JP2002325585A - Ｒｆｒｐの製造法 - Google Patents

Ｒｆｒｐの製造法

Info

Publication number
JP2002325585A
JP2002325585A JP2001372444A JP2001372444A JP2002325585A JP 2002325585 A JP2002325585 A JP 2002325585A JP 2001372444 A JP2001372444 A JP 2001372444A JP 2001372444 A JP2001372444 A JP 2001372444A JP 2002325585 A JP2002325585 A JP 2002325585A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
phe
amino acid
acid sequence
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2001372444A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2002325585A5 (ja
Inventor
Masato Suenaga
正人 末永
Takahisa Yamada
隆央 山田
Tadashi Nishimura
紀 西村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Priority to JP2001372444A priority Critical patent/JP2002325585A/ja
Publication of JP2002325585A publication Critical patent/JP2002325585A/ja
Publication of JP2002325585A5 publication Critical patent/JP2002325585A5/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＲＦアミドペプチドを工業的かつ大量に製造
するのに有利な製造法を提供する。 【解決手段】 Ｎ末端にシステインを有するタンパク質
またはペプチドのＮ末端にＲＦアミドペプチドを連結し
た融合タンパク質またはペプチドをシステイン残基のア
ミノ酸側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴と
するＲＦアミドペプチドの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、融合タンパク質ま
たはポリペプチドを製造し、次いで該融合タンパク質ま
たはポリペプチドをペプチド結合の切断反応に付すこと
により、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：
２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配列番
号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドの部分ペプチドまたはその塩を製造する方法などに関
する。さらに、所望に応じて、Ｎ末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基を有する配列番号：１９、配列番
号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番
号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩か
ら効率よくＮ末端の酸化されていてもよいメチオニン残
基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を除去する方
法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いて、ペプチドを
製造するに際しては、ペプチドが細胞内で分解を受けや
すいために、融合タンパク質の形で発現させることがし
ばしば行われている。融合タンパク質からの目的ペプチ
ドの切り出しには、ブロムシアンを用い化学的に切断す
る方法（イタクラら、Science, 198, 1056(1977)）、フ
ァフターＸａを用い酵素的に切断する方法（ナガイら、
Methods in Enzymology,153, 46(1987)）が知られてい
る。さらに、タンパク質中のペプチド結合を切断する方
法として、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸による
アシルシステイン結合の切断が知られている（「生化学
実験講座」１，タンパク質の化学ＩＩ，日本生化学会
編，東京化学同人発行，第２４７〜２５０頁，１９７６
年）。しかしながら、タンパク質から配列番号：１９、
配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配
列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドの切り出し
については、開示されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来知られている技術
において、ブロムシアンを用いる場合には、メチオニン
を含有するペプチドの製造には適用することはできない
し、切り出し時の収率等に問題が多い。このように、融
合タンパク質またはポリペプチドから配列番号：１９、
配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配
列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドを効率良く
切り出す方法が望まれている。さらに、同じ配列番号：
１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２
５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドであ
っても、Ｎ末端にメチオニンの付加した分子種とそうで
ない分子種とはポリペプチドの高次構造、生物活性、安
定性が相互に異なる可能性があり、さらにメチオニンの
Ｎ末端への付加が抗原性の増加をもたらす可能性もあり
うるものと考えられる。従って、産業利用上の観点か
ら、この開始コドンに対応するＮ末端メチオニン除去法
を確立することは意義あることと考えられる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、配列番
号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番
号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドまたはその塩を効率良く製造する方法について鋭意検
討を加えたところ、Ｎ末端にシステインを有するタンパ
ク質またはポリペプチドのＮ末端に配列番号：１９、配
列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列
番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配
列を含有するポリペプチドの部分ペプチドを連結した融
合タンパク質またはポリペプチドを製造し、次いでこれ
をペプチド結合を切断する反応に付すことにより、配列
番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番
号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドまたはその塩を効率良く製造できることを見い出し、
これに基づいてさらに研究した結果、本発明を完成し
た。さらに、上記の製造方法に従って製造したポリペプ
チド中、特に配列番号：３、配列番号：５、配列番号：
９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドなどについては、Ｎ末端にメチオニン残
基が余分に付加したものが製造される可能性があるた
め、本発明者らは、遺伝子工学的に製造される配列番
号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番
号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドにおけるＮ末端のメチオニン残基のみを切断すること
による、天然型のアミノ酸配列を有する配列番号：１
９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２
５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドの製
造法を鋭意研究したところ、下記のスキーム１に表され
るとおり式（Ｉ）で表されるＮ末端に酸化されていても
よいメチオニン残基を有する配列番号：１９、配列番
号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番
号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドに、例えば、α
−ジケトン類であるグリオキシル酸、遷移金属イオンを
供与しうる硫酸銅、塩基（例えばアミン類）であるピリ
ジンを反応させて、アミノ基転移反応を行うことにより
得られる該メチオニン残基のジケトン体を有する配列番
号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番
号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドに塩基（例えばジアミン類）である３，４−ジアミノ
安息香酸を反応させて加水分解反応を行うことにより、
該メチオニン残基のジケトン体を有する配列番号：１
９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２
５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドから
メチオニン残基のジケトン体を予想外にも効率よく除去
できることを見出した。すなわち、本発明者らはメチオ
ニン残基を有する配列番号：１９、配列番号：２１、配
列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドから、Ｎ末端の酸化されていて
もよいメチオニン残基を除去し、その活性を低下させる
ことなく、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基を有していない配列番号：１９、配列番号：２１、配
列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドを予想外にも高収率で得る方法
を見い出し、さらに研究を進め、本発明を完成させるに
至った。 （スキーム１）
【化１】 ［式（I）中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘは配列
番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番
号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドのペプチド鎖を示す。］ 本願明細書においては、上記スキーム１中、 （１）一般式（Ｉ）で表される化合物を「Ｎ末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基を有する配列番号：１
９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２
５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドまた
はその塩」または「メチオニン残基を有する配列番号：
１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２
５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドまた
はその塩」； （２）一般式（Ｉ）において
【化２】 [式中、ｍは前記と同意義]で表される部分構造を「酸化
されていてもよいメチオニン残基」、「メチオニン残
基」または「メチオニン」； （３）一般式（ＩＩ）で表される化合物を「Ｎ末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有す
る配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、
配列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９
で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分
ペプチドまたはその塩」または「メチオニン残基のジケ
トン体を有する配列番号：１９、配列番号：２１、配列
番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配
列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドまたはその塩」； （４）一般式（ＩＩ）において
【化３】 [式中、ｍは前記と同意義]で表される部分構造を「酸化
されていてもよいメチオニン残基のジケトン体」または
「メチオニン残基のジケトン体」；および、 （５）一般式（ＩＩＩ）に代表される化合物を「Ｎ末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していない
配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配
列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で
表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそ
の塩」または「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基のジケトン体を有していない配列番号：１９、配
列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列
番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配
列を含有するポリペプチドまたはその塩」と、それぞれ
称することがある。
【０００５】すなわち本発明は、（１）Ｎ末端にシステ
インを有するタンパク質またはポリペプチドのＮ末端
に、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有
していてもよい配列番号：１９、配列番号：２１、配列
番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配
列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドを連結した融合タンパク質または
ポリペプチドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド
結合の切断反応に付すことを特徴とする配列番号：１
９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２
５、配列番号：２７または配列番号：２９を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（２）Ｎ末端にシステインを有するタンパク質またはポ
リペプチドのＮ末端に、Ｎ末端にメチオニン残基を有し
ていてもよい配列番号：１９、配列番号：２１、配列番
号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配列
番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドの部分ペプチドを連結した融合タンパク質またはポ
リペプチドをコードするＤＮＡを有するベクターを保持
する形質転換体を培養して融合タンパク質またはポリペ
プチドを発現させ、発現された融合タンパク質またはポ
リペプチドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド結
合の切断反応に付すことを特徴とするＮ末端にメチオニ
ン残基を有していてもよい配列番号：１９、配列番号：
２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２
７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有
するポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造
法、（３）切断反応がＳ−シアノ化反応、次いでアンモ
ノリシスまたは加水分解反応に付す反応である上記
（１）または（２）記載の製造法、（４）配列番号：１
９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２
５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドが、 １）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ３）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅ
ｒ）〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）
〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜
１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番
目（Ｐｈｅ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目
（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、 ４）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖ
ａｌ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）
〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第１１８番目（Ｐｈｅ）
〜第１２５番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または ５）配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記（１）または（２）記載の製
造法、（５）配列番号：１９、配列番号：２１、配列番
号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配列
番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドの部分ペプチドが、配列番号：１または配列番号：
９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドであ
る上記（１）または（２）記載の製造法、（６）配列番
号：１または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドが、配列番号：１、配列番号：３、
配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列
番号：１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドである上記（５）記載の製造法、（７）Ｎ末端にシス
テインを有するタンパク質またはポリペプチドのＮ末端
に、Ｎ末端にメチオニン残基を有していてもよい配列番
号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番
号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドを連結した融合タンパク質もしくはポリペプチドまた
はその塩、（８）配列番号：１９、配列番号：２１、配
列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、 １）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ３）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅ
ｒ）〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）
〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜
１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番
目（Ｐｈｅ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目
（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、 ４）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖ
ａｌ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）
〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第１１８番目（Ｐｈｅ）
〜第１２５番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または ５）配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記（７）記載のポリペプチドま
たはその塩、（９）配列番号：１９、配列番号：２１、
配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７また
は配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドが、配列番号：１または配列
番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドである上記（７）記載のポリペプチドまたはその塩、
（１０）配列番号：１または配列番号：９で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号：１、
配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番
号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドである上記（９）記載のポリペプチ
ドまたはその塩、（１１）上記（７）記載の融合タンパ
ク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡを有するベ
クター、（１２）上記（１１）記載のベクターで形質転
換された形質転換体、（１３）Ｎ末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基を有する配列番号：１９、配列番
号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番
号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩と
α−ジケトン類を反応させた後、加水分解することを特
徴とする該メチオニン残基の除去方法、（１４）Ｎ末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有する配列番
号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番
号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドが遺伝子工学的に製造された配列番号：１９、配列番
号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番
号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドであって、該酸
化されていてもよいメチオニン残基のＣ末端側に隣接す
るアミノ酸残基がイソロイシン残基、バリン残基、シス
テイン残基、スレオニン残基、アスパラギン酸残基、リ
ジン残基、ロイシン残基、アルギニン残基、アスパラギ
ン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、チロ
シン残基、トリプトファン残基、グルタミン酸残基、グ
ルタミン残基またはヒスチジン残基である上記（１３）
記載の方法、（１５）配列番号：１９、配列番号：２
１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７
または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドの部分ペプチドが、 １）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ３）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅ
ｒ）〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）
〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜
１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番
目（Ｐｈｅ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目
（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、 ４）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖ
ａｌ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）
〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第１１８番目（Ｐｈｅ）
〜第１２５番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または ５）配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記（１３）または（１４）記載
の方法、（１６）配列番号：１９、配列番号：２１、配
列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、配列番号：１または配列番
号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である上記（１３）または（１４）記載の製造法、（１
７）配列番号：１または配列番号：９で表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号：１、配列
番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９
または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである上記（１６）記載の方法、（１８）
遷移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させる
ことを特徴とする上記（１３）記載の方法、（１９）塩
基の存在下にα−ジケトン類を反応させることを特徴と
する上記（１３）記載の方法、（２０）遷移金属イオン
および塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させること
を特徴とする上記（１３）記載の方法、（２１）α−ジ
ケトン類がグリオキシル酸またはその塩である上記（１
３）記載の方法、（２２）遷移金属イオンが銅イオンで
ある上記（１８）記載の方法、（２３）塩基がピリジン
である上記（１９）記載の方法。（２４）塩基を用いて
加水分解することを特徴とする上記（１３）記載の方
法、（２５）塩基がアミン類である上記（２４）記載の
方法、（２６）塩基がジアミン類またはチオもしくはセ
レノセミカルバジド類である上記（２４）記載の方法、
（２７）ジアミン類がｏ−フェニレンジアミンまたは
３，４−ジアミノ安息香酸である上記（２６）記載の方
法、（２８）遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端にメチオ
ニンが付加した配列番号：１９、配列番号：２１、配列
番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配
列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドまたはその塩とグリオキシル酸ま
たはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反応さ
せた後、ｏ−フェニレンジアミンまたは３，４−ジアミ
ノ安息香酸と反応させることを特徴とする配列番号：１
もしくは配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドまたはその塩の製造法、（２９）配列番
号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番
号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドが、 １）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ３）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅ
ｒ）〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）
〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜
１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番
目（Ｐｈｅ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目
（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、 ４）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖ
ａｌ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）
〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第１１８番目（Ｐｈｅ）
〜第１２５番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または ５）配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項２８記載の製造法、（３
０）配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２
３、配列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：
２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの
部分ペプチドが、配列番号：１または配列番号：９で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記
（２８）記載の製造法、（３１）配列番号：１または配
列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、
配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記
（３０）記載の製造法、（３２）式 CH3-S(O)m-(CH2)2
-CO-CO-X〔式中、ｍは０ないし２の整数を、Ｘは配列番
号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番
号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表さ
れるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドのペプチド鎖を示す。〕で表
される化合物またはその塩、（３３）配列番号：１９、
配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配
列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドが、 １）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ３）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅ
ｒ）〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）
〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜
１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番
目（Ｐｈｅ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目
（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、 ４）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖ
ａｌ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）
〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第１１８番目（Ｐｈｅ）
〜第１２５番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または ５）配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項３２記載の化合物またはそ
の塩、（３４）配列番号：１９、配列番号：２１、配列
番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配
列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドが、配列番号：１または配列番
号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である上記（３２）記載の化合物またはその塩、（３
５）配列番号：１または配列番号：９で表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号：１、配列
番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９
または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである上記（３４）記載の化合物またはそ
の塩、（３６）上記（３２）記載の化合物を加水分解す
ることを特徴とする配列番号：１９、配列番号：２１、
配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７また
は配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造法、（３
７）Ｎ末端にシステインを有するタンパク質またはポリ
ペプチドのＮ末端に、Ｎ末端にメチオニン残基を有する
で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを連結
した融合タンパク質またはポリペプチドをシステイン残
基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付し、Ｎ末
端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するで表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその
塩を得、さらに、該Ｎ末端に酸化されていてもよいメチ
オニン残基を有するで表されるアミノ酸配列を含有する
ポリペプチドまたはその塩とα−ジケトン類を反応させ
た後、加水分解することを特徴とするで表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の製造法、
（３８）配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：
２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配列番
号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドの部分ペプチドが、 １）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 ３）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅ
ｒ）〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）
〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜
１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番
目（Ｐｈｅ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目
（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、 ４）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖ
ａｌ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）
〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第１１８番目（Ｐｈｅ）
〜第１２５番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または ５）配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番
目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記（３７）記載の製造法、（３
９）配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２
３、配列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：
２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの
部分ペプチドが、配列番号：１または配列番号：９で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記
（３７）記載の製造法、（４０）配列番号：１または配
列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、
配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項
３９記載の製造法等を提供する。
【０００６】本発明の配列番号：１９、配列番号：２
１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７
または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチド（以下、本発明の前駆体ポリペプチドと
称する場合がある）は、それぞれＷＯ００／２９４４１
号公報およびＷＯ０１／６６１３４号公報に記載されて
いる配列番号：１、配列番号：８、配列番号：１４、配
列番号：３３、配列番号：５０または配列番号：１８で
表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである。
本発明の前駆体ポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に
従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カ
ルボキシル末端）である。配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列を含有する前駆体ポリペプチドをはじめとす
る、本発明の前駆体ポリペプチドは、Ｃ末端が通常カル
ボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−
ＣＯＯ-)であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）ま
たはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエ
ステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、
ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどの
Ｃ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘ
キシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ
1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口
用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基
などが用いられる。本発明の前駆体ポリペプチドがＣ末
端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を
有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエス
テル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれ
る。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末
端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の前駆
体ポリペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチ
オニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル
基、アセチル基などのＣ1- 6アルカノイルなどのＣ1-6ア
シル基など）で保護されているもの、生体内で切断され
て生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸
化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例え
ば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インド
ール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、
ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基な
どのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、ある
いは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タ
ンパク質なども含まれる。以下、これらのポリペプチド
を含めて本発明の前駆体ポリペプチドと略称することも
ある。
【０００７】本発明の前駆体ポリペプチドの部分ペプチ
ド（以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある）
としては、前記した本発明の前駆体ポリペプチドの部分
ペプチドであって、例えば、本発明の前駆体ポリペプチ
ドに対するレセプタータンパク質（具体的には、ＷＯ０
０／２９４４１号公報およびＷＯ０１／６６１３４号公
報に記載されている配列番号：３７で表されるアミノ酸
配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するタンパク質またはその塩）に結合し、プロラクチン
分泌調節活性を有するものであればいかなるものでもよ
い。また、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列
中の１〜５個（好ましくは、１〜３個のアミノ酸が欠失
し、または、そのアミノ酸配列に１〜５個（好ましく
は、１〜３個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミ
ノ酸配列に１〜５個（好ましくは、１〜３個のアミノ酸
が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１〜５個
（好ましくは、１〜３個のアミノ酸が他のアミノ酸で置
換されたアミノ酸配列を含有していてもよく、それらを
組み合わせたアミノ酸配列を含有していてもよい。ま
た、本発明のポリペプチドはＣ末端が通常カルボキシル
基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯ
Ｏ-）であるが、前記した本発明の前駆体ポリペプチド
のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエス
テル（−ＣＯＯＲ）（Ｒは上記と同意義を示す）であっ
てもよい。なかでも、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）
であるものが好ましい。本発明のポリペプチドがＣ末端
以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有
している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステ
ル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれ
る。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末
端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のポリ
ペプチドには、前記した本発明の前駆体ポリペプチドと
同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）
のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生
体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミ
ン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が
適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結
合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含
まれる。以下、これらのポリペプチドを含めて本発明の
ポリペプチドと略称することもある。
【０００８】本発明の前駆体ポリペプチドの部分ペプチ
ドとしては、例えば、ＲＦａｍｉｄｅ、ＲＳａｍｉｄｅ
またはＲＬａｍｉｄｅ構造を有するペプチド、より好ま
しくは、ＲＦａｍｉｄｅまたはＲＳａｍｉｄｅ構造を有
するペプチド、特に好ましくは、ＲＦａｍｉｄｅを有す
るペプチドが挙げられる。ＲＦａｍｉｄｅ構造とは、ぺ
プチドのＣ末端がＡｒｇｉｎｉｎｅ（アルギニン）−Ｐ
ｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（フェニルアラニン）−ＮＨ
2構造になっていることをいい、ＲＳａｍｉｄｅ構造と
は、ぺプチドのＣ末端がＡｒｇｉｎｉｎｅ（アルギニ
ン）−Ｓｅｒｉｎｅ（セリン）−ＮＨ2構造になってい
ることをいい、ＲＬａｍｉｄｅ構造とは、ぺプチドのＣ
末端がＡｒｇｉｎｉｎｅ（アルギニン）−Ｌｅｕｃｉｎ
ｅ（ロイシン）−ＮＨ2構造になっていることを意味す
る。本発明のポリペプチドの中でも、例えば、（１）配
列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓ
ｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目
（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓ
ｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｓｅ
ｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目（Ｐｈ
ｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈ
ｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第
１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１番
目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を
含有するペプチド、（２）配列番号：２１で表されるア
ミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈ
ｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４
番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目
（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓ
ｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓ
ｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａ
ｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第
９２番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目
（Ｓｅｒ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐ
ｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、（３）配列
番号：２３で表されるアミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅ
ｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜
第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜第１
１２番目（Ｌｅｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２
番目（Ｌｅｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目
（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
ｅ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）
のアミノ酸配列を含有するペプチド、（４）配列番号：
２５で表されるアミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜
第９４番目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖａｌ）〜第９４
番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）〜第９４番目
（Ｐｈｅ）または第１１８番目（Ｐｈｅ）〜第１２５番
目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（５）配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８
番目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番
目（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を
含有するペプチドなどが好ましい例としてあげられ、特
に、（１）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第
５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番
目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１
１２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２
番目（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番
目（Ｐｈｅ）または第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番
目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（２）配列番号：２１表されるアミノ酸配列の第５６番
目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍ
ｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）
〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番
目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目
（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）または第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目
（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、（３）
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の第５８番目
（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅ
ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）
〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第
１１２番目（Ｌｅｕ）または第１２４番目（Ｖａｌ）〜
１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチ
ド、（４）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列の第
５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８３番
目（Ｖａｌ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｐ
ｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第１１８番目（Ｐ
ｈｅ）〜第１２５番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有
するペプチド、（５）配列番号：２７で表されるアミノ
酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）
または第８４番目（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）の
アミノ酸配列を含有するペプチドなどが好ましい例とし
てあげられる。
【０００９】なかでも、（１）配列番号：１９で表され
るアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目
（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
ｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０
１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目
（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）、第１１５番目
（Ａｓｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）または第１２４番
目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を
含有するペプチド、（２）配列番号：２１で表されるア
ミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈ
ｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４
番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目
（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓ
ｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓ
ｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）または第１２４番目（Ｖ
ａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有す
るペプチド、（３）配列番号：２３で表されるアミノ酸
配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０
１番目（Ｓｅｒ）〜第１１２番目（Ｌｅｕ）、第９５番
目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｌｅｕ）または第１２４
番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、（４）配列番号：２５で表される
アミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐ
ｈｅ）、第８３番目（Ｖａｌ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）
または第１１８番目（Ｐｈｅ）〜第１２５番目（Ｐｈ
ｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、（５）配列番
号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅ
ｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有する
ペプチドなどが好ましく、とりわけ、（１）配列番号：
１９で表されるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜
第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２
番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目
（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈ
ｅ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目（Ｐｈ
ｅ）または第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈ
ｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、（２）配列番
号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅ
ｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜
第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２
番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目
（Ｐｈｅ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
（Ｐｈｅ）または第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目
（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、（３）
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の第５８番目
（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅ
ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）または第１２４番目（Ｖａ
ｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有する
ペプチドが好ましい。
【００１０】なかでも、（１）配列番号：１９で表され
るアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目
（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
ｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）ま
たは第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のア
ミノ酸配列を含有するペプチド、（２）配列番号：２１
で表されるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目
（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
ｅ）または第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈ
ｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、（３）配列番
号：２３で表されるアミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅ
ｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）または第８１番目（Ｍｅ
ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有する
ペプチドが好ましく、とりわけ、（１）配列番号：１９
で表されるアミノ酸配列の第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９
２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第８１
番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
を含有するペプチド、（３）配列番号：２３で表される
アミノ酸配列の第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐ
ｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましく、
特に、（１）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の
第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ
酸配列を含有するペプチド、（２）配列番号：２１で表
されるアミノ酸配列の第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番
目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが
好ましい。
【００１１】また、本発明のポリペプチドの好ましい例
として、（ａ）配列番号：１９の第８１番目（Ｍｅｔ）
ないし第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を有するペ
プチド、（ｂ）配列番号：１９の第１０１番目（Ｓｅ
ｒ）ないし第１１２番目（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を有
するペプチド、（ｃ）配列番号：１９の第１２４番目
（Ｖａｌ）ないし第１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配
列を有するペプチド、（ｄ）配列番号：１９の第５６番
目（Ｓｅｒ）ないし第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配
列を有するペプチド、（ｅ）配列番号：２３の第８１番
目（Ｍｅｔ）ないし第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配
列を有するペプチド、（ｆ）配列番号：２３の第１０１
番目（Ｓｅｒ）ないし第１１２番目（Ｌｅｕ）のアミノ
酸配列を有するペプチド、（ｇ）配列番号：２３の第５
８番目（Ｓｅｒ）ないし第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ
酸配列を有するペプチド、（ｈ）配列番号：２５の第８
３番目（Ｖａｌ）ないし第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ
酸配列を有するペプチド、（ｉ）配列番号：２５の第１
１８番目（Ｐｈｅ）ないし第１２５番目（Ｐｈｅ）のア
ミノ酸配列を有するペプチド、（ｊ）配列番号：２５の
第５８番目（Ｓｅｒ）ないし第９４番目（Ｐｈｅ）のア
ミノ酸配列を有するペプチド、（ｋ）配列番号：２７の
第５８番目（Ｓｅｒ）ないし第９４番目（Ｐｈｅ）のア
ミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
【００１２】特にこれらのペプチドのアミド体（好まし
くは、これらペプチドのＣ末端のカルボキシル基（−Ｃ
ＯＯＨ）がアミド化された（−ＣＯＮＨ2）ペプチド）
が好ましい。具体的には配列番号：１９で表されるアミ
ノ酸配列の第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
ｅ）のアミノ酸配列で表されるペプチドのＣ末端がアミ
ド化された（−ＣＯＮＨ2）ペプチド、配列番号：１９
で表されるアミノ酸配列の第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１
１２番目（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列で表されるペプチド
のＣ末端がアミド化された（−ＣＯＮＨ2）ペプチドお
よび配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第１２４
番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
で表されるペプチドのＣ末端がアミド化された（−ＣＯ
ＮＨ2）ペプチドなどがあげられる。なかでも、配列番
号：１９で表されるアミノ酸配列の第８１番目（Ｍｅ
ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列で表される
ペプチドのＣ末端がアミド化された（−ＣＯＮＨ2）ペ
プチドまたは、配列番号：１９で表されるアミノ酸配列
の第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のア
ミノ酸配列で表されるペプチドのＣ末端がアミド化され
た（−ＣＯＮＨ2）ペプチドなどが好ましく、配列番
号：１９で表されるアミノ酸配列の第８１番目（Ｍｅ
ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列で表される
ペプチドのＣ末端がアミド化された（−ＣＯＮＨ2）ペ
プチドが特に好ましい。
【００１３】また、本発明のポリペプチドとしては、例
えば、配列番号：１もしくは配列番号：９で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドなども好ましく用い
られ、具体的には、配列番号：１もしくは配列番号：９
で表されるアミノ酸配列を含有し、例えば、Hinuma et
al., Nature Cell Biology, Vol 2, p703-708 (2000)に
記載のRF amide-related peptidesやＷＯ００／２９４
４１号に記載のポリペプチドなどがあげられ、Hinuma e
t al., Nature Cell Biology, Vol 2, p703-708 (2000)
やＷＯ００／２９４４１号に記載のレセプターOT7T022
に対し、リガンド活性を有するペプチドであれば、如何
なるものであってもよい。このようなポリペプチドとし
ては、例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：
５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあ
げられる。
【００１４】本発明の前駆体ポリペプチドをコードする
ＤＮＡとしては、具体的には、（１）配列番号：１９で
表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来前駆体ポリペ
プチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２０で
表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（２）配列
番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来
前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列
番号：２２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなど
が、（３）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含
有するウシ由来前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：２４で表される塩基配列を含有す
るＤＮＡなどが、（４）配列番号：２５で表されるアミ
ノ酸配列を含有するマウス由来前駆体ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表される塩
基配列を含有するＤＮＡなどが、（５）配列番号：２７
で表されるアミノ酸配列を含有するラット由来前駆体ポ
リペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２
８で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（６）
配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するラッ
ト由来前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡとして
は、配列番号：３０で表される塩基配列を含有するＤＮ
Ａなどが用いられる。
【００１５】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、前記した配列番号：２０、配列番
号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番
号：２８または配列番号：３０で表される塩基配列を含
有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用い
られる。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとし
ては、具体的には、（１）配列番号：１９で表されるア
ミノ酸配列の第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
ｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、配列番号：２０で表される塩基配列の第
２４１番目ないし第２７６番目の塩基配列を含有するＤ
ＮＡ、（２）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の
第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとして
は、配列番号：２０で表される塩基配列の第３０１番目
ないし第３３６番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、
（３）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第１２
４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：２０で表される塩基配列の第３７０番目ないし
第３９３番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（４）配列
番号：１９で表されるアミノ酸配列の第１番目（Ｍｅ
ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有する
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２０
で表される塩基配列の第１番目ないし第２７６番目の塩
基配列を含有するＤＮＡ、（５）配列番号：１９で表さ
れるアミノ酸配列の第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目
（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を含有するペプチドをコード
するＤＮＡとしては、配列番号：２０で表される塩基配
列の第１番目ないし第３３６番目の塩基配列を含有する
ＤＮＡ、（６）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列
の第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ
酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとして
は、配列番号：２０で表される塩基配列の第１番目ない
し第３９３番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（７）配
列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓ
ｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２
０で表される塩基配列の第１６６番目〜第２７６番目の
塩基配列を含有するＤＮＡ、（８）配列番号：１９で表
されるアミノ酸配列の第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番
目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチドをコー
ドするＤＮＡとしては、配列番号：２０で表される塩基
配列の第２１７番目〜第２７６番目の塩基配列を含有す
るＤＮＡ、（９）配列番号：１９で表されるアミノ酸配
列の第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のア
ミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとし
ては、配列番号：２０で表される塩基配列の第２５３番
目〜第２７６番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（１
０）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第９５番
目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列
を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列
番号：２０で表される塩基配列の第２８３番目〜第３９
３番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（１１）配列番
号：１９で表されるアミノ酸配列の第１１５番目（Ａｓ
ｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２
０で表される塩基配列の第３４６番目〜第３９３番目の
塩基配列を含有するＤＮＡ、
【００１６】（１２）配列番号：２１で表されるアミノ
酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：２２で表される塩基配列の第１６
９番目〜第２７６番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、
（１３）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第７
３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：２２で表される塩基配列の第２２０番目〜第２
７６番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（１４）配列番
号：２１で表されるアミノ酸配列の第８１番目（Ｍｅ
ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有する
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２２
で表される塩基配列の第２４４番目〜第２７６番目の塩
基配列を含有するＤＮＡ、（１５）配列番号：２１で表
されるアミノ酸配列の第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番
目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチドをコー
ドするＤＮＡとしては、配列番号：２２で表される塩基
配列の第２５３番目〜第２７６番目の塩基配列を含有す
るＤＮＡ、（１６）配列番号：２１で表されるアミノ酸
配列の第１０１番目（Ｓｅｒ）〜第１１２番目（Ｓｅ
ｒ）のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、配列番号：２２で表される塩基配列の第
３０４番目〜第３３６番目の塩基配列を含有するＤＮ
Ａ、（１７）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の
第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとして
は、配列番号：２２で表される塩基配列の第２８３番目
〜第３９３番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（１８）
配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第１１５番目
（Ａｓｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を
含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番
号：２２で表される塩基配列の第３４６番目〜第３９３
番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（１９）配列番号：
２１で表されるアミノ酸配列の第１２４番目（Ｖａｌ）
〜第１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペ
プチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２２で
表される塩基配列の第３７３番目〜第３９３番目の塩基
配列を含有するＤＮＡ、（２０）配列番号：２１で表さ
れるアミノ酸配列の第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目
（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチドをコード
するＤＮＡとしては、配列番号：２２で表される塩基配
列の第１番目〜第２７６番目の塩基配列を含有するＤＮ
Ａ、（２１）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の
第１番目（Ｍｅｔ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）のアミノ
酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとして
は、配列番号：２２で表される塩基配列の第１番目〜第
３３６番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（２２）配列
番号：２１で表されるアミノ酸配列の第１番目（Ｍｅ
ｔ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２
２で表される塩基配列の第１番目〜第３９３番目の塩基
配列を含有するＤＮＡ、
【００１７】（２３）配列番号：２３で表されるアミノ
酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：２４で表される塩基配列の第１７
２番目〜第２７６番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、
（２４）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の第８
１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：２４で表される塩基配列の第２４１番目〜第２
７６番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（２５）配列番
号：２３で表されるアミノ酸配列の第１０１番目（Ｓｅ
ｒ）〜第１１２番目（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２
４で表される塩基配列の第３０１番目〜第３３６番目の
塩基配列を含有するＤＮＡ、（２６）配列番号：２３で
表されるアミノ酸配列の第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１
２番目（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列を含有するペプチドを
コードするＤＮＡとしては、配列番号：２４で表される
塩基配列の第２８３番目〜第３３６番目の塩基配列を含
有するＤＮＡ、（２７）配列番号：２３で表されるアミ
ノ酸配列の第１２４番目（Ｖａｌ）〜第１３１番目（Ｐ
ｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする
ＤＮＡとしては、配列番号：２４で表される塩基配列の
第３７０番目〜第３９３番目の塩基配列を含有するＤＮ
Ａ、（２８）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の
第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸
配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号：２４で表される塩基配列の第１番目〜第２７
６番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（２９）配列番
号：２３で表されるアミノ酸配列の第１番目（Ｍｅｔ）
〜第１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペ
プチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２４で
表される塩基配列の第１番目〜第３９３番目の塩基配列
を含有するＤＮＡ、
【００１８】（３０）配列番号：２５で表されるアミノ
酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：２６で表される塩基配列の第１７
２番目〜第２８２番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、
（３１）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列の第８
３番目（Ｖａｌ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：２６で表される塩基配列の第２４７番目〜第２
８２番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、（３２）配列番
号：２５で表されるアミノ酸配列の第８４番目（Ｐｒ
ｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有する
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６
で表される塩基配列の第２５０番目〜第２８２番目の塩
基配列を含有するＤＮＡ、（３３）配列番号：２５で表
されるアミノ酸配列の第１１８番目（Ｐｈｅ）〜第１２
５番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチドを
コードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表される
塩基配列の第３５２番目〜第３７５番目の塩基配列を含
有するＤＮＡ、
【００１９】（３４）配列番号：２７で表されるアミノ
酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：２８で表される塩基配列の第１７
２番目〜第２８２番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、
（３５）配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第８
４番目（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：２８で表される塩基配列の第２５０番目〜第２
８２番目の塩基配列を含有するＤＮＡなどがあげられ
る。
【００２０】本発明の方法に用いられるＮ末端にシステ
インを有するタンパク質またはポリペプチドとしては、
特定されるものではない。そのＮ末端にシステインを有
しないタンパク質またはポリペプチドの場合は、公知の
方法によりＮ末端にシステインを有するようにすればよ
い。該Ｎ末端にシステインを有するタンパク質またはポ
リペプチドとしては、分子量が１００〜１０００００の
ものが好ましく、さらに、分子量が３００〜５００００
のものが好ましい。また、Ｎ末端にシステインを有する
タンパク質またはポリペプチドとしては、１〜１０００
個のアミノ酸を有するものが好ましく、さらに３〜５０
０個のアミノ酸を有するものが好ましい。該タンパク質
またはペプチドとしては、例えばインターフエロン類、
インターロイキン類、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、
ｂＦＧＦなど）等各種成長因子類、（プロ）ウロキナー
ゼ類、リンホトキシン、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis
factor（ＴＮＦ））、β−ガラトシターゼなどの酵素
タンパク類、貯蔵タンパク類、ストレプトアビシン、プ
ロテインＡ、プロテインＧ、組織プラスミノーゲンアク
チベーター（Tissue Plasminogen Activator（ｔＰ
Ａ））、これらのムテイン又はこれらの一部（断片）な
どのＮ末端にシステインを有するものがあげられる。な
かでも、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦな
ど）またはそのムテインまたはこれらの一部（断片）
（例えば、ｂＦＧＦ ＣＳ２３ムテインなど）などが好
ましく用いられる。ｂＦＧＦ ＣＳ２３ムテインとして
は、例えば、Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gl
y-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His-Phe-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-
Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-Hi
s-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-
Asp-Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Ar
g-Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys-Gly-Val-Ser-Ala-Asn-Arg-
Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-Gly-Arg-Leu-Leu-Ala-Se
r-Lys-Ser-Val-Thr-Asp-Glu-Cys-Phe-Phe-Phe-Glu-Arg-
Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Ly
s-Tyr-Thr-Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-
Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ser-Lys-Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Ly
s-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Met-Ser-Ala-Lys-Ser（配
列番号：１３）で表されるアミノ酸配列を含有するタン
パク質などがあげられる。
【００２１】本発明方法で用いられる融合タンパク質
（融合ポリペプチドを含む）をコードするＤＮＡは、
(１)全塩基配列を化学的に合成してもよいし、(２)タン
パク質をコードする塩基配列のＮ末端側にシステインを
コードする塩基配列を配置し、さらにそのＮ末端側に本
発明のポリペプチドをコードする塩基配列を配置するこ
とにより該ＤＮＡを構築してもよい。また、（３）本発
明のポリペプチドのフラグメントを得るのが目的の場合
には、所望のフラグメントの直後のアミノ酸残基を部位
特異的突然変異誘発（site-directed mutagenesis）等
の手法でシステインに置換した該ＤＮＡを構築すればよ
い。上記の(１)の場合の製造法としては、例えば、公知
のホスホアミダイド法、リン酸トリエステル法、ジエス
テル法、ハイドロジェンホスホネート法などを用いて、
短いものなら一度に、長いものでは分割して合成した後
にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結して作成すること
が可能である。
【００２２】上記の(２)の場合の製造法としては、例え
ば、Ｃ末端側のタンパク質をコードするＤＮＡは、染色
体から適当な制限酵素で切断し、ベクターに連結して得
るか、もしくはｃＤＮＡを取得する。しかる後にＮ末端
がシステインになるように制限酵素で切断するか、もし
くは、合成ＤＮＡを全タンパク質もしくはその一部のＤ
ＮＡの５'末端に結合しＮ末端がシステインになるよう
に改変する。その５'末端に目的のタンパク質をコード
するＤＮＡ（化学合成したものでも、生体よりクローニ
ングしてきたものでもよい）をつなげる、などの手法が
用いられる。このようにして得られる融合タンパク質を
コードする遺伝子の具体例としては、例えば式 AGCCTGAACTTTGAAGAACTGAAAGATTGGGGTCCGAAAAATGTGATTAAAATGAGCACCCCGGCGGTGAAT AAAATGCCGCATAGCTTTGCGAATCTGCCGCTGCGTTTT-TGCまたはTGT-Ｒ (Ｉ) 〔式中、Ｒは CCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGAC CCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGA GTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAG AGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGAGCGCTAATCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGAT GGAAGATTACTAGCTTCTAAGTCTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAA TCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAA CGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTT CTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGC（配列番号：１４；ｈｂＦＧＦムテインＣＳ２３の断 片）からなる塩基配列を示す。〕で表されるＤＮＡなどがあげられる。
【００２３】上記式（Ｉ）は配列番号：７で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
の塩基配列にシステインをコードする塩基配列を介して
Ｒで示される塩基配列が結合していることを示す。５'
末端にＡＴＧを有し、その下流に該融合タンパク質をコ
ードする領域、ついで翻訳終止コドンを有するＤＮＡ
（プラスミド）は、化学合成で、あるいは遺伝子工学的
に製造された公知の該タンパク質のｃＤＮＡ、もしく
は、染色体由来の該タンパク質のＤＮＡを加工すること
により製造することができる。本発明のＮ末端にシステ
インを有するタンパク質またはポリペプチドのＮ末端に
本発明のポリペプチドを連結した融合タンパク質または
ポリペプチドをコードするＤＮＡを、従来のＤＮＡ技
術、例えば部位特異的突然変異誘発技術を用いて目的の
ムテインをコードする遺伝子に変換することができる。
部位特異的突然変異誘発技術は周知であり、アール・エ
フ・レイサー（Lather, R. F.）及びジェイ・ピー・レ
コック（lecoq, J. P.）、ジェネティック・エンジニア
リング（Genetic Engineering）、アカデミックプレス
社（１９８３年）、第３１−５０頁に示されている。オ
リゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス
（Smith, M.）及びエス・ギラム（Gillam, S.）、ジェ
ネティック・エンジニアリング：原理と方法、プレナム
プムス社（１９８１年）、３巻、１−３２頁に示されて
いる。
【００２４】本発明のＮ末端にシステインを有するタン
パク質またはポリペプチドのＮ末端に本発明のポリペプ
チドを連結した融合タンパク質またはポリペプチド（以
下、本発明の融合タンパク質と称する場合がある）をコ
ードする領域を有するＤＮＡを含有するプラスミドを製
造するにあたって、ベクターとして用いられるプラスミ
ドとしては、例えば大腸菌（Escherichia coli）由来の
ｐＢＲ３２２〔ジーン(Gene)，２，９５(１９７７)〕、
ｐＢＲ３１３〔ジーン，２，７５(１９７７)〕、ｐＢＲ
３２４、ｐＢＲ３２５〔ジーン，４，１２４(１９７
８)〕、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８〔ジーン，９，２
８７(１９８０)〕、ｐＢＲ３２９〔ジーン，１７，７９
(１９８２)〕、ｐＫＹ２２８９〔ジーン，３，１(１９
７８)〕、ｐＫＹ２７００〔生化学，５２，７７０(１９
８０)〕、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４〔ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacterio
logy)，１３４，１１４１(１９７８)〕、ｐＲＫ２４
８、ｐＲＫ６４６、ｐＤＦ〔メソッズ・イン・エン ジ
ーモロジー(Methods in Enzymology)，６８，２６８(１
９７９)〕、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９〔ヤニシューペロ
ンら，ジーン(Gene)，３３，１０３(１９８５)〕などが
あげられる。また、バクテリオファージ、例えばλファ
ージを使用したλｇｔ系のλｇｔ・λＣ〔Proc. Nat. A
cad. Sci. Ｕ.Ｓ.Ａ．７１，４５７９(１９７４)〕、λ
ｇｔ・λＢ〔Proc. Nat. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.Ａ. ７２，
３４６１(１９７５)〕、λＤａｍ〔ジーン，１，２５５
(１９７７)〕やシャロンベクター〔サイエンス，(Scien
ce)，１９６，１６１(１９７７)；ジャーナル・オブ・
ビーロロジー(Journal of Virology)，２９，５５５(１
９７９)〕、繊維状ファージを使用したｍｐ系のｍｐ１
８、ｍｐ１９〔ヤニシューペロンら，ジーン(Gene)，３
３，１０３(１９８５)〕ベクターなどもあげられる。
【００２５】上記ＤＮＡは、ＡＴＧの上流にプロモータ
ーを有しているのが好ましく、該プロモーターは、形質
転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌（Esch
erichia coli）ではｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、
ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなど、枯草菌
（Bacillus subtilis）ではＳＰＯ１プロモーター、Ｓ
ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、酵母
（Saccharomyces cerevisiae）ではＰＨＯ５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
プロモーターなど、動物細胞ではＳＶ４０由来のプロモ
ーターなどがあげられる。必要によりＳＤ（シャイン−
ダルガーノ）配列をプロモーターの下流に挿入してもよ
い。Ｔ７プロモーターの系を用いる場合には、Ｔ７プロ
モーターとしては、Ｔ７ＤＮＡ上で見い出されている１
７種のプロモーター〔J. L. Oakley ら，Proc．Natl. A
cad. Sci, Ｕ.Ｓ.Ａ，７４：４２６６−４２７０(１９
７７)，M. D. Rosa, Cell １６：８１５−８２５(１９
７９)，N. Panayotatos ら，Nature，２８０：３５(１
９７９)，J. J. Dunn ら，J. Mol. Biol.，１６６：４
７７−５３５(１９８３)〕のいずれでもよいがφ１０プ
ロモーター〔A. H. Rosenberg ら，Gene，５６：１２５
−１３５(１９８７)〕が好ましい。
【００２６】転写ターミネーターとしては、大腸菌の系
で作動するターミネーター、好ましくはＴφターミネー
ター〔F. W. Studier ら，J. Mol. Biol.，１８９：１
１３−１３０(１９８６)〕が用いられる。Ｔ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子としてはＴ７遺伝子〔F. W. Studie
r ら，J.Mol. Biol.，１８９：１１３−１３０(１９８
６)〕をあげることが出来る。ベクターは上記ベクター
にＴ７プロモーター，Ｔ７ターミネーターを組み込んで
構築されるのが好ましく、このようなベクターとして
は、ｐＥＴ−１、ｐＥＴ−２、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−
４、ｐＥＴ−５〔A. H. Rosenberg, Gene ５６：１２５
−１３５(１９８７)〕、ｐＴＢ９６０−２〔ＥＰ−Ａ−
４９９９９０〕などをあげることができるが、好ましく
はｐＴＢ９６０−２が用いられる。
【００２７】本発明の形質転換体は、上記方法で得られ
る発現用プラスミドを公知の方法〔例、コーエンS, N,
ら，プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス(Pro. Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.
Ａ.)，６９，２１１０(１９７２)〕で宿主を形質転換す
ることにより製造することができる。形質転換される微
生物の宿主としては、例えば、エシェリヒア（Escheric
hia）属菌，バチルス（Bacillus）属菌，酵母，動物細
胞などがあげられる。上記エシェリヒア属菌の例として
は、エシェリヒア・コリ（E. coli）があげられ、具体
的にはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２
ＤＨ１〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl. Acad. Sci.
Ｕ.Ｓ.Ａ.)，６０，１６０(１９６８)〕、ＪＭ−１０３
〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，(Nucleic Acids
Research)，９，３０９(１９８１)〕、ＪＡ２２１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal
of Molecular Biology)，１２０，５１７(１９７
８)〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オ ブ・モレ キュラ
ー・バイオロジー，４１，４５９(１９６９)〕、Ｃ６０
０〔ジェネティックス(Genetics)，３９，４４０(１９
５４)〕、Ｎ４８３０〔セル(Cell)，２５，７１３(１９
８１)〕、Ｋ−１２ ＭＭ２９４〔プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ，
７３，４１７４(１９７６)〕、ＢＬ−２１などがあげら
れる。
【００２８】上記バチルス属菌としては、例えばバチル
ス・サチルス（Bacillus subtilis）があげられ、具体
的にはバチルス・サチルスＭＩ１１４（ジーン，２４，
２５５（１９８３））、２０７−２１〔ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry)，
９５，８７(１９８４)〕などがあげられる。上記酵母と
しては、例えばサッカロマイセス・セレビシェ（Saccha
romyces cerevisiae）があげられ、具体的には、サッカ
ロマイセス・セレビシェＡＨ２２〔Proc. Natl. Acid.
Sci. ＵＳＡ，７５，１９２９(１９７８)〕、ＸＳＢ５
２−２３Ｃ〔Proc. Natl. Acid. Sci. ＵＳＡ，７７
２１７３(１９８０)〕、ＢＨ−６４１Ａ（ＡＴＣＣ ２
８３３９）、２０Ｂ−１２〔Genetics，８５，２３(１
９７６)〕、ＧＭ３Ｃ−２〔Proc. Natl. Acid. Sci. Ｕ
ＳＡ，７８ ２２５８(１９８１)〕などがあげられる。
【００２９】動物細胞としては、例えばサル細胞ＣＯＳ
−７〔セル(Cell)，２３，１７５(１９８１)〕、Ｖｅｒ
ｏ〔(日本臨床 ２１，１２０９(１９６３))、チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ〔ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メデイシン(J. Exp. Med.)，１０８，９
４５(１９８５)〕、マウスＬ細胞〔ジャーナル・オブ・
ナショナル・キャンサー・インスティチュート(J. Nat.
Cancer Inst.)，４，１６５(１９４３)〕、ヒトＦＬ細
胞〔プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティ・フォ
ー・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィシン(Proc.Sco. Etp. Biol. Med.)，９４，５３２(１
９５７)〕、ハムスターＣ細胞などがあげられる。
【００３０】Ｔ７プロモーターの系を用いる場合には、
その形質転換体の宿主としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子（Ｔ７遺伝子１）〔F. W. Studierら，J. Mo
l. Biol. １８９：１１３−１３０(１９８６)〕を組み
込んだ大腸菌株、例えばＭＭ２９４、ＤＨ−１、Ｃ６０
０、ＪＭ１０９、ＢＬ２１あるいはＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子（Ｔ７遺伝子１）を他のプラスミドと共に
組込んだ大腸菌株などならいずれでもよい。好ましくは
Ｔ７遺伝子１を組み込んだλファージが溶原化したＭＭ
２９４株およびＢＬ２１株が用いられる。この場合Ｔ７
遺伝子１のプロモーターとしては、イソプロピル−１−
チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧと略する
ことがある。）で発現が誘導されるｌａｃプロモーター
が用いられる。
【００３１】バチルス属菌を宿主として形質転換するに
は、例えばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス（Molecular and General Genetics）, 168,
111（1979）など公知の方法に従って行なうことができ
る。酵母を宿主として形質転換するには、例えばProc.
Natl. Acad. Sci. USA，75, 1929（1978）などの公知の
方法に従って行なうことができる。動物細胞を宿主とし
て形質転換するには、例えばヴィーロロジー（Virolog
y）, 52, 456（1973）などの公知の方法に従って行なう
ことができる。本発明の融合タンパク質は、上述の形質
転換体を培地に培養し、産生された本発明の融合タンパ
ク質を採取することにより製造することができる。培地
のｐＨは約６〜８が望ましい。
【００３２】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experi
ments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York 1972〕〕が好ましい。
ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、例えば３β−インドリルアクリル酸やイソプロピル
β−Ｄ−チオガラクトピラノシドのような薬剤を加える
ことができる。
【００３３】宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通
常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
例えばバークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bost
ian, K. L. ら、プロシージングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. S
ci.) USA,77, 4505(1980)〕があげられる。培地のｐＨ
は約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０
℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気
や撹拌を加える。
【００３４】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際の培地としては、例えば約０.２〜２０％好ましく
は約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエ
ンス(Science)，122, 501(1952)〕、ＤＭＥ培地〔ヴィ
ロロジー(Virology), 8, 396(1959)〕、ＲＰＭＩ １６
４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション(The Journal of the American
Medical Association)，199, 519(1967)〕、１９９培
地〔プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of t
he Society for the Biologcal Medicine)，73, 1 (195
0)〕などがあげられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約３０〜４０℃、培養時間は約１５〜
６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３５】本発明の融合タンパク質は、上記形質転換
体を培養し、培養物中に該融合タンパク質を生成，蓄積
せしめ、これを採取することにより製造することができ
る。培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含
むＭ９培地〔ミラー，J.，エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネテイクス(Experiments in Molecula
r Genetics)，４３１−４３３(Cold Spring Horbor Lab
oratort，New York１９７２)〕、２×ＹＴ培地〔メシン
グ，メソッド・イン・エンザイモロジー(Methods in En
zymology)，１０１，２０(１９８３)〕、ＬＢ培地など
があげられる。
【００３６】培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時
間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。λｃ
Ｉｔｓリプレッサーと、λＰLプロモーターを含有する
発現ベクターとを有する組換え体を使用する場合には、
培養は約１５〜３６℃、好ましくは約３０℃〜３６℃の
温度で行い、λｃＩｔｓリプレッサーの不活化は約３７
℃〜４２℃で行うのが好ましい。またｒｅｃＡプロモー
ターをより効率良く働かせるため、すなわちｒｅｃＡ遺
伝子発現抑制機能を低下せしめるため、必要によりマイ
トマイシンＣ，ナルジキシン酸などのような薬剤を添加
したり、紫外線を照射する、あるいは培養液のｐＨをア
ルカリ側に変化させてもよい。Ｔ７プロモーターの系を
用いている場合には、(１)ｌａｃプロモーターの下流に
連結されているＴ７遺伝子（ＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子）を発現させる時はＩＰＴＧなどを添加する、もしく
は(２)λＰLプロモーターの下流に連結されているＴ７
遺伝子（ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子）を発現させる時は
培養の温度を上昇させることなどにより、生成するＴ７
ファージＲＮＡポリメラーゼ１により特異的にＴ７プロ
モーターを作動させる。
【００３７】培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば
緩衝液に懸濁したのち、例えば、タンパク質変性剤処
理，超音波処理やリゾチームなどの酵素処理，グラスビ
ーズ処理，フレンチプレス処理，凍結融解処理などを行
って菌体を破砕し、遠心分離など公知の方法によって上
清を得る。上記により得られた上清から、本発明の融合
タンパク質を単離するには、通常知られているタンパク
質の精製法に従えばよい。例えば、ゲル濾過法，イオン
交換クロマトグラフィー，吸着クロマトグラフィー，高
速液体クロマトグラフィー，アフイニティークロマトグ
ラフィー，疎水クロマトグラフィー，電気泳動等を適切
に組合せて行うことができる。本発明のポリペプチドの
Ｎ末端がイソロイシン残基、バリン残基、システイン残
基、スレオニン残基、アスパラギン酸残基、リジン残
基、ロイシン残基、アルギニン残基、アスパラギン残
基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、チロシン
残基、トリプトファン残基、グルタミン酸残基、グルタ
ミン残基またはヒスチジン残基である場合（例えば、配
列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドまたは配列番号：１１で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチドなどである場合）には、こ
のようにして得られる本発明の融合タンパク質のＮ末端
には、翻訳開始コドンに由来するメチオニンが付加して
いる場合がある。また、該融合タンパク質は、精製する
ことなく、あるいは部分精製の状態で、次の反応工程に
進んでもよい。次に、このようにして得られる本発明の
融合タンパク質をシステイン残基のアミノ基側のペプチ
ド結合の切断反応に付す。該切断反応としては、例え
ば、Ｓ−シアノ化反応次いで加水分解反応があげられ
る。本発明のポリペプチドのアミドまたはその塩を最終
物として得る場合には、該切断反応としては、例えば、
Ｓ−シアノ化反応次いでアンモノリシスを行うことがあ
げられる。該Ｓ−シアノ化反応は、原料化合物に、Ｓ−
シアノ化試薬を作用させることにより行なう。
【００３８】Ｓ−シアノ化試薬としては例えば２−ニト
ロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）、１−シアノ
−４−ジメチルアミノピリジウム塩（ＤＭＡＰ−Ｃ
Ｎ）、ＣＮ-イオンなどがあげられる。該Ｓ−シアノ化
試薬の量は、全チオール基の約２倍から５０倍量であれ
ばよい。より好ましくは約５倍〜１０倍量であればよ
い。反応温度は約０℃〜８０℃の間であれば、いずれで
もよく、約０℃〜５０℃の間がより好ましい。用いる溶
媒としては、Ｓ−シアノ化試薬と反応しないものであれ
ばいずれの緩衝液でもよいが、例えば、トリス−塩酸緩
衝液、トリス−酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液などがあげられる。また、有機溶媒は、Ｓ−シアノ化
試薬と反応しないものであれば、存在していてもよい。
該反応は、ｐＨ１〜１２の間で行なうのが良い。特に、
ＮＴＣＢを用いる場合にはｐＨ７〜１０、ＤＭＡＰ−Ｃ
Ｎを用いる場合にはＳ−Ｓ交換反応を防止するため、ｐ
Ｈ２〜７の間が好ましい。また、反応液中には、塩酸グ
アニジン等の変性剤が存在していてもよい。
【００３９】上記加水分解反応としては、例えばアルカ
リ処理に付すことがあげられる。該アルカリ処理として
は、原料化合物を含有する水溶液のｐＨを７〜１４に調
整することにより行なわれる。該ｐＨの調整は、例えば
アンモニア、水酸化ナトリウム、アミノ化合物、トリツ
マベース（トリス〔ヒドロキシメチル〕−アミノメタ
ン）、リン酸第２ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化
バリウム等の溶液を原料化合物を含有する水溶液に適当
量加えて行うが、特にアンモニアなどが好ましい。上記
反応の際の溶液の濃度としては、例えばアンモニアまた
はアミノ化合物の場合は約０.０１〜１５Ｎ、好ましく
は約０.１〜５Ｎ、水酸化ナトリウムの場合は約０.０１
〜２Ｎ、好ましくは０.０５〜１Ｎ、トリツマベースの
場合は約１mＭ〜１Ｍ、好ましくは約２０mＭ〜２００m
Ｍ、リン酸第２ナトリウムの場合は約１mＭ〜１Ｍ、好
ましくは約１０mＭ〜１００mＭ、水酸化カリウムの場合
は約０.０１〜４Ｎ、好ましくは約０.１〜２Ｎ、水酸化
カリウムの場合は約０.０１〜０.２ Ｍ、好ましくは約
０.１〜０.２Ｍがあげられる。反応温度は約−２０℃〜
８０℃の間であればいずれでもよく、約−１０℃〜５０
℃の間がより好ましい。
【００４０】反応時間は、好ましくは、Ｓ−シアノ化反
応は約１〜６０分、好ましくは約１５〜３０分が、アン
モノリシスは約５分〜２４時間、好ましくは約１０〜１
８０分が、加水分解反応は約５分〜１００時間、好まし
くは１０分〜１５時間があげられる。上記のＳ−シアノ
化または加水分解により、〔図１〕に示される反応が起
こると考えられる。〔図１〕において、ＸはＲ1−(ＮＲ
2)−（式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって、(i)
水素、(ii)Ｃ1-20アルキル，Ｃ3-8シクロアルキル，Ｃ
6-14アリール（aryl）またはＣ6-14アリール−Ｃ1-3ア
ルキル（これらは置換基を有していないかあるいは１〜
３個のアミノ基，水酸基などを炭素原子上に有していて
もよい）、(iii)置換されていてもよいアミノ、(iv)水酸
基またはＣ1-6アルコキシ基を示す。）またはＯＨを示
す。上記Ｃ1-20アルキルの例としては、例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ
−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１
−エチルペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチ
ル、オクチル、ノナニル、デカニル、ウンデカニル、ド
デカニル、テトラデカニル、ペンタデカニル、ヘキサデ
カニル、ヘプタデカニル、オクタデカニル、ノナデカニ
ルおよびエイコサニルなどがあげられる。上記Ｃ3-8シ
クロアルキルの例としては、例えば、シクロプロピル、
シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチルなどがあげられる。上記Ｃ
6-14アリールの例としては、フェニル、ナフチル、アン
スリル、フェナンスリル、アセナフチレニルなどがあげ
られる。上記Ｃ6-14アリール−Ｃ1-3アルキルの例とし
ては、例えばベンジル、フェネチル、３−フェニルプロ
ピル、（１−ナフチル）メチル、（２−ナフチル）メチ
ルなどがあげられる。上記Ｃ1-6アルコキシの例として
は、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキ
シ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどがあげられ
る。
【００４１】上記(iii)の置換されていてもよいアミノ
の置換基の例としては、例えばアミノ酸，２〜１０個の
アミノ酸からなるペプチドなどがあげられる。上記アミ
ノ酸としては、Ｌ体でもＤ体でもよく、その例として
は、例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅ
ｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙ
ｒ、Ｖａｌなどがあげられる。該反応において、アンモ
ニアまたはアミノ化合物を用いた場合には、対応するア
ミド体が得られる。
【００４２】切り出された本発明のポリペプチドを単離
するには、通常知られているペプチドの精製法に従えば
よい。例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフ
ィー，高速液体クロマトグラフィー，アフィニティーク
ロマトグラフィー，疎水クロマトグラフィー，薄層クロ
マトグラフィー，電気泳動等を適宜組み合せて行うこと
ができる。上述のとおり、得られる本発明のポリペプチ
ドのＮ末端には翻訳開始コドンに由来するメチオニンが
付加している場合があるが、下記に詳述される方法に準
じて、例えば、グリオキシル酸などのα−ジケトン類を
反応（好ましくは、硫酸銅などの遷移金属イオンとピリ
ジンなどの塩基の存在下に反応）させた後、ｏ−フェニ
レンジアミンなどのジアミン類を用いて加水分解するこ
とによりＮ末端のメチオニンを除去することも可能であ
る。
【００４３】〔本発明のポリペプチドのＮ末端のメチオ
ニンの除去方法〕本明細書において、酸化されていても
よいメチオニン残基は、メチオニン残基またはそのＳ酸
化体を示し、メチオニン残基のＳ酸化体としては、スル
ホキシドおよびスルホン体が挙げられる。Ｎ末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基を有する本発明のポリ
ペプチドとしては、 式CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-Ｘ ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘは本発明のポ
リペプチドのペプチド鎖を示す。］で表されるポリペプ
チドが挙げられ、これらは塩を形成してもよく、塩とし
ては、上記した本発明のポリペプチドの塩と同様のもの
が挙げられる。Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基を有する本発明のポリペプチドまたはその塩は、
遺伝子工学的に製造されたＮ末端に酸化されていてもよ
いメチオニン残基を有する本発明のポリペプチドまたは
その塩であることが好ましい。
【００４４】上記式中、ｍとしては０が好ましい。ま
た、Ｘで示される本発明のポリペプチドのペプチド鎖と
しては上記した本発明のポリペプチドが挙げられる。上
記の本発明のポリペプチドまたはその塩は、Ｎ末端の酸
化されていてもよいメチオニン（Ｍｅｔ）残基または該
メチオニン残基のジケトン体の除去工程に付す前あるい
は後にリフォールディング（活性化、再生化）を行うこ
とができる。
【００４５】本明細書において、Ｎ末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基のジケトン体を有する本発明の
ポリペプチドまたはその塩とは、 式CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘは本発明のポ
リペプチドのペプチド鎖を示す。］で表される化合物ま
たはその塩を示す。Ｎ末端に酸化されていてもよいメチ
オニン残基のジケトン体を有する本発明のポリペプチド
またはその塩は、化学反応または酵素反応等各種反応に
より得ることができる。例えば、Ｎ末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基を有する本発明のポリペプチド
またはその塩をα−ジケトン類と反応させるアミノ基転
移反応により、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基のジケトン体を有する本発明のポリペプチドまた
はその塩を得ることができる。本明細書において、α−
ジケトン類は、上記した本発明のポリペプチドまたはそ
の塩のアミノ基転移反応を進行させうるものであれば何
れでもよく、例えば式Ｒ1−ＣＯ−ＣＯ−Ｒ2［式中、Ｒ
1は水素またはカルボキシル基で置換されていてもよい
低級アルキルもしくはフェニル基（好ましくは水素また
はメチル、さらに好ましくは水素）を示し、Ｒ2は水酸
基、低級アルコキシ基または低級アルキルで置換されて
いてもよいアミノ基（好ましくは水酸基）を示す。］で
表される化合物またはその塩などが挙げられる。上記式
中、Ｒ1で示される低級アルキル基としては、メチル、
エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチ
ル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルなどの炭素数１ないし
６程度のアルキル基などが挙げられ、Ｒ2で示される低
級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポ
キシ、ｉ−プロポキシ、ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓｅ
ｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどの炭素数１ないし６程
度のアルコキシ基などが挙げられる。また、Ｒ2で示さ
れる低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基とし
ては、前記したＲ1で示される低級アルキル基を１ない
し２個有していてもよいアミノ基などが挙げられる。さ
らに、塩としては、上記したＮ末端に酸化されていても
よいメチオニン残基を有する本発明のポリペプチドの塩
と同様なものが挙げられる。α−ジケトン類の具体例と
しては、グリオキシル酸、ピルビン酸、オキサル酢酸、
フェニルグリオキシル酸、２−オキソグルタル酸などが
挙げられるが、なかでも、グリオキシル酸が好ましく用
いられる。α−ジケトン類は塩を形成していてもよく、
ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、塩酸
塩などの無機酸の塩などがあげられる。
【００４６】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有する本発明のポリペプチドまたはその塩とα−
ジケトン類とのアミノ基転移反応は、通常、本発明のポ
リペプチドまたはその塩１モルに対して、１ないし１万
モル（好ましくは２０００ないし４０００モル）程度の
α−ジケトン類を、約０ないし７０℃（好ましくは約２
０ないし４０℃）で約１０分ないし５時間（好ましくは
約２０分ないし２時間）反応させるのが好ましい。上記
したアミノ基転移反応を阻害しないものであれば何れの
緩衝液（例、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝
液など）を用いてもよいが、なかでも、酢酸緩衝液が好
ましく用いられる。また、反応のｐＨは、約２ないし
９、なかでも、約４ないし７、とりわけ、約５ないし６
に調整して反応を進行させるのがよい。該アミノ基転移
反応を促進するため、遷移金属イオンの存在下にα−ジ
ケトン類を反応させることが好ましく、通常、α−ジケ
トン類１モルに対して、０.００１ないし０.１モル（好
ましくは０.０１ないし０.０５モル）程度の遷移金属イ
オンを用いるのが好ましい。遷移金属イオンとしては、
例えば、銅イオン（Ｃｕ+，Ｃｕ2+）、コバルトイオン
（Ｃｏ2+，Ｃｏ3+）、ニッケルイオン（Ｎｉ2+，Ｎ
ｉ3+）、鉄イオン（Ｆｅ2+，Ｆｅ3+）、亜鉛イオン（Ｚ
ｎ2+）、アルミニウムイオン（Ａｌ3+）、マンガンイオ
ン（Ｍｎ2+など）、ガリウムイオン（Ｇａ3+）、インジ
ウムイオン（Ｉｎ3+）、マグネシウムイオン（Ｍ
ｇ2+）、カルシウムイオン（Ｃａ2+）などを用いること
ができるが、なかでも、銅イオン、コバルトイオンな
ど、とりわけ、銅イオン（Ｃｕ2+）が好ましく用いられ
る。これらの遷移金属イオンは、通常、硫酸、硝酸、塩
酸、過塩素酸などの無機酸との塩または酢酸、シュウ
酸、クエン酸、炭酸などの有機酸との塩として、反応溶
媒に添加することができ、なかでも、硫酸銅、酢酸銅、
とりわけ、硫酸銅が好ましく用いられる。
【００４７】また、塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類１モル
に対して、０.１ないし２０モル（好ましくは０.５ない
し１０モル）程度の塩基を用いるのが好ましい。塩基と
しては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン
などのアルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、
ピリジン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミ
ノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類など
を用いることができるが、なかでも、ピリジンが好まし
く用いられる。また、アミノ基転移反応の際に、Ｎ末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有する本発明
のポリペプチドまたはその塩、および該本発明のポリペ
プチドまたはその塩のアミノ基転移反応で得られるメチ
オニン残基のジケトン体を有する本発明のポリペプチド
またはその塩の沈殿防止などを目的として、アミノ基転
移反応のための緩衝液中に尿素を添加することが好まし
い。例えば、緩衝液中に尿素を好ましくは約１ないし８
Ｍ、より好ましくは約３ないし６Ｍの濃度になるよう添
加することが好ましい。
【００４８】さらに、上記したアミノ基転移反応は、遷
移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることが好ましく、実用的には、遷移金属イオ
ン、塩基およびα−ジケトン類の３成分（例えば、硫酸
銅、ピリジンおよびグリオキシル酸など）を含有する混
合液を、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
を有する本発明のポリペプチドまたはその塩を含有する
水溶液に添加して、アミノ基転移反応を進行させる。該
アミノ基転移反応により得られる、 式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘは本発明のポ
リペプチドのペプチド鎖を示す。］で表される化合物ま
たはその塩（メチオニン残基のジケトン体を有する本発
明のポリペプチドまたはその塩）は、ペプチドまたはタ
ンパク質の公知精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、
再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から
単離・精製することもできるが、そのまま次の加水分解
反応に付すこともできる。アミノ基転移反応で得られた
メチオニンのジケトン体を有する本発明のポリペプチド
またはその塩は、通常、塩基による加水分解反応に付し
て、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基ある
いは該メチオニン残基のジケトン体を有していない本発
明のポリペプチドまたはその塩に変換することができ
る。
【００４９】加水分解反応に用いる塩基としては、例え
ば、システアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミ
ンなどのアルキルアミン類またはその塩、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−
（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香
族アミン類またはその塩、ｏ−フェニレンジアミン、ト
リレン−３，４−ジアミン、３，４−ジアミノ安息香酸
およびそのＮ−アルキル置換体（例えば、Ｎ−メチル−
１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エチル−１，２−フ
ェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル−１，２−フェニ
レンジアミンなど）、２，３−ジアミノフェノール、４
−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンなどのジアミン類
（好ましくは芳香族ジアミン類、なかでも、３，４−ジ
アミノ安息香酸およびそのＮ−アルキル置換体（例え
ば、Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エ
チル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル
−１，２−フェニレンジアミンなど）またはそれらの塩
など、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバジ
ド、フェニルチオセミカルバジドなどのチオセミカルバ
ジド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカ
ルバジドなどのセレノセミカルバジド類などのアミン類
またはその塩などを用いることができるが、なかでも、
アミン類、とりわけ、ジアミン類またはチオセミカルバ
ジド類またはそれらの塩が好ましく用いられ、特に、
３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩が好ましく用い
られる。加水分解反応に用いられる塩基の塩としては、
例えば上記のＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有する本発明のポリペプチドの塩と同様のものな
どがあげられる。
【００５０】塩基の量は、通常、メチオニン残基のジケ
トン体を有する本発明のポリペプチドまたはその塩１モ
ルに対して約１ないし１万モル、好ましくは約２００な
いし３０００モル、より好ましくは約５００ないし３０
００モルである。加水分解反応は、通常、約０ないし７
０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約１時間ない
し７日間（好ましくは約１０時間ないし５日間）で進行
させるのが好ましい。反応には、緩衝液を溶媒として用
いることが好ましく、緩衝液としては、例えば、リン酸
系緩衝液、酢酸系緩衝液、クエン酸系緩衝液、ギ酸系緩
衝液などが挙げられる。上記した加水分解反応を阻害し
ないものであれば何れの緩衝液を用いてもよいが、なか
でも、酢酸−ギ酸ナトリウム、ギ酸−ギ酸ナトリウムま
たはギ酸−酢酸ナトリウム緩衝液などのギ酸系緩衝液が
好ましく用いられる。また、反応のｐＨは、約２ないし
９、なかでも、約３ないし７、とりわけ、約４ないし６
に調整して、反応を進行させるのがよい。これらの緩衝
液は、好ましくは約０．１〜８mol/L、より好ましくは
約０．５〜６mol/Lで用いられる。また、加水分解の際
に、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基のジ
ケトン体を有する本発明のポリペプチドまたはその塩お
よび加水分解反応により生成する該メチオニン残基を有
していない本発明のポリペプチドまたはその塩の沈殿防
止等を目的として、加水分解反応のための緩衝液中に尿
素を添加することが好ましい。例えば、緩衝液中に尿素
を、好ましくは約１ないし６Ｍ、より好ましくは約２な
いし５Ｍの濃度になるよう添加することが好ましい。こ
のようにして得られる本発明のポリペプチドまたはその
塩は、公知の精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再
結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から単
離・精製することもできるが、好ましい例として、例え
ば、ＳＰ−セファロース（ファルマシアバイオテク
(株)）あるいは、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー(株)）を介
したイオン交換クロマトグラフィーなどによる精製法が
挙げられる。
【００５１】本発明の方法で製造される本発明のポリペ
プチドまたはその塩は滅菌水，ヒト血清アルブミン(Ｈ
ＳＡ)，生理食塩水その他公知の生理学的に許容される
担体と混合することができ、哺乳動物（例、ヒトなど）
に対して非経口的に又は局所に投与することができる。
たとえば、その１日投与量は１人あたり、約０.０１ｍ
ｇ−５０ｍｇ、好ましくは、約０.１ｍｇ−１０ｍｇ
を、静注または筋注などにより非経口的に投与すること
ができる。本発明の方法で製造される本発明のポリペプ
チドまたはその塩を含有する製剤は、塩、希釈剤、アジ
ュバント、他の担体、バッファー、結合剤、界面活性
剤、保存剤のような生理的に許容される他の活性成分も
含有していてもよい。非経口的投与製剤は、滅菌水溶液
又は生理学的に許容される溶媒との懸濁液アンプル、ま
たは生理学的に許容される希釈液で用時希釈して使用し
うる滅菌粉末（通常ペプチド溶液を凍結乾燥して得られ
る）アンプルとして提供される。
【００５２】本発明の製造法によって得られる本発明の
ポリペプチドはプロラクチン分泌の調節作用、つまり、
プロラクチン分泌の促進および抑制作用を有する。即
ち、本発明のポリペプチドは、まずプロラクチン分泌の
促進作用を有するため、プロラクチン分泌不全に関係す
る各種疾患の予防および治療薬に用いることができる。
一方、本発明のポリペプチドは、そのレセプタータンパ
ク質との親和性が強いため、投与量が増えるとプロラク
チン分泌に対し脱感作（desensitization）が起こる結
果、プロラクチン分泌を抑制する作用も有する。この場
合、プロラクチン過剰分泌に関係する各種疾患の予防お
よび治療薬に用いることができる。従って、本発明のポ
リペプチドは、プロラクチン分泌促進剤として、卵巣機
能低下症、精嚢発育不全、骨粗鬆症、更年期障害、乳汁
分泌不全、甲状腺機能低下、腎不全などのプロラクチン
分泌に関係する各種疾患の予防および治療薬として有用
である。さらに、本発明のポリペプチドは、プロラクチ
ン分泌促進作用に基づき、性欲促進作用（フェロモン的
作用）を有するため、性欲促進剤としても有用である。
また、本発明のポリペプチドは、プロラクチン分泌抑制
剤として、高プロラクチン血症、下垂体腺腫瘍、間脳腫
瘍、月経異常、ストレス、自己免疫疾患、プロラクチノ
ーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末
端肥大症、キアリ・フロンメル（Chiari-Frommel）症候
群、アルゴンツ-デル・カスティロ（Argonz-del Castil
o）症候群、フォーベス・アルブライト（Forbes-Albrig
ht）症候群、乳癌リンパ腫またはシーハン症候群または
精子形成異常などのプロラクチン分泌に関係する各種疾
患の予防および治療薬として有用である。また、本発明
のポリペプチドは、プロラクチン分泌抑制作用に基づい
て、避妊薬としても有用である。その他、本発明のポリ
ペプチドは、プロラクチン分泌機能を調べるための検査
薬としても、また、牛、ヤギ、ブタなどの畜産哺乳動物
の乳汁の分泌促進剤などの動物薬としても有用であり、
さらには該畜産哺乳動物体内で有用物質を生産させ、こ
れをその乳汁中への分泌することによる有用物質生産な
どへの応用も期待される。さらにまた、本発明のポリペ
プチドは、胎盤機能調節作用を有するため、絨毛癌、胞
状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異
常、脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療薬と
しても有用である。
【００５３】本明細書および図面において、アミノ酸，
ペプチド，保護基，活性基，その他に関し略号で表示す
る場合、それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ（Commission on
Biochemical Nomenclature）による略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に
あげる。また、アミノ酸などに関し光学異性体がありう
る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
【００５４】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 ［配列番号：１］９アミノ酸残基からなる本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：２］配列番号：１のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：３］１２アミノ酸残基からなる本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：４］配列番号：３のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：５］２０アミノ酸残基からなる本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：６］配列番号：５のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：７］３７アミノ酸残基からなる本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：８］配列番号：７のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 ［配列番号：９］９アミノ酸残基からなる本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１０］配列番号：９のアミノ酸配列で表さ
れるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 ［配列番号：１１］１７アミノ酸残基からなる本発明の
ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１２］配列番号：１１のアミノ酸配列で表
されるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 ［配列番号：１３］ｂＦＧＦ ＣＳ２３ムテインのアミ
ノ酸配列を示す。 ［配列番号：１４］式（Ｉ）で表される融合タンパク質
をコードする遺伝子の断片の塩基配列を示す。 ［配列番号：１５］後述の実施例１で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-＃１の塩基
配列を示す。 ［配列番号：１６］後述の実施例１で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-＃２の塩基
配列を示す。 ［配列番号：１７］後述の実施例１で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-＃３の塩基
配列を示す。 ［配列番号：１８］後述の実施例１で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-＃４の塩基
配列を示す。 ［配列番号：１９］本発明のヒト由来前駆体ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：２０］配列番号：１９のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。 ［配列番号：２１］本発明のヒト由来前駆体ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：２２］配列番号：２１のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。 ［配列番号：２３］本発明のウシ由来前駆体ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：２４］配列番号：２３のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。 ［配列番号：２５］本発明のマウス由来前駆体ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：２６］配列番号：２５のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。 ［配列番号：２７］本発明のラット由来前駆体ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：２８］配列番号：２７のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。 ［配列番号：２９］本発明のラット由来前駆体ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：３０］配列番号：２９のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。
【００５５】後述の実施例２で得られた形質転換体Esch
erichia coli MM294(DE3)/pTFCRFRP-1は受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７３１３として２０００年９月２８日付で茨
城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３
０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託されている。
また２０００年９月１９日付で受託番号ＩＦＯ １６４
７６として大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８
５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究
所（ＩＦＯ）に寄託されている。
【００５６】
【発明の実施の形態】以下に実施例をあげて、本発明を
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。
【００５７】
【実施例】実施例１ 本発明のポリペプチド（配列番
号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）
構造遺伝子の調製 配列番号：１５〜１８に示す４種類のＤＮＡ断片（＃
１：配列番号：１５、＃４：配列番号：１８；キコーテ
ック社製）（＃２：配列番号：１６、＃３：配列番号：
１７；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を
用いて、公知の方法により、本発明のポリペプチド（配
列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド）の構造遺伝子を調製した。 a)ＤＮＡオリゴマーのリン酸化 ５’末端になるべき＃１及び＃４を除いた２種類のオリ
ゴマー各１μｇを１００μＬのリン酸化反応液［50mM T
ris-HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10m
M ジチオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、
1mM ATP、10ユニット Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（日本ジーン）］中で３７℃、１時間反応させ、５’末
端のリン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水
層を回収し２倍量のエタノールを加え、−７０℃に冷却
した後、遠心でＤＮＡを沈殿させた。 b)ＤＮＡフラグメントの連結 上記a)で得られたリン酸化ＤＮＡフラグメントと＃１及
び＃４各１μｇを合わせ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、
２ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)に加え、１２０μＬとし
た。この混合液を８０℃で１０分間保った後、室温まで
徐冷しアニーリングを行った。TaKaRa DNA Ligation Ki
t ver.2（宝酒造）を用いてライゲーション反応を行っ
た。アニーリング液３０μＬにキットに付属のＩＩ液３
０μＬを加え良く混合した後、キットに付属のＩ液６０
μＬを加え、３７℃、１時間反応させ、ライゲーション
を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２
倍量のエタノールを加え、−７０℃に冷却した後、遠心
でＤＮＡを沈殿させた。 c)５’末端のリン酸化 沈殿をＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA）
10 μLに溶解し、100μLのリン酸化反応液［50mM Tris-
HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジ
チオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM
ATP、10ユニット Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（日本
ジーン）］中で３７℃、１時間反応させ、５’末端のリ
ン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水層を回
収し２倍量のエタノールを加え、−７０℃に冷却した
後、遠心でＤＮＡを沈殿させ、20μLのＴＥ緩衝液に溶
解した。
【００５８】実施例２ 本発明のポリペプチド（配列番
号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）
発現プラスミドの調製 発現用ベクターとしてはｐＴＦＣ（特開２０００−２７
０８７１号公報に記載）をＮｄｅＩおよびＡｖａＩ（宝
酒造）で３７℃ ４時間消化した後、１％アガロースゲ
ル電気泳動により４.４kbのＤＮＡ断片をQIAquick Gel
Extraction Kit（キアゲン社）を用いて抽出し、２５μ
ｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このｐＴＦＣのＮｄｅＩ、
ＡｖａＩ断片と上記により調製した本発明のポリペプチ
ド（配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド）の構造遺伝子をTaKaRa DNA ligation kit ve
r.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行った。
この反応液を１０μl用いて大腸菌ＪＭ１０９コンピテ
ントセル（東洋紡）を形質転換し、１０μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、３７℃で
１晩培養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニー選ん
だ。この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養し、QIAprep8
Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプラスミドpTFCR
FRP-1を調製した（図２）。この本発明のポリペプチド
（配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド）構造遺伝子部分の塩基配列をアプライドバイオ
システムズ社モデル３７７ＤＮＡシーケンサーを用いて
確認した。プラスミドpTFCRFRP-1で大腸菌ＭＭ２９４
（ＤＥ３）を形質転換し、RFRP-1−ＣＳ２３融合タンパ
ク質発現株大腸菌（Escherichia coli）MM294(DE3)/pTF
CRFRP-1を得た。
【００５９】実施例３ 実施例２で得られた形質転換体を、５．０ｍｇ／Ｌのテ
トラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５
％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１Ｌを用い
て、２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培
養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培地
（１．６８％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸
２水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５
％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．
０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．００
０２５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カ
ザミノ酸）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３０
℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００
クレット単位になった時点で、イソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシドの最終濃度が１２ｍｇ／Ｌにな
るように添加し、さらに４時間培養を行った。培養終了
後、培養液を遠心分離し、約５００ｇの湿菌体を取得
し、−８０℃で凍結保存した。
【００６０】実施例４ 本発明のポリペプチド（配列番
号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）
の取得 実施例２で得た菌体５0０ｇに６Ｍ グアニジン塩酸塩、
０．２Ｍ トリス／ＨＣｌ（pＨ８.０）溶液１０００ml
を加え、約４時間攪拌した後、遠心分離（１００００rp
m、６０分）を行い、上澄液を０．６Ｍ アルギニン、
１ｍＭ ジチオトレイトール、５０mＭ トリス／ＨＣＬ
（pＨ８.０）２９Ｌで希釈した。一晩１０℃で静置した
後、濃塩酸でｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭ リン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したAF-Heparin Toyopearl
650Mカラム(１１．３ｃｍID×１３ｃｍL、東ソー)に通
液し、吸着、洗浄した後、５０ｍＭ リン酸緩衝液、２
ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０で溶出を行い、１０００ｍｌの
本発明のポリペプチド（配列番号：７で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド）−ＣＳ２３融合タンパク
質画分を得た。この溶出液をペリコンミニカセット（ミ
リポア社）で０．１Ｍ酢酸を加えながら濃縮を行い、本
発明のポリペプチド（配列番号：７で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチド）−ＣＳ２３融合タンパク質
の０．１Ｍ酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度６Ｍと
なるように尿素を添加した後、１−シアノ−４−ジメチ
ルアミノピリジニウム塩（ＤＭＡＰ−ＣＮ）445ｍｇを
加えて、室温で１５分間反応した。反応終了後、反応液
を１０％酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５
カラム(46mmID×600mmL、ファルマシア)に通液し、平衡
化に用いた１０％酢酸を６ｍｌ／ｍｉｎの流速で展開
し、Ｓ−シアノ化された本発明のポリペプチド（配列番
号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）
−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペ
リコンミニカセット（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行
い、本発明のポリペプチド（配列番号：７で表されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド）−ＣＳ２３融合タン
パク質の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度６Ｍとな
るように尿素を添加した後、さらに、３Ｍ濃度となるよ
うに２５％アンモニア水を加え、１５℃で１５分間反応
させた。反応終了後、酢酸でｐＨ６．０に調整し、本発
明のポリペプチド（配列番号：７で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチド）を得た。この反応液を３Ｍ尿
素を含む５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化
したＳＰ−５ＰＷ(５．５ｃｍID×３０ｃｍL、東ソー)
に通液し、吸着、洗浄した後、０−５０％Ｂ（Ｂ＝５０
ｍＭ ＭＥＳ緩衝液＋１Ｍ ＮａＣｌ＋３Ｍ尿素）の段階
勾配で溶出を行い、本発明のポリペプチド（配列番号：
７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）画分
を得た（溶出時間：６０分）。この本発明のポリペプチ
ド（配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド）画分を、さらに０．１％トリフルオロ酢酸
（TFA）で平衡化したＯＤＳ−１２０Ｔ(21.5mmID×300m
mL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、３０−６０
％Ｂ（Ｂ：８０％アセトニトリル／ ０．１％TFA）の段
階勾配で溶出を行い、本発明のポリペプチド（配列番
号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）
画分をプールした（溶出時間：４５分）後、凍結乾燥を
行い、本発明のポリペプチド（配列番号：７で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド）凍結乾燥粉末を得
た。 ａ）アミノ酸組成分析 得られた本発明のポリペプチド（配列番号：７で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド）のアミノ酸組成
をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid A
nalyzer）を用いて決定した(酸加水分解（６Ｎ 塩酸−
４％チオグリコール酸、１１０℃、２４，４８時間加水
分解）)。その結果、本発明のポリペプチド（配列番
号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）
のＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致し
た（表１）。
【００６１】
【表１】
【００６２】b)Ｎ末端アミノ酸配列分析 得られた本発明のポリペプチド（配列番号：７で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド）のＮ末端アミノ
酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイ
オシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて決定した(本
発明のポリペプチド（配列番号：７で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチド）１００ｐｍｏｌを用いて分
析を行った)。その結果、得られた本発明のポリペプチ
ド（配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド）はＤＮＡ塩基配列から予想されるＮ末端アミ
ノ酸配列と一致した（表２）。
【００６３】
【表２】
【００６４】ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析 得られた本発明のポリペプチド（配列番号：７で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド）のＣ末端アミノ
酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid
Analyzer）を用いて分析したが、Ｃ末端はアミド化さ
れているため、不検出であった。
【表３】
【００６５】実施例５ 実施例４で得られた本発明のポリペプチド（配列番号：
７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）を用
いて、ＷＯ００／２９４４１号公報の実施例１０に記載
の方法でｃＡＭＰ産生抑制活性を測定したところ、化学
合成したポリペプチド（配列番号：７で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド）と同等の活性を有するこ
とが確認された。
【００６６】
【配列表】 [SEQUENCE LISTING] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Method of Production for RFRP <130> P01-0262 <150> JP 2000-373125 <151> 2000-12-07 <160> 30 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 1 Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe 1 5 9 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Human <400> 2 agctttgcga atctgccgct gcgtttt 27 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 3 Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe 1 5 10 12 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Human <400> 4 atgccgcata gctttgcgaa tctgccgctg cgtttt 36 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 5 Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu 1 5 10 15 Pro Leu Arg Phe 20 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Human <400> 6 atgagcaccc cggcggtgaa taaaatgccg catagctttg cgaatctgcc gctgcgtttt 60 <210> 7 <211> 37 <212> PRT <213> Human <400> 7 Ser Leu Asn Phe Glu Glu Leu Lys Asp Trp Gly Pro Lys Asn Val Ile 1 5 10 15 Lys Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys Met Pro His Ser Phe Ala Asn 20 25 30 Leu Pro Leu Arg Phe 35 37 <210> 8 <211> 111 <212> DNA <213> Human <400> 8 agcctgaact ttgaagaact gaaagattgg ggtccgaaaa atgtgattaa aatgagcacc 60 ccggcggtga ataaaatgcc gcatagcttt gcgaatctgc cgctgcgttt t 111 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 9 Val Pro Asn Leu Pro Gln Arg Phe 1 5 8 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Human <400> 10 gttcctaacc tgccccaaag gttt 24 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Human <400> 11 Asn Met Glu Val Ser Leu Val Arg Arg Val Pro Asn Leu Pro Gln Arg 1 5 10 15 Phe 17 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Human <400> 12 aatatggagg tgagcctcgt gagacgtgtt cctaacctgc cccaaaggtt t 51 <210> 13 <211> 146 <212> PRT <213> Human <400> 13 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr 100 105 110 Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser 115 120 125 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 Lys Ser 145 146 <210> 14 <211> 432 <212> DNA <213> Human <400> 14 cccgaggatg gcggcagcgg cgccttcccg cccggccact tcaaggaccc caagcggctg 60 tactgcaaaa acgggggctt cttcctgcgc atccaccccg acggccgagt tgacggggtc 120 cgggagaaga gcgaccctca catcaagcta caacttcaag cagaagagag aggagttgtg 180 tctatcaaag gagtgagcgc taatcgttac ctggctatga aggaagatgg aagattacta 240 gcttctaagt ctgttacgga tgagtgtttc ttttttgaac gattggaatc taataactac 300 aatacttacc ggtcaaggaa atacaccagt tggtatgtgg cactgaaacg aactgggcag 360 tataaacttg gatccaaaac aggacctggg cagaaagcta tactttttct tccaatgtct 420 gctaagagct gc 432 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tatgagcctg aactttgaag aactgaaagat tggggtccga aaaatgtgat taaaatg 57 <210> 16 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 agcaccccgg cggtgaataa aatgccgcat agctttgcga atctgccgct gcgtttttgc 60 c 61 <210> 17 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ggtgctcatt ttaatcacat ttttcggacc ccaatctttc agttcttcaa agttcaggct 60 ca 62 <210> 18 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 tcggggcaaa aacgcagcgg cagattcgca aagctatgcgg cattttattc accgccgg 58 <210> 19 <211> 180 <212> PRT <213> Human <400> 19 Met Glu Ile Ile Ser Ser Lys Leu Phe Ile Leu Leu Thr Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Leu Leu Thr Ser Asn Ile Phe Cys Ala Asp Glu Leu Val Met 20 25 30 Ser Asn Leu His Ser Lys Glu Asn Tyr Asp Lys Tyr Ser Glu Pro Arg 35 40 45 Gly Tyr Pro Lys Gly Glu Arg Ser Leu Asn Phe Glu Glu Leu Lys Asp 50 55 60 Trp Gly Pro Lys Asn Val Ile Lys Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys 65 70 75 80 Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg Asn Val 85 90 95 Gln Glu Glu Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ala Asn Leu Pro Leu Arg Ser 100 105 110 Gly Arg Asn Met Glu Val Ser Leu Val Arg Arg Val Pro Asn Leu Pro 115 120 125 Gln Arg Phe Gly Arg Thr Thr Thr Ala Lys Ser Val Cys Arg Met Leu 130 135 140 Ser Asp Leu Cys Gln Gly Ser Met His Ser Pro Cys Ala Asn Asp Leu 145 150 155 160 Phe Tyr Ser Met Thr Cys Gln His Gln Glu Ile Gln Asn Pro Asp Gln 165 170 175 Lys Gln Ser Arg 180 <210> 20 <211> 540 <212> DNA <213> Human <400> 20 atggaaatta tttcatcaaa actattcatt ttattgactt tagccacttc aagcttgtta 60 acatcaaaca ttttttgtgc agatgaatta gtgatgtcca atcttcacag caaagaaaat 120 tatgacaaat attctgagcc tagaggatac ccaaaagggg aaagaagcct caattttgag 180 gaattaaaag attggggacc aaaaaatgtt attaagatga gtacacctgc agtcaataaa 240 atgccacact ccttcgccaa cttgccattg agatttggga ggaacgttca agaagaaaga 300 agtgctggag caacagccaa cctgcctctg agatctgga agaaatatgga ggtgagcctc 360 gtgagacgtg ttcctaacct gccccaaagg tttgggagaa caacaacagc caaaagtgtc 420 tgcaggatgc tgagtgattt gtgtcaagga tccatgcatt caccatgtgc caatgactta 480 ttttactcca tgacctgcca gcaccaagaa atccagaatc ccgatcaaaa acagtcaagg 540 <210> 21 <211> 196 <212> PRT <213> Human <400> 21 Met Glu Ile Ile Ser Ser Lys Leu Phe Ile Leu Leu Thr Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Leu Leu Thr Ser Asn Ile Phe Cys Ala Asp Glu Leu Val Met 20 25 30 Ser Asn Leu His Ser Lys Glu Asn Tyr Asp Lys Tyr Ser Glu Pro Arg 35 40 45 Gly Tyr Pro Lys Gly Glu Arg Ser Leu Asn Phe Glu Glu Leu Lys Asp 50 55 60 Trp Gly Pro Lys Asn Val Ile Lys Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys 65 70 75 80 Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg Asn Val 85 90 95 Gln Glu Glu Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ala Asn Leu Pro Leu Arg Ser 100 105 110 Gly Arg Asn Met Glu Val Ser Leu Val Arg Arg Val Pro Asn Leu Pro 115 120 125 Gln Arg Phe Gly Arg Thr Thr Thr Ala Lys Ser Val Cys Arg Met Leu 130 135 140 Ser Asp Leu Cys Gln Gly Ser Met His Ser Pro Cys Ala Asn Asp Leu 145 150 155 160 Phe Tyr Ser Met Thr Cys Gln His Gln Glu Ile Gln Asn Pro Asp Gln 165 170 175 Lys Gln Ser Arg Arg Leu Leu Phe Lys Lys Ile Asp Asp Ala Glu Leu 180 185 190 Lys Gln Glu Lys 195 <210> 22 <211> 588 <212> DNA <213> Human <400> 22 atggaaatta tttcatcaaa actattcatt ttattgactt tagccacttc aagcttgtta 60 acatcaaaca ttttttgtgc agatgaatta gtgatgtcca atcttcacag caaagaaaat 120 tatgacaaat attctgagcc tagaggatac ccaaaagggg aaagaagcct caattttgag 180 gaattaaaag attggggacc aaaaaatgtt attaagatga gtacacctgc agtcaataaa 240 atgccacact ccttcgccaa cttgccattg agatttggga ggaacgttca agaagaaaga 300 agtgctggag caacagccaa cctgcctctg agatctggaa gaaatatgga ggtgagcctc 360 gtgagacgtg ttcctaacct gccccaaagg tttgggagaa caacaacagc caaaagtgtc 420 tgcaggatgc tgagtgattt gtgtcaagga tccatgcatt caccatgtgc caatgactta 480 ttttactcca tgacctgcca gcaccaagaa atccagaatc ccgatcaaaa acagtcaagg 540 agactgctat tcaagaaaat agatgatgca gaattgaaac aagaaaaa 588 <210> 23 <211> 196 <212> PRT <213> Bovine <400> 23 Met Glu Ile Ile Ser Leu Lys Arg Phe Ile Leu Leu Met Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Leu Leu Thr Ser Asn Ile Phe Cys Thr Asp Glu Ser Arg Met 20 25 30 Pro Asn Leu Tyr Ser Lys Lys Asn Tyr Asp Lys Tyr Ser Glu Pro Arg 35 40 45 Gly Asp Leu Gly Trp Glu Lys Glu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Glu Val 50 55 60 Lys Asp Trp Ala Pro Lys Ile Lys Met Asn Lys Pro Val Val Asn Lys 65 70 75 80 Met Pro Pro Ser Ala Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg Asn Met 85 90 95 Glu Glu Glu Arg Ser Thr Arg Ala Met Ala His Leu Pro Leu Arg Leu 100 105 110 Gly Lys Asn Arg Glu Asp Ser Leu Ser Arg Trp Val Pro Asn Leu Pro 115 120 125 Gln Arg Phe Gly Arg Thr Thr Thr Ala Lys Ser Ile Thr Lys Thr Leu 130 135 140 Ser Asn Leu Leu Gln Gln Ser Met His Ser Pro Ser Thr Asn Gly Leu 145 150 155 160 Leu Tyr Ser Met Ala Cys Gln Pro Gln Glu Ile Gln Asn Pro Gly Gln 165 170 175 Lys Asn Leu Arg Arg Arg Gly Phe Gln Lys Ile Asp Asp Ala Glu Leu 180 185 190 Lys Gln Glu Lys 195 <210> 24 <211> 588 <212> DNA <213> Bovine <400> 24 atggaaatta tttcattaaa acgattcatt ttattgatgt tagccacttc aagcttgtta 60 acatcaaaca tcttctgcac agacgaatca aggatgccca atctttacag caaaaagaat 120 tatgacaaat attccgagcc tagaggagat ctaggctggg agaaagaaag aagtcttact 180 tttgaagaag taaaagattg ggctccaaaa attaagatga ataaacctgt agtcaacaaa 240 atgccacctt ctgcagccaa cctgccactg agatttggga ggaacatgga agaagaaagg 300 agcactaggg cgatggccca cctgcctctg agactcggaa aaaatagaga ggacagcctc 360 tccagatggg tcccaaatct gccccagagg tttggaagaa caacaacagc caaaagcatt 420 accaagaccc tgagtaattt gctccagcag tccatgcatt caccatctac caatgggcta 480 ctctactcca tggcctgcca gccccaagaa atccagaatc ctggtcaaaa gaacctaagg 540 agacggggat tccagaaaat agatgatgca gaattgaaac aagaaaaa 588 <210> 25 <211> 188 <212> PRT <213> Mouse <400> 25 Met Glu Ile Ile Ser Leu Lys Arg Phe Ile Leu Leu Thr Val Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Thr Ser Asn Thr Phe Cys Thr Asp Glu Phe Met Met 20 25 30 Pro His Phe His Ser Lys Glu Gly Asp Gly Lys Tyr Ser Gln Leu Arg 35 40 45 Gly Ile Pro Lys Gly Glu Lys Glu Arg Ser Val Ser Phe Gln Glu Leu 50 55 60 Lys Asp Trp Gly Ala Lys Asn Val Ile Lys Met Ser Pro Ala Pro Ala 65 70 75 80 Asn Lys Val Pro His Ser Ala Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg 85 90 95 Thr Ile Asp Glu Lys Arg Ser Pro Ala Ala Arg Val Asn Met Glu Ala 100 105 110 Gly Thr Arg Ser His Phe Pro Ser Leu Pro Gln Arg Phe Gly Arg Thr 115 120 125 Thr Ala Arg Ser Pro Lys Thr Pro Ala Asp Leu Pro Gln Lys Pro Leu 130 135 140 His Ser Leu Gly Ser Ser Glu Leu Leu Tyr Val Met Ile Cys Gln His 145 150 155 160 Gln Glu Ile Gln Ser Pro Gly Gly Lys Arg Thr Arg Arg Gly Ala Phe 165 170 175 Val Glu Thr Asp Asp Ala Glu Arg Lys Pro Glu Lys 180 185 <210> 26 <211> 564 <212> DNA <213> Mouse <400> 26 atggaaatta tttcattaaa acgattcatt ttattgactg tggcaacttc aagcttctta 60 acatcaaaca ccttctgtac agatgagttc atgatgcctc attttcacag caaagaaggt 120 gacggaaaat actcccagct gagaggaatc ccaaaagggg aaaaggaaag aagtgtcagt 180 tttcaagaac taaaagattg gggggcaaag aatgttatta agatgagtcc agcccctgcc 240 aacaaagtgc cccactcagc agccaacctg cccctgagat ttggaaggac catagatgag 300 aaaagaagcc ccgcagcacg ggtcaacatg gaggcaggga ccaggagcca tttccccagc 360 ctgccccaaa ggtttgggag aacaacagcc agaagcccca agacacccgc tgatttgcca 420 cagaaacccc tgcactcact gggctccagc gagttgctct acgtcatgat ctgccagcac 480 caagaaattc agagtcctgg tggaaagcga acgaggagag gagcgtttgt ggaaacagat 540 gatgcagaaa ggaaaccaga aaaa 564 <210> 27 <211> 203 <212> PRT <213> Rat <400> 27 Met Glu Ile Ile Ser Ser Lys Arg Phe Ile Leu Leu Thr Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Thr Ser Asn Thr Leu Cys Ser Asp Glu Leu Met Met 20 25 30 Pro His Phe His Ser Lys Glu Gly Tyr Gly Lys Tyr Tyr Gln Leu Arg 35 40 45 Gly Ile Pro Lys Gly Val Lys Glu Arg Ser Val Thr Phe Gln Glu Leu 50 55 60 Lys Asp Trp Gly Ala Lys Lys Asp Ile Lys Met Ser Pro Ala Pro Ala 65 70 75 80 Asn Lys Val Pro His Ser Ala Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg 85 90 95 Asn Ile Glu Asp Arg Arg Ser Pro Arg Ala Arg Ala Asn Met Glu Ala 100 105 110 Gly Thr Met Ser His Phe Pro Ser Leu Pro Gln Arg Phe Gly Arg Thr 115 120 125 Thr Ala Arg Arg Ile Thr Lys Thr Leu Ala Gly Leu Pro Gln Lys Ser 130 135 140 Leu His Ser Leu Ala Ser Ser Glu Leu Leu Tyr Ala Met Thr Arg Gln 145 150 155 160 His Gln Glu Ile Gln Ser Pro Gly Gln Glu Gln Pro Arg Lys Arg Val 165 170 175 Phe Thr Glu Thr Asp Asp Ala Glu Arg Lys Gln Glu Lys Ile Gly Asn 180 185 190 Leu Gln Pro Val Leu Gln Gly Ala Met Lys Leu 195 200 <210> 28 <211> 609 <212> DNA <213> Rat <400> 28 atggaaatta tttcatcaaa gcgattcatt ttattgactt tagcaacttc aagcttctta 60 acttcaaaca ccctttgttc agatgaatta atgatgcccc attttcacag caaagaaggt 120 tatggaaaat attaccagct gagaggaatc ccaaaagggg taaaggaaag aagtgtcact 180 tttcaagaac tcaaagattg gggggcaaag aaagatatta agatgagtcc agcccctgcc 240 aacaaagtgc cccactcagc agccaacctt cccctgaggt ttgggaggaa catagaagac 300 agaagaagcc ccagggcacg ggccaacatg gaggcaggga ccatgagcca ttttcccagc 360 ctgccccaaa ggtttgggag aacaacagcc agacgcatca ccaagacact ggctggtttg 420 ccccagaaat ccctgcactc cctggcctcc agtgaattgc tctatgccat gacccgccag 480 catcaagaaa ttcagagtcc tggtcaagag caacctagga aacgggtgtt cacggaaaca 540 gatgatgcag aaaggaaaca agaaaaaata ggaaacctcc agccagtcct tcaaggggct 600 atgaagctg 609 <210> 29 <211> 203 <212> PRT <213> Rat <400> 29 Met Glu Ile Ile Ser Ser Lys Arg Phe Ile Leu Leu Thr Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Thr Ser Asn Thr Leu Cys Ser Asp Glu Leu Met Met 20 25 30 Pro His Phe His Ser Lys Glu Gly Tyr Gly Lys Tyr Tyr Gln Leu Arg 35 40 45 Gly Ile Pro Lys Gly Val Lys Glu Arg Ser Val Thr Phe Gln Glu Leu 50 55 60 Lys Asp Trp Gly Ala Lys Lys Asp Ile Lys Met Ser Pro Ala Pro Ala 65 70 75 80 Asn Lys Val Pro His Ser Ala Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg 85 90 95 Asn Ile Glu Asp Arg Arg Ser Pro Arg Ala Arg Ala Asn Met Glu Ala 100 105 110 Gly Thr Met Ser His Phe Pro Ser Leu Pro Gln Arg Phe Gly Arg Thr 115 120 125 Thr Ala Arg Arg Ile Thr Lys Thr Leu Ala Gly Leu Pro Gln Lys Ser 130 135 140 Leu His Ser Leu Ala Ser Ser Glu Ser Leu Tyr Ala Met Thr Arg Gln 145 150 155 160 His Gln Glu Ile Gln Ser Pro Gly Gln Glu Gln Pro Arg Lys Arg Val 165 170 175 Phe Thr Glu Thr Asp Asp Ala Glu Arg Lys Gln Glu Lys Ile Gly Asn 180 185 190 Leu Gln Pro Val Leu Gln Gly Ala Met Lys Leu 195 200 <210> 30 <211> 609 <212> DNA <213> Rat <400> 30 atggaaatta tttcatcaaa gcgattcatt ttattgactt tagcaacttc aagcttctta 60 acttcaaaca ccctttgttc agatgaatta atgatgcccc attttcacag caaagaaggt 120 tatggaaaat attaccagct gagaggaatc ccaaaagggg taaaggaaag aagtgtcact 180 tttcaagaac tcaaagattg gggggcaaag aaagatatta agatgagtcc agcccctgcc 240 aacaaagtgc cccactcagc agccaacctt cccctgaggt ttgggaggaa catagaagac 300 agaagaagcc ccagggcacg ggccaacatg gaggcaggga ccatgagcca ttttcccagc 360 ctgccccaaa ggtttgggag aacaacagcc agacgcatca ccaagacact ggctggtttg 420 ccccagaaat ccctgcactc cctggcctcc agtgaatcgc tctatgccat gacccgccag 480 catcaagaaa ttcagagtcc tggtcaagag caacctagga aacgggtgtt cacggaaaca 540 gatgatgcag aaaggaaaca agaaaaaata ggaaacctcc agccagtcct tcaaggggct 600 atgaagctg 609
【００６７】
【発明の効果】本発明の製造方法を用いると、プロラク
チン分泌不全またはプロラクチン分泌過剰に関係する各
種疾患の予防および治療薬などとして用いることができ
るポリペプチドを工業的かつ大量に製造することができ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の製造方法における反応メカニズムを示
す。
【図２】実施例２で得られたプラスミドｐＴＦＣＲＦＲ
Ｐ−１の構築図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ａ６１Ｐ 5/14 Ｃ１２Ｐ 21/02 13/12 // Ａ６１Ｋ 38/00 15/00 Ａ６１Ｐ 5/14 １７１ 13/12 15/10 15/00 15/12 １７１ 15/14 15/10 19/10 15/12 35/00 15/14 37/02 19/10 43/00 １１１ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/02 5/00 Ａ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 山田 隆央 大阪府松原市一津屋４丁目３番26号 (72)発明者 西村 紀 兵庫県川西市大和西１丁目54番地の16 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA80 CA05 CA07 HA17 4B064 AG01 CA19 CC24 CE10 DA01 4B065 AA26X AB01 CA24 CA44 4C084 AA06 AA07 BA04 BA31 CA59 DB70 MA55 MA66 ZA811 ZA861 ZA971 ZB071 ZB261 ZC021 ZC611 ZC631 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA40 EA20 FA15 FA74

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｎ末端にシステインを有するタンパク質
    またはポリペプチドのＮ末端に、Ｎ末端に酸化されてい
    てもよいメチオニン残基を有していてもよい配列番号：
    １９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２
    ５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるア
    ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドを連
    結した融合タンパク質またはポリペプチドをシステイン
    残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すこと
    を特徴とする配列番号：１９、配列番号：２１、配列番
    号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配列
    番号：２９を含有するポリペプチドの部分ペプチドまた
    はその塩の製造法。
  2. 【請求項２】 Ｎ末端にシステインを有するタンパク質
    またはポリペプチドのＮ末端に、Ｎ末端にメチオニン残
    基を有していてもよい配列番号：１９、配列番号：２
    １、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７
    または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有す
    るポリペプチドの部分ペプチドを連結した融合タンパク
    質またはポリペプチドをコードするＤＮＡを有するベク
    ターを保持する形質転換体を培養して融合タンパク質ま
    たはポリペプチドを発現させ、発現された融合タンパク
    質またはポリペプチドをシステイン残基のアミノ基側の
    ペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とするＮ末端
    にメチオニン残基を有していてもよい配列番号：１９、
    配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配
    列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸
    配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドまたはその
    塩の製造法。
  3. 【請求項３】 切断反応がＳ−シアノ化反応、次いでア
    ンモノリシスまたは加水分解反応に付す反応である請求
    項１または２記載の製造法。
  4. 【請求項４】 配列番号：１９、配列番号：２１、配列
    番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配
    列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
    プチドの部分ペプチドが、（１）配列番号：１９で表さ
    れるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目
    （Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０
    １番目（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目
    （Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）、第１１５番目
    （Ａｓｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）、第１２４番目
    （Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜１
    １２番目（Ｓｅｒ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１
    番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、
    （２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６
    番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目
    （Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜
    第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１
    ２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番
    目（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
    （Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
    ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
    番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
    を含有するペプチド、（３）配列番号：２３で表される
    アミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）また
    は第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ
    酸配列を含有するペプチド、（４）配列番号：２５で表
    されるアミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番
    目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖａｌ）〜第９４番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）
    または第１１８番目（Ｐｈｅ）〜第１２５番目（Ｐｈ
    ｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、または（５）
    配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番目
    （Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
    （Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
    有するペプチドである請求項１または２記載の製造法。
  5. 【請求項５】 配列番号：１９、配列番号：２１、配列
    番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配
    列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
    プチドの部分ペプチドが、配列番号：１または配列番
    号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
    である請求項１または２記載の製造法。
  6. 【請求項６】 配列番号：１または配列番号：９で表さ
    れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
    号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、
    配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸
    配列を有するポリペプチドである請求項５記載の製造
    法。
  7. 【請求項７】 Ｎ末端にシステインを有するタンパク質
    またはポリペプチドのＮ末端に、Ｎ末端にメチオニン残
    基を有していてもよい配列番号：１９、配列番号：２
    １、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７
    または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有す
    るポリペプチドの部分ペプチドを連結した融合タンパク
    質もしくはポリペプチドまたはその塩。
  8. 【請求項８】 配列番号：１９、配列番号：２１、配列
    番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配
    列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
    プチドの部分ペプチドが、（１）配列番号：１９で表さ
    れるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目
    （Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０
    １番目（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目
    （Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）、第１１５番目
    （Ａｓｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）、第１２４番目
    （Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜１
    １２番目（Ｓｅｒ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１
    番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、
    （２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６
    番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目
    （Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜
    第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１
    ２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番
    目（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
    （Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
    ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
    番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
    を含有するペプチド、（３）配列番号：２３で表される
    アミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）また
    は第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ
    酸配列を含有するペプチド、（４）配列番号：２５で表
    されるアミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番
    目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖａｌ）〜第９４番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）
    または第１１８番目（Ｐｈｅ）〜第１２５番目（Ｐｈ
    ｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、または（５）
    配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番目
    （Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
    （Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
    有するペプチドである請求項７記載のポリペプチドまた
    はその塩。
  9. 【請求項９】 配列番号：１９、配列番号：２１、配列
    番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配
    列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
    プチドの部分ペプチドが、配列番号：１または配列番
    号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
    である請求項７記載のポリペプチドまたはその塩。
  10. 【請求項１０】 配列番号：１または配列番号：９で表
    されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
    号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、
    配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸
    配列を有するポリペプチドである請求項９記載のポリペ
    プチドまたはその塩。
  11. 【請求項１１】 請求項７記載の融合タンパク質または
    ポリペプチドをコードするＤＮＡを有するベクター。
  12. 【請求項１２】 請求項１１記載のベクターで形質転換
    された形質転換体。
  13. 【請求項１３】 Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオ
    ニン残基を有する配列番号：１９、配列番号：２１、配
    列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
    配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドの部分ペプチドまたはその塩とα−ジケトン類
    を反応させた後、加水分解することを特徴とする該メチ
    オニン残基の除去方法。
  14. 【請求項１４】 Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオ
    ニン残基を有する配列番号：１９、配列番号：２１、配
    列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
    配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドの部分ペプチドが遺伝子工学的に製造された配
    列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列
    番号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表
    されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプ
    チドであって、該酸化されていてもよいメチオニン残基
    のＣ末端側に隣接するアミノ酸残基がイソロイシン残
    基、バリン残基、システイン残基、スレオニン残基、ア
    スパラギン酸残基、リジン残基、ロイシン残基、アルギ
    ニン残基、アスパラギン残基、メチオニン残基、フェニ
    ルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、
    グルタミン酸残基、グルタミン残基またはヒスチジン残
    基である請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 配列番号：１９、配列番号：２１、配
    列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
    配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドの部分ペプチドが、（１）配列番号：１９で表
    されるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番
    目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）、第９
    ５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）、第１１５
    番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）、第１２４番
    目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜１
    １２番目（Ｓｅｒ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１
    番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、
    （２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６
    番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目
    （Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜
    第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１
    ２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番
    目（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
    （Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
    ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
    番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
    を含有するペプチド、（３）配列番号：２３で表される
    アミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）また
    は第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ
    酸配列を含有するペプチド、（４）配列番号：２５で表
    されるアミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番
    目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖａｌ）〜第９４番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）
    または第１１８番目（Ｐｈｅ）〜第１２５番目（Ｐｈ
    ｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、または（５）
    配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番目
    （Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
    （Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
    有するペプチドである請求項１３または１４記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】 配列番号：１９、配列番号：２１、配
    列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
    配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドの部分ペプチドが、配列番号：１または配列番
    号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
    である請求項１３または１４記載の製造法。
  17. 【請求項１７】 配列番号：１または配列番号：９で表
    されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
    号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、
    配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸
    配列を有するポリペプチドである請求項１６記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】 遷移金属イオンの存在下にα−ジケト
    ン類を反応させることを特徴とする請求項１３記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】 塩基の存在下にα−ジケトン類を反応
    させることを特徴とする請求項１３記載の方法。
  20. 【請求項２０】 遷移金属イオンおよび塩基の存在下に
    α−ジケトン類を反応させることを特徴とする請求項１
    ３記載の方法。
  21. 【請求項２１】 α−ジケトン類がグリオキシル酸また
    はその塩である請求項１３記載の方法。
  22. 【請求項２２】 遷移金属イオンが銅イオンである請求
    項１８記載の方法。
  23. 【請求項２３】 塩基がピリジンである請求項１９記載
    の方法。
  24. 【請求項２４】 塩基を用いて加水分解することを特徴
    とする請求項１３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 塩基がアミン類である請求項２４記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】 塩基がジアミン類またはチオもしくは
    セレノセミカルバジド類である請求項２４記載の方法。
  27. 【請求項２７】 ジアミン類がｏ−フェニレンジアミン
    または３，４−ジアミノ安息香酸である請求項２６記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】 遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端にメ
    チオニンが付加した配列番号：１９、配列番号：２１、
    配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７また
    は配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポ
    リペプチドの部分ペプチドまたはその塩とグリオキシル
    酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反
    応させた後、ｏ−フェニレンジアミンまたは３，４−ジ
    アミノ安息香酸と反応させることを特徴とする配列番
    号：１もしくは配列番号：９で表されるアミノ酸配列を
    含有するポリペプチドまたはその塩の製造法。
  29. 【請求項２９】 配列番号：１９、配列番号：２１、配
    列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
    配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドの部分ペプチドが、（１）配列番号：１９で表
    されるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番
    目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）、第９
    ５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）、第１１５
    番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）、第１２４番
    目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜１
    １２番目（Ｓｅｒ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１
    番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、
    （２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６
    番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目
    （Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜
    第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１
    ２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番
    目（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
    （Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
    ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
    番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
    を含有するペプチド、（３）配列番号：２３で表される
    アミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）また
    は第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ
    酸配列を含有するペプチド、（４）配列番号：２５で表
    されるアミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番
    目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖａｌ）〜第９４番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）
    または第１１８番目（Ｐｈｅ）〜第１２５番目（Ｐｈ
    ｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、または（５）
    配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番目
    （Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
    （Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
    有するペプチドである請求項２８記載の製造法。
  30. 【請求項３０】 配列番号：１９、配列番号：２１、配
    列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
    配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドの部分ペプチドが、配列番号：１または配列番
    号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
    である請求項２８記載の製造法。
  31. 【請求項３１】 配列番号：１または配列番号：９で表
    されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
    号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、
    配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸
    配列を有するポリペプチドである請求項３０記載の製造
    法。
  32. 【請求項３２】 式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X〔式
    中、ｍは０ないし２の整数を、Ｘは配列番号：１９、配
    列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列
    番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配
    列で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部
    分ペプチドのペプチド鎖を示す。〕で表される化合物ま
    たはその塩。
  33. 【請求項３３】 配列番号：１９、配列番号：２１、配
    列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
    配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドの部分ペプチドが、（１）配列番号：１９で表
    されるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番
    目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）、第９
    ５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）、第１１５
    番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）、第１２４番
    目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜１
    １２番目（Ｓｅｒ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１
    番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、
    （２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６
    番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目
    （Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜
    第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１
    ２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番
    目（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
    （Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
    ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
    番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
    を含有するペプチド、（３）配列番号：２３で表される
    アミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）また
    は第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ
    酸配列を含有するペプチド、（４）配列番号：２５で表
    されるアミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番
    目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖａｌ）〜第９４番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）
    または第１１８番目（Ｐｈｅ）〜第１２５番目（Ｐｈ
    ｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、または（５）
    配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番目
    （Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
    （Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
    有するペプチドである請求項３２記載の化合物またはそ
    の塩。
  34. 【請求項３４】配列番号：１９、配列番号：２１、配列
    番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または配
    列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
    プチドの部分ペプチドが、配列番号：１または配列番
    号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
    である請求項３２記載の化合物またはその塩。
  35. 【請求項３５】 配列番号：１または配列番号：９で表
    されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
    号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、
    配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸
    配列を有するポリペプチドである請求項３４記載の化合
    物またはその塩。
  36. 【請求項３６】 請求項３２記載の化合物を加水分解す
    ることを特徴とする配列番号：１９、配列番号：２１、
    配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７また
    は配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポ
    リペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造法。
  37. 【請求項３７】 Ｎ末端にシステインを有するタンパク
    質またはポリペプチドのＮ末端に、Ｎ末端にメチオニン
    残基を有するで表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
    プチドを連結した融合タンパク質またはポリペプチドを
    システイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応
    に付し、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
    を有するで表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
    ドまたはその塩を得、さらに、該Ｎ末端に酸化されてい
    てもよいメチオニン残基を有するで表されるアミノ酸配
    列を含有するポリペプチドまたはその塩とα−ジケトン
    類を反応させた後、加水分解することを特徴とするで表
    されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその
    塩の製造法。
  38. 【請求項３８】 配列番号：１９、配列番号：２１、配
    列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
    配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドの部分ペプチドが、（１）配列番号：１９で表
    されるアミノ酸配列の第５６番目（Ｓｅｒ）〜第９２番
    目（Ｐｈｅ）、第７３番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）、第９
    ５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｓｅｒ）、第１１５
    番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目（Ｐｈｅ）、第１２４番
    目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜１
    １２番目（Ｓｅｒ）または第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１
    番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、
    （２）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第５６
    番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第７３番目
    （Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８１番目（Ｍｅ
    ｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、第８４番目（Ｓｅｒ）〜
    第９２番目（Ｐｈｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜１１
    ２番目（Ｓｅｒ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番
    目（Ｓｅｒ）、第１１５番目（Ａｓｎ）〜第１３１番目
    （Ｐｈｅ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐ
    ｈｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）、
    第１番目（Ｍｅｔ）〜１１２番目（Ｓｅｒ）または第１
    番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列
    を含有するペプチド、（３）配列番号：２３で表される
    アミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９２番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１０１番目（Ｓｅｒ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第９５番目（Ａｓｎ）〜第１１２番目（Ｌｅ
    ｕ）、第１２４番目（Ｖａｌ）〜１３１番目（Ｐｈ
    ｅ）、第１番目（Ｍｅｔ）〜第９２番目（Ｐｈｅ）また
    は第１番目（Ｍｅｔ）〜１３１番目（Ｐｈｅ）のアミノ
    酸配列を含有するペプチド、（４）配列番号：２５で表
    されるアミノ酸配列の第５８番目（Ｓｅｒ）〜第９４番
    目（Ｐｈｅ）、第８３番目（Ｖａｌ）〜第９４番目（Ｐ
    ｈｅ）、第８４番目（Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）
    または第１１８番目（Ｐｈｅ）〜第１２５番目（Ｐｈ
    ｅ）のアミノ酸配列を含有するペプチド、または（５）
    配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第５８番目
    （Ｓｅｒ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）または第８４番目
    （Ｐｒｏ）〜第９４番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列を含
    有するペプチドである請求項３７記載の製造法。
  39. 【請求項３９】 配列番号：１９、配列番号：２１、配
    列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７または
    配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドの部分ペプチドが、配列番号：１または配列番
    号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
    である請求項３７記載の製造法。
  40. 【請求項４０】 配列番号：１または配列番号：９で表
    されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
    号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、
    配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸
    配列を有するポリペプチドである請求項３９記載の製造
    法。
JP2001372444A 2000-12-07 2001-12-06 Ｒｆｒｐの製造法 Withdrawn JP2002325585A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001372444A JP2002325585A (ja) 2000-12-07 2001-12-06 Ｒｆｒｐの製造法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000373125 2000-12-07
JP2000-373125 2000-12-07
JP2001372444A JP2002325585A (ja) 2000-12-07 2001-12-06 Ｒｆｒｐの製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002325585A true JP2002325585A (ja) 2002-11-12
JP2002325585A5 JP2002325585A5 (ja) 2005-05-19

Family

ID=26605437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001372444A Withdrawn JP2002325585A (ja) 2000-12-07 2001-12-06 Ｒｆｒｐの製造法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2002325585A (ja)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6258561B1 (en) Method of producing a 19P2 ligand
US6838259B2 (en) Process for producing kiss-1 peptide
JP2001008697A (ja) Ｅ．コリでの非融合タンパク質の調製方法
KR100599419B1 (ko) 펩티드의 제조법
JPH05271279A (ja) ヒト副甲状腺ホルモンムテインおよびその製造法
JPH0788398B2 (ja) 新規生理活性ポリペプチドおよびその製造法
US20110092424A1 (en) Production of glucagon like peptide 2 and analogs
WO2003084983A1 (fr) Procede de production d&#39;un peptide modifie
EP1466976A1 (en) PROCESS FOR PRODUCING KiSS-1 PEPTIDE
KR101081814B1 (ko) ＬＰｃｉｎ－Ⅰ펩타이드 또는 ＬＰｃｉｎ－Ⅱ 펩타이드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 펩타이드의 대량생산방법
CA2485587A1 (en) Muteins of placental growth factor type 1, preparation method and application thereof
JPH089639B2 (ja) Ｃ末端アミド化ペプチドの前駆体およびその製造法
JP2002325585A (ja) Ｒｆｒｐの製造法
US20040029215A1 (en) Process for producing rfrp
WO2000020439A1 (fr) Procede d&#39;elimination de methionine n-terminale
EP1138772A1 (en) Process for producing apelin
JP2000228991A (ja) アペリンの製造法
JP2004002378A (ja) 修飾ペプチドの製造方法
JP2001231581A (ja) ＫｉＳＳ−１ペプチドの製造法
JP2003265191A (ja) ＫｉＳＳ−１ペプチドの製造法
JPH1171396A (ja) １９ｐ２リガンドの製造法
宋雨遅 Efficient recombinant production of mouse-derived cryptdin family peptides by a novel facilitation strategy for inclusion body formation
JP4475707B2 (ja) Ｎ末端メチオニンの除去方法
JP3352713B2 (ja) ペプチドの製造法
JP2003009867A (ja) Ｇｐｒ８に対するリガンドポリペプチドの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040709

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20040709

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20060201