの前駆体蛋白質
のＣ末端側の部分ペプチドに代えることによって、同様
にして、目的成熟ペプチドを製造することができる。他
の目的成熟ペプチドとしては、例えば、約１０〜２００
個、好ましくは約１０〜１００個程度のアミノ酸残基を
含有するペプチドなどが用いられる。当該目的成熟ペプ
チドの前駆体蛋白質のＣ末端側の部分ペプチドとして
は、当該目的成熟ペプチドを含む前駆体蛋白質のＣ末端
側の部分ペプチドであって、当該目的成熟ペプチドのＣ
末端アミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基から始まるア
ミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。また、
当該目的成熟ペプチドの前駆体蛋白質のＣ末端側の部分
ペプチドとしては、例えば、当該目的成熟ペプチドの前
駆体蛋白質のＣ末端側の約１０〜５０個、好ましくは約
２０〜４０個、さらに好ましくは約２０〜３０個のアミ
ノ酸残基を有する部分ペプチドが用いられる。
【００３５】本明細書および図面において、アミノ酸，
ペプチド，保護基，活性基，その他に関し略号で表示す
る場合、それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ(Commission on B
iochemical Nomenclature)による略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づくものであり、その例を次にあ
げる。また、アミノ酸などに関し光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 Ｇly ：グリシン Ａla ：アラニン Ｖal ：バリン Ｌeu ：ロイシン Ｉle ：イソロイシン Ｓer ：セリン Ｔhr ：スレオニン Ｍet ：メチオニン Ｇlu ：グルタミン酸 Ａsp ：アスパラギン酸 Ｌys ：リジン Ａrg ：アルギニン Ｈis ：ヒスチジン Ｐhe ：フェニールアラニン Ｔyr ：チロシン Ｔrp ：トリプトファン Ｐro ：プロリン Ａsn ：アスパラギン Ｇln ：グルタミン Ｃys ：システイン Ａsx ：アスパラギンまたはアスパラギン酸 Ｇlx ：グルタミンまたはグルタミン酸 ATP ：アデノシン三リン酸
ペプチド，保護基，活性基，その他に関し略号で表示す
る場合、それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ(Commission on B
iochemical Nomenclature)による略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づくものであり、その例を次にあ
げる。また、アミノ酸などに関し光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 Ｇly ：グリシン Ａla ：アラニン Ｖal ：バリン Ｌeu ：ロイシン Ｉle ：イソロイシン Ｓer ：セリン Ｔhr ：スレオニン Ｍet ：メチオニン Ｇlu ：グルタミン酸 Ａsp ：アスパラギン酸 Ｌys ：リジン Ａrg ：アルギニン Ｈis ：ヒスチジン Ｐhe ：フェニールアラニン Ｔyr ：チロシン Ｔrp ：トリプトファン Ｐro ：プロリン Ａsn ：アスパラギン Ｇln ：グルタミン Ｃys ：システイン Ａsx ：アスパラギンまたはアスパラギン酸 Ｇlx ：グルタミンまたはグルタミン酸 ATP ：アデノシン三リン酸
【００３６】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 ［配列番号：１］ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドのアミノ酸
配列を示す。 ［配列番号：２］ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドをコードす
るＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：３］低分子ペプチドのアミノ酸配列を示
す。 ［配列番号：４］低分子ペプチドをコードするＤＮＡの
塩基配列を示す。 ［配列番号：５］融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：６］式（I）で表される融合蛋白質をコー
ドするＤＮＡの断片の塩基配列１を示す。 ［配列番号：７］式（I）で表される融合蛋白質をコー
ドするＤＮＡの断片の塩基配列２を示す。 ［配列番号：８］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプチ
ドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列を
示す。 ［配列番号：９］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプチ
ドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列を
示す。 ［配列番号：１０］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列
を示す。 ［配列番号：１１］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列
を示す。 ［配列番号：１２］実施例１において得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 ［配列番号：１３］実施例１において得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 ［配列番号：１４］実施例１において得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 ［配列番号：１５］ＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体のアミ
ノ酸配列を示す。 ［配列番号：１６］マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体
（Ａ）のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１７］マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体
（Ｂ）のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１８］ラットＫｉＳＳ−１ペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。 ［配列番号：１９］マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体
（Ａ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：２０］マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体
（Ｂ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：２１］ラットＫｉＳＳ−１ペプチドをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 後述の実施例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣ２Ｍ
ｅｔＣ２４−１．３は、２００１年１２月１０日から茨
城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３
０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８
２３として、２００１年１０月２４日から大阪府大阪市
淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６
８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号Ｉ
ＦＯ １６７１７して寄託されている。
配列を示す。 ［配列番号：１］ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドのアミノ酸
配列を示す。 ［配列番号：２］ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドをコードす
るＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：３］低分子ペプチドのアミノ酸配列を示
す。 ［配列番号：４］低分子ペプチドをコードするＤＮＡの
塩基配列を示す。 ［配列番号：５］融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：６］式（I）で表される融合蛋白質をコー
ドするＤＮＡの断片の塩基配列１を示す。 ［配列番号：７］式（I）で表される融合蛋白質をコー
ドするＤＮＡの断片の塩基配列２を示す。 ［配列番号：８］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプチ
ドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列を
示す。 ［配列番号：９］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプチ
ドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列を
示す。 ［配列番号：１０］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列
を示す。 ［配列番号：１１］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列
を示す。 ［配列番号：１２］実施例１において得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 ［配列番号：１３］実施例１において得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 ［配列番号：１４］実施例１において得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 ［配列番号：１５］ＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体のアミ
ノ酸配列を示す。 ［配列番号：１６］マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体
（Ａ）のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１７］マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体
（Ｂ）のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１８］ラットＫｉＳＳ−１ペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。 ［配列番号：１９］マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体
（Ａ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：２０］マウスＫｉＳＳ−１ペプチド前駆体
（Ｂ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：２１］ラットＫｉＳＳ−１ペプチドをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 後述の実施例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣ２Ｍ
ｅｔＣ２４−１．３は、２００１年１２月１０日から茨
城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３
０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８
２３として、２００１年１０月２４日から大阪府大阪市
淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６
８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号Ｉ
ＦＯ １６７１７して寄託されている。
【００３７】
【発明の実施の形態】以下に実施例をあげて、本発明を
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。
【００３８】
【実施例】実施例１ Ｃ末端２４アミノ酸付加ＫｉＳＳ
−１ペプチドをコードするＤＮＡの製造（１） (a)ＤＮＡ断片の合成 〔図１〕に示す４種のＤＮＡ断片（＃１、＃２；５’リ
ン酸化済，＃３；５’リン酸化済，＃４：キコーテック
社）（配列番号：８〜１１）を用いてＫｉＳＳ−１ペプ
チドのＣ末端に付加（２４アミノ酸残基）する遺伝子を
調製した。
−１ペプチドをコードするＤＮＡの製造（１） (a)ＤＮＡ断片の合成 〔図１〕に示す４種のＤＮＡ断片（＃１、＃２；５’リ
ン酸化済，＃３；５’リン酸化済，＃４：キコーテック
社）（配列番号：８〜１１）を用いてＫｉＳＳ−１ペプ
チドのＣ末端に付加（２４アミノ酸残基）する遺伝子を
調製した。
【００３９】(b)Ｃ末端付加用ＤＮＡ断片の連結
上記ａ）で得られたＤＮＡ断片＃１〜＃４を合わせ４０
μｌとした。この混合液を６５℃で１０分間保った後、
室温まで徐冷しアニーリングを行った。このアニーリン
グ液のうち１０μｌについてT4 DNA Ligase（宝酒造）
を用いてライゲーション反応を行った。アニーリング液
１０μｌに １０倍濃縮添付Ligation バッファー２μｌ
およびＴ４ DNA ライゲース１μｌ（３５０ユニット）
を加えよく混合した後、１６℃、１７時間反応させ、ラ
イゲーションを行った後、６５℃で５分間の熱処理を行
った。この様にして得られたＤＮＡ断片をＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造）によるリン酸化を行った
後、１.８％低融点アガロースゲル電気泳動により９６b
pのＤＮＡ断片（配列番号：１２）をELUTIP Minicolumn
（Ｓ＆Ｓ社）を用いて抽出し、２０μｌのＴＥ緩衝液
に溶解し、以下の(c)に供した。
μｌとした。この混合液を６５℃で１０分間保った後、
室温まで徐冷しアニーリングを行った。このアニーリン
グ液のうち１０μｌについてT4 DNA Ligase（宝酒造）
を用いてライゲーション反応を行った。アニーリング液
１０μｌに １０倍濃縮添付Ligation バッファー２μｌ
およびＴ４ DNA ライゲース１μｌ（３５０ユニット）
を加えよく混合した後、１６℃、１７時間反応させ、ラ
イゲーションを行った後、６５℃で５分間の熱処理を行
った。この様にして得られたＤＮＡ断片をＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造）によるリン酸化を行った
後、１.８％低融点アガロースゲル電気泳動により９６b
pのＤＮＡ断片（配列番号：１２）をELUTIP Minicolumn
（Ｓ＆Ｓ社）を用いて抽出し、２０μｌのＴＥ緩衝液
に溶解し、以下の(c)に供した。
【００４０】(c)ＫｉＳＳ−１遺伝子とＣ末端付加用Ｄ
ＮＡフラグメントの連結 ＫｉＳＳ−１ペプチド発現ベクターpTFC-KiSS-1をＮｄ
ｅＩ（宝酒造）およびＸｍｎＩ（ＮＥＢ社）で３７℃、
２時間消化した後、１.５％低融点アガロースゲル電気
泳動により１４９bpのＤＮＡ断片（配列番号：１３）を
ELUTIP Minicolumn （Ｓ＆Ｓ社）を用いて抽出し、２
０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このＤＮＡ断片と上記
b）で得られたＤＮＡ断片をライゲーションした。１４
９bpのＤＮＡ溶液２０μｌと９６bpのＤＮＡ溶液１０μ
ｌに１０倍濃縮添付 Ligation バッファー３．５μｌお
よびＴ４ DNA ライゲース１.５μｌ（５２５ユニット）
を加えよく混合した後、１６℃、１７時間反応させた。
ライゲーションを行った後、６５℃で５分間の熱処理を
行った。このライゲーション液を用いて全量３５０μｌ
でＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ消化を１時間行った後、エ
タノール沈殿によってＤＮＡ断片（配列番号：１４）を
回収し、以下の(d)に供した。 (d)Ｃ末端２４アミノ酸付加ＫｉＳＳ−１ペプチド発現
ベクターの構築〔図２〕 発現用ベクターｐＴＣIIをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ
（宝酒造）で３７℃、１時間消化した後、１％アガロー
スゲル電気泳動により４.６kbのＤＮＡ断片をQIAquick
Gel Extraction Kit （キアゲン社）を用いて抽出し、
２５μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このｐＴＣIIのＮｄ
ｅＩ−ＢａｍＨＩ断片と上記c）で得られたＤＮＡ断片
をT4 DNA Ligase（宝酒造）を用いてライゲーション反
応を行った。
ＮＡフラグメントの連結 ＫｉＳＳ−１ペプチド発現ベクターpTFC-KiSS-1をＮｄ
ｅＩ（宝酒造）およびＸｍｎＩ（ＮＥＢ社）で３７℃、
２時間消化した後、１.５％低融点アガロースゲル電気
泳動により１４９bpのＤＮＡ断片（配列番号：１３）を
ELUTIP Minicolumn （Ｓ＆Ｓ社）を用いて抽出し、２
０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このＤＮＡ断片と上記
b）で得られたＤＮＡ断片をライゲーションした。１４
９bpのＤＮＡ溶液２０μｌと９６bpのＤＮＡ溶液１０μ
ｌに１０倍濃縮添付 Ligation バッファー３．５μｌお
よびＴ４ DNA ライゲース１.５μｌ（５２５ユニット）
を加えよく混合した後、１６℃、１７時間反応させた。
ライゲーションを行った後、６５℃で５分間の熱処理を
行った。このライゲーション液を用いて全量３５０μｌ
でＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ消化を１時間行った後、エ
タノール沈殿によってＤＮＡ断片（配列番号：１４）を
回収し、以下の(d)に供した。 (d)Ｃ末端２４アミノ酸付加ＫｉＳＳ−１ペプチド発現
ベクターの構築〔図２〕 発現用ベクターｐＴＣIIをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ
（宝酒造）で３７℃、１時間消化した後、１％アガロー
スゲル電気泳動により４.６kbのＤＮＡ断片をQIAquick
Gel Extraction Kit （キアゲン社）を用いて抽出し、
２５μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このｐＴＣIIのＮｄ
ｅＩ−ＢａｍＨＩ断片と上記c）で得られたＤＮＡ断片
をT4 DNA Ligase（宝酒造）を用いてライゲーション反
応を行った。
【００４１】この反応液を１０μl用いて大腸菌ＪＭ１
０９コンピテントセル（宝酒造）を形質転換し、１０μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播
き、３７℃で一晩培養し、生じたテトラサイクリン耐性
コロニー選んだ。この形質転換体をＬＢ培地で１晩培養
し、QIAprep8 Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプ
ラスミドpTC2MetC24を調製した。このＣ末端２４アミノ
酸付加ＫｉＳＳ−１構造遺伝子部分の塩基配列をアプラ
イドバイオシステムズ社モデル３１００ＤＮＡシーケン
サーを用いて確認した。プラスミドpTC2MetC24で大腸菌
ＭＭ２９４（ＤＥ３）を形質転換し、Ｃ末端２４アミノ
酸付加ＫｉＳＳ−１タンパク質発現株ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＴＣ２ＭｅｔＣ２４−１．３を得た。
０９コンピテントセル（宝酒造）を形質転換し、１０μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播
き、３７℃で一晩培養し、生じたテトラサイクリン耐性
コロニー選んだ。この形質転換体をＬＢ培地で１晩培養
し、QIAprep8 Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプ
ラスミドpTC2MetC24を調製した。このＣ末端２４アミノ
酸付加ＫｉＳＳ−１構造遺伝子部分の塩基配列をアプラ
イドバイオシステムズ社モデル３１００ＤＮＡシーケン
サーを用いて確認した。プラスミドpTC2MetC24で大腸菌
ＭＭ２９４（ＤＥ３）を形質転換し、Ｃ末端２４アミノ
酸付加ＫｉＳＳ−１タンパク質発現株ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＴＣ２ＭｅｔＣ２４−１．３を得た。
【００４２】（e）Ｃ末端２４アミノ酸付加ＫｉＳＳ−
１ペプチドの製造 MM294(DE3)/ pTC2MetC24-1.3 を５．０ｍｇ／Ｌのテト
ラサイクリンを含むＬＢ培地に１Ｌ（１％ペプトン、
０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）を用い
て２Ｌ容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。
得られた培養液を１９Ｌの主発酵培地（１．６８％リン
酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸２水素カリウム、
０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウ
ム、０．０２５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡
剤、０．０００２５％硫酸第１鉄、０．０００５％塩酸
チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を
仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３０℃で通気攪拌
を開始した。培養液の濁度が５００クレット単位になっ
たところで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシドの最終濃度が１２ｍｇ／Ｌになるように添加し、
さらに６時間培養を行った。培養終了後、培養液を遠心
分離し、約４３０ｇの湿菌体を取得し、−８０℃で保存
した。
１ペプチドの製造 MM294(DE3)/ pTC2MetC24-1.3 を５．０ｍｇ／Ｌのテト
ラサイクリンを含むＬＢ培地に１Ｌ（１％ペプトン、
０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）を用い
て２Ｌ容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。
得られた培養液を１９Ｌの主発酵培地（１．６８％リン
酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸２水素カリウム、
０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウ
ム、０．０２５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡
剤、０．０００２５％硫酸第１鉄、０．０００５％塩酸
チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を
仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３０℃で通気攪拌
を開始した。培養液の濁度が５００クレット単位になっ
たところで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシドの最終濃度が１２ｍｇ／Ｌになるように添加し、
さらに６時間培養を行った。培養終了後、培養液を遠心
分離し、約４３０ｇの湿菌体を取得し、−８０℃で保存
した。
【００４３】実施例２
実施例１で得た菌体７０ｇに７Ｍグアニジン塩酸塩、１
００ｍＭトリス緩衝液１ｍＭ ＥＴＤＡ（pＨ８．０）溶
液２１０mlを加え、攪拌溶解を行った後、遠心分離（８
０００rpm、６０分）を行った。上澄液を４．２Ｌの５
０ｍＭ トリス緩衝液、０．２Ｍ アルギニン ｐＨ８．
０、 １ｍＭ 還元型グルタチオン、０．１ｍＭ 酸化型
グルタチオンを含む溶液に希釈して低温室に一晩放置し
た。本溶液を１Ｍ尿素溶液で４倍に希釈し、酢酸でpＨ
６.０に調整し、５０mＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（pＨ
６.０）で平衡化した ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５
０Ｃカラム（５ｃｍＩＤ×２０ｃｍＬ、東ソー）に７５
０ｍＬ／時間の流速で通液、吸着後、５０ｍＭ ＭＥＳ
−ＮａＯＨ緩衝液０．２Ｍ ＮａＣｌｐＨ６．０で洗浄
した後に５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ０．５Ｍ
ＮａＣｌ ｐＨ６．０で溶出した。この溶出液を蒸留水
で３倍に希釈した後、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝
液 ｐＨ６．０で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（２１．５ｍ
ｍＩＤ×１５０ｍｍＬ、東ソー）に５ｍＬ／分の流速で
通液、吸着した後０−８０％Ｂ（Ｂ＝１ＭＮａＣｌ ５
０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．０）の段階勾
配で溶出を行い、ＫｉＳＳ−１−２４アミノ酸付加体画
分をプールした。本溶出画分を０．１％トリフルオロ酢
酸で平衡化したＣ４Ｐ−５０（２１．５ｍｍＩＤ×３０
０ｍｍＬ、昭和電工）に通液、吸着した後５ｍＬ／分の
流速で２０−７０％Ｂ（Ｂ＝０．１％トリフルオロ酢酸
＋８０％アセトニトリル）の段階勾配で溶出を行い、Ｋ
ｉＳＳ−１−２４アミノ酸付加体画分を得、凍結乾燥を
行った。凍乾粉末を０.１Ｍ 酢酸 ６Ｍ 尿素溶液に溶解
した後、ＤＭＡＰ−ＣＮ（1-cyano-4-dimethylaminopyr
idinium tetrafluoroborate）約１．５mgを加えて、室
温で１５分間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭ
リン酸１カリウムで平衡化した SephadexＧ−２５カラ
ム（２．５ｃｍＩＤ×５０ｃｍＬ、ファルマシア）に通
液し、平衡化に用いた５０ｍＭリン酸１カリウムを１０
ml／分 の流速で展開し、Ｓ−シアノ化されたＫｉＳＳ
−１ペプチド−２４アミノ酸付加体タンパク質画分を得
た。この溶出液をセントリプラス（分画分子量３ｋDa：
ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、ＫｉＳＳ−１−２４
アミノ酸付加体の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度
６Ｍとなるように尿素を添加した後、さらに、３Ｍアン
モニア濃度となるように２５％アンモニア水を加え、室
温で１５分間反応した。反応終了後、酢酸で pＨ６．０
に調整し、ＫｉＳＳ−１ペプチドを得た。この反応液を
５０mＭリン酸１カリウムで平衡化した Sephadex Ｇ−
２５カラム（２．５ｃｍＩＤ×５０ｃｍＬ）に通液し、
平衡化に用いた５０mＭリン酸１カリウムを１０ml／分
の流速で展開し、ＫｉＳＳ−１ペプチド画分を得た。こ
の画分を、０.１％トリフルオロ酢酸で平衡化したＣ４
Ｐ−５０（２１.５mmＩＤ×３００mmＬ、昭和電工）に
通液し、吸着、洗浄した後、５ｍＬ／分の流速で２０−
６０％Ｂ（Ｂ：８０％アセトニトリル／ ０.１％トリフ
ルオロ酢酸）の段階勾配で溶出を行い、ＫｉＳＳ−１ペ
プチド画分をプールした後、凍結乾燥を行い、ＫｉＳＳ
−１ペプチド凍結乾燥粉末約０．３５mgを得た。
００ｍＭトリス緩衝液１ｍＭ ＥＴＤＡ（pＨ８．０）溶
液２１０mlを加え、攪拌溶解を行った後、遠心分離（８
０００rpm、６０分）を行った。上澄液を４．２Ｌの５
０ｍＭ トリス緩衝液、０．２Ｍ アルギニン ｐＨ８．
０、 １ｍＭ 還元型グルタチオン、０．１ｍＭ 酸化型
グルタチオンを含む溶液に希釈して低温室に一晩放置し
た。本溶液を１Ｍ尿素溶液で４倍に希釈し、酢酸でpＨ
６.０に調整し、５０mＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（pＨ
６.０）で平衡化した ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５
０Ｃカラム（５ｃｍＩＤ×２０ｃｍＬ、東ソー）に７５
０ｍＬ／時間の流速で通液、吸着後、５０ｍＭ ＭＥＳ
−ＮａＯＨ緩衝液０．２Ｍ ＮａＣｌｐＨ６．０で洗浄
した後に５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ０．５Ｍ
ＮａＣｌ ｐＨ６．０で溶出した。この溶出液を蒸留水
で３倍に希釈した後、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝
液 ｐＨ６．０で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（２１．５ｍ
ｍＩＤ×１５０ｍｍＬ、東ソー）に５ｍＬ／分の流速で
通液、吸着した後０−８０％Ｂ（Ｂ＝１ＭＮａＣｌ ５
０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．０）の段階勾
配で溶出を行い、ＫｉＳＳ−１−２４アミノ酸付加体画
分をプールした。本溶出画分を０．１％トリフルオロ酢
酸で平衡化したＣ４Ｐ−５０（２１．５ｍｍＩＤ×３０
０ｍｍＬ、昭和電工）に通液、吸着した後５ｍＬ／分の
流速で２０−７０％Ｂ（Ｂ＝０．１％トリフルオロ酢酸
＋８０％アセトニトリル）の段階勾配で溶出を行い、Ｋ
ｉＳＳ−１−２４アミノ酸付加体画分を得、凍結乾燥を
行った。凍乾粉末を０.１Ｍ 酢酸 ６Ｍ 尿素溶液に溶解
した後、ＤＭＡＰ−ＣＮ（1-cyano-4-dimethylaminopyr
idinium tetrafluoroborate）約１．５mgを加えて、室
温で１５分間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭ
リン酸１カリウムで平衡化した SephadexＧ−２５カラ
ム（２．５ｃｍＩＤ×５０ｃｍＬ、ファルマシア）に通
液し、平衡化に用いた５０ｍＭリン酸１カリウムを１０
ml／分 の流速で展開し、Ｓ−シアノ化されたＫｉＳＳ
−１ペプチド−２４アミノ酸付加体タンパク質画分を得
た。この溶出液をセントリプラス（分画分子量３ｋDa：
ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、ＫｉＳＳ−１−２４
アミノ酸付加体の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度
６Ｍとなるように尿素を添加した後、さらに、３Ｍアン
モニア濃度となるように２５％アンモニア水を加え、室
温で１５分間反応した。反応終了後、酢酸で pＨ６．０
に調整し、ＫｉＳＳ−１ペプチドを得た。この反応液を
５０mＭリン酸１カリウムで平衡化した Sephadex Ｇ−
２５カラム（２．５ｃｍＩＤ×５０ｃｍＬ）に通液し、
平衡化に用いた５０mＭリン酸１カリウムを１０ml／分
の流速で展開し、ＫｉＳＳ−１ペプチド画分を得た。こ
の画分を、０.１％トリフルオロ酢酸で平衡化したＣ４
Ｐ−５０（２１.５mmＩＤ×３００mmＬ、昭和電工）に
通液し、吸着、洗浄した後、５ｍＬ／分の流速で２０−
６０％Ｂ（Ｂ：８０％アセトニトリル／ ０.１％トリフ
ルオロ酢酸）の段階勾配で溶出を行い、ＫｉＳＳ−１ペ
プチド画分をプールした後、凍結乾燥を行い、ＫｉＳＳ
−１ペプチド凍結乾燥粉末約０．３５mgを得た。
【００４４】実施例３ ＫｉＳＳ−１ペプチドの特徴の
決定 ａ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
ＫｉＳＳ−１ペプチドのＤＮＡ塩基配列から予想される
アミノ酸組成と一致した〔表１〕。
決定 ａ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
ＫｉＳＳ−１ペプチドのＤＮＡ塩基配列から予想される
アミノ酸組成と一致した〔表１〕。
【表１】
【００４５】ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（Ｐ
Ｅアプライドバイオシステムズ モデル４９２）を用い
て決定した。その結果、ＫｉＳＳ−１ペプチドのＤＮＡ
塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した
〔表２〕。
Ｅアプライドバイオシステムズ モデル４９２）を用い
て決定した。その結果、ＫｉＳＳ−１ペプチドのＤＮＡ
塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した
〔表２〕。
【表２】
【００４６】実施例４ 生物活性測定
実施例２で取得したヒトＫｉＳＳ−１ペプチドを用い
て、ＷＯ ９９／３３９７６の実施例３に記載の方法
（細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性）で活性を測定
し、ヒト胎盤抽出液より精製した標品と同等の活性を有
することを確認した。
て、ＷＯ ９９／３３９７６の実施例３に記載の方法
（細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性）で活性を測定
し、ヒト胎盤抽出液より精製した標品と同等の活性を有
することを確認した。
【００４７】実施例５ Ｃ末端２４アミノ酸付加ＫｉＳ
Ｓ−１ペプチドをコードするＤＮＡの製造（２） 実施例１(c)で用いたＫｉＳＳ−１ペプチド発現ベクタ
ーpTFC-KiSS-1に代えて、pTC2KiSS1を用いることによっ
ても、Ｃ末端２４アミノ酸付加ＫｉＳＳ−１ペプチド発
現ベクターｐＴＣ２ＭｅｔＣ２４−１．３を構築するこ
とができた〔図３〕。
Ｓ−１ペプチドをコードするＤＮＡの製造（２） 実施例１(c)で用いたＫｉＳＳ−１ペプチド発現ベクタ
ーpTFC-KiSS-1に代えて、pTC2KiSS1を用いることによっ
ても、Ｃ末端２４アミノ酸付加ＫｉＳＳ−１ペプチド発
現ベクターｐＴＣ２ＭｅｔＣ２４−１．３を構築するこ
とができた〔図３〕。
【００４８】
【発明の効果】本発明の製造方法を用いると、例えば、
癌（例えば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸
癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳癌等）、
さらには絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発
育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘発の予
防または治療薬などとして用いることができるＫｉｓｓ
−１ペプチドまたはその塩を工業的かつ大量に製造でき
る。
癌（例えば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸
癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳癌等）、
さらには絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発
育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘発の予
防または治療薬などとして用いることができるＫｉｓｓ
−１ペプチドまたはその塩を工業的かつ大量に製造でき
る。
【００４９】
【配列表】
[SEQUENCE LISTING]
<110> Takeda Chemical Industries, Ltd.
<120> Method of Production for KiSS-1 peptide
<130> B03002
<150> JP 2002-005180
<151> 2002-01-11
<160> 21
<210> 1
<211> 54
<212> PRT
<213> Human
<223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH2) form
<400> 1
Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gln Gln
1 5 10 15
Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala Pro Gln Gly
20 25 30
Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn
35 40 45
Ser Phe Gly Leu Arg Phe
50 54
<210> 2
<211> 162
<212> DNA
<213> Human
<400> 2
ggtacttctc tgtctccgcc gccggaatct tctggttctc gtcagcagcc gggtctgtct 60
gctccgcact ctcgtcagat cccggctccg cagggtgctg ttctggttca gcgtgaaaaa 120
gacctgccga actacaactg gaactctttc ggtctgcgtt tc 162
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> Human
<400> 3
Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro Gly Asn His Gly Arg Ser Ala Gly Arg
1 5 10 15
Gly Trp Gly Ala Gly Ala Gly Gln
20 24
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> Human
<400> 4
ggtaaacgtg aagctgctcc gggtaaccac ggtcgttctg ctggtcgtgg ttggggtgct 60
ggtgctggtc ag 72
<210> 5
<211> 79
<212> PRT
<213> Human
<400> 5
Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gln Gln
1 5 10 15
Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala Pro Gln Gly
20 25 30
Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn
35 40 45
Ser Phe Gly Leu Arg Phe Cys Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro Gly Asn
50 54 55 56 60
His Gly Arg Ser Ala Gly Arg Gly Trp Gly Ala Gly Ala Gly Gln
65 70 75 79
<210> 6
<211> 237
<212> DNA
<213> Human
<400> 6
ggtacttctc tgtctccgcc gccggaatct tctggttctc gtcagcagcc gggtctgtct 60
gctccgcact ctcgtcagat cccggctccg cagggtgctg ttctggttca gcgtgaaaaa 120
gacctgccga actacaactg gaactctttc ggtctgcgtt tctgcggtaa acgtgaagct 180
gctccgggta accacggtcg ttctgctggt cgtggttggg gtgctggtgc tggtcag 237
<210> 7
<211> 237
<212> DNA
<213> Human
<400> 7
ggtacttctc tgtctccgcc gccggaatct tctggttctc gtcagcagcc gggtctgtct 60
gctccgcact ctcgtcagat cccggctccg cagggtgctg ttctggttca gcgtgaaaaa 120
gacctgccga actacaactg gaactctttc ggtctgcgtt tctgtggtaa acgtgaagct 180
gctccgggta accacggtcg ttctgctggt cgtggttggg gtgctggtgc tggtcag 237
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
ctttcggtct gcgtttctgc ggtaaacgtg aagctgctcc gg 42
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
gttacccgga gcagcttcac gtttaccgca gaaacgcaga ccgaaag 47
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
gtaaccacgg tcgttctgct ggtcgtggtt ggggtgctgg tgctggtcag tgag 54
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
gatcctcact gaccagcacc agcaccccaa ccacgaccag cagaacgacc gtg 53
<210> 12
<211> 96
<212> cDNA
<213>
<400> 12
ctttcggtct gcgtttctgc ggtaaacgtg aagctgctcc gggtaaccac ggtcgttctg 60
ctggtcgtgg ttggggtgct ggtgctggtc agtgag 96
<210> 13
<211> 149
<212> cDNA
<400> 13
tatgggtact tctctgtctc cgccgccgga atcttctggt tctcgtcagc agccgggtct 60
gtctgctccg cactctcgtc agatcccggc tccgcagggt gctgttctgg ttcagcgtga 120
aaaagacctg ccgaactaca actggaact 149
<210> 14
<211> 245
<212> cDNA
<400> 14
tatgggtact tctctgtctc cgccgccgga atcttctggt tctcgtcagc agccgggtct 60
gtctgctccg cactctcgtc agatcccggc tccgcagggt gctgttctgg ttcagcgtga 120
aaaagacctg ccgaactaca actggaactc tttcggtctg cgtttctgcg gtaaacgtga 180
agctgctccg ggtaaccacg gtcgttctgc tggtcgtggt tggggtgctg gtgctggtca 240
gtgag 245
<210> 15
<211> 145
<212> PRT
<213> Human
<400> 15
Met Asn Ser Leu Val Ser Trp Gln Leu Leu Leu Phe Leu Cys Ala Thr
1 5 10 15
His Phe Gly Glu Pro Leu Glu Lys Val Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg
20 25 30
Pro Thr Gly Gln Gln Leu Glu Ser Leu Gly Leu Leu Ala Pro Gly Glu
35 40 45
Gln Ser Leu Pro Cys Thr Glu Arg Lys Pro Ala Ala Thr Ala Arg Leu
50 55 60
Ser Arg Arg Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser
65 70 75 80
Arg Gln Gln Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala
85 90 95
Pro Gln Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr
100 105 110
Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro
115 120 125
Gly Asn His Gly Arg Ser Ala Gly Arg Gly Trp Gly Ala Gly Ala Gly
130 135 140
Gln
145
<210> 16
<211> 152
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 16
Met Tyr Leu Arg Phe Gly Val Asp Val Cys Ser Leu Ser Pro Trp Lys
5 10 15
Glu Thr Val Asp Leu Pro Leu Pro Pro Arg Met Ile Ser Met Ala Ser
20 25 30
Trp Gln Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Ala Thr Tyr Gly Glu Pro Leu
35 40 45
Ala Lys Val Ala Pro Gly Ser Thr Gly Gln Gln Ser Gly Pro Gln Glu
50 55 60
Leu Val Asn Ala Trp Glu Lys Glu Ser Arg Tyr Ala Glu Ser Lys Pro
65 70 75 80
Gly Ser Ala Gly Leu Arg Ala Arg Arg Ser Ser Pro Cys Pro Pro Val
85 90 95
Glu Gly Pro Ala Gly Arg Gln Arg Pro Leu Cys Ala Ser Arg Ser Arg
100 105 110
Leu Ile Pro Ala Pro Arg Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp
115 120 125
Leu Ser Thr Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Tyr Gly Arg Arg
130 135 140
Gln Ala Ala Arg Ala Ala Arg Gly
145 150
<210> 17
<211> 156
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 17
Met Tyr Leu Arg Phe Gly Val Asp Val Cys Ser Leu Ser Pro Trp Lys
5 10 15
Glu Thr Val Asp Leu Pro Leu Pro Pro Arg Met Ile Ser Met Ala Ser
20 25 30
Trp Gln Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Ala Thr Tyr Gly Glu Pro Leu
35 40 45
Ala Lys Val Ala Pro Leu Val Lys Pro Gly Ser Thr Gly Gln Gln Ser
50 55 60
Gly Pro Gln Glu Leu Val Asn Ala Trp Glu Lys Glu Ser Arg Tyr Ala
65 70 75 80
Glu Ser Lys Pro Gly Ser Ala Gly Leu Arg Ala Arg Arg Ser Ser Pro
85 90 95
Cys Pro Pro Val Glu Gly Pro Ala Gly Arg Gln Arg Pro Leu Cys Ala
100 105 110
Ser Arg Ser Arg Leu Ile Pro Ala Pro Arg Gly Ala Val Leu Val Gln
115 120 125
Arg Glu Lys Asp Leu Ser Thr Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg
130 135 140
Tyr Gly Arg Arg Gln Ala Ala Arg Ala Ala Arg Gly
145 150 155
<210> 18
<211> 130
<212> PRT
<213> Rat
<400> 18
Met Thr Ser Leu Ala Ser Trp Gln Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Ala
5 10 15
Ser Phe Gly Glu Pro Leu Ala Lys Met Ala Pro Val Val Asn Pro Glu
20 25 30
Pro Thr Gly Gln Gln Ser Gly Pro Gln Glu Leu Val Asn Ala Trp Gln
35 40 45
Lys Gly Pro Arg Tyr Ala Glu Ser Lys Pro Gly Ala Ala Gly Leu Arg
50 55 60
Ala Arg Arg Thr Ser Pro Cys Pro Pro Val Glu Asn Pro Thr Gly His
65 70 75 80
Gln Arg Pro Pro Cys Ala Thr Arg Ser Arg Leu Ile Pro Ala Pro Arg
85 90 95
Gly Ser Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Met Ser Ala Tyr Asn Trp
100 105 110
Asn Ser Phe Gly Leu Arg Tyr Gly Arg Arg Gln Val Ala Arg Ala Ala
115 120 125
Arg Gly
130
<210> 19
<211> 449
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 19
atgtatctga gatttggcgt tgatgtctgc agcctgagtc cctggaagga gactgtagac 60
ctgccccttc ctcccagaat tctcaatggc ttcttggcag ctgctgcttc tcctctgtgt 120
cgccacctat ggggagccgc tggcaaaagt gaagcctgga cacaggccag cagtccggac 180
cccaggaact cgttaatgcc tgggaaaagg aatcgcggta tgcagagagc aagcctgggt 240
gcagggctgc gcgctcgtag gtcgtcgcca tgcccgccgg ttgagggccc cgcggggcgc 300
cagcggcccc tgtgtgcctc gcagtcgcct gatccctgcg ccccgcggag cggtgctggt 360
gcagcgggag aaggacctgt ccacctacaa ctggaactcc cggcctgcgc tacggcagga 420
ggcaggcggc gcgggcagca cggggctga 449
<210> 20
<211> 458
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 20
atgtatctga gatttggcgt tgatgtctgc agcctgagtc cctggaagga gactgtagac 60
ctgccccttc ctcccagaat tctcaatggc ttcttggcag ctgctgcttc tcctctgtgt 120
cgccacctat ggggagccgc tggcaaaagt ggcacctttg gaagcctgga tccacaggcc 180
agcagtccgg accccaggaa ctcgttaatg cctgggaaaa ggaatcgcgg tatgcagaga 240
aagcctgggt ctgcagggct gcgcgctcgt aggtcgtcgc catgcccgcc ggttgagggc 300
cccgcggggc gccagcggcc tgtgtgcctc ccgcagtcgc ctgatccctg cgccccgcgg 360
agcggtgctg gtgcagcggg agaaggacct gtcgacctac ctggaactcc ttcggcctgc 420
gctacggcag gaggcaggcg gcgcgggcag cacggggc 458
<210> 21
<211> 390
<212> DNA
<213> Rat
<400> 21
atgacctcgc tggcttcttg gcagctgctg cttctcctct gtgtggcctc ttttggggag 60
ccactggcaa aaatggcacc tgtggtgaac cctgaaccca caggccaaca gtccggaccc 120
caggaactcg ttaatgcctg gcaaaagggc ccgcggtatg cagagagcaa gcctggggct 180
gcaggactgc gcgctcgccg aacatcgcca tgcccgccgg tggagaaccc cacggggcac 240
cagcggcccc cgtgtgccac ccgcagtcgc ctgatccctg cgccccgcgg atcggtgctg 300
gtgcagcgcg agaaggacat gtcagcctac aactggaact cctttggcct gcgctacggc 360
aggaggcagg tggcgcgggc ggcacggggc 390
【図１】実施例１で用いられたＤＮＡフラグメントを示
す。
す。
【図２】実施例１で得られたプラスミドｐＴＣ２Ｍｅｔ
Ｃ２４の構築図を示す。
Ｃ２４の構築図を示す。
【図３】実施例５で得られたプラスミドｐＴＣ２Ｍｅｔ
Ｃ２４の構築図を示す。
Ｃ２４の構築図を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｐ 35/00
// Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ａ６１Ｐ 15/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
35/00 5/00 Ａ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA80 CA07 DA06
EA04 HA01
4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 CD02
CD09 CD12 CD13 CE10 CE11
DA01
4B065 AA26X AA91Y AB01 BA02
BB03 BB12 BB15 BB29 BB37
BB39 BC03 CA24 CA44
4C084 AA06 BA22 CA53 CA56 CA59
ZA812 ZB262
4H045 AA10 AA20 BA20 BA41 CA40
EA20 FA16 FA74 GA23 GA25
Claims (17)
- 【請求項１】Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋
白質、ペプチドまたはその塩を該システイン残基のアミ
ノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とす
るＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩の製造法。 - 【請求項２】Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋
白質またはペプチドをコードするＤＮＡを有するベクタ
ーを保持する形質転換体を培養して融合蛋白質、ペプチ
ドまたはその塩を発現させ、発現された融合蛋白質、ペ
プチドまたはその塩を該システイン残基のアミノ基側の
ペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とするＫｉＳ
Ｓ−１ペプチドまたはその塩の製造法。 - 【請求項３】製造されるＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端
がアミドである請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項４】切断反応がＳ−シアノ化反応、次いでアン
モノリシスまたは加水分解反応に付す反応である請求項
１または２記載の製造法。 - 【請求項５】ＫｉＳＳ−１ペプチドが配列番号：１で表
されるアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１
または２記載の製造法。 - 【請求項６】ＫｉＳＳ−１ペプチドが、配列番号：１
で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４０〜５４番目
からなるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：
１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４５〜５４番
目からなるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４６〜５
４番目からなるアミノ酸配列を有するペプチドまたは
配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４
７〜５４番目からなるアミノ酸配列を有するペプチドで
ある請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項７】Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ドが、Ｎ末端にシステインを有し、約１０〜約５０個の
アミノ酸残基からなるペプチドである請求項１または２
記載の製造法。 - 【請求項８】低分子ペプチドが、ＫｉＳＳ−１ペプチド
を含む前駆体蛋白質のＣ末端側の部分ペプチドであっ
て、該ＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端アミノ酸に隣接す
るアミノ酸残基から始まるアミノ酸配列を有するペプチ
ドである請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項９】Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプチ
ドが、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有し、
そのＮ末端にシステイン残基が付加したペプチドである
請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項１０】Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプ
チドが配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有し、
そのＮ末端にシステイン残基が付加したペプチドであ
り、ＫｉＳＳ−１ペプチドが配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列を有するペプチドであり、製造されるＫｉＳ
Ｓ−１ペプチドのＣ末端がアミドである配列番号：１で
表されるアミノ酸配列を有するペプチドである請求項１
または２記載の製造法。 - 【請求項１１】Ｎ末端にシステインを有する低分子ペプ
チドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合
蛋白質、ペプチドまたはその塩。 - 【請求項１２】配列番号：５で表わされるアミノ酸配列
を含有する請求項１１記載の融合蛋白質、ペプチドまた
はその塩。 - 【請求項１３】請求項１１記載の融合蛋白質またはペプ
チドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。 - 【請求項１４】配列番号：６で表される塩基配列また
は配列番号：７で表される塩基配列を有する請求項１
３記載のＤＮＡ。 - 【請求項１５】請求項１３記載のＤＮＡを有するベクタ
ー。 - 【請求項１６】請求項１５記載のベクターを含有する形
質転換体。 - 【請求項１７】ＦＥＲＭ ＢＰ−７８２３で表示される
エシュリヒア・コリＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣ２Ｍ
ｅｔＣ２４−１．３。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003002932A JP2003265191A (ja) | 2002-01-11 | 2003-01-09 | ＫｉＳＳ−１ペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002-5180 | 2002-01-11 | ||
| JP2002005180 | 2002-01-11 | ||
| JP2003002932A JP2003265191A (ja) | 2002-01-11 | 2003-01-09 | ＫｉＳＳ−１ペプチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003265191A true JP2003265191A (ja) | 2003-09-24 |
Family
ID=29217894
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003002932A Withdrawn JP2003265191A (ja) | 2002-01-11 | 2003-01-09 | ＫｉＳＳ−１ペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003265191A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7872449B2 (en) | 2006-04-13 | 2011-01-18 | Linde Material Handling Gmbh | Industrial truck with a battery and method for operating an industrial truck with a battery |
-
2003
- 2003-01-09 JP JP2003002932A patent/JP2003265191A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7872449B2 (en) | 2006-04-13 | 2011-01-18 | Linde Material Handling Gmbh | Industrial truck with a battery and method for operating an industrial truck with a battery |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20060404 |