JP2001231581A - ＫｉＳＳ−１ペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規生理活性ペプチド（ＫｉＳＳ−１ペプチ
ド）またはその塩を工業的かつ大量に製造するのに有利
な製造法を提供する。 【解決手段】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
ペプチドのＮ末端にＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融
合蛋白質またはペプチドをシステイン残基のアミノ酸側
のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とするＫｉ
ＳＳ−１ペプチドまたはその塩の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、融合蛋白質または
ポリペプチドを製造し、次いで該融合蛋白質またはポリ
ペプチドをペプチド結合の切断反応に付すことにより、
ＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩を製造する方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いて、ペプチドを
製造するに際しては、ペプチドが細胞内で、分解を受け
やすいために、融合蛋白質の形で発現させることがしば
しば行なわれている。融合蛋白質からの目的ペプチドの
切り出しには、ブロムシアンを用い化学的に切断する方
法（イタクラら、Science, 198, 1056(1977)）、ファフ
ターＸaを用い酵素的に切断する方法（ナガイら、Metho
ds in Enzymology, 153,46(1987)）が知られている。さ
らに、蛋白質中のペプチド結合を切断する方法として、
２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸によるアシルシス
テイン結合の切断が知られている（「生化学実験講座」
１，タンパク質の化学II，日本生化学会編，東京化学同
人発行，第２４７〜２５０頁１９７６年）。しかしなが
ら、蛋白質からの目的ペプチドの切り出しについては、
開示されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来知られている技術
において、融合蛋白質からの目的ペプチドの切り出しに
際し、ブロムシアンを用いる場合には、メチオニンを含
有するペプチドの製造には適用することはできないし、
切り出し時の収率等に問題が多い。このように、融合蛋
白質またはポリペプチドから目的とするペプチドを効率
良く切り出す方法が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規生理
活性ペプチドであるＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩
を効率良く製造する方法について鋭意検討を加えたとこ
ろ、Ｎ末端にシステインを有する蛋白質またはポリペプ
チドのＮ末端にＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋
白質またはポリペプチドを製造し、次いでこれをペプチ
ド結合を切断する反応に付すことにより、ＫｉＳＳ−１
ペプチドまたはその塩を効率良く製造できることを見い
出した。

【０００５】本発明は、（１）Ｎ末端にシステインを有
する蛋白質またはペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペ
プチドを連結した融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を
該システイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反
応に付すことを特徴とするＫｉＳＳ−１ペプチドまたは
その塩の製造法、（２）Ｎ末端にシステインを有する蛋
白質またはペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチド
を連結した融合蛋白質またはペプチドをコードするＤＮ
Ａを有するベクターを保持する形質転換体を培養して融
合蛋白質、ペプチドまたはその塩を発現させ、発現され
た融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該システイン残
基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを
特徴とするＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩の製造
法、（３）ＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端がアミドであ
る第（１）項または第（２）項記載の製造法、（４）切
断反応がＳ−シアノ化反応、次いでアンモノリシスまた
は加水分解反応に付す反応である第（１）項または第
（２）項記載の製造法、（５）ＫｉＳＳ−１ペプチドが
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチ
ドである第（１）項または第（２）項記載の製造法、
（６）ＫｉＳＳ−１ペプチドが、配列番号：１で表さ
れるアミノ酸配列のＮ末端から第４０〜５４番目からな
るアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１で表
されるアミノ酸配列のＮ末端から第４５〜５４番目から
なるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１で
表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４６〜５４番目か
らなるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番
号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４７〜５
４番目からなるアミノ酸配列を有するペプチドである第
（１）項または第（２）項記載の製造法、（７）Ｎ末端
にシステインを有する蛋白質またはペプチドが、Ｎ末端
にシステインを有するインターフェロン類、インターロ
イキン類、繊維芽細胞成長因子、（プロ）ウロキナーゼ
類、リンホトキシン、Tumor Necrosis Factor（ＴＮ
Ｆ）、β−ガラクロシダーゼ、貯蔵タンパク類、ストレ
プトアビシン、プロテインＡ、プロテインＧ、Tissue P
lasminogen Activator（ＴＰＡ）またはそのムテインも
しくは断片である第（１）項または第（２）項記載の製
造法、（８）Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
ペプチドが、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含
有し、そのＮ末端にシステイン残基が付加した蛋白質ま
たはペプチドである第（１）項または第（２）項記載の
製造法、（９）Ｎ末端にシステインを有する蛋白質また
はペプチドが配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含
有し、そのＮ末端にシステイン残基が付加した蛋白であ
り、ＫｉＳＳ−１ペプチドが配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列を有するペプチドであり、製造されるＫｉＳ
Ｓ−１ペプチドがＣ末端がアミドである配列番号：１で
表されるアミノ酸配列を有するペプチドである第（１）
項または第（２）項記載の製造法、（１０）Ｎ末端にシ
ステインを有する蛋白質またはペプチドのＮ末端に、Ｋ
ｉＳＳ−１ペプチドを連結した融合蛋白質、ペプチドま
たはその塩、（１１）配列番号：３で表されるアミノ酸
配列を含有し、そのＮ末端にシステイン残基が付加した
蛋白質のＮ末端に、配列番号：１で表されるアミノ酸配
列を含有するＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した第（１
０）項記載の融合蛋白質、ペプチドまたはその塩、（１
２）第（１０）項記載の融合蛋白質またはペプチドをコ
ードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（１３）配列番
号：４で表される塩基配列または配列番号：５で表さ
れる塩基配列を有する第（１２）項記載のＤＮＡ、（１
４）第（１２）項記載のＤＮＡを有するベクター、（１
５）第（１４）項記載のベクターを含有する形質転換
体、および（１６）ＦＥＲＭ ＢＰ−６９０７で表示さ
れるエシュリヒア・コリＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＦ
Ｃ−ＫｉＳＳ−１を提供する。さらに、本発明は、（１
７）次の〜の工程； Ｎ末端にシステインを有する蛋白質またはペプチドの
Ｎ末端システインに、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した
融合蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡを作製す
る、 該ＤＮＡを有するベクターを作製する、 該ベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白
質、ペプチドまたはその塩を発現させる、 発現された融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該シ
ステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に
付す、 からなる第（２）項記載の製造法を提供する。

【０００６】本発明の方法に用いられるＫｉＳＳ−１ペ
プチドとしては、例えばＷＯ００／２４８９０（国際特
許出願 ＰＣＴ／ＪＰ９９／０５９０５号）に記載のヒ
トＫｉＳＳ−１ペプチドが用いられ、具体的には、本願
の配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末
端から第４７〜５４番目のアミノ酸配列を含有し、８乃
至５４個のアミノ酸残基からなるペプチドなどがあげら
れる。「本願の配列番号：１で表されるアミノ酸配列に
おいて、Ｎ末端から第４７〜５４番目のアミノ酸配列を
含有し、８乃至５４個のアミノ酸残基からなるペプチ
ド」としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列に
おいて、Ｎ末端から第４７〜５４番目のアミノ酸配列を
含有し、かつ８乃至５４個のアミノ酸残基からなるペプ
チドであればいかなるものであってもよいが、ペプチド
活性（例えば、ペプチドと受容体の結合活性、ペプチド
によって引き起こされる受容体発現細胞の細胞刺激活性
など）などが、実質的に同じであることを意味する。具
体的には、本願の配列番号：１で表されるアミノ酸配
列で表されるペプチド、本願の配列番号：１で表され
るアミノ酸配列において、Ｎ末端から第４７〜５４番目
のアミノ酸配列をＣ末端に有し、８乃至１５個のアミノ
酸残基からなるペプチドなどが用いられる。より具体的
には、ＫｉＳＳ−１ペプチドとしては、本願の配列番
号：１で表されるアミノ酸配列で表されるペプチド、
本願の配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端か
ら第４０〜５４番目からなるアミノ酸配列で表されるペ
プチド、本願の配列番号：１で表されるアミノ酸配列
のＮ末端から第４５〜５４番目からなるアミノ酸配列で
表されるペプチド、本願の配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列のＮ末端から第４６〜５４番目からなるアミ
ノ酸配列で表されるペプチド、本願の配列番号：１で
表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４７〜５４番目か
らなるアミノ酸配列で表されるペプチドなどがあげられ
る。上記ＫｉＳＳ−１ペプチドは、ＷＯ００／２４８９
０（国際特許出願 ＰＣＴ／ＪＰ９９／０５９０５号）
に記載のレセプター蛋白質ＯＴ７Ｔ１７５に対し、リガ
ンド活性を有する。本明細書におけるペプチドはペプチ
ド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右
端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１
で表されるペプチドのＣ末端は、アミド（-CONH₂)、カ
ルボキシル基（-COOH)、カルボキシレート(-COO^-)、ア
ルキルアミド（-CONHR）またはエステル(-COOR)であっ
てもよい。エステルまたはアルキルアミドのＲとして
は、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピ
ルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、シクロ
ペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル
基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、
ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル
−Ｃ_1-2アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどの
α−ナフチル−Ｃ_1-2アルキルなどのＣ_7-14アラルキル
基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイル
オキシメチル基などがあげられる。本発明のＫｉＳＳ−
１ペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基
（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）と
の塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸
付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明の
方法に用いられるＮ末端にシステインを有する蛋白質ま
たはペプチドとしては、特定されるものではない。その
Ｎ末端にシステインを有しない蛋白質またはペプチドの
場合は、自体公知の方法によりＮ末端にシステインを有
するようにすればよい。

【０００７】該Ｎ末端にシステインを有する蛋白質また
はペプチドとしては、分子量が１００〜１０００００の
ものが好ましく、さらに、分子量が３００〜５００００
のものが好ましい。また、Ｎ末端にシステインを有する
蛋白質またはペプチドとしては、１〜１０００個のアミ
ノ酸を有するものが好ましく、さらに３〜５００個のア
ミノ酸を有するものが好ましい。該蛋白質またはペプチ
ドとしては、例えばインターフエロン類、インターロイ
キン類、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦな
ど）等各種成長因子類、(プロ)ウロキナーゼ類、リンホ
トキシン、Tumor Necrosis Factor(ＴＮＦ)、β−ガラ
トシターゼなどの酵素タンパク類、貯蔵タンパク類、ス
トレプトアビシン、プロテインＡ、プロテインＧ、Tiss
ue Plasminogen Activator(ＴＰＡ)、これらのムテイン
又はこれらの一部（断片）などのＮ末端にシステインを
有するものがあげられる。なかでも、線維芽細胞成長因
子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦなど）またはそのムテインまた
はこれらの一部（断片）（例えば、ｂＦＧＦ ＣＳ２３
ムテインなど）などが好ましく用いられる。ｂＦＧＦ
ＣＳ２３ムテインとしては、例えば、Pro-Ala-Leu-Pro-
Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His-Ph
e-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-
Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gl
y-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp-Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-
Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Arg-Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys-Gl
y-Val-Ser-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-
Gly-Arg-Leu-Leu-Ala-Ser-Lys-Ser-Val-Thr-Asp-Glu-Cy
s-Phe-Phe-Phe-Glu-Arg-Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-
Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-Thr-Ser-Trp-Tyr-Val-Al
a-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ser-Lys-
Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Lys-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Me
t-Ser-Ala-Lys-Ser(配列番号：３)で表されるアミノ酸
配列を含有し、そのＮ末端にシステイン残基が付加した
蛋白質などがあげられる。

【０００８】本発明方法で用いられる融合蛋白質（融合
ペプチドを含む）をコードするＤＮＡは、(１)全塩基配
列を化学的に合成してもよいし、(２)蛋白質をコードす
る塩基配列のＮ末端側にシステインをコードする塩基配
列を配置しさらにそのＮ末端側にＫｉＳＳ−１ペプチド
をコードする塩基配列を配置することにより該ＤＮＡを
構築してもよい。また、（３）該ペプチドのフラグメン
トを得るのが目的の場合には、所望のフラグメントの直
後のアミノ酸残基をsite-directed mutagenesis 等の手
法でシステインに置換した該ＤＮＡを構築すればよい。
上記の(１)の場合の製造法としては、例えば、自体公知
のホスホアミダイド法、リン酸トリエステル法、ジエス
テル法、ハイドロジェンホスホネート法などを用いて、
短いものなら一度に、長いものでは分割して合成した後
にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結して作成することが
可能である。

【０００９】上記の(２)の場合の製造法としては、例え
ば、Ｃ末端側の蛋白質をコードするＤＡＮは、染色体ま
たはｃＤＮＡから適当な制限酵素で切断し、ベクターに
連結して得るか、もしくはcＤＮＡを取得する。しかる
後にＮ末端がシステインになるように制限酵素で切断す
るか、もしくは、合成ＤＮＡを全蛋白もしくはその一部
の遺伝子の５'−末端に結合しＮ末端がシステインにな
るように改変する。その５'−末端に目的の蛋白質をコ
ードするＤＡＮ(化学合成したものでも、生体よりクロ
ーニングしてきたものでもよい)をつなげる。このよう
にして得られる融合蛋白質をコードするＤＮＡの具体例
としては、例えば式 GGTACTTCTCTGTCTCCGCCGCCGGAATCTTCTGGTTCTCGTCAGCAGCCGGGTCTGTCTGCTCCGCACTCT CGTCAGATCCCGGCTCCGCAGGGTGCTGTTCTGGTTCAGCGTGAAAAAGACCTGCCGAACTACAACTGGAAC TCTTTCGGTCTGCGTTTC-TGC または TGT-Ｒ (I) 〔式中、Ｒは CCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGAC CCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGA GTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAG AGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGAGCGCTAATCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGAT GGAAGATTACTAGCTTCTAAGTCTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAA TCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAA CGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTT CTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGC (ｂＦＧＦＣＳ２３ムテイン
の断片)からなる塩基配列を示す。〕で表わされるＤＮ
Ａなどがあげられる。

【００１０】上記式（Ｉ）はヒト（human）ＫｉＳＳ−
１ペプチドを含有するペプチドをコードするＤＮＡ塩基
配列（配列番号：２）にシステインをコードする塩基配
列を介してＲで示される塩基配列が結合していることを
示す。ＫｉＳＳ−１ペプチドをコードするＤＮＡは、上
記式（Ｉ）で表されるＤＮＡや配列番号：１５で表され
るＫｉＳＳ−１ペプチド成熟体をコードするＤＮＡまた
はその改変ＤＮＡ（例えば、J. Natl. Cancer Inst., 8
8, 1731, 1996；ＷＯ９８／３９４４８）を用いて、自
体公知の方法に従って製造することもできる。５'末端
にＡＴＧを有し、その下流に該融合蛋白質をコードする
領域、ついで翻訳終止コドンを有するＤＮＡ(プラスミ
ド)は、化学合成で、あるいは遺伝子工学的に製造され
た公知の該蛋白質のcＤＮＡ、もしくは、染色体由来の
該蛋白質のＤＮＡを加工することにより製造することが
できる。本発明のＮ末端にシステインを有する蛋白質ま
たはペプチドのＮ末端にＫｉＳＳ−１ペプチドを連結し
た融合蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡを、従
来のＤＮＡ技術、例えば特定部位指向性変異誘発技術を
用いて目的のムテインをコードするＤＮＡに変換するこ
とができる。特定部位指向性変異誘発技術は周知であ
り、アール・エフ・レイサー(Lather,R. F.)及びジェイ
・ピー・レコック(Lecoq, J. P.)、ジェネティック・エ
ンジニアリング(Genetic Engineering)、アカデミック
プレス社(１９８３年)第３１−５０頁に示されている。
オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミ
ス(Smith, M.) 及びエス・ギラム(Gillam, S.)、ジェネ
ティック・エンジニアリング：原理と方法、プレナムプ
ムス社(１９８１年)３巻 １−３２頁に示されている。

【００１１】該融合蛋白質をコードする領域を有するＤ
ＮＡを有するプラスミドを製造するにあたって、ベクタ
ーとして用いられるプラスミドとしては、例えば大腸菌
（Escherichia coli）由来のpＢＲ３２２〔ジーン(Gen
e)，２，９５(１９７７)〕，pＢＲ３１３〔ジーン，
２，７５(１９７７)〕，pＢＲ３２４，pＢＲ３２５〔ジ
ーン，４，１２４(１９７８)〕，pＢＲ３２７，pＢＲ３
２８〔ジーン，９，２８７(１９８０)〕，pＢＲ３２９
〔ジーン，１７，７９(１９８２)〕，pＫＹ２２８９
〔ジーン，３，１(１９７８)〕，pＫＹ ２７００〔生化
学，５２，７７０(１９８０)〕，pＡＣＹＣ１７７，pＡ
ＣＹＣ１８４〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J
ournal of Bacteriology)，１３４，１１４１(１９７
８)〕，ｐＲＫ２４８，ｐＲＫ６４６，pＤＦ〔メソッズ
・イン・エン ジーモロジー(Methods inEnzymology)，
６８，２６８(１９７９)〕，pＵＣ１８，pＵＣ１９〔ヤ
ニシューペロンら，ジーン(Gene)，３３，１０３(１９
８５)〕などがあげられる。また、バクテリオファー
ジ、例えばλファージを使用したλgt系のλgt・λＣ
〔Proc.Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.Ａ．７ １，４５７９
(１９７４)〕，λgt・λＢ〔Proc.Natl. Acad. Sci.
Ｕ.Ｓ.Ａ. ７２，３４６１(１９７５)〕，λＤam〔ジー
ン，１，２５５(１９７７)〕やシャロンベクター〔サイ
エンス，(Science)，１９６，１６１(１９７７)；ジャ
ーナル・オブ・ビーロロジー(Journal of Virology)，
２９，５５５(１９７９)〕，繊維状ファージを使用した
mp系のmp１８，mp１９〔ヤニシューペロンら，ジーン(G
ene)，３３，１０３(１９８５)〕ベクターなどもあげら
れる。

【００１２】上記ＤＮＡは、ＡＴＧの上流にプロモータ
ーを有しているのが好ましく、該プロモーターは、形質
転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌(Esche
richia coli)ではtrpプロモーター，lacプロモーター，
rec Ａプロモーター，λＰＬプロモーター，lppプロモ
ーター，Ｔ７プロモーターなど、枯草菌(Bacillus subt
ilis)ではＳＰＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモータ
ー，penＰプロモーターなど、酵母(Saccharomyces cere
visiae)ではＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモータ
ー，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターなど、動
物細胞ではＳＶ４０由来のプロモーターなどがあげられ
る。必要によりＳＤ(シヤインアンドダルガーノ)配列を
プロモーターの下流に挿入してもよい。Ｔ７プロモータ
ーの系を用いる場合には、Ｔ７プロモーターとしては、
Ｔ７ＤＮＡ上で見い出されている１７種のプロモーター
〔J. L. Oakley ら，Proc．Natl. Acad. Sci, Ｕ.Ｓ.
Ａ，７４：４２６６−４２７０(１９７７)，M. D. Ros
a,Cell １６：８１５−８２５(１９７９)，N. Panayota
tos ら，Nature，２８０：３５(１９７９)，J. J. Dunn
ら，J. Mol. Biol.，１６６：４７７−５３５(１９８
３)〕のいずれでもよいがφ１０プロモーター〔A. H. R
osenberg ら，Gene，５６：１２５−１３５(１９８
７)〕が好ましい。

【００１３】転写ターミネーターとしては、大腸菌の系
で作動するターミネーター、好ましくはＴφターミネー
ター〔F. W. Studier ら，J. Mol. Biol.，１８９：１
１３−１３０(１９８６)〕が用いられる。Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子としてはＴ７遺伝子〔F. W. Studier
ら，J. Mol. Biol.，１８９：１１３−１３０(１９８
６)〕をあげることが出来る。ベクターは上記ベクター
にＴ７プロモーター，Ｔ７ターミネーターを組み込んで
構築されるのが好ましく、このようなベクターとして
は、pＥＴ−１，pＥＴ−２，pＥＴ−３，pＥＴ−４，p
ＥＴ−５〔A. H. Rosenberg, Gene ５６：１２５−１３
５(１９８７)〕、pＴＢ９６０−２〔ＥＰ−Ａ−４９９
９９０〕などをあげることができるが、好ましくはpＴ
Ｂ９６０−２が用いられる。

【００１４】本発明の形質転換体は、上記方法で得られ
る発現用プラスミドを自体公知の方法〔例、コーエンS,
N, ら，プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.
Ａ.)，６９，２１１０(１９７２)〕で宿主を形質転換す
ることにより製造することができる。形質転換される微
生物の宿主としては、例えば、エシエリシア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）属菌，バチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属菌，酵母，動物細胞などがあげられる。上記エシエリ
シア属菌の例としては、エシエリシア・コリ(E. coli)
があげられ、具体的にはエシエリシア・コリ(Escherich
ia coli)Ｋ１２ＤＨ１〔プロシーディングス・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Nat
l.Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.Ａ.)，６０，１６０(１９６
８)〕，ＪＭ−１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ，(Nucleic Acids Research)，９，３０９(１９８
１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー(Journal ofMolecular Biology)，１２
０，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オ
ブ・モレ キュラー・バイオロジー，４１，４５９(１
９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス(Genetics)，
３９，４４０(１９５４)〕，Ｎ４８３０〔セル(Cell)，
２５，７１３(１９８１)〕，Ｋ−１２ＭＭ２９４〔プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ，７３，４１７４(１９７６)〕ＢＬ−２
１などがあげられる。

【００１５】上記バチルス属菌としては、例えばバチル
ス・サチルス(Bacillus subtilis)があげられ、具体的
にはバチルス・サチルスＭＩ１１４(ジーン，２４，２
５５(１９８３))，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー(Journal of Biochemistry)，９
５，８７(１９８４)〕などがあげられる。上記酵母とし
ては、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ(Sacchar
omyces cerevisiae)があげられ、具体的には、サッカロ
マイセス・セレビシアエＡＨ２２〔Proc. Natl. Acad.
Sci. ＵＳＡ，７５，１９２９(１９７８)〕，ＸＳＢ５
２−２３Ｃ〔Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，７７
２１７３(１９８０)〕，ＢＨ−６４１Ａ(ＡＴＣＣ ２
８３３９)，２０Ｂ−１２〔Genetics，８５，２３(１９
７６)〕，ＧＭ３Ｃ−２〔Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ，７８ ２２５８(１９８１)〕などがあげられる。

【００１６】動物細胞としては、例えばサル細胞ＣＯＳ
−７〔セル(Cell)，２３，１７５(１９８１)〕，Vero
〔(日本臨床 ２１，１２０９(１９６３)〕，チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ〔ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メデイシン(J.Exp. Med.)，１０８，９
４５(１９８５)〕，マウスＬ細胞〔ジャーナル・オブ・
ナショナル・キャンサー・インスティチュート(J. Nat.
Cancer Inst.)，４，１６５(１９４３)〕，ヒトＦＬ細
胞〔プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティ・フォ
ー・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィシン(Proc. Soc. Exp. Biol. Med.)，９４，５３２
(１９５７)〕，ハムスターＣ細胞などがあげられる。

【００１７】Ｔ７プロモーターの系を用いる場合には、
その形質転換体の宿主としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子(Ｔ７遺伝子１)〔F. W. Studierら，J. Mol. B
iol.１８９：１１３−１３０(１９８６)〕を組み込んだ
大腸菌株、例えばＭＭ２９４，ＤＨ−１，Ｃ６００，Ｊ
Ｍ１０９，ＢＬ２１，あるいはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子(Ｔ７遺伝子１)を他のプラスミドと共に組込んだ
大腸菌株などが用いられる。好ましくはＴ７遺伝子１を
組み込んだλファージが溶原化したＭＭ２９４株および
ＢＬ２１株が用いられる。この場合Ｔ７遺伝子１のプロ
モーターとしては、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド(ＩＰＴＧと略することがある。)で
発現が誘導されるlacプロモーターが用いられる。

【００１８】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を宿主として形質転換するには、例え
ばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティック
ス（Molecular and General Genetics), 168, 111(197
9)など公知の方法に従って行なうことができる。酵母菌
を宿主として形質転換するには、例えば、プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA），75, 1929(1978)などの公知の方法に従
って行なうことができる。動物細胞を宿主として形質転
換するには、例えば、ヴィーロロジー(Virology,52, 45
6(1973)などの公知の方法に従って行なうことができ
る。融合蛋白は、上述の形質転換体を培地に培養し、産
生された融合蛋白を採取することにより製造することが
できる。培地のpＨは約６〜８が望ましい。

【００１９】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experi
ments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York 1972)〕が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、例えば３β−インドリル アクリル酸やイソプロピ
ルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のよう
な薬剤を加えることができる。

【００２０】宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通
常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
例えばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostia
n, K. L. ら、プロシージングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sc
i.) USA, 77, 4505(1980)〕があげられる。培地のpＨは
約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃
〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や
撹拌を加える。

【００２１】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えば約０.２〜２０％好ましく
は約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエ
ンス(Science)，122, 501(1952)〕，ＤＭＥ培地〔ヴィ
ロロジー(Virology), 8, 396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６
４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション(The Journal of the American
Medical Association)，199, 519(1967)〕，１９９培
地〔プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of t
he Society for the Biologcal Medicine)，73, 1 (195
0)〕などがあげられる。pＨは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約３０〜４０℃、培養時間は約１５〜
６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００２２】融合蛋白質は、上記形質転換体を培養し、
培養物中に該融合蛋白質を生成，蓄積せしめ、これを採
取することにより製造することができる。培地として
は、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミ
ラー，J.，エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジ
ェネテイクス(Experiments in Molecular Genetics)，
４３１−４３３(Cold Spring Horbor Laboratort，New
York１９７２)〕，２×ＹＴ培地〔メシング，メソッド
・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)，
１０１，２０(１９８３)〕ＬＢ培地などがあげられる。

【００２３】培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時
間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。λc
Ｉtsリプレッサーと、λＰ_L−プロモーターを含有する
発現ベクターとを有する組換え体を使用する場合には、
培養は約１５〜３６℃好ましくは約３０℃〜３６℃の温
度で行い、λc Ｉtsリプレッサーの不活化は約３７℃〜
４２℃で行うのが好ましい。またrecＡプロモーターを
より効率良く働かせるため、すなわちrecＡ遺伝子発現
抑制機能を低下せしめるため、必要によりマイトマイシ
ンＣ，ナルジキシン酸などのような薬剤を添加したり、
紫外線を照射する、あるいは培養液のｐＨをアルカリ側
に変化させてもよい。Ｔ７プロモーターの系を用いてい
る場合には、(１)lacプロモーターの下流に連結されて
いるＴ７遺伝子(ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子)を発現させ
る時はＩＰＴＧなどを添加する、もしくは(２)λＰ_Lプ
ロモーターの下流に連結されているＴ７遺伝子（ＲＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子）を発現させる時は培養の温度を上
昇させることなどにより、生成するＴ７ファージＲＮＡ
ポリメラーゼ１により特異的にＴ７プロモーターを作動
させる。

【００２４】培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば
緩衝液に懸濁したのち、例えば、蛋白変性剤処理，超音
波処理やリゾチームなどの酵素処理，グラスビーズ処
理，フレンチプレス処理，凍結融解処理などを行って菌
体を破砕し、遠心分離など公知の方法によって上清を得
る。上記により得られた上清から、融合蛋白質を単離す
るには、通常知られている蛋白質の精製法に従えばよ
い。例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフィ
ー，吸着クロマトグラフィー，高速液体クロマトグラフ
ィー，アフイニティークロマトグラフィー，疎水クロマ
トグラフィー，電気泳動等を適切に組み合せて行うこと
ができる。また、該融合蛋白質は、精製することなく、
あるいは部分精製の状態で、次の反応工程に進んでもよ
い。次に、このようにして得られる融合蛋白質やペプチ
ドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断
反応に付す。該切断反応としては、例えば、Ｓ−シアノ
化反応次いで加水分解反応があげられる。ＫｉＳＳ−１
ペプチドのアミドまたはその塩を最終物として得る場合
には、該切断反応としては、例えば、Ｓ−シアノ化反応
次いでアンモノリシスを行うことがあげられる。該Ｓ−
シアノ化反応は、原料化合物に、Ｓ−シアノ化試薬を作
用させることにより行なう。

【００２５】Ｓ−シアノ化試薬としては例えば２−ニト
ロ−５−チオシアノ安息香酸(ＮＴＣＢ)，１−シアノ−
４−ジメチルアミノピリジウム塩(ＤＭＡＰ−ＣＮ)，Ｃ
Ｎ^-イオンなどがあげられる。該Ｓ−シアノ化試薬の量
は、モル数で全チオール基の約２倍から５０倍量であれ
ばよく、好ましくは約５倍〜１０倍量である。反応温度
は約０℃〜８０℃の間であれば、いずれでもよく、約０
℃〜５０℃の間がより好ましい。用いる溶媒としては、
Ｓ−シアノ化試薬と反応しないものであれば、いずれの
緩衝液でもよいが、例えば、トリス−塩酸緩衝液，トリ
ス−酢酸緩衝液，リン酸緩衝液，ホウ酸緩衝液，などが
あげられる。また、有機溶媒は、Ｓ−シアノ化試薬と反
応しないものであれば、存在していてもよい。該反応
は、pＨ１〜１２の間で行なうのが良い。特に、ＮＴＣ
Ｂを用いる場合にはpＨ７〜１０，ＤＭＡＰ−ＣＮを用
いる場合にはＳ−Ｓ交換反応を防止するため、pＨ２〜
７の間が好ましい。また、反応液中には、塩酸グアニジ
ン等の変性剤が存在していてもよい。

【００２６】上記アンモノリシスまたは加水分解反応と
しては、例えばアルカリ処理に付すことがあげられる。
該アルカリ処理としては、原料化合物を含有する水溶液
のpＨを７〜１４に、調整することにより行なわれる。
該ｐＨの調整は、例えばアンモニア、水酸化ナトリウ
ム，アミノ化合物，トリツマベース（トリス〔ヒドロキ
シメチル〕−アミノメタン），リン酸第２ナトリウム，
水酸化カリウム，水酸化バリウム等の溶液を原料化合物
を含有する水溶液に適当量加えて行うが特にアンモニア
などが好ましい。上記反応の際の溶液の濃度としては、
たとえばアンモニアまたはアミノ化合物の場合は約０.
０１〜１５Ｎ好ましくは約０.１〜３Ｎ、水酸化ナトリ
ウムの場合は約０.０１〜２Ｎ好ましくは約０.０５〜１
Ｎ、トリツマベースの場合は約１mＭ〜１Ｍ好ましくは
約２０mＭ〜２００mＭ、リン酸第２ナトリウムの場合は
約１mＭ〜１Ｍ好ましくは約１０mＭ〜１００mＭ、水酸
化カリウムの場合は約０.０１〜４Ｎ好ましくは約０.１
〜２Ｎがあげられる。反応温度は約−２０℃〜８０℃の
間であればいずれでもよく、約−１０℃〜５０℃の間が
より好ましい。

【００２７】反応時間は、好ましくは、Ｓ−シアノ化反
応は約１〜６０分好ましくは約１５〜３０分が、加水分
解反応は約５分〜１００時間好ましくは１０分〜１５時
間が、アンモノリシスは約５分〜２４時間好ましくは約
１０〜１８０分があげられる。該アミノ化合物として
は、例えば、式 Ｒ¹−(ＮＲ²)−Ｈ（式中、Ｒ¹および
Ｒ²は同一または異なって、(i)水素原子、(ii)Ｃ_1-20ア
ルキル基，Ｃ_3-8シクロアルキル基，Ｃ_6-14アリール(ar
yl)基またはＣ_6-14アリール−Ｃ_1-3アルキル基（これら
は置換基を有していないかあるいは１〜３個のアミノ
基，水酸基などを炭素原子上に有していてもよい）、(i
ii)置換されていてもよいアミノ基、(iv)水酸基またはＣ
_1-6アルコキシ基を示す。）で表される化合物などがあ
げられる。上記のＳ−シアノ化およびアンモノリシスま
たは加水分解により、〔図１〕に示される反応が起こる
と考えられる。本発明の製造法で得られるＫｉＳＳ−１
ペプチドのＣ末端は、前記したようにアミド（-CON
H₂)、カルボキシル基、カルボキシレート(-COO^-)、アル
キルアミド（-CONHR）またはエステル(-COOR)であって
もよく、なかでもアミド、カルボキシル基（-COOH)また
はアルキルアミドが好ましく、特にアミドまたはアルキ
ルアミドが好適である。具体的には、本発明の製造法で
得られるＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端は、〔図１〕に
示される−ＣＯ−Ｘであってよい。ＸはＲ¹−(ＮＲ²)−
（式中、各記号は前記と同意義を示す。）またはＯＨを
示す。上記Ｃ_1-20アルキルの例としては、例えば、メチ
ル，エチル，プロピル，イソプロピル，ブチル，sec-ブ
チル，ペンチル，イソペンチル，ネオペンチル，１−エ
チルペンチル，ヘキシル，イソヘキシル，ヘプチル，オ
クチル，ノナニル，デカニル，ウンデカニル，ドデカニ
ル，テトラデカニル，ペンタデカニル，ヘキサデカニ
ル，ヘプタデカニル，オクタデカニル，ノナデカニルお
よびエイコサニルなどがあげられる。上記Ｃ_3-8シクロ
アルキルの例としては、例えば、シクロプロピル，シク
ロブチル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロヘ
プチル，シクロオクチルなどがあげられる。上記Ｃ_6-14
アリールの例としては、フェニル，ナフチル，アンスリ
ル，フェナンスリル，アセナフチレニルなどがあげられ
る。上記Ｃ_6-14アリール−Ｃ_1-3アルキルの例として
は、例えばベンジル，フェネチル，３−フェニルプロピ
ル，(１−ナフチル)メチル，(２−ナフチル)メチルなど
があげられる。上記Ｃ_1-6アルコキシの例としては、例
えばメトキシ，エトキシ，プロポキシ，ブトキシ，ペン
チルオキシ，ヘキシルオキシなどがあげられる。

【００２８】上記(iii)の置換されていてもよいアミノ
の置換基の例としては、例えばアミノ酸，２〜１０個の
アミノ酸からなるペプチドなどがあげられる。上記アミ
ノ酸としては、Ｌ−体でもＤ−体でもよく、その例とし
ては、例えば、Ala，Arg，Asp，Asn，Glu，Gln，Gly，H
is，Ile，Met，Leu，Lys, Phe，Pro,Ser,Thr, Trp, Ty
r, Val などがあげられる。上記ペプチドの例として
は、例えば、H-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅，H-Val-Ala
-Leu-D-Ala-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-OH などがあげら
れる。上記した中でも、Ｒ²としては水素原子、Ｒ¹とし
ては水素原子またはＣ_1-20アルキル基が好ましい。該ア
ンモノリシス反応において、アンモニアまたはアミノ化
合物を用いた場合には、対応するアミド体が得られる。

【００２９】切り出された目的ペプチドを単離するに
は、通常知られているペプチドの精製法に従えばよい。
例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフィー，
高速液体クロマトグラフィー，アフイニティークロマト
グラフィー，疎水クロマトグラフィー，薄層クロマトグ
ラフィー，電気泳動等を適宜組み合せて行うことができ
る。このようにして得られるＫｉＳＳ−１ペプチドまた
はその塩は、公知の精製手段、例えば、抽出、塩析、分
配、再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液
から単離・精製することもできるが、好ましい例とし
て、例えば、ＳＰ−セファロース（ファルマシア バイ
オテク(株)）、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー(株)）、ある
いはＳＰ−５ＰＷ（東ソー(株)）を介したイオン交換ク
ロマトグラフィーなどによる精製法があげられる。

【００３０】得られるＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその
塩は、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすること
もできる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール，マンニ
トール，デキストロース，マルトース，トレハロース，
グリセロールなどの安定化剤を加えることができる。

【００３１】本発明の方法で製造されるＫｉＳＳ−１ペ
プチドまたはその塩は滅菌水，ヒト血清アルブミン(Ｈ
ＳＡ)，生理食塩水その他公知の生理学的に許容される
担体と混合することができ、哺乳動物（例、ヒト）に対
して非経口的に又は局所に投与することができる。たと
えば、その１日投与量は１人あたり、約０.０１mg−５
０mg、好ましくは、約０.１mg−１０mgを、静注または
筋注などにより非経口的に投与することができる。本発
明の方法で製造されるＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその
塩を含有する製剤は、塩，希釈剤，アジュバント，他の
担体，バッファー，結合剤，界面活性剤，保存剤のよう
な生理的に許容される他の活性成分も含有していてもよ
い。非経口的投与製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許
容される溶媒との懸濁液アンプル、または生理学的に許
容される希釈液で用時希釈して使用しうる滅菌粉末(通
常ペプチド溶液を凍結乾燥して得られる)アンプルとし
て提供される。

【００３２】本発明の製造法によって得られるＫｉＳＳ
−１ペプチドまたはその塩は癌転移抑制活性を有するた
め、あらゆる癌（例えば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大
腸癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、
乳癌等）の予防または治療薬として有用である。また、
ＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩は胎盤機能調節作用
を有するため、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎
児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘
発の予防または治療薬として有用である。

【００３３】本明細書および図面において、アミノ酸，
ペプチド，保護基，活性基，その他に関し略号で表示す
る場合、それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ(Commission on B
iochemical Nomenclature)による略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づくものであり、その例を次にあ
げる。また、アミノ酸などに関し光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 Ｇly ：グリシン Ａla ：アラニン Ｖal ：バリン Ｌeu ：ロイシン Ｉle ：イソロイシン Ｓer ：セリン Ｔhr ：スレオニン Ｍet ：メチオニン Ｇlu ：グルタミン酸 Ａsp ：アスパラギン酸 Ｌys ：リジン Ａrg ：アルギニン Ｈis ：ヒスチジン Ｐhe ：フェニールアラニン Ｔyr ：チロシン Ｔrp ：トリプトファン Ｐro ：プロリン Ａsn ：アスパラギン Ｇln ：グルタミン Ｃys ：システイン Ａsx ：アスパラギンまたはアスパラギン酸 Ｇlx ：グルタミンまたはグルタミン酸 ATP ：アデノシン三リン酸

【００３４】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 ［配列番号：１］ＫｉＳＳ−１ペプチドのアミノ酸配列
を示す。 ［配列番号：２］ＫｉＳＳ−１ペプチドをコードするＤ
ＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：３］ｂＦＧＦ ＣＳ２３ムテインのアミノ
酸配列を示す。 ［配列番号：４］式（I）で表される融合蛋白質をコー
ドするＤＮＡの断片の塩基配列を示す。 ［配列番号：５］式（I）で表される融合蛋白質をコー
ドするＤＮＡの断片の塩基配列を示す。 ［配列番号：６］ｂＦＧＦＣＳ２３ムテインの断片をコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：７］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプチ
ドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列を
示す。 ［配列番号：８］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプチ
ドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列を
示す。 ［配列番号：９］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプチ
ドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列を
示す。 ［配列番号：１０］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列
を示す。 ［配列番号：１１］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列
を示す。 ［配列番号：１２］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列
を示す。 ［配列番号：１３］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列
を示す。 ［配列番号：１４］実施例１においてＫｉＳＳ−１ペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたオリゴマーの塩基配列
を示す。 ［配列番号：１５］ＫｉＳＳ−１ペプチド成熟体のアミ
ノ酸配列を示す。

【００３５】

【発明の実施の形態】以下に実施例をあげて、本発明を
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。

【００３６】

【実施例】実施例１ ＫｉＳＳ−１ペプチドをコードするＤＮＡの製造 (a)ＤＮＡ断片の合成 〔図２〕に示す８種のＤＮＡ断片（＃１、＃４，＃５，
＃８：アマシャム・ファルマシア・バイオテク社、＃
２、＃３，＃６，＃７：キコーテック社）（配列表中、
配列番号：７〜１４）を用いてＫｉＳＳ−１ペプチドの
構造遺伝子を調製した（図３）。

【００３７】(b)ＤＮＡオリゴマーのリン酸化 ５’になるべき＃１（配列番号：７）および＃８（配列
番号：１４）を除いた６種のＤＮＡオリゴマー（＃２〜
＃７）（配列番号：８〜１３）各々を、２５μlのリン
酸化反応液〔ＤＮＡオリゴマー１０μg，５０mＭ Tris
−ＨＣl，pＨ７.６, １０mＭ ＭgＣl₂, １mＭスペルミ
ジン，１０mＭ ジチオスレイトール（以後ＤＴＴと略
記），０.１mg／mlウシ血清アルブミン（以後ＢＳＡと
略記），１mＭＡＴＰ，１０ユニットＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造）〕中で３７℃１時間反応させ、
各オリゴマーの５’末端をリン酸化した。フェノール処
理を行った後、２倍量のエタノールを加え、−７０℃に
冷却した後、遠心でＤＮＡを沈殿させた。

【００３８】(c)ＤＮＡフラグメントの連結 上記ａ）で得られたＤＮＡフラグメントと＃１および＃
８を合わせ１２０μｌとした。この混合液を９０℃で１
０分間保った後、室温まで徐冷しアニーリングを行っ
た。TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2（宝酒造）を用い
てライゲーション反応を行った。アニーリング液３０μ
ｌに Ligation Kit II液３０μｌを加えよく混合した
後、 Ligation Kit Ｉ液６０μｌを加え、３７℃、１時
間反応させ、ライゲーションを行った。フェノール処理
を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加え、
−７０℃に冷却した後、遠心でＤＮＡを沈殿させた。こ
の様にして得られたＤＮＡフラグメントをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造）によるリン酸化を行った
後、以下の(ｄ)に供した。

【００３９】(d)ＫｉＳＳ−１ペプチド発現ベクターの
構築〔図４〕 発現用ベクターとしてはｐＴＦＣ（特開２０００−２７
０８７１、特願平１１−０８０３０３号）をＮｄｅＩお
よびＡｖａＩ（宝酒造）で３７℃ ４時間消化した後、
１％アガロースゲル電気泳動により４.４kbのＤＮＡ断
片をQIAquick Gel Extraction Kit （キアゲン社）を用
いて抽出し、２５μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このｐ
ＴＦＣのＮｄｅＩ、ＡｖａＩ断片と上記により調製した
ＫｉＳＳ−１ペプチドの構造遺伝子をTaKaRa DNA ligat
ion kit ver.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応
を行った。

【００４０】この反応液を１０μl用いて大腸菌ＪＭ１
０９コンピテントセル（東洋紡）を形質転換し、１０μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播
き、３７℃で１晩培養し、生じたテトラサイクリン耐性
コロニー選んだ。この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養
し、QIAprep8 Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプ
ラスミドpTFC-KiSS-1を調製した。このＫｉＳＳ−１構
造遺伝子部分の塩基配列をアプライドバイオシステムズ
社モデル３７７ＤＮＡシーケンサーを用いて確認した。
プラスミドpTFC-KiSS-1で大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）
を形質転換し、ＫｉＳＳ−１ペプチド−ＣＳ２３融合タ
ンパク質発現株M294(DE3)/pTFC-KiSS-1を得た（図
４）。Escherichia coli MM294(DE3)/pTFC-KiSS-1は受
託番号FERM BP-6907で1999年10月4日付で通産省工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託された。また1999年
9月16日付で受託番号IFO 16321として財団法人発酵研究
所（IFO）に寄託された。

【００４１】（d）ＫｉＳＳ−１ペプチドの製造 ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＦＣ−ＫｉＳＳ−１を５．
０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地に１Ｌ
（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０５％塩化ナト
リウム）を用いて２Ｌ容フラスコ中で３７℃、８時間振
とう培養した。得られた培養液を１９Ｌの主発酵培地
（１．６８％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸
２水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５
％塩化ナトリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム、
０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第１鉄、０．
０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％
カザミノ酸）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３
０℃で通気攪拌を開始した。培養液の濁度が５００クレ
ット単位になったところで、イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシドの最終濃度が１２ｍｇ／Ｌになる
ように添加し、さらに６時間培養を行った。培養終了
後、培養液を遠心分離し、約６００ｇの湿菌体を取得
し、−８０℃で保存した。

【００４２】実施例２ 実施例１で得た菌体１００ｇに１０mＭ ＥＤＴＡ（pＨ
６.０）溶液３００mlを加え、超音波処理（ＢＲＡＮＳ
ＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０）した後、
遠心分離（１００００rpm、６０分）を行った。上澄液
はプールし、沈殿物を用いて再び同様の操作を行った。
プールした上澄液はpＨ６.０に調整し、５０mＭ リン酸
緩衝液（pＨ６.０）で平衡化した AF-Heparin Toyopear
l ６５０Ｍカラム（１１．３ｃｍＩＤ×１３．５ｃｍ
Ｌ、東ソー）に通液し、吸着、洗浄した後、０−１００
％Ｂ（Ｂ＝５０mＭ リン酸緩衝液＋２Ｍ ＮaＣl、pＨ
６.０）の段階勾配で溶出を行い、ＫｉＳＳ−１ペプチ
ド−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た（１００分間の
勾配で溶出時間約１００分の画分）。この溶出液をペリ
コンミニカセット（ミリポア社）で濃縮した後、さらに
０.１Ｍ酢酸を加えながら濃縮を行い、ＫｉＳＳ−１ペ
プチド−ＣＳ２３融合タンパク質の０.１Ｍ酢酸溶液を
得た。この溶液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加
した後、ＤＭＡＰ−ＣＮ（1-cyano-4-dimethylaminopyr
idinium tetrafluoroborate）約１００mgを加えて、室
温で１５分間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭ
リン酸１カリウムで平衡化した Sephadex Ｇ−２５カラ
ム（４6mmＩＤ×６００mmＬ、ファルマシア）に通液
し、平衡化に用いた５０ｍＭリン酸１カリウムを６ml／
min の流速で展開し、Ｓ−シアノ化されたＫｉＳＳ−１
ペプチド−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た。この溶
出液をペリコンミニカセット（ミリポア社）で濃縮・脱
塩を行い、ＫｉＳＳ−１ペプチド−ＣＳ２３融合タンパ
ク質の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度６Ｍとなる
ように尿素を添加した後、さらに、３Ｍアンモニア濃度
となるように２５％アンモニア水を加え、室温で１５分
間反応した。反応終了後、酢酸で pＨ６．０に調整し、
ＫｉＳＳ−１ペプチド（アミド体）を得た。この反応液
を５０mＭリン酸１カリウムで平衡化した Sephadex Ｇ
−２５カラム（４６mmＩＤ×６００mmＬ）に通液し、平
衡化に用いた５０mＭリン酸１カリウムを６ml／minの流
速で展開し、ＫｉＳＳ−１ペプチド画分（アミド体）を
得た。この画分を、３Ｍ尿素を含む５０mＭ ＭＥＳ＋
３Ｍ尿素（pＨ４．５）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（２
１.５mmＩＤ×１５０mmＬ、東ソー）に通液し、吸着、
洗浄した後、０−３０％Ｂ（Ｂ＝５０mＭ リン酸緩衝液
＋１Ｍ ＮaＣl＋３Ｍ尿素、pＨ４.５）の段階勾配で溶
出を行い、ＫｉＳＳ−１ペプチド（アミド体）画分を得
た（６０分間の勾配で溶出時間約３０分の画分）。この
画分を、さらに０.１％トリフルオロ酢酸で平衡化した
Ｃ４Ｐ−５０（２１.５mmＩＤ×３００mmＬ、昭和電
工）に通液し、吸着、洗浄した後、２０−５０％Ｂ
（Ｂ：８０％アセトニトリル／ ０.１％トリフルオロ酢
酸）の段階勾配で溶出を行い、ＫｉＳＳ−１ペプチド
（アミド体）画分（６０分間の勾配で溶出時間約４５分
の画分）をプールした後、凍結乾燥を行い、ＫｉＳＳ−
１ペプチド（アミド体）凍結乾燥粉末約４０mgを得た。

【００４３】実施例３ （ＫｉＳＳ−１ペプチドの特徴
の決定） ａ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
ＫｉＳＳ−１ペプチドのＤＮＡ塩基配列から予想される
アミノ酸組成と一致した〔表１〕。

【表１】

【００４４】ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（Ｐ
Ｅアプライドバイオシステムズ モデル４９２）を用い
て決定した。その結果、ＫｉＳＳ−１ペプチドのＤＮＡ
塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した
〔表２〕。

【表２】

【００４５】ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて分析したが、Ｃ末端
はアミド化されているため、不検出であった〔表３〕。

【表３】

【００４６】実施例４（生物活性測定） 実施例２で取得したヒトＫｉＳＳ−１ペプチドを用い
て、ＷＯ ９９／３３９７６の実施例３に記載の方法
（細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性）で活性を測定
し、ヒト胎盤抽出液より精製した標品と同等の活性を有
することを確認した。

【００４７】実施例５ （ＫｉＳＳ−１ペプチド（非ア
ミド体）の製造） 実施例１で得た菌体１００ｇに１０mＭ ＥＤＴＡ（pＨ
６.０）溶液３００mlを加え、超音波処理（ＢＲＡＮＳ
ＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０）した後、
遠心分離（１００００rpm、６０分）を行った。上澄液
はプールし、沈殿物を用いて再び同様の操作を行った。
プールした上澄液はpＨ６.０に調整し、５０mＭ リン酸
緩衝液（pＨ６.０）で平衡化した AF-Heparin Toyopear
l ６５０Ｍカラム（１１．３ｃｍＩＤ×１３．５ｃｍ
Ｌ、東ソー）に通液し、吸着、洗浄した後、０−１００
％Ｂ（Ｂ＝５０mＭ リン酸緩衝液＋２Ｍ ＮaＣl、pＨ
６.０）の段階勾配で溶出を行い、KiSS-１ペプチド−Ｃ
Ｓ２３融合タンパク質画分を得た（１００分間の勾配で
溶出時間約１００分の画分）。この溶出液をペリコンミ
ニカセット（ミリポア社）で濃縮した後、さらに０.１
Ｍ酢酸を加えながら濃縮を行い、ＫｉＳＳ−１ペプチド
−ＣＳ２３融合タンパク質の０.１Ｍ酢酸溶液を得た。
この溶液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加した
後、ＤＭＡＰ−ＣＮ約１００mgを加えて、室温で１５分
間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸１カ
リウムで平衡化した Sephadex Ｇ−２５カラム（４6mm
ＩＤ×６００mmＬ、ファルマシア）に通液し、平衡化に
用いた５０ｍＭリン酸１カリウムを６ml／min の流速で
展開し、Ｓ−シアノ化されたＫｉＳＳ−１ペプチド−Ｃ
Ｓ２３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコ
ンミニカセット（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、Ｋ
ｉＳＳ−１ペプチド−ＣＳ２３融合タンパク質の脱塩液
を得た。この脱塩液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を
添加した後、さらに、０．０５Ｎ ＮａＯＨ濃度となる
ように１Ｎ ＮａＯＨを加え、０℃で１５分間反応し
た。反応終了後、酢酸で pＨ６．０に調整し、ＫｉＳＳ
−１ペプチド（非アミド体）を得た。この反応液を５０
mＭリン酸１カリウムで平衡化した Sephadex Ｇ−２５
カラム（４６mmＩＤ×６００mmＬ）に通液し、平衡化に
用いた５０mＭリン酸１カリウムを６ml／minの流速で展
開し、ＫｉＳＳ−１ペプチド画分（非アミド体）を得
た。この画分を、３Ｍ尿素を含む５０mＭ ＭＥＳ＋３
Ｍ尿素（pＨ４．５）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（２１.
５mmＩＤ×１５０mmＬ、東ソー）に通液し、吸着、洗浄
した後、０−３０％Ｂ（Ｂ＝５０mＭ リン酸緩衝液＋１
Ｍ ＮaＣl＋３Ｍ尿素、pＨ４.５）の段階勾配で溶出を
行い、ＫｉＳＳ−１ペプチド（非アミド体）画分を得た
（６０分間の勾配で溶出時間約３０分の画分）。この画
分を、さらに０.１％トリフルオロ酢酸で平衡化したＣ
４Ｐ−５０（２１.５mmＩＤ×３００mmＬ、昭和電工）
に通液し、吸着、洗浄した後、２０−５０％Ｂ（Ｂ：８
０％アセトニトリル／ ０.１％トリフルオロ酢酸）の段
階勾配で溶出を行い、ＫｉＳＳ−１ペプチド（非アミド
体）画分（６０分間の勾配で溶出時間約４５分の画分）
をプールした後、凍結乾燥を行い、ＫｉＳＳ−１ペプチ
ド（非アミド体）凍結乾燥粉末約３０mgを得た。

【００４８】実施例６ （ＫｉＳＳ−１ペプチドの特徴
の決定） ａ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
ＫｉＳＳ−１ペプチドのＤＮＡ塩基配列から予想される
アミノ酸組成と一致した〔表４〕。

【表４】

【００４９】ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（Ｐ
Ｅアプライドバイオシステムズ モデル４９２）を用い
て決定した。その結果、ＫｉＳＳ−１ペプチドのＤＮＡ
塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した
〔表５〕。

【表５】

【００５０】ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて分析した。〔表
６〕。

【表６】

【００５１】

【配列表】 [SEQUENCE LISTING] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Method of Production for KiSS-1 peptide <130> B00361 <150> JP 11-358693 <151> 1999-12-17 <160> 15 <210> 1 <211> 54 <212> PRT <213> Human <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 1 Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gln Gln 1 5 10 15 Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala Pro Gln Gly 20 25 30 Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn 35 40 45 Ser Phe Gly Leu Arg Phe 50 54 <210> 2 <211> 162 <212> DNA <213> Human <400> 2 GGTACTTCTC TGTCTCCGCC GCCGGAATCT TCTGGTTCTC GTCAGCAGCC GGGTCTGTCT 60 GCTCCGCACT CTCGTCAGAT CCCGGCTCCG CAGGGTGCTG TTCTGGTTCA GCGTGAAAAA 120 GACCTGCCGA ACTACAACTG GAACTCTTTC GGTCTGCGTT TC 162 <210> 3 <211> 146 <212> PRT <213> Human <400> 3 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr 100 105 110 Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser 115 120 125 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 Lys Ser 145 <210> 4 <211> 165 <212> DNA <213> Human <400> 4 GGTACTTCTC TGTCTCCGCC GCCGGAATCT TCTGGTTCTC GTCAGCAGCC GGGTCTGTCT 60 GCTCCGCACT CTCGTCAGAT CCCGGCTCCG CAGGGTGCTG TTCTGGTTCA GCGTGAAAAA 120 GACCTGCCGA ACTACAACTG GAACTCTTTC GGTCTGCGTT TCTGC 165 <210> 5 <211> 165 <212> DNA <213> Human <400> 5 GGTACTTCTC TGTCTCCGCC GCCGGAATCT TCTGGTTCTC GTCAGCAGCC GGGTCTGTCT 60 GCTCCGCACT CTCGTCAGAT CCCGGCTCCG CAGGGTGCTG TTCTGGTTCA GCGTGAAAAA 120 GACCTGCCGA ACTACAACTG GAACTCTTTC GGTCTGCGTT TCTGT 165 <210> 6 <211> 432 <212> DNA <213> Human <400> 6 CCCGAGGATG GCGGCAGCGG CGCCTTCCCG CCCGGCCACT TCAAGGACCC CAAGCGGCTG 60 TACTGCAAAA ACGGGGGCTT CTTCCTGCGC ATCCACCCCG ACGGCCGAGT TGACGGGGTC 120 CGGGAGAAGA GCGACCCTCA CATCAAGCTA CAACTTCAAG CAGAAGAGAG AGGAGTTGTG 180 TCTATCAAAG GAGTGAGCGC TAATCGTTAC CTGGCTATGA AGGAAGATGG AAGATTACTA 240 GCTTCTAAGT CTGTTACGGA TGAGTGTTTC TTTTTTGAAC GATTGGAATC TAATAACTAC 300 AATACTTACC GGTCAAGGAA ATACACCAGT TGGTATGTGG CACTGAAACG AACTGGGCAG 360 TATAAACTTG GATCCAAAAC AGGACCTGGG CAGAAAGCTA TACTTTTTCT TCCAATGTCT 420 GCTAAGAGCT GC 432 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 TATGGGTACT TCTCTGTCTC CGCCGCCGGA ATCTTC 36 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 TGGTTCTCGT CAGCAGCCGG GTCTGTCTGC TCCGCACTCT CGTCA 45 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 GATCCCGGCT CCGCAGGGTG CTGTTCTGGT TCAGCGTGAA AA 42 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 AGACCTGCCG AACTACAACT GGAACTCTTT CGGTCTGCGT TTCTGCC 47 <210> 11 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ACGAGAACCA GAAGATTCCG GCGGCGGAGA CAGAGAAGTA CCCATA 46 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 AGCCGGGATC TGACGAGAGT GCGGAGCAGA CAGACCCGGC TGCTG 45 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 CGGCAGGTCT TTTTCACGCT GAACCAGAAC AGCACCCTGC GG 42 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 TCGGGGCAGA AACGCAGACC GAAAGAGTTC CAGTTGTAGT T 41 <210> 15 <211> 145 <212> PRT <213> Human <400> 15 Met Asn Ser Leu Val Ser Trp Gln Leu Leu Leu Phe Leu Cys Ala Thr 1 5 10 15 His Phe Gly Glu Pro Leu Glu Lys Val Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg 20 25 30 Pro Thr Gly Gln Gln Leu Glu Ser Leu Gly Leu Leu Ala Pro Gly Glu 35 40 45 Gln Ser Leu Pro Cys Thr Glu Arg Lys Pro Ala Ala Thr Ala Arg Leu 50 55 60 Ser Arg Arg Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser 65 70 75 80 Arg Gln Gln Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala 85 90 95 Pro Gln Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr 100 105 110 Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro 115 120 125 Gly Asn His Gly Arg Ser Ala Gly Arg Gly Trp Gly Ala Gly Ala Gly 130 135 140 Gln 145

【００５２】

【発明の効果】本発明の製造方法を用いると、例えば、
あらゆる癌（例えば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸
癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳
癌等）、さらには絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、
胎児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩
誘発の予防または治療薬などとして用いることができる
ペプチドを工業的かつ大量に製造できる。

【００５３】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の反応工程における反応メカニズムを示
す。

【図２】実施例１で用いられたＤＮＡフラグメントを示
す。

【図３】実施例１で得られた２重鎖構成のヒトＫｉＳＳ
−１ペプチドを製造する模式図を示す。

【図４】実施例２で得られたプラスミドｐＴＦＣ−Ｋｉ
ＳＳ−１の構築図を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
   ペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した
   融合蛋白質、ペプチドまたはその塩を該システイン残基
   のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特
   徴とするＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩の製造法。
2. 【請求項２】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
   ペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した
   融合蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡを有する
   ベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白質、
   ペプチドまたはその塩を発現させ、発現された融合蛋白
   質、ペプチドまたはその塩を該システイン残基のアミノ
   基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする
   ＫｉＳＳ−１ペプチドまたはその塩の製造法。
3. 【請求項３】ＫｉＳＳ−１ペプチドのＣ末端がアミドで
   ある請求項１または２記載の製造法。
4. 【請求項４】切断反応がＳ−シアノ化反応、次いでアン
   モノリシスまたは加水分解反応に付す反応である請求項
   １または２記載の製造法。
5. 【請求項５】ＫｉＳＳ−１ペプチドが配列番号：１で表
   されるアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１
   または２記載の製造法。
6. 【請求項６】ＫｉＳＳ−１ペプチドが、配列番号：１
   で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４０〜５４番目
   からなるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：
   １で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４５〜５４番
   目からなるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番
   号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４６〜５
   ４番目からなるアミノ酸配列を有するペプチドまたは
   配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第４
   ７〜５４番目からなるアミノ酸配列を有するペプチドで
   ある請求項１または２記載の製造法。
7. 【請求項７】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
   ペプチドが、Ｎ末端にシステインを有するインターフェ
   ロン類、インターロイキン類、繊維芽細胞成長因子、
   （プロ）ウロキナーゼ類、リンホトキシン、Tumor Necr
   osis Factor（ＴＮＦ）、β−ガラクロシダーゼ、貯蔵
   タンパク類、ストレプトアビシン、プロテインＡ、プロ
   テインＧ、Tissue Plasminogen Activator（ＴＰＡ）ま
   たはそのムテインもしくは断片である請求項１または２
   記載の製造法。
8. 【請求項８】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
   ペプチドが、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含
   有し、そのＮ末端にシステイン残基が付加した蛋白質ま
   たはペプチドである請求項１または２記載の製造法。
9. 【請求項９】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
   ペプチドが配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有
   し、そのＮ末端にシステイン残基が付加した蛋白であ
   り、ＫｉＳＳ−１ペプチドが配列番号：１で表されるア
   ミノ酸配列を有するペプチドであり、製造されるＫｉＳ
   Ｓ−１ペプチドがＣ末端がアミドである配列番号：１で
   表されるアミノ酸配列を有するペプチドである請求項１
   または２記載の製造法。
10. 【請求項１０】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質また
    はペプチドのＮ末端に、ＫｉＳＳ−１ペプチドを連結し
    た融合蛋白質、ペプチドまたはその塩。
11. 【請求項１１】配列番号：３で表されるアミノ酸配列を
    含有し、そのＮ末端にシステイン残基が付加した蛋白質
    のＮ末端に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含
    有するＫｉＳＳ−１ペプチドを連結した請求項１０記載
    の融合蛋白質、ペプチドまたはその塩。
12. 【請求項１２】請求項１０記載の融合蛋白質またはペプ
    チドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
13. 【請求項１３】配列番号：４で表される塩基配列また
    は配列番号：５で表される塩基配列を有する請求項１
    ２記載のＤＮＡ。
14. 【請求項１４】請求項１２記載のＤＮＡを有するベクタ
    ー。
15. 【請求項１５】請求項１４記載のベクターを含有する形
    質転換体。
16. 【請求項１６】ＦＥＲＭ ＢＰ−６９０７で表示される
    エシュリヒア・コリＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＦＣ−
    ＫｉＳＳ−１。