KR20080012437A

KR20080012437A - 세포막투과 전달 펩타이드 및 이를 포함하는 생물제제

Info

Publication number: KR20080012437A
Application number: KR1020060073238A
Authority: KR
Inventors: 정지형; 장양수
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2006-08-03
Filing date: 2006-08-03
Publication date: 2008-02-12
Also published as: WO2008016276A1; JP4960454B2; KR100843634B1; US20090269842A1; US7994148B2; JP2009545312A

Abstract

본 발명은 목적 단백질을 세포내로 용이하게 전달할 수 있는 인간 유래 세포막투과 전달 펩타이드와 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 등에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 유래 G 단백질 알파 12 단백질의 아미노산 서열 중 특정 부위의 아미노산 11개를 포함하고 있는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 세포막투과 전달 펩타이드와 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 등에 관한 것이다. 본 발명의 세포막투과 전달 펩타이드는 세포 내로 효율적으로 전달될 수 있으므로, 단백질, 핵산, 약물 등을 포함하는 다양한 물질들을 세포내로 전달하는데 유용하게 사용될 수 있다.

세포막투과 전달 펩타이드, 단백질 전달, G 단백질

Description

세포막투과 전달 펩타이드 및 이를 포함하는 생물제제{Transmembrane Delivery Peptide and Bio-material Comprising the Same}

도 1은 GNP-TDP 펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 57 bp 길이의 상보적 DNA 서열을 어닐링(annealing) 한 후 이를 증폭하여 얻은 DNA 절편을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 2는 pET28a 벡터에 GNP-TDP를 코딩하는 절편을 삽입하여 pGNP 벡터를 제조하는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 3은 EGFP (enhanced green fluorescent protein)를 코딩하는 DNA를 pGNP 벡터에 삽입하여 pGNP-EGFP 벡터를 제조하는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 4는 pGNP-EGFP 플라스미드를 대장균 균주에 형질전환시켜 배양하고 IPTG 처리 후 시간대별로 샘플링한 후, 과발현된 GNP-EGFP 재조합 단백질을 포함한 세포 추출물을 SDS-폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤에서 전기영동한 결과를 보여주는 사진이다.

도 5는 대장균 균주에서 과발현된 GNP-EGFP 재조합 단백질을 Ni-NTA 칼럼 크로마토그래피와 Q-세파로즈(sepharose) 칼럼 크로마토그래피를 통한 순수 정제 과정에서 각각의 시료를 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동한 결과를 보여주는 사진이다.

레인 M ; 단백질 마커, 레인 1 ; IPTG 유도 전 시료,

레인 2 ; IPTG 유도 4시간 후 시료, 레인 3 ; 세포 파쇄물의 상등액 시료,

레인 4 ; Ni-NTA 칼럼 크로마토그래피 시료,

레인 5 ; Q-세파로즈 칼럼 크로마토그래피 시료,

레인 6 ; PD-10 탈염 칼럼 시료

도 6은 순수 정제된 재조합 단백질 GNP-EGFP를 동물 세포주 H9c2에 단백질 농도별 (A) 또는 시간별 (B)로 처리한 후 세포 내로 전달된 단백질을 확인하기 위해 세포를 파쇄하고 웨스턴 블롯(Western blot)으로 분석한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

도 7은 순수 정제된 재조합 단백질 GNP-EGFP을 동물 세포주 H9c2에 처리하고 세포 내로 전달된 단백질을 유세포 분석기를 사용하여 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 8은 순수 정제된 재조합 단백질 GNP-EGFP을 동물 세포주 H9c2에 처리하고 세포 내로 전달된 단백질을 형광현미경을 사용하여 분석한 사진이다.

본 발명은 세포막투과 전달 펩타이드(transmembrane delivery peptide, 이하 "TDP"라 약칭함)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단백질, 핵산, 약물 등과 같은 생체 기능성 물질의 세포내 전달에 유용하게 사용될 수 있는 것으로서, 인간 G 단백질(guanine nucleotide-binding protein)로부터 유래된 세포막투과 전달 펩타이드에 관한 것이다.

PTD (protein transduction domain)로 불려지는 단백질 전달 도메인은 1990년대 초반에 몇몇 단백질의 일부가 살아있는 세포에서 세포막을 가로질러 세포 안으로 들어갈 수 있다는 사실이 밝혀지면서 단백질의 세포 내 작용 기전 연구나 단백질을 임상치료제로 응용하기 위한 효과적인 기술로 사용될 수 있음이 알려져 있다(Derossi et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 10444-10450). 특히 이러한 단백질 전달 도메인은 단백질과 같은 거대 분자들 이외에도 핵산이나 리포좀 등의 물질을 세포 내로 전달하는 것도 가능하다(Lewin et al., 2000, Nature Biotech., 18, 410-414; Torchilin, 2002, Cell. Mol. Biol. Lett., 7, 265-267).

현재까지 알려진 몇 가지 단백질 전달 도메인으로는 HIV-1 유래 TAT 단백질의 염기성 도메인(basic domain) 유래 펩타이드(TAT), 초파리(Drosophila) 유래 Antennapedia의 호메오도메인(homeodomain)(Antp), HSV 유래 전사 인자 (VP22)와 합성 라이신/알기닌 펩타이드 등이 있다(Wadia and Dowdy, 2003, Curr. Protein Pept. Sci., 4, 97-104). 이 가운데 가장 많이 연구가 된 TAT 펩타이드는 TAT 단백질의 아미노산 서열 중 47번에서 57번의 총 11개의 염기성 아미노산 도메인으로 구성되어 있으며(YGRKKRRQRRR, 서열번호 7), 상기 TAT 펩타이드만으로도 세포막을 홀로 혹은 다른 단백질과 융합(fusion)된 상태로 전달될 수 있음이 밝혀졌다(Vives et al., 1997, J. Biol. Chem., 272, 16010-16017). 또한, TAT-PTD는 분자량 10 kDa에서 120 kDa까지 크기에 관계없이 다양한 단백질을 세포내로 전달할 수 있다(Fawell et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 664-668; Nagahara et al., 1998, Nature Med., 4, 1449-1452). 더욱이, TAT-PTD와 융합된 단백질들은 실제 진핵 세포들 안으로 전달될 수 있을 뿐만 아니라 세포 내에서 각각의 단백질 본래의 생물학적 기능을 갖고 세포내에서 기능을 하는 것으로 확인되었으며, 마우스 등의 동물 모델을 이용한 실험에서도 동일한 결과가 보고되었다(Asoh et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 17107-17112; Cao et al., 2002, J. Neurosci., 22, 5423-5431).

단백질 전달 도메인에 의한 세포내 단백질의 전달은 기존에 알려진 수용체(receptor), 트랜스포터 혹은 엔도좀을 통한 방법과는 관계없이 이루어지는 독립적인 기작으로서, 알기닌 혹은 라이신과 같은 아미노산에 의한 특정한 구조 모티프나 그의 배열이 이런 단백질 전달 도메인의 전달 능력에 영향이 있을 것으로 추측되고 있다(Ho et al., 2001, Cancer Res., 61, 474-477). 또한, 양전하를 갖고 있는 아미노산들 중에서 히스티딘, 라이신 등과는 달리 알기닌의 올리고머만이 효과적으로 세포 내로 전달되는 능력이 있음이 알려지면서, 아미노산이 갖고 있는 전하만이 세포내 전달 능력에 영향을 미치는 것은 아님이 알려져 있다(Wender et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 13003-13008). HIV-1 유래 TAT-PTD에 의한 세포내 전달의 경우 알파-헬릭스(α-helix)와 같은 아미노산의 2차 구조 모티프가 중요한 역할을 하고 있으며, 실제로 이러한 알파-헬릭스 구조는 단백질 전달 효 율을 극대화 시킨다고 보고되어 있다(Ho et al., 2001, Cancer Res., 61, 474-477).

이와 같이, 세포 내에서 기능을 하는 목적 단백질을 세포 또는 조직 안으로 전달시키는 단백질 전달 펩타이드는 단백질, 핵산 혹은 약물을 전달하기 위한 매우 효율적인 방법으로서, 가장 처음 발견된 TAT-PTD 외에도 다양한 단백질 전달 도메인들이 발견되었거나 합성되어져 왔다. 그러나 종래에 알려진 단백질 전달 도메인들은 모두 바이러스 등에서 유래되거나 또는 합성된 펩타이드로서, 실제 인체 내에 적용시에는 면역반응 등의 문제가 발생할 소지가 있다. 따라서, 지금까지 알려진 단백질 전달 도메인들을 대체할 수 있는 새로운 인간유래 단백질 전달 도메인을 찾아내는 것은 매우 중요한 일이라 하겠다.

이에, 본 발명자들은 인간 유래 G 단백질 α-12의 전체 아미노산 서열 중 일부가 세포막투과 전달 펩타이드 기능을 갖고 있음을 발견하고, 상기 펩타이드를 코딩하는 재조합 벡터를 제조하였으며, 여기에 목적 단백질이 융합되도록 목적 단백질의 재조합 유전자를 벡터에 삽입하여 대장균 균주에서 단백질을 발현, 정제한 후 동물 세포내에 전달하여 이를 생물학적 방법으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세포내로 목적 단백질을 전달하는 능력을 가진 새로운 인간유래 세포막투과 전달 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 유전자, 상기 유전자 와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 융합되어 있는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 등을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 G 단백질 알파 12로부터 유래된 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 세포막투과 전달 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 재조합 벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체로부터 융합단백질을 발현 및 대량 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 상기 재조합 벡터를 세포를 포함하는 배양 배지 또는 생체 내에 처리함으로써 목적 단백질을 세포내로 도입하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인간 G 단백질 알파 12로부터 유래된 서열번호 1로 기재되는 아미 노산 서열을 갖는 세포막투과 전달 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 인간 유전자 중에서 단백질 전달 도메인을 갖고 있을 가능성이 있는 후보 서열들을 검색하였고, 이 중 G 단백질 알파 12 단백질의 총 381 아미노산 서열 중에서 29번째 알라닌으로부터 39번째 알기닌까지 11개 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 융합단백질을 세포 내로 전달하는 기능을 갖고 있음을 발견하였다. 상기 펩타이드는 세포 내로 목적 단백질을 효과적으로 전달할 수 있으므로, 다양한 단백질, 핵산 및 약물들을 세포 내로 전달하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명자들은 상기 펩타이드를 "GNP-TDP (guanine nucleotide-binding protein transmembrane delivery peptide)"라 명명하였다.

본 발명의 유전자는 서열번호 1로 기재되는 세포막투과 전달 펩타이드를 코딩할 수 있는 모든 염기서열을 포함하며, 이 중에서 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터에 상기 서열번호 1로 기재되는 펩타이드를 코딩하는 유전자를 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 발현용 벡터로 pET28a를 사용하였지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대 장균주 발현용 벡터가 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 균주 발현용 벡터인 pET28a 벡터를 사용하여 서열번호 2로 기재되는 GNP-TDP 염기서열을 포함하는 DNA 절편을 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였으며, 이를 "pGNP"라 명명하였다(도 2 참조).

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제공한다.

재조합 벡터를 이용하여 목적 단백질을 융합 단백질 형태로 제조한 후, 세포 내 전달 효율을 직접 확인하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 EGFP 유전자를 pGNP에 삽입시킨 재조합 벡터를 제조하고 이를 "pGNP-EGFP"라 명명하였다(도 3 참조). 상기에서, 목적 단백질은 특정한 단백질, 예를 들면, 본 발명의 바람직한 실시예에서 사용된 EGFP 등에만 한정되는 것은 아니며, 모든 종류의 단백질이 제한없이 사용될 수 있음은 자명하다.

상기 형질전환체는 상기 제조합 벡터를 임의의 숙주 세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pGNP 벡터 및 상기 pGNP 벡터에 목적 단백질인 EGFP를 삽입시킨 발현용 재조합 벡터 pGNP-EGFP를 대장균 균주 DH5α에 도입하여 형질전환체를 제조하였다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포를 이용하여 세포막투과 전달 펩타이드와 융합된 목적 단백질을 발현하는 방법을 제공한다.

상기 목적 단백질은 상기 형질전환 세포를 적절한 배지에서 배양하거나, 또는 상기 형질전환 세포를 임의의 동물에 도입한 후 생체내에서 배양함으로써 용이하게 발현 및 대량 생산할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pGNP 벡터에 EGFP 유전자를 삽입시킨 재조합 발현벡터 pGNP-EGFP를 대장균 균주 BL21 (pLysS)에 도입하여 형질전환체를 만들고, 이를 적절한 배지에서 배양함으로서 세포막투과 전달 펩타이드와 EGFP가 융합된 재조합 단백질을 발현 및 정제하였다(도 4 및 도 5 참조). 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 재조합 융합단백질을 동물세포주에 처리할 경우, GNP가 융합되지 않은 천연형 EGFP를 처리했을 경우와 비교할 때 월등히 높은 비율로 단백질이 세포 안으로 전달된다(도 7 및 도 8 참조). 따라서, 본 발명의 방법을 사용하면 목적으로 하는 물질, 예컨대 단백질, 핵산, 약물 등을 인간을 포함한 동물세포 내로 효율적으로 전달할 수 있으므로, 약물 등을 전달하기 위한 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> GNP-TDP 펩타이드를 코딩하는 이중사슬 DNA의 제작

인간 G 단백질 알파 12 (GenBank 기탁번호 AAH87537, BC087537)의 총 381 아미노산 서열중에 29번째 알라닌으로부터 39번째 알기닌까지의 11개 아미노산 서열(GNP-TDP 펩타이드)을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 서열번호 3으로 기재되는 한쪽 사슬의 올리고머와 그와 상보적인 서열을 갖는 서열번호 4로 기재되는 올리고머를 결합시킴으로써 GNP-TDP 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 이중사슬 DNA를 제조하였다. 구체적으로, 상기 DNA 올리고머는 GNP-TDP를 코딩하는 33개 염기를 갖는 서열번호 2로 기재되는 DNA 서열과 제한효소 NdeI과 BamHI의 인식 부위를 포함하고 있는 총 57 bp의 DNA와 이에 상보적인 서열의 DNA이다. 상기 올리고머들을 80℃에서 15분간 처리한 후 실온에 방치하여 두 올리고머를 결합시킴으로써 57 bp의 이중사슬 DNA를 제조하였다. 상기 반응으로부터 증폭된 증폭산물에 대하여 2% 아가로스 젤 전기영동을 수행한 결과, 57 bp의 DNA 절편(fragment)이 증폭되었음을 확인하였다(도 1).

<실시예 2> pGNP 벡터의 제작

상기 실시예 1에서 제조된 57 bp DNA 절편을 사용하여 대장균주 발현용 pGNP 재조합 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 상기 57 bp DNA 절편을 2% 아가로스 젤에서 전기영동한 후 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, Germany)를 사용하여 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA 절편을 제한효소 NdeI과 BamHI으로 자르고 pET28a 벡터(Novagen, USA) 벡터도 동일한 제한효소로 자른 후 T4 DNA 라이게이즈(Promega, USA)로 반응시켜 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 DNA 절편이 삽입된 새로운 플라스 미드 벡터를 제조하였으며, 이를 "pGNP" 라 명명하였다(도 2).

상기 pGNP 벡터를 대장균 XL1-Blue 균주에 형질전환시킨 후 항생제 카나마이신(50 ㎍/㎖)이 첨가된 LB (Luria Botani) 평판 배지에 도말하여 배양하였다. 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균 균주로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 T7 프로모터 서열 (TAATACGACTCACTATAGGG)을 프라이머로 사용하여 DNA 염기서열 분석기(ABI system, USA)를 이용한 DNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 상기 PCR 반응으로 증폭된 DNA 절편은 서열번호 2로 기재되는 GNP-TDP의 DNA 서열임을 확인하였다.

<실시예 3> pGNP-EGFP 플라스미드의 제작

상기 실시예 2에서 제조된 pGNP 벡터에서 GNP-TDP의 세포 내 전달 효율을 직접 확인하기 위하여, 목적 단백질로 선택한 EGFP 유전자를 pGNP 벡터 내에 삽입시켰다. 상기 EGFP 유전자는 전체 DNA 서열이 포함되어 있는 pEGFP-N1 (BD Biosciences, USA) 벡터를 주형으로 PCR 반응을 수행하여 얻어냈다. 이때 사용된 PCR 반응을 위한 프라이머로는 서열번호 5로 기재되는 상류 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 하류 프라이머를 사용하였으며, 이들은 각각 제한효소 EcoRI, XhoI 인식 부위가 포함된 서열이다. PCR 반응은 주형의 열변성으로 95℃에서 1분, 주형과 프라이머의 결합으로 58℃에서 1분, 연장반응으로 72℃에서 1분을 수행하는 것을 1주기로 하여 35 주기를 PCR 반응기를 이용하여 수행하였다. 상기 반응으로부터 증폭된 약 720 bp의 DNA 절편에 대하여 1% 아가로스 젤 전기영동을 수행하여 확인한 후 QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 분리하였다. 분리된 DNA 절편을 제한 효소 EcoRI과 XhoI으로 자르고, 동일한 제한효소로 자른 pGNP벡터에 T4 DNA 라이게이즈로 반응시켜 삽입함으로써, 목적 단백질을 코딩하는 EGFP 유전자가 삽입된 새로운 플라스미드 "pGNP-EGFP"를 제조하였다.

상기 pGNP-EGFP 벡터를 대장균 XL1-Blue 균주에 형질전환시킨 후 항생제 카나마이신(50 ㎍/㎖)이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니로부터 pGNP-EGFP를 분리하여 이를 PCR 반응 분석과 DNA 염기서열 분석을 수행한 결과, EGFP 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다. 상기 pGNP-EGFP를 대장균주 DH5α에 도입하여 형질전환체를 제조하여 보존하였다.

<실시예 4> 대장균에서 GNP-EGFP 재조합 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 3에서 제조된 벡터 pGNP-EGFP를 사용하여 대장균 균주에서 융합단백질 GNP-EGFP을 제조하였다. 재조합 벡터 pGNP-EGFP를 단백질 과발현용 대장균 균주 BL21(pLysS)에 도입하여 형질전환 시킨 후 항생제인 카나마이신(50 ㎍/㎖)과 클로람페니콜(34 ㎍/㎖)이 첨가된 LB 평판 배지에서 형성된 콜로니를 LB 액상 배지에 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하여 충분한 배양액을 얻었고, 이를 새로운 LB 액상 배지에 접종하였다. 동일한 온도에서 진탕배양한 후 600 nm 파장에서 흡광도(optical density)가 0.6이 되면 단백질의 과발현을 위해서 최종 농도가 0.5 mM가 되도록 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가한 후 4시간을 더 배양하였다. 시간별로 샘플링한 배양액을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동을 수행한 결과, 재조합 단백질 GNP-EGFP이 발현된 것을 확인하였다(도 4).

재조합 단백질 GNP-EGFP를 분리 정제하기 위해 배양액을 원심분리로 모은 후 완충용액(6 M Urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 용해시켰다. 대장균의 세포벽이 잘 깨지도록 -80℃ 온도에서 얼렸다가 녹이는 과정을 3회 반복한 후 울트라소닉 프로세서(ultrasonic processor) VCX-500 (Sonics & Materials, USA)을 사용하여 세포를 분쇄하고 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 시료를 Ni-NTA 칼럼(Qiagen, Germany)과 Q-세파로즈 칼럼(Amersham Bioscience, Sweden)에 적용하여 GNP-EGFP 단백질을 순수 분리 정제하였다(도 5). 상기 재조합 단백질을 PD-10 탈염 칼럼(Amersham Biosciences, Sweden)을 사용하여 탈염시킨 후, 글리세롤의 농도가 10%가 되도록 첨가하여 -80℃에 보관하였다.

<실시예 5> 동물세포주 안으로 GNP-EGFP 재조합 단백질의 전달

상기 실시예 4에서 분리 정제된 재조합 단백질을 래트 마이오블라스트(myoblast) H9c2 세포주(ATCC CRL-1446) 내로 전달하고 이의 효율을 확인하였다. H9c2 세포를 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, USA)를 사용하여 배양하고 6-웰 플레이트(Nalge Nunc, USA)에 세포수를 6ㅧ10⁵ 으로 분주한 후, 플레이트 면적의 70% 가량 성장하였을 때 10% FBS가 포함된 새로운 배지로 교체해 주었다. 여기에 GNP-EGFP 재조합 단백질을 농도별(0 내지 2.0 μM)로 2시간동안, 또는 0.5 μM의 농도로 2시간동안 세포에 처리하였다. 대조군으로는 GNP 펩타이드 가 융합되지 않은 천연형 EGFP 단백질을 사용하였다. 정해진 시간 후에 세포를 PBS 완충용액(phosphate-buffered saline)으로 두번씩 세척한 후 EDTA가 들어가 있지 않은 트립신(trypsin)(Gibco-BRL, USA)을 10분간 처리함으로써 세포 표면에 붙어있을 수 있는 단백질들을 제거하고 다시 PBS로 세척하였다.

상기 세포주에 처리된 재조합 단백질의 전달 효율을 확인하기 위해 웨스턴 블롯(western blot) 분석, 유세포 분석(fluorescence activated cell sorting) 및 형광현미경을 이용한 분석을 수행하였다. 먼저, 웨스턴 블롯 분석을 위하여 세포 용해 완충용액(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na₃VO₄, 1 ㎎/㎖ leupeptin, and 1 mM PMSF)을 사용하여 세포를 파괴하고 원심분리하여 세포 내 전체 단백질을 얻었다. 단백질 20 ㎍을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동한 후 전기영동된 겔에 포함된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 용지(Gelman, USA)에 흡착시킨 후 EGFP에 대한 항체(SantaCruz, USA)를 사용하여 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 세포 내로 전달된 EGFP를 검출하였다. 그 결과, 단백질의 처리 농도와 시간에 의존적으로 동물세포주 안으로 전달되었음을 확인하였다(도 6).

이와 같은 결과를 검증하기 위해 유세포 분석기를 이용하여 실험하였다. 동물세포주 H9c2를 6-웰 플레이트에 세포수 2ㅧ10⁵로 분주한 후 세포가 플레이트 면적의 80∼90% 가량 성장하였을 때 EGFP 혹은 GNP-EGFP 재조합 단백질을 0.5 μM의 농 도로 처리하였다. 한 시간 후 배지를 제거하여 PBS로 2회 세척하고 트립신을 처리하여 세포 멤브레인에 붙어있을 수 있는 재조합 단백질을 제거하였다. 다시 PBS로 세척한 후 세포를 긁어내고 0.5 ㎖ PBS를 넣어 섞어준 후 유세포 분석기를 사용하여 형광을 분석하였다. 그 결과, GNP가 융합되어 있지 않은 EGFP는 동물세포 안으로 전달되지 않았고, GNP-EGFP가 동물세포 안으로 효율적으로 전달되었음을 확인하였다(도 7).

마지막으로 실제 동물세포 안에 전달되어 있는 단백질을 직접 확인하기 위하여 형광현미경(Olympus BX51, USA)을 사용하여 실험하였다. 4-웰 플레이트(LAB-TEK II CHAMBER, Nalge Nunc, USA)에 세포를 분주한 후 EGFP 혹은 GNP-EGFP 재조합 단백질을 0.5 μM 농도로 처리하고 트립신 처리한 후 PBS로 세척하였다. 이를 실온에서 3.7% 포름알데히드(formaldehyde) 용액으로 5분간 방치한 후 다시 PBS로 세척하고 마운팅하여 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 재조합 단백질이 효율적으로 동물세포주 안으로 전달되었음을 확인하였다(도 8).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 세포막투과 전달 펩타이드는 동물 세포주 내로 효율적으로 전달될 수 있으므로, 단백질, 핵산, 약물 등을 포함하는 다양한 목적 물질을 세포 내로 전달하기 위한 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> CHUNG, Ji Hyung JANG, Yangsoo <120> Transmembrane Delivery Peptide and Bio-material Comprising the Same <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transmembrane Delivery Peptide from Human G protein alpha 12 <400> 1 Ala Arg Asp Ala Glu Arg Glu Ala Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence Coding the Transmembrane Delivery Peptide <400> 2 gcgcgcgacg cggagcgcga ggcccggagg cgt 33 <210> 3 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence Comprising the Sequence Represented by SEQ. ID. No. 2 (GNP-1) <400> 3 ggcagccata tggcgcgcga cgcggagcgc gaggcccgga ggcgtggatc cgaattc 57 <210> 4 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence Complementary to SEQ. ID. No. 3 (GNP-2) <400> 4 gaattcggat ccacgcctcc gggcctcgcg ctccgcgtcg cgcgccatat ggctgcc 57 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for EGFP Gene <400> 5 ccggtcgaat tcatggtgag caagggc 27 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for EGFP Gene <400> 6 gtcgcgctcg agttacttgt acagctcgtc 30 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Transduction Domain of TAT Protein <400> 7 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10

Claims

인간 G 단백질 알파 12 유래로서, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 세포막투과 전달 펩타이드.
제1항의 세포막투과 전달 펩타이드를 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항에 있어서, 상기 벡터 내에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체.
제6항의 형질전환체를 배지에서 배양하거나, 또는 상기 형질전환체를 임의의 동물에 도입한 후 생체내에서 배양함으로써 제1항의 세포막투과 전달 펩타이드와 융합된 목적 단백질을 발현하는 방법.
목적 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 제5항의 재조합 벡터를 세포를 포함하는 배양 배지 또는 생체 내에 처리함으로써 목적 단백질을 세포내로 도입하는 방법.