WO2000020439A1 - Procede d'elimination de methionine n-terminale - Google Patents

Procede d'elimination de methionine n-terminale Download PDF

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WO2000020439A1
WO2000020439A1 PCT/JP1999/005456 JP9905456W WO0020439A1 WO 2000020439 A1 WO2000020439 A1 WO 2000020439A1 JP 9905456 W JP9905456 W JP 9905456W WO 0020439 A1 WO0020439 A1 WO 0020439A1
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WO
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peptide
salt
methionine residue
acid
diketone
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Application number
PCT/JP1999/005456
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English (en)
French (fr)
Inventor
Osamu Nishimura
Tsuneo Asano
Masato Suenaga
Hiroaki Ohmae
Norio Okutani
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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Filing date
Publication date
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Priority to PCT/JP1999/006903 priority patent/WO2000036122A1/ja
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Priority to EP99961284A priority patent/EP1138772A4/en
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing acetic acid and sodium formate, formic acid and sodium formate from a peptide (including a protein) having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus or a diketone of the methionine residue or a salt thereof. Or a method for efficiently removing an optionally oxidized N-terminal methionine residue or a diketone of the methionine residue in the presence of formic acid and sodium acetate; and The present invention also relates to a method for producing a methionine residue or a peptide having no diketone form of the methionine residue or a salt thereof.
  • Background art
  • the higher order structure, biological activity, and stability of the protein may be different between molecular species with methionine added to the N-terminus and non-methionine at the N-terminus. It is possible that the addition to the protein may result in increased antigenicity. Therefore, from the viewpoint of industrial use, it is considered significant to establish a method for removing the N-terminal methionine corresponding to this start codon.
  • proteins with relatively large molecular weights which are produced by genetic engineering, especially as pharmaceuticals
  • the present inventors have aimed to provide a method for producing a peptide having a natural amino acid sequence by cleaving only the N-terminal methionine residue in a peptide (including a protein) produced by genetic engineering.
  • a peptide having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus represented by the formula (I) as shown in the following scheme 1 includes, for example, Dali which is a diketone Oxylic acid, copper sulfate capable of donating a transition metal ion, and pyridine which is a base (for example, amines) are reacted with each other to perform an amino group transfer reaction.
  • 3,4-diaminobenzoic acid eg, diamines
  • acetic acid and sodium formate formic acid and sodium formate, or formic acid and sodium acetate
  • the present inventors have found a method of unexpectedly obtaining a peptide having no methionine residue in a high yield, and have further studied to complete the present invention.
  • m represents an integer of 0 to 2
  • X may be any amino acid residue or a peptide chain having an arbitrary number of amino acids of 2 or more. From a practical viewpoint, the gene The peptide chain corresponding to X in an engineered protein may be mentioned.
  • a peptide or protein comprising a plurality of amino acids may be any of non-glycosylated or dalycosylated peptides or proteins.
  • a compound represented by the general formula (I) is referred to as “a peptide having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus” or a “peptide having a methionine residue”;
  • the compound represented by the general formula (II) is referred to as a “method that may be oxidized at the N-terminal.
  • a compound represented by the general formula (III) is referred to as a “peptide having no methionine residue which may be oxidized at the N-terminus” or a “peptide having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus. Not a beptide "
  • a peptide having a diketone of a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus, or a salt thereof is prepared in the presence of acetic acid and sodium formate, formic acid and sodium formate, or formic acid and sodium acetate.
  • a method for removing a diketone of a methionine residue comprising reacting the compound with a diaminobenzoic acid or a salt thereof;
  • Peptide activity (1) the method according to (1), which is (i) growth hormone, (ii) vessellin, (iii) interleukin-12, (iv) neutrophin-13 or (V) apelin.
  • the method according to (1) wherein the peptide is a growth hormone;
  • Acetic acid and sodium formate, formic acid and sodium formate or formic acid and sodium acetate are used as a buffer having a pH of about 2 to 9 and a pH of about 0.1 to 8 niol / L.
  • a method for removing a diketone body of the methionine residue characterized by comprising:
  • a peptide having a diketone of a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus, or a salt thereof is prepared in the presence of acetic acid and sodium formate, formic acid and sodium formate, or formic acid and sodium acetate.
  • FIG. 1 shows the results of the electrophoresis obtained in Example 4 a).
  • Lane (Lane) 1 shows the molecular weight marker
  • lane (Lane) 2 shows the purified hGH.
  • FIG. 2 shows the results of electrophoresis obtained in Example 16a). Lane (L an) 1 indicates the molecular weight and Lane (L an) 2 indicates the BTC obtained in Example 15.
  • FIG. 3 shows the results of the electrophoresis obtained in Example 18a).
  • Lane (L an e) 1 is the molecular weight marker, Lane 2 was obtained in Example 17
  • FIG. 4 shows the DNA fragment used in Example 26.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram for producing the double-chain human apelin-136 obtained in Example 26.
  • FIG. 6 shows a construction diagram of the plasmid pTB960-13 obtained in Example 27. -Best mode for carrying out the invention
  • the methionine residue which may be oxidized indicates a methionine residue or an S-oxidized form thereof, and examples of the S-oxidized form of the methionine residue include sulfoxides and sulfone forms.
  • Examples of the peptide having an optionally oxidized methionine residue at the N-terminus include a compound represented by the formula CH 3 -S (0) m- (CH 2 ) 2 -CH (NH 2 ) -CO- X [where m is And X represents an amino acid residue or a peptide chain. Which may form a salt, and any salt may be used as long as it does not inhibit the reaction of the present invention. Among them, pharmaceutically acceptable salts are preferred.
  • salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, phthalic acid, fumaric acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfone
  • organic acids such as acids, alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts, and ammonium salts.
  • the peptide having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus is preferably a peptide having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus produced by genetic engineering.
  • m is preferably 0.
  • X is preferably a peptide chain having two or more amino acids.
  • the peptide of the present invention may be a so-called peptide having less than 50 amino acids or a so-called protein having 50 or more amino acids.
  • the term “peptide” includes not only a molecule having an amino acid number of less than 50 but also a molecule having an amino acid number of 50 or more. Molecules having 50 or more amino acids (so-called proteins) are preferably used.
  • Preferable peptides include peptides having 2 to 100 amino acids, more preferably peptides having 15 to 500 amino acids, and specific examples thereof include growth hormone (GH).
  • GH growth hormone
  • hGH human growth hormone
  • BTC paracellulose
  • PTH parathyroid hormone
  • insulin Neural growth factor, brain-derived neurotrophic factor, ciliary neurotrophic factor, glial-derived neurotrophic factor, neurotrophin-1, 3, 4 or 6, central nerve growth factor, glial growth factor, lung-derived neurotrophic factor, Epidermal growth factor, fibroblast growth factor, platelet-derived growth factor, transforming growth factor or / 3, vascular endothelial cell growth factor, tissue 'plasminogen-activator, peroki Protease, protein C, thrombomodulin, bone morphogenetic factor, calcitonin, insulin-like growth factor, inuichiferon-hi, 3 or a, interleukin-1 ( ⁇ ,
  • genetically engineered peptides including proteins
  • engineered growth hormones eg, human growth hormone (hGH) (eg, 20K-hGH, 22K-hGH) , Etc.)
  • neurotrophin-3 e.g., braintrophin-3
  • beysuccin e.g., parathyroid hormone, inulin-leukin-12, apelin and their mucins
  • growth hormones eg. human growth hormone (hGH) (eg, 20K -HGH, 22K-hGH, etc.) and their mucins
  • growth hormones eg, human growth hormone (hGH) (eg, 20K-hGH, 22K-hGH, etc.)
  • hGH human growth hormone
  • hGH human growth hormone
  • averine examples include amino acids at the ⁇ -terminal of human apelin-36, human apelin-13, and apelin-13 as described in, for example, Biochem. Biophys. Res. Co. Mardan un., 251, 471-476 (1998).
  • peptides including natural proteins
  • human-derived peptides including proteins
  • the above peptide is subjected to refolding (activation, regeneration) before or after subjecting to a step of removing an N-terminal optionally oxidized methionine (Me t) residue or a diketone body of the methionine residue.
  • Refolding activation, regeneration
  • Me t optionally oxidized methionine residue
  • a peptide having a diketone form of a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus or a salt thereof is represented by the formula CH 3 -S (0) m- (CH 2 ) 2 -C 0 -C 0- X [wherein, m represents an integer of 0 to 2, and X represents an amino acid residue or a peptide chain. ] Or a salt thereof.
  • the peptide having a diketone of a methionine residue which may be oxidized at the N-terminal or a salt thereof can be obtained by various reactions such as a chemical reaction or an enzymatic reaction.
  • a peptide having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus or a salt thereof is reacted with an ⁇ -diketone by an amino group transfer reaction to oxidize the ⁇ -terminus.
  • a peptide having a diketone form of a methionine residue or a salt thereof can be obtained (Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-72489 (9- 1-812856)).
  • the hydiketones may be any as long as the amino group transfer reaction of the above-mentioned peptide or a salt thereof can proceed, for example, a compound represented by the formula R 1 -CO-CO-R 2 [wherein R 1 Represents a lower alkyl or phenyl group (preferably hydrogen or methyl, more preferably hydrogen) which may be substituted with hydrogen or a carboxyl group, and R 2 may be substituted with a hydroxyl group, a lower alkoxy group or a lower alkyl. Shows good amino groups (preferably hydroxyl groups). Or a salt thereof.
  • the lower alkyl group represented by R 1 includes alkyl having about 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, i-propyl, butyl, i-butyl, sec-butyl, and t-butyl.
  • the lower alkoxy group represented by R 2 include those having about 1 to 6 carbon atoms such as methoxy, ethoxy, propoxy, i-propoxy, butoxy, i-butoxy, sec-butoxy, t-butoxy and the like.
  • an alkoxy group examples of the amino group optionally substituted with lower alkyl represented by R 2 include the aforementioned R 1 And amino groups which may have one or two lower alkyl groups as shown.
  • the salt include those similar to the above-mentioned salt of a peptide having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus.
  • ⁇ -diketones include dalioxylic acid, pyruvic acid, oxalic acetic acid, phenyldalioxylic acid, and 2-oxodaltalic acid. Of these, dalioxylic acid is preferably used.
  • Higedoketones may form salts, and examples thereof include salts of alkali metal such as sodium salt and potassium salt, and salts of inorganic acids such as hydrochloride.
  • the transamination reaction between a peptide having a methionine residue which may be oxidized at the terminal or a salt thereof and an ⁇ -diketone is usually performed in an amount of 10,000 to 10,000 mol per mol of the peptide or a salt thereof ( About 2000 to 4000 moles) of ⁇ -diketones at about 0 to 70 ° C. (preferably about 20 to 40) for about 10 minutes to 5 hours (preferably about 20 minutes to 2 hours)
  • Any buffer eg, phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, etc.
  • acetate buffer is preferable. Used.
  • the pH of the reaction is preferably adjusted to about 2 to 9, especially about 4 to 7, particularly preferably about 5 to 6, to advance the reaction.
  • transition metal ion In order to promote the amino transfer reaction, it is preferable to react ⁇ -diketones in the presence of a transition metal ion, and usually 0.001 to 0.1 mol per 1 mol of ⁇ -diketones. It is preferable to use about 0.1 to 0.05 mol of a transition metal ion.
  • the transition metal ion include copper ion (Cu + , Cu 2+ ), cobalt ion (Co 2 + , Co 3+ ), nickel ion (Ni 2 + , Ni 3 + ), iron ion (Fe 2 + , Fe 3 +), zinc ion (Zn 2+), ⁇ Ruminiumuion (Al 3+), etc.
  • manganese ions Mn 2 +
  • Gariumuio emissions Ga 3+
  • indium ion In 3+
  • magnesium ions Mg 2+
  • copper I O emissions such as cobalt ions, especially copper ions (Cu 2+) is Ru are preferably used.
  • transition metal ions are usually found in sulfuric, nitric, hydrochloric, and perchloric acids.
  • reaction solvent can be added to the reaction solvent as a salt with an inorganic acid or a salt with an organic acid such as acetic acid, oxalic acid, citric acid, carbonic acid, etc., among which copper sulfate, copper acetate, especially copper sulfate Is preferably used.
  • organic acid such as acetic acid, oxalic acid, citric acid, carbonic acid, etc., among which copper sulfate, copper acetate, especially copper sulfate Is preferably used.
  • the ⁇ -diketones are preferably reacted in the presence of a base.
  • a base usually, about 0.1 to 20 mol (preferably 0.5 to 10 mol) per 1 mol of the ⁇ -diketones.
  • the base include alkylamines such as triethylamine and triptylamine, and aromatic amines such as ⁇ , ⁇ -methylaniline, pyridine, lutidine, collidine, 4- (dimethylamino) pyridine, and imidazole.
  • pyridine is preferably used.
  • a peptide having a methionine residue which may be oxidized at the terminal, or a salt thereof, and a methionine residue obtained by an amino group transfer reaction of the peptide or a salt thereof is preferable to add urea to the solution.
  • a buffer for an amino group rearrangement reaction It is preferable to add urea to the solution.
  • urea it is preferable to add urea to the buffer at a concentration of preferably about 1 to 8 M, more preferably about 3 to 6 M.
  • ⁇ -diketones in the presence of a transition metal ion and a base, and practically, three components of a transition metal ion, a base and ⁇ -diketones (for example, a mixed solution containing copper sulfate, pyridine, and dalioxylic acid) is added to an aqueous solution containing a peptide having a methionine residue which may be oxidized at its terminal or a salt thereof, and the amino group is added. Allow the transfer reaction to proceed.
  • amination transfer reaction Obtained by the amination transfer reaction, and has the formula CH 3 -S (0) m- (CH 2 ) 2 -C 0 -C 0 -X, wherein m represents an integer of 0 to 2, X represents an amino acid residue or Indicates a peptide chain.
  • a salt thereof a peptide having a diketone form of a meteonin residue or a salt thereof
  • From the reaction solution It can be isolated and purified, but it can also be directly subjected to the next hydrolysis reaction.
  • the peptide having a diketone form of methionine obtained by transamination or a salt thereof is usually subjected to a hydrolysis reaction with a base to give an N-terminal optionally oxidized methionine residue or the methionine. It can be converted to an amino acid having no diketone residue, a peptide or a salt thereof.
  • Examples of the base used in the hydrolysis reaction include alkylamines such as cysteamine, triethylamine, and triptylamine or salts thereof, N, N-dimethylaniline, pyridine, lutidine, collidine, 4- (dimethylamino) pyridine, imidazole and the like.
  • alkylamines such as cysteamine, triethylamine, and triptylamine or salts thereof, N, N-dimethylaniline, pyridine, lutidine, collidine, 4- (dimethylamino) pyridine, imidazole and the like.
  • aromatic amines or salts thereof o-phenylenediamine, tolylene-3,4-diamine, 3,4-diaminobenzoic acid and N-alkyl-substituted products thereof (for example, methyl-1,2-phenylenediamine, Diamines such as N-ethyl-1,2-phenylenediamine, N-isopropyl-1,1,2-phenylenediamine, 2,3-diaminophenol, 4-chloro-1-o-phenylenediamine
  • aromatic diamines, particularly, 3,4-diaminobenzoic acid and its N-alkyl substitution Eg, N-methyl-1,2-phenylenediamine, N-ethyl-1,2-phenylenediamine, N-isopropyl-1,1,2-phenylenediamine
  • salts thereof such as thiosemicarbazide, acetonethiol Amines such as thiosemicarbazides
  • Examples of the salt of the base used in the hydrolysis reaction include the same salts as the above-mentioned salts of peptides having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus.
  • the amount of the base is usually a peptide having a diketone body of a methionine residue or It is about 1 to 10,000 mol, preferably about 200 to 300 mol, more preferably about 500 to 300 mol, per 1 mol of the salt.
  • the hydrolysis reaction usually proceeds at about 0 to 70 ° C (preferably about 20 to 40 ° C) for about 1 hour to 7 days (preferably about 10 hours to 5 days). Is preferred.
  • a buffer is preferably used as a solvent. Examples of the buffer include a formic acid-based buffer (for example, sodium acetate monoformate, sodium formate sodium formate, sodium formate monoacetate, etc.) And the like. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the above hydrolysis reaction.
  • sodium acetate monoformate, sodium formate monoformate or sodium formate monoacetate buffer is preferred. It is preferably used. Further, the pH of the reaction is adjusted to about 2 to 9, especially about 3 to 7, especially about 4 to 6, and the reaction is allowed to proceed. These buffers are preferably used at about 0.1 to 8 mol / L, more preferably about 0.5 to 6 mol / L.
  • a peptide having a diketone of a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus or a salt thereof during hydrolysis, and an amino acid not having the methionine residue formed by a hydrolysis reaction
  • the hydrolysis reaction is carried out for the purpose of preventing precipitation of the peptide or the salt thereof.
  • Urea is preferably added to the buffer for the reaction.
  • urea to the buffer to a concentration of preferably about 1 to 6 M, more preferably about 2 to 5 M.
  • amino acid, peptide or salt thereof thus obtained can be isolated and purified from the reaction solution by known purification means, for example, extraction, salting out, distribution, recrystallization, chromatography, etc., but is preferable.
  • purification means for example, extraction, salting out, distribution, recrystallization, chromatography, etc., but is preferable.
  • SP-Sepharose Pharmacia Biotech Co., Ltd.
  • DEAE DEAE
  • the peptides produced according to the present invention do not have methionine at the N-terminus, and have a desired bioactive peptide (for example, a natural bioactive polypeptide). Since it is obtained as having the same amino acid sequence, it has the same activity as the target peptide (for example, a natural polypeptide), has low toxicity, and can be used safely as a pharmaceutical or diagnostic agent.
  • a desired bioactive peptide for example, a natural bioactive polypeptide
  • an N-terminal methionine residue or a diketone of the methionine residue from a peptide having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminal or a diketone of the methionine residue Can be.
  • Abbreviations such as amino acids in the specification and drawings of the present invention are based on the abbreviations of IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or abbreviations commonly used in the art, examples of which are shown below. When amino acids have optical isomerism, L-integration is indicated unless otherwise specified.
  • H is: histidine P h •, Funo J-cho--'No) Shi Leno, — ⁇ , yr yr • • ⁇ , No' Non, No
  • a sx A sp + A sn
  • the hGH structural gene is derived from a human pituitary cDNA library (Quick-Clone, CLONTECH) with a primer with an NdeI cleavage site adjacent to the upstream of the start codon of the structural gene and a downstream of the stop codon. Using a primer having a BamHI cleavage site adjacent thereto, amplification was performed by PCR and recovery was performed. The resulting hGH enzyme gene with restriction enzyme recognition sites added at both ends was ligated to the T-cloning site of pT7B1ue (DNA Ligation on Kit Ver. 2, Takara Shuzo). PT 7HGH-Na was produced. This was introduced into E. coli JM109, and transformants were selected using ampicillin resistance and ⁇ -galactosidase activity as indices.
  • an expression vector was constructed by the following method.
  • PBR322 was digested with NdeI, blunt-ended with T4 DNA polymerase (DNA Blunting Kit. Takara Shuzo Co., Ltd.), and religated to remove the NdeI recognition site.
  • des Nde was prepared. After cutting pET3c with Bg1II-Eco RV and recovering a fragment of about 0.26 kbp, the ends were blunted with T4 DNA polymerase and the SBR I fragment of pBRdes Nde Ligation was performed to produce PBRZT 7 des Nde. In addition, site-directed mutagenesis (Quick Channel, STRATAGENE) was used.
  • pBR322 desBam was prepared in which the BamHI recognition site of pBR322 was deleted.
  • the SphI-EcoRV fragment of pBR322 desBam was ligated with the SphI-EcoRV fragment of PBRZT7desNde to produce a tetracycline resistance expression vector PTC.
  • the one in which the direction of the tetracycline resistance gene and the direction of the T7 promoter were reversed each other was called pTC1, and the same one was called pTC2.
  • the hGH structural gene was recovered by digesting PT7HGH-Na with NdeI and BamHI, ligating it with the NdeI-BamHI fragment of pTCl, and introducing it into E. coli JM109 to obtain ampicillin resistance. Transformants were selected, and plasmid was recovered from the strain again, and used as an expression plasmid pTCHGH-Na.
  • E. coli MM 294 was lysogenized with lambda phage (Studyer, Subra) that had been recombined with the T7 phage RNA polymerase gene.
  • the hGH expression vector-pTCHGH-Na was introduced into this Escherichia coli MM294 (DE3) to obtain Escherichia coli MM294 (DE3) pTCCHGH-Na.
  • the nucleotide sequence of hGH was confirmed by the ABIPrisms 377 ADNA sequencer at the time when pT7HGH-Na was prepared.
  • Reference Example 2 Expression of hGH with methionine residue (Me t -hGH) in E. coli)
  • the transformed cells obtained in Reference Example 1 were placed in a 2 liter flask containing 1 liter of LB medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) containing 5 mg ZL of tetracycline at 30 ° C. The cells were cultured with shaking for 16 hours. The obtained culture solution was transferred to a 50-liter fermenter containing 20 liters of LB medium containing 0.02% Newpole LB-625 (antifoaming agent: manufactured by Sanyo Chemical Industries) and 5 mg ZL tetracycline. The cells were cultured at 37 with aeration and agitation for 6 hours.
  • LB medium 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride
  • the culture was diluted with 360 liters of the main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.05%).
  • sugars, 3.0% high-case amino, 1.0% yeast extract were transferred to a 500-liter fermenter, and aeration and agitation culture was started at 37 ° C.
  • the regeneration solution which had been activated in Example 1, was treated with a Pellicon cassette system (PTG C membrane, Millipore) while adding 2 OmM Tris ZHC 1, 2.5 M urea (pH 8.0) to obtain an electric conductivity of 1%.
  • 5 OmM phosphate buffer pH 6.0 was added to 5 liters of the obtained concentrate, diluted to 50 liters, and allowed to stand at 4 ° C. . Then, continuous centrifugation (J What? ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 ⁇ .
  • the eluate was passed through at a flow rate of h, and developed using the same buffer solution as for equilibration, to obtain 4.2 l of an eluate as an hGH fraction having a diketone form of methionine residues.
  • 1.2 M acetic acid, 2.4 M sodium formate, 3.6 M urea solution, 48 mM 3,4-diaminobenzoic acid solution Add 20.8 liters with good stirring, then slowly stir at 30 ° C. After the reaction, the solution was concentrated to 14 liters using a Pellicon cassette system (PTGC membrane, Millipore), and divided into two portions of 7 liters each.
  • the solution was passed through 5.2 cm ⁇ 5 O cm (Pharmacia Biotech) at a flow rate of 6 liters to collect 20 liters of the hGH fraction.
  • the solution was then purified by high-performance liquid chromatography (Gilson HP LC system, Gilson).
  • B 5 OmMME S Elution was performed with a pH gradient of 70-85% B with [2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid] + 2.5 M urea (pH 4.0) at a flow rate of 320 milliliters Z minutes for 70 minutes.
  • the GH fraction 5.84 l was obtained.
  • the N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (PerkinElmer Applied Biosystems, model 477A). As a result, the N-terminal amino acid sequence of the obtained hGH was consistent with the N-terminal amino acid sequence of hGH deduced from the nucleotide sequence of the cDNA (Table 1).
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (L-8500A, Hitachi). As a result, the amino acid composition of the obtained hGH was consistent with the amino acid composition deduced from the nucleotide sequence of cDNA (Table 2). Table 2
  • Hiroo analyzes using about 10 g
  • C-terminal amino acids were determined using an amino acid analyzer (L-850 OA, Hitachi).
  • the C-terminal amino acid of the obtained hGH coincided with the C-terminal amino acid deduced from the nucleotide sequence of the cDNA (Table 3).
  • Example 3 Purified hGH Nb 2 cells obtained in Example 3 [Journal of Clinic The growth-promoting effect on Cal-Endo-Clino-guchi 'and' medium volism, 51, 1058 (1980)] was equivalent to that of a standard product (Chemicon International, Temecula, CaHfornia, USA).
  • Example 6 N-terminal met removal
  • the solution was treated with 2 OmM Tris / HC and equilibrated with 4.01 ⁇ urea ( ⁇ 8.0) on a Sephadex G-25 column (lcm ⁇ i) x 30 cm, Pharmacia).
  • the solution was passed at a flow rate of 60 ml / h, and 10 ml of the hGH fraction was collected.
  • the solution was then subjected to DEAE-5 PW column (Gilson HP LC system, Gilson) by high performance liquid chromatography (Gilson).
  • this solution was applied to a Sephadex G-25 column (1 cmci) x 30 cm, 30 cm, Pharmacia) equilibrated with 2 OmM Tris / HC1, 4.0 M urea (pH 8.0). The solution was passed at a flow rate of h, and 10 ml of the h ⁇ ⁇ fraction was collected. Then, the solution was passed through a DE AE-5 PW column (2.15 cm x 15 cm, Tosoh I) using a high performance liquid chromatograph (Gilson HP LC system, Gilson).
  • This eluate was added to 49.5 ml of 1.2 M acetic acid, 2.4 M sodium formate, 3.6 M urea solution, 48 mM 3,4-diaminobenzoic acid solution with good stirring.
  • the reaction was carried out for 24 hours while stirring slowly at ° C. After the reaction, apply to a Sephadex G-25 column (4.6 cm X 6 O cm, Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mM Tris HC and 4.0 M urea (pH 8.0) at a flow rate of 500 ml / h.
  • the solution was passed, and an GH fraction (15 Om1) was collected.
  • Example 9 N-terminal met removal
  • 2.5 M dalioxylic acid, 40 mM copper sulfate, 50% pyridine solution 0.45 m1 was added to 1.8 ml of the Met-h GH solution obtained in Example 2, and the mixture was stirred well and then stirred at 25 ° C for 60 minutes. Reacted. Then, 100 m 1 Zh was applied to a Sephadex G-25 column (1.5 cm ⁇ X 30 c Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mM Tris ZHC 1, 4.0 M urine (pH 8.0).
  • the solution was passed at a flow rate and developed using the same buffer solution as for equilibration, to obtain an eluate of 1 Om1 as a hGH fraction having a diketone form of methionine residue.
  • Add this eluate to 2 M formic acid, 10 M sodium formate, 6 M urea solution, 80 mM 3,4-diaminobenzoic acid solution 1 Om 1 with good stirring, and then slowly stir at 30 ° C. While reacting for 3 days. After the reaction, Sephadex G-25 column (4.6 c ⁇ X 60 cm, equilibrated with Tris 7?
  • PBS phosphate-buffered saline
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the cell lysate was centrifuged (10,000 rpm, 20 minutes), and the supernatant was discarded to obtain an inclusion body.
  • Two liters of 5 OmM Tris // HC1, 8 M guanidine hydrochloride solution (pH 8.0) was added to the inclusion body to dissolve the inclusion body, followed by centrifugation (10000 rpm, 120 minutes). Add 5 OmM Tris // to 2 liters of the obtained supernatant.
  • Example 10 the solution that had been activated in Example 10 was subjected to 2 OmM Tris / HC with a minitan ultrafiltration system (PTGC membrane, Millipore), and the electric conductivity was increased to 1 OmS while adding 2.5 M urea (pH 8.0). After desalting and concentrating until the concentration became / cm or less, the obtained concentrated solution was centrifuged (10000 rpm, 20 minutes) to obtain 150 ml of the supernatant of the concentrated solution.
  • PTGC membrane minitan ultrafiltration system
  • Sephadex G—25 column (1 Omm IDX 30) obtained by equilibrating 6 ml of the Met-20 K-h GH solution obtained in Example 11 with 2 OmM Tris ZHC 1, 8 M urea (pH 8.0). cm, Pharmacia Biotech) to collect the eluted Met—20K—hGH fractions, and then use an ultrafiltration system (Diaflow Membrane YM10, 25 mm, Amicon). And concentrated to 2 ml. To this solution was added 0.5 ml of a 2.5 M dalioxylic acid, 40 mM copper sulfate, 50% pyridine solution, and the mixture was stirred well and reacted at 25 ° C. for 60 minutes.
  • reaction solution was passed through a Sephadex G_25 column (1 Omm ID 40 cm, Pharmacia Biotech) equilibrated with 2 OmM Tris / HC1, 4M urea (pH 8.0), and the remaining amount of methionine was measured.
  • 4 ml of eluate was collected as a 20K-hGH fraction having a diketone group.
  • To this eluate were added 20 mL of 1.2 M acetic acid, 2.4 M sodium formate, 3.6 M urea, 48 mM 3,4-diaminobenzoic acid solution, and the mixture was stirred well and reacted at 30 ° C. for 65 hours.
  • N-terminal amino acid sequence analysis The N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (Kinelma Applied Biosystems, Model 477A). As a result, the obtained N-terminal amino acid sequence of 20K_hGh was consistent with the N-terminal amino acid sequence of 20K-hGH deduced from the nucleotide sequence of cDNA (Table 4). Table 4
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (System 6300, Beckman). As a result, the amino acid composition of 20K-hGH obtained in Example 12 was consistent with the amino acid composition deduced from the nucleotide sequence of the cDNA of 20K-hGH (Table 5). Table 5
  • Example 15 1 ⁇ 132 cells of 20-11 & 1-1 obtained in Example 12 [Journal, Clinical, Endocrinology, and Medicine], 51, 1058 (1980)] It was confirmed that it had a growth promoting effect.
  • Example 15
  • human met BTC was produced by the following method.
  • a 0.6 Kb EcoRI-BamHI fragment encoding human pro-BTC (1-147 amino acid residues) was used in Example 5 of JP-A-6-87894 (EP-A-0555785). Isolated from the indicated plasmid pTB1515. A synthetic adapter having an ATG translation initiation codon (5,1 TATGGATGGG-3 '; 5, -AAT TCCCATCCA-3') was ligated to the Ec0RI site of the above 0.6 Kb fragment. The 6 Kb Ndel—BamHI fragment was inserted into plasmid pET-3c containing the T7 promoter (Gene, 56, 125 (187)) to construct plasmid pTB1505. .
  • plasmid pT ⁇ 1505 as type ⁇ and two oligonucleotides as primers (5 ′ — ATAC ATATGGATGGGAATTC C ⁇ -3 ′; 5 ′ one CCGGATCCT AGTAAAAC AAGTC AACTCT-3 ′) PCR using
  • E. coli MM294 was lysogenized with lambda phage (Studyer, Subra) that has been recombined with the T7 phage RNA polymerase gene. Thereafter, the plasmid pLysS was introduced into this E. coli MM294 (DE3) to obtain E. coli MM294 (DE3) ZpLysS.
  • the plasmid pTB1516 obtained in the above Reference Example was introduced into the cells to obtain Escherichia coli MM294 (DE3) / pLysS, pTB1516.
  • the obtained culture solution was added to 19 liters of the main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.05% magnesium sulfate, 0.02% defoamer, 0.025% ferrous sulfate, 0.050% thiamine hydrochloride, 1.5% dextrose, 1.5% (Casamino acid) was transferred to a 50-liter fermenter, and aeration and stirring culture was started at 30 ° C.
  • the main fermentation medium 1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.05% magnesium sulfate, 0.02% defoamer, 0.025% ferrous sulfate, 0.050% thiamine hydrochloride, 1.5% dextrose, 1.5% (Casamino acid) was transferred to a 50-liter fermenter, and aer
  • the transformed Escherichia coli MM 2 94 (DE 3) / p Lys S, p TB 1516 was obtained under the accession number FERM BP-38 36 on April 21, 1992 by the Ministry of Trade and Industry. Deposited with the National Institute of Bioscience and Biotechnology (NI BH), and on April 16th, 1992 as the accession number IFO15282. Ii) has been deposited.
  • reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (46 mm IDX 600 mmL) equilibrated with 5 OmM phosphate buffer (pH 6.0), and the buffer used for equilibration was diluted to 10 m 1 / The BTC fractions without N-terminal methionine were pooled.
  • Example 15 The BTC obtained in Example 15 was suspended in a sample buffer [Laemml i, Nature (Nature), 227, 680 (1970)] and heated at 100 ° C for 1 minute. Electrophoresis was performed on May 25 (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.). When the gel after electrophoresis was stained with Coomassie brilliant blue, a single band of protein was recognized, and the purified product was almost single (Fig. 2). b) N-terminal amino acid sequence analysis
  • the N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (Aff. Ride ⁇ 'Yeosystem Model 477 ⁇ ). As a result, the amino acid sequence matched the ⁇ -terminal amino acid sequence of BTC deduced from the nucleotide sequence of the obtained BTC cDNA (Table 6). Table 6
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Heckman System 6300E). The results were consistent with the amino acid composition deduced from the nucleotide sequence of the BTC cDNA (Table 7). Table 7
  • Purified product is BALB / C3T3 A31-714 Clone 4 (International 'Journal of Kyansa, 1, 2, 463) by the method described in Molecular Cell Biology, 8, 588 (1988). The activity was measured using 1973), and it was confirmed that it had the same activity as the standard product.
  • the solution used for (1) was developed at a flow rate of 1 Om 1 Z, and the IL-12 fraction having a diketo form of methionine residues was pooled. Subsequently, equal amounts of 2 M acetic acid, 4 M sodium formate, and 3 M urea solution were added to this fraction, and 3,4-diaminobenzoic acid was added to a concentration of 4 OmM, followed by degassing and nitrogen. Gas sealing was performed, and the reaction was performed at 25 ° C for 5 days.
  • reaction solution was passed through a Sephadex G_25 column (46 mix IDX, 600 miL) equilibrated with 1 OmM phosphate buffer + 2.5 M urea (PH5.0), and the buffer used for equilibration. was developed at a flow rate of 1 Om 1 min, and the IL-2 fraction without methionine added to the N-terminus was pooled.
  • B 25 mM phosphate buffer, pH 8.0
  • the IL-1 obtained in Example 17 was used as a sample buffer [Laemmli,
  • N-terminal amino acid sequence of IL-2 was determined using a gas-phase protein sequencer (Aff. Ride ⁇ Yosystem Model 477 ⁇ ). As a result, the base sequence of the obtained IL-2 cDNA Table 9: N-terminal amino acid sequence of IL-2
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Heckman System 6300E). As a result, the amino acid composition was consistent with the amino acid composition deduced from the nucleotide sequence of the IL-12 cDNA (Table 10). Table 10
  • the activated solution is subjected to electric conduction using a Pellicon cassette system (Biomax 8 membrane, Millipore) while adding about 25 liters of 20 mM Tris Z acetic acid and 2.5 ⁇ 1 urea solution (1 ⁇ 8.0). Concentration and desalination were performed until the degree became 5 mS / cm or less. Again, desalting was performed while adding about 35 liters of a 2 OmM Tris Z acetic acid solution (pH 8.0), followed by centrifugation (10, OOO rpm) to obtain a supernatant.
  • the electric conductivity is 5 mS / cm using a Pellicon cassette system (Biomax 8 membrane, Millipore) while adding 25 liters of 20 mM Tris / acetic acid and 2.5 M urea solution (PH 8.0). Concentration and desalination were performed until the concentration became as follows. Again, desalting was performed while adding 35 liters of 2 OmM Tris Z acetic acid solution (pH 8.0), followed by centrifugation (10,000 rpm) to obtain a supernatant.
  • the solution used for the equilibration was developed at a flow rate of 4 ml / Z, and the NT-3 fraction having a diketone form of methionine residue was pooled. Subsequently, equal amounts of 2 M acetic acid, 4 M sodium formate, and 3 M urea solution are added to this fraction, and 3,4-diaminobenzoic acid is added to a concentration of 4 OmM, and the mixture is added at 25 ° C for 5 days. Reacted.
  • the reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (46 mm IDX 600 mmL) equilibrated with 2.5 M urea + 1 OmM phosphate buffer (pH 6.0), and the buffer used for equilibration was removed. It is developed at a flow rate of 10 m 1 Z, and is a human protein without a methionine residue at the N-terminus.
  • Lot 1 Fin 3 (NT-3) fractions were pooled. The pooled NT-3 fractions were adjusted to pH 5.0 and CM equilibrated with 50 mM phosphate buffer + 0.2 M NaC1 + 2.5 M urea (pH 5.0).
  • B 50 mM phosphate buffer + 0.2 M Na C 1 + 2.5 M urea, pH Elution was performed with a step gradient of 8.0) at a flow rate of 6 ml / min for 60 minutes, and the NT-3 fractions were pooled.
  • Example 24 Determination of characteristics of NT-3)
  • N-terminal amino acid sequence was determined using a gas-phase protein sequencer (Applied Biosystems model 477A). The results agreed with the N-terminal amino acid sequence of NT-3 deduced from the cDNA base sequence (Table 12). Table 1 2
  • H is (161) H is 8 A rg (318) A rg
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Heckman System 6300E). The results were consistent with the amino acid composition estimated from the nucleotide sequence of the NT-3 cDNA (Table 13). Table 13
  • H 4 3 4
  • Example 25 The NT-3 obtained in Example 23 was subjected to DRG (chicken sperm eggs were shaken with an incubator at 37.5 ° C for 8-10 days, and then isolated from the embryos that had undergone embryogenesis. )), And confirm that it has the same activity as NT-3 obtained from CHO cells. 7
  • DRG dry sperm eggs were shaken with an incubator at 37.5 ° C for 8-10 days, and then isolated from the embryos that had undergone embryogenesis. )), And confirm that it has the same activity as NT-3 obtained from CHO cells. 7
  • DRG dry sperm eggs were shaken with an incubator at 37.5 ° C for 8-10 days, and then isolated from the embryos that had undergone embryogenesis.
  • the solution used for the equilibration was developed at a flow rate of 10 m 1 Z, and the hGH fraction having a diketone body having methionine residues was pooled. Subsequently, equal amounts of 2 M acetic acid, 4 M sodium formate, and 4 M urea solution were added to this fraction, and then 34-diaminobenzoic acid was added to a concentration of 4 OmM. Reacted for days. After completion of the reaction, the reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (11.3 cm IDX 80 cmL) equilibrated with 4 M urea + 2 OmM Tris buffer (PH 8.0) to allow equilibration.
  • the buffer used was developed at a flow rate of 30 m 1 / min, and the hGH fraction having no N-terminal methionine residue was pooled.
  • Adsorbed pooled hGH fraction to DEAE-5PW (5.5 cm IDX 20 cmL, Tosoh Corporation) equilibrated with 5 OmM Tris buffer + 2.5 M urine (pH 8.0) After that, elution was performed with a step gradient of 0-100% B (B 5 OmM MES + 2.5 M urea, pH 4.0) for 60 minutes at a flow rate of 15 ml / min. I got Example 26 Preparation of human aperin-36 structural gene
  • the phosphorylated DNA fragment obtained in a) above and 1 g of each of # 1 and # 2 were combined to make 120 L. After maintaining this mixed solution at 80 ° C for 10 minutes, it was gradually cooled to room temperature and subjected to annealing. A Reigesion reaction was performed using TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo). After 30 L of Solution II was added to Annealing Solution 30 and mixed well, Solution I was added and reacted at 37 ° C for 1 hour to perform ligation. After phenol treatment, the aqueous layer was recovered, twice the amount of ethanol was added, and the mixture was cooled to -70 ° C and the DNA was precipitated by centrifugation. C) 5 'end phosphorylation
  • PTB960-2 (EP-A-499990: Koyama et al., Journal of Biotechnology, Vol. 32, p. 273) is digested with Xbal and Aval, and subjected to 1% agarose electrophoresis to obtain a DNA of about 4.4 Kbp.
  • the fragments were extracted using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) and dissolved in 25 L of TE buffer.
  • the Xbal and Aval fragments of PTB960-2 and the structural gene of human apelin-136 prepared as described above were
  • Ligation reaction was performed using Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo). Ie PTB960- 2 of Xbal, mixed Aval fragment solution l ii L and structure of Hitaperin one 3 6 gene solution 4 L, added I solution 5 L, reacted 16 D C, 30 min, Rye The game was done. E. coli JM109 competent cells (Toyobo) were transformed with 10 L of the Lyge solution and seeded on LB agar medium containing 10 g / mL tetracycline, and cultured at 37 ° C for 1 day. Resistant colonies were selected.
  • the transformant was cultured overnight in an LB medium, and plasmid pTB960-13 was prepared using QIAprep8 Miniprep Kit (Qiagen).
  • the nucleotide sequence of this human apelin-36 structural gene was confirmed using an Applied Biosystems model 377 DNA sequencer. Plasmid
  • Example 2 8 The transformed cells obtained in Example 27 were mixed with 1 L of LB medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) containing 5.mg of OmgZL tetracycline for 2 hours. The culture was shake-cultured for 37 hours in a liter flask for 8 hours. The obtained culture solution was cultured in 19 liters of a main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate).
  • LB medium 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride
  • B 5 OmM phosphate buffer + 2 M NaC, pH 6.0
  • the eluate was concentrated using a Pellicon minicassette (Millipore) while adding 0.1 M acetic acid to obtain a 0.1 M acetic acid solution of human aperin-136-CS23 fusion protein.
  • DMAP-CN 1-cyano-14-dimethylaminopyridinium salt 35m g was added and reacted at room temperature for 15 minutes.
  • the reaction solution was passed through a Sephade XG-25 column (46 mm IDX 600 mmL, Pharmacia) equilibrated with 10% acetic acid, and the 10% acetic acid used for equilibration was removed at 6 ml / min.
  • the fraction was developed at a flow rate to obtain an S-cyanated human aperin-136-CS23 fusion protein fraction.
  • the eluate was concentrated and desalted using a Pellicon minicassette (Millipore) to obtain a desalted solution of human aperin-136-CS23 fusion protein.
  • Pellicon minicassette Millipore
  • 1N caustic soda was further added to a 0.06N concentration, and the mixture was reacted at 0 ° C for 15 minutes.
  • the pH was adjusted to 6.0 with acetic acid to obtain human aperin-136.
  • N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems Model 477A). The results were identical to the N-terminal amino acid sequence predicted from the DNA base sequence, except that methionine was added to the N-terminus of the obtained human aperin-36 (Table 16). Table 16: N-terminal amino acid sequence
  • Example 29 Human apelin-36 obtained in Example 29 is a molecular species having a methionine residue at the N-terminal end (Me t_human aperin-36) It turned out that it was.
  • Example 30 Bio activity measurement
  • Example 29 Using the met-human apelin-136 obtained in Example 29, the activity was measured by the method (cytosensor) described in Example 6 of Japanese Patent Application No. 10-271645, which was equivalent to the synthetic product of human aperin-36. It was confirmed to have the activity of Example 3 Removal of UN Terminal Meteonine Residue)
  • the solution used in (1) was developed at a flow rate of 0.5 m 1 / min, and human apelin-36 fractions having a diketone form of methionine residues were pooled. Subsequently, equal amounts of 2 M sodium formate, 4 M acetic acid, and 3 M urea solution were added to this fraction, and 3,4-diaminobenzoic acid was added to a concentration of 4 OmM, followed by reaction at 30 ° C for 3 days. did.
  • reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (25 mm IDX 600 mmL) equilibrated with 5 OmM phosphate buffer (pH 6.0), and the buffer used for equilibration was 4 m 1 Z
  • the fraction was developed at a flow rate of 1 min, and the human apelin-36 fraction having no methionine residue at the N-terminus was pooled.
  • swimming pool The 36 fractions of human aperin were adjusted to pH 6.0, and CM-5PW (50 mM phosphate buffer + 0.1 M Na C 1 + 2.5!
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer).
  • Example 31 Japanese Patent Application No. 10-271646 using human perine-36 obtained in Example 31 The activity was measured by the method described in Example 6 (Cytosensor 1), and the activity was confirmed to be equivalent to that of the synthesized product of human aperin-36. Industrial applicability
  • a methionine residue is selectively and efficiently removed from a peptide or a protein or a salt thereof having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus, and the methionine residue may be oxidized at the N-terminus.
  • Peptides, proteins or salts thereof that do not have good methionine residues can be produced efficiently.
  • the N-terminal methionine residue can be chemically removed under mild conditions, so that it can be genetically engineered.
  • the peptide or protein having a natural amino acid sequence can be industrially advantageously produced from the produced peptide or protein having a methionine residue as a raw material.

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Description

明 細
N末端メチォニンの除去方法 技術分野
本発明は、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基あるいは該メチ ォニン残基のジケトン体を有するペプチド （蛋白質を含む） またはその塩か ら酢酸およびぎ酸ナトリゥム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリゥムまたはぎ酸および 酢酸ナ卜リウムの存在下、 効率よく N末端の酸化されていてもよいメチォ二 ン残基あるいは該メチォニン残基のジケトン体を除去する方法；および N末 端に酸化されていてもよいメチォニン残基あるいは該メチォニン残基のジケ トン体を有していないべプチドまたはその塩の製造法等に関する。 背景技術
蛋白質が細胞内で生合成される際には、 その N末端は Di RNAの開始コド ン AUGに対応するメチォニンから始まっていることが知られている。 しか しながらこのメチォニンは以後のプロセッシングによって取り除かれてしま うため、 完成された成熟蛋白質分子にはもはや存在しないのが通例である。 遺伝子組換え技術の進歩により、 有用な蛋白質を微生物や動物細胞、 例え ば大腸菌を用いて産生することが可能となったが、 本手法により産生される 蛋白質には、 上記メチォニンが残存している例が見い出されている。例えば、 大腸菌で発現させたヒト成長ホルモンにおいてメチォニンの付加率はほぼ 1 00 % [ネィチヤ一 （Nature) ' 293, 408 ( 1 98 1 ) ] に達し、 ィ ンターフェロン一ひにおいては 50 % [ジャーナル 'ォブ 'インタ一フエ口 ン · リサーチ （J. Interferon Res. ) ， 丄， 38 1 ( 1 98 1 ) ] 、 非ダリ コシル化ヒ卜インターロイキン一 2では、 天然型ヒトインタ一ロイキン一 2 と同じくァラニンではじまる分子種 （r I L- 2) に加え、 ァミノ末端にさ らにメチォニンの付加した （N末端にメチォニン残基を有する） 分子種 （M et-r I L- 2) の存在が認められている。 一方、 N末端のアミノ酸を化学的に除去する方法としては、 Dixon 力 1 9 64年に、 DL—ァラニルダリシンにダリオキシル酸、 ピリジン、 酢酸銅 を反応させるとァミノ基移転反応が起こり、 ピルボイルダリシンが生成する こと [バイオケミストリー 'ジャーナル （Biochem. J) , 92 , 66 1 ( 1 9 64) ] 、 さらに、 化合物にチォセミカルバジドを反応させるとアミド結 合の解裂が起こり、 グリシンを生成することを報告している [バイオケミス トリ— .ジャーナル （Biochejn. j) , 9 0, 2 C ( 1 9 64) ] 。 次いで、 こ の反応をチ卜クローム c— 5 5 1 (Pseudomonas cytochrome c— 5 5 1 ) に 応用し、 N末端グルタミン酸が除去されることを報告している [バイオケミ ストリー 'ジャーナル （Biochem. J) ， 94 , 46 3 ( 1 9 6 5) ] 。
同じ蛋白質であっても、 N末端にメチォニンの付加した分子種とそうでな い分子種とは蛋白質の高次構造、 生物活性、 安定性が相互に異なる可能性が あり、 さらにメチォニンの N末端への付加が抗原性の増加をもたらす可能性 もありうるものと考えられる。 従って、 産業利用上の観点から、 この開始コ ドンに対応する N末端メチォニン除去法を確立することは意義あることと考 えられる。
この課題を解決するため、 臭化シアン （B r CN) 分解によってメチォ二 ンを取り除く方法が提案 [サイエンス （Science) ， 1 98, 1 0 5 6 ( 1 9 7 7) ] されているが、 この場合は所望の成熟蛋白質中にメチォニン残基が 存在しないことが前提となる上、 過酷な化学反応を蛋白質に付す該方法によ つては、 決して満足する結果は得られない。
N末端にメチォニン残基を有するペプチドまたは蛋白質から、 ペプチドま たは蛋白質の種類に拘わらず、 選択的かつ効率的に、 N末端のメチォニン残 基を除去することを可能とする化学的な方法としては、 特開平 1 0— 7 24 8 9号 （E P— A— 8 1 2 8 5 6号） に記載の方法以外には全く知られてい ないが、 このことは、 最終生産物となるペプチドまたは蛋白質を変性させる ことなく、 マイルドな条件下で N末端のメチォニン残基を除去しうる化学的 な反応を見い出すことの困難性に起因すると考えられる。 特に、 分子量が比 較的大きく、 遺伝子工学的に製造される蛋白質、 なかでも、 医薬として用い ることを目的とした蛋白質から、 N末端に余分に付加したメチォニンを除去 する場合、 メチォニン除去後に蛋白質の活性が低下しないことが要求される ため、 通常、 弱酸性から弱アルカリの水溶液中で加熱することなく、 反応を 進行させる必要があり、 化学的な反応条件としては制限が多いので、 良好な 反応条件を見い出せないのが現状であった。 発明の開示
本発明者らは、 遺伝子工学的に製造されるペプチド （蛋白質を含む） にお ける N末端のメチォニン残基のみを切断することによる、 天然型のアミノ酸 配列を有するペプチドの製造法を提供すべく鋭意研究したところ、 下記のス キ一ム 1に表されるとおり式 （ I ) で表わされる N末端に酸化されていても よいメチォニン残基を有するペプチドに、 例えば、 ひ -ジケトン類であるダリ ォキシル酸、 遷移金属イオンを供与しうる硫酸銅、 塩基 （例えばアミン類） であるピリジンを反応させて、 アミノ基移転反応を行うことにより得られる 該メチォニン残基のジケトン体を有するぺプチドに塩基（例えばジァミン類） である 3 , 4—ジァミノ安息香酸と、 酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およ びぎ酸ナトリゥムまたはぎ酸および酢酸ナトリゥム等の存在下に反応させて 加水分解反応を行うことにより、 該メチォニン残基のジケトン体を有するぺ プチドからメチォニン残基のジケトン体を予想外にも効率よく除去できるこ とを見出した。 すなわち、 本発明者らはメチォニン残基を有するペプチドか ら、 N末端の酸化されていてもよいメチォニン残基を除去し、 その活性を低 下させることなく、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有して いないべプチドを予想外にも高収率で得る方法を見い出し、 さらに研究を進 め、 本発明を完成させるに至った。
(スキーム 1 ) ο. ,
Figure imgf000006_0001
[式 （I ) 中、 mは 0ないし 2の整数を示し、 Xはアミノ酸残基または 2以上 の任意のアミノ酸数を有するペプチド鎖であればいずれでもよいが、 実用的 な面からは、 遺伝子工学的に製造された蛋白質の Xに対応する部分のぺプチ ド鎖が挙げられる。 なお、 本願明細書において、 蛋白質あるいはペプチドと 称する場合、 複数のアミノ酸からなるペプチドまたは蛋白質は、 非グリコシ ル化またはダリコシル化べプチドまたは蛋白質のいずれであってもよい。 ] 本願明細書においては、 上記スキーム 1中、
一般式 （ I ) に代表される化合物を 「N末端に酸化されていてもよいメチ ォニン残基を有するペプチド」 または「メチォニン残基を有するペプチド」 ； 一般式 （ I ) において
Figure imgf000006_0002
[式中、 mは前記と同意義]
に代表される部分構造を 「酸化されていてもよいメチォニン残基」 、 「メチ ォニン残基」 または 「メチォニン」 ；
一般式 （ I I ) に代表される化合物を 「N末端に酸化されていてもよいメ チォニン残基のジケトン体を有するペプチド」 または 「メチォニン残基のジ ケトン体を有するペプチド」 ；
一般式 （ I I ) において
Figure imgf000007_0001
[式中、 mは前記と同意義]
に代表される部分構造を 「酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン 体」 または 「メチォニン残基のジケトン体」 ； および、
一般式 （ I I I ) に代表される化合物を 「N末端に酸化されていてもよい メチォニン残基を有していないペプチド」 または 「N末端に酸化されていて もよいメチォニン残基のジケトン体を有していないべプチド」
と、 それぞれ称することがある。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有する ペプチドまたはその塩を、 酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およびぎ酸ナト リウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に 3， 4ージァミノ安息香 酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチォニン残基のジケトン 体の除去方法、
(2) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有する ぺプチドまたはその塩が、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を 有するぺプチドまたはその塩を 0；—ジケトン類と反応させることにより得ら れるペプチドまたはその塩である前記 （ 1) 記載の方法、
(3) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するぺプチドが遺 伝子工学的に製造されたペプチドである前記 （2) 記載の方法、
(4) ペプチド力 （i)成長ホルモン， （ii)ベ一夕セルリン， （iii)インター口 ィキン一 2， （iv)ニュートロフィン一 3または（V)ァペリンである前記 （ 1 ) 記載の方法、 (5) ペプチドが成長ホルモンである前記 （ 1 ) 記載の方法、
(6) 酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸お よび酢酸ナトリウムが、 pH約2なぃし9で約0. 1ないし 8niol/Lの緩衝液 として用いられることを特徴とする前記 （1) 記載の方法、
(7) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有する ペプチドまたはその塩を、 酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に 3， 4ージ ァミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチォニン残 基のジケトン体の除去方法、
(8) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有する ペプチドまたはその塩を、 酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およびぎ酸ナト リウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に 3， 4ージァミノ安息香 酸またはその塩と反応させることを特徴とする N末端に酸化されていてもよ いメチォニン残基を有していないペプチドまたはその塩の製造法、
(9) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有する ペプチドまたはその塩が、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を 有するぺプチドまたはその塩をひージケトン類と反応させることにより得ら れるペプチドまたはその塩である前記 （8) 記載の製造法、
( 1 0) 酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸 および酢酸ナトリウムが、 1^約2なぃし9で約0. 1ないし 8mol/Lの緩衝 液として用いられることを特徴とする前記 （8) 記載の製造法、
( 1 1 ) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有す るペプチドまたはその塩を、 酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に 3, 4— ジァミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする N末端にメチ ォニン残基を有していないべプチドまたはその塩の製造法、
( 1 2) 遺伝子工学的に製造され、 N末端に酸化されていてもよいメチォ二 ン残基を有するヒト成長ホルモンまたはその塩をダリオキシル酸またはその 塩と硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、 酢酸およびぎ酸ナトリ ゥム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリゥムまたはぎ酸および酢酸ナトリゥムの存在下 に 3, 4—ジァミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする N 末端にメチォニン残基を有していないヒト成長ホルモンまたはその塩の製造 法、
( 1 3) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するペプチドま たはその塩の該メチォニン残基を除去するための、 （ i )酢酸およびぎ酸ナト リウム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムと（ii) 3， 4—ジァミノ安息香酸またはその塩の使用、
(14) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有す るべプチドまたはその塩の該メチォニン残基のジケトン体を除去するための, ( i )酢酸およびぎ酸ナトリゥム、 ぎ酸およびぎ酸ナ卜リウムまたはぎ酸およ び酢酸ナトリウム、 と（ii) 3， 4ージァミノ安息香酸またはその塩の使用、
(1 5) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するペプチドま たはその塩から、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有しない ぺプチドまたはその塩を製造するための、 （ i )酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、 と（ii) 3， 4 —ジァミノ安息香酸またはその塩の使用、 および、
(1 6) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有す るペプチドまたはその塩から、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残 基のジケトン体を有していないべプチドまたはその塩を製造するための、
( i )酢酸およびぎ酸ナトリゥム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリゥムまたはぎ酸およ び酢酸ナトリウム、 と（ii) 3， 4ージァミノ安息香酸またはその塩の使用、 に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、実施例 4 a)で得られた電気泳動の結果を示す。 レーン（L a n e) 1は分子量マーカ一を、 レーン （L a n e) 2は精製 hGHを示す。
図 2は、 実施例 1 6 a)で得られた電気泳動の結果を示す。 レ一ン （L a n e) 1は分子量マ一力一を、 レーン （L a n e) 2は実施例 1 5で得られた BTCを示す。
図 3は、 実施例 1 8 a)で得られた電気泳動の結果を示す。 レーン （L a n e ) 1は分子量マーカーを、 レーン （L a n e ) 2は実施例 1 7で得られた
I L - 2を示す。
図 4は、 実施例 2 6で用いられた D N Aフラグメントを示す。
図 5は、 実施例 2 6で得られた 2重鎖構成のヒトァペリン一 3 6を製造す る模式図を示^。
図 6は、実施例 2 7で得られたプラスミ ド p TB 9 6 0— 1 3の構築図を示 す。 - 発明を実施するための最良の形態
本明細書において、 酸化されていてもよいメチォニン残基は、 メチォニン 残基またはその S酸化体を示し、 メチォニン残基の S酸化体としては、 スル ホキシドおよびスルホン体が挙げられる。
N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するペプチドとしては、 式 CH 3 - S (0) m -（CH 2) 2 - CH (NH 2 ) - CO- X [式中、 mは 0ないし 2の整数を示し、 Xはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す。 ] で表されるペプチドが挙げら れ、 これらは塩を形成してもよく、 塩としては、 本発明の反応を阻害しない ものであれば何れでもよいが、 中でも薬学的に許容可能な塩が好ましく、 塩 酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸など無機酸との塩、 酢酸、 フタル酸、 フマル酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 メタンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸などの有機酸との塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩な どのアルカリ金属塩、 カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 アンモニゥ ム塩などが挙げられる。
N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するぺプチドは、 遺伝 子工学的に製造された N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有す るペプチドであることが好ましい。
上記式中、 mとしては 0が好ましい。 また、 Xとしてはアミノ酸の数が 2 以上のぺプチド鎖が好ましい。
本発明のペプチドとしては、 アミノ酸数が 5 0未満のいわゆるペプチドあ るいはアミノ酸数が 5 0以上のいわゆる蛋白質の何れであってもよい。 このように、 本願明細書において、 「ペプチド」 で示される用語は、 アミ ノ酸数が 5 0未満の分子のみならず、 アミノ酸数が 5 0以上の分子をも含む ものであるが、 なかでも、 アミノ酸数が 5 0以上の分子 （いわゆる蛋白質） が好ましく用いられる。
好ましいペプチドとしては、 アミノ酸数が 2ないし 1 0 0 0であるべプチ ド、 さらに好ましくはアミノ酸数が 1 5ないし 5 0 0であるペプチドが挙げ られ、 その具体例としては、 成長ホルモン （G H ) 類 〔例えば、 ヒト成長ホ ルモン （h G H) (例、 2 0 K— h G H、 2 2 ー11 01^など） など〕 、 ベ —夕セルリン （B T C ) 、 副甲状腺ホルモン （P T H ) 、 インシュリン、 神 経成長因子、 脳由来神経栄養因子、 毛様体神経栄養因子、 グリア由来神経栄 養因子、 ニューロトロフィン一 3、 4または 6、 中枢神経成長因子、 グリア 成長因子、 肺由来神経栄養因子、 上皮細胞成長因子、 繊維芽細胞成長因子、 血小板由来成長因子、 トランスフォーミング成長因子ひまたは /3、 血管内皮 細胞成長因子、 ティッシュ ' プラスミノ一ゲン ·ァクチべ一夕、 ゥロキナー ゼ、 プロテイン C、 トロンボモジュリン、 骨形成因子、 カルシトニン、 イン スリン様成長因子、 イン夕一フエロン—ひ、 3またはァ、 インターロイキン - 1 ( α , β ) 〜 1 2、 顆粒コロニー刺激因子、 顆粒マクロファージ · コ口 ニー刺激因子、 顆粒マクロファージ刺激因子、 トロンポポェチン、 エリス口 ボイエチン、 P A C A P、 心房性ナトリウム利尿ペプチド、 エンドセリン、 巨核球成長因子、 血液幹細胞成長因子、 肝細胞成長因子、 モチリン、 ィムノ トキシン、 腫瘍壊死因子、 ヒルジン、 コルチコトロピン、 アンジォテンシン、 アンジォテンシン 2およびそのペプチド性拮抗薬、 アンジォテンシン 3、 ブ ラジキニン類、 ブラジキニン増強因子、 α、 ）3または rエンドルフィン、 ェ ンケフアリン、 好球中走化性因子、 ガストリン、 グルカゴン、 成長ホルモン 放出因子、 キヨウトルフィン、 カリジン、 性腺刺激ホルモン放出ホルモン、 肥満細胞脱顆粒ペプチド、 メラニン細胞刺激ホルモン、 ニューロテンシン、 トリプシンインヒビ夕一、 ォキシトシン、 プロインシュリン C一ペプチド、 セクレチン、 ソマトス夕チン、 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、 ュビキチ ン、 ゥロガストロン、 バソプレツシン類、 キニン類、 タフトシン、 ソマトメ ジン、 コルチコトロピン放出因子、 インスリン様成長因子、 カルシトニン遺 伝子関連ペプチド、 PTH r P、 V I P, DH I、 インスリノ トロピン、 G RP、 CCK一 P Z、 Galanin (ガラニン） 、 ァカトラムペプチド （Antrum Peptide) 、 PPY、 Pancreat ic Polypept ide> P S P、 パンクレアスタチン. h CG、 h C S、 リラキシン、 血清胸腺因子、 サイモポイエチン、 サイモシン. ファクター XIII、 ファクタ一 VIII、 プロゥロキナーゼ、 S〇D、 ファクター VII a, アンチトロンビン、 ァペリンなどの蛋白質およびそれらのムティン (天然型の蛋白質に 1つ以上のアミノ酸が置換、 欠損または付加し、 天然の 蛋白質と同等またはそれ以上の生物学的または免疫学的活性を示すもの） な ど、 あるいは化学合成などにより製造される公知または新規のペプチドなど が挙げられるが、 なかでも、 遺伝子工学的に製造されたペプチド （蛋白質を 含む） 、 とりわけ、 遺伝子工学的に製造された成長ホルモン類 〔例えば、 ヒ ト成長ホルモン （hGH) (例、 2 0K— hGH、 22K— hGHなど） な ど〕 、 ニューロトロフィン— 3、 ベー夕セルリン、 副甲状腺ホルモン、 イン 夕一ロイキン一 2、 ァペリンおよびそれらのムティン， 特に成長ホルモン類 〔例えば、 ヒト成長ホルモン （hGH) (例、 20K—hGH、 22 K- h GHなど） など〕 およびそれらのムティン、 とりわけ成長ホルモン類 〔例え ば、 ヒト成長ホルモン （h GH) (例、 20K— hGH、 22K— hGHな ど） など〕 が好ましく用いられる。 前記アベリンとしては、 例えば Biochem. Biophys. Res. Co匪 un. , 251, 471-476 (1998)に記載のヒトァペリン— 3 6、 ヒトァペリン一 1 3、 ァペリン一 1 3の Ν末端のアミノ酸 （G i n) がピロ グルタミン酸化したペプチドなどがあげられ、 AP J (O'Dowd. B. F. , et al. , Gene, 436, 355-359 (1993)) に対し、 リガンド活性を有するペプチドであれ ば、 如何なるものであっていてもよく、 具体的には、 例えば特願平 1 0— 2 7 1 654号に記載の 「配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質に結合能を有す るポリペプチド」 などが挙げられる。
上記したペプチド （天然型の蛋白質を含む） は、 何れの動物種由来のもの であってもよいが、 実用的には、 ヒト由来のペプチド （蛋白質を含む） が好 ましく用いられる。
上記のペプチドは、 N末端の酸化されていてもよいメチォニン （Me t ) 残基または該メチォニン残基のジケトン体の除去工程に付す前あるいは後に リフォールデイング （活性化、 再生化） を行うことができる。
本明細書において、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケ トン体を有するペプチドまたはその塩とは、 式 CH 3-S(0)m- (CH 2)2-C0-C0 - X [式中、 mは 0ないし 2の整数を示し、 Xはアミノ酸残基またはペプチド 鎖を示す。]で表される化合物またはその塩を示す。 N末端に酸化されていて もよいメチォニン残基のジケトン体を有するぺプチドまたはその塩は、 化学 反応または酵素反応等各種反応により得ることができる。 例えば、 化学反応 により得る方法としては、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を 有するぺプチドまたはその塩を α—ジケトン類と反応させるアミノ基移転反 応により、 Ν末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有 するペプチドまたはその塩を得ることができる （特開平 1 0— 7 248 9号 (ΕΡ—Α— 8 1 2856号） ） 。
本明細書において、 ひージケトン類は、 上記したペプチドまたはその塩の アミノ基移転反応を進行させうるものであれば何れでもよく、 例えば式 R 1 -CO-CO-R2 [式中、 R1は水素またはカルボキシル基で置換されてい てもよい低級アルキルもしくはフエニル基 （好ましくは水素またはメチル、 さらに好ましくは水素） を示し、 R2は水酸基、 低級アルコキシ基または低 級アルキルで置換されていてもよいアミノ基 （好ましくは水酸基） を示す。 ] で表される化合物またはその塩などが挙げられる。
上記式中、 R1で示される低級アルキル基としては、 メチル、 ェチル、 プ 口ピル、 i一プロピル、 ブチル、 i—ブチル、 s e c—ブチル、 t一ブチル などの炭素数 1ないし 6程度のアルキル基などが挙げられ、 R2で示される 低級アルコキシ基としては、 メトキシ、 エトキシ、 プロボキシ、 i 一プロボ キシ、 ブトキシ、 i 一ブトキシ、 s e c—ブトキシ、 t一ブトキシなどの炭 素数 1ないし 6程度のアルコキシ基などが挙げられる。 また、 R2で示され る低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基としては、 前記した R1で 示される低級アルキル基を 1ないし 2個有していてもよいアミノ基などが挙 げられる。 さらに、 塩としては、 上記した N末端に酸化されていてもよいメ チォニン残基を有するぺプチドの塩と同様なものが挙げられる。
α—ジケトン類の具体例としては、 ダリオキシル酸、 ピルビン酸、 ォキサ ル酢酸、 フエニルダリオキシル酸、 2—ォキソダルタル酸などが挙げられる が、 なかでも、 ダリオキシル酸が好ましく用いられる。
ひージケトン類は塩を形成していてもよく、 ナトリウム塩、 カリウム塩な どのアル力リ金属塩、 塩酸塩などの無機酸の塩などがあげられる。
Ν末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するペプチドまたはそ の塩と α—ジケトン類とのアミノ基転移反応は、 通常、 ペプチドまたはその 塩 1モルに対して、 1ないし 1万モル （好ましくは 2000ないし 4000 モル） 程度の α—ジケトン類を、 約 0ないし 70°C (好ましくは約 20ない し 40 ） で約 1 0分ないし 5時間 （好ましくは約 20分ないし 2時間） 反 応させるのが好ましい。 上記したアミノ基転移反応を阻害しないものであれ ば何れの緩衝液 （例、 リン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 クェン酸緩衝液など） を 用いてもよいが、 なかでも、 酢酸緩衝液が好ましく用いられる。 また、 反応 の pHは、 約 2ないし 9、 なかでも、 約 4ないし 7、 とりわけ、 約 5ないし 6に調整して反応を進行させるのがよい。
該ァミノ基転移反応を促進するため、 遷移金属イオンの存在下に α—ジケ トン類を反応させることが好ましく、通常、 α—ジケトン類 1モルに対して、 0. 00 1ないし 0. 1モル （好ましくは 0. 0 1ないし 0. 05モル） 程度の 遷移金属イオンを用いるのが好ましい。 遷移金属イオンとしては、 例えば、 銅イオン （Cu + , Cu 2+) 、 コバルトイオン （Co 2 +， Co 3+) 、 ニッケルィォ ン （Ni 2 +， Ni 3 + ) 、 鉄イオン （Fe 2 +， Fe 3 + ) 、 亜鉛イオン （Zn 2+) 、 ァ ルミニゥムイオン （Al 3+) 、 マンガンイオン （Mn 2 +など） 、 ガリウムィォ ン （Ga 3+) 、 インジウムイオン （In 3+) 、 マグネシウムイオン （Mg2+) 、 カルシウムイオン （Ca 2 + ) などを用いることができるが、 なかでも、 銅ィォ ン、 コバルトイオンなど、 とりわけ、 銅イオン （Cu 2+) が好ましく用いられ る。 これらの遷移金属イオンは、 通常、 硫酸、 硝酸、 塩酸、 過塩素酸などの 無機酸との塩または酢酸、 シユウ酸、 クェン酸、 炭酸などの有機酸との塩と して、 反応溶媒に添加することができ、 なかでも、 硫酸銅、 酢酸銅、 とりわ け、 硫酸銅が好ましく用いられる。
また、 塩基の存在下に α —ジケトン類を反応させることが好ましく、 通常、 α—ジケトン類 1モルに対して、 0 . 1ないし 2 0モル （好ましくは 0 . 5な いし 1 0モル） 程度の塩基を用いるのが好ましい。 塩基としては、 例えば、 トリェチルァミン、 トリプチルァミンなどのアルキルアミン類、 Ν , Ν—ジ メチルァニリン、 ピリジン、 ルチジン、 コリジン、 4— (ジメチルァミノ） ピリジン、イミダゾ一ルなどの芳香族アミン類などを用いることができるが、 なかでも、 ピリジンが好ましく用いられる。
また、 アミノ基転位反応の際に、 Ν末端に酸化されていてもよいメチォ二 ン残基を有するぺプチドまたはその塩、 および該ぺプチドまたはその塩のァ ミノ基転位反応で得られるメチォニン残基のジケトン体を有するペプチドま たはその塩の沈殿防止などを目的として、 該ペプチド， メチォニン残基のジ ケトン体を有するペプチドまたはその塩の種類に応じて、 アミノ基転位反応 のための緩衝液中に尿素を添加することが好ましい。 例えば、 h G Hを用い る場合、 緩衝液中に尿素を好ましくは約 1ないし 8 M、 より好ましくは約 3 ないし 6 Mの濃度になるよう添加することが好ましい。
さらに、 上記したアミノ基転移反応は、 遷移金属イオンおよび塩基の存在 下に α —ジケトン類を反応させることが好ましく、 実用的には、 遷移金属ィ オン、 塩基および α—ジケトン類の 3成分 （例えば、 硫酸銅、 ピリジンおよ びダリオキシル酸など） を含有する混合液を、 Ν末端に酸化されていてもよ いメチォニン残基を有するペプチドまたはその塩を含有する水溶液に添加し て、 アミノ基転移反応を進行させる。
該ァミノ基転移反応により得られ、 式 CH 3 - S (0) m- (CH 2 ) 2-C0-C0-X [式 中、 mは 0ないし 2の整数を示し、 Xはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示 す。]で表される化合物またはその塩 （メテオニン残基のジケトン体を有する ペプチドまたはその塩） は、 ペプチドまたは蛋白質の公知精製手段、 例えば、 抽出、 塩析、 分配、 再結晶、 クロマトグラフィーなどにより、 反応溶液から 単離 ·精製することもできるが、 そのまま次の加水分解反応に付すこともで さる。
アミノ基転移反応で得られたメチォニンのジケトン体を有するぺプチドま たはその塩は、 通常、 塩基による加水分解反応に付して、 N末端の酸化され ていてもよいメチォニン残基あるいは該メチォニン残基のジケトン体を有し ていないアミノ酸、 ぺプチドまたはその塩に変換することができる。
加水分解反応に用いる塩基としては、 例えば、 システアミン、 トリェチル ァミン、 トリプチルァミンなどのアルキルアミン類またはその塩、 N , N— ジメチルァニリン、 ピリジン、 ルチジン、 コリジン、 4一 （ジメチルァミノ） ピリジン、 イミダゾ一ルなどの芳香族ァミン類またはその塩、 o—フエニレ ンジァミン、 トリレン— 3 , 4—ジァミン、 3 , 4—ジァミノ安息香酸および その N—アルキル置換体 （例えば、 メチルー 1 , 2—フエ二レンジアミ ン、 N—ェチル一 1， 2—フエ二レンジァミン、 N—イソプロピル一 1， 2 一フエ二レンジァミンなど） 、 2 , 3—ジァミノフエノール、 4—クロ口一 o 一フエ二レンジァミンなどのジァミン類 （好ましくは芳香族ジァミン類、 な かでも、 3， 4—ジァミノ安息香酸およびその N—アルキル置換体 （例えば、 N—メチルー 1， 2—フエ二レンジァミン、 N—ェチル一 1， 2—フエニレ ンジァミン、 N—イソプロピル一 1， 2—フエ二レンジァミンなど） または それらの塩など、 チォセミカルバジド、 アセトンチォセミカルバジド、 フエ 二ルチオセミカルバジドなどのチォセミカルバジド類、 セレノセミカルバジ ド、 アセトンセレノセミカルバジドなどのセレノセミカルバジド類などのァ ミン類またはその塩などを用いることができるが、 なかでも、 アミン類、 と りわけ、 ジァミン類またはチォセミカルバジド類またはそれらの塩が好まし く用いられ、特に、 3 , 4—ジァミノ安息香酸またはその塩が好ましく用いら れる。
加水分解反応に用いられる塩基の塩としては、 例えば上記の N末端に酸化 されていてもよいメチォニン残基を有するぺプチドの塩と同様のものなどが あげられる。
塩基の量は、 通常、 メチォニン残基のジケトン体を有するペプチドまたは その塩 1モルに対して約 1ないし 1万モル、 好ましくは約 2 0 0ないし 3 0 0 0モル、 より好ましくは約 5 0 0ないし 3 0 0 0モルである。 加水分解反 応は、 通常、 約 0ないし 7 0 °C (好ましくは約 2 0ないし 4 0 °C ) で約 1時 間ないし 7日間 （好ましくは約 1 0時間ないし 5日間） で進行させるのが好 ましい。 反応には、 緩衝液を溶媒として用いることが好ましく、 緩衝液とし ては、 例えば、 ぎ酸系緩衝液 （例えば、 酢酸一ぎ酸ナトリウム、 ぎ酸一ぎ酸 ナトリウム、 ぎ酸一酢酸ナトリウムなど） などが挙げられる。 上記した加水 分解反応を阻害しないものであれば何れの緩衝液を用いてもよいが、 なかで も、 酢酸一ぎ酸ナトリウム、 ぎ酸一ぎ酸ナトリウムまたはぎ酸一酢酸ナトリ ゥム緩衝液が好ましく用いられる。 また、 反応の p Hは、 約 2ないし 9、 な かでも、 約 3ないし 7、 とりわけ、 約 4ないし 6に調整して、 反応を進行さ せるのがよい。 これらの緩衝液は、 好ましくは約 0 . l〜8 mo l/L、 より好 ましくは約 0 . 5〜6 mo l/L用いられる。
また、 加水分解の際に、 N末端の酸化されていてもよいメチォニン残基の ジケトン体を有するぺプチドまたはその塩および加水分解反応により生成す る該メチォニン残基を有していないアミノ酸， ぺプチドまたはその塩の沈殿 防止等を目的として、 該メチォニン残基のジケトン体を有するペプチド、 該 メチォニン残基を有していないアミノ酸， ぺプチドまたはその塩の種類に応 じて、 加水分解反応のための緩衝液中に尿素を添加することが好ましい。 例 えば、 h G Hを用いる場合、 緩衝液中に尿素を、 好ましくは約 1ないし 6 M、 より好ましくは約 2ないし 5 Mの濃度になるよう添加することが好ましい。 このようにして得られるアミノ酸、 ペプチドまたはその塩は、 公知の精製 手段、 例えば、 抽出、 塩析、 分配、 再結晶、 クロマトグラフィーなどにより、 反応溶液から単離 ·精製することもできるが、 好ましい例として、 例えば、 S P—セファロース （フアルマシア バイオテク（株）） あるいは、 D E A E
- 5 P W (東ソ一（株）） を介したイオン交換クロマトグラフィーなどによる 精製法が挙げられる。
本発明により製造されるべプチドはその N末端にメチォニンを有さず、 ま た目的とする生理活性ペプチド （例えば、 天然の生理活性ポリペプチド） と 同一のアミノ酸配列を有するものとして得られるので、 目的とするペプチド (例えば、 天然のポリペプチド） と同様の活性を有し低毒性で安全に医薬品 や診断用薬剤として使用できる。
本発明により、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基あるいは該 メチォニン残基のジケトン体を有するぺプチドから N末端のメチォニン残基 あるいは該メテオニン残基のジケトン体を特異的に除去することができる。 本発明の明細書および図面においてアミノ酸等の略号で表示する場合にほ、 I U P A C— I U B Commission on Biochemical Nomenclature による略号 あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下に示す。 またアミノ酸に関して光学異性がある場合は、 特に明示しなければ L一体を 示す。
.• 「ギ "7" ノ Jしレ i w¾i?t +フ P 1ソ 1 'ノ八 Λ
G ly ： グリシン
A la ： ァラニン
V al ： バリン
L eu ： ロイシン
I le ： イソロイシン
S er ： セリン
T hr ： スレオニン
C ys ： システィン
M et ： メチォニン
G lu ： グルタミン酸
G In ： グルタミン
A sp ： ァスパラギン酸
A sn ： ァスパラギン
L ys ： リジン
A rg ： アルギニン
H is ： ヒスチジン P h •， フノ J丁- -— 'ノ）しレァノ ノ 、— ノ、ノ 丄 yr • • ソ Ί、ノ'ノン、ノ
T rp ： トリブトファン
P ro ： プロリン
A sx ： A sp + A sn
G lx ： G lu + G In 以下の参考例および実施例によって本発明をより具体的に説明するが、 本 発明はこれらに制限されるものではない。 参考例 1 (T 7プロモータ一を用いたヒト成長ホルモン （hGH) 発現べク 夕一の構築）
hGHの構造遺伝子は、 ヒト下垂体 c DNAライブラリー （Qu i c k— C l o n e, CLONTECH社製） より、 構造遺伝子の開始コドン上流に 隣接して Nd e I切断部位を持つプライマー、 及び始終コドン下流に隣接 して B am H I切断部位を持つプライマ一を用いて、 PCRで増幅して回 収した。 これにより得られた両端に制限酵素認識部位が付加した h GH酵素 遺伝子を、 p T 7 B 1 u eの T一クロ一ニング部位に連結して （DNA L i g a t i on K i t Ve r. 2、 宝酒造株式会社製） pT 7HGH— Naを作製した。 これを、 大腸菌 J M 1 09に導入し、 アンピシリン耐性と β一ガラクトシダーゼ活性を指標として形質転換体を選択した。
一方、 以下の方法で発現ベクターを構築した。 P BR 322を Nd e I で切断、 T4 DNAポリメラ一ゼ （DNA B l u n t i n g K i t . 宝酒造株式会社製） で末端を平滑化し、 再度連結することによって、 Nd e I認識部位を欠損させた P BR d e s Nd eを作製した。 pET 3 cを B g 1 II一 E c o RVで切断し、 約 0. 26 k b pの断片を回収した後、 T 4 DNAポリメラ一ゼで末端を平滑化し、 pBRd e s Nd eの S e a I 断片と連結して、 PBRZT 7 d e s Nd eを作製した。 また、 部位特異 的変異導入 （Qu i c k Ch n g e, S T R A T A G E N E社製） によ り、 p BR 322の B am H I認識部位を欠損させた p B R 322 d e s B amを作製した。 p B R 322 d e s B amの S p h I— E c o R V 断片を PBRZT 7 d e s Nd eの S p h I— E c o RV断片と連結 してテ卜ラサイクリン耐性発現べクタ一 P T Cを作製した。 テトラサイクリ ン耐性遺伝子と T 7プロモ一夕一の向きが逆のものを p TC 1、 同じものを p TC 2とした。
PT 7HGH— Naを Nd e I及び B am H Iで切断してhGH構造 遺伝子を回収し、 pTC lの Nd e I— B am H I断片と連結した後、 大腸菌 J M 1 09に導入してアンピシリン耐性で形質転換体を選択、 その株 より再度プラスミ ドを回収して、発現プラスミ ド pTCHGH— Naとした。 大腸菌 MM 294を、 T 7ファージの RNAポリメラ一ゼ遺伝子で組換え られているラムダファージ （スチュデイエ、 スブラ） で溶原化した。 その後、 hGH発現べク夕ーpTCHGH— Naをこの大腸菌MM294 (DE 3) へ導入し、 大腸菌 MM 294 (DE 3) p T C H G H— N aを得た。 なお、 hGHの塩基配列は、 pT 7HGH— N aを作製した時点で AB I P r i s m 377 A D N Aシーケンサ一によって確認した。 参考例 2 (大腸菌でのメチォニン残基を有する h GH (Me t - hGH) の 発現）
参考例 1で得た形質転換細胞を、 5mgZLのテトラサイクリンを含む L B培地 （1 %ペプトン、 0. 5 %酵母エキス、 0. 5 %塩化ナトリウム） 1 リットルを含む 2リットル容フラスコ中で 30°C、 1 6時間振とう培養した。 得られた培養液を、 0. 02 %ニューポール LB— 625 (消泡剤：三洋化 成工業製） および 5m gZLのテトラサイクリンを含む 20リットルの LB 培地を仕込んだ 50リットル容発酵槽へ移植して、 37で、 6時間通気撹拌 培養した。 この培養液を 360リッ トルの主発酵培地 （ 1 · 68 %リン酸一 水素ナトリウム、 0. 3 %リン酸二水素カリウム、 0. 1 %塩化アンモニゥ ム、 0. 05 %塩化ナトリウム、 0. 05 %硫酸マグネシウム、 0. 05% ニューポール L B— 625、 0. 0005 %塩酸チアミン、 1. 5%ブドウ 糖、 3. 0 %ハイケースアミノ、 1. 0 %酵母エキス） を仕込んだ 500リ ットル容発酵槽に移植して、 37°Cで通気撹拌培養を開始した。 培養液の濁 度が約 1 200クレット単位になつた時点で 1 7. 85mg/L分のイソプ 口ピル一 /3— D—チォガラクトビラノシド （ I PTQ) を添加し、 さらに 2 4リットルの 30 %ブドウ糖を添加しながら培養を続け、 5時間後に培養液 を遠心分離して、 約 1 2. 3 k gの湿菌体を得、 — 80°Cに凍結保存した。 上記の形質転換大腸菌 （MM 294 (DE 3) ， pTCHGH— N a) は、 受託番号 FERM P- 1 6546として平成 9年 1 2月 1 0日に通商産業 省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託され、 受託番号 F ERM BP— 6888として平成 1 1年 9月 24日に国際寄託に移管され た。 また、 上記の形質転換大腸菌 （MM294 (DE 3) , pTCHGH— N a) は、 受託番号 I F〇 1 6 1 24として財団法人発酵研究所 （ I FO) に平成 9年 1 0月 1 6日に寄託されている。 実施例 1 (Me t— hGHの活性化）
参考例 2で得られた菌体 2 k gに 5 OmMトリス ZHC 1、 8 Mグァニジ ン塩酸塩溶液 （PH 8. 0) 6リットルを加えて菌体を溶解してから超音波 破砕器 （ソニファイア一 450、 ブランソン社） を用いて破砕処理を行った 後、 遠心分離 （1 0000 r pm、 1 20分間） を行った。 得られた上澄液 6リットルに 5 OmMトリス ZHC し 0. 28mMGS S G、 1. 4mM GSH、 0. 7Mアルギニン （pH8. 0) 1 8リッ トルを加えて p H 8. 0に調整した後、 4°Cで 4日間活性化を行った。 実施例 2 (Me t— hGHの精製）
実施例 1で活性化の終了した再生液をペリコンカセットシステム （PTG C膜、 ミリポア社） で、 2 OmMトリス ZHC 1、 2. 5 M尿素 （pH 8. 0) を加えながら電気伝導度が 1 OmS以下になるまで脱塩、 濃縮を行った 後、 得られた濃縮液 5リットルに 5 OmMリン酸緩衝液 （pH6. 0) を加 えて 50リットルに希釈後 4°Cにー晚静置した。 ついで、 連続遠心分離 （J じ？ー ロー夕、 ベックマン社） を行い、 得られた上清 50リットルに 1 0 M水酸化ナトリウムを加えて PH 7. 1 2に調整した後ペリコンカセットシ ステム （PTGC膜、 ミリポア社） で濃縮し、 201111^トリス/?1(： 1 (p H8. 0) に置換後、 遠心分離 （1 0000 r pm、 30分） を行い上清を 得た。 ついでこの液を 2 OmMトリス ZHC 1 (pH 8. 0) で平衡化した DEAE—トヨパ一ル 650 Mカラム （20 cm^X 84 cm、 東ソ一社） に吸着させ、 十分に洗浄した後、 20mMトリス ZHC 1、 50mM塩化ナ トリウム （pH8. 0) で溶出を行い、 Me t一 hGH画分として 95リッ トルの溶出液を得た。 さらに、 この溶出液をペリコンカセットシステム （P TGC膜、 ミリポア社） で濃縮、 脱塩し、 20:^1^トリス ？^。 1、 6M尿 素 （pH 8. 0) に置換し、 1 2. 2 1グラムの M e t— h GHを得た。 実施例 3 (N末端メチォニン残基 （N末端 Me t) の除去）
実施例 2で得た Me t _110]4溶液1 800ミリリツトルに 2. 5Mダリ ォキシル酸、 4 OmM硫酸銅、 50 %ピリジン溶液 450ミリリットルを加 えよく撹拌した後 25 °Cで 60分間反応させた。 次いで、 2 OmMトリス/ " HC し 4. 0M尿素 （pH8. 0) で平衡化したセフアデックス G— 25 カラム （1 1. 3 cm^ x i 25 cm、 フアルマシアバイオテク社） に 3リ ットル/ hの流速で通液し、 平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、 メチォ二 ン残基のジケトン体を有する h GH画分として 4. 2リットルの溶出液を得 た。 この溶出液を 1. 2M酢酸、 2. 4 Mぎ酸ナトリウム、 3. 6M尿素溶 液、 48mM3， 4—ジァミノ安息香酸溶液 20. 8リットル中によく撹拌 しながら加えた後、 30°Cでゆっくり攪拌しながら 3日間反応させた。 反応 後、 この溶液をペリコンカセッ トシステム （PTGC膜、 ミリポア社） で 1 4リツトルに濃縮し、 7リツトルずつ 2回に分けて 2 OmMトリス ZHC 1、
4. 0M尿素 （PH8. 0) で平衡化したセフアデックス G— 25カラム （2
5. 2 cm X 5 O cm, フアルマシアバイオテク社） に 6リットル の 流速で通液し、 h GH画分 20リットルを集めた。 ついで、 高速液体クロマ トグラフ法 （ギルソン HP L Cシステム、 ギルソン社） により、 この溶液を DEAE— 5 PWカラム （2 1 cmx 30 cm、 東ソ一社） に通液吸着させ た後、 A = 5 OmMトリス ZHC 1 + 2. 5 M尿素 （pH 8. 0) 、 B = 5 OmMME S [2 - (N—モルホリノ）エタンスルホン酸] + 2. 5M尿素（p H4. 0) とによる 70〜85 %Bの pH勾配で、 70分間、 320ミリり ットル Z分の流速で溶出を行い、 h GH画分 5. 84リットルを得た。 この h GH画分に 1 OMN a〇H溶液を 1 6ミリリツトル加えて pH 7. 1に調 整後、 8回に分けて高速液体クロマトグラフ法 （ギルソン HP L Cシステ厶、 ギルソン社） によるクロマトグラフィーを行った。 所定量の濃縮液を P OR ◦ S 20 R 1カラム （5 cmX 60 cm、 日本パーセプティブ社） に通液吸 着させた後、 A=25%n—フ。 。ノ-ル + 75 % 5 OmMトリス ZHC 1 (p H 8. 5) 、 B= 3 5 %n—フ。 Dハ -ル + 65 % 5 OmMトリスノ HC 1 (p H 8. 5) とによる 50〜85 %Bの濃度勾配で、 1 50分間、 50ミリリ ットル Z分の流速で溶出を行い、 h GH画分として 34. 7リツ.トルの溶出 液を得た。 この溶出液に蒸留水を加えて 200リツトルに希釈してからペリ コンカセッ トシステム （PTGC膜、 ミリポア社） で 5リットルに濃縮後更 に、 高速液体クロマトグラフ法 （ギルソン HP LCシステム、 ギルソン社） により、 この溶液を 3回に分けて D E AE— 5 PWカラム （1 0. 8 cmX 20 cm, 東ソ一社） に通液吸着させた後、 A= 5 OmMトリス/ HC 1 + 2. 5M尿素 （pH8. 0) 、 B= 5 OmMME S [2— (N—モルホリノ） エタンスルホン酸] + 2. 5M尿素 （pH4. 0) とによる 70〜85 %B の pH勾配で、 70分間、 80ミリリッ トル Z分の流速で溶出を行い、 hG H画分 1 6 1 6ミリリツトルを得た。 この h GH画分に 1 OMN a OH溶液 を 2ミリリットル加えて pH7. 1に調整後、 限外ろ過装置 （オメガ膜、 富 士フィル夕一社） で濃縮し、 濃縮液 0. 4リッ トルを得た。 この濃縮液を蒸 留水で平衡化したセフアクリル S— 1 00カラム （ 1 1. 3 cmci)X 50 c m、 フアルマシアバイオテク社） に 2リットル Zhの流速で通液、 展開し h GH画分を得た。 更に、 この溶液をミリパック 60 (ミリポア社） でろ過し、 hGH溶液 239 1ミリリットル （4638ミリグラムの h GH) を得た。 実施例 4 (h GHの特徴決定）
(a) SD Sポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例 3で得られた h GHに 1 0 OmMDTTを含むサンプルバッファ [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] を等量加えてよく撹拌し、 9 5°Cで 2分 間加熱後、 マルチゲル 1 0Z2 0 (第一化学薬品） で電気泳動を行った。 泳 動後のゲルをクマシ一 ·ブリリアント ·ブル一（Coomassie Brilliant Blue) で染色した結果、 約 2 2 KD aに単一のバンドが認められたことから、 精製 h GHは単一であることが確認された （図 1) 。
(b) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロティンシーケンサー （パーキンエルマ一 · アプライドバイオシステムズ社、 モデル 47 7 A) を用いて決定した。 その 結果、 得られた h GHの N末端アミノ酸配列は c DNAの塩基配列から推定 された h GHの N末端アミノ酸配列と一致した （表 1 ) 。
獄さ^： hGH©¾g^iJ
翻 0. PTH1) -アミノ酸 から予測される
κρτηο 1 ) アミノ酸
1 Phe (848) Phe
2 Pro (520) Pro
3 Thr (403) Th r
4 l i e (620) I 1 e
5 Pro (401) Pro
6 Leu (429) Leu
7 Se r ( 92) Se r
8 Arg (262) Arg
9 Leu (376) Leu
0 Phe (283) Phe 11 Asp (182) As p
12 Asn (175) Asn
13 Al a (175) Al a
14 Me t (194) Me t
15 Leu (261) Leu
16 Arg (181) Arg
17 Al a (144) Al a
18 Hi s ( 80) H i s
19 Arg (152) Arg
20 Leu (200) Leu
21 Hi s ( 71) Hi s
1) フヱニリ^才ヒダントイン
1 nmo 1を用いて分析を行つ广 (C ) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （L一 8 500 A, 日立） を用いて決定し た。 その結果、 得られた h GHのアミノ酸組成は c DN Aの塩基配列から推 定されるアミノ酸組成と一致した （表 2) 。 表 2
1モル当たりの hGHの纏例
アミノ酸 から予測される値
As 19. 8 20
Thr」 9. 7 10
Se r 16. 1 18
G 1 x 27. 0 27
Pro 7. 7 8
Gl y 8. 0 8
Al a 6. 9 7 Cy s N. D. 4
Va 1 6. 8 7
Me t 2. 9 3
I 1 e 7. 4 8
Leu 26. 6 26
Tyr 7. 9 8
Phe 12. 4 13
H i s 3. 0 3
Ly s 8. 7 9
Ar g 10. 7 11
Trp 0. 9
w0M (6N HC 1—4%チ才グリコ-ル酸、 110°C、 24及び 48B#fB n7j分 m
l) o ;^した ίϋο 2)
約 10 gを用いて分析をおこなつ广o
(d) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （L一 850 OA, 日立） を用いて決定 した。 得られた h GHの C末端アミノ酸は c DNAの塩基配列から推定され た C末端アミノ酸と一致した （表 3) 。
アミノ酸 隨率 {%)
Phe 94
ヒドラジン^ * (100t：、 6Pf¾D
20 nmo 1を用いて分析を行つ 実施例 5 (hGHの活性測定）
実施例 3で得られた精製 h GHの Nb 2細胞 [ジャーナル ·ォブ · クリニ カル ·エンドクリノ口ジ一 'アンド 'メ夕ボリズム、 5 1巻、 1 058頁 （ 1 980) ] に対する増殖促進効果は、 標準品 （ケミコンインターナショナル 社、 Temecula, CaHfornia, USA) と同等であった。 実施例 6 (N末端 Me tの除去）
実施例 3で得たメチォニン残基のジケトン体を有する h GH画分 0. 4ミ リリットルに 2 OmMトリス ZHC し 4. 0^1尿素 （ 1"18. 0) を加え て 2ミリリットルに希釈した。 この希釈液に等量の 4 M酢酸、 4 M酢酸ナト リウム、 6M尿素溶液、 80mM N—メチルー 1， 2—フエ二レンジァミン 溶液を加え、 よく攪拌した後 3 O :で 20時間反応させた。 反応後、 この溶 液を 2 OmMトリス/ HC し 4. 01^尿素 （ ^^8. 0) で平衡化したセ フアデックス G— 25カラム （l cm<i) X 30 cm、 フアルマシア社） に 6 0ミリリットル/ hの流速で通液し、 h GH画分 1 0ミリリツトルを集めた。 ついで、 高速液体クロマトグラフ法 （ギルソン HP L Cシステム、 ギルソン 社） により、 この溶液を DEAE— 5 PWカラム （2. 1 5 cmX 1 5 cm、 東ソ一社） に通液吸着させた後、 A= 5 OmMトリスノ HC 1 + 2. 5 M尿 素 （pH8. 0) 、 B= 5 OmMME S [ 2— (N—モルホリノ）エタンスル ホン酸] + 2. 5M尿素 （pH4. 0) とによる 70〜85 %Bの pH勾配 で、 70分間、 7. 5ミリリットル Z分の流速で溶出を行い、 hGHを得た。 実施例 7 (N末端 Me tの除去）
実施例 3で得たメチォニン残基のジケトン体を有する h GH画分 0. 4ミ リリットルに 2 OmMトリス ZHC 1、 4. 01^尿素 （ 118. 0) を加え て 2ミリリットルに希釈した。 この希釈液に等量の 2 M酢酸、 4Mぎ酸ナト リウム、 6M尿素溶液、 80mM N—メチル— 1， 2—フエ二レンジァミン 溶液を加え、 よく攪拌した後 30°Cで 20時間反応させた。 反応後、 この溶 液を 2 OmMトリス/ HC 1、 4. 0 M尿素 （pH8. 0) で平衡化したセ フアデックス G— 25カラム （l cmci)X 30 cm、 フアルマシア社） に 6 0ミリリットル/ hの流速で通液し、 h〇}^画分1 0ミリリットルを集めた。 ついで、 高速液体クロマトグラフ法 （ギルソン HP L Cシステム、 ギルソン 社） により、 この溶液を D E AE— 5 PWカラム （2. 1 5 cmX 1 5 cm、 東ソ一社） に通液吸着させた後、 A= 5 OmMトリス ZHC 1 + 2. 5 M尿 素 （ρΗ8. 0) 、 Β= 5 OmMME S [ 2— (N—モルホリノ）エタンスル ホン酸] + 2. 5M尿素 （pH4. 0) とによる 70〜85 %Bの pH勾配 で、 70分間、 7. 5ミリリットル/分の流速で溶出を行い、 hGHを得た。 実施例 8 (N末端 Me tの除去）
実施例 2で得た M e t— h GH溶液 1. 8m lに 2. 5 Mダリオキシル酸、 40mM硫酸銅、 50 %ピリジン溶液 0. 45 m 1を加えよく攪拌した後 2 5 で 60分間反応させた。 ついで、 20mMトリス HC 1、 4. 0 M尿 素 （pH8. 0) で平衡化したセフアデックス G— 25カラム （1. 5 cm X 30 c m, フアルマシアバイオテク社） に 1 00 m 1 の流速で通液 し、 平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、 メチォニン残基のジケトン体を有 する h GH画分として 1 0m lの溶出液を得た。 この溶出液を 1. 2 M酢酸、 2. 4 Mぎ酸ナトリウム、 3. 6 M尿素溶液、 48mM3, 4—ジァミノ安 息香酸溶液 49. 5m 1中によく攪拌しながら加えた後、 37 °Cでゆっくり 攪拌しながら 24時間反応させた。 反応後、 20mMトリス HC し 4. 0M尿素 （pH8. 0) で平衡化したセフアデックス G— 25カラム （4. 6 cm X 6 O cm, フアルマシアバイオテク社） に 500m l / hの流速 で通液し、 h GH画分 1 5 Om 1を集めた。 ついで、 高速液体クロマトダラ フ法 （ギルソン HP L Cシステム、 ギルソン社） により、 この溶液を DE A E- 5 PWカラム （2. 1 5 cmX 1 5 cm、 東ソ一社） に通液吸着させた 後、 A= 5 OmMトリス ZHC 1 + 2. 5 M尿素 （pH8. 0) 、 B= 50 mM ME S [2- (N -モルホリノ）エタンスルホン酸] + 2. 5 M尿素 （pH 4. 0) とによる 70— 85 %Bの pH勾配で、 70分間、 7. 5 m 1 Z分 の流速で溶出を行い、 6. 7mgの hGHを得た。 実施例 9 (N末端 Me tの除去） 実施例 2で得た M e t— h GH溶液 1. 8m lに 2. 5 Mダリオキシル酸、 40mM硫酸銅、 50%ピリジン溶液 0. 45 m 1を加えよく攪拌した後 2 5°Cで 60分間反応させた。 ついで、 20mMトリス ZHC 1、 4. 0 M尿 素 （pH 8. 0) で平衡化したセフアデックス G— 25カラム （ 1. 5 cm φ X 30 c フアルマシアバイオテク社） に 1 00m 1 Zhの流速で通液 し、 平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、 メチォニン残基のジケトン体を有 する h GH画分として 1 Om 1の溶出液を得た。 この溶出液を 2 Mぎ酸、 1 0Mぎ酸ナトリウム、 6 M尿素溶液、 80mM3， 4—ジァミノ安息香酸溶 液 1 Om 1中によく攪拌しながら加えた後、 30°Cでゆつく り攪拌しながら 3日間反応させた。 反応後、 2 0111^^トリス7?^(： し 4. 0M尿素 （pH 8. 0) で平衡化したセフアデックス G— 2 5カラム （4. 6 c πι X 60 cm、 フアルマシアバイオテク社） に 50 Om 1 Zhの流速で通液し、 hG H画分 1 0 Om 1を集めた。 ついで、 高速液体クロマトグラフ法 （ギルソン HP LCシステム、 ギルソン社） により、 この溶液を DEAE— 5 PWカラ ム （2. 1 5 cmx 1 5 cm、 東ソ一社） に通液吸着させた後、 A= 5 Om Mトリス ZHC 1 + 2. 5M尿素 （pH 8. 0) 、 B= 5 OmM ME S [2 一（N—モルホリノ）エタンスルホン酸] + 2. 5M尿素 （pH4. 0) とに よる 70— 8 5 %Bの pH勾配で、 70分間、 7. 5m 1 Z分の流速で溶出 を行い、 6. 0111 の1 01^を得た。 実施例 1 0 (メチォニン残基を有する 20 K- h GH (Me t一 20K— h GH) の活性化）
特開平 1 0— 234386号の参考例 2記載の方法で得られた菌体 40 g に P B S (リン酸緩衝化生理食塩水） 1 00ミリリツトルを加えて懸濁した 後、 5分間、 超音波破砕 （ブランソン社） を行い菌体を破砕した。 菌体破砕 液を遠心分離 （1 0000 r pm、 20分間） して上清を廃棄し、 封入体を 得た。 この封入体に 5 OmMトリス/ /HC 1、 8 Mグァニジン塩酸塩溶液（ p H8. 0) 2リットルを加えて封入体を溶解後、 遠心分離 （ 1 0000 r p m、 120分間） を行った。 得られた上清液 2リットルに 5 OmMトリス/ / HC 1、 0. 28mMGS SG、 1. 4mMGSH、 0. 7Mアルギニン （p H 8. 0) 24リットルを加えて、 4°Cで 1日間活性化を行った。 実施例 1 1 (Me t— 20K— hGHの精製）
実施例 1 0で活性化の終了した液をミニタン限外濾過システム （PTGC 膜、 ミリポア社） で 2 OmMトリス/ HC し 2. 5 M尿素 （pH8. 0) を加えながら電気伝導度が 1 OmS/cm以下になるまで脱塩、 濃縮を行つ た後、 得られた濃縮液を遠心分離 （1 0000 r pm、 20分間） し、 濃縮 液の上清 1 50ミリリツトルを得た。 ついでこの液を 5 OmMトリス ZHC 1、 2. 5^1尿素 1 0 %ァセトニトリル（p H 8. 2)で平衡化した HiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラム （1.6cm Φ x 10 cm、 フアルマシア ·バイオテ ク社） に吸着させ、 十分に洗浄した後、 0〜0. 1 8M塩化ナトリウムの濃 度勾配により流速 3. 0ミリリットル Z分で溶出を行い、 Me t - 20 K- h GH画分として 28ミリリットルの溶出液を得た。 さらにこの画分をセン トリプラス— 1 0 (ミリポア社） で濃縮 '脱塩を行い、 濃縮液 1 5ミリリツ トルを得た。 この液を再度、 5 OmMトリス ZHC 1、 2. 5 M尿素 1 0 % ァセトニトリル （pH8. 2) で平衡化した HiLoadTM Q Sepharose 16/10 HP カラム （1.6cm Φ x 10 cm、 フアルマシア 'バイオテク社） に吸着させ、 十分 に洗浄した後、 A= 5 OmMトリス HC 1、 2. 5 M尿素、 10 %ァセト 二トリル （pH8. 2) 及び B= 5 OmMME S [2- (N-モルホリノ） Iタンスルホン酸]、 2. 5M尿素、 1 0 %ァセトニトリル （PH4. 0) とによる 0〜 1 00 % Bの pH勾配で 60分間、 流速 3. 0ミリリッ トル Z分で溶出を行い、 Me t - 20 K- h GH画分 1 2ミリリツトルを得た。 この溶出液に 2 Mトリス /HC 1 (pH 7. 8) を 0. 6ミリリットル加えて pHを 7. 2に調整し、 セントリプラス一 1 0 (ミリポア社） で濃縮を行った。 この濃縮液 0. 5ミ リリットルを 1 0 %エタノールを含む P B Sで平衡化した SuperdexTM 75 HR 10/30 (1.0 cm Φ X 30 cm, フアルマシア 'バイオテク社） に添加し、 1 0% エタノールを含む P B Sで溶出し、 M e t _ 20 K— h GH画分 7. 5ミリ リットルを得た。 実施例 1 2 (N末端 Me tの除去）
実施例 1 1によって得た Me t - 2 0 K- h GH溶液 6ミリリットルを 2 OmMトリス ZHC 1、 8M尿素 （pH8. 0 ) で平衡化したセフアデック ス G— 2 5カラム （ 1 Omm I D X 3 0 cm、 フアルマシアバイオテク社） に通液し、 溶出してきた Me t— 2 0K— hGH画分を集め、 更に限外濾過 システム （ダイァフローメンプレン YM 1 0、 2 5mm, アミコン社） を使 つて 2ミリリットルに濃縮した。 この溶液に 2. 5 Mダリオキシル酸、 40 mM硫酸銅、 5 0 %ピリジン溶液 0. 5ミリリットルを加えよく撹拌した後 2 5°Cで 6 0分間反応させた。 次いで、 この反応液を 2 OmMトリス/ HC 1、 4M尿素 （pH8. 0) で平衡化したセフアデックス G_ 2 5カラム （ 1 Omm I D 40 c m, フアルマシアバイオテク社） に通液し、 メチォニン 残基のジケトン体を有する 2 0K— hGH画分として 4ミリリットルの溶出 液を集めた。 この溶出液に 1. 2M酢酸、 2. 4 Mぎ酸ナトリウム、 3. 6 M尿素、 48mM3， 4—ジァミノ安息香酸溶液 20ミリリットルを加えよ く撹拌した後 30°Cで 6 5時間反応した。 反応後、 2 OmMトリス/ HC 1、 4M尿素 （pH8. 0) で平衡化したセフアデックス G_ 2 5カラム （2 0 mm I D x 40 cm、 フアルマシアバイオテク社） に通液し、 2 0 K— h G H画分を集めた後、 更に高速液体クロマトグラフ法 （ギルソン HPL Cシス テム、 ギルソン社） により、 この溶液を 5 OmMトリス ZHC 1、 2. 5 M 尿素 1 0 %ァセトニトリル（pH 8.2)で平衡化した HiLoadTMQSepharose 16/10 HPカラム （1.6cm Φ X 10 cm、 フアルマシアバイオテク社） に吸着さ せ、 十分に洗浄した後、 A= 5 OmMトリス/ HC 1、 2. 5 M尿素、 1 0 % ァセトニトリル （pH8. 2 ) 及び B= 5 OmM ME S [2 - (N—モルホリ ノ）エタンスルホン酸]、 2. 5M尿素、 1 0 %ァセトニトリル （pH4. 0) とによる 0〜 1 00 %Bの pH勾配で 60分間、 流速 3. 0ミリリットル/ 分で溶出を行い、 20K— hGH画分 1 2ミリリットルを得た。 この溶出液 に 2Mトリス ZHC l (pH 7. 8) を 0. 6ミリリットル加えて p Hを 7. 2に調整した後、 セントリプラス一 1 0 (ミリポア社） で濃縮を行った。 こ の濃縮液 0. 5ミリリットルを 1 0 %エタノールを含む P B Sで平衡化した SuperdexTM 75 HR 10/30 (1.0 cm Φ x 30 cm, フアルマシア .バイオテク社） に添加し、 1 0 %エタノールを含む P B Sで溶出し、 20K— hGH画分 7. 5ミリリットルを得た。 実施例 1 3 (20K— hGHの特徴決定）
(a) N末端アミノ酸配列分析 ― N末端アミノ酸配列を気相プロティンシーケンサー ひ \°—キンエルマ一 · アプライドバイオシステムズ社、 モデル 477 A) を用いて決定した。 その 結果、 得られた 20 K_ h Ghの N末端アミノ酸配列は c DNAの塩基配列 から推定された 20K— hGHの N末端アミノ酸配列と一致した （表 4) 。 表 4
獄さ 20K— hGHの
歹鋤 0. PTH —アミノ酸 ら予測
(pmo 1) されるアミノ酸
1 Phe (642) Phe
2 Pro (504) Pro
3 Thr (342) Thr
4 I 1 e (410) I 1 e
5 Pro (200) Pro
6 Leu (378) Leu
7 Se r ( 95) S e r
8 Ar g (170) Ar g
9 Leu (285) Leu
10 Phe (262) Phe
1) フエ二リ1^才ヒダン卜イン
1 nmo 1の »を用いて分析を行った (b) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （システム 6300, ベックマン社） を用 いて決定した。 その結果、 実施例 1 2で得られた 20 K— hGHのアミノ酸 組成は 20K— h GHの c DNAの塩基配列から推定されるアミノ酸組成と 一致した （表 5) 。 表 5
1モル当たりの 2 OK - hGHの塩某
アミノ酸 膨 ら 、される値
As X 20. , 2 20
Thr1) 9. , 7 10
Ser" 16. 5 17
G 1 x 22. 0 22
Pro 6. 9 7
Gl y ft o w 8
Al a 6. 2 6
2)
Cy s N. D. 4
Va 1 7. 0 7
Me t 2. 9 3
I 1 e 6. 5 7
Leu 24. 3 25
Ty r 5. 9 6
Phe 12. 2 12
Hi s 3. 1 3
Ly s 7. 1 7
Ar g 10. 7 11
Trp N. D. 1
w (6N HC 1一 1%フエノール、 11 o , 24及び 4 ¾ロ
i rn i )。 約 20^ gを用レて分析をおこなっ 1) 0 ^ した 2) τ^Κ 実施例 14 (2 OK - hGHの活性測定）
実施例 12で得られた 20 ー11&1~1の1^132細胞 [ジャーナル ·ォブ · クリニカル ·エンドクリノロジ一 ·アンド ·メ夕ポリズム、 5 1巻、 1 05 8頁 （ 1 980) ] に対する増殖促進効果のあることを確認した。 実施例 1 5
(メチォニン残基を有するヒト BTC (ヒト Me t _BTC) の製造） 特開平 6— 87894号（EP— A— 05 55785号）の実施例 4〜 6、
8および 1 3に記載の方法に準じて、 下記の方法でヒト Me t— BTCを製 造した。
(大腸菌のヒト BTC c DNA発現プラスミドの構築）
ヒト ·プロ BTC ( 1— 147アミノ酸残基） をコードする 0. 6 Kbの E c o R I— B amH I断片を、 特開平 6— 87894号 （EP— A— 05 55785号）の実施例 5に記載のプラスミド pTB 1 5 1 5から単離した。 ATG翻訳開始コドン （5， 一 TATGGATGGG— 3 ' ； 5， — AAT TCCCATCCA— 3 ' ) を有する合成アダプタ一を上記 0. 6 K b断片 の E c 0 R I部位に連結した後、 生成した 0. 6Kb Nd e l— B amH I断片を、 T 7プロモータ一 （Ge n e、 56巻、 1 25頁 （1 987年） ） を含有するプラスミド pET— 3 c中へ挿入し、 プラスミド pTB 1 505 を構築した。
ヒト BTCの 80ァミノ酸残基 （特開平 6— 87894号 （EP—A— 0 555785号） の図 1 0— 1〜図 1 0— 2の 1 (A s p) から 80 (T y r ) まで） をコードする DNA断片を得るため、 铸型としてプラスミド pT Β 1 505、 プライマ一として 2個のオリゴヌクレオチド （5 ' — ATAC ATATGGATGGGAATTC C Α - 3 ' ； 5 ' 一 CCGGATCCT AGTAAAAC AAGTC AACTCT— 3 ' ) を用いて PCR
(polymerase chain reaction) を打った。 生成物を N d e Iおよび B a mH Iで消化し、 2. 0 %ァガロースゲル電気泳動で分画し、 目的とする 0. 2 5 KbDNA断片を単離した。 この 2 5 KbNd e I— B amH I断片 を、 p ET— 3 cの T 7プロモーターの下流に T 4 DN Aリガ一ゼを用いて 連結しプラスミド P TB 1 5 1 6を得た （特開平 6 _ 8 7 894号 （EP— A— 0 5 5 5 7 8 5号） の図 1 3参照） 。
(大腸菌でのヒト M e t -BTCの発現）
大腸菌 MM 2 94を、 T 7ファージの RNAポリメラーゼ遺伝子で組み換 えられているラムダファージ （スチュデイエ、 スブラ） で溶原化した。 その 後、 プラスミド p L y s Sをこの大腸菌 MM2 94 (DE 3) へ導入し、 大 腸菌 MM2 94 (DE 3) Zp L y s Sを得た。 この菌体に上記参考例で得 られたプラスミド pTB 1 5 1 6を導入し、 大腸菌 MM 2 94 (DE 3) / p Ly s S, pTB 1 5 1 6を得た。
この形質転換細胞を、 50 g/m 1のアンピシリンと 1 5 g/m 1の クロラムフエ二コールを含む L B培地 （ 1 %ペプトン、 0. 5 %酵母エキス、 0. 5 %塩化ナトリウム） 1リットルを含む 2リットル容フラスコ中で 3 7で、 8時間振とう培養した。 得られた培養液を 1 9リットルの主発酵培地 （1. 6 8 %リン酸一水素ナトリウム、 0. 3 %リン酸二水素カリウム、 0. 1 % 塩化アンモニゥム、 0. 0 5 %塩化ナトリウム、 0. 0 5 %硫酸マグネシゥ ム、 0. 02 %消泡剤、 0. 0 0 0 2 5 %硫酸第一鉄、 0. 0 0 0 5 %塩酸 チアミン、 1. 5 %ブドウ糖、 1. 5 %カザミノ酸） を仕込んだ 5 0リット ル容発酵糟へ移植して、 3 0°Cで通気撹拌培養を開始した。 培養液の濁度が 約 500クレツト単位になった時点で、 1 0 Omg/リツトル分のイソプロ ピル— ]3— D—チォガラクトビラノシド （ I PTG) を添加し、 さらに培養 を続け、 7時間後に培養を終了した。 この培養終了液を遠心分離して、 約 3 4 O gの湿菌体を得、 一 80°Cに凍結保存した。
この形質転換大腸菌 MM 2 94 (DE 3) /p Ly s S, p TB 1 5 1 6 は、 受託番号 FERM BP- 3 8 3 6として平成 4年 4月 2 1日に通商産 業省工業技術院生命工学工業研究所 （N I BH) に寄託され、 また受託番号 I FO 1 5282として平成 4年 4月 1 6日に財団法人発酵研究所 （ I F 〇） に寄託されている。
上述の方法により取得した N末端にメチォニン残基を有するヒトベータセ ルリン （Me t— BTC) 1 Omgを 3M尿素溶液 4m 1に溶解した後、 8 0 mM硫酸銅 0. 25 m 1、 ダリオキシル酸 0. 25 g、 ピリジン 0. 5 m 1の混合液を加え、 25 °Cで 1時間反応した。 反応終了後、 反応液を 2. 5 M尿素 + 5 OmMリン酸緩衝液（pH 6. 0) で平衡化したセフアデックス G — 25カラム （25mmIDX 600mmL) に通液し、 平衡化に用いた溶液を 6 m l Z 分の流速で展開し、 メチォニン残基のジケトン体を有する BTC画分をブー ルした。 続いてこの画分に等量の 2 M酢酸、 4 Mギ酸ナトリウム、 3M尿素 溶液を加えた後、 3、 4ージァミノ安息香酸を 4 OmM濃度になるよに添加 して、 脱気、 窒素ガスシールを行い、 25°Cで 5日間反応した。 反応終了後、 反応液を 5 OmMリン酸緩衝液 （pH6. 0) で平衡化したセフアデックス G— 25カラム （46mmIDX 600mmL) に通液し、 平衡化に用いた緩衝液を 1 0 m 1 /分の流速で展開し、 N末端にメチォニンの付加していない BTC画分 をプールした。 プールした BTC画分を pH 6. 0に調整後、 5 OmMリン 酸緩衝液 + 0. 1 M N a CL+ 2. 5M尿素 （pH5. 0) で平衡化した C M— 5 PW (21.5mmIDX150mmL, 東ソ一 （株） ） に吸着した後、 0— 1 00 % B (B= 5 OmMほう酸緩衝液 + 0. 1M N a C 1 + 2. 5 M尿素、 ρΗ9· 0) の段階勾配で 60分間、 6m 1 /分の流速で溶出を行い、 BTC画分を プールした。 さらに、 ；8丁〇画分を0. 1 %TFAで平衡化した C4 P— 5 0 (10imIDX 50miiiL, 昭和電工 （株） ） に吸着した後、 20— 60 %B (B = 80 %ァセトニトリル /0. 1 %TF A) の段階勾配で 40分間、 2 ml/ 分の流速で溶出した。 BTCのフラクションをプールした後、 凍結乾燥を行 い、 BTC約 2. 6mgを得た。 実施例 1 6 (BTCの特徴決定）
a) SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例 1 5で得られた BTCを Sample buffer [Laemml i,ネィチヤ- (Nature), 227, 680 (1970)] に懸濁し 100°Cで 1分間加熱した後、マルチゲル 1 5/25 (第一化学薬品 （株） ） で電気泳動を行った。 泳動後のゲルをクー マシーブリリアントブル一（Coomassie brilliant blue)で染色したところ、 単一バンドの蛋白が認められ、 精製品はほぼ単一であった （図 2) 。 b) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサ一（ァフ。ライド Λ'ィォシステム モ ϊ' ル 477Α)を用いて決定した。 その結果、 得られた BTCの c DNAの塩基配列 から推定した BTCの Ν末端アミノ酸配列と一致した （表 6) 。 表 6
細さ^^こ BTCの塩細列
纖 No. Ρ1Ή丄 ) -アミノ酸 から予測される
(pmol) (pmol)アミノ酸
Asp (261) As ρ
2 G 1 y (457) Gly
3 Asn (300) Asn
4 Se r (107) Se r
5 Thr (75) Thr
6 Arg (181) Arg
7 Se r (121) Se r
8 Pro (245) Pro
9 Gl u (55) Gl u
10 Thr (71) Thr
11 Asn (133) Asn
12 Gly (149) Gly
13 Leu (132) Leu
14 Leu (155) Leu
15 N. D. Cy s
16 Gly (111) Gly 17 Asp (70) As p
18 Pro (65) Pro
19 Glu (29) Glu
20 G 1 u (64) Glu
1 nmo 1を用いて分析を行った。
N. D. 未細
1) フェニーリ ォヒダントイン c ) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（へ'ックマン システム 6300E)を用いて決定した。 そ の結果、 BTCの c DNAの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した (表 7) 。 表 7
1モル当たりの BTCの
アミノ酸 残 基 数 から予測される値
As X 7. 0 7
Thr 6. 1 6
Se r 4. 8 5
Gl x 9. 3 9
Pro 3. 8 4
Gl y 7. 1 7
Al a 4. 0 4
2)
Cy s N. D. 8
Va 1 3. 9 4
Me t 0 0
I 1 e 1. 9 2
Leu 3. 0 3
Ty r 3. 7 4 Phe 3. 3 3
Hi s 2. 3 2
Ly s 5. 0 5
Ar g 6. 9 7
Tr p 0 0
(6 ¾ 1 %フエノール 110°C、 24 · 48 #fH1
Figure imgf000039_0001
1) 0晴 した値 ―
2)未細
ca.20 ^ gを用いて分析を行った。 d) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計（へ'ックマン システム 6300E)を用いて決定した。 得られた BTCは c DN Aの塩基配列から推定した C末端アミノ酸と一致し た （表 8) 。 表 8 ： アミノ 析
C¾¾アミノ酸 m %)
BTC
Ty r 44. 6
@ヒドラジン^ 去 （100°C， 3. 5»
15 nmo 1を用いて分析を行った。 e) BTCの生物活性
精製品はモレキュラー ·セル ·バイオロジー、 8、 588 ( 1 988) に 記載の方法により、 BALB/C3T3 A31-714 クロ-ン 4 (インターナショナル ' ジャ ーナル ·ォブ ·キヤンサ一、 1 2、 463 ( 1 973) を用いた活性測定を 行い、 標準品と同等の活性を有することを確認した。 実施例 1 7
特開平 1 0— 72489号 （EP— A— 8 1 2856号） の参考例 5の方 法により取得した N末端にメチォニン残基を有するヒトインターロイキン— 2 (Me t— I L— 2) 50 m gを 4 M尿素溶液 40 m 1に溶解した後、 1 O OmM硫酸銅 2. 5m 1、 グリオキシル酸 2. 5 g、 ピリジン 5. Om 1の混合液を加え、 25 °Cで 1時間反応した。 反応終了後、 反応液を 1 0m Mリン酸緩衝液 + 2. 5M尿素 （pH5. 0 ) で平衡化したセフアデックス (S e p h a d e ) G— 2 5カラム （46mmIDX 600mmL) に通液し、 平衡化 に用いた溶液を 1 Om 1 Z分の流速で展開し、 メチォニン残基のジケト 体 を有する I L一 2画分をプールした。 続いてこの画分に等量の 2 M酢酸、 4 Mギ酸ナトリウム、 3 M尿素溶液を加えた後、 3、 4 _ジァミノ安息香酸を 4 OmM濃度になるように添加して、 脱気、 窒素ガスシールを行い、 25°C で 5日間反応した。 反応終了後、 反応液を 1 OmMリン酸緩衝液 + 2. 5M 尿素 （PH5. 0) で平衡化したセフアデックス G_ 25カラム （46匪 IDX 600miL) に通液し、 平衡化に用いた緩衝液を 1 Om 1 分の流速で展開し、 N末端にメチォニンの付加していない I L - 2画分をプールした。 プールし た I L一 2画分を、 25mMリン酸緩衝液 （pH 7. 0) で平衡化した S P - 5 PW (21.5匪 IDXl50mmL、 東ソ一 （株） ） に吸着した後、 30— 80 % B (B= 25mMりん酸緩衝液、 pH8. 0) の段階勾配で 60分間、 6 m 1 Z分の流速で溶出を行い、 1 7. 3mgの I L— 2画分を得た。 実施例 18 ( I L- 2の特徴決定）
a) SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例 1 7で得られた I L一 2を Sample buffer [Laemmli,ネィチヤ-
(Nature), 227, 680 (1970)] に懸濁し 100°Cで 1分間加熱した後、マルチゲル 1 5/25 (第一化学薬品 （株） ） で電気泳動を行った。 泳動後のゲルをク一 マシ一ブリリアントブル一（Coomassie brilliant blue)で染色したところ、 単一バンドの蛋白が認められ、 精製品はほぼ単一であった （図 3) 。
b) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサ一（ァフ。ライド Λ'ィォシステム モテ' ル 477Α)を用いて決定した。 その結果、 得られた I L— 2の c DNAの塩基配 列から推定した I L— 2の N末端アミノ酸配列と一致した （表 9) 表 9
さ IL-2
Figure imgf000041_0001
藤 No. PTH -アミノ酸 から予測される
(pmol) アミノ酸
1 A 1 a (701) Al a
2 Pro (354) Pro
3 Thr (359) Thr
4 Se r (122) Se r
5 Se r (128) Se r
6 Se r (78) Se r
7 Thr (46) Thr
8 Ly s (176) Lys
9 Lys (61) Lys
10 Thr (40) Th r
1 nmo 1を用いて分析を行った。
1) フェニーリ！ ^才ヒダン卜イン C ) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（へ'ックマン システム 6300E)を用いて決定した。 そ の結果、 I L一 2の c DNAの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致し た （表 1 0 ) 。 表 10
1モル当たりの IL—
Figure imgf000041_0002
アミノ酸 残 基 数 から予測される値
As X 8 12 Thr 12. 9 13
Se r 7. 0 8
Gl x 18. 4 18
Pro 4. 8 5
Gl y 2. 0 2
Al a 4. 8 5
Cy s' N. D. 3
Va 1 3. 5 4
Me t 3. 8 4
I 1 e 7. 7 9
Leu 22. 0 22
Tyr 2. 8 3
Phe 5. 6 6
Hi s 2. 9 3
Ly s 10. 3 11
Arg 3. 7 4
Trp 0. 9
黝咏 （ 6 N驢- 4%チォグリコ一避、 110°C 24-48«,カ咏 職
1) 0麵 した値
2) mm d) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計（へ'ックマン システム 6300E)を用いて決定した。 得られた I L一 2は c DNAの塩基配列から推定した C末端アミノ酸と一致 した （表 1 1) 。
¾1 1 ： アミノ酸分析
アミノ酸 (¾)
IL-2
Thr 32. 5 目ヒドラジン^ 去（100°C， 3. 5Β»
15nmo 1を用いて分析を行つ e) I L- 2の生物活性
生物活性測定は、 I L一 2依存細胞を用いる日沼らの方法 [バイオケミカ ル ·バイオフィジカル · リサーチ · コミュニケ一ションズ
(Biochem. Biophys. Res. Commun. ), 109, 363 (1982) ]に従がつて行い、標準品と 同等の活性を有することを確認した。 実施例 1 9 (Me t— hGHの活性化）
参考例 2で得られた菌体 1 k gに 5 OmMトリス Z酢酸、 8 Mグァニジン 塩酸塩溶液 （pH8. 5) 4リットルを加えて菌体を溶解した後、 遠心分離 (1 0, O O O r pm) を行った。 得られた上清液約 4リットルに 50 mM トリス/酢酸、 1. 09mM還元型ダル夕チオン、 0. 055mM酸化型グ ル夕チオン、 1 09mMアルギニン、 4. 36M尿素溶液 （pH8. 0) 4 4リットルを加えて、 4°Cで 3日間活性化を行った。 活性化の終了した液を ペリコンカセットシステム （バイオマックス 8膜、 ミリポア社） で、 20m Mトリス Z酢酸、 2. 5^1尿素溶液 （ 1^8. 0) 約 25リットルを加えな がら電気伝導度が 5mS/cm以下になるまで濃縮脱塩を行った。 再度、 2 OmMトリス Z酢酸溶液 （pH8. 0 ) 約 35リッ トルを加えながら脱塩を 行った後、 遠心分離 （1 0， O O O r pm) を行い上清を得た。 ついで、 上 清液を 2 OmMトリス/酢酸溶液 （pH8. 0) で平衡化した DEAE_ト ョパール 650 Mカラム（30 cmci)X 60 cm、 東ソ一社） に吸着させ、 2 OmMトリス/酢酸溶液 （pH8. 0) および 2 OmMトリスノ酢酸、 25 mM塩化ナトリウム溶液 （pH8. 0) で十分に洗浄した後、 2 OmMトリ ス /酢酸、 55mM塩化ナトリウム溶液 （pH8. 0) で溶出を行い、 Me t—hGH画分として 50リットルの溶出液を得た。 この溶出液をペリコン カセットシステム （バイオマックス 8膜、 ミリポア社） で濃縮脱塩し、 Me t - h GHを得た。 実施例 20 (Me t— hGHの活性化）
参考例 2で得られた菌体 1 k gに 5 OmMトリス/酢酸、 8 Mグァニジン 塩酸塩溶液 （PH8. 5) 4リットルを加えて菌体を溶解した後、 遠心分離 (1 0， 000 r pm) を行った。 得られた上清液約 4リットルに 5 OmM トリス Z酢酸、 5. 45 mMシスティン塩酸塩一水和物、 1 09mMアルギ ニン、 4. 9 1M尿素溶液 （pH8. 0) 44リットルを加えて、 4°Cで 3 日間活性化を行った。活性化された Me t— hGHの量は実施例 1 9の約 1. 2倍多く得られた。 活性化の終了した液をペリコンカセットシステム （バイ ォマックス 8膜、 ミリポア社） で、 20mMトリス/酢酸、 2. 5 M尿素溶 液 （PH8. 0) 25リットルを加えながら電気伝導度が 5mS/c m以下 になるまで濃縮脱塩を行った。 再度、 2 OmMトリス Z酢酸溶液 （pH8. 0) 35リットルを加えながら脱塩を行った後、 遠心分離 （1 0， 000 r pm) を行い上清を得た。 ついで、 上清液を 2 OmMトリス Z酢酸溶液 （p H 8. 0)で平衡化した DEAE—トヨパール 650 Mカラム（30 επιφ X 60 c m、 東ソ一社） に吸着させ、 2 OmMトリス /酢酸溶液 （pH 8. 0) および 2 OmMトリスノ酢酸、 25mM塩化ナトリウム溶液 （pH 8. 0) で十分に洗浄した後、 2 OmMトリスノ酢酸、 55 mM塩化ナトリウム溶液 (pH 8. 0) で溶出を行い、 Me t— hGH画分として 50リットルの溶 出液を得た。 この溶出液をペリコンカセットシステム（バイオマックス 8膜、 ミリポア社） で濃縮脱塩し、 Me t— hGHを得た。 実施例 2 1 (Me t— h GHの活性化）
参考例 2で得られた菌体 1. 25 gに 5 OmMトリス 酢酸、 8Mグァニ ジン塩酸塩溶液 （pH 8. 5) 5ミリリットルを加えて菌体を溶解した後、 遠心分離 （1 0， 000 r pm) を行った。 得られた上清液約 5ミリリット ルに 5 OmMトリス/酢酸、 5. 45mMN—ァセチルー L一システィン、 1 09mMアルギニン、 4. 9 11^尿素溶液 （ ？{8. 0) 55ミリリットル を加えて、 4 °Cで 3日間活性化を行った。 その結果、 システィン塩酸塩一水 和物を添加した場合 （実施例 20) と同等の Me t— hGHの活性化効率が 認められた。 実施例 22 (Me t— hGHの活性化）
参考例 2で得られた菌体 1. 2 5 gに 5 OmMトリス Z酢酸、 8Mグァニ ジン塩酸塩溶液 （pH 8. 5) 5ミリリットルを加えて菌体を溶解した後、 遠心分離 （ 10, 000 r p m) を行った。 得られた上清液約 5ミリリット ルに 5 OmMトリス/酢酸、 5. 45 mMシステアミン塩酸塩、 1 09mM アルギニン、 4. 9 1^^尿素溶液 （ ^18. 0) 55ミリリットルを加えて、 4°Cで 3日間活性化を行った。 その結果、 システィン塩酸塩一水和物を添加 した場合（実施例 20) と同等の Me t—hGHの活性化効率が認められた。 実施例 23
特開平 1 0— 72489号 （EP— A— 8 12856号） の参考例 3記載 の方法により、 N末端にメチォニン残基を有するヒトニユーロトロフィン一 3 (Me t -NT- 3) を製造した。
N末端にメチォニンの付加したヒトニユーロトロフィン一 3 (Me t -N T一 3) 5 Omgを 3Μ尿素溶液 8 m 1に溶解し、 0. 2 M硫酸銅 0. 4 m 1、 ダリオキシル酸 0. 5 g、 ピリジン lm 1の混合液を加え 1 Omにし た後、 25°Cで 1時間反応した。 反応終了後、 反応液を 2. 5M尿素 + 1 0 mMリン酸緩衝液（pH 6. 0) で平衡化したセフアデックス （S e p h a d e x) G— 25カラム （25匪 IDX 600mmL) に通液し、 平衡化に用いた溶液を 4m l Z分の流速で展開し、 メチォニン残基のジケトン体を有する NT— 3 画分をプールした。続いてこの画分に等量の 2M酢酸、 4Mギ酸ナトリウム、 3 M尿素溶液を加えた後、 3、 4—ジァミノ安息香酸を 4 OmM濃度になる ように添加して、 25°Cで 5日間反応した。 反応終了後、 反応液を 2. 5M 尿素 + 1 OmMリン酸緩衝液 （pH6. 0) で平衡化したセフアデックス G 一 25カラム （46mmIDX 600mmL) に通液し、 平衡化に用いた緩衝液を 1 0 m 1 Z分の流速で展開し、 N末端にメチォニン残基を有していないヒトニユー ロト口フィン一 3 (NT- 3) 画分をプールした。 プールした NT— 3画分 を p H 5. 0に調整後、 5 0 mMリン酸緩衝液 + 0. 2 M N a C 1 + 2. 5 M尿素 （pH 5. 0) で平衡化した CM— 5 PW (21.5mmIDX 150mmL, 東ソ ― (株） ） に吸着した後、 0 _ 1 00 %B (B= 50mMリン酸緩衝液 + 0. 2M N a C 1 + 2. 5 M尿素、 p H 8. 0 ) の段階勾配で 6 0分間、 6 m 1 /分の流速で溶出を行い、 NT— 3画分をプールした。 さらに、 NT— 3画 分を 0. 1 %TFAで平衡化した C 4 P— 50 (21.5 mm I D X 3 0 Ο Ή mL、 昭和電工 （株） ） に吸着した後、 2 0— 6 0 %B (B = 8 0 %ァセト 二トリル /0. 1 %TF A) の段階勾配で 40分間、 5m l /分の流速で溶出 した。 NT— 3のフラクションをプールした後、 凍結乾燥を行い、 NT— 3 の凍結乾燥粉末約 5 m gを得た。 実施例 24 (NT— 3の特徴決定）
a) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサ一（アプライドバイオシ ステムズモデル 47 7 A)を用いて決定した。 その結果、 c DNAの塩基配列 から推定した NT— 3の N末端アミノ酸配列と一致した （表 1 2) 。 表 1 2
検出された NT- 3の塩基配列
残基 No PTH*) -アミノ酸 から予測される
卿 1) アミノ酸
Ty r (410) Ty r
2 A 1 a (521) A 1 a
3 G 1 u (155) G 1 u
4 H i s (213) H i s
5 L y s (587) L y s
6 S e r ( 91) S e r
7 H i s (161) H i s 8 A r g (318) A r g
9 G 1 y (214) G 1 y
0 G 1 u (108) G 1 u
Ty r (104) Ty r
12 S e r ( 50) S e r
1 3 V a 1 (208) V a 1
14 N. D. C y s
1 5 A s p ( 99) A s p
1 6 S e r ( 41) S e r
1 7 G 1 u ( 24) G 1 u
18 S e r ( 27) S e r
1 9 L e u ( 63) L e u
20 T r p ( 26) T r p
1 nmo 1を用いて分析を行った (
N. D. 未検出
*) フェニールチオヒダントイン b) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（へ'ックマン システム 6300E)を用いて決定した。 そ の結果、 NT— 3の c DNAの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致し た （表 1 3 ) 。 表 1 3
モル当たりの NT- 3の塩基配列 アミノ酸 残 基 数 から予測される値
A s X 1 1. 0
Th r *) 8 - 7 9
S e r *) 10. 4 2
G 1 x 1 1. 0 P r o 1. 7 2
G 1 y 8. 0 8
A 1 a 4. 8 5
C y s N. D, 6
V a 1 8. 7 9
Me t 0 0
I 1 e 6 7 7
L e u 5 0 5
T y r 5 1 5
P h e 1 2 1
H i s 4 3 4
L y s 9 7 0
A r g 9 6 0
T r p 3 8 4
酸加水分解 （6 N塩酸一 4%チォグリコール酸 1 1 0° (：、
24 - 48時間、 加水分解の平均値）
N. D. 未検出
*) 0時間に外挿した値
ca.20 /I gを用いて分析を行った。 d) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマンシステム 6300 E)を用い て決定した。 その結果 c DNAの塩基配列から推定した C末端アミノ酸と一 致した （表 14) 。 表 14
C末端アミノ酸 回収率
NT- 3 (%)
Th r 42. 0 気相ヒドラジン分解法 （ 1 00°C 3. 5時間）
1 5 nmo 1を用いて分析を行った。 e)NT- 3の生物活性
実施例 23で得られた NT— 3について DRG (ニヮトリ有精卵をふ卵器 で 37. 5°C 8— 10日間揺卵して、 胚発生を行った胎児から摘出した後 神経節 （Do r s a l r o o t g a n g l i a) ) を用いた生物活性測 定を行い、 CHO細胞より得られた NT— 3と同等の活性を有することを確 pj^し 7 実施例 25
実施例 2で得られた Me t一 hGH溶液 14. 7 5m lを 6 M尿素溶液で 60m lにした後、 0. 5M硫酸銅 1. 2m 1、 ダリオキシル酸 3. 75 g、 ピリジン 7. 5m 1の混合液を加え 75m 1にした後、 25°0で1時間 反応した。 反応終了後、 反応液を 4 M尿素 + 2 OmMトリス緩衝液（pH 8. 0) で平衡化したセフアデックス （S e p h a d e x) G— 25カラム （4. 6 cm I DX 60 cmL) に通液し、 平衡化に用いた溶液を 1 0 m 1 Z分の 流速で展開し、 メチォニン残基のジケトン体を有する h GH画分をプールし た。 続いてこの画分に等量の 2 M酢酸、 4 Mギ酸ナトリウム、 4 M尿素溶液 を加えた後、 3 4—ジァミノ安息香酸を 4 OmM濃度になるように添加し て、 30°Cで 4日間反応した。 反応終了後、 反応液を 4M尿素 + 2 OmMト リス緩衝液 （PH8. 0) で平衡化したセフアデックス G— 25カラム （1 1. 3 cm I DX 80 cmL) に通液し、 平衡化に用いた緩衝液を 30 m 1 /分の流速で展開し、 N末端にメチォニン残基を有していない h GH画分を プールした。 プールした hGH画分を、 5 OmMトリス緩衝液 + 2. 5 M尿 素 （pH8. 0) で平衡化した DEAE— 5 PW (5. 5 cm I DX 20 c mL、 東ソー （株） ） に吸着した後、 0— 100%B (B = 5 OmM ME S + 2. 5M尿素、 pH4. 0) の段階勾配で 60分間、 1 5m l /分の流 速で溶出を行い、 h GH約 6 Omgを取得した。 実施例 26 ヒトァペリンー 36構造遺伝子の調製
図 4に示す 6種類の DN A断片（#1， #5：グライナ一'ジャパン社、 #2, #6： キコ一テック社、 #3, #4：アマシャム 'フアルマシア 'バイオテク） を用いて ァペリン一 3 6の構造遺伝子を調製した （図 5) 。 a) DNAオリゴマーのリン酸化 ― 5'末端になるべき #1及び #6を除いた 4種類のオリゴマ一各 1 ^ gを 100 Lのリン酸化反応液 [50mM Tris- HC1 (pH7.6), 10mM MgCl2, ImM スペルミ ジン、 lOmM ジチオスレイト一ル、 0. lmg/mLゥシ血清アルブミン、 lmM ATP、 10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ （日本ジーン） ] 中で 37° (：、 1時 間反応させ、 5'末端のリン酸化を行った。 フエノ一ル処理を行った後、 水層 を回収し 2倍量のエタノールを加え、 一 70°Cに冷却した後、 遠心で DNAを沈 殿させた。 b) DNAフラグメントの連結
上記 a)で得られたリン酸化 DNAフラグメントと #1及び #2各 1 gを合わ せ 120 Lとした。 この混合液を 80°Cで 10分間保った後、 室温まで徐冷し ァニ一リングを行った。 TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (宝酒造） を用い てライゲ一シヨン反応を行った。 アニーリング液 30 に II液 30 Lを 加え良く混合した後、 I液 60 を加え、 37°C、 1時間反応させ、 ライゲー シヨンを行った。 フエノール処理を行った後、 水層を回収し 2倍量のエタノ ールを加え、 — 70°Cに冷却した後、 遠心で DNAを沈殿させた。 C) 5'末端のリン酸化
沈殿を TE緩衝液 （lOmM Tris-HCl (pH8.0), lmM EDTA) 10 Lに溶解し、 100 Lのリン酸化反応液 [50mM Tris-HCl (pH7.6), lOmM MgCl2, lmM スぺ ルミジン、 lOmM ジチオスレィトール、 0. lmg/mLゥシ血清アルブミン、 lmMATP、 10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ （日本ジーン） ] 中で 37°C、 1時 間反応させ、 5'末端のリン酸化を行った。 フエノール処理を行った後、 水層 を回収し 2倍量のエタノールを加え、 —70°Cに冷却した後、 遠心で DNAを沈 殿させ、 20 Lの TE緩衝液に溶解した。 実施例 2 7 ヒトァペリン一 3 6発現プラスミドの調製
PTB960-2 (EP-A- 499990：小山ら、 ジャーナル'ォブ'バイオテクノロジ一、 32巻、 273頁） を Xbal及び Avalで消化し、 1 %ァガロース電気泳動を行-い約 4.4Kbpの DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社） を用いて 抽出し、 25 Lの TE緩衝液に溶解した。 この PTB960-2の Xbal, Aval断片 と上記により調製したヒトァペリン一 3 6の構造遺伝子を TaKaRa DNA
Ligation Kit ver.2 (宝酒造） を用いてライゲーシヨン反応を行った。 すな わち pTB960- 2の Xbal, Aval断片溶液 l ii Lとヒトァペリン一 3 6の構造遺 伝子溶液 4 Lを混合し、 I液 5 Lを加え、 16DC、 30分間反応させ、 ライ ゲーシヨンを行った。 ライゲ一シヨン液 10 Lを用いて E, coli JM109コ ンピテントセル （東洋紡） を形質転換し、 10 g/mLのテトラサイクリンを 含む L B寒天培地上に播き、 37°Cで 1 日培養し、 生じたテトラサイクリン耐 性コロニーを選んだ。 この形質転換体を L B培地で一晩培養し、 QIAprep8 Miniprep Kit (キアゲン社） を用いてプラスミド pTB960-13を調製した。 こ のヒトァペリンー 3 6構造遺伝子部分の塩基配列をアプライドバイオシステ ムズ社モデル 377 DNAシークェンサ一を用いて確認した。 プラスミド
PTB960-13を大腸菌 BL21 (DE3)株（Novagen社） に形質転換を行い、 10 n g/mL のテトラサイクリンを含む L B寒天培地上に播き、 37 で 1 日培養し、 ヒト ァペリンー 3 6-C S 2 3融合蛋白質発現株 BL21 (DE3)/pTB960- 13を得た（図 6) 。· この形質転換大腸菌 BL21 (DE3)/pTB960-13は受託番号 FERMBP-6590で 1998年 12月 日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され た。 また 1998年 11月 11 日付で受託番号 IF016220として財団法人発酵研究 所 （IF0) に寄託された。 実施例 2 8 実施例 27で得られた形質転換細胞を、 5. OmgZLのテトラサイクリ ンを含む L B培地 （ 1 %ペプトン、 0. 5 %酵母エキス、 0. 5%塩化ナト リウム） 1 Lを用いて、 2リットル容フラスコ中で 37 (：、 8時間振とう培 養した。 得られた培養液を 1 9リツトルの主発酵培地 （ 1. 68 %リン酸 1 水素ナトリウム、 0. 3 %リン酸 2水素カリウム、 0. 1 %塩化アンモニゥ ム、 0. 05 %塩化ナトリウム、 0. 05 %硫酸マグネシウム、 0. 02 % 消泡剤、 0. 00025 %硫酸第一鉄、 0. 00025 %塩酸チアミン 1. 5 %ブドウ糖、 1. 5 %カザミノ酸） を仕込んだ 50 L容発酵槽へ移植して、 30°Cで通気撹拌培養を開始した。 培養液の濁度が約 500クレツト単位に なつた時点で、 イソプロピル一 — D—チォガラクトビラノシドの最終濃度 が 1 2mgZLになるように添加し、 さらに 4時間培養を行った。 培養終了 後、 培養液を遠心分離し、 約 660 gの湿菌体を取得し、 — 80°Cで凍結保 存した。 実施例 29 ヒトァペリン一 36の取得
実施例 28で得た菌体 550 gに 1 0mM EDTA+ 1 mM (p-アミシ'ノフエ二 ル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩 （ p H 6. 0 ) 溶液 1 500m lを加え、 超音波処 理 （BRANSON SON I F I ER M〇 D E L 450 ) した後、 遠心 分離 （10000 r pm、 6 Om i n) を行った。 上澄液はプールし、 沈殿 は再び同様の操作を行った。 プールした上澄液は PH6. 0に調整し、 50 mM リン酸緩衝液 （pH6. 0) で平衡化した AF- Heparin Toyopearl 650M カラム（30imnIDX 500inmL、 東ソ一）に通液し、 吸着、 洗浄した後、 0— 1 00 % B (B= 5 OmM リン酸緩衝液 + 2 M N aC し pH6. 0) の段階勾配 で溶出を行い、 530m lのヒトァペリン一 36— CS 23融合タンパク質 画分を得た。
この溶出液をペリコンミニカセット （ミリポア社） で 0. 1M酢酸を加え ながら濃縮を行い、 ヒトァペリン一 36— C S 23融合タンパク質の 0. 1 M酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度 6 Mとなるように尿素を添加した後、 1—シァノ一4—ジメチルァミノピリジニゥム塩 （DMAP— CN) 35m gを加えて、 室温で 1 5分間反応した。 反応終了後、 反応液を 1 0 %酢酸で 平衡化した S e p h a d e X G— 2 5カラム（46mmIDX 600mmL、 フアルマシ ァ）に通液し、平衡化に用いた 1 0 %酢酸を 6 m 1 /m i nの流速で展開し、 S—シァノ化されたヒトァペリン一 3 6— C S 2 3融合タンパク質画分を得 た。 この溶出液をペリコンミニカセット （ミリポア社） で濃縮 '脱塩を行い、 ヒトァペリン一 36— C S 2 3融合タンパク質の脱塩液を得た。 この脱塩液 に最終濃度 6Mとなるように尿素を添加した後、 さらに、 0. 0 6 N濃度と なるように 1 N苛性ソーダを加え、 0°Cで 1 5分間反応した。 反応終了後、 酢酸で PH6. 0に調整し、 ヒトァペリン一 36を得た。 この反応液を 3 M 尿素を含む 5 OmMリン酸緩衝液 （pH 6. 5 ) で平衡化した S P— 5 P W (21.5mmIDX150mmL、 東ソ一）に通液し、 吸着、 洗浄した後、 0— 40 %B (B = 5 OmM リン酸緩衝液 + 1 M N a C 1 + 3 M尿素、 p H 6. 5) の段階 勾配で溶出を行い、 ヒトァペリン一 3 6を画分を得た。 このヒトァペリン一 3 6画分を、 さらに 0. 1 %トリフルォロ酢酸 （TFA) で平衡化した C 4 P一 5 0 (21.5mmIDX 300mmL, 昭和電工）に通液し、 吸着、 洗浄した後、 1 5— 3 0 %B (B ： 80 %ァセトニトリル Z 0. 1 %TFA) の段階勾配で溶出を行 レ、、 ヒトァペリン一 36画分をプールした後、 凍結乾燥を行い、 ヒトァペリ ンー 3 6凍結乾燥粉末を得た。
a) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L一 8 5 0 OA Amino Acid
Analyzer) を用いて決定した。
その結果、 N末端にメチォニン残基を有するヒトァペリン— 3 6の DN A 塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した （表 1 5) 。 表 1 5 :アミノ酸組成分析
1モル当たりの ヒトァペリン一 3 6の塩基配列 アミノ酸 _ _残—基 数— から予測される値
A s X 1. 0 1
Th r 1 ) 0 0 S e r 1 ) 1. 9 2
G 1 x 3. 0 3
P r o 5. 7 6
G 1 y 5. 7 6
A 1 a 0 0
Cy s 2) N. D, 0
V a 1 1. 0 1
Me t 2 · 0 1
I 1 e 0 0
L e u 2 0 2
Ty r 0 0
P h e 9 2
H i s 0
L y s 8 2
A r g 7 3 8
T r p 0 9
酸加水分解 （6N 塩酸一 4 %チォグリコール酸、 0°C、 24， 48時 間加水分解）
1) 0時間に外挿した値
2) 未検出 b)N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロティンシーケンサ一 （アプライドバイオシ ステムズ モデル 477 A) を用いて決定した。 その結果、 得られたヒトァ ペリン— 36の N末端にはメチォニンが付加していることのほかは DNA塩 基配列から予想される N末端アミノ酸配列と一致した （表 1 6) 。 表 16 ： N末端アミノ酸配列
検出された ヒトァペリン一 36の塩基配列 残基 N o . PTH 1 ) から予測される
~7 m
(pmol) アミノ酸
1 M e t (526)
2 L e u (648) L e u
3 1
V a 1 (513) V a 1
4 1 (437) G 1 n
5 O (463) P r o "
6 Λ
g (216) A r g
7 y (232) G 1 y
8 o e r (129) S e r
9 A Λ r g (129) A r g
1 0 A Λ p S n (142) A s n
1 1 (J 丄 y (185) G 1 y
12 r r o (219) P r o
1 3 G 1 y (202) G 1 y
14 P r o (188) P r o
1 5 T r P (88) T r p
1 6 G 1 n (116) G 1 n
1 7 G 1 y (120) G 1 y
1 8 G 1 y (72) G 1 y
1 9 A r g (56) A r g
20 A r g (40) A r g
1 nmo 1を用いて分析を行った ;
1 ) フエ二一ルチオヒダントイン c) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （日立 L— 850 OA Amino Acid Analyzer) を用いて分析した （表 1 7 ) 。 表 1 7 : C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸 回収率
ヒ卜ァペリンー 36 (%)
P h e 38. 6
気相ヒドラジン分解法 （100°C、 6時間） 以上の結果から実施例 29で得られたヒトァペリン一 36は、 その N末-端 にメチォニン残基を有する分子種 （Me t _ヒトァペリン一 36) であるこ とがわかった。 実施例 30 (生物活性測定）
実施例 29で取得した Me t—ヒトァペリン一 36を用いて、 特願平 10— 271645号の実施例 6に記載の方法 （サイトセンサー） で活性を測定し、 ヒト ァペリン— 36の合成品と同等の活性を有することを確認した。 実施例 3 UN末端のメテオニン残基の除去）
実施例 29で取得した Me t—ヒトァペリン— 36 4mgを 3M尿素溶 液 0. 8m lに溶解した後、 8 OmM硫酸銅 0. 05mし グリオキシル酸 0. 046 g、 ピリジン 0. 1m lの混合液を加え、 25°〇で1時間反応し た。反応終了後、反応液を 2. 5M尿素 + 1 OmMリン酸緩衝液（pH5. 5) で平衡化したセフアデックス （S e p h a d e x) G— 2 5カラム （lOmmlD X 250mmL) に通液し、 平衡化に用いた溶液を 0. 5 m 1 /分の流速で展開し、 メチォニン残基のジケトン体を有するヒトァペリンー 36画分をプールした。 続いてこの画分に等量の 2 Mギ酸ナトリウム、 4M酢酸、 3 M尿素溶液を 加えた後、 3， 4ージァミノ安息香酸を 4 OmM濃度になるように添加し、 30°Cで 3日間反応した。 反応終了後、 反応液を 5 OmMリン酸緩衝液 （p H 6. 0) で平衡化したセフアデックス G— 25カラム （25mmIDX 600mmL) に通液し、 平衡化に用いた緩衝液を 4m 1 Z分の流速で展開し、 N末端にメ チォニン残基を有していないヒトァペリンー 36画分をプールした。 プール したヒトァペリン一 36画分を pH6. 0に調整し、 50mMリン酸緩衝液 + 0. 1 M N a C 1 + 2. 5!^尿素 （ 1"15. 0 ) で平衡化した C M— 5 P W (7.5mmIDX75mmL, 東ソ一 （株） ） に吸着した後、 0— 1 00%B (B = 5 OmMほぅ酸緩衝液+ 0. 1 M N a C 1 + 2. 5M尿素、 pH9. 0) の 段階勾配で 40分間、 0. 8m 1 Z分の流速で溶出を行い、 ヒトァペリン一 36画分をプールした。 さらに、 ヒトァペリン— 36を 0. 1 %TFAで平 衡化した C4 P— 50 (10mmIDX 250mmL, 昭和電工 （株） ） に吸着した後、 1 5 - 30 %B (B=80%ァセトニトリル Z0. 1 %TF A) の段階勾配 で 40分間、 2 ml/分の流速で溶出した。 ヒトァペリン— 36のフラクシ ヨンをプールした後、 凍結乾燥を行い、 ヒトァペリン— 36を取得した。 a) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L— 8500A Amino Acid Analyzer) を用いて決定した。
その結果、 h A 1 0 Lの DNA塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致 した （表 1 8) 。 表 1 8 ：アミノ酸組成分析
モル当たりの ヒトァペリン— 36の塩基配列 アミノ酸 残 基 数 から予測される値
A s X 0
Th r 1 ) 0 0
S e r 1 ) 1. 9 2
G 1 x 2. 9 3
P r o 6. 3 6
G 1 y 5. 9 6
A 1 a 0 0
Cy s 2) N. D, 0
V a 1 1. 0
Me t 1. 0 I 1 e 0 0
L e u 2 0 2
Ty r 0 0
P h e 9 2
H i s 0
L y s 1 9 2
A r g 7 6 8
T r p 0 9
酸加水分解 （6N 塩酸一 4 %チォグリコール酸、 1 0°C、 24， 48時 間加水分解）
1) 0時間に外挿した値
2) 未検出 b)N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー
ステムズ モデル 477 A) を用いて決定した。 その結果、 得られたヒトァ ペリン— 36の DNA塩基配列から予想される N末端アミノ酸配列と一致し た （表 1 9 ) 。 表 1 9： N末端アミノ酸配列
検出された ヒトァペリン一 36の塩基配列 残基 No. PTH 1 ) -アミノ酸 から予測される
(pmol) アミノ酸
1 L e u (475) L e u
2 V a 1 (845) V a 1
3 G 1 n (365) G 1 n
4 P r o (563) P r o
5 A r g (425) A r g
6 G 1 y (424) G 1 y 7 S e r (139) S e r
8 A r (423) A r e
9 A s n (245) A s n
1 0 G 1 V (290) G 1 V
1 1 p r o (197) P r o
1 2 G 1 v y (234) 1 v
1 3 p r o (197) P r o "
1 4 T r (101) y
1 5 G 1 ( V 76) ν_τ
Figure imgf000059_0001
1 I G 1 y (13U) G 1 y
1 8 A r g ( 79) A r g
1 9 A r g (116) A r g
2 0 L y s ( 43) L y s
nmo 1を用いて分析を行った (
) フェニールチオヒダン卜イン c) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （日立 L一 8 5 0 OA Amino Acid Analyzer) を用いて分析した （表 2 0 ) 表 2 0 C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸 回収率
ヒトァペリンー 3 6 (%)
P h e 8 6. 6
気相ヒドラジン分解法 （ 1 0 0° (：、 6時間） 実施例 32 (生物活性測定）
実施例 3 1で取得したヒトァペリン— 3 6を用いて、 特願平 10— 271646 号の実施例 6に記載の方法 （サイトセンサ一） で活性を測定し、 ヒトァペリ ン— 3 6の合成品と同等の活性を有することを確認した。 産業上の利用可能性
本発明により、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するぺ プチド、 蛋白質またはその塩から、 該メチォニン残基のみを選択特異的かつ 効率的に取り除き、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有じて いないペプチド， 蛋白質またはその塩を効率よく生産することができる。 ま た、 本発明の方法によれば、 ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、 しか もマイルドな条件下で N末端のメチォニン残基を化学的に除去することがで きるので、 遺伝子工学的手法により製造されたメチォニン残基を有するぺプ チド， 蛋白質またはその塩を原料にして、 天然型のアミノ酸配列を有するぺ プチドまたは蛋白質を工業的に有利に製造することができる。

Claims

請求の範囲
1 . N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有するぺ プチドまたはその塩を、 酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリ ゥムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に 3， 4ージァミノ安息香酸 またはその塩と反応させることを特徴とする該メチォニン残基のジケトン体 の除去方法。 ―
2 . N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有するぺ プチドまたはその塩が、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有 するペプチドまたはその塩を α —ジケトン類と反応させることにより得られ るべプチドまたはその塩である請求項 1記載の方法。
3 . Ν末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するペプチドが遺伝 子工学的に製造されたペプチドである請求項 2記載の方法。
4 . ペプチドが（i)成長ホルモン， （i i)ベータセルリン， （i i i)インターロイ キン— 2， （iv)ニュ一トロフィンー 3または（V)ァペリンである請求項 1記載 の方法。
5 . ぺプチドが成長ホルモンである請求項 1記載の方法。
6 . 酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸およ び酢酸ナトリウムが、 ^1約2なぃし9で約0 . 1ないし 8 mo l/Lの緩衝液と して用いられることを特徴とする請求項 1記載の方法。
7 . N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有するぺ プチドまたはその塩を、 酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に 3 , 4—ジァ ミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチォニン残基 のジケトン体の除去方法。
8 . N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有するぺ プチドまたはその塩を、 酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリ ゥムまたはぎ酸および酢酸ナトリゥムの存在下に 3 , 4—ジァミノ安息香酸 またはその塩と反応させることを特徴とする N末端に酸化されていてもよい メチォニン残基を有していないべプチドまたはその塩の製造法。
9 . N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有するぺ プチドまたはその塩が、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有 するペプチドまたはその塩を α—ジケトン類と反応させることにより得られ るぺプチドまたはその塩である請求項 8記載の製造法。
1 0 . 酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸お よび酢酸ナトリウムが、 11約2なぃし9で約0 . 1ないし 8 mo l/Lの緩衝液 として用いられることを特徴とする請求項 8記載の製造法。 -
1 1 . Ν末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有する ペプチドまたはその塩を、 酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に 3， 4ージ ァミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする Ν末端にメチォ ニン残基を有していないペプチドまたはその塩の製造法。
1 2 . 遺伝子工学的に製造され、 Ν末端に酸化されていてもよいメチォニン 残基を有するヒト成長ホルモンまたはその塩をダリオキシル酸またはその塩 と硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、 酢酸およびぎ酸ナトリウ ム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に 3， 4—ジァミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする Ν末 端にメチォニン残基を有していないヒト成長ホルモンまたはその塩の製造法。
1 3 . Ν末端に酸化されていてもよいメテオニン残基を有するペプチドまた はその塩の該メチォニン残基を除去するための、 （ i )酢酸およびぎ酸ナトリ ゥム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、 と（i i) 3， 4ージァミノ安息香酸またはその塩の使用。
1 4 . N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有する ペプチドまたはその塩の該メチォニン残基のジケトン体を除去するための、
( i )酢酸およびぎ酸ナトリゥム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリゥムまたはぎ酸およ び酢酸ナトリウム、 と（i i) 3， 4ージァミノ安息香酸またはその塩の使用。
1 5 . N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するペプチドまた はその塩から、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有しないぺ プチドまたはその塩を製造するための、 （ i )酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ 酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、 と（i i) 3， 4一 ジァミノ安息香酸またはその塩の使用。
1 6 . N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有する ぺプチドまたはその塩から、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基 のジケトン体を有していないペプチドまたはその塩を製造するための、 （ i ) 酢酸およびぎ酸ナトリウム、 ぎ酸およびぎ酸ナトリゥムまたはぎ酸および酢 酸ナトリウム、 と（i i ) 3， 4—ジァミノ安息香酸またはその塩の使用。
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