JP2000228991A

JP2000228991A - アペリンの製造法

Info

Publication number: JP2000228991A
Application number: JP11351103A
Authority: JP
Inventors: Masato Suenaga; 正人末永; Takashi Ito; 隆司伊藤; Tadashi Nishimura; 紀西村
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2000-08-22

Abstract

(57)【要約】【課題】新規生理活性ペプチド（アペリン）を工業的か
つ大量に製造するのに有利な製造法を提供する。【解決手段】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
ペプチドのＮ末端にアペリンを連結した融合蛋白質また
はペプチドをシステイン残基のアミノ酸側のペプチド結
合の切断反応に付すことを特徴とするアペリンの製造
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、融合蛋白質または
ポリペプチドを製造し、次いで該融合蛋白質またはポリ
ペプチドをペプチド結合の切断反応に付すことにより、
アペリンまたはその塩を製造する方法に関する。さら
に、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有
するアペリンまたはその塩から効率よくＮ末端の酸化さ
れていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残
基のジケトン体を除去する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いて、ペプチドを
製造するに際しては、ペプチドが細胞内で、分解を受け
やすいために、融合蛋白質の形で発現させることがしば
しば行なわれている。融合蛋白質からの目的ペプチドの
切り出しには、ブロムシアンを用い化学的に切断する方
法（イタクラら、Science, 198, 1056(1977)）、ファフ
ターＸaを用い酵素的に切断する方法（ナガイら、Metho
ds in Enzymology, 153,46(1987)）が知られている。さ
らに、蛋白質中のペプチド結合を切断する方法として、
２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸によるアシルシス
テイン結合の切断が知られている（「生化学実験講座」
１，タンパク質の化学II，日本生化学会編，東京化学同
人発行，第２４７〜２５０頁１９７６年）。しかしなが
ら、蛋白質からの目的ペプチドの切り出しについては、
開示されていない。蛋白質が細胞内で生合成される際に
は、そのＮ末端は mＲＮＡの開始コドンＡＵＧに対応す
るメチオニンから始まっていることが知られている。し
かしながらこのメチオニンは以後のプロセッシングによ
って取り除かれてしまうため、完成された成熟蛋白質分
子にはもはや存在しないのが通例である。遺伝子組換え
技術の進歩により、有用な蛋白質を微生物や動物細胞、
例えば大腸菌を用いて産生することが可能となったが、
本手法により産生される蛋白質には、上記メチオニンが
残存している例が見い出されている。例えば、大腸菌で
発現させたヒト成長ホルモンにおいてメチオニンの付加
率はほぼ１００％［ネイチャー（Nature），２９３，４
０８（１９８１）］に達し、インターフェロン−αにお
いては５０％［ジャーナル・オブ・インターフェロン・
リサーチ（J. Interferon Res.），１，３８１（１９８
１）］、非グリコシル化ヒトインターロイキン−２で
は、天然型ヒトインターロイキン−２と同じくアラニン
ではじまる分子種（rＩＬ−２）に加え、アミノ末端に
さらにメチオニンの付加した（Ｎ末端にメチオニン残基
を有する）分子種（Ｍet−rＩＬ−２）の存在が認めら
れている。一方、Ｎ末端のアミノ酸を化学的に除去する
方法としては、Dixon が、ＤＬ−アラニルグリシンにグ
リオキシル酸、ピリジン、酢酸銅を反応させるとアミノ
基転移反応が起こり、ピルボイルグリシンが生成するこ
と［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem. J），
９２，６６１（１９６４）］、さらに、化合物にチオセ
ミカルバジドを反応させるとアミド結合の解裂が起こ
り、グリシンを生成することを報告している［バイオケ
ミストリー・ジャーナル（Biochem.J），９０，２Ｃ
（１９６４）］。次いで、この反応をチトクロームｃ−
５５１（Pseudomonas cytochrome ｃ−５５１）に応用
し、Ｎ末端グルタミン酸が除去されることを報告してい
る［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem. J），
９４，４６３（１９６５）］。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来知られている技術
において、融合蛋白質からの目的ペプチドの切り出しに
際し、ブロムシアンを用いる場合には、メチオニンを含
有するペプチドの製造には適用することはできないし、
切り出し時の収率等に問題が多い。このように、融合蛋
白質またはポリペプチドから目的とするペプチドを効率
良く切り出す方法が望まれている。さらに、同じ蛋白質
であっても、Ｎ末端にメチオニンの付加した分子種とそ
うでない分子種とは蛋白質の高次構造、生物活性、安定
性が相互に異なる可能性があり、さらにメチオニンのＮ
末端への付加が抗原性の増加をもたらす可能性もありう
るものと考えられる。従って、産業利用上の観点から、
この開始コドンに対応するＮ末端メチオニン除去法を確
立することは意義あることと考えられる。この課題を解
決するため、臭化シアン（ＢrＣＮ）分解によってメチ
オニンを取り除く方法［サイエンス（Science），１９
８，１０５６（１９７７）］が提案されているが、この
場合は所望の成熟蛋白質中にメチオニン残基が存在しな
いことが前提となる上、過酷な化学反応を蛋白質に付す
該方法によっては、決して満足する結果は得られない。
Ｎ末端にメチオニン残基を有するペプチドまたは蛋白質
から、ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、選択的
かつ効率的に、Ｎ末端のメチオニン残基を除去すること
を可能とする化学的な方法としては、特開平１０−７２
４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）に記載の方法以
外には全く知られていないが、このことは、最終生産物
となるペプチドまたは蛋白質を変性させることなく、マ
イルドな条件下でＮ末端のメチオニン残基を除去しうる
化学的な反応を見い出すことの困難性に起因すると考え
られる。特に、分子量が比較的大きく、遺伝子工学的に
製造される蛋白質、なかでも、医薬として用いることを
目的とした蛋白質から、Ｎ末端に余分に付加したメチオ
ニンを除去する場合、メチオニン除去後に蛋白質の活性
が低下しないことが要求されるため、通常、弱酸性から
弱アルカリの水溶液中で加熱することなく、反応を進行
させる必要があり、化学的な反応条件としては制限が多
いので、良好な反応条件を見い出せないのが現状であっ
た。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規生理
活性ペプチドであるアペリン（Biochem. Biophys. Res.
Commun., 251, 471-476,（1998））またはその塩を効
率良く製造する方法について鋭意検討を加えたところ、
Ｎ末端にシステインを有する蛋白質またはポリペプチド
のＮ末端にアペリンを連結した融合蛋白質またはポリペ
プチドを製造し、次いでこれをペプチド結合を切断する
反応に付すことにより、アペリンを効率良く製造できる
ことを見い出した。さらに、本発明者らは、遺伝子工学
的に製造されるアペリンにおけるＮ末端のメチオニン残
基のみを切断することによる、天然型のアミノ酸配列を
有するアペリンの製造法を提供すべく鋭意研究したとこ
ろ、下記のスキーム１に表されるとおり式（Ｉ）で表わ
されるＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を
有するアペリンに、例えば、α-ジケトン類であるグリ
オキシル酸、遷移金属イオンを供与しうる硫酸銅、塩基
（例えばアミン類）であるピリジンを反応させて、アミ
ノ基転移反応を行うことにより得られる該メチオニン残
基のジケトン体を有するアペリンに塩基（例えばジアミ
ン類）である３，４−ジアミノ安息香酸を反応させて加
水分解反応を行うことにより、該メチオニン残基のジケ
トン体を有するアペリンからメチオニン残基のジケトン
体を予想外にも効率よく除去できることを見出した。す
なわち、本発明者らはメチオニン残基を有するアペリン
から、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基を
除去し、その活性を低下させることなく、Ｎ末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基を有していないアペリ
ンを予想外にも高収率で得る方法を見い出し、さらに研
究を進め、本発明を完成させるに至った。（スキーム１）

【化１】［式（I）中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアペ
リンのペプチド鎖を示す。］本願明細書においては、上記スキーム１中、（１）一般式（Ｉ）で表される化合物を「Ｎ末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基を有するアペリンまた
はその塩」または「メチオニン残基を有するアペリンま
たはその塩」；（２）一般式（Ｉ）において

【化２】 [式中、ｍは前記と同意義]で表される部分構造を「酸化
されていてもよいメチオニン残基」、「メチオニン残
基」または「メチオニン」；（３）一般式（II）で表される化合物を「Ｎ末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有する
アペリンまたはその塩」または「メチオニン残基のジケ
トン体を有するアペリンまたはその塩」；（４）一般式（II）において

【化３】 [式中、ｍは前記と同意義]で表される部分構造を「酸化
されていてもよいメチオニン残基のジケトン体」または
「メチオニン残基のジケトン体」；および、（５）一般式（III）に代表される化合物を「Ｎ末端に
酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないア
ペリンまたはその塩」または「Ｎ末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基のジケトン体を有していないアペ
リンまたはその塩」と、それぞれ称することがある。

【０００５】本発明は、（１）Ｎ末端にシステインを有
する蛋白質またはペプチドのＮ末端に、Ｎ末端に酸化さ
れていてもよいメチオニン残基を有していてもよいアペ
リンを連結した融合蛋白質またはペプチドをシステイン
残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すこと
を特徴とするアペリンまたはその塩の製造法、（２）Ｎ
末端にシステインを有する蛋白質またはペプチドのＮ末
端に、Ｎ末端にメチオニン残基を有していてもよいアペ
リンを連結した融合蛋白質またはペプチドをコードする
遺伝子を有するベクターを保持する形質転換体を培養し
て融合蛋白質またはペプチドを発現させ、発現された融
合蛋白質またはペプチドをシステイン残基のアミノ基側
のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とするＮ末
端にメチオニン残基を有していてもよいアペリンまたは
その塩の製造法、（３）切断反応がＳ−シアノ化反応、
次いで加水分解反応に付す反応である上記（１）または
（２）記載の製造法、（４）アペリンが配列番号：１で
表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上
記（１）または（２）記載の製造法、（５）Ｎ末端にシ
ステインを有する蛋白質またはペプチドのＮ末端に、Ｎ
末端にメチオニン残基を有していてもよいアペリンを連
結した融合蛋白質またはペプチド、（６）上記（５）記
載の融合蛋白質またはペプチドをコードする遺伝子を有
するベクター、（７）上記（６）記載のベクターを含有
する形質転換体、（８）Ｎ末端に酸化されていてもよい
メチオニン残基を有するアペリンまたはその塩とα−ジ
ケトン類を反応させた後、加水分解することを特徴とす
る該メチオニン残基の除去方法、（９）Ｎ末端に酸化さ
れていてもよいメチオニン残基を有するアペリンが遺伝
子工学的に製造されたアペリンである上記（８）記載の
方法、（１０）遷移金属イオンの存在下にα−ジケトン
類を反応させることを特徴とする上記（８）記載の方
法、（１１）塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させ
ることを特徴とする上記（８）記載の方法、（１２）遷
移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることを特徴とする上記（８）記載の方法、（１
３）α−ジケトン類がグリオキシル酸またはその塩であ
る上記（８）記載の方法、（１４）遷移金属イオンが銅
イオンである上記（１０）記載の方法、（１５）塩基が
ピリジンである上記（１１）記載の方法、（１６）塩基
を用いて加水分解することを特徴とする上記（８）記載
の方法、（１７）塩基がアミン類である上記（１６）記
載の方法、（１８）塩基がジアミン類またはチオもしく
はセレノセミカルバジド類である上記（１６）記載の方
法、（１９）ジアミン類がo−フェニレンジアミンまた
は３，４−ジアミノ安息香酸である上記（１８）記載の
方法、（２０）遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端にメチ
オニンが付加したアペリンまたはその塩とグリオキシル
酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反
応させた後、o−フェニレンジアミンまたは３，４−ジ
アミノ安息香酸と反応させることを特徴とするアペリン
またはその塩の製造法、（２１）式 CH₃-S(O)_m-(CH₂)₂
-CO-CO-X〔式中、ｍは０ないし２の整数を、Ｘはアペリ
ンのペプチド鎖を示す。〕で表される化合物またはその
塩、（２２）上記（２１）記載の化合物を加水分解する
ことを特徴とするアペリンまたはその塩の製造法、およ
び（２３）Ｎ末端にシステインを有する蛋白質またはペ
プチドのＮ末端に、Ｎ末端にメチオニン残基を有するア
ペリンを連結した融合蛋白質またはペプチドをシステイ
ン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付し、
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有する
アペリンまたはその塩を得、さらに、該Ｎ末端に酸化さ
れていてもよいメチオニン残基を有するアペリンまたは
その塩とα−ジケトン類を反応させた後、加水分解する
ことを特徴とするアペリンまたはその塩の製造法などに
関する。

【０００６】本発明の方法に用いられるアペリンとして
は、例えばBiochem. Biophys. Res.Commun., 251, 471-
476,（1998）に記載のヒトアペリン−３６（配列番号：
１で表されるアミノ酸配列で表されるポリペプチド）、
アペリン−１３（配列番号：１の第２４〜３６番目のア
ミノ酸配列で表されるポリペプチド）、アペリン−１３
のＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化し
たペプチドなどがあげられ、ＡＰＪ（O'Dowd. B.F., et
al., Gene, 436, 355-359, 1993）に対し、リガンド活
性を有するペプチドであれば、如何なるものであってい
てもよく、具体的には、例えばＷＯ９９／３３９７６
（特願平１０−３６４６５６号）に記載の「配列番号：
３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に結合能を
有するポリペプチド」などがあげられる。また、本発明
のアペリンには、ＧｌｎのＮ端側が生体内で切断され、
該Ｇｌｎがピログルタミン酸化したものなども含まれ
る。本明細書におけるペプチドはペプチド標記の慣例に
従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カ
ルボキシル末端）である。配列番号：１で表されるペプ
チドのＣ末端は、カルボキシル基（-COOH)、カルボキシ
レート(-COO^-)、アミド（-CONH₂)、アルキルアミド（-C
ONHR）またはエステル(-COOR)であってもよい。エステ
ルまたはアルキルアミドのＲとしては、例えばメチル、
エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチ
ルなどのＣ_1-6アルキル基、シクロペンチル、シクロヘ
キシルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、フェニル、α−
ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、ベンジル、フェネチ
ル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル、
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ
_1-2アルキルなどのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用
エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエス
テルなどがあげられる。本発明のアペリンの塩として
は、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属な
ど）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、と
りわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この
ような塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン
酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例え
ば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明の方法に用いられ
るＮ末端にシステインを有する蛋白質またはペプチドと
しては、特定されるものではない。そのＮ末端にシステ
インを有しない蛋白質またはペプチドの場合は、自体公
知の方法によりＮ末端にシステインを有するようにすれ
ばよい。

【０００７】該Ｎ末端にシステインを有する蛋白質また
はペプチドとしては、分子量が１００〜１０００００の
ものが好ましく、さらに、分子量が３００〜５００００
のものが好ましい。また、Ｎ末端にシステインを有する
蛋白質またはペプチドとしては、１〜１０００個のアミ
ノ酸を有するものが好ましく、さらに３〜５００個のア
ミノ酸を有するものが好ましい。該蛋白質またはペプチ
ドとしては、例えばインターフエロン類、インターロイ
キン類、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦな
ど）等各種成長因子類、(プロ)ウロキナーゼ類、リンホ
トキシン、Tumor Necrosis Factor(ＴＮＦ)、β−ガラ
トシターゼなどの酵素タンパク類、貯蔵タンパク類、ス
トレプトアビシン、プロテインＡ、プロテインＧ、Tiss
ue Plasminogen Activator(ＴＰＡ)、これらのムテイン
又はこれらの一部（断片）などのＮ末端にシステインを
有するものがあげられる。なかでも、線維芽細胞成長因
子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦなど）またはそのムテインまた
はこれらの一部（断片）（例えば、ｂＦＧＦＣＳ２３
ムテインなど）などが好ましく用いられる。ｂＦＧＦ
ＣＳ２３ムテインとしては、例えば、Pro-Ala-Leu-Pro-
Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His-Ph
e-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-
Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gl
y-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp-Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-
Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Arg-Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys-Gl
y-Val-Ser-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-
Gly-Arg-Leu-Leu-Ala-Ser-Lys-Ser-Val-Thr-Asp-Glu-Cy
s-Phe-Phe-Phe-Glu-Arg-Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-
Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-Thr-Ser-Trp-Tyr-Val-Al
a-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ser-Lys-
Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Lys-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Me
t-Ser-Ala-Lys-Ser(配列番号：３)で表されるアミノ酸
配列を含有し、そのＮ末端にシステイン残基が付加した
蛋白などがあげられる。

【０００８】本発明方法で用いられる融合蛋白質（融合
ペプチドを含む）をコードする遺伝子は、(１)全塩基配
列を化学的に合成してもよいし、(２)蛋白質をコードす
る塩基配列のＮ末端側にシステインをコードする塩基配
列を配置しさらにそのＮ末端側にアペリンをコードする
塩基配列を配置することにより該遺伝子を構築してもよ
い。また、（３）該ペプチドのフラグメントを得るのが
目的の場合には、所望のフラグメントの直後のアミノ酸
残基をsite-directed mutagenesis 等の手法でシステイ
ンに置換した該遺伝子を構築すればよい。上記の(１)の
場合の製造法としては、例えば、自体公知のホスホアミ
ダイド法、リン酸トリエステル法、ジエステル法、ハイ
ドロジェンホスホネート法などを用いて、短いものなら
一度に、長いものでは分割して合成した後にＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結して作成することが可能である。

【０００９】上記の(２)の場合の製造法としては、例え
ば、Ｃ末端側の蛋白をコードする遺伝子は、染色体から
適当な制限酵素で切断し、ベクターに連結して得るか、
もしくはcＤＮＡを取得する。しかる後にＮ末端がシス
テインになるように制限酵素で切断するか、もしく
は、合成ＤＮＡを全蛋白もしくはその一部の遺伝子の
５'−末端に結合しＮ末端がシステインになるように改
変する。その５'−末端に目的の蛋白質をコードする遺
伝子(化学合成したものでも、生体よりクローニングし
てきたものでもよい)をつなげる。などが考えられる。
このようにして得られる融合蛋白質をコードする遺伝子
の具体例としては、例えば式 CTGGTGCAGCCCAGAGGGTCAAGGAATGGGCCAGGGCCCTGGCAGGGAGGTCGGAGGAAATTCCGCCGCCAG CGGCCCCGCCTCTCCCATAAGGGACCCATGCCTTTC-TGC または TGT-Ｒ (I) 〔式中、ＲはCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCA
CTTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGC
GCATCCACCCCGACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCT
CACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAA
AGGAGTGAGCGCTAATCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGATGGAAGATTAC
TAGCTTCTAAGTCTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAA
TCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGT
GGCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTG
GGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGC (ｈ
ｂＦＧＦムテインＣＳ２３の断片)からなる塩基配列を
示す。〕で表わされるＤＮＡなどがあげられる。

【００１０】上記式（Ｉ）はヒト（human）アペリン−3
6を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
（配列番号：２）にシステインをコードする塩基配列を
介してＲで示される塩基配列が結合していることを示
す。５'末端にＡＴＧを有し、その下流に該融合蛋白質
をコードする領域、ついで翻訳終止コドンを有するＤＮ
Ａ(プラスミド)は、化学合成で、あるいは遺伝子工学的
に製造された公知の該蛋白質のcＤＮＡ、もしくは、染
色体由来の該蛋白質のＤＮＡを加工することにより製造
することができる。本発明のＮ末端にシステインを有す
る蛋白質またはペプチドのＮ末端にアペリンを連結した
融合蛋白質またはペプチドをコードする遺伝子を、従来
のＤＮＡ技術、例えば特定部位指向性変異誘発技術を用
いて目的のムテインをコードする遺伝子に変換すること
ができる。特定部位指向性変異誘発技術は周知であり、
アール・エフ・レイサー(Lather,R. F.)及びジェイ・ピ
ー・レコック(Lecoq, J. P.)、ジェネティック・エンジ
ニアリング(Genetic Engineering)、アカデミックプレ
ス社(１９８３年)第３１−５０頁に示されている。オリ
ゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス(S
mith, M.) 及びエス・ギラム(Gillam, S.)、ジェネティ
ック・エンジニアリング：原理と方法、プレナムプムス
社(１９８１年)３巻１−３２頁に示されている。

【００１１】該融合蛋白質をコードする領域を有するＤ
ＮＡを有するプラスミドを製造するにあたって、ベクタ
ーとして用いられるプラスミドとしては、例えば大腸菌
（Escherichia coli）由来のpＢＲ３２２〔ジーン(Gen
e)，２，９５(１９７７)〕，pＢＲ３１３〔ジーン，
２，７５(１９７７)〕，pＢＲ３２４，pＢＲ３２５〔ジ
ーン，４，１２４(１９７８)〕，pＢＲ３２７，pＢＲ３
２８〔ジーン，９，２８７(１９８０)〕，pＢＲ３２９
〔ジーン，１７，７９(１９８２)〕，pＫＹ２２８９
〔ジーン，３，１(１９７８)〕，pＫＹ２７００〔生化
学，５２，７７０(１９８０)〕，pＡＣＹＣ１７７，pＡ
ＣＹＣ１８４〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J
ournal of Bacteriology)，１３４，１１４１(１９７
８)〕，ｐＲＫ２４８，ｐＲＫ６４６，pＤＦ〔メソッズ
・イン・エンジーモロジー(Methods inEnzymology)，
６８，２６８(１９７９)〕，pＵＣ１８，pＵＣ１９〔ヤ
ニシューペロンら，ジーン(Gene)，３３，１０３(１９
８５)〕などがあげられる。また、バクテリオファー
ジ、例えばλファージを使用したλgt系のλgt・λＣ
〔Proc.Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.Ａ．７１，４５７９
(１９７４)〕，λgt・λＢ〔Proc.Natl. Acad. Sci.
Ｕ.Ｓ.Ａ. ７２，３４６１(１９７５)〕，λＤam〔ジー
ン，１，２５５(１９７７)〕やシャロンベクター〔サイ
エンス，(Science)，１９６，１６１(１９７７)；ジャ
ーナル・オブ・ビーロロジー(Journal of Virology)，
２９，５５５(１９７９)〕，繊維状ファージを使用した
mp系のmp１８，mp１９〔ヤニシューペロンら，ジーン(G
ene)，３３，１０３(１９８５)〕ベクターなどもあげら
れる。

【００１２】上記ＤＮＡは、ＡＴＧの上流にプロモータ
ーを有しているのが好ましく、該プロモーターは、形質
転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌(Esche
richia coli)ではtrpプロモーター，lacプロモーター，
rec Ａプロモーター，λＰＬプロモーター，lppプロモ
ーター，Ｔ７プロモーターなど、枯草菌(Bacillus subt
ilis)ではＳＰＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモータ
ー，penＰプロモーターなど、酵母(Saccharomyces cere
visiae)ではＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモータ
ー，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターなど、動
物細胞ではＳＶ４０由来のプロモーターなどがあげられ
る。必要によりＳＤ(シヤインアンドダルガーノ)配列を
プロモーターの下流に挿入してもよい。Ｔ７プロモータ
ーの系を用いる場合には、Ｔ７プロモーターとしては、
Ｔ７ＤＮＡ上で見い出されている１７種のプロモーター
〔J. L. Oakley ら，Proc．Natl. Acad. Sci, Ｕ.Ｓ.
Ａ，７４：４２６６−４２７０(１９７７)，M. D. Ros
a,Cell １６：８１５−８２５(１９７９)，N. Panayota
tos ら，Nature，２８０：３５(１９７９)，J. J. Dunn
ら，J. Mol. Biol.，１６６：４７７−５３５(１９８
３)〕のいずれでもよいがφ１０プロモーター〔A. H. R
osenberg ら，Gene，５６：１２５−１３５(１９８
７)〕が好ましい。

【００１３】転写ターミネーターとしては、大腸菌の系
で作動するターミネーター、好ましくはＴφターミネー
ター〔F. W. Studier ら，J. Mol. Biol.，１８９：１
１３−１３０(１９８６)〕が用いられる。Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子としてはＴ７遺伝子〔F. W. Studier
ら，J. Mol. Biol.，１８９：１１３−１３０(１９８
６)〕をあげることが出来る。ベクターは上記ベクター
にＴ７プロモーター，Ｔ７ターミネーターを組み込んで
構築されるのが好ましく、このようなベクターとして
は、pＥＴ−１，pＥＴ−２，pＥＴ−３，pＥＴ−４，p
ＥＴ−５〔A. H. Rosenberg, Gene ５６：１２５−１３
５(１９８７)〕、pＴＢ９６０−２〔ＥＰ−Ａ−４９９
９９０〕などをあげることができるが、好ましくはpＴ
Ｂ９６０−２が用いられる。

【００１４】本発明の形質転換体は、上記方法で得られ
る発現用プラスミドを自体公知の方法〔例、コーエンS,
N, ら，プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.
Ａ.)，６９，２１１０(１９７２)〕で宿主を形質転換す
ることにより製造することができる。形質転換される微
生物の宿主としては、例えば、エシエリシア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）属菌，バチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属菌，酵母，動物細胞などがあげられる。上記エシエリ
シア属菌の例としては、エシエリシア・コリ(E. coli)
があげられ、具体的にはエシエリシア・コリ(Escherich
ia coli)Ｋ１２ＤＨ１〔プロシーディングス・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Nat
l.Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.Ａ.)，６０，１６０(１９６
８)〕，ＪＭ−１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ，(Nucleic Acids Research)，９，３０９(１９８
１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー(Journal ofMolecular Biology)，１２
０，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー，４１，４５９(１
９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス(Genetics)，
３９，４４０(１９５４)〕，Ｎ４８３０〔セル(Cell)，
２５，７１３(１９８１)〕，Ｋ−１２ＭＭ２９４〔プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ，７３，４１７４(１９７６)〕ＢＬ−２
１などがあげられる。

【００１５】上記バチルス属菌としては、例えばバチル
ス・サチルス(Bacillus subtilis)があげられ、具体的
にはバチルス・サチルスＭＩ１１４(ジーン，２４，２
５５(１９８３))，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー(Journal of Biochemistry)，９
５，８７(１９８４)〕などがあげられる。上記酵母とし
ては、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ(Sacchar
omyces cerevisiae)があげられ、具体的には、サッカロ
マイセス・セレビシアエＡＨ２２〔Proc. Natl. Acad.
Sci. ＵＳＡ，７５，１９２９(１９７８)〕，ＸＳＢ５
２−２３Ｃ〔Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，７７
２１７３(１９８０)〕，ＢＨ−６４１Ａ(ＡＴＣＣ２
８３３９)，２０Ｂ−１２〔Genetics，８５，２３(１９
７６)〕，ＧＭ３Ｃ−２〔Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ，７８２２５８(１９８１)〕などがあげられる。

【００１６】動物細胞としては、例えばサル細胞ＣＯＳ
−７〔セル(Cell)，２３，１７５(１９８１)〕，Vero
〔(日本臨床２１，１２０９(１９６３)〕，チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ〔ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メデイシン(J.Exp. Med.)，１０８，９
４５(１９８５)〕，マウスＬ細胞〔ジャーナル・オブ・
ナショナル・キャンサー・インスティチュート(J. Nat.
Cancer Inst.)，４，１６５(１９４３)〕，ヒトＦＬ細
胞〔プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティ・フォ
ー・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィシン(Proc. Soc. Exp. Biol. Med.)，９４，５３２
(１９５７)〕，ハムスターＣ細胞などがあげられる。

【００１７】Ｔ７プロモーターの系を用いる場合には、
その形質転換体の宿主としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子(Ｔ７遺伝子１)〔F. W. Studierら，J. Mol. B
iol.１８９：１１３−１３０(１９８６)〕を組み込んだ
大腸菌株、例えばＭＭ２９４，ＤＨ−１，Ｃ６００，Ｊ
Ｍ１０９，ＢＬ２１，あるいはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子(Ｔ７遺伝子１)を他のプラスミドと共に組込んだ
大腸菌株など、ならいずれでもよい。好ましくはＴ７遺
伝子１を組み込んだλファージが溶原化したＭＭ２９４
株およびＢＬ２１株が用いられる。この場合Ｔ７遺伝子
１のプロモーターとしては、イソプロピル−１−チオ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド(ＩＰＴＧと略することが
ある。)で発現が誘導されるlacプロモーターが用いられ
る。

【００１８】バチルス属菌を宿主として形質転換するに
は、例えばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス（Molecular and General Genetics), 168,
111(1979)など公知の方法に従って行なうことができ
る。酵母菌を宿主として形質転換するには、例えばPro
c. Natl. Acad. Sci. USA，75, 1929(1978)などの公知
の方法に従って行なうことができる。動物細胞を宿主と
して形質転換するには、例えばヴィーロロジー(Virolog
y, 52, 456(1973)などの公知の方法に従って行なうこと
ができる。融合蛋白は、上述の形質転換体を培地に培養
し、産生された融合蛋白を採取することにより製造する
ことができる。培地のpＨは約６〜８が望ましい。

【００１９】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experi
ments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York 1972)〕が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、例えば３β−インドリルアクリル酸やイソプロピ
ルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のよう
な薬剤を加えることができる。

【００２０】宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通
常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
例えばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostia
n, K. L. ら、プロシージングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sc
i.) USA, 77, 4505(1980)〕があげられる。培地のpＨは
約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃
〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や
撹拌を加える。

【００２１】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えば約０.２〜２０％好ましく
は約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエ
ンス(Science)，122, 501(1952)〕，ＤＭＥ培地〔ヴィ
ロロジー(Virology), 8, 396(1959)〕，ＲＰＭＩ１６
４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション(The Journal of the American
Medical Association)，199, 519(1967)〕，１９９培
地〔プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of t
he Society for the Biologcal Medicine)，73, 1 (195
0)〕などがあげられる。pＨは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約３０〜４０℃、培養時間は約１５〜
６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００２２】融合蛋白質は、上記形質転換体を培養し、
培養物中に該融合蛋白質を生成，蓄積せしめ、これを採
取することにより製造することができる。培地として
は、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミ
ラー，J.，エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジ
ェネテイクス(Experiments in Molecular Genetics)，
４３１−４３３(Cold Spring Horbor Laboratort，New
York１９７２)〕，２×ＹＴ培地〔メシング，メソッド
・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)，
１０１，２０(１９８３)〕ＬＢ培地などがあげられる。

【００２３】培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時
間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。λc
Ｉtsリプレッサーと、λＰ_L−プロモーターを含有する
発現ベクターとを有する組換え体を使用する場合には、
培養は約１５〜３６℃好ましくは約３０℃〜３６℃の温
度で行い、λc Ｉtsリプレッサーの不活化は約３７℃〜
４２℃で行うのが好ましい。またrecＡプロモーターを
より効率良く働かせるため、すなわちrecＡ遺伝子発現
抑制機能を低下せしめるため、必要によりマイトマイシ
ンＣ，ナルジキシン酸などのような薬剤を添加したり、
紫外線を照射する、あるいは培養液のｐＨをアルカリ側
に変化させてもよい。Ｔ７プロモーターの系を用いてい
る場合には、(１)lacプロモーターの下流に連結されて
いるＴ７遺伝子(ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子)を発現させ
る時はＩＰＴＧなどを添加する、もしくは(２)λＰ_Lプ
ロモーターの下流に連結されているＴ７遺伝子（ＲＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子）を発現させる時は培養の温度を上
昇させることなどにより、生成するＴ７ファージＲＮＡ
ポリメラーゼ１により特異的にＴ７プロモーターを作動
させる。

【００２４】培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば
緩衝液に懸濁したのち、例えば、蛋白変性剤処理，超音
波処理やリゾチームなどの酵素処理，グラスビーズ処
理，フレンチプレス処理，凍結融解処理などを行って菌
体を破砕し、遠心分離など公知の方法によって上清を得
る。上記により得られた上清から、融合蛋白質を単離す
るには、通常知られている蛋白質の精製法に従えばよ
い。例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフィ
ー，吸着クロマトグラフィー，高速液体クロマトグラフ
ィー，アフイニティークロマトグラフィー，疎水クロマ
トグラフィー，電気泳動等を適切に組み合せて行うこと
ができる。ここに得られる該融合蛋白質のＮ末端には翻
訳開始コドンに由来するメチオニンが付加している場合
がある。また、該融合蛋白質は、精製することなく、あ
るいは部分精製の状態で、次の反応工程に進んでもよ
い。次に、このようにして得られる融合蛋白質やペプチ
ドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断
反応に付す。該切断反応としては、例えば、Ｓ−シアノ
化反応次いで加水分解反応があげられる。アペリンのア
ミドまたはその塩を最終物として得る場合には、該切断
反応としては、例えば、Ｓ−シアノ化反応次いでアンモ
ノリシスを行うことがあげられる。該Ｓ−シアノ化反応
は、原料化合物に、Ｓ−シアノ化試薬を作用させること
により行なう。

【００２５】Ｓ−シアノ化試薬としては例えば２−ニト
ロ−５−チオシアノ安息香酸(ＮＴＣＢ)，１−シアノ−
４−ジメチルアミノピリジウム塩(ＤＭＡＰ−ＣＮ)，Ｃ
Ｎ^-イオンなどがあげられる。該Ｓ−シアノ化試薬の量
は、全チオール基の約２倍から５０倍量であればよい。
より好ましくは約５倍〜１０倍量であればよい。反応温
度は約０゜〜８０℃の間であれば、いずれでもよく、約
０゜〜５０℃の間がより好ましい。用いる溶媒として
は、Ｓ−シアノ化試薬と反応しないものであれば、いず
れの緩衝液でもよいが、例えば、トリス−塩酸緩衝液，
トリス−酢酸緩衝液，リン酸緩衝液，ホウ酸緩衝液，な
どがあげられる。また、有機溶媒は、Ｓ−シアノ化試薬
と反応しないものであれば、存在していてもよい。該反
応は、pＨ１〜１２の間で行なうのが良い。特に、ＮＴ
ＣＢを用いる場合にはpＨ７〜１０，ＤＭＡＰ−ＣＮを
用いる場合にはＳ−Ｓ交換反応を防止するため、pＨ２
〜７の間が好ましい。また、反応液中には、塩酸グアニ
ジン等の変性剤が存在していてもよい。

【００２６】上記加水分解反応としては、例えばアルカ
リ処理に付すことがあげられる。該アルカリ処理として
は、原料化合物を含有する水溶液のpＨを７〜１４に、
調整することにより行なわれる。該pＨの調整は、例え
ば水酸化ナトリウム，アンモニア，アミノ化合物，トリ
ツマベース（トリス〔ヒドロキシメチル〕−アミノメタ
ン），リン酸第２ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化
バリウム等の溶液を原料化合物を含有する水溶液に適当
量加えて行うが特に水酸化ナトリウムなどが好ましい。
上記反応の際の溶液の濃度としては、たとえば水酸化ナ
トリウムの場合は約０.０１〜２Ｎ好ましくは約０.０５
〜１Ｎ、アンモニアまたはアミノ化合物の場合は約０.
０１〜１５Ｎ好ましくは約０.１〜３Ｎ、トリツマベー
スの場合は約１mＭ〜１Ｍ好ましくは約２０mＭ〜２００
mＭ、リン酸第２ナトリウムの場合は約１mＭ〜１Ｍ好ま
しくは約１０mＭ〜１００mＭ、水酸化カリウムの場合は
約０.０１〜４Ｎ好ましくは約０.１〜２Ｎがあげられ
る。反応温度は約−２０℃〜８０℃の間であればいずれ
でもよく、約−１０℃〜５０℃の間がより好ましい。

【００２７】反応時間は、好ましくは、Ｓ−シアノ化反
応は約１〜６０分好ましくは約１５〜３０分が、加水分
解反応は約５分〜１００時間好ましくは１０分〜１５時
間が、アンモノリシスは約５分〜２４時間好ましくは約
１０〜１８０分があげられる。上記のＳ−シアノ化また
は加水分解により、〔図１〕に示される反応が起こると
考えられる。〔図１〕において、ＸはＲ¹−(ＮＲ²)−
（式中、Ｒ¹およびＲ²は同一または異なって、(i)水
素、(ii)Ｃ_1-20アルキル，Ｃ_3-8シクロアルキル，Ｃ
_6-14アリール(aryl)またはＣ_6-14アリール−Ｃ_1-3アル
キル（これらは置換基を有していないかあるいは１〜３
個のアミノ基，水酸基などを炭素原子上に有していても
よい）、(iii)置換されていてもよいアミノ、(iv)水酸基
またはＣ_1-6アルコキシ基を示す。）またはＯＨを示
す。上記Ｃ_1-20アルキルの例としては、例えば、メチ
ル，エチル，プロピル，イソプロピル，ブチル，sec-ブ
チル，ペンチル，イソペンチル，ネオペンチル，１−エ
チルペンチル，ヘキシル，イソヘキシル，ヘプチル，オ
クチル，ノナニル，デカニル，ウンデカニル，ドデカニ
ル，テトラデカニル，ペンタデカニル，ヘキサデカニ
ル，ヘプタデカニル，オクタデカニル，ノナデカニルお
よびエイコサニルなどがあげられる。上記Ｃ_3-8シクロ
アルキルの例としては、例えば、シクロプロピル，シク
ロブチル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロヘ
プチル，シクロオクチルなどがあげられる。上記Ｃ_6-14
アリールの例としては、フェニル，ナフチル，アンスリ
ル，フェナンスリル，アセナフチレニルなどがあげられ
る。上記Ｃ_6-14アリール−Ｃ_1-3アルキルの例として
は、例えばベンジル，フェネチル，３−フェニルプロピ
ル，(１−ナフチル)メチル，(２−ナフチル)メチルなど
があげられる。上記Ｃ_1-6アルコキシの例としては、例
えばメトキシ，エトキシ，プロポキシ，ブトキシ，ペン
チルオキシ，ヘキシルオキシなどがあげられる。

【００２８】上記(iii)の置換されていてもよいアミノ
の置換基の例としては、例えばアミノ酸，２〜１０個の
アミノ酸からなるペプチドなどがあげられる。上記アミ
ノ酸としては、Ｌ−体でもＤ−体でもよく、その例とし
ては、例えば、Ala，Arg，Asp，Asn，Glu，Gln，Gly，H
is，Ile，Met，Leu，Lys, Phe，Pro,Ser,Thr, Trp, Ty
r, Val などがあげられる。上記ペプチドの例として
は、例えば、H-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅，H-Val-Ala
-Leu-D-Ala-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-OH などがあげら
れる。該反応において、アンモニアまたはアミノ化合物
を用いた場合には、対応するアミド体が得られる。

【００２９】切り出された目的ペプチドを単離するに
は、通常知られているペプチドの精製法に従がえばよ
い。例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフィ
ー，高速液体クロマトグラフィー，アフイニティークロ
マトグラフィー，疎水クロマトグラフィー，薄層クロマ
トグラフィー，電気泳動等を適宜組み合せて行うことが
できる。ここで得られる目的ペプチドのＮ末端には翻訳
開始コドンに由来するメチオニンが付加している場合が
あるが、下記に詳述される方法に準じて、例えば、グリ
オキシル酸などのα−ジケトン類を反応（好ましくは、
硫酸銅などの遷移金属イオンとピリジンなどの塩基の存
在下に反応）させた後、ｏ−フェニレンジアミンなどの
ジアミン類を用いて加水分解することによりＮ末端のメ
チオニンを除去することも可能である。

【００３０】〔アペリンのＮ末端のメチオニンの除去方
法〕本明細書において、酸化されていてもよいメチオニ
ン残基は、メチオニン残基またはそのＳ酸化体を示し、
メチオニン残基のＳ酸化体としては、スルホキシドおよ
びスルホン体が挙げられる。Ｎ末端に酸化されていても
よいメチオニン残基を有するアペリンとしては、式 CH₃-S(O)_m-(CH₂)₂-CH(NH₂)-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアペリンの
ペプチド鎖を示す。］で表されるペプチドが挙げられ、
これらは塩を形成してもよく、塩としては、上記したア
ペリンの塩と同様のものが挙げられる。Ｎ末端に酸化さ
れていてもよいメチオニン残基を有するアペリンまたは
その塩は、遺伝子工学的に製造されたＮ末端に酸化され
ていてもよいメチオニン残基を有するアペリンまたはそ
の塩であることが好ましい。

【００３１】上記式中、ｍとしては０が好ましい。ま
た、Ｘで示されるアペリンのペプチド鎖としては上記し
たアペリンが挙げられる。上記のアペリンまたはその塩
は、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン（Ｍｅ
ｔ）残基または該メチオニン残基のジケトン体の除去工
程に付す前あるいは後にリフォールディング（活性化、
再生化）を行うことができる。

【００３２】本明細書において、Ｎ末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基のジケトン体を有するアペリン
またはその塩とは、式 CH₃-S(O)_m-(CH₂)₂-CO-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアペリンの
ペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩を示
す。Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジ
ケトン体を有するアペリンまたはその塩は、化学反応ま
たは酵素反応等各種反応により得ることができる。例え
ば、N末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有
するアペリンまたはその塩をα−ジケトン類と反応させ
るアミノ基転移反応により、Ｎ末端に酸化されていても
よいメチオニン残基のジケトン体を有するアペリンまた
はその塩を得ることができる。本明細書において、α−
ジケトン類は、上記したアペリンまたはその塩のアミノ
基転移反応を進行させうるものであれば何れでもよく、
例えば式Ｒ¹−ＣＯ−ＣＯ−Ｒ²［式中、Ｒ¹は水素また
はカルボキシル基で置換されていてもよい低級アルキル
もしくはフェニル基（好ましくは水素またはメチル、さ
らに好ましくは水素）を示し、Ｒ²は水酸基、低級アル
コキシ基または低級アルキルで置換されていてもよいア
ミノ基（好ましくは水酸基）を示す。］で表される化合
物またはその塩などが挙げられる。上記式中、Ｒ¹で示
される低級アルキル基としては、メチル、エチル、プロ
ピル、ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブ
チル、ｔ−ブチルなどの炭素数１ないし６程度のアルキ
ル基などが挙げられ、Ｒ²で示される低級アルコキシ基
としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉ−プロ
ポキシ、ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、
ｔ−ブトキシなどの炭素数１ないし６程度のアルコキシ
基などが挙げられる。また、Ｒ²で示される低級アルキ
ルで置換されていてもよいアミノ基としては、前記した
Ｒ¹で示される低級アルキル基を１ないし２個有してい
てもよいアミノ基などが挙げられる。さらに、塩として
は、上記したＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するアペリンの塩と同様なものが挙げられる。
α−ジケトン類の具体例としては、グリオキシル酸、ピ
ルビン酸、オキサル酢酸、フェニルグリオキシル酸、２
−オキソグルタル酸などが挙げられるが、なかでも、グ
リオキシル酸が好ましく用いられる。α−ジケトン類は
塩を形成していてもよく、ナトリウム塩、カリウム塩な
どのアルカリ金属塩、塩酸塩などの無機酸の塩などがあ
げられる。

【００３３】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するアペリンまたはその塩とα−ジケトン類と
のアミノ基転移反応は、通常、アペリンまたはその塩１
モルに対して、１ないし１万モル（好ましくは２０００
ないし４０００モル）程度のα−ジケトン類を、約０な
いし７０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約１０
分ないし５時間（好ましくは約２０分ないし２時間）反
応させるのが好ましい。上記したアミノ基転移反応を阻
害しないものであれば何れの緩衝液（例、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）を用いてもよい
が、なかでも、酢酸緩衝液が好ましく用いられる。ま
た、反応のｐＨは、約２ないし９、なかでも、約４ない
し７、とりわけ、約５ないし６に調整して反応を進行さ
せるのがよい。該アミノ基転移反応を促進するため、遷
移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させるこ
とが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対して、
０.００１ないし０.１モル（好ましくは０.０１ないし
０.０５モル）程度の遷移金属イオンを用いるのが好ま
しい。遷移金属イオンとしては、例えば、銅イオン（Cu
⁺，Cu²⁺）、コバルトイオン（Co²⁺，Co³⁺）、ニッケル
イオン（Ni²⁺，Ni³⁺）、鉄イオン（Fe²⁺，Fe³⁺）、亜鉛
イオン（Zn²⁺）、アルミニウムイオン（Al³⁺）、マンガ
ンイオン（Mn²⁺など）、ガリウムイオン（Ga³⁺）、イン
ジウムイオン（In³⁺）、マグネシウムイオン（Mg²⁺）、
カルシウムイオン（Ca²⁺）などを用いることができる
が、なかでも、銅イオン、コバルトイオンなど、とりわ
け、銅イオン（Cu²⁺）が好ましく用いられる。これらの
遷移金属イオンは、通常、硫酸、硝酸、塩酸、過塩素酸
などの無機酸との塩または酢酸、シュウ酸、クエン酸、
炭酸などの有機酸との塩として、反応溶媒に添加するこ
とができ、なかでも、硫酸銅、酢酸銅、とりわけ、硫酸
銅が好ましく用いられる。

【００３４】また、塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類１モル
に対して、０.１ないし２０モル（好ましくは０.５ない
し１０モル）程度の塩基を用いるのが好ましい。塩基と
しては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン
などのアルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、
ピリジン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミ
ノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類など
を用いることができるが、なかでも、ピリジンが好まし
く用いられる。また、アミノ基転移反応の際に、Ｎ末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するアペリ
ンまたはその塩、および該アペリンまたはその塩のアミ
ノ基転移反応で得られるメチオニン残基のジケトン体を
有するアペリンまたはその塩の沈殿防止などを目的とし
て、アミノ基転移反応のための緩衝液中に尿素を添加す
ることが好ましい。例えば、緩衝液中に尿素を好ましく
は約１ないし８Ｍ、より好ましくは約３ないし６Ｍの濃
度になるよう添加することが好ましい。

【００３５】さらに、上記したアミノ基転移反応は、遷
移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることが好ましく、実用的には、遷移金属イオ
ン、塩基およびα−ジケトン類の３成分（例えば、硫酸
銅、ピリジンおよびグリオキシル酸など）を含有する混
合液を、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
を有するアペリンまたはその塩を含有する水溶液に添加
して、アミノ基転移反応を進行させる。該アミノ基転移
反応により得られる、式 CH₃-S(O)_m-(CH₂)₂-CO-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアペリンの
ペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩（メ
チオニン残基のジケトン体を有するアペリンまたはその
塩）は、ペプチドまたは蛋白質の公知精製手段、例え
ば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィーな
どにより、反応溶液から単離・精製することもできる
が、そのまま次の加水分解反応に付すこともできる。ア
ミノ基転移反応で得られたメチオニンのジケトン体を有
するアペリンまたはその塩は、通常、塩基による加水分
解反応に付して、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオ
ニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有し
ていないアペリンまたはその塩に変換することができ
る。

【００３６】加水分解反応に用いる塩基としては、例え
ば、システアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミ
ンなどのアルキルアミン類またはその塩、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−
（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香
族アミン類またはその塩、ｏ−フェニレンジアミン、ト
リレン−３，４−ジアミン、３,４−ジアミノ安息香酸
およびそのＮ−アルキル置換体（例えば、Ｎ−メチル−
１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エチル−１，２−フ
ェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル−１，２−フェニ
レンジアミンなど）、２,３−ジアミノフェノール、４
−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンなどのジアミン類
（好ましくは芳香族ジアミン類、なかでも、３，４−ジ
アミノ安息香酸およびそのＮ−アルキル置換体（例え
ば、Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エ
チル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル
−１，２−フェニレンジアミンなど）またはそれらの塩
など、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバジ
ド、フェニルチオセミカルバジドなどのチオセミカルバ
ジド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカ
ルバジドなどのセレノセミカルバジド類などのアミン類
またはその塩などを用いることができるが、なかでも、
アミン類、とりわけ、ジアミン類またはチオセミカルバ
ジド類またはそれらの塩が好ましく用いられ、特に、
３,４−ジアミノ安息香酸またはその塩が好ましく用い
られる。加水分解反応に用いられる塩基の塩としては、
例えば上記のＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するアペリンの塩と同様のものなどがあげられ
る。

【００３７】塩基の量は、通常、メチオニン残基のジケ
トン体を有するアペリンまたはその塩１モルに対して約
１ないし１万モル、好ましくは約２００ないし３０００
モル、より好ましくは約５００ないし３０００モルであ
る。加水分解反応は、通常、約０ないし７０℃（好まし
くは約２０ないし４０℃）で約１時間ないし７日間（好
ましくは約１０時間ないし５日間）で進行させるのが好
ましい。反応には、緩衝液を溶媒として用いることが好
ましく、緩衝液としては、例えば、リン酸系緩衝液、酢
酸系緩衝液、クエン酸系緩衝液、ぎ酸系緩衝液などが挙
げられる。上記した加水分解反応を阻害しないものであ
れば何れの緩衝液を用いてもよいが、なかでも、酢酸−
ぎ酸ナトリウム、ぎ酸−ぎ酸ナトリウムまたはぎ酸−酢
酸ナトリウム緩衝液などのぎ酸系緩衝液が好ましく用い
られる。また、反応のｐＨは、約２ないし９、なかで
も、約３ないし７、とりわけ、約４ないし６に調整し
て、反応を進行させるのがよい。これらの緩衝液は、好
ましくは約０．１〜８mol/L、より好ましくは約０．５
〜６mol/L用いられる。また、加水分解の際に、Ｎ末端
の酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を
有するアペリンまたはその塩および加水分解反応により
生成する該メチオニン残基を有していないアペリンまた
はその塩の沈殿防止等を目的として、加水分解反応のた
めの緩衝液中に尿素を添加することが好ましい。例え
ば、緩衝液中に尿素を、好ましくは約１ないし６Ｍ、よ
り好ましくは約２ないし５Ｍの濃度になるよう添加する
ことが好ましい。このようにして得られるアペリンまた
はその塩は、公知の精製手段、例えば、抽出、塩析、分
配、再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液
から単離・精製することもできるが、好ましい例とし
て、例えば、ＳＰ−セファロース（ファルマシアバイ
オテク(株)）あるいは、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー
(株)）を介したイオン交換クロマトグラフィーなどによ
る精製法が挙げられる。

【００３８】得られるアペリンは、必要によりこれを凍
結乾燥により粉末とすることもできる。凍結乾燥に際し
ては、ソルビトール，マンニトール，デキストロース，
マルトース，トレハロース，グリセロールなどの安定化
剤を加えることができる。

【００３９】本発明の方法で製造されるアペリンまたは
その塩は滅菌水，ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)，生理食
塩水その他公知の生理学的に許容される担体と混合する
ことができ、哺乳動物（例、ヒト）に対して非経口的に
又は局所に投与することができる。たとえば、その１日
投与量は１人あたり、約０.０１mg−５０mg、好ましく
は、約０.１mg−１０mgを、静注または筋注などにより
非経口的に投与することができる。本発明の方法で製造
されるアペリンまたはその塩を含有する製剤は、塩，希
釈剤，アジュバント，他の担体，バッファー，結合剤，
界面活性剤，保存剤のような生理的に許容される他の活
性成分も含有していてもよい。非経口的投与製剤は、滅
菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との懸濁液アン
プル、または生理学的に許容される希釈液で用時希釈し
て使用しうる滅菌粉末(通常ペプチド溶液を凍結乾燥し
て得られる)アンプルとして提供される。

【００４０】本発明の製造法によって得られるアペリン
は中枢神経機能調節作用、循環機能調節作用、免疫機能
調節作用、消化器機能調節作用、代謝機能調節作用ある
いは生殖器機能調節作用などに関与していることから、
たとえば老人性痴呆、脳血管性痴呆、系統変成型の退行
変成疾患（例：アルツハイマー病、パーキンソン病、ピ
ック病、ハンチントン病など）に起因する痴呆、感染性
疾患（例：クロイツフェルト−ヤコブ病などの遅発ウイ
ルス感染症など）に起因する痴呆、内分泌性・代謝性・
中毒性疾患（例：甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠
乏症、アルコール中毒、各種薬剤・金属・有機化合物に
よる中毒など）に起因する痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫
瘍など）に起因する痴呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下
血腫など）に起因する痴呆などの痴呆、鬱病、多動児
（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂
症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害（例：巨人症、末端
肥大症など）、過食症、多食症、高コレステロール血
症、高グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血
症、低血糖症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、糖
尿病（例：糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神
経障害、糖尿病性網膜症など）、癌（例：乳癌、リンパ
性白血病、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌など）、膵
炎、腎疾患（例：慢性腎不全、腎炎など）、ターナー症
候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚
血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳
変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘
息、てんかん、不妊症、動脈硬化、肺気腫、肺水腫また
は乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤として用いる
ことができる。さらに催眠鎮静剤、手術後の栄養状態改
善剤、昇圧剤、降圧剤などとしても用いることができ
る。加えて、ＨＩＶ感染症、エイズ（ＡＩＤＳ（Acquir
ed Immune Deficiency Syndrome）：後天性免疫不全症
候群）などの治療・予防剤として用いることができる。

【００４１】本明細書および図面において、アミノ酸，
ペプチド，保護基，活性基，その他に関し略号で表示す
る場合、それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ(Commission on B
iochemical Nomenclature)による略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づくものであり、その例を次にあ
げる。また、アミノ酸などに関し光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸Ｇly ：グリシンＡla ：アラニンＶal ：バリンＬeu ：ロイシンＩle ：イソロイシンＳer ：セリンＴhr ：スレオニンＭet ：メチオニンＧlu ：グルタミン酸Ａsp ：アスパラギン酸Ｌys ：リジンＡrg ：アルギニンＨis ：ヒスチジンＰhe ：フェニールアラニンＴyr ：チロシンＴrp ：トリプトファンＰro ：プロリンＡsn ：アスパラギンＧln ：グルタミンＣys ：システイン ATP ：アデノシン三リン酸

【００４２】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。［配列番号：１］アペリン−３６のアミノ酸配列を示
す。［配列番号：２］アペリン−３６をコードする遺伝子の
塩基配列を示す。［配列番号：３］ｂＦＧＦＣＳ２３ムテインのアミノ
酸配列を示す。［配列番号：４］式（I）で表される融合蛋白質をコー
ドする遺伝子の断片の塩基配列を示す。［配列番号：５］式（I）で表される融合蛋白質をコー
ドする遺伝子の断片の塩基配列を示す。［配列番号：６］ｈｂＦＧＦムテインＣＳ２３の断片を
コードする遺伝子の塩基配列を示す。［配列番号：７］実施例１においてアペリン−36の構造
遺伝子の調製に用いたプライマーの塩基配列を示す。［配列番号：８］実施例１においてアペリン−36の構造
遺伝子の調製に用いたプライマーの塩基配列を示す。［配列番号：９］実施例１においてアペリン−36の構造
遺伝子の調製に用いたプライマーの塩基配列を示す。［配列番号：１０］実施例１においてアペリン−36の構
造遺伝子の調製に用いたプライマーの塩基配列を示す。［配列番号：１１］実施例１においてアペリン−36の構
造遺伝子の調製に用いたプライマーの塩基配列を示す。［配列番号：１２］実施例１においてアペリン−36の構
造遺伝子の調製に用いたプライマーの塩基配列を示す。

【００４３】

【発明の実施の形態】以下に実施例をあげて、本発明を
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。

【００４４】

【実施例】実施例１ヒトアペリン−36構造遺伝子の調
製図２に示す６種類のＤＮＡ断片（#1,#5：グライナー・
ジャパン社、#2,#6：キコーテック社、#3,#4：アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテク）を用いてアペリン−36
の構造遺伝子を調製した（図３）。 a)DNAオリゴマーのリン酸化 5'末端になるべき#1及び#6を除いた４種類のオリゴマー
各１μgを100 μLのリン酸化反応液［50mM Tris-HCl (p
H7.6), 10mM MgCl₂, 1mM スペルミジン、10mMジチオス
レイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM ATP、1
0ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジー
ン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化を
行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍
量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDN
Aを沈殿させた。 b)DNAフラグメントの連結上記a)で得られたリン酸化DNAフラグメントと#1及び#2
各１μgを合わせ120μLとした。この混合液を80℃で10
分間保った後、室温まで徐冷しアニーリングを行った。
TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 （宝酒造）を用いてラ
イゲーション反応を行った。アニーリング液30 μLにII
液30 μLを加え良く混合した後、I液60 μLを加え、37
℃、１時間反応させ、ライゲーションを行った。フェノ
ール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノール
を加え、ー70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させた。 c)5'末端のリン酸化沈殿をＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA）
10 μLに溶解し、100μLのリン酸化反応液［50mM Tris-
HCl (pH7.6), 10mM MgCl₂, 1mM スペルミジン、10mM ジ
チオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM
ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジ
ーン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化
を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２
倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心で
DNAを沈殿させ、20μLのＴＥ緩衝液に溶解した。

【００４５】実施例２ヒトアペリン−36発現プラスミドの調製 pTB960-2（EP-A-499990：小山ら、ジャーナル・オブ・
バイオテクノロジー、32巻、273頁、１９９４年）をXba
I及びAvaIで消化し、1％アガロース電気泳動を行い約4.
4KbpのDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲ
ン社）を用いて抽出し、25μLのＴＥ緩衝液に溶解し
た。このpTB960-2のXbaI, AvaI断片と上記により調製し
たヒトアペリン−３６の構造遺伝子をTaKaRa DNA Ligat
ion Kit ver.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応
を行った。すなわちpTB960-2のXbaI, AvaI断片溶液1μL
とヒトアペリン−３６の構造遺伝子溶液4μLを混合し、
I液5μLを加え、16℃、30分間反応させ、ライゲーショ
ンを行った。ライゲーション液10 μLを用いてE. coli
JM109コンピテントセル（東洋紡）を形質転換し、10μg
/mLのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、3
7℃で1日培養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニー
を選んだ。この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養し、QI
Aprep8 Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプラスミ
ドpTB960-13を調製した。このヒトアペリン−３６構造
遺伝子部分の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社
モデル377ＤＮＡシークエンサーを用いて確認した。プ
ラスミドpTB960-13を大腸菌BL21(DE3)株（Novagen社）
に形質転換を行い、10μg/mLのテトラサイクリンを含む
ＬＢ寒天培地上に播き、37℃で1日培養し、ヒトアペリ
ン−３６-CS23融合蛋白質発現株BL21(DE3)/pTB960-13を
得た（図４）。この形質転換大腸菌BL21(DE3)/pTB960-1
3は受託番号FERM BP-6590で1998年12月2日付で通産省工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。また19
98年11月11日付で受託番号IFO16220として財団法人発酵
研究所（IFO）に寄託された。

【００４６】実施例３実施例２で得られた形質転換細胞を、５．０ｍｇ／Ｌの
テトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．
５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１Ｌを用い
て、２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培
養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培地
（１．６８％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸
２水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５
％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．
０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．００
０２５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カ
ザミノ酸）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３０
℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００
クレット単位になった時点で、イソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシドの最終濃度が１２ｍｇ／Ｌにな
るように添加し、さらに４時間培養を行った。培養終了
後、培養液を遠心分離し、約６６０ｇの湿菌体を取得
し、−８０℃で凍結保存した。

【００４７】実施例４ヒトアペリン−３６の取得実施例２で得た菌体５５０ｇに１０ｍＭＥＤＴＡ＋１
ｍＭ(p-アミシ゛ノフェニル)メタンスルホニルフルオリト゛塩酸塩（ｐＨ６．
０）溶液１５００ｍｌを加え、超音波処理（ＢＲＡＮＳ
ＯＮＳＯＮＩＦＩＥＲＭＯＤＥＬ４５０）した後、
遠心分離（１００００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）を行った。
上澄液はプールし、沈殿は再び同様の操作を行った。プ
ールした上澄液はｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したAF-Heparin Toyop
earl 650Mカラム(30mmID×500mmL、東ソー)に通液し、
吸着、洗浄した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭリ
ン酸緩衝液＋２ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の段階勾配
で溶出を行い、５３０ｍｌのヒトアペリン−36−ＣＳ２
３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコンミ
ニカセット（ミリポア社）で０．１Ｍ酢酸を加えながら
濃縮を行い、ヒトアペリン−36−ＣＳ２３融合タンパク
質の０．１Ｍ酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度６Ｍ
となるように尿素を添加した後、１−シアノ−４−ジメ
チルアミノピリジニウム塩（ＤＭＡＰ−ＣＮ）３５ｍｇ
を加えて、室温で１５分間反応した。反応終了後、反応
液を１０％酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２
５カラム(46mmID×600mmL、ファルマシア)に通液し、平
衡化に用いた１０％酢酸を６ｍｌ／ｍｉｎの流速で展開
し、Ｓ−シアノ化されたヒトアペリン−36−ＣＳ２３融
合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコンミニカ
セット（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、ヒトアペリ
ン−36−ＣＳ２３融合タンパク質の脱塩液を得た。この
脱塩液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加した後、
さらに、０．０６Ｎ濃度となるように１Ｎ苛性ソーダを
加え、０℃で１５分間反応した。反応終了後、酢酸でｐ
Ｈ６．０に調整し、ヒトアペリン−36を得た。この反応
液を３Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ(21.5mmID×150mmL、東
ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０−４０％Ｂ（Ｂ
＝５０ｍＭリン酸緩衝液＋１ＭＮａＣｌ＋３Ｍ尿素、
ｐＨ６．５）の段階勾配で溶出を行い、ヒトアペリン−
36を画分を得た。このヒトアペリン−36画分を、さらに
０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）で平衡化したＣ４Ｐ
−５０(21.5mmID×300mmL、昭和電工)に通液し、吸着、
洗浄した後、１５−３０％Ｂ（Ｂ：８０％アセトニトリ
ル／０．１％TFA）の段階勾配で溶出を行い、ヒトアペ
リン−36画分をプールした後、凍結乾燥を行い、ヒトア
ペリン−36凍結乾燥粉末を得た。ａ）アミノ酸組成分析アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
Ｎ末端にメチオニンの付加したヒトアペリン−36のＤＮ
Ａ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表
１）。

【００４８】（表１）アミノ酸組成分析１モル当たりのヒトアペリン−36の塩基配列アミノ酸残基数から予測される値Ａｓｘ１．０１Ｔｈｒ１）００Ｓｅｒ１）１．９２Ｇｌｘ３．０３Ｐｒｏ５．７６Ｇｌｙ５．７６Ａｌａ００Ｃｙｓ２）Ｎ．Ｄ．０Ｖａｌ１．０１Ｍｅｔ２．０１Ｉｌｅ００Ｌｅｕ２．０２Ｔｙｒ００Ｐｈｅ１．９２Ｈｉｓ１．０１Ｌｙｓ１．８２Ａｒｇ７．３８Ｔｒｐ０．９１酸加水分解（６Ｎ塩酸−４％チオグリコール酸、１１０℃、２４，４８時間加水分解）１）０時間に外挿した値２）未検出

【００４９】b)Ｎ末端アミノ酸配列分析Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズモデル４７７Ａ）を用いて
決定した。その結果、得られたヒトアペリン−36のＮ末
端にはメチオニンが付加していることのほかはＤＮＡ塩
基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した
（表２）。

【００５０】（表２）Ｎ末端アミノ酸配列検出されたヒトアペリン−36の塩基配列残基Ｎｏ． PTH１）-アミノ酸から予測される (pmol) アミノ酸１Ｍｅｔ (526) ２Ｌｅｕ (648) Ｌｅｕ３Ｖａｌ (513) Ｖａｌ４Ｇｌｎ (437) Ｇｌｎ５Ｐｒｏ (463) Ｐｒｏ６Ａｒｇ (216) Ａｒｇ７Ｇｌｙ (232) Ｇｌｙ８Ｓｅｒ (129) Ｓｅｒ９Ａｒｇ (129) Ａｒｇ１０Ａｓｎ (142) Ａｓｎ１１Ｇｌｙ (185) Ｇｌｙ１２Ｐｒｏ (219) Ｐｒｏ１３Ｇｌｙ (202) Ｇｌｙ１４Ｐｒｏ (188) Ｐｒｏ１５Ｔｒｐ (88) Ｔｒｐ１６Ｇｌｎ (116) Ｇｌｎ１７Ｇｌｙ (120) Ｇｌｙ１８Ｇｌｙ (72) Ｇｌｙ１９Ａｒｇ (56) Ａｒｇ２０Ａｒｇ (40) Ａｒｇ１ｎｍｏｌを用いて分析を行った。１）フェニールチオヒダントイン

【００５１】ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表３）。（表３）Ｃ末端アミノ酸分析Ｃ末端アミノ酸回収率ヒトアペリン−36 （％）Ｐｈｅ３８．６気相ヒドラジン分解法（１００℃、６時間）以上の結果から実施例４で得られたヒトアペリン−36
は、そのＮ末端にメチオニンが付加した分子種（Ｍｅｔ
−ヒトアペリン−36）であることがわかった。

【００５２】実施例５（生物活性測定）実施例４で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−36を用い
て、ＷＯ９９／３３９７６の実施例６に記載の方法
（サイトセンサー）で活性を測定し、合成品と同等の活
性を有することを確認した。

【００５３】実施例６（Ｎ末端のメチオニン残基の除去：その１）実施例４で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−36 ４ｍｇ
を３Ｍ尿素溶液０．８ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ硫酸
銅０．０５ｍｌ、グリオキシル酸０．０４６ｇ、ピリ
ジン０．１ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応
した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリ
ン酸緩衝液(ｐＨ５．５）で平衡化したセファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（10mmID×250mm
L）に通液し、平衡化に用いた溶液を０．５ｍｌ／分の
流速で展開し、Ｍｅｔ−ヒトアペリン−36のジケトン体
画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸、
４Ｍ酢酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、ｏ-フ
ェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加し
て、脱気、窒素ガスシールを行い、２５℃で５日間反応
した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム
（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を
４ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加
していないヒトアペリン−36画分をプールした。プール
したヒトアペリン−36画分をｐＨ６．０に調整し、５０
ｍＭリン酸緩衝液＋０．３ＭＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素
（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（7.5mmID×7
5mmL、東ソー（株））に吸着した後、０−１００％Ｂ
（Ｂ＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋０．３ＭＮａＣｌ＋
２．５Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段階勾配で４０分間、
０．８ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ヒトアペリン−36
画分をプールした。さらに、ヒトアペリン−36を０．１
％ＴＦＡで平衡化したＣ４Ｐ−５０（10mmID×250mm
L、昭和電工（株））に吸着した後、１５−３０％Ｂ
（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階
勾配で４０分間、２ml/分の流速で溶出した。ヒトア
ペリン−36のフラクションをプールした後、凍結乾燥を
行い、ヒトアペリン−36を取得した。ａ）アミノ酸組成分析アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
ヒトアペリン−３６のＤＮＡ塩基配列から予想されるア
ミノ酸組成と一致した（表４）。

【００５４】（表４）アミノ酸組成分析１モル当たりのヒトアペリン−36の塩基配列アミノ酸残基数から予測される値Ａｓｘ１．０１Ｔｈｒ１）００Ｓｅｒ１）１．８２Ｇｌｘ３．０３Ｐｒｏ５．７６Ｇｌｙ５．６６Ａｌａ００Ｃｙｓ２）Ｎ．Ｄ．０Ｖａｌ１．０１Ｍｅｔ１．０１Ｉｌｅ００Ｌｅｕ２．０２Ｔｙｒ００Ｐｈｅ１．８２Ｈｉｓ１．０１Ｌｙｓ１．８２Ａｒｇ７．２８Ｔｒｐ０．９１酸加水分解（６Ｎ塩酸−４％チオグリコール酸、１１０℃、２４，４８時間加水分解）１）０時間に外挿した値２）未検出

【００５５】b)Ｎ末端アミノ酸配列分析Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズモデル４７７Ａ）を用いて
決定した。その結果、得られたヒトアペリン−36のＤＮ
Ａ塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致し
た（表５）。

【００５６】（表５）Ｎ末端アミノ酸配列検出されたヒトアペリン−36の塩基配列残基Ｎｏ． PTH１）-アミノ酸から予測される (pmol) アミノ酸１Ｌｅｕ (570) Ｌｅｕ２Ｖａｌ (611) Ｖａｌ３Ｇｌｎ (594) Ｇｌｎ４Ｐｒｏ (587) Ｐｒｏ５Ａｒｇ (332) Ａｒｇ６Ｇｌｙ (552) Ｇｌｙ７Ｓｅｒ (255) Ｓｅｒ８Ａｒｇ (277) Ａｒｇ９Ａｓｎ (345) Ａｓｎ１０Ｇｌｙ (383) Ｇｌｙ１１Ｐｒｏ (383) Ｐｒｏ１２Ｇｌｙ (366) Ｇｌｙ１３Ｐｒｏ (318) Ｐｒｏ１４Ｔｒｐ (131) Ｔｒｐ１５Ｇｌｎ (210) Ｇｌｎ１６Ｇｌｙ (218) Ｇｌｙ１７Ｇｌｙ (281) Ｇｌｙ１８Ａｒｇ (130) Ａｒｇ１９Ａｒｇ (190) Ａｒｇ２０Ｌｙｓ (144) Ｌｙｓ 1nmolを用いて分析を行った。１）フェニールチオヒダントイン

【００５７】ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表６）。（表６）Ｃ末端アミノ酸分析Ｃ末端アミノ酸回収率ヒトアペリン−36 （％）Ｐｈｅ６６．３気相ヒドラジン分解法（１００℃、６時間）

【００５８】実施例７（生物活性測定）実施例６で取得したヒトアペリン−36を用いて、ＷＯ
９９／３３９７６の実施例６に記載の方法（サイトセン
サー）で活性を測定し、合成品と同等の活性を有するこ
とを確認した。

【００５９】実施例８ (Ｎ末端のメチオニン残基の除去：その２) 実施例４で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−３６４ｍ
ｇを３Ｍ尿素溶液０．８ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ硫
酸銅０．０５ｍｌ、グリオキシル酸０．０４６ｇ、ピ
リジン０．１ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反
応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭ
リン酸緩衝液(ｐＨ５．５）で平衡化したセファデック
ス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（10mmID×250m
mL）に通液し、平衡化に用いた溶液を０．５ｍｌ／分の
流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するヒ
トアペリン−３６画分をプールした。続いてこの画分に
等量の２Ｍギ酸ナトリウム、４Ｍ酢酸、３Ｍ尿素溶液を
加えた後、３，４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度に
なるように添加し、３０℃で３日間反応した。反応終了
後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平
衡化したセファデックスＧ−２５カラム（25mmID×600m
mL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を４ｍｌ／分の流
速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していないヒ
トアペリン−３６画分をプールした。プールしたヒトア
ペリン−３６画分をｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭリン
酸緩衝液＋０．３ＭＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ
５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（7.5mmID×75mmL、
東ソー（株））に吸着した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５
０ｍＭほう酸緩衝液＋０．３ＭＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿
素、ｐＨ９．０）の段階勾配で４０分間、０．８ｍｌ／
分の流速で溶出を行い、ヒトアペリン−３６画分をプー
ルした。さらに、ヒトアペリン−３６を０．１％ＴＦＡ
で平衡化したＣ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭和電
工（株））に吸着した後、１５−３０％Ｂ（Ｂ＝８０％
アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分
間、２ml/分の流速で溶出した。ヒトアペリン−３６
のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ヒト
アペリン−３６を取得した。ａ）アミノ酸組成分析アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
ヒトアペリン−３６のＤＮＡ塩基配列から予想されるア
ミノ酸組成と一致した（表７）。

【００６０】（表７）アミノ酸組成分析１モル当たりのヒトアペリン−36の塩基配列アミノ酸残基数から予測される値Ａｓｘ１．０１Ｔｈｒ１）００Ｓｅｒ１）１．９２Ｇｌｘ２．９３Ｐｒｏ６．３６Ｇｌｙ５．９６Ａｌａ００Ｃｙｓ２）Ｎ．Ｄ．０Ｖａｌ１．０１Ｍｅｔ１．０１Ｉｌｅ００Ｌｅｕ２．０２Ｔｙｒ００Ｐｈｅ１．９２Ｈｉｓ１．０１Ｌｙｓ１．９２Ａｒｇ７．６８Ｔｒｐ０．９１酸加水分解（６Ｎ塩酸−４％チオグリコール酸、１１０℃、２４，４８時間加水分解）１）０時間に外挿した値２）未検出

【００６１】b)Ｎ末端アミノ酸配列分析Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズモデル４７７Ａ）を用いて
決定した。その結果、得られたヒトアペリン−３６のＤ
ＮＡ塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致
した（表８）。

【００６２】（表８）Ｎ末端アミノ酸配列検出されたヒトアペリン−36の塩基配列残基Ｎｏ． PTH１）-アミノ酸から予測される (pmol) アミノ酸１Ｌｅｕ (475) Ｌｅｕ２Ｖａｌ (845) Ｖａｌ３Ｇｌｎ (365) Ｇｌｎ４Ｐｒｏ (563) Ｐｒｏ５Ａｒｇ (425) Ａｒｇ６Ｇｌｙ (424) Ｇｌｙ７Ｓｅｒ (139) Ｓｅｒ８Ａｒｇ (423) Ａｒｇ９Ａｓｎ (245) Ａｓｎ１０Ｇｌｙ (290) Ｇｌｙ１１Ｐｒｏ (197) Ｐｒｏ１２Ｇｌｙ (234) Ｇｌｙ１３Ｐｒｏ (197) Ｐｒｏ１４Ｔｒｐ (101) Ｔｒｐ１５Ｇｌｎ ( 76) Ｇｌｎ１６Ｇｌｙ ( 84) Ｇｌｙ１７Ｇｌｙ (130) Ｇｌｙ１８Ａｒｇ ( 79) Ａｒｇ１９Ａｒｇ (116) Ａｒｇ２０Ｌｙｓ ( 43) Ｌｙｓ 1nmolを用いて分析を行った。１）フェニールチオヒダントイン

【００６３】ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表９）。（表９）Ｃ末端アミノ酸分析Ｃ末端アミノ酸回収率ヒトアペリン−36 （％）Ｐｈｅ８６．６気相ヒドラジン分解法（１００℃、６時間）

【００６４】実施例９（生物活性測定）実施例８で取得したヒトアペリン−３６を用いて、ＷＯ
９９／３３９７６の実施例６に記載の方法（サイトセ
ンサー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の合成品
と同等の活性を有することを確認した。

【００６５】

【配列表】 [SEQUENCE LISTING] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Method of Production for Apelin <130> A99276 <150> JP 10-352389 <151> 1998-12-11 <150> PCT/JP99/05456 <151> 1999-10-04 <160> 12 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Human <400> 1 Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly 1 5 10 15 Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly 20 25 30 Pro Met Pro Phe 35 <210> 2 <211> 108 <212> DNA <213> Human <400> 2 CTGGTGCAGC CCAGAGGGTC AAGGAATGGG CCAGGGCCCT GGCAGGGAGG TCGGAGGAAA 60 TTCCGCCGCC AGCGGCCCCG CCTCTCCCAT AAGGGACCCA TGCCTTTC 108 <210> 3 <211> 146 <212> PRT <213> Human <400> 3 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr 100 105 110 Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser 115 120 125 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 145 <210> 4 <211> 111 <212> DNA <213> Human <400> 4 CTGGTGCAGC CCAGAGGGTC AAGGAATGGG CCAGGGCCCT GGCAGGGAGG TCGGAGGAAA 60 TTCCGCCGCC AGCGGCCCCG CCTCTCCCAT AAGGGACCCA TGCCTTTCTG C 111 <210> 5 <211> 111 <212> DNA <213> Human <400> 5 CTGGTGCAGC CCAGAGGGTC AAGGAATGGG CCAGGGCCCT GGCAGGGAGG TCGGAGGAAA 60 TTCCGCCGCC AGCGGCCCCG CCTCTCCCAT AAGGGACCCA TGCCTTTCTG T 111 <210> 6 <211> 432 <212> DNA <213> Human <400> 6 CCCGAGGATG GCGGCAGCGG CGCCTTCCCG CCCGGCCACT TCAAGGACCC CAAGCGGCTG 60 TACTGCAAAA ACGGGGGCTT CTTCCTGCGC ATCCACCCCG ACGGCCGAGT TGACGGGGTC 120 CGGGAGAAGA GCGACCCTCA CATCAAGCTA CAACTTCAAG CAGAAGAGAG AGGAGTTGTG 180 TCTATCAAAG GAGTGAGCGC TAATCGTTAC CTGGCTATGA AGGAAGATGG AAGATTACTA 240 GCTTCTAAGT CTGTTACGGA TGAGTGTTTC TTTTTTGAAC GATTGGAATC TAATAACTAC 300 AATACTTACC GGTCAAGGAA ATACACCAGT TGGTATGTGG CACTGAAACG AACTGGGCAG 360 TATAAACTTG GATCCAAAAC AGGACCTGGG CAGAAAGCTA TACTTTTTCT TCCAATGTCT 420 GCTAAGAGCT GC 432 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 CTAGAAAGGA GATATCATAT GCTGGTTCAA CCGCGTGGTT CT 42 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 CGTAATGGTC CGGGTCCATG GCAAGGTGGT CGTCGTAAAT TTCGTC 46 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 GTCAACGTCC GCGTCTGTCT CATAAAGGTC CGATGCCGTT TTGCC 45 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 GACCATTACG AGAACCACGC GGTTGAACCA GCATATGATA TCTCCTTT 48 <210> 11 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 GGACGTTGAC GACGAAATTT ACGACGACCA CCTTGCCATG GACCCG 46 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 TCGGGGCAAA ACGGCATCGG ACCTTTATGA GACAGACGC 39

【００６６】

【発明の効果】本発明の製造方法を用いると、たとえば
老人性痴呆、脳血管性痴呆、系統変成型の退行変成疾患
（例：アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、
ハンチントン病など）に起因する痴呆、感染性疾患
（例：クロイツフェルト−ヤコブ病などの遅発ウイルス
感染症など）に起因する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒
性疾患（例：甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏
症、アルコール中毒、各種薬剤・金属・有機化合物によ
る中毒など）に起因する痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫瘍
など）に起因する痴呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下血
腫など）に起因する痴呆などの痴呆、鬱病、多動児（微
細脳障害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂症、
恐怖症、成長ホルモン分泌障害（例：巨人症、末端肥大
症など）、過食症、多食症、高コレステロール血症、高
グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、低血
糖症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、糖尿病
（例：糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障
害、糖尿病性網膜症など）、癌（例：乳癌、リンパ性白
血病、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌など）、膵炎、
腎疾患（例：慢性腎不全、腎炎など）、ターナー症候
群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血
発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変
性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘
息、てんかん、不妊症、動脈硬化、肺気腫、肺水腫また
は乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤として用いる
ことができ、さらに催眠鎮静剤、手術後の栄養状態改善
剤、昇圧剤、降圧剤、ＨＩＶ感染症、エイズ（ＡＩＤＳ
（Acquired Immune Deficiency Syndrome）：後天性免
疫不全症候群）などの予防および治療薬などとして用い
ることができるペプチドを工業的かつ大量に製造でき
る。

【００６７】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の反応工程における反応メカニズムを示
す。

【図２】実施例１で用いられたDNAフラグメントを示
す。

【図３】実施例１で得られた２重鎖構成のヒトアペリン
−３６を製造する模式図を示す。

【図４】実施例２で得られたプラスミドｐTB９６０−１
３の構築図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
ペプチドのＮ末端に、Ｎ末端に酸化されていてもよいメ
チオニン残基を有していてもよいアペリンを連結した融
合蛋白質またはペプチドをシステイン残基のアミノ基側
のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とするアペ
リンまたはその塩の製造法。
【請求項２】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
ペプチドのＮ末端に、Ｎ末端にメチオニン残基を有して
いてもよいアペリンを連結した融合蛋白質またはペプチ
ドをコードする遺伝子を有するベクターを保持する形質
転換体を培養して融合蛋白質またはペプチドを発現さ
せ、発現された融合蛋白質またはペプチドをシステイン
残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すこと
を特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していてもよ
いアペリンまたはその塩の製造法。
【請求項３】切断反応がＳ−シアノ化反応、次いで加水
分解反応に付す反応である請求項１または２記載の製造
法。
【請求項４】アペリンが配列番号：１で表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドである請求項１または２
記載の製造法。
【請求項５】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
ペプチドのＮ末端に、Ｎ末端にメチオニン残基を有して
いてもよいアペリンを連結した融合蛋白質またはペプチ
ド。
【請求項６】請求項５記載の融合蛋白質またはペプチド
をコードする遺伝子を有するベクター。
【請求項７】請求項６記載のベクターを含有する形質転
換体。
【請求項８】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するアペリンまたはその塩とα−ジケトン類を
反応させた後、加水分解することを特徴とする該メチオ
ニン残基の除去方法。
【請求項９】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するアペリンが遺伝子工学的に製造されたアペ
リンである請求項８記載の方法。
【請求項１０】遷移金属イオンの存在下にα−ジケトン
類を反応させることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】塩基の存在下にα−ジケトン類を反応さ
せることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】遷移金属イオンおよび塩基の存在下にα
−ジケトン類を反応させることを特徴とする請求項８記
載の方法。
【請求項１３】α−ジケトン類がグリオキシル酸または
その塩である請求項８記載の方法。
【請求項１４】遷移金属イオンが銅イオンである請求項
１０記載の方法。
【請求項１５】塩基がピリジンである請求項１１記載の
方法。
【請求項１６】塩基を用いて加水分解することを特徴と
する請求項８記載の方法。
【請求項１７】塩基がアミン類である請求項１６記載の
方法。
【請求項１８】塩基がジアミン類またはチオもしくはセ
レノセミカルバジド類である請求項１６記載の方法。
【請求項１９】ジアミン類がo−フェニレンジアミンま
たは３，４−ジアミノ安息香酸である請求項１８記載の
方法。
【請求項２０】遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端にメチ
オニンが付加したアペリンまたはその塩とグリオキシル
酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反
応させた後、o−フェニレンジアミンまたは３，４−ジ
アミノ安息香酸と反応させることを特徴とするアペリン
またはその塩の製造法。
【請求項２１】式 CH₃-S(O)_m-(CH₂)₂-CO-CO-X〔式中、
ｍは０ないし２の整数を、Ｘはアペリンのペプチド鎖を
示す。〕で表される化合物またはその塩。
【請求項２２】請求項２１記載の化合物を加水分解する
ことを特徴とするアペリンまたはその塩の製造法。
【請求項２３】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質また
はペプチドのＮ末端に、Ｎ末端にメチオニン残基を有す
るアペリンを連結した融合蛋白質またはペプチドをシス
テイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付
し、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有
するアペリンまたはその塩を得、さらに、該Ｎ末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基を有するアペリンま
たはその塩とα−ジケトン類を反応させた後、加水分解
することを特徴とするアペリンまたはその塩の製造法。