KR20010080015A - Ｎ-말단 메티오닌의 제거방법 - Google Patents

Ｎ-말단 메티오닌의 제거방법 Download PDF

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다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염을, 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨, 또는 포름산 및 아세트산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 상기 메티오닌 잔기의 디케톤체의 제거방법, 및 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 펩티드 또는 그 염의 제조법을 개시한다.

Description

Ｎ-말단 메티오닌의 제거방법{PROCESS FOR ELIMINATING N-TERMINAL METHIONINE}
단백질이 세포내에서 생합성될 때에는, 그 N 말단은 mRNA 의 개시코돈 AUG 에 대응하는 메티오닌에서 시작되고 있음을 알 수 있다. 그러나, 이 메티오닌은 이후의 프로세싱에 의해 제거되기 때문에, 완성된 성숙 단백질분자에는 이미 존재하지 않는 것이 통례이다.
유전자재조합기술의 진보에 의해, 유용한 단백질을 미생물이나 동물세포, 예컨대 대장균을 사용하여 생산할 수 있게 되었으나, 본 수법에 의해 생산되는 단백질에는 상기 메티오닌이 잔존하지 않는 예가 발견되고 있다. 예컨대, 대장균에서 발현시킨 사람 성장호르몬에 있어서 메티오닌의 부가율은 거의 100 % [Nature,293, 408 (1981)] 에 달하며, 인터페론-α에 있어서는 50 % [Journal Of Interferon Research,1, 381 (1981)], 비글리코실화 사람 인터루킨-2 에서는 천연형 사람 인터루킨-2와 마찬가지로 알라닌에서 시작되는 분자종 (rIL-2) 에 더하여 아미노말단에 메티오닌이 더욱 부가된 (N 말단에 메티오닌 잔기를 갖는) 분자종 (Met-rIL-2) 의 존재가 확인되었다.
한편, N 말단의 아미노산을 화학적으로 제거하는 방법으로서는, Dixon 이 1964 년에 DL-알라닐글리신에 글리옥실산, 피리딘, 아세트산구리를 반응시키면 아미노기 전이반응이 일어나서 피루보일글리신이 생성되는 점 [Biochemistry Journal,92, 661 (1964)], 그리고 화합물에 티오세미카르바지드를 반응시키면 아미드결합의 균열이 일어나서 글리신이 생성되는 점을 보고하고 있다 [Biochemistry Journal,90, 2C (1964)]. 이어서, 이 반응을 슈도모나스 사이토크롬 (Pseudomonas cytochrome) c-551 에 응용하여 N 말단 글루타민산이 제거됨을 보고하고 있다 [Biochemistry Journal,94, 463 (1965)].
동일한 단백질이라도, N 말단에 메티오닌이 부가된 분자종과 그렇지 않은 분자종은 단백질의 고차구조, 생물활성, 안정성이 서로 다를 가능성이 있고, 또한 메티오닌의 N 말단으로의 부가가 항원성의 증가를 초래할 가능성도 있을 수 있다고 생각된다. 따라서, 산업이용상의 관점에서 이 개시코돈에 대응하는 N 말단 메티오닌 제거법을 확립하는 것은 의의가 있는 것으로 생각된다.
이 과제를 해결하기 위하여, 브롬화시안 (BrCN) 분해에 의해 메티오닌을 제거하는 방법이 제안 [Science,198, 1056 (1977)] 되어 있는데, 이 경우에는 원하는 성숙 단백질중에 메티오닌 잔기가 존재하지 않음이 전제로 되기 때문에, 과혹한 화학반응을 단백질에 가하는 상기 방법에 의해서는 결코 만족할 만한 결과는 얻을 수 없다.
N 말단에 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 단백질로부터, 펩티드 또는 단백질의 종류에 관계없이, 선택적이고 효율적으로 N 말단의 메티오닌 잔기를 제거할 수 있게 하는 화학적인 방법으로서는, 일본 공개특허공보 평10-72489 호 (EP-A-812856 호) 에 기재된 방법 이외에는 전혀 알려져 있지 않으나, 이 점은 최종생산물로 되는 펩티드 또는 단백질을 변성시키지 않고, 온화한 조건하에서 N 말단의 메티오닌 잔기를 제거할 수 있는 화학적인 반응을 발견하는 것의 어려움에서 기인하는 것으로 생각된다. 특히, 분자량이 비교적 크고, 유전자공학적으로 제조되는 단백질, 그 중에서도 의약으로 사용하는 것을 목적으로 한 단백질로부터, N 말단에 여분으로 부가된 메티오닌을 제거하는 경우, 메티오닌 제거후에 단백질의 활성이 저하되지 않을 것이 요구되기 때문에, 통상 약산성에서 약알칼리의 수용액중에서 가열하지 않고 반응을 진행시킬 필요가 있으며, 화학적인 반응조건으로서는 제한이 많기 때문에 양호한 반응조건을 찾을 수 없는 것이 현실이었다.
발명의 개시
본 발명자들은 유전자공학적으로 제조되는 펩티드 (단백질을 포함함) 에 있어서의 N 말단의 메티오닌 잔기만을 절단하는 것에 의한, 천연형 아미노산서열을 갖는 펩티드의 제조법을 제공하기 위하여 예의 연구한 결과, 하기 반응식 1 로 표시되는 바와 같이 식 (Ⅰ) 로 표시되는 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드에, 예컨대 α-디케톤류인 글리옥실산, 전이금속이온을 공여할 수 있는 황산구리, 염기 (예컨대, 아민류) 인 피리딘을 반응시켜 아미노기 전이반응을 실시함으로써 얻어지는 이 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드에 염기 (예컨대, 디아민류) 인 3,4-디아미노안식향산과, 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨 등의 존재하에 반응시켜 가수분해반응을 실시함으로써, 상기 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드로부터 메티오닌 잔기의 디케톤체를 예상외로 효율적으로 제거할 수 있음을 발견하였다. 즉, 본 발명자들은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드로부터 N 말단의 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 제거하고, 그 활성을 저하시키지 않고 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 펩티드를 예상외로 고수율로 얻는 방법을 발견하고, 더욱 연구를 진행시켜 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
[식 (Ⅰ) 중 m 은 0 내지 2 의 정수를 나타내고, X 는 아미노산 잔기 또는 2 이상의 임의의 아미노산 수를 갖는 펩티드쇄라면 어느 것이라도 좋으나, 실용적인 면에서는 유전자공학적으로 제조된 단백질의 X 에 대응하는 부분의 펩티드쇄를 들 수 있다. 그리고, 본 명세서에 있어서, 단백질 혹은 펩티드라 칭하는 경우, 복수의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 또는 단백질은 비글리코실화 또는 글리코실화 펩티드 또는 단백질 중 어느 하나일 수 있다.]
본 명세서에 있어서는, 상기 반응식 1 중,
일반식 (Ⅰ) 로 대표되는 화합물을「N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드」또는「메티오닌 잔기를 갖는 펩티드」;
일반식 (Ⅰ) 에 있어서
[식중, m 은 상기와 동일한 의미를 가짐]
로 대표되는 부분구조를「산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기」,「메티오닌 잔기」또는「메티오닌」;
일반식 (Ⅱ) 로 대표되는 화합물을「N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드」또는「메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드」;
일반식 (Ⅱ) 에 있어서,
[식중, m 은 상기와 동일한 의미를 가짐]
로 대표되는 부분구조를「산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체」또는「메티오닌 잔기의 디케톤체」; 및
일반식 (Ⅲ) 으로 대표되는 화합물을「N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 펩티드」또는「N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖고 있지 않는 펩티드」라 각각 칭하는 경우가 있다.
즉, 본 발명은
(1) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염을, 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨, 또는 포름산 및 아세트산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 상기 메티오닌 잔기의 디케톤체의 제거방법,
(2) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염이, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염을 α-디케톤류와 반응시킴으로써 얻어지는 펩티드 또는 그 염인 상기 (1) 에 기재된 방법,
(3) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드가 유전자공학적으로 제조된 펩티드인 상기 (2) 에 기재된 방법,
(4) 펩티드가 (ⅰ) 성장호르몬, (ⅱ) 베타셀룰린, (ⅲ) 인터루킨-2, (ⅳ) 뉴로트로핀-3 또는 (ⅴ) 아페린인 상기 (1) 에 기재된 방법,
(5) 펩티드가 성장호르몬인 상기 (1) 에 기재된 방법,
(6) 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨이, pH 약 2 내지 9 에서 약 0.1 내지 8 mol/ℓ의 완충액으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 방법,
(7) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염을, 아세트산 및 포름산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 상기 메티오닌 잔기의 디케톤체의 제거방법,
(8) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염을, 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 펩티드 또는 그 염의 제조법,
(9) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염이, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염을 α-디케톤류와 반응시킴으로써 얻어지는 펩티드 또는 그 염인 상기 (8) 에 기재된 제조법,
(10) 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨이, pH 약 2 내지 9 에서 약 0.1 내지 8 mol/ℓ의 완충액으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 상기 (8) 에 기재된 제조법,
(11) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염을, 아세트산 및 포름산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 펩티드 또는 그 염의 제조법,
(12) 유전자공학적으로 제조되고, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 사람 성장호르몬 또는 그 염을 글리옥실산 또는 그 염과 황산구리 및피리딘의 존재하에 반응시킨 후, 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 사람 성장호르몬 또는 그 염의 제조법,
(13) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염의 상기 메티오닌 잔기를 제거하기 위한, (ⅰ) 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨과 (ⅱ) 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염의 사용,
(14) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염의 상기 메티오닌 잔기의 디케톤체를 제거하기 위한, (ⅰ) 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨과 (ⅱ) 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염의 사용,
(15) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염으로부터, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖지 않는 펩티드 또는 그 염을 제조하기 위한, (ⅰ) 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨과 (ⅱ) 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염의 사용 및
(16) N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염으로부터, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖고 있지 않는 펩티드 또는 그 염을 제조하기 위한, (ⅰ) 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨과 (ⅱ) 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염의 사용에 관한 것이다.
본 발명은, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기 혹은 이 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 (단백질을 포함함) 또는 그 염으로부터 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨, 또는 포름산 및 아세트산나트륨의 존재하, 효율적으로 N 말단의 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기 혹은 이 메티오닌 잔기의 디케톤체를 제거하는 방법 ; 및 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기 혹은 이 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖고 있지 않는 펩티드 또는 그 염의 제조법 등에 관한 것이다.
도 1 은 실시예 4a) 에서 얻어진 전기영동의 결과를 나타낸다. 레인 (Lane) 1 은 분자량 마커를, 레인 (Lane) 2 는 정제 hGH 를 나타낸다.
도 2 는 실시예 16a) 에서 얻어진 전기영동의 결과를 나타낸다. 레인 (Lane) 1 은 분자량 마커를, 레인 (Lane) 2 는 실시예 15 에서 얻어진 BTC 를 나타낸다.
도 3 은 실시예 18a) 에서 얻어진 전기영동의 결과를 나타낸다. 레인 (Lane) 1 은 분자량 마커를, 레인 (Lane) 2 는 실시예 17 에서 얻어진 IL-2 를 나타낸다.
도 4 는 실시예 26 에서 사용된 DNA 프래그먼트를 나타낸다.
도 5 는 실시예 26 에서 얻어진 2 중쇄 구성의 사람 아페린-36 을 제조하는 모식도를 나타낸다.
도 6 은 실시예 27 에서 얻어진 플라스미드 pTB 960-13 의 구축도를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
본 명세서에 있어서 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기는, 메티오닌 잔기 또는 그의 S 산화체를 나타내고, 메티오닌 잔기의 S 산화체로서는 술폭시드 및 술폰체를 들 수 있다.
N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드로서는, 식 CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-X [식중, m 은 0 내지 2 의 정수를 나타내고, X 는 아미노산 잔기 또는 펩티드쇄를 나타낸다.] 로 표시되는 펩티드를 들 수 있는데, 이들은 염을 형성하여도 되며, 염으로서는 본 발명의 반응을 저해하지 않는 것이라면 어떠한 것이어도 되는데, 그 중에서도 약학적으로 허용가능한 염이 바람직하고, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등 무기산과의 염, 아세트산, 프탈산, 푸마르산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 유기산과의 염, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리금속염, 칼슘염 등의 알칼리토류금속염, 암모늄염 등을 들 수 있다.
N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드는, 유전자공학적으로 제조된 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드인 것이 바람직하다.
상기 식중, m 으로서는 0 이 바람직하다. 또한, X 로서는 아미노산의 수가 2 이상인 펩티드쇄가 바람직하다.
본 발명의 펩티드로서는, 아미노산수가 50 미만인 소위 펩티드, 혹은 아미노산수가 50 이상인 소위 단백질 중 어느 하나일 수 있다.
이와 같이 본 명세서에 있어서「펩티드」로 표시되는 용어는, 아미노산수가 50 미만인 분자뿐만 아니라 아미노산수가 50 이상인 분자를 포함하는 것인데, 그 중에서도 아미노산수가 50 이상인 분자 (소위, 단백질) 가 바람직하게 사용된다.
바람직한 펩티드로서는, 아미노산수가 2 내지 1000 인 펩티드, 더욱 바람직하게는 아미노산수가 15 내지 500 인 펩티드를 들 수 있고, 그 구체예로서는 성장호르몬(GH)류 [예컨대, 사람 성장호르몬 (hGH) (예, 20K-hGH, 22K-hGH 등) 등], 베타셀룰린 (BTC), 부갑상선 호르몬 (PTH), 인슐린, 신경성장인자, 뇌유래신경영양인자, 모양체 신경영양인자, 글리아유래 신경영양인자, 뉴로트로핀-3,4 또는 6, 중추신경성장인자, 글리아성장인자, 폐유래 신경영양인자, 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 혈소판유래 성장인자, 트랜스포밍 성장인자 α또는 β, 혈관내피세포 성장인자, 조직·플라스미노겐·액티베타, 유로키나아제, 프로테인 C, 트롬보모듈린, 골형성인자, 칼시토닌, 인슐린양 성장인자, 인터페론-α, β또는 γ, 인터루킨-1(α, β) ∼ 12, 과립 콜로니자극인자, 과립 마크로파지·콜로니 자극인자, 과립 마크로파지 자극인자, 트롬보포이에틴, 에리트로포이에틴, PACAP, 심방성 나트륨이뇨펩티드, 엔도세린, 거핵구성장인자, 혈액간세포 성장인자, 간세포 성장인자, 모틸린, 이뮤노톡신, 종양괴사인자, 히루딘, 코르티코트로핀, 안지오텐신, 안지오텐신2 및 그의 펩티드성 길항약, 안지오텐신3, 브라디키닌류, 브라디키닌 증강인자, α, β또는 γ엔도르핀, 엔케팔린, 호중구 주화성 인자, 가스트린, 글루카곤, 성장호르몬 방출인자, 쿄톨핀, 칼리딘, 성선자극호르몬 방출호르몬, 비만세포 탈과립 펩티드, 멜라닌 세포 자극호르몬, 뉴로텐신, 트립신 저해제, 옥시토신, 프로인슐린 C-펩티드, 세크레틴, 소마토스타틴, 갑상선자극호르몬 방출호르몬, 유비키틴, 유로가스트론, 바소프레신류, 키닌류, 터프트신, 소마토메딘, 코르티코트로핀 방출인자, 인슐린양 성장인자, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, PTHrP, VIP, DHI, 인슐리노트로핀, GRP, CCK-PZ, 갈라닌 (Galanin), 안트럼펩티드 (Antrum Peptide), PPY, 판크레아틱 폴리펩티드 (Pancreatic Polypeptide), PSP, 판크레아스타틴, hCG, hCS, 릴락신, 혈청흉선인자, 싸이모포이에틴, 싸이모신, 팩터-ⅩⅢ, 팩터-Ⅷ, 프로유로키나아제, SOD, 팩터-Ⅶa, 안티트롬빈, 아페린 등의 단백질 및 이들의 뮤테인 (천연형 단백질에 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결손 또는 부가되어, 천연의 단백질과 동등하거나 더 큰 생물학적 또는 면역학적 활성을 나타내는 것) 등, 혹은 화학합성 등에 의해 제조되는 공지 또는 신규의 펩티드 등을 들 수 있으나, 그 중에서도 유전자공학적으로 제조된 펩티드 (단백질을 포함함), 특히 유전자공학적으로 제조된 성장호르몬류 [예컨대, 사람성장호르몬 (hGH) (예, 20K-hGH, 22K-hGH 등) 등], 뉴로트로핀-3, 베타셀룰린, 부갑상선호르몬, 인터루킨-2, 아페린 및 이들의 뮤테인, 특히 성장호르몬류 [예컨대, 사람성장호르몬 (hGH) (예, 20K-hGH, 22K-hGH 등) 등]가 바람직하게 사용된다. 상기 아페린으로서는, 예컨대 Biochem. Biophys. Res. Commun.,251, 471-476 (1998) 에 기재된 사람아페린-36, 사람아페린-13, 아페린-13 의 N 말단의 아미노산 (Gln) 이 피로글루타민산화된 펩티드 등을 들 수 있고, APJ (O'Dowd. B.F., 등, Gene,436, 355-359 (1993)) 에 대하여 리간드활성을 갖는 펩티드라면 어떠한 것이어도 되며, 구체적으로는 예컨대 일본 특허출원 평10-271654 호에 기재된「서열번호 : 3 으로 표시되는 아미노산서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 수용체 단백질에 결합능을 갖는 폴리펩티드」등을 들 수 있다.
상기한 펩티드 (천연형 단백질을 포함함) 는, 어떤 동물종 유래의 것이어도되지만, 실용적으로는 사람유래의 펩티드 (단백질을 포함함) 가 바람직하게 사용된다.
상기한 펩티드는, N 말단의 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 (Met) 잔기 또는 이 메티오닌 잔기의 디케톤체의 제거공정을 실시하기 전 또는 후에 리폴딩 (활성화, 재생화) 을 실시할 수 있다.
본 명세서에 있어서 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염이란, 식 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X [식중, m 은 0 내지 2 의 정수를 나타내고, X 는 아미노산 잔기 또는 펩티드쇄를 나타낸다.] 로 표시되는 화합물 또는 그 염을 나타낸다. N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염은, 화학반응 또는 효소반응 등 각종 반응에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 화합반응에 의해 얻은 방법으로서는, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염을 α-디케톤류와 반응시키는 아미노기 전이반응에 의해, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염을 얻을 수 있다 (일본 공개특허공보 평10-72489 호 (EP-A-812856 호)).
본 명세서에 있어서 α-디케톤류는, 상기한 펩티드 또는 그 염의 아미노기 전이반응을 진행시키는 것이라면 어느 것이어도 되며, 예컨대 식 R1-CO-CO-R2[식중, R1은 수소 또는 카르복실기로 치환되어 있어도 좋은 저급알킬 혹은 페닐기 (바람직하게는 수소 또는 메틸, 더욱 바람직하게는 수소) 를 나타내고, R2는 히드록실기, 저급알콕시기 또는 저급알킬로 치환되어 있어도 좋은 아미노기 (바람직하게는 히드록실기) 를 나타낸다.] 로 표시되는 화합물 또는 그 염 등을 들 수 있다.
상기 식중, R1으로 표시되는 저급알킬기로서는 메틸, 에틸, 프로필, i-프로필, 부틸, i-부틸, sec-부틸, t-부틸 등의 탄소수 1 내지 6 정도의 알킬기 등을 들 수 있고, R2로 표시되는 저급알콕시기로서는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, i-프로폭시, 부톡시, i-부톡시, sec-부톡시, t-부톡시 등의 탄소수 1 내지 6 정도의 알콕시기 등을 들 수 있다. 또한, R2로 표시되는 저급알킬로 치환되어 있어도 좋은 아미노기로서는, 상기한 R1으로 표시되는 저급알킬기를 1 내지 2 개 갖고 있어도 좋은 아미노기 등을 들 수 있다. 그리고, 염으로서는 상기한 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드의 염과 동일한 것을 들 수 있다.
α-디케톤류의 구체예로서는, 글리옥실산, 피루브산, 옥살아세트산, 페닐글리옥실산, 2-옥소글루타르산 등을 들 수 있는데, 그 중에서도 글리옥실산이 바람직하게 사용된다.
α-디케톤류는 염을 형성하고 있어도 되고, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리금속염, 염산염 등의 무기산의 염 등을 들 수 있다.
N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염과 α-디케톤류의 아미노기 전이반응은, 통상 펩티드 또는 그 염 1 몰에 대하여 1 내지 1 만몰 (바람직하게는 2000 내지 4000 몰) 정도의 α-디케톤류를, 약 0 내지 70 ℃ (바람직하게는 약 20 내지 40 ℃) 에서 약 10 분 내지 5 시간 (바람직하게는 약 20 분 내지 2 시간) 반응시키는 것이 바람직하다. 상기한 아미노기 전이반응을 저해하지 않는 것이라면 어떤 완충액 (예, 인산완충액, 아세트산완충액, 시트르산완충액 등) 을 사용하여도 되는데, 그 중에서도 아세트산완충액이 바람직하게 사용된다. 또한, 반응의 pH 는 약 2 내지 9, 그 중에서도 약 4 내지 7, 특히 약 5 내지 6 으로 조정하여 반응을 진행시키는 것이 좋다.
상기 아미노기 전이반응을 촉진하기 위하여, 전이금속이온의 존재하에 α-디케톤류를 반응시키는 것이 바람직하고, 통상 α-디케톤류 1 몰에 대하여 0.001 내지 0.1 몰 (바람직하게는 0.01 내지 0.05 몰) 정도의 전이금속이온을 사용하는 것이 바람직하다. 전이금속이온으로서는, 예컨대 구리이온 (Cu+, Cu2+), 코발트이온 (Co2+, Co3+), 니켈이온 (Ni2+, Ni3+), 철이온 (Fe2+, Fe3+), 아연이온 (Zn2+), 알루미늄이온 (Al3+), 망간이온 (Mn2+등), 갈륨이온 (Ga3+), 인듐이온 (In3+), 마그네슘이온 (Mg2+), 칼슘이온 (Ca2+) 등을 사용할 수 있는데, 그 중에서도 구리이온, 코발트이온 등, 특히 구리이온 (Cu2+) 이 바람직하게 사용된다. 이들 전이금속이온은 통상 황산, 질산, 염산, 과염소산 등의 무기산과의 염 또는 아세트산, 옥살산, 시트르산, 탄산 등의 유기산과의 염으로서 반응용매에 첨가할 수 있고, 그 중에서도 황산구리, 아세트산구리, 특히 황산구리가 바람직하게 사용된다.
또한, 염기의 존재하에 α-디케톤류를 반응시키는 것이 바람직하고, 통상 α-디케톤류 1 몰에 대하여 0.1 내지 20 몰 (바람직하게는 0.5 내지 10 몰) 정도의 염기를 사용하는 것이 바람직하다. 염기로서는, 예컨대 트리에틸아민, 트리부틸아민 등의 알킬아민류, N,N-디메틸아닐린, 피리딘, 루티딘, 콜리딘, 4-(디메틸아미노)피리딘, 이미다졸 등의 방향족 아민류 등을 사용할 수 있는데, 그 중에서도 피리딘이 바람직하게 사용된다.
또한, 아미노기 전위반응시에 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염, 및 이 펩티드 또는 그 염의 아미노기 전위반응에서 얻어지는 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염의 침전방지 등을 목적으로 하여, 이 펩티드, 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염의 종류에 따라 아미노기 전위반응을 위한 완충액중에 요소를 첨가하는 것이 바람직하다. 예컨대, hGH 를 사용하는 경우, 완충액중에 요소를 바람직하게는 약 1 내지 8 M, 보다 바람직하게는 약 3 내지 6 M 의 농도로 되도록 첨가하는 것이 바람직하다.
그리고, 상기한 아미노기 전이반응은, 전이금속이온 및 염기의 존재하에 α-디케톤류를 반응시키는 것이 바람직하고, 실용적으로는 전이금속이온, 염기 및 α-디케톤류의 3 성분 (예컨대, 황산구리, 피리딘 및 글리옥실산 등) 을 함유하는 혼합액을, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염을 함유하는 수용액에 첨가하여 아미노기 전이반응을 진행시킨다.
상기 아미노기 전이반응에 의해 얻어지고, 식 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X [식중, m 은 0 내지 2 의 정수를 나타내고, X 는 아미노산 잔기 또는 펩티드쇄를 나타낸다.] 로 표시되는 화합물 또는 그 염 (메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염) 은, 펩티드 또는 단백질의 공지 정제수단, 예컨대 추출, 염석, 분배, 재결정, 크로마토그래피 등에 의해 반응용액으로부터 단리·정제할 수도 있는데, 그대로 다음 가수분해반응을 실시할 수도 있다.
아미노기 전이반응에서 얻어진 메티오닌의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염은, 통상 염기에 의한 가수분해반응을 실시하여 N 말단의 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기 혹은 이 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖고 있지 않는 아미노산, 펩티드 또는 그 염으로 변환할 수 있다.
가수분해반응에 사용하는 염기로서는, 예컨대 시스테아민, 트리에틸아민, 트리부틸아민 등의 알킬아민류 또는 그 염, N,N-디메틸아닐린, 피리딘, 루티딘, 콜리딘, 4-(디메틸아미노)피리딘, 이미다졸 등의 방향족 아민류 또는 그 염, o-페닐렌디아민, 톨릴렌-3,4-디아민, 3,4-디아민 안식향산 및 그 N-알킬 치환체 (예컨대, N-메틸-1,2-페닐렌디아민, N-에틸-1,2-페닐렌디아민, N-이소프로필-1,2-페닐렌디아민 등), 2,3-디아미노페놀, 4-클로로-o-페닐렌디아민 등의 디아민류 (바람직하게는 방향족 디아민류, 그 중에서도 3,4-디아미노안식향산 및 그 N-알킬치환체 (예컨대, N-메틸-1,2-페닐렌디아민, N-에틸-1,2-페닐렌디아민, N-이소프로필-1,2-페닐렌디아민 등) 또는 이들의 염 등, 티오세미카르바지드, 아세톤티오세미카르바지드, 페닐티오세미카르바지드 등의 티오세미카르바지드류, 셀레노세미카르바지드, 아세톤셀레노세미카르바지드 등의 셀레노세미카르바지드류 등의 아민류 또는 그 염 등을 사용할 수 있는데, 그 중에서도 아민류, 특히 디아민류 또는 티오세미카르바지드류 또는 이들의 염 등이 바람직하게 사용되고, 특히 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염이 바람직하게 사용된다.
가수분해반응에 사용되는 염기의 염으로서는, 예컨대 상기 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드의 염과 동일한 것 등을 들 수 있다.
염기의 양은, 통상 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염 1 몰에 대하여 약 1 내지 1 만몰, 바람직하게는 약 200 내지 3000 몰, 보다 바람직하게는 약 500 내지 3000 몰이다. 가수분해반응은 통상 약 0 내지 70 ℃ (바람직하게는 약 20 내지 40 ℃) 에서 약 1 시간 내지 7 일간 (바람직하게는 약 10 시간 내지 5 일간) 진행시키는 것이 바람직하다. 반응에는, 완충액을 용매로서 사용하는 것이 바람직하고, 완충액으로서는 예컨대 포름산계 완충액 (예컨대, 아세트산-포름산나트륨, 포름산-포름산나트륨, 포름산-아세트산나트륨 등) 등을 들 수 있다. 상기한 가수분해반응을 저해하지 않는 것이라면 어떤 완충액을 사용하여도 되는데, 그 중에서도 아세트산-포름산나트륨, 포름산-포름산나트륨 또는 포름산-아세트산나트륨 완충액이 바람직하게 사용된다. 또한, 반응의 pH 는 약 2 내지 9, 그 중에서도 약 3 내지 7, 특히 약 4 내지 6 으로 조정하여 반응을 진행시키는 것이 좋다. 이들 완충액은, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 8 mol/ℓ, 보다 바람직하게는 약 0.5 ∼ 6 mol/ℓ사용된다.
또한, 가수분해시에 N 말단의 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염 및 가수분해반응에 의해 생성되는 이 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 아미노산, 펩티드 또는 그 염의 침전방지 등을 목적으로 하여, 상기 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드, 상기 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 아미노산, 펩티드 또는 그 염의 종류에 따라 가수분해반응을 위한 완충액중에 요소를 첨가하는 것이 바람직하다. 예컨대, hGH 를 사용하는 경우, 완충액중에 요소를 바람직하게는 약 1 내지 6 M, 보다 바람직하게는 약 2 내지 5 M 의 농도로 되도록 첨가하는 것이 바람직하다.
이와 같이 하여 얻어지는 아미노산, 펩티드 또는 그 염은 공지의 정제수단, 예컨대 추출, 염석, 분배, 재결정, 크로마토그래피 등에 의해 반응용액으로부터 단리·정제할 수도 있는데, 바람직한 예로서, 예컨대 SP-세파로스 (파르마시아 바이오테크(주)) 혹은 DEAE-5PW (도소(주)) 를 통한 이온교환크로마토그래피 등에 의한 정제법을 들 수 있다.
본 발명에 의해 제조되는 펩티드는 그 N 말단에 메티오닌을 갖지 않고, 또한 목적으로 하는 생리활성펩티드 (예컨대, 천연의 생리활성 폴리펩티드) 와 동일한 아미노산서열을 갖는 것으로서 얻을 수 있기 때문에, 목적으로 하는 펩티드 (예컨대, 천연의 폴리펩티드) 와 동일한 활성을 가지며 저독성이고 안전하게 의약품이나 진단용 약제로서 사용할 수 있다.
본 발명에 의해, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기 혹은 이 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드로부터 N 말단의 메티오닌 잔기 혹은 이 메티오닌 잔기의 디케톤체를 특이적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 명세서 및 도면에 있어서 아미노산 등의 약호로 표시할 경우에는, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature 에 의한 약호 혹은 당해 분야에 있어서의 관용약호에 의거하는 것으로서, 그 예를 다음에 나타낸다. 또한, 아미노산에 관하여 광학이성이 있는 경우에는 특별히 명시하지 않는 한 L-체를 나타낸다.
SDS : 도데실황산나트륨
Gly : 글리신
Ala : 알라닌
Val : 발린
Leu : 류신
Ile : 이소류신
Ser : 세린
Thr : 트레오닌
Cys : 시스테인
Met : 메티오닌
Glu : 글루타민산
Gln : 글루타민
Asp : 아스파라긴산
Asn : 아스파라긴
Lys : 리신
Arg : 아르기닌
His : 히스티딘
Phe : 페닐알라닌
Tyr : 티로신
Trp : 트립토판
Pro : 프롤린
Asx : Asp + Asn
Glx : Glu + Gln
이하의 참고예 및 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들로 제한되는 것은 아니다.
<참고예 1> T7 프로모터를 사용한 사람 성장호르몬 (hGH) 발현벡터의 구축
hGH 의 구조유전자는, 사람 하수체 cDNA 라이브러리 (Quick-Clone, CLONTECH 사 제조) 로부터, 구조유전자의 개시코돈 상류에 인접하여 Nde I 절단부위를 갖는 프라이머 및 종료코돈 하류에 인접하여 Bam HI 절단부위를 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 로 증폭하여 회수한다. 그럼으로써 얻어진 양단에 제한효소인식부위가 부가된 hGH 효소유전자를 pT7Blue 의 T-클로닝부위에 연결하여 (DNA Ligation Kit Ver.2, 다카라슈조가부시키가이샤 제조) pT7HGH-Na 를 제작한다. 이것을 대장균 JM109 로 도입하고, 암피실린내성과 β-갈락토시다아제 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택한다.
한편, 이하의 방법으로 발현벡터를 구축한다. pBR322 를 NdeI 로 절단, T4 DNA 폴리머라아제 (DNA Blunting Kit. 다카라슈죠가부시키가이샤 제조) 로 말단을 평활화하고, 다시 연결함으로써, NdeI 인식부위를 결손시킨 pBRdesNde 를 제작한다. pET3c 를 BglⅡ-Eco RV 로 절단하고, 약 0.26 kbp 의 단편을 회수한 후, T4DNA 폴리머라아제로 말단을 평활화하고, pBRdesNde 의 ScaI 단편과 연결하여 pBR/T7 desNde 를 제작한다. 또한, 부위특이적 변위도입 (Quick Change, STRATAGENE 사 제조) 에 의해 pBR322 의 Bam HI 인식부위를 결손시킨 pBR322desBam 을 제작한다. pBR322desBam 의 SphⅠ-Eco RV 단편을 pBR/T7 desNde 의 SphⅠ-Eco RV 단편과 연결하여 테트라사이클린 내성발현벡터 pTC 를 제작한다. 테트라사이클린 내성유전자와 T7 프로모터의 방향이 반대인 것을 pTC1, 동일한 것을 pTC2 라 한다.
pT7HGH-Na 를 NdeⅠ및 Bam HI 로 절단하여 hGH 구조 유전자를 회수하고, pTC1 의 NdeⅠ-Bam HI 단편과 연결한 후, 대장균 JM109 로 도입하여 암피실린내성으로 형질전환체를 선택, 그 주로부터 다시 플라스미드를 회수하여 발현 플라스미드 pTCHGH-Na 로 한다.
대장균 MM294 를 T7 파지의 RNA 폴리머라아제 유전자로 재조합되어 있는 람다파지 (스튜디에 (Studier), 상기문헌) 로 용원화한다(lysogenize). 그 후, hGH 발현벡터 pTCHGH-Na 를 이 대장균 MM294(DE3) 로 도입하고, 대장균 MM294(DE3)/pTCHGH-Na 를 얻는다. 그리고, hGH 의 염기서열은 pT7HGH-Na 를 제작한 시점에서 ABI Prism 377A DNA 시퀀서에 의해 확인한다.
<참고예 2> 대장균에서의 메티오닌 잔기를 갖는 hGH (Met-hGH) 의 발현
참고예 1 에서 얻은 형질전환세포를, 5 ㎎/ℓ의 테트라사이클린을 함유하는 LB 배지 (1 % 펩톤, 0.5 % 효모엑기스, 0.5 % 염화나트륨) 1 ℓ를 함유하는 2 ℓ용량의 플라스크중에서 30 ℃, 16 시간 진탕배양한다. 얻어진 배양액을 0.02 % 뉴폴 LB-625 (소포제 : 산요카세이고교 제조) 및 5 ㎎/ℓ의 테트라사이클린을 함유하는 20 ℓ의 LB 배지를 함유한 50 ℓ용량 발효조로 이식하여 37 ℃, 6 시간 통기교반배양한다. 이 배양액을 360 ℓ의 주발효배지 (1.68 % 인산일수소나트륨, 0.3 % 인산이수소칼륨, 0.1 % 염화암모늄, 0.05 % 염화나트륨, 0.05 % 황산마그네슘, 0.05 % 뉴폴 LB-625, 0.0005 % 염산티아민, 1.5 % 포도당, 3.0 % 하이케이스아미노, 1.0 % 효모엑기스) 를 함유한 500 ℓ용량 발효조로 이식하여 37 ℃ 에서 통기교반배양을 개시한다. 배양액의 탁도가 약 1200 크레트 단위로 된 시점에서 17.85 ㎎/ℓ분의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTQ) 를 첨가하고, 다시 24 ℓ의 30 % 포도당을 첨가하면서 배양을 계속하고, 5 시간후에 배양액을 원심분리하여 약 12.3 ㎏ 의 습균체를 얻어 -80 ℃ 로 동결보존한다.
상기한 형질전환 대장균 (MM294(DE3), pTCHGH-Na) 는 수탁번호 FERM P-16546 으로서 1997년 12월 10일에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁되고, 수탁번호 FERM BP-6888 로서 1999년 9월 24일에 국제기탁에 이관되었다. 또한, 상기한 형질전환 대장균 (MM294(DE3), pTCHGH-Na) 은 수탁번호 IFO 16124 로서 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 1997년 10월 16일에 기탁되었다.
<실시예 1> Met-hGH 의 활성화
참고예 2 에서 얻어진 균체 2 ㎏ 에 50 mM 트리스/HCl, 8 M 구아니딘염산염 용액 (pH 8.0) 6 ℓ를 첨가하여 균체를 용해하고 나서 초음파파쇄기 (소니파이어 450, 브란손사) 를 사용하여 파쇄처리를 실시한 후, 원심분리 (10000 rpm, 120 분간) 를 실시한다. 얻어진 상징액 6 ℓ에 50 mM 트리스/HCl, 0.28 mM GSSG, 1.4 mM GSH, 0.7 M 아르기닌 (pH 8.0) 18 ℓ를 첨가하여 pH 8.0 으로 조정한 후, 4 ℃ 에서 4 일간 활성화를 실시한다.
<실시예 2> Met-hGH 의 정제
실시예 1 에서 활성화가 종료된 재생액을 페리콘카세트시스템 (PTGC 막, 밀리포어사) 으로 20 mM 트리스/HCl, 2.5 M 요소 (pH 8.0) 를 첨가하면서 전기전도도가 10 mS 이하로 될 때까지 탈염, 농축을 실시한 후, 얻어진 농축액 5 ℓ에 50 mM 인산완충액 (pH 6.0) 을 첨가하여 50 ℓ로 희석후 4 ℃ 로 하룻밤 정치한다. 이어서, 연속원심분리 (JCF-Z 로터, 베크만사) 를 실시하고, 얻어진 상청 50 ℓ에 10 M 수산화나트륨을 첨가하여 pH 7.12 로 조정한 후, 페리콘카세트시스템 (PTGC 막, 밀리포어사) 으로 농축하고, 20 mM 트리스/HCl (pH 8.0) 로 치환한 후, 원심분리 (10000 rpm, 30 분) 를 실시하여 상청을 얻는다. 이어서, 이 액을 20 mM 트리스/HCl (pH 8.0) 로 평형화한 DEAE-토요펄 650 M 칼럼 (20 ㎝φ×84 ㎝, 도소사) 에 흡착시키고, 충분히 세정한 후, 20 mM 트리스/HCl, 50 mM 염화나트륨 (pH 8.0) 으로 용출을 실시하고, Met-hGH 분획으로서 95 ℓ의 용출액을 얻는다. 그리고, 이 용출액을 페리콘카세트시스템 (PTGC 막, 밀리포어사) 로 농축, 탈염하고, 20 mM트리스/HCl, 6 M 요소 (pH 8.0) 로 치환하여 12.21 g 의 Met-hGH 를 얻는다.
실시예 3 (N 말단 메티오닌 잔기 (N 말단 Met) 의 제거)
실시예 2 에서 얻은 Met-hGH 용액 1800 ㎖ 에 2.5 M 글리옥실산, 40 mM 황산구리, 50 % 피리딘용액 450 ㎖ 를 첨가하여 잘 교반한 후 25 ℃ 에서 60 분간 반응시킨다. 이어서, 20 mM 트리스/HCl, 4.0 M 요소 (pH 8.0) 으로 평형화한 세파덱스 (Sephadex) G-25 칼럼 (11.3 ㎝φ×125 ㎝, 파르마시아바이오테크사)에 3 ℓ/h 의 유속으로 통액하고, 평형화와 동일한 완충액을 사용하여 전개하고, 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 hGH 분획으로서 4.2 ℓ의 용출액을 얻는다. 이 용출액을 1.2 M 아세트산, 2.4 M 포름산나트륨, 3.6 M 요소용액, 48 mM 3,4-디아미노안식향산 용액 20.8 ℓ중에 잘 교반하면서 첨가한 후, 30 ℃ 에서 천천히 교반하면서 3 일간 반응시킨다. 반응후, 이 용액을 페리콘카세트시스템 (PTGC 막, 밀리포어사) 으로 14 ℓ로 농축하고, 7 ℓ씩 2 회로 나누어 20 mM 트리스/HCl, 4.0 M 요소 (pH 8.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (25.2 ㎝φ×50 ㎝, 파르마시아바이오테크사) 에 6 ℓ/h 의 유속으로 통액하여 hGH 분획 20 ℓ를 모은다. 이어서, 고속 액체 크로마토그래프법 (길슨 HPLC 시스템, 길슨사) 에 의해 이 용액을 DEAE-5PW 칼럼 (21 ㎝ ×30 ㎝, 도소사) 에 통액흡착시킨 후, A = 50 mM 트리스/HCl + 2.5 M 요소 (pH 8.0), B = 50 mM MES [2-(N-모르폴리노)에탄술폰산] + 2.5M 요소 (pH 4.0) 에 의한 70 ∼ 85 % B 의 pH 구배로 70 분간, 320 ㎖/min 의 유속으로 용출을 실시하여 hGH 분획 5.84 ℓ를 얻는다. 이 hGH 분획에 10 MNaOH 용액을 16 ㎖ 첨가하여 pH 7.1 로 조정한 후, 8 회로 나누어 고속 액체 크로마토그래프법 (길슨 HPLC 시스템, 길슨사) 에 의한 크로마토그래피를 실시한다. 소정량의 농축액을 POROS20R1 칼럼 (5 ㎝ ×60 ㎝, 닛폰퍼셉티브사) 에 통액흡착시킨 후, A = 25 % n - 프로판올 + 75% 50 mM 트리스/HCl (pH 8.5), B = 35 % n - 프로판올 + 65 % 50 mM 트리스/HCl (pH 8.5) 에 의한 50 ∼ 85 % B 의 농도구배로 150 분간 50 ㎖/min 의 유속으로 용출을 실시하여 hGH 분획으로 34.7 ℓ의 용출액을 얻는다. 이 용출액에 증류수를 첨가하여 200 ℓ로 희석하고 나서 페리콘카세트시스템 (PTGC 막, 밀리포어사) 으로 5 ℓ로 농축후 다시 고속 액체 크로마토그래프법 (길슨 HPGC 시스템, 길슨사) 에 의해 이 용액을 3 회로 나누어 DEAE-5PW 칼럼 (10.8 ㎝ ×20 ㎝, 도소사) 에 통액흡착시킨 후, A = 50 mM 트리스/HCl + 2.5 M 요소 (pH 8.0), B = 50 mM MES [2-(N-모르폴리노)에탄술폰산] + 2.5 M 요소 (pH 4.0) 에 의한 70 ∼ 85 % B 의 pH 구배로 70 분간, 80 ㎖/min 의 유속을 용출하여 hGH 분획 1616 ㎖ 를 얻는다. 이 hGH 분획에 10 M NaOH 용액을 2 ㎖ 첨가하여 pH 7.1 로 조정한 후, 한외여과장치 (오메가막, 후지필터사) 로 농축하여 농축액 0.4 ℓ를 얻는다. 이 농축액을 증류수로 평형화한 세파크릴 S-100 칼럼 (11.3 ㎝φ×50 ㎝, 파르마시아바이오테크사) 에 2 ℓ/h 의 유속으로 통액, 전개하여 hGH 분획을 얻는다. 그리고, 이 용액을 밀리팩 60 (밀리포어사) 으로 여과하여 hGH 용액 2391 ㎖ (4638 ㎎ 의 hGH) 를 얻는다.
<실시예 4> hGH 의 특징결정
(a) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 분석
실시예 3 에서 얻어진 hGH 에 100 mM DTT 를 함유하는 샘플버퍼 [Laemmli,Nature,227, 680 (1979)] 를 등량 첨가하여 잘 교반하고, 95 ℃ 에서 2 분간 가열한 후, 멀티 겔 10/20 (다이이치가가쿠야쿠힌) 으로 전기영동을 실시한다. 영동후의 겔을 쿠마씨 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue) 로 염색한 결과, 약 22 KDa 에 단일한 밴드가 확인되어 정제 hGH 가 단일함이 확인되었다 (도 1).
(b) N 말단 아미노산 서열분석
N 말단 아미노산 서열을 기상 프로테인 시퀀서 (퍼킨엘머·어플라이드 바이오시스템즈사, 모델 477A) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, 얻어진 hGH 의 N 말단 아미노산 서열은 cDNA 의 염기서열로부터 추정된 hGH 의 N 말단 아미노산 서열과 일치하였다 (표 1).
잔기No. 검출된 PTH1)-아미노산 (pmol) hGH의 염기서열로부터예측되는 아미노산
123456789101112131415161718192021 Phe(848)Pro(520)Thr(403)Ile(620)Pro(401)Leu(429)Ser( 92)Arg(262)Leu(376)Phe(283)Asp(182)Asn(175)Ala(175)Met(194)Leu(261)Arg(181)Ala(144)His( 80)Arg(152)Leu(200)His( 71) PheProThrIleProLeuSerArgLeuPheAspAsnAlaMetLeuArgAlaHisArgLeuHis
1) 페닐티오히단토인 1 nmol 을 사용하여 분석을 실시함.
(c) 아미노산 조성 분석
아미노산 조성을 아미노산 분석계 (L-8500A, 히다치) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, 얻어진 hGH 의 아미노산 조성은 cDNA 의 염기서열로부터 추정되는 아미노산 조성과 일치한다 (표 2).
아미노산 1몰당 잔기수 hGH의 염기서열로부터예측되는 값
AsxThr1) Ser1)GlxProGlyAla Cys2)ValMetIleLeuTyrPheHisLysArgTrp 19.89.716.127.07.78.06.9N.D.6.82.97.426.67.912.43.08.710.70.9 2010182788747382681339111
산가수분해 (6N HCl-4% 티오글리콜산, 110 ℃, 24 및 48 시간 가수분해의 평균치)1) 0 시간에 외삽한 값. 2) 미검출약 10㎍을 사용하여 분석을 실시함.
(d) C 말단 아미노산 분석
C 말단 아미노산을 아미노산 분석계 (L-8500A, 히다치) 를 사용하여 결정한다. 얻어진 hGH 의 C 말단 아미노산은 cDNA 의 염기서열로부터 추정된 C 말단 아미노산과 일치한다 (표 3).
C 말단 아미노산 회수율 (%)
Phe 94
기상히드라진분해법 (100 ℃, 6시간) 20 nmol 을 사용하여 분석을 실시함.
<실시예 5> hGH 의 활성측정
실시예 3 에서 얻어진 정제 hGH 의 Nb2 세포 [저널·오브·크리니컬·엔도크리놀로지·앤드·메타볼리즘, 51 권, 1058 페이지 (1980)] 에 대한 증식촉진효과는표준품 (미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재의 케미콘 인터네셔널사) 과 동등하다.
<실시예 6> N 말단 Met 의 제거
실시예 3 에서 얻은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 hGH 분획 0.4 ㎖ 에 20 mM 트리스/HCl, 4.0 M 요소 (pH 8.0) 를 첨가하여 2 ㎖ 로 희석한다. 이 희석액에 등량의 4 M 아세트산, 4 M 아세트산나트륨, 6 M 요소용액, 80 mM N-메틸-1,2-페닐렌디아민 용액을 첨가하여 잘 혼합한 후에 30 ℃ 에서 20 시간 반응시킨다. 반응후, 이 용액을 20 mM 트리스/HCl, 4.0 M 요소 (pH 8.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (1 ㎝φ×30 ㎝, 파르마시아사) 에 60 ㎖/h 의 유속으로 통액하여 hGH 분획 10 ㎖ 를 모은다. 이어서, 고속 액체 크로마토그래프법 (길슨 HPLC 시스템, 길슨사) 에 의해, 이 용액을 DEAE-5PW 칼럼 (2.15 ㎝×15 ㎝, 도소사) 에 통액흡착시킨 후, A = 50 mM 트리스/HCl + 2.5 M 요소 (pH 8.0), B = 50 mM MES [2-(N-모르폴리노)에탄술폰산] + 2.5 M 요소 (pH 4.0) 에 의한 70 ∼ 85 % B 의 pH 구배로 70 분간, 7.5 ㎖/min 의 유속으로 용출하여 hGH 를 얻는다.
실시예 7 (N 말단 Met 의 제거)
실시예 3 에서 얻은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 hGH 분획 0.4 ㎖ 에 20 mM 트리스/HCl, 4.0 M 요소 (pH 8.0) 를 첨가하여 2 ㎖ 로 희석한다. 이 희석액에 등량의 2 M 아세트산, 4 M 포름산나트륨, 6 M 요소용액, 80 mM N-메틸-1,2-페닐렌디아민 용액을 첨가하여 잘 교반한 후에 30 ℃ 에서 20 시간 반응시킨다. 반응후, 이 용액을 20 mM 트리스/HCl, 4.0 M 요소 (pH 8.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (1 ㎝φ×30 ㎝, 파르마시아사) 에 60 ㎖/h 의 유속으로 통액하여 hGH분획 10 ㎖ 를 모은다.
이어서, 고속 액체크로마토그래프법 (길슨 HPLC 시스템, 길슨사) 에 의해, 이 용액을 DEAE-5PW 칼럼 (2.15 ㎝ ×15 ㎝, 도소사) 에 통액흡착시킨 후, A = 50 mM 트리스/HCl + 2.5 M 요소 (pH 8.0), B = 50 mM MES [2-(N-모르폴리노)에탄술폰산] + 2.5 M 요소 (pH 4.0) 에 의한 70 ∼ 85 % B 의 pH 구배로 70 분간, 7.5 ㎖/min 의 유속으로 용출하여 hGH 를 얻는다.
<실시예 8> N 말단 Met 의 제거
실시예 2 에서 얻은 Met-hGH 용액 1.8 ㎖ 에 2.5 M 글리옥실산, 40 mM 황산구리, 50 % 피리딘용액 0.45 ㎖ 에 첨가하여 잘 교반한 후에 25 ℃ 에서 60 분간 반응시킨다. 이어서, 20 mM 트리스/HCl, 4.0 M 요소 (pH 8.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (1.5 ㎝φ×30 ㎝, 파르마시아바이오테크사) 에 100 ㎖/h 의 유속으로 통액하고, 평형화와 동일한 완충액을 사용하여 전개하고, 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 hGH 분획으로서 10 ㎖ 의 용출액을 얻는다. 이 용출액을 1.2 M 아세트산, 2.4 M 포름산나트륨, 3.6 M 요소용액, 48 mM 3,4-디아미노안식향산 용액 49.5 ㎖ 중에 잘 교반하면서 첨가한 후, 37 ℃ 에서 천천히 교반하면서 24 시간 반응시킨다. 반응후, 20 mM 트리스/HCl, 4.0 M 요소 (pH 8.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (4.6 ㎝φ×60 ㎝, 파르마시아사) 에 500 ㎖/h 의 유속으로 통액하여 hGH 분획 150 ㎖ 를 모은다. 이어서, 고속 액체 크로마토그래프법 (길슨 HPLC 시스템, 길슨사) 에 의해 이 용액을 DEAE-5PW 칼럼 (2.15 ㎝ ×15 ㎝, 도소사) 에 통액흡착시킨 후, A = 50 mM 트리스/HCl + 2.5 M 요소 (pH 8.0), B = 50 mMMES [2-(N-모르폴리노)에탄술폰산] + 2.5 M 요소 (pH 4.0) 에 의한 70 ∼ 85 % B 의 pH 구배로 70 분간, 7.5 ㎖/min 의 유속으로 용출하여 6.7 ㎎ 의 hGH 를 얻는다.
<실시예 9> N 말단 Met 의 제거
실시예 2 에서 얻은 Met-hGH 용액 1.8 ㎖ 에 2.5 M 글리옥실산, 40 mM 황산구리, 50 % 피리딘용액 0.45 ㎖ 를 첨가하여 잘 교반한 후에 25 ℃ 에서 60 분간 반응시킨다. 이어서, 20 mM 트리스/HCl, 4.0 M 요소 (pH 8.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (1.5 ㎝φ×30 ㎝, 파르마시아바이오테크사) 에 100 ㎖/h 의 유속으로 통액하고, 평형화와 동일한 완충액을 사용하여 전개하고, 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 hGH 분획으로서 10 ㎖ 의 용출액을 얻는다. 이 용출액을 2 M 포름산, 10 M 포름산나트륨, 6 M 요소용액, 80 mM 3,4-디아미노안식향산 용액 10 ㎖ 중에 잘 교반하면서 첨가한 후, 30 ℃ 에서 천천히 교반하면서 3 일간 반응시킨다. 반응후, 20 mM 트리스/HCl, 4.0 M 요소 (pH 8.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (4.6 ㎝φ×60 ㎝, 파르마시아바이오테크사) 에 500 ㎖/h 의 유속으로 통액하고, hGH 분획 100 ㎖ 를 모은다. 이어서, 고속 액체 크로마토그래프법 (길슨 HPLC 시스템, 길슨사) 에 의해, 이 용액을 DEAE-5PW 칼럼 (2.15 ㎝ ×15 ㎝, 도소사) 에 통액흡착시킨 후, A = 50 mM 트리스/HCl + 2.5 M 요소 (pH 8.0), B = 50 mM MES [2-(N-모르폴리노)에탄술폰산] + 2.5 M 요소 (pH 4.0) 에 의한 70 ∼ 85 % B 의 pH 구배로 70 분간, 7.5 ㎖/min 의 유속으로 용출하여 6.0 ㎎ 의 hGH 를 얻는다.
<실시예 10> 메티오닌 잔기를 갖는 20K-hGH (Met-20K-hGH) 의 활성화
일본 공개특허공보 평10-234386 호의 참고예 2 에 기재된 방법으로 얻어진 균체 40 g 에 PBS (인산완충액화 생리식염수) 100 ㎖ 를 첨가하여 현탁한 후, 5 분간, 초음파분쇄 (브란손사) 를 실시하여 균체를 파쇄한다. 균체파쇄액을 원심분리 (10000 rpm, 20 분간) 하여 상청을 폐기하여 봉입체를 얻는다. 이 봉입체에 50 mM 트리스/HCl, 8 M 구아니딘염산염 용액 (pH 8.0) 2 ℓ를 첨가하여 봉입체를 용해한 후, 원심분리 (10000 rpm, 120 분간) 를 실시한다. 얻어진 상청액 2 ℓ에 50 mM 트리스/HCl, 0.28 mM GSSG, 1.4 mM GSH, 0.7 M 아르기닌 (pH 8.0) 24 ℓ를 첨가하여 4 ℃ 에서 1 일간 활성화를 실시한다.
<실시예 11> Met-20K-hGH 의 정제
실시예 10 에서 활성화가 종료된 액을 미니탄 한외여과시스템 (PTGC 막, 밀리포어사) 에서 20 mM 트리스/HCl, 2.5 M 요소 (pH 8.0) 를 첨가하면서 전기전도도가 10 mS/㎝ 이하로 될 때까지 탈염, 농축을 실시한 후, 얻어진 농축액을 원심분리 (10000 rpm, 20 분간) 하여 농축액의 상청 150 ㎖ 를 얻는다. 이어서, 이 액을 50 mM 트리스/HCl, 2.5 M 요소/10 % 아세토니트릴 (pH 8.2) 로 평형화한 HiLoadTMQ Sepharose 16/10 HP 칼럼 (1.6 ㎝φ×10 ㎝, 파르마시아·바이오테크사) 에 흡착시키고, 충분히 세정한 후, 0 ∼ 0.18 M 염화나트륨의 농도구배에 의해 유속 3.0 ㎖/min 으로 용출하여 Met-20K-hGH 분획으로서 28 ㎖ 의 용출액을 얻는다. 그리고, 이 분획을 센트리플러스-10 (밀리포어사) 으로 농축·탈염을 실시하여 농축액 15 ㎖ 를 얻는다. 이 액을 다시 50 mM 트리스/HCl, 2.5 M 요소/10 % 아세토니트릴 (pH 8.2) 로 평형화한 HiLoadTM Q Sepharose 16/10 HP 칼럼 (1.6 ㎝φ×10 ㎝, 파르마시아·바이오테크사) 에 흡착시키고, 충분히 세정한 후, A = 50 mM 트리스/HCl, 2.5 M 요소, 10 % 아세토니트릴 (pH 8.2) 및 B = 50 mM MES [2-(N-모르폴리노)에탄술폰산], 2.5 M 요소, 10 % 아세토니트릴 (pH 4.0) 에 의한 0 ∼ 100 % B 의 pH 구배로 60 분간, 유속 3.0 ㎖/min 으로 용출하여 Met-20K-hGH 분획 12 ㎖ 를 얻는다. 이 용출액에 2 M 트리스/HCl (pH 7.8) 을 0.6 ㎖ 첨가하여 pH 를 7.2 로 조정하고, 센트리플러스-10 (밀리포어사) 으로 농축한다. 이 농축액 0.5 ㎖ 를 10 % 에탄올을 함유하는 PBS 로 평형화한 SuperdexTM 75 HR10/30 (1.0 ㎝φ×30 ㎝, 파르마시아·바이오테크사) 에 첨가하고, 10 % 에탄올을 함유하는 PBS 로 용출하여 Met-20K-hGH 분획 7.5 ㎖ 를 얻는다.
실시예 12 (N 말단 Met 의 제거)
실시예 11 에 의해 얻은 Met-20K-hGH 용액 6 ㎖ 를 20 mM 트리스/HCl, 8 M 요소 (pH 8.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (10 mmID ×30 ㎝, 파르마시아바이오테크사) 에 통액하고, 용출된 Met-20K-hGH 분획을 모으고, 다시 한외여과시스템 (다이아플로멤브레인 YM10, 25 ㎜, 아미콘사) 을 사용하여 2 ㎖ 로 농축한다. 이 용액에 2.5 M 글리옥실산, 40 mM 황산구리, 50 % 피리딘용액 0.5 ㎖ 를 첨가하여 잘 교반한 후에 25 ℃ 에서 60 분간 반응시킨다. 이어서, 이 반응액을 20 mM 트리스/HCl, 4 M 요소 (pH8.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (10 mmID ×40 ㎝, 파르마시아바이오테크사) 에 통액하고, 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 20K-hGH분획으로서 4 ㎖ 의 용출액을 모은다. 이 용출액에 1.2 M 아세트산, 2.4 M포름산나트륨, 3.6 M 요소, 48 mM 3,4-디아미노안식향산 용액 20 ㎖ 를 첨가하여 잘 교반한 후에 30 ℃ 에서 65 시간 반응한다. 반응후, 20 mM 트리스/HCl, 4 M 요소 (pH 8.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (20 mmID ×40 ㎝, 파르마시아바이오테크사) 에 통액하고, 20K-hGH 분획을 모은 후, 그리고 고속 액체 크로마토그래프법 (길슨사 HPLC 시스템, 길슨사) 에 의해, 이 용액을 50 mM 트리스/HCl, 2.5 M 요소/10 % 아세토니트릴 (pH 8.2) 로 평형화한 HiLoadTM Q Sepharose 16/10 HP 칼럼 (1.6 ㎝φ×10 ㎝, 파르마시아바이오테크사) 에 흡착시키고, 충분히 세정한 후, A = 50 mM 트리스/HCl, 2.5 M 요소, 10 % 아세토니트릴 (pH 8.2) 및 B = 50 mM MES [2-(N-모르폴리노)에탄술폰산], 2.5 M 요소, 10 % 아세토니트릴 (pH 4.0) 에 의한 0 ∼ 100 % B 의 pH 구배로 60 분간, 유속 3.0 ㎖/min 으로 용출하여 20K-hGH 분획 12 ㎖ 를 얻는다. 이 용출액에 2 M 트리스/HCl (pH 7.8) 을 0.6 ㎖ 첨가하여 pH 를 7.2 로 조정한 후, 센트리플러스-10 (밀리포어사) 으로 농축을 실시한다. 이 농축액 0.5 ㎖ 를 10 % 에탄올을 함유하는 PBS 로 평형화한 Superdex TM 75 HR 10/30 (1.0 ㎝φ×30 ㎝, 파르마시아·바이오테크사) 에 첨가하고, 10 % 에탄올을 함유하는 PBS 로 용출하여 20K-hGH 분획 7.5 ㎖ 를 얻는다.
실시예 13 (20K-hGH 의 특징결정)
(a) N 말단 아미노산 서열 분석
N 말단 아미노산 서열을 기상 프로테인시퀀서 (퍼킨엘머·어플라이드바이오스시스템즈사, 모델 477A) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, 얻어진 20K-hGH 의 N 말단 아미노산서열은 cDNA 의 염기서열에서 추정된 20K-hGH 의 N 말단 아미노산서열과 일치한다 (표 4).
잔기No. 검출된 PTH1)-아미노산 (pmol) 20K-hGH의 염기서열로부터예측되는 아미노산
12345678910 Phe(642)Pro(504)Thr(342)Ile(410)Pro(200)Leu(378)Ser( 95)Arg(170)Leu(285)Phe(262) PheProThrIleProLeuSerArgLeuPhe
1) 페닐티오히단토인 1 nmol 을 사용하여 분석을 실시함.
(b) 아미노산 조성 분석
아미노산 조성을 아미노산 분석계 (시스템 6300, 베크만사) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, 실시예 12 에서 얻어진 20K-hGH 의 아미노산 조성은 20K-hGH 의 cDNA 의 염기서열로부터 추정되는 아미노산 조성과 일치한다 (표 5).
아미노산 1 몰당 잔기수 20K-hGH의 염기서열로부터예상되는 값
AsxThr1) Ser1)GlxProGlyAla Cys2)ValMetIleLeuTyrPheHisLysArgTrp 20.29.716.522.06.98.06.2N.D.7.02.96.524.35.912.23.17.110.7N.D. 2010172278647372561237111
산가수분해 (6N HCl-1% 페놀, 110℃, 24 및 48시간 가수분해의 평균치). 약 20㎍을 사용하여 분석을 실시함.1) 0 시간에 외삽한 값. 2) 미검출
<실시예 14> 20K-hGH 의 활성측정
실시예 12 에서 얻어진 20K-hGH 의 Nb2 세포 [저널·오브·크리니컬·엔도크리놀로지·앤드·메타볼리즘, 51권, 1058 페이지 (1980)] 에 대한 증식촉진효과가 있음을 확인하였다.
<실시예 15> 메티오닌 잔기를 갖는 사람 BTC (사람 Met-BTC) 의 제조
일본 공개특허공보 평6-87894 호 (EP-A-0555785 호) 의 실시예 4 ∼ 6, 8 및 13 에 기재된 방법에 준하여 하기 방법으로 사람 Met-BTC 를 제조한다.
(대장균의 사람 BTC cDNA 발현 플라스미드의 구축)
사람·프로BTC (1-147 아미노산 잔기) 를 코딩하는 0.6 Kb 의 EcoRI-BamHI단편을 일본 공개특허공보 평6-87894 호 (EP-A-0555785 호) 의 실시예 5 에 기재된 플라스미드 pTB1515 에서 단리한다. ATG 번역개시코돈 (5'-TATGGATGGG-3';5'-AATTCCCATCCA-3') 을 갖는 합성어댑터를 상기 0.6 Kb 단편의 EcoRI 부위에 연결한 후, 생성된 0.6 Kb NdeI-BamHI 단편을 T7프로모터 (Gene, 56권, 125페이지 (1987년)) 를 함유하는 플라스미드 pET-3c 중으로 삽입하여 플라스미드 pTB1505 를 구축한다.
사람 BTC 의 80개의 아미노산 잔기 (일본 공개특허공보 평6-87894 호 (EP-A-0555785 호) 의 도 10-1 ∼ 도 10-2 의 1(Asp) 에서 80(Tyr) 까지) 를 코딩하는 DNA 단편을 얻기 위하여, 주형으로서 플라스미드 pTB1505, 프라이머로서 2 개의 올리고뉴클레오티드 (5'-ATACATATGGATGGGAATTCCA-3';5'-CCGGATCCTAGTAAAACAAGTCAACTCT-3') 를 사용하여 PCR (polymerase chain reaction) 을 실시한다. 생성물을 NdeI 및 BamHI 로 소화하고, 2.0 % 아가로스 겔 전기영동으로 분획하여 목적으로 하는 0.25 Kb DNA 단편을 단리한다. 이 0.25 Kb NdeI-BamHI 단편을, pET-3c 의 T7 프로모터의 하류에 T4DNA 리가제를 사용해서 연결하여 플라스미드 pTB1516 을 얻는다 (일본 공개특허공보 평6-87894 호 (EP-A-0555785 호) 의 도 13 참조).
(대장균에서의 사람 Met-BTC 의 발현)
대장균 MM294 를 T7 파지의 RNA 폴리머라아제 유전자로 재조합되어 있는 람다파지 (스튜디에, 상기문헌) 로 용원화한다. 그 후, 플라스미드 pLysS 를 이 대장균 MM294(DE3) 로 도입하여 대장균 MM294(DE3)/pLysS 를 얻는다. 이 균체에 상기 참고예에서 얻어진 플라스미드 pTB1516 을 도입하여 대장균 MM294(DE3)/pLysS, pTB1516 을 얻는다.
이 형질전환세포를 50 ㎍/㎖ 의 암피실린과 15 ㎍/㎖ 의 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지 (1 % 펩톤, 0.5 % 효모엑기스, 0.5 % 염화나트륨) 1 ℓ를 함유하는 2 ℓ용량 플라스크중에서 37 ℃, 8 시간 진탕배양한다. 얻어진 배양액을 19 ℓ의 주발효배지 (1.68 % 인산일수소나트륨, 0.3 % 인산이수소칼륨, 0.1 % 염화나트륨, 0.05 % 염화나트륨, 0.05 % 황산마그네슘, 0.02 % 소포제, 0.00025 % 황산제일철, 0.0005 % 염산티아민, 1.5 % 포도당, 1.5 % 카자미노산) 를 함유한 50 ℓ용량 발효조로 이식하여 30 ℃ 에서 통기교반배양을 개시한다. 배양액의 탁도가 약 500 크레트 단위로 된 시점에서, 100 ㎎/ℓ분의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 를 첨가하고, 다시 배양을 계속하여 7 시간후에 배양을 종료한다. 이 배양종료액을 원심분리하여 약 340 g 의 습균체를 얻어 -80 ℃ 로 동결건조한다.
이 형질전환 대장균 MM294(DE3)/pLysS, pTB1516 은 수탁번호 FERM BP-3836 으로서 1992년 4월 21일에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁되고, 또한, 수탁번호 IFO 15282 로서 1992년 4월 16일에 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 기탁되었다.
상술한 방법에 의해 취득한 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖는 사람 베타셀룰린 (Met-BTC) 10 ㎎ 을 3 M 요소용액 4 ㎖ 에 용해한 후, 80 mM 황산구리 0.25 ㎖, 글리옥실산 0.25 g, 피리딘 0.5 ㎖ 의 혼합액을 첨가하여 25 ℃ 에서 1 시간 반응한다. 반응종료후, 반응액을 2.5 M 요소 + 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (25 mmID ×600 mmL) 에 통액하고, 평형화에 사용한 용액을 6 ㎖/min 의 유속으로 전개하고, 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 BTC 분획을 풀한다. 계속해서 이 분획에 등량의 2 M 아세트산, 4 M 포름산나트륨, 3 M 요소용액을 첨가한 후, 3,4-디아미노안식향산을 40 mM 농도로 되도록 첨가하여 탈기, 질소가스 시일을 실시하여 25 ℃ 에서 5 일간 반응한다. 반응종료후, 반응액을 50 mM 인산완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (46 mmID ×600 mmL) 에 통액하고, 평형화에 사용한 완충액을 10 ㎖/min 의 유속으로 전개하여 N 말단에 메티오닌이 부가되어 있지 않는 BTC 분획을 풀한다. 풀한 BTC 분획을 pH 6.0 으로 조정한 후, 50 mM 인산완충액 + 0.1 M NaCL + 2.5 M 요소 (pH 5.0) 로 평형화한 CM-5PW (21.5 mmID ×150 mmL, 도소(주)) 에 흡착한 후, 0-100 % B (B = 50 mM 붕산완충액 + 0.1 M NaCl + 2.5 M 요소, pH 9.0) 의 단계구배에서 60 분간, 6 ㎖/min 의 유속으로 용출하여 BTC 분획을 풀한다. 그리고, BTC 분획을 0.1 % TFA 로 평형화한 C4P-50 (10 mmID ×250 mmL, 쇼와덴코(주)) 에 흡착한 후, 20-60 % B (B = 80 % 아세토니트릴/0.1 % TFA) 의 단계구배로 40 분간, 2 ㎖/min 의 유속으로 용출한다. BTC 의 분획을 풀한 후, 동결건조시켜 BTC 약 2.6 ㎎ 을 얻는다.
<실시예 16> BTC 의 특징결정
a) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 분석
실시예 15 에서 얻어진 BTC 를 샘플 버퍼 [Laemmli, Nature, 227, 680(1970)] 에 현탁하여 100 ℃ 에서 1 분간 가열한 후, 멀티 겔 15/25 (다이이치가가쿠야쿠힌(주)) 로 전기영동을 실시한다. 영동후의 겔을 쿠마씨 브릴리언트 블루 로 염색한 결과, 단일밴드의 단백질이 인정되고, 정제품은 거의 단일했다 (도 2).
b) N 말단 아미노산 서열 분석
N 말단 아미노산 서열을 기상 프로테인 시퀀서 (어플라이드 바이오시스템 모델 477A) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, 얻어진 BTC 의 cDNA 의 염기서열로부터 추정한 BTC 의 N 말단 아미노산 서열과 일치하였다 (표 6).
잔기No. 검출된 PTH1)-아미노산 (pmol) BTC의 염기서열로부터예측되는 (pmol)아미노산
1234567891011121314151617181920 Asp(261)Gly(457)Asn(300)Ser(107)Thr( 75)Arg(181)Ser(121)Pro(245)Glu( 55)Thr( 71)Asn(133)Gly(149)Leu(132)Leu(155)N.D.Gly(111)Asp( 70)Pro( 65)Glu( 29)Glu( 64) AspGlyAsnSerThrArgSerProGluThrAsnGlyLeuLeuCysGlyAspProGluGlu
1 nmol을 사용하여 분석을 실시함.N.D.미검출1) 페닐티오히단토인
c) 아미노산 조성 분석
아미노산 조성을 아미노산 분석계 (베크만 시스템 6300E) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, BTC 의 cDNA 의 염기서열로부터 추정한 아미노산 조성과 일치한다 (표 7).
아미노산 1 몰당 잔기수 BTC의 염기서열로부터예측되는 값
AsxThr1) Ser1)GlxProGlyAla Cys2)ValMetIleLeuTyrPheHisLysArgTrp 7.06.14.89.33.87.14.0N.D.3.901.93.03.73.32.35.06.90 765947484023432570
산가수분해 (6N 염산-1% 페놀, 110℃, 24·48시간, 가수분해의 평균치).1) 0시간에 외삽한 값2) 미검출대략 20㎍을 사용하여 분석을 실시함.
d) C 말단 아미노산 분석
C 말단 아미노산을 아미노산 분석계 (베크만시스템 6300E) 를 사용하여 결정한다. 얻어진 BTC 는 cDNA 의 염기서열로부터 추정한 C 말단 아미노산과 일치한다 (표 8).
C 말단 아미노산 분석
BTC C 말단 아미노산 회수율 (%)
Tyr 44.6
기상히드라진분해법 (100℃, 3.5 시간)15 nmol을 사용하여 분석을 실시함.
e) BTC 의 생물활성
정제품은 모레큘러·셀·바이올로지, 8,588(1988) 에 기재한 방법에 의해, BALB/C3T3 A31-714 클론4 (인터네셔널·저널·오브·캔서,12, 463 (1973)) 를 사용한 활성측정을 실시하여 표준품과 동등한 활성을 가짐을 확인하였다.
<실시예 17>
일본 공개특허공보 평10-72489 호 (EP-A-812856 호) 의 참고예 5 의 방법에 의해 취득한 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖는 사람 인터루킨-2 (Met-IL-2) 50 ㎎ 을 4 M 요소용액 40 ㎖ 에 용해한 후, 100 mM 황산구리 2.5 ㎖, 글리옥실산 2.5 g, 피리딘 5.0 ㎖ 의 혼합액을 첨가하여 25 ℃ 에서 1 시간 반응시킨다. 반응종료후, 반응액을 10 mM 인산완충액 + 2.5 M 요소 (pH 5.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (45 mmID ×600 mmL) 에 통액하고, 평형화에 사용한 용액을 10 ㎖/min 의 유속으로 전개하여 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 IL-2 분획을 풀한다. 계속해서 이 분획에 등량의 2 M 아세트산, 4 M 포름산나트륨, 3 M 요소용액을 첨가한 후, 3,4-디아미노안식향산을 40 mM 농도로 되도록 첨가하여 탈기, 질소가스 시일을 실시하여 25 ℃ 에서 5 일간 반응시킨다. 반응종료후, 반응액을 10 mM 인산완충액 + 2.5M 요소 (pH 5.0) 로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (46 mmID ×600 mmL) 에 통액하고, 평형화에 사용한 완충액을 10 ㎖/min 의 유속으로 전개하여 N 말단에 메티오닌이 부가되어 있지 않는 IL-2 분획을 풀한다. 풀한 IL-2 분획을 25 mM 인산완충액 (pH 7.0) 으로 평형화한 SP-5PW (21.5 mmID ×150 mmL, 도소(주)) 에 흡착한 후, 30-80 % B (B = 25 mM 인산완충액, pH 8.0) 의 단계구배로 60 분간, 6 ㎖/min 의 유속으로 용출하여 17.3 ㎎ 의 IL-2 분획을 얻는다.
실시예 18 (IL-2 의 특징 결정)
a) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 분석
실시예 17 에서 얻어진 IL-2 를 Sample buffer [Laemmli, Nature,227, 680 (1970)] 에 현탁하여 100 ℃ 에서 1 분간 가열한 후, 멀티 겔 15/25 (다이이치가가쿠야쿠힌(주)) 로 전기영동을 실시한다. 영동후의 겔을 Coomassie brilliant blue 로 염색한 결과, 단일밴드의 단백질이 인정되고, 정제품은 거의 단일했다 (도 3).
b) N 말단 아미노산 서열 분석
N 말단 아미노산 서열을 기상 프로테인 시퀀서 (어플라이드 바이오시스템 모델 477A) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, 얻어진 IL-2 의 cDNA 의 염기서열에서 추정한 IL-2 의 N 말단 아미노산 서열과 일치한다 (표 9).
잔기No. 검출된 PTH1)-아미노산 (pmol) IL-2의 염기서열로부터예측되는 아미노산
12345678910 Ala(701)Pro(354)Thr(359)Ser(122)Ser(128)Ser( 78)Thr( 46)Lys(176)Lys( 61)Thr( 40) AlaProThrSerSerSerThrLysLysThr
1 nmol을 사용하여 분석을 실시함.1) 페닐티오히단토인
c) 아미노산 조성 분석
아미노산 조성을 아미노산 분석계 (베크만시스템 6300E) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, IL-2 의 cDNA 의 염기서열로부터 추정한 아미노산 조성과 일치하였다 (표 10).
아미노산 1 몰당 잔기수 IL-2의 염기서열로부터예측되는 값
AsxThr1) Ser1)GlxProGlyAla Cys2)ValMetIleLeuTyrPheHisLysArgTrp 11.812.97.018.44.82.04.8N.D.3.53.87.722.02.85.62.910.33.70.9 12138185253449223631141
산가수분해 (6N 염산-4% 티오글리콜산, 110℃, 24·48시간, 가수분해의 평균치).1) 0 시간에 외삽한 값2) 미검출
d) C 말단 아미노산 분석
C 말단 아미노산을 아미노산 분석계 (베크만시스템 6300E) 를 사용하여 결정한다. 얻어진 IL-2 는 cDNA 의 염기서열로부터 추정한 C 말단 아미노산과 일치하였다 (표 11).
C 말단 아미노산 분석
IL-2 C 말단 아미노산 회수율 (%)
Thr 32.5
기상히드라진분해법 (100℃, 3.5시간)15 nmol을 사용하여 분석을 실시함.
e) IL-2 의 생물활성
생물활성측정은 IL-2 의존세포를 사용하는 히누마 등의 방법 [바이오케미컬·바이오피지컬·리서치·커뮤니케이션즈 (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 109,363(1982)] 에 따라 실시하여 표준품과 동등한 활성을 가짐을 확인하였다.
<실시예 19> Met-hGH 의 활성화
참고예 2 에서 얻어진 균체 1 ㎏ 에 50 mM 트리스/아세트산, 8 M 구아니딘 염산염 용액 (pH 8.5) 4 ℓ를 첨가하여 균체를 용해한 후, 원심분리 (10,000 rpm) 를 실시한다. 얻어진 상청액 약 4 ℓ에 50 mM 트리스/아세트산, 1.09 mM 환원형 글루타티온, 0.055 mM 산화형 글루타티온, 109 mM 아르기닌, 4.36 M 요소용액 (pH 8.0) 44 ℓ를 첨가하여 4 ℃ 에서 3 일간 활성화를 실시한다. 활성화가 종료된 액을 페리콘카세트시스템 (바이오맥스 8 막, 밀리포어사) 으로 20 mM 트리스/아세트산, 2.5 M 요소용액 (pH 8.0) 약 25 ℓ를 첨가하면서 전기전도도가 5 mS/㎝ 이하로 될 때까지 농축탈염을 실시한다. 다시, 20 mM 트리스/아세트산 용액 (pH 8.0) 약 35 ℓ를 첨가하면서 탈염을 실시한 후, 원심분리 (10,000 rpm) 를 실시하여 상청을 얻는다. 이어서, 상청액을 20 mM 트리스/아세트산용액 (pH 8.0) 으로 평형화한 DEAE-토요펄 650M 칼럼 (30 ㎝φ×60 ㎝, 도소사) 에 흡착시키고, 20 mM 트리스/아세트산용액 (pH 8.0) 및 20 mM 트리스/아세트산, 25 mM 염화나트륨 용액 (pH 8.0) 으로 충분히 세정한 후, 20 mM 트리스/아세트산, 55 mM 염화나트륨 용액 (pH 8.0) 으로 용출을 실시하여 Met-hGH 분획으로서 50 ℓ의 용출액을 얻는다. 이 용출액을 페리콘카세트시스템 (바이오맥스 8 막, 밀리포어사) 으로 농축탈염하여 Met-hGH 를 얻는다.
실시예 20 (Met-hGH 의 활성화)
참고예 2 에서 얻어진 균체 1 ㎏ 에 50 mM 트리스/아세트산, 8 M 구아니딘염산염 용액 (pH 8.5) 4 ℓ를 첨가하여 균체를 용해한 후, 원심분리 (10,000 rpm) 를 실시한다. 얻어진 상청액 약 4 ℓ에 50 mM 트리스/아세트산, 5.45 mM 시스테인염산염일수화물, 109 mM 아르기닌, 4.91 M 요소용액 (pH 8.0) 44 ℓ를 첨가하여 4 ℃ 에서 3 일간 활성화를 실시한다. 활성화된 Met-hGH 의 양은 실시예 19 의 약 1.2 배 많게 얻어진다. 활성화가 종료된 액을 페리콘카세트시스템 (바이오맥스 8 막, 밀리포어사) 으로 20 mM 트리스/아세트산, 2.5 M 요소용액 (pH 8.0) 25 ℓ를 첨가하면서 전기전도도가 5 mS/㎝ 이하로 될 때까지 농축탈염을 실시한다. 다시, 20 mM 트리스/아세트산 용액 (pH 8.0) 약 35 ℓ를 첨가하면서 탈염을 실시한 후, 원심분리 (10,000 rpm) 를 실시하여 상청을 얻는다. 이어서, 상청액을 20 mM 트리스/아세트산용액 (pH 8.0) 으로 평형화한 DEAE-토요펄 650M 칼럼 (30 ㎝φ×60 ㎝, 도소사) 에 흡착시키고, 20 mM 트리스/아세트산용액 (pH 8.0) 및 20 mM 트리스/아세트산, 25 mM 염화나트륨 용액 (pH 8.0) 으로 충분히 세정한 후, 20 mM 트리스/아세트산, 55 mM 염화나트륨 용액 (pH 8.0) 으로 용출하여 Met-hGH 분획으로서 50 ℓ의 용출액을 얻는다. 이 용출액을 페리콘카세트시스템 (바이오맥스 8 막, 밀리포어사) 으로 농축탈염하여 Met-hGH 를 얻는다.
실시예 21 (Met-hGH 의 활성화)
참고예 2 에서 얻어진 균체 1.25 g 에 50 mM 트리스/아세트산, 8 M 구아니딘염산염 용액 (pH 8.5) 5 ㎖ 를 첨가하여 균체를 용해한 후, 원심분리 (10,000 rpm)를 실시한다. 얻어진 상청액 약 5 ㎖ 에 50 mM 트리스/아세트산, 5.45 mM N-아세틸-L-시스테인, 109 mM 아르기닌, 4.91 M 요소용액 (pH 8.0) 55 ㎖ 를 첨가하여 4 ℃ 에서 3 일간 활성화를 실시한다. 그 결과, 시스테인염산염일수화물을 첨가한 경우 (실시예 20) 와 동등한 Met-hGH 의 활성화효율이 인정되었다.
실시예 22 (Met-hGH 의 활성화)
참고예 2 에서 얻어진 균체 1.25 g 에 50 mM 트리스/아세트산, 8 M 구아니딘염산염 용액 (pH 8.5) 5 ㎖ 를 첨가하여 균체를 용해한 후, 원심분리 (10,000 rpm) 를 실시한다. 얻어진 상청액 약 5 ㎖ 에 50 mM 트리스/아세트산, 5.45 mM 시스테인염산염, 109 mM 아르기닌, 4.91 M 요소용액 (pH 8.0) 55 ㎖ 를 첨가하여 4 ℃ 에서 3 일간 활성화를 실시한다. 그 결과, 시스테인염산염일수화물을 첨가한 경우 (실시예 20) 와 동등한 Met-hGH 의 활성화효율이 인정되었다.
실시예 23
일본 공개특허공보 평10-72489 호 (EP-A-812856 호) 의 참고예 3 에 기재된 방법에 의해 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖는 사람 뉴로트로핀-3 (Met-NT-3) 을 제조한다.
N 말단에 메티오닌이 부가된 사람 뉴로트로핀-3(Met-NT-3) 50 ㎎ 을 3 M 요소용액 8 ㎖ 에 용해하고, 0.2 M 황산구리 0.4 ㎖, 글리옥실산 0.5 g, 피리딘 1 ㎖ 의 혼합액을 첨가하여 10 m 로 한 후, 25 ℃ 에서 1 시간 반응한다. 반응종료후, 반응액을 2.5 M 요소 + 10 mM 인산완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (25 mmID ×600 mmL) 에 통액하고, 평형화에 사용한 용액을 4 ㎖/min 의유속으로 전개하여 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 NT-3 분획을 풀한다. 계속해서 이 분획에 등량의 2 M 아세트산, 4 M 포름산나트륨, 3 M 요소용액을 첨가한 후, 3,4-디아미노안식향산을 40 mM 농도로 되도록 첨가하여 25 ℃ 에서 5 일간 반응한다. 반응종료후, 반응액을 2.5 M 요소 + 10 mM 인산완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (46 mmID ×600 mmL) 에 통액하고, 평형화에 사용한 완충액을 10 ㎖/min 의 유속으로 전개하여 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 사람 뉴로트로핀-3 (NT-3) 분획을 풀한다. 풀한 NT-3 분획을 pH 5.0 으로 조정한 후, 50 mM 인산완충액 + 0.2 M NaCl + 2.5 M 요소 (pH 5.0) 으로 평형화한 CM-5PW (21.5 mmID ×150 mmL, 도소(주)) 에 흡착한 후, 0-100 % B (B = 50 mM 인산완충액 + 0.2 M NaCl + 2.5 M 요소, pH 8.0) 의 단계구배로 60 분간, 6 ㎖/min 의 유속으로 용출하여 NT-3 분획을 풀한다. 그리고, NT-3 분획을 0.1 % TFA 로 평형화한 C4P-50 (21.5 mmID ×300 mmL, 쇼와덴코(주)) 에 흡착한 후, 20-60 % B (B = 80 % 아세토니트릴/0.1 % TFA) 의 단계구배로 40 분간, 5 ㎖/min 의 유속으로 용출한다. NT-3 의 분획을 풀한 후, 동결건조시켜 NT-3 의 동결건조 분말 약 5 ㎎ 을 얻는다.
실시예 24 (NT-3 의 특징 결정)
a) N 말단 아미노산 서열 분석
N 말단 아미노산 서열을 기상 프로테인 시퀀서 (어플라이드 바이오시스템 모델 477A) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, cDNA 의 염기서열로부터 추정한 NT-3 의 N 말단 아미노산 서열과 일치하였다 (표 12).
잔기No. 검출된 PTH*)-아미노산 (pmol) NT-3의 염기서열로부터예측되는 아미노산
1234567891011121314151617181920 Tyr(410)Ala(521)Glu(155)His(213)Lys(587)Ser( 91)His(161)Arg(318)Gly(214)Glu(108)Tyr(104)Ser( 50)Val(208)N.D.Asp( 99)Ser( 41)Glu( 24)Ser( 27)Leu( 63)Trp( 26) TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCysAspSerGluSerLeuTrp
1 nmol을 사용하여 분석을 실시함.N.D. 미검출*)페닐티오히단토인
b) 아미노산 조성 분석
아미노산 조성을 아미노산 분석계 (베크만시스템 6300E) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, NT-3 의 cDNA 의 염기서열로부터 추정한 아미노산 조성과 일치하였다 (표 13).
아미노산 1 몰당 잔기수 NT-3의 염기서열로부터예측되는 값
AsxThr*) Ser*)GlxProGlyAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisLysArgTrp 11.08.710.411.01.78.04.8N.D.8.706.75.05.11.24.39.79.63.8 11912112856907551410104
산가수분해 (6N 염산-4% 티오글리콜산, 110℃, 24·48시간, 가수분해의 평균치).N.D. 미검출*) 0 시간에 외삽한 값대략 20㎍ 을 사용하여 분석을 실시함.
d) C 말단 아미노산 분석
C 말단 아미노산을 아미노산 분석계 (베크만시스템 6300E) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, cDNA 의 염기서열로부터 추정한 C 말단 아미노산과 일치하였다 (표 14).
NT-3 C 말단 아미노산 회수율 (%)
Thr 42.0
기상히드라진분해법 (100℃, 3.5시간)15 nmol을 사용하여 분석을 실시함.
e) NT-3 의 생물활성
실시예 23 에서 얻어진 NT-3 에 대하여 DRG (닭 유정란을 부란기에서 37.5 ℃, 8-10 일간 요란(搖卵)하여 배(胚)발생을 실시한 태아로부터 적출한 후에 신경절 (Dorsal root ganglia)) 을 사용한 생물활성측정을 실시하여 CHO 세포로부터 얻어진 NT-3 와 동등한 활성을 가짐을 확인하였다.
<실시예 25>
실시예 2 에서 얻어진 Met-hGH 용액 14.75 ㎖ 를 6 M 요소용액으로 60 ㎖ 로 한 후, 0.5 M 황산구리 1.2 ㎖, 글리옥실산 3.75 g, 피리딘 7.5 ㎖ 의 혼합액을 첨가하여 75 ㎖ 로 한 후, 25 ℃ 에서 1 시간 반응시킨다. 반응종료후, 반응액을 4 M 요소 + 20 mM 트리스완충액 (pH 8.0) 으로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (4.6 ㎝ID ×60 cmL) 에 통액하고, 평형화에 사용한 용액을 10 ㎖/min 의 유속으로 전개하고, 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 hGH 분획을 풀한다. 계속해서 이 분획에 등량의 2 M 아세트산, 4 M 포름산나트륨, 4 M 요소용액을 첨가한 후, 3,4-디아미노안식향산을 40 mM 농도로 되도록 첨가하여 30 ℃ 에서 4 일간 반응시킨다. 반응종료후, 반응액을 4 M 요소 + 20 mM 트리스완충액 (pH 8.0) 으로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (11.3 ㎝ID ×80 ㎝L) 에 통액하고, 평형화에 사용한 완충액을 30 ㎖/min 의 유속으로 전개하여 N 말단에 메티오닌이 부가되어 있지 않는 hGH 분획을 풀한다. 풀한 hGH 분획을 50 mM 트리스완충액 + 2.5 M 요소 (pH 8.0) 로 평형화한 DEAE-5PW (5.5 ㎝ID ×20 ㎝L, 도소(주)) 에 흡착한 후, 0-100 % B (B = 50 mM MES + 2.5 M 요소, pH 4.0) 의 단계구배로 60 분간, 15 ㎖/min 의 유속으로 용출하여 hGH 약 60 ㎎ 을 취득한다.
실시예 26 사람 아페린-36 구조유전자의 조제
도 4 에 나타낸 6 종류의 DNA 단편 (#1, #5 : 구라이나·저팬사, #2, #6 : 키코테크사, #3,#4 : 아마샴·파르마시아·바이오테크) 을 사용하여 아페린-36 의 구조유전자를 조제한다 (도 5).
a) DNA 올리고머의 인산화
5' 말단에 가능한 한 #1 및 #6 을 제외한 4 종류의 올리고머 각 1 ㎍ 을 100 μL 의 인산화반응액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 1 mM 스페르미딘, 10 mM 디티오트레이톨, 0.1 ㎎/㎖ 소 혈청알부민, 1mM ATP, 10 유닛 T4 폴리누클레오티드키나아제 (닛폰진)] 중에서 37 ℃, 1 시간 반응시키고, 5' 말단의 인산화를 실시한다. 페놀처리를 실시한 후, 수층을 회수하여 2 배량의 에탄올을 첨가하고, -70 ℃ 로 냉각한 후, 원심으로 DNA 를 침전시킨다.
b) DNA 프래그먼트의 연결
상기 a) 에서 얻어진 인산화 DNA 프래그먼트와 #1 및 #2 각 1 ㎍ 을 합하여 120 ㎕ 로 한다. 이 혼합액을 80 ℃ 에서 10 분간 유지한 후, 실온까지 서서히 냉각하여 어닐링을 실시한다. TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (다카라슈조) 를사용하여 라이게이션반응을 실시한다. 어닐링액 30 ㎕ 에 Ⅱ 액 30 ㎕ 를 첨가하여 잘 혼합한 후, Ⅰ액 60 ㎕ 를 첨가하여 37 ℃, 1 시간 반응시키고, 라이게이션을 실시한다. 페놀처리를 실시한 후, 수층을 회수하여 2 배량의 에탄올을 첨가하여 -70 ℃ 로 냉각한 후, 원심으로 DNA 를 침전시킨다.
c) 5' 말단의 인산화
침전을 TE 완충액 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) 10 ㎕ 에 용해하고, 100 ㎕ 의 인산화반응액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 1 mM 스페르미딘, 10 mM 디티오트레이톨, 0.1 ㎎/㎖ 소 혈청알부민, 1 mM ATP, 10 유닛 T4 폴리누클레오티드키나아제 (닛폰진)] 중에서 37 ℃, 1 시간 반응시키고, 5' 말단의 인산화를 실시한다. 페놀처리를 실시한 후, 수층을 회수하여 2 배량의 에탄올을 첨가하여 -70 ℃ 로 냉각한 후, 원심으로 DNA 를 침전시켜 20 ㎕ 의 TE 완충액에 용해한다.
<실시예 27> 사람 아페린-36 발현 플라스미드의 조제
pTB960-2 (EP-A-499990 : 코야마 등, 저널·오브·바이오테크놀로지, 32 권, 273 페이지) 를 XbaI 및 AvaI 로 소화하고, 1 % 아가로스 전기영동을 실시하여 약 4.4 Kbp 의 DNA 단편을 QIAquick Gel Extraction Kit (키아겐사) 를 사용하여 추출하고, 25 ㎕ 의 TE 완충액에 용해한다. 이 pTB960-2 의 XbaI, AvaI 단편과 상기에 의해 조제한 사람 아페린-36 의 구조유전자를 TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (다카라슈조) 를 사용하여 라이게이션반응을 실시한다. 즉, pTB960-2 의 XbaI,AvaI 단편용액 1 ㎕ 와 사람 아페린-36 의 구조유전자 용액 4 ㎕ 를 혼합하고, Ⅰ 액 5 ㎕ 를 첨가하여 16 ℃, 30 분간 반응시키고, 라이게이션을 실시한다. 라이게이션액 10 ㎕ 를 사용하여 이. 콜라이 (E. coli) JM109 콤피턴트 세포 (도요보) 을 형질전환하고, 10 μg/ml 의 테트라사이클린을 함유하는 LB 한천배지상에 파종하고, 37 ℃ 에서 1 일 배양하여 발생한 테트라사이클린 내성 콜로니를 선택한다. 이 형질전환체를 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, QIAprep8 Miniprep Kit (키아겐사) 를 사용하여 플라스미드 pTB960-13 을 조제한다. 이 사람 아페린-36 구조유전자 부분의 염기서열을 어플라이드 바이오시스템즈사 모델 377DNA 시퀀서를 사용하여 확인한다. 플라스미드 pTB960-13 을 대장균 BL21(DE3) 주 (Novagen 사) 로 형질전환을 실시하고, 10 ㎍/㎖ 의 테트라사이클린을 포함하는 LB 한천배지상에 파종하고, 37 ℃ 에서 1 일 배양하여 사람 아페린-36-CS23 융합 단백질 발현주 BL21(DE3)/pTB960-13 을 얻는다 (도 6). 이 형질전환대장균 BL21(DE3)/pTB960-13 은 수탁번호 FERM BP-6590 으로 1998년 12월 2일부로 통산성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁되었다. 또한, 1998년 11월 11일부로 수탁번호 IFO16220 으로서 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 기탁되었다.
<실시예 28>
실시예 27 에서 얻어진 형질전환세포를, 5.0 ㎎/ℓ의 테트라사이클린을 포함하는 LB 배지 (1 % 펩톤, 0.5 % 효모엑기스, 0.5 % 염화나트륨) 1 ℓ를 사용하여 2 ℓ용량의 플라스크중에서 37 ℃, 8 시간 진탕배양한다. 얻어진 배양액을 19 ℓ의 주발효배지 (1.68 % 인산일수소나트륨, 0.3 % 인산이수소칼륨, 0.1 % 염화암모늄, 0.05 % 염화나트륨, 0.05 % 황산마그네슘, 0.02 % 소포제, 0.00025 % 황산제일철, 0.00025 % 염산티아민, 1.5 % 포도당, 1.5 % 카자미노산) 를 함유한 50 ℓ용량 발효조로 이식하여 30 ℃ 에서 통기교반배양을 개시한다. 배양액의 탁도가 약 500 크레트 단위로 된 시점에서 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드의 최종농도가 12 ㎎/ℓ로 되도록 첨가하고, 그리고 4 시간 배양을 실시한다. 배양종료후, 배양액을 원심분리하고, 약 660 g 의 습균체를 취득하여 -80 ℃ 에서 동결보존한다.
<실시예 29> 사람 아페린-36 의 취득
실시예 28 에서 얻은 균체 550 g 에 10 mM EDTA + 1 mM (p-아미디노페닐)메탄술포닐플루오리드염산염 (pH 6.0) 용액 1500 ㎖ 를 첨가하고, 초음파처리 (BRANSON SONIFIER MODEL 450) 한 후, 원심분리 (10000 rpm, 60 min) 를 실시한다. 상징액은 풀하고, 침전은 다시 동일한 조작을 실시한다. 풀한 상징액은 pH 6.0 으로 조정하고, 50 mM 인산완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 AF-헤파린 토요펄 (Heparin Toyopearl) 650 M 칼럼 (30 mmID ×500 mmL, 도소) 에 통액하고, 흡착, 세정한 후, 0-100 % B (B = 50 mM 인산완충액 + 2 M NaCl, pH 6.0) 의 단계구배로 용출하여 530 ㎖ 의 사람 아페린-36-CS23 융합 단백질 분획을 얻는다.
이 용출액을 페리콘미니카세트 (밀리포어사) 로 0.1 M 아세트산을 첨가하면서 농축하여 사람 아페린-36-CS23 융합단백질의 0.1 M 아세트산 용액을 얻는다. 이 용액에 최종농도 6 M 으로 되도록 요소를 첨가한 후, 1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄염 (DMAP-CN) 35 ㎎ 을 첨가하여 실온에서 15 분간 반응시킨다. 반응종료후, 반응액을 10 % 아세트산으로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (46 mmID ×600 mmL, 파르마시아) 에 통액하고, 평형화에 사용한 10 % 아세트산을 6 ㎖/min 의 유속으로 전개하여 S-시아노화된 사람 아페린-36-CS23 융합 단백질 분획을 얻는다. 이 용출액을 페리콘미니카세트 (밀리포어사) 로 농축·탈염을 실시하여 사람 아페린-36-CS23 융합 단백질의 탈염액을 얻는다. 이 탈염액에 최종농도 6 M 으로 되도록 요소를 첨가한 후, 다시 0.06 N 농도가 되도록 1N 가성소다를 첨가하여 0 ℃ 에서 15 분간 반응한다. 반응종료후, 아세트산으로 pH 6.0 으로 조정하여 사람 아페린-36 을 얻는다. 이 반응액을 3 M 요소를 함유하는 50 mM 인산완충액 (pH 6.5) 으로 평형화한 SP-5PW (21.5 mmID ×150 mmL, 도소) 에 통액하고, 흡착, 세정한 후, 0-40 % B (B = 50 mM 인산완충액 + 1M NaCl + 3M 요소, pH 6.5) 의 단계구배로 용출을 실시하여 사람 아페린-36 분획을 얻는다. 이 사람 아페린-36 분획을 다시 0.1 % 트리플루오로아세트산 (TFA) 으로 평형화한 C4P-50 (21.5 mmID ×300 mmL, 쇼와덴코) 에 통액하고, 흡착, 세정한 후, 15-30 % B (B : 80 % 아세토니트릴/0.1 % TFA) 의 단계구배로 용출을 실시하여 사람 아페린-36 분획을 풀한 후, 동결건조시켜 사람 아페린-36 동결건조분말을 얻는다.
a) 아미노산 조성 분석
아미노산 조성을 아미노산 분석계 (히다치 L-8500A Amino Acid Analyzer) 를 사용하여 결정한다.
그 결과, N 말단에 메티오닌 잔기를 갖는 사람 아페린-36 의 DNA 염기서열로부터 예상되는 아미노산 조성과 일치하였다 (표 15).
아미노산 조성 분석
아미노산 1 몰당 잔기수 사람아페린-36의 염기서열로부터예측되는 값
AsxThr1) Ser1)GlxProGlyAla Cys2)ValMetIleLeuTyrPheHisLysArgTrp 1.001.93.05.75.70N.D.1.02.002.001.91.01.87.30.9 102366001102021281
산가수분해 (6N 염산-4% 티오글리콜산, 110℃, 24, 48시간 가수분해)1) 0 시간에 외삽한 값2) 미검출
b) N 말단 아미노산 서열 분석
N 말단 아미노산 서열을 기상 프로테인 시퀀서 (어플라이드 바이오시스템 모델 477A) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, 얻어진 사람 아페린-36 의 N 말단에는 메티오닌이 부가되어 있는 것 외에는 DNA 염기서열로부터 예상되는 N 말단 아미노산 서열과 일치하였다 (표 16).
N 말단 아미노산 서열
잔기No. 검출된 PTH1)-아미노산 (pmol) 사람아페린-36의 염기서열로부터예측되는 아미노산
1234567891011121314151617181920 Met(526)Leu(648)Val(513)Gln(437)Pro(463)Arg(216)Gly(232)Ser(129)Arg(129)Asn(142)Gly(185)Pro(219)Gly(202)Pro(188)Trp( 88)Gln(116)Gly(120)Gly( 72)Arg( 56)Arg( 40) LeuValGlnProArgGlySerArgAsnGlyProGlyProTrpGlnGlyGlyArgArg
1 nmol을 사용하여 분석을 실시함.1) 페닐티오히단토인
(c) C 말단 아미노산 분석
C 말단 아미노산을 아미노산 분석계 (히다치L-8500A, Amino Acid Analyzer) 를 사용하여 분석한다 (표 17).
C 말단 아미노산 분석
사람아페린-36 C 말단 아미노산 회수율 (%)
Phe 38.6
기상히드라진분해법 (100 ℃, 6시간)
이상의 결과로부터, 실시예 29 에서 얻어진 사람 아페린-36 은 그 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖는 분자종 (Met-사람 아페린-36) 임을 알 수 있다.
<실시예 30> 생물활성 측정
실시예 29 에서 취득한 Met-사람아페린-36 을 사용하여 일본 특허출원 평10-271645 호의 실시예 6 에 기재된 방법 (사이토센서) 으로 활성을 측정하여 사람 아페린-36 의 합성품과 동등한 활성을 가짐을 확인하였다.
<실시예 31> N 말단의 메티오닌 잔기의 제거
실시예 29 에서 취득한 Met-사람아페린-36 4 ㎎ 을 3 M 요소용액 0.8 ㎖ 에 용해한 후, 80 mM 황산구리 0.05 ㎖, 글리옥실산 0.046 g, 피리딘 0.1 ㎖ 의 혼합액을 첨가하여 25 ℃ 에서 1 시간 반응한다. 반응종료후, 반응액을 2.5 M 요소 + 10 mM 인산완충액 (pH 5.5) 으로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (10 mmID ×250 mmL) 에 통액하고, 평형화에 사용한 용액을 0.5 ㎖/min 의 유속으로 전개하여 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 사람 아페린-36 분획을 풀한다. 게속해서 이 분획에 등량의 2 M 포름산나트륨, 4 M 아세트산, 3 M 요소용액을 첨가한 후, 3,4-디아미노안식향산을 40 mM 농도로 되도록 첨가하여 30 ℃ 에서 3 일간 반응한다. 반응종료후, 반응액을 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 세파덱스 G-25 칼럼 (25 mmID ×600 mmL) 에 통액하고, 평형화에 사용한 용액을 4 ㎖/min 의 유속으로 전개하여 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 사람 아페린-36 분획을 풀한다. 풀한 사람 아페린-36 분획을 pH 6.0 으로 조정하고, 50 mM 인산 완충액 + 0.1 M NaCl + 2.5 M 요소 (pH 5.0) 로 평형화한 CM-5PW (7.5 mmID ×75 mmL, 도소(주)) 에 흡착한 후, 0-100 % B (B = 50 mM 붕산완충액 + 0.1 M NaCl + 2.5 M 요소, pH 9.0) 의 단계구배로 40 분간, 0.8 ㎖/min 의 유속으로 용출하여 사람 아페린-36 분획을 풀한다. 그리고, 사람 아페린-36 을 0.1 % TFA 로 평형화한 C4P-50 (10 mmID ×250 mmL, 쇼와덴코(주)) 에 흡착한 후, 15-30 % B (B = 80 % 아세토니트릴/0.1 % TFA) 의 단계구배로 40 분간, 2 ㎖/min 의 유속으로 용출한다. 사람 아페린-36 의 분획을 풀한 후, 동결건조시켜 사람 아페린-36 을 취득한다.
a) 아미노산 조성 분석
아미노산 조성을 아미노산 분석계 (히다치L-8500A Amino Acid Analyzer) 를 사용하여 결정한다.
그 결과, hA10L 의 DNA 염기서열로부터 예상되는 아미노산 조성과 일치한다 (표 18).
아미노산 조성 분석
아미노산 1 몰당 잔기수 사람아페린-36의 염기서열로부터예측되는 값
AsxThr1) Ser1)GlxProGlyAla Cys2)ValMetIleLeuTyrPheHisLysArgTrp 1.001.92.96.35.90N.D.1.01.002.001.91.01.97.60.9 102366001102021281
산가수분해 (6N 염산-4% 티오글리콜산, 110℃, 24, 48시간 가수분해)1) 0 시간에 외삽한 값2) 미검출
b) N 말단 아미노산 서열 분석
N 말단 아미노산 서열을 기상 프로테인 시퀀서 (어플라이드 바이오시스템즈 모델 477A) 를 사용하여 결정한다. 그 결과, 얻어진 사람 아페린-36 의 DNA 염기서열로부터 예상되는 N 말단 아미노산 서열과 일치하였다 (표 19).
N 말단 아미노산 서열
잔기No. 검출된 PTH1)-아미노산 (pmol) 사람아페린-36의 염기서열로부터예측되는 아미노산
1234567891011121314151617181920 Leu(475)Val(845)Gln(365)Pro(563)Arg(425)Gly(424)Ser(139)Arg(423)Asn(245)Gly(290)Pro(197)Gly(234)Pro(197)Trp(101)Gln( 76)Gly( 84)Gly(130)Arg( 79)Arg(116)Lys( 43) LeuValGlnProArgGlySerArgAsnGlyProGlyProTrpGlnGlyGlyArgArgLys
1 nmol을 사용하여 분석을 실시함.1) 페닐티오히단토인
(c) C 말단 아미노산 분석
C 말단 아미노산을 아미노산 분석계 (히다치L-8500A, Amino Acid Analyzer) 를 사용하여 분석한다 (표 20).
C 말단 아미노산 분석
사람아페린-36 C 말단 아미노산 회수율 (%)
Phe 86.6
기상히드라진분해법 (100 ℃, 6시간)
실시예 32 (생물활성 측정)
실시예 31 에서 취득한 사람 아페린-36 을 사용하여 일본 특허출원 평10-271646 호의 실시예 6 에 기재된 방법 (사이토센서) 로 활성을 측정하여 사람 아페린-36 의 합성품과 동등한 활성을 가짐을 확인하였다.
본 발명에 의해, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드, 단백질 또는 그 염으로부터 이 메티오닌 잔기만을 선택특이적이고 효율적으로 제거하여, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 펩티드, 단백질 또는 그 염을 효율적으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면, 펩티드 또는 단백질의 종류에 관계없이, 또한 온화한 조건하에서 N 말단의 메티오닌 잔기를 화학적으로 제거할 수 있기 때문에, 유전자공학적 수법에 의해 제조된 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드, 단백질 또는 그 염을 원료로 하여 천연형 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 단백질을 공업적으로 유리하게 제조할 수 있다.

Claims (16)

  1. N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염을, 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨, 또는 포름산 및 아세트산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 상기 메티오닌 잔기의 디케톤체의 제거방법.
  2. 제 1 항에 있어서, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염이, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염을 α-디케톤류와 반응시킴으로써 얻어지는 펩티드 또는 그 염인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드가 유전자공학적으로 제조된 펩티드인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 펩티드가 (ⅰ) 성장호르몬, (ⅱ) 베타셀룰린, (ⅲ) 인터루킨-2, (ⅳ) 뉴로트로핀-3 또는 (ⅴ) 아페린인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 펩티드가 성장호르몬인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨이, pH 약 2 내지 9 에서 약 0.1 내지 8 mol/L의 완충액으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염을, 아세트산 및 포름산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 상기 메티오닌 잔기의 디케톤체의 제거방법.
  8. N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염을, 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨, 또는 포름산 및 아세트산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 펩티드 또는 그 염의 제조법.
  9. 제 8 항에 있어서, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염이, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염을 α-디케톤류와 반응시킴으로써 얻어지는 펩티드 또는 그 염인 제조법.
  10. 제 8 항에 있어서, 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨, 또는 포름산 및 아세트산나트륨이, pH 약 2 내지 9 에서 약 0.1 내지 8 mol/L의 완충액으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 제조법.
  11. N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염을, 아세트산 및 포름산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 펩티드 또는 그 염의 제조법.
  12. 유전자공학적으로 제조되고, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 사람 성장호르몬 또는 그 염을 글리옥실산 또는 그 염과 황산구리 및 피리딘의 존재하에 반응시킨 후, 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨의 존재하에 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염과 반응시키는 것을 특징으로 하는 N 말단에 메티오닌 잔기를 갖고 있지 않는 사람 성장호르몬 또는 그 염의 제조법.
  13. N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염의 상기 메티오닌 잔기를 제거하기 위한, (ⅰ) 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨, 또는 포름산 및 아세트산나트륨과 (ⅱ) 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염의 사용.
  14. N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염의 상기 메티오닌 잔기의 디케톤체를 제거하기 위한, (ⅰ) 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨과 (ⅱ) 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염의 사용.
  15. N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖는 펩티드 또는 그 염으로부터, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기를 갖지 않는 펩티드 또는 그 염을 제조하기 위한, (ⅰ) 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨과 (ⅱ) 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염의 사용.
  16. N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖는 펩티드 또는 그 염으로부터, N 말단에 산화되어 있어도 좋은 메티오닌 잔기의 디케톤체를 갖고 있지 않는 펩티드 또는 그 염을 제조하기 위한, (ⅰ) 아세트산 및 포름산나트륨, 포름산 및 포름산나트륨 또는 포름산 및 아세트산나트륨과 (ⅱ) 3,4-디아미노안식향산 또는 그 염의 사용.
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