FI98309C - Menetelmä synteettisten isohirudiinien valmistamiseksi, joilla on parantunut stabiilisuus - Google Patents
Menetelmä synteettisten isohirudiinien valmistamiseksi, joilla on parantunut stabiilisuus Download PDFInfo
- Publication number
- FI98309C FI98309C FI925497A FI925497A FI98309C FI 98309 C FI98309 C FI 98309C FI 925497 A FI925497 A FI 925497A FI 925497 A FI925497 A FI 925497A FI 98309 C FI98309 C FI 98309C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- glu
- gly
- isohirudins
- ala
- leu
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical group OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract description 3
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 abstract 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N desirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 29
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 27
- 108010073652 desirudin Proteins 0.000 description 24
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 23
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 22
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 2
- 101000610640 Homo sapiens U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 101001110823 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-A Proteins 0.000 description 2
- 101000712176 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-B Proteins 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 102100040374 U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Human genes 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101100313763 Arabidopsis thaliana TIM22-2 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- 101150102661 HIR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101100459248 Mus musculus Mxra8 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100506779 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) hip1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000011170 pharmaceutical development Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Extrusion Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
98309
Menetelmä synteettisten isohirudiinien valmistamiseksi, joilla on parantunut stabiilisuus
Keksintö koskee menetelmää uusien synteettisten 5 isohirudiinien valmistamiseksi, joiden stabiilisuus on aiempaa parempi korvauksen Asp-Gly-aiheiden alueella johdosta. Tällöin yhtäältä saanto jatkokäsittelyssä kohoaa ja toisaalta galeeninen valmistus suoraan injisoitavaksi valmisliuokseksi mahdollistuu.
10 Veri-iilimadosta Hirudo medicinalis tunnetaan lää ketieteellisesti arvokkaita trombiini-inhibiittoreita, joiden affiniteetti on korkea ja joiden käytöstä ihmislää-ketieteessä odotetaan oleellisia edistysaskeleita verisuonitukosten hoidossa. Näitä peptidiluonteisia inhi-15 biittoreita kutsutaan hirudiineiksi, jolloin tunnetaan mo nilukuinen määrä luonnollisia isohirudiineja, jotka poikkeavat sekvenssiltään toisistaan vain muutamien aminohappojen suhteen. Luonnollisia isohirudiineja kuvataan esim. EP-julkaisuissa 142 860, 158 564, 158 986, 168 342, 20 171 024, 193 175, 200 655, 209 061 ja 227 938. Yhdistelmä- DNA-tekniikan kehitys viime vuosikymmenellä on nyt tehnyt mahdolliseksi saada hirudiineja käyttöön teollisessa mittakaavassa käyttäen geeniteknisesti modifioituja mikro-organismeja. Menetelmiä isohirudiinien valmistamiseksi 25 luonnollisten sekvenssien pohjalta kuvataan esimerkiksi EP-julkaisuissa 171 024 sekä 200 655 sekä niissä mainitussa kirjallisuudessa.
Terapeuttisen tehokkuuden ohella lääkeaineelle asetetaan kuitenkin nykyisin korkeita vaatimuksia. Näihin 30 kuuluvat mm. taloudellisuus valmistuksessa, kliinisen kä sittelyn helppous sekä korkea säilyvyys silmällä pitäen pitkää käyttöikää.
Jotta aiempaa parempi hoito myös taloudelliset näkökohdat huomioon ottaen hyödyttäisi suurta lukumäärää 2 98309 potilaita, on tarpeen pitää lääkeaineen valmistuskustannukset alhaisina. Tähän voidaan geeniteknisillä tuotteilla pyrkiä kehittämällä optimoituja ilmennyssysteemejä, mutta myös sopeuttamalla lääkeaine tällaiseen systeemiin. Tässä 5 suhteessa rakenteeltaan optimaalisia isohirudiineja kuva taan esimerkiksi EP-julkaisuissa 324 712 ja 448 093.
Käyttöikänäkökohta tulisi ottaa huomioon lääkeaineen korkealla stabiilisuudella, jolloin vältetään hajoamistuotteiden muodostumisesta johtuvat terapeuttiset ja 10 farmakologiset komplikaatiot. Veri-iilimadosta tutut iso- hirudiinit sekä myös desulfatohirudiinit geeniteknisesti modifioiduista mikro-organismeista jättävät tässä suhteessa toivomisen varaa, koska ne rakenteensa johdosta ovat taipuvaisia muodostamaan sivutuotteita sisäisellä 15 kemiallisella konversiolla. Myös jatkokäsittelymenetelmän taloudellisuusnäkökohtien puitteissa edullisesti vältetään nimenomaan sivutuotteiden muodostumista, jolloin sivutuotteiden erottaminen jää pois. Tämä ilmenee parantuneina saantoina.
20 Aiempaa parempi stabiilisuus tekisi lisäksi mah dolliseksi valmisteen, joka sallii lääkeaineen varastoinnin ja käytön siten, että se kulutus on mahdollisimman vähäistä. Hirudiinin kohdalla suoraan injisoitava, stabiili valmisliuos on tällainen valmiste, jolla edelleen olisi 25 ilmeisesti pitkä käyttöikä. Tunnettujen isohirudiinien kemiallinen epästabiilisuus on nimittäin rajoittava tekijä, koska liuotetun aineen lämpötilasta riippuvainen si-vutuotemuodostus sallii jääkaappivarastoinnissakin tällaisen valmisteen vain rajoitetun (lyhyen) käyttöiän, 30 jolloin taloudellisuuteen pääseminen on vaikeata.
Tunnetut luonnolliset isohirudiinit ja niistä johdetut desulfatohirudiinit farmaseuttiseen kehitykseen eroavat toisistaan vain harvoissa aminohapporakenneosissa, jolloin sekvenssissä voidaan erottaa vaihtuvia ja pysyviä li 3 98309 alueita. Säilyviin alueisiin kuuluvat sekvenssit -Ser33-Asp (Asn) 33-Gly34- ja -Asn52-Asp (Asn) 53-Gly54-Aspi;-.
Numerointi vastaa Dodtin et ai., FEBS Lett. 165 (1984) 180 - 183, julkaisemaa sekvenssiä, jossa on 65 aminohap-5 poa. Hirudiinin hajoamistuotteiden proteiinikemialliset analyysit ovat nyt osoittaneet, että nämä sekvenssiaiheet ovat valtaosin vastuussa hirudiinin kemiallisesta epästa-biilisuudesta. Asparagiinin deamidointi asparagiinihapoksi voidaan tällöin jättää ottamatta lukuun, koska se johtaa 10 vain toiseen luonnolliseen isohirudiinirakenteeseen.
Oleellista hirudiinin hajoamiselle on isomeeri- ja rase-maattimuodostus molemmissa -Asp-Gly-sekvensseissä. Näiden reaktioiden merkitys proteiinien hajoamiselle on kirjallisuudesta tuttu [JBC 262 (1987) 785 - 793 ja JBC 264 15 (1989) 6164 - 6170]. Hirudiinin karboksipään rakenteen merkitys sitoutumiselle trombiiniin korkealla affiniteetilla on samoin tunnettu. Aminohappokorvaukseen alueilla, joiden sekvenssiluonne on säilyvä ja jotka osallistuvat sitoutumiseen, liittyy vaara affiniteetin häiriytymisestä. 20 Yllättäen nyt on todettu, että tiettyjä, stabiilisuutta parantavia modifikaatioita voidaan suorittaa säilyvillä alueilla häiritsemättä affiniteettia trombiinille ja siten tehokkuutta (esimerkki 7, taulukko 1 sekä esimerkki 8, kuvio 2).
25 Lisäksi ilmenee yllättäen, että huolimatta suori tetuista korvauksista useammassakin kuin yhdessä aminohapossa ei tapahdu antigeenisyyden lisääntymistä.
Edelleen todettiin, että molemmat -Asp-Gly-sekvens-sit vaikuttavat yhtä paljon hirudiinin epästabiilisuuteen. 30 Vasta modifioimalla molempia sekvenssialueita voidaan si- vutuotemuodostusta vähentää ratkaisevasti (esimerkki 9, taulukko 2).
Kantayhdisteiden sekä myös optimoitujen desulfato-hirudiinien sivutuotemuodostuksen ajallinen sujuminen sekä 4 98309 happamassa (esimerkki 11, kuvio 3) että fysiologisessa pH:ssa (esimerkki 10, kuvio 4) osoittaa, ettei aminopäällä ole mitään vaikutusta stabiilisuuteen, jolloin modifiointi ei vaikuta stabiloivasti. Siitä seuraa, että [Ala1, Thr2] de-5 sulfatohirudiinin esimerkkinä esitetyt optimoinnit vaihte- levan aminopään käsittävillä isohirudiineilla voidaan suorittaa (esim. [Vai-, Vai2]- ja [ Ile1, Thr2] desulfatohirudii-ni) .
Erilaisten synteettisten isohirudiinien stabiili-10 suuden yksityiskohtainen analyysi (kuviot 3 ja 4) tekee kuitenkin ilmeiseksi esimerkiksi [Ala1, Thr2, Glu33, Glu53] de-sulfatohirudiinilla, että asparagiinihapon yksinkertaisella korvauksella ei saada optimaalista vaikutusta. [Ala1, Thr2, GluJJ, Gin2-, Glu2', Ala24] desulf atohirudiinin sekä 15 [Ala1, Thr-, GluJJ, Gin22, Glu2J, Glu55] desulf atohirudiinin yli voimainen stabiilisuus osoittaa yllättäen, että asparagii-nin lisävaihtoglutamiiniksi asemassa 52 tuo oleellisen stabiilisuuslisän.
Keksintö koskee siten menetelmää isohirudiinin val-20 mistamiseksi, jonka stabiilisuus on aiempaa parempi ja jossa ovat seuraavat aminohapot: asemassa 33 Glu; asemassa 52 Gin, Glu, Asn tai Asp; asemassa 53 Glu; asemassa 54 Gly tai Ala; ja asemassa 55 Asp tai Glu, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat menetelmävai-25 heet: a) valmistetaan vektorit, jotka koodittavat mainittuja isohirudiineja; b) ilmennetään mainitut vektorit sopivassa isän-täsolussa; ja 30 c) eristetään ilmennetyt isohirudiinit.
Edullisia ovat yhdisteet, joiden kaava on I: li 10 5 98309 A^A^-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu- 20 5 Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile- 30 40
Leu-Gly-Ser-B-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-thr-Gly-Glu-Gly- 50 52 53 54 55
Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-C - D - E - F -Phe-Glu-Glu-10 60
Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln jossa A' on Leu, Ala, Ile tai Vai; 15 Az on Thr tai Vai; B on Glu; C on Gin tai Glu; D on Glu; E on Gly tai Ala; ja 20 F on Asp tai Glu.
Erityisen edullisia ovat yhdisteet [Ala1 tai Leu*,T-hr2, Glu5-, Gin52, Glu'', Ala"1 ] desulfatohirudiini ja [Ala1 tai Leu1,Thr2,GluJJ,Gln;-,Glu53, Glu55] desulfatohirudiini.
Synteettiset hirudiinijohdannaiset voidaan valmis-25 taa myös kemiallisesti syntetisoimalla. Keksinnön mu kaisesti valmistus suoritetaan edullisesti leipomohiivassa tai EL^ colissa.
Optimoitujen isohirudiinien kemiallinen stabiilisuus yhdessä korkeatehoisen ilmennyssysteemin kanssa tekee 30 mahdolliseksi suhteellisen yksinkertaisen ja siten kustan nuksiltaan edullisen jatkokäsittelymenetelmän. Tällöin sinänsä tuttujen biokemiallisten menetelmien yhdistäminen voi johtaa menetelmiin, jotka voidaan helposti erottaa toisistaan. Keksintö koskee myös tällaisia menetelmämuun-35 noksia. [Ala*, Thr2]desulfatohirudiinin johdannaisia voi- 6 98309 daan esimerkiksi valmistaa EP-patenttihakemusjulkaisun 448 093 mukaisessa ilmennyssysteemissä, jolloin jatkokäsittely käsittää vain muutamia vaiheita: fermentoinnin päätteeksi 5 saatu soluliete tai viljelmäsuodos, josta solut on pois tettu, tehdään happamaksi pH-arvoon 2-4 (esim. lisäämällä muurahaishappoa, HCl:ää), minkä jälkeen tässä muodostunut proteiinipitoinen sakka voidaan sentrifugoida tai suodattaa eroon. Kirkkaasta suodoksesta tuote voidaan yksin-10 kertaisimmassa tapauksessa käytetyn kasvualustan tämä sal liessa rikastaa voimakkaasti käänteisfaasikromatografises-ti. Käytettäessä kompleksisia kasvualustoja sitä vastoin edullisesti alennetaan liuoksen suolapitoisuutta, esim. ultra-/diasuodattamalla ioninvaihtokromatografiän ka-15 tioninvaihtajalla (esim. FractogelR EMD-S03) suoritta miseksi. Ultrasuodatuksen asemesta voidaan suorittaa myös hydrofobinen adsorptio sopivaan hartsiin, kuten kuvataan esim. EP-hakemusjulkaisussa 316 650. Kationinvaihtokroma-tografiasta saatu tuote voidaan sitten siirtää suoraan 20 käänteisfaasikromatografia-ajoon (esim. LichroprepR RP18), josta saadaan hyvin puhdas tuote. Tarpeen vaatiessa voidaan jäljelle jääneet epäpuhtaudet poistaa ylimääräisellä anioninvaihtokromatografia-ajolla esim. Q-Sepharose-hart-sissa. Optimoimalla vastaavasti yksittäiset vaiheet voi-25 daan päästä 50 %:n tai sitä korkeampiin saantoihin.
Käytettäessä EP-hakemusjulkaisun 316 650 mukaista ilmennysysteemiä stabiloitujen [Leu1, Thr2]desulfatohiru-diinijohdannaisten valmistamiseksi voidaan työstäminen suorittaa analogisesti, jolloin kuitenkin edullisesti ka-30 tioninvaihtokromatografiästä saatua tuotetta rikastetaan edelleen käyttämällä eräanioninvaihtovaihetta, esim. kuten kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 316 650.
Esimerkki 1
Vektorin pCMT203 rakentaminen 35 Biotekniset työvaiheet, kuten ymppiviljelmien val mistus tai kannan fermentointi, suoritetaan edullisesti li 7 98309 käyttäen valikointipainetta työstettävässä isäntä-/vekto-risysteemissä. Tällöin minimoidaan vierailla mikro-organismeilla saastumisen vaara. Amerikkalaisten terveysviranomaisten ohjelinjojen mukaan ampisilliini-antibioottia 5 ei tulisi käyttää yhdistelmä-DNA-proteiinien valmistus menetelmissä .
EP-hakemusjulkaisussa 448 093 kuvattiin plasmideja pCM7051 ja pCM7053. Parannus plasmideihin edellä kuvattuun näkökohtaan nähden saadaan, kun vektori-DNA:ta laajenne-10 taan käsittämään tunnettu resistenssi tetrasykliinille.
Tässä tarkoituksessa plasmidin pCM7051 DNA tehdään lineaariseksi Nrulrllä ja ligatoidaan 1,1 ke:n Nrul-frag-menttiin, joka on eristetty plasmidista pCM7053. Tämä DNA-fragmentti sisältää plasmidista pCM7051 puuttuvan 5'-pää-15 osan tetrasykliinigeenistä. coli -kannan Mcl061 trans- formoitumiskelpoisia soluja transformoidaan ligatointi-seoksella, minkä jälkeen ne maljoitetaan NA-agarmaljoihin, joissa kasvualusta sisältää 12,5 mg/1 tetrasykliiniä. In-kuboimalla yön yli 37 °C:ssa saadaan transformantteja. 20 Näistä eristetään plasmidi-DNA, jota karakterisoidaan restriktioanalyysillä. Sopivan plasmidin DNA:ta käsitellään sitten valmistajan ohjeita noudattaen entsyymeillä Aval ja Ndel ja suoritetaan geelielektroforeettinen erotus. Suurempi kahdesta fragmentista eristetään, ja ylijää-25 mäpäät täytetään käyttämällä Klenow-polymeraasia. Sitten fragmentti autoligatoidaan ja transformoidaan toistamiseen E. coli -kantaan Mcl061. DNA:n karakterisoinnin restriktioanalyysillä jälkeen nimetään toivomuksia vastaavat plasmidit pCMT203:ksi (kuvio 1).
30 Esimerkki 2
Hirudiinivarianttien, jossa on N-pään aminohappona alaniini, rakentaminen
Hirudiinivarianttien, jotka alkavat alaniinilla, tulisi ilmentyä E_;_ colissa. Kloonauksessa käytettiin esi-35 merkissä 1 kuvattuja vektoreita pCM7053, pCMT203 sekä EP- hakemus j ulkaisussa 171 024 kuvattua plasmidia kuviosta 3, 8 98309 joka käsitti DNA-sekvenssiksi I kuvatun synteettisen DNA-sekvenssin hirudiinille. Tätä plasmidia kutsutaan seuraa-vassa plasmidiksi pK152. Edelleen syntetisoitiin seuraavat oligonukleotidit käyttäen DNA-syntetisointilaitetta 391 5 DNA Synthesizer valmistajalta Applied Biosystems: HIR1 5'-CCCGAAACCGCAGTCTCACCAGGAAGGCGAATT-3'
Hir2 5'-CGAATTCGCCTTCCTGGTGAGACTGCGGTTTCGGGGTAC-3'
Hir5 5'-GATCCGAAGGTGAAAAGAACCAGTGCGTTACTGGCGAAGGTAC-3' Hir6 5'-CTTCGCCAGTAACGCACTGGTTCTTTTCACCTTCG-3' 10 Hir13 5'-CCCGAAACCGCAGTCTCATAACGAGGGCGACTT-3'
Hirl4 5'-CGAAGTCGCCCTCGTTATGAGACTGCGGTTTCGGGGTAC-3'
Hirl5 5'-CCCGAAACCGCAGTCTCATCAGGAGGCTGACTT-3'
Hirl6 5'-CGAAGTCAGCCTCCTGATGAGACTGCGGTTTCGGGGTAC-3'
Esimerkki 2a 15 Hirudiinivariantin 13 (Ala^Glu^Gln^Glu^Glu55) rakentaminen plasmidiin pSCH13 DNA:ta plasmidista pK152 käsitellään entsyymeillä BamHI ja Kpnl, ja muodostuneet kaksi fragmenttia erotetaan toisistaan geelielektroforeettisesti. Suuri fragmentti 20 eristetään ja ligatoidaan T4-DNA-ligaasireaktiossa edeltä käsin kaksisäikeisiksi hybridisoituihin oligonukleotidi-sekvenseihin Hir5 ja Hir6. Transformoitumiskelpoisia E. coli Mcl061 -soluja transformoidaan ligatointiseoksella. Samanaikaisesti edellä esitetyn kanssa pK153-vektorifrag-25 mentti ligatoidaan sisäisesti autoligatointireaktiossa ja transformoidaan niinikään. Transformointiseokset maljoite-taan NA-maljoihin, joissa kasvualusta sisältää 20 mg/litra ampisilliiniä, ja inkuboidaan yön yli 37 °C:ssa. Seuraava-na aamuna koe arvioidaan. Kloonauksen katsotaan onnistu-30 neen, jos ligatointi oligonukleotidifragmenttiin tuottaa vähintään 100 kertaa enemmän transformantteja kuin autoli-gatointi. Kloonausreaktion transformanteista eristetään sitten plasmidi-DNA, jota karakterisoidaan restriktioana-lyysillä. Plasmidi-DNA:sta, joka osoittaa oikeanlaista 35 restriktiokuviota, eristetään BamHI/Hindlll-fragmentti, 9 98309 joka sisältää hirudiinipeptidisekvenssin 32 - 65, joka käsittää korvauksen Asp3' - Glu55. Tämä fragmentti liga-toidaan BamHI/Hindlll:11a avattuun vektoriin pCM7053. Saadaan plasmidi pCM7053Var3, joka sisältää muutetun hi-5 rudiinin jossa DNA-sekvenssin, jossa asemassa 55 on amino happo Glu.
Plasmidi pK152-DNA:ta pilkotaan restriktioentsyy-meillä Kpnl ja Bstbl. Elektroforeettisen erotuksen jälkeen erotetaan suuri vektorifragmentti. Tämä fragmentti liga-10 toidaan edeltäpäin kaksisäikeisiksi hybridisoituihin oli- gonukleotideihin Hirl ja Hir2. Edellä kuvatun menettelyn mukaan muodostuu plasmidi pK153-johdannainen. Tämä nimetään variantiksi 1. Tästä plasmidista eristetään BamHI/-HindIII-fragmentti, joka ligatoidaan BamHI/Hindlll:11a 15 avattuun vektoriin pCM7053. Muodostuu plasmidi pCM7053-
Varl, joka koodittaa muutettua hirudiinia, joka sisältää asemissa 52, 53 ja 55 aminohapot Gin, Glu ja Glu. Tämä plasmidi eroaa pCM7053:sta ylimääräisen restriktioentsyy-min EcoRI tunnistuskkohdan suhteen.
20 Plasmidien pCM7053Varl ja pCM7053Var3 DNA:ta kak- soispilkotaan entsyymeillä Kpnl ja MluI ja suoritetaan elektroforeettinen erotus. Kummassakin tapauksessa muodostuu kaksi fragmenttia, joista pCM7053Varl:n kohdalla suurempi kyseisistä kahdesta ja pCM7053Var3:n kohdalla 25 pienempi kyseisistä kahdesta fragmentista eristetään. Mo lemmat fragmentit yhdistetään ligatointireaktiossa uuteen plasmidiin pVarl3, joka ilmennetään kannassa coli
Mcl061. Hirudiini eristetään esimerkin 5 mukaan, ja sitä karakterisoidaan aminohappoanalyysillä. Odotusten mukainen 30 aminohappokoostumus vahvistaa plasmidin pVarl3 rakenteen oikeellisuuden.
Sitten plasmidien pCMT203 sekä pVarl3 DNA:ta pilkotaan restriktioentsyymeillä MluI ja PvuI ja suoritetaan elektroforeettinen erotus. Kummassakin tapauksessa muo-35 dostuu kaksi fragmenttia, joista molemmissa tapauksissa 10 98309 eristetään suurempi. Näin eristetyt fragmentit yhdistetään ligaasireaktiossa plasmidiin pSCH13. Tämän rakenne vahvistetaan restriktioentsyymianalyysillä ja DNA-sekvenssiana-lyysillä. Tämä plasmidi viedään transformoimalla tunnet-5 tuun tapaan EP-hakemusjulkaisussa 448 093 kuvattuun E.
coli K12 -eritysmutanttiin.
Esimerkki 2b
Hirudiinivariantin 83 (Ala^Glu^Glu53) rakentaminen plasmidiin pSCH83 10 Esimerkissä 2a kuvattu KpnI/BstbI-pK152-vektori- fragmentti ligatoidaan edeltäpäin kaksisäikeisiksi hybri-disoituihin oligonukleotideihin Hirl3 ja Hirl4. Muodostuu variantiksi 8 nimetty plasmidi. Tästä plasmidista eristetään esimerkin 2a mukaan BamHI/HindiII-fragmentti, joka 15 viedään BamHI/Hindlll:11a avattuun vektoriin pCM7053.
Muodostuu plasmidi pCMVar8, josta eristetään pienempi Kpnl/Mlul-fragmentti. Tämä ligatoidaan suureen Kpnl/Mlul-fragmenttiin plasmidista pCMVar3. Muodostuu plasmidi pVar83, joka ilmennetään kannassa E_^ coli Mcl061. Hiru-20 diinijohdannainen eristetään ja suoritetaan aminohappo- analyysi, jolloin plasmidirakenne varmistuu, minkä jälkeen eristetään esimerkin 2a mukaan MluI/PvuI-fragmentti, joka ligatoidaan suureen MluI/PvuI-vektorifragmenttiin plasmidista pCMT203. Tämä plasmidi viedään edellä kuvattuihin 25 eritysmutantteihin.
Esimerkki 2c
Hirudiinivariantin 93 (Ala1,Glu33,Gln52,Glu53,Ala54) rakentaminen plasmidiin pSCH93
Plasmidin pSCH93 rakentaminen tapahtuu esimerkin 2b 30 mukaan. Tällöin ensimmäisessä kloonausvaiheessa Bstbl/-
KpnI-pK152-fragmentti muutetaan kaksisäikeisiksi hybridi-soituja oligonukleotideja Hirl5 ja Hirl6 käyttäen plasmi-diksi nimeltä variantti 9.
Il 11 98309
Esimerkki 3
Plasmidien pSCH13, pSCH83 ja pSCH93 ilmentäminen
Plasmidien pSCH13, pSCH83 ja pSCH93 ilmentäminen tapahtuu sekä ravistelukolveissa että 10 litran mittakaa-5 vassa EP-hakemusjulkaisun EP-A 448 093 mukaan. Tällöin käytetään kuvattuja kantoja tai niiden variantteja. Viljelmien ilmentämiseksi kuutiometrin mittakaavassa voidaan luonnollisesti käyttää erilaisia kasvualustoja, indusoin-tiolosuhteita ja fermentointiaikoja, kuten alan ammatti-10 laiselle tuttua.
Esimerkki 4
Hirudiinivarianttien 13 ja 93 kloonaus ja ilmentäminen leipomohiivassa EP-hakemusjulkaisussa 324 712 kuvataan synteettistä 15 hirudiinia, joka muutoksena luonnolliseen sekvenssiin si sältää N-päässä leusiiniaminohapon. Tätä hirudiinia voidaan samoin edelleen optimoida, kun leusiinia seuraavaan sekvenssiin aminohaposta 2 eteenpäin tehdään aiemmin varianteille 13 tai 93 kuvatut muutokset. Tällöin käytetään 20 esimerkiksi tässä selitysosassa kuvattuja vektoreita ja kantoja. Alan ammattilainen tietää, että myös mitä tahansa muuta hiivailmennyssysteemiä, joka johtaa hirudiinin tai sen varianttien ilmennykseen, voidaan käyttää.
EP-hakemusjulkaisussa 324 712 kuvattu kloonausvek-25 tori 7 avataan BamHI:llä ja HindIII:lla, ja ligatoidaan kulloinkin plasmidista pSCH13 tai pSCH93 eristettyyn Bam-HI/HindIII-fragmenttiin, joka käsittää kulloinkin kloo-nausvektorista puuttuvat hirudiinisekvenssin karboksyyli-pään aminohapot. Saadaan plasmidit p713 ja p793, joita 30 karakterisoidaan restriktioanalyysillä. Näiden plasmidien oikeasta DNA:sta eristetään sitten EcoRI/HindIII-frag-mentti, ja ylijäämäpäät täytetään Klenow-polymeraasireak-tiossa. Näin valmistetut fragmentit ligatoidaan kulloinkin tasapäiseen vektorifragmenttiin plasmidista yEP13 EP-ha-35 kemusjulkaisun 324 712 esimerkin 1 mukaan. Saadaan plas- 12 98309 midit pHABVarl31 ja pHAB132, jotka poikkeavat toisistaan vain insertoidun fragmentin suuntauksen osalta ja jotka koodittavat hirudiinijohdannaista, jolle ovat tunnusomaisia aminohapot Leu1, GluJJ, Gin32, G1u5j ja Glu35, sekä plas-5 midit pHABVar931 ja pHABVar932, jotka samoin poikkeavat toisistaan vain insertoidun fragmentin suuntauksen osalta ja jotka koodittavat hirudiinijohdannaista, jolle ovat tunnusomaisia aminohapot Leu1, Glu33, Gin52, Glu53 ja Ala54. Plasmidit transformoidaan esimerkiksi mainitussa pa-10 tenttihakemusjulkaisussa kuvattuihin hiivakantoihin. Hi rudiini johdannaisten ilmentäminen ja puhdistus voidaan suorittaa siinä kuvatuilla menettelyillä. Kuten tuttua on, voidaan puhdistuksessa luopua sentrifugoinnista ja siihen liittyvästä adsorptiokromatografiästä, kun käytetään esim. 15 Milliporen Pellicon-ultrasuodatussysteemiä. Tässä käytet tyjä menetelmiä kuvataan laboratoriomittakaavassa. Kuutiometrin mittakaavassa suoritettuihin viljelmiin voidaan joutua käyttämään muita fermentointiaikoja, viljelyolosuhteita sekä jatkokäsittelyvaiheita. Tämä on alan ämmätti-20 laiselle tuttua.
Esimerkki 5 [Ala1, Thr2, Glu33, Gin52, Glu53, Glu55] desulf atohirudiinin puhdistus 3,6 g/litra hirudiinia sisältävän, soluista vapaan 25 viljelmäsupernatantin pH säädettiin muurahaishappoa li säämällä arvoon 3. Yhden tunnin huoneenlämpötilassa sei-sotuksen jälkeen muodostunut sakka erotettiin CEPA-sentri-fugissa. Kirkkaan suodoksen johtokyky laskettiin diasuoda-tuksella arvoon 2,5 mS/cm tai alle. Sitten tuote puhdis-30 tettiin erittäin puhtaaksi toisiaan seuraavilla kromato- grafiavaiheilla FractogelR EMD-S03 -, LichroprepR RP18- ja Q-Sepharose-valmisteilla. Jäljelle jääneet suolat ja pus-kuriainesosat poistettiin Q-Sepharose-eluaatista käyttämällä yhdistettyä ultra-/diasuodatusta, minkä jälkeen tuo-35 te voitiin saada kylmäkuivaamalla kuiva-aineena.
li 13 98309
Esimerkki 6 [Ala1, Thr2, Glu33, Gin52, Glu53, Ala54 ] desulfatohirudiinin puhdistus
Fermentoinnin päätteeksi viljelmäliuos tehtiin so-5 luaineen läsnä ollessa happamaksi pH-arvoon 3. Solumassa ja muodostunut sakka poistettiin separaattorissa. Kirkkaaseen suodokseen lisättiin 5 % w/v Diaion HP20 -valmistetta, jolloin tapahtui hirudiinin kvantitatiivinen adsorptio. Kun neste oli poistettu suodattamalla, hartsi pestiin 10 kerran vedellä. Sitten tuote eluoitiin 30-%:iseen isopro- panoliliuokseen, joka oli tehty happamaksi pH-arvoon 3. Kirkasta eluaattia jatkotyöstettiin kuten esimerkissä 5 alkaen kationinvaihtokromatografiällä, jolloin sitten kyl-mäkuivaamalla saatiin erittäin puhdas kuivatuote.
15 Esimerkki 7
Optimoitujen isohirudiinien vertaileva Ki-arvomää- ritys
Ki-arvot määritettiin Stonen ja Hofsteengen [Biochemistry 25 (1986) 4622 - 4628] menetelmillä: 20 Seos, jossa oli 0,2 ml 1,25 mM D-HHT-Gly-Arg-pNA- liuosta, 1,7 ml 0,1 M Tris-puskuria, joka sisälsi 0,2 M NaCl:a ja 0,1 % (v/v) Triton X-100 -valmistetta, pH 8,3, sekä 0,1 ml testattavaa isohirudiinia 145 mM NaCl-liuok-sessa, temperoitiin 25 °C:seen. Sitoutuminen käynnistet-25 tiin lisäämällä 0,05 ml trombiiniliuosta. Absorptio 405 nm:ssä määritettiin 10 - 20 minuutin aikajakson jälkeen .
Reaktio noudattaa yhtälöä: 30 [P] = Vs't + (V0-Vs) (l-e~k’:)/k + d, jossa [P] = tuotepitoisuus (nitroaniliini) V0 = alkunopeus
Vs = reaktionopeus tasapainotilassa 35 d = [P] kun t = 0 14 98309
Nopeusvakio k määritettiin ei-lineaarisella regressiolla. Ekstrapoloimalla k eri inhibiittoripitoisuuk-silla arvoon [I] = 0 yhtälön 5 k = k=n* [I] / (1+S/KJ + ka mukaan saadaan nopeusvakiot ko: ja kofr ja siten K4 = kcff/krn.
Taulukko 1
Optimoitujen desulfatohirudiinien KA-arvoja 10
Yhdiste Ki(app)[M]
[ Ile*, Thr*1] desulf atohirudiini* 6,1 x 10“1C
[Leu*, Thr1] desulfatohirudiini2 1,4 x 10‘iC
15 [Ala3, Thr4 5 ] desulf atohirudiini2 2,0 x 10'1C
[Ala*, Thr2, Glu12] desulfatohirudiini 1,6 x 10~1C
[Ala*,Thr2,Gln12,Glu12,Glul5]desulfatohi- rudiini 1,9 x 10'10
[Ala*,Thrz,Glu22,Gln12,Glul2,Glu55]desulfa-20 tohirudiini 3,0 x 10~1C
[Ala*, Thr1, Ala14 ] desulf atohirudiini 2,7 x 10'10 [Ala*, Thr2, Glu22, Ala14] desulf atohirudiini 3,5 x 10'10 [Ala*, Thr*1, Glu12] desulfatohirudiini 3,8 x 10‘10 2 5 [ Ala*, Thr2, Glu22, Glu12 ] desulfatohirudiini 3,7 x 10'12 [Ala*, Thr", Gin11, GlulJ, AI a54] desulfatohirudiini 2,2 x 10~12 [ AI a*,Thr2,Glu32,Gin*1,Glu52, AI a11] de sul-30 f atohirudiini 3,1 x 10~12 11
Luonnollisesta isohirudiinista johdettu desulfatohirudiini 2
Optimoitu desulfatohirudiini EP-julkaisun 324 712 3 35 mukaan 4 1 Optimoitu desulfatohirudiini Ε_^ coli -eritysilmen- 5 nykseen EP-julkaisun 448 093 mukaan 15 98309
Esimerkki 8
Optimoitujen [Ala1, Thr2 ] desulfatohirudiinianalogien vaikutus partiaalinen tromboplastiiniaikaan (Ρπ) rhesus-apinoissa 5 [Leu1, Thr"] desulfatohirudiinia, [Ala1, Thr2] desulfa- tohirudiinia, [Ala1, Thr2, Glu^J, Gin-", Glu=J, Glu'5 ] desulf atohirudiinia ja [Ala1, Thr", Glu3', Gin"2, Glu5'\ Ala5J ] desulfatohi-rudiinia annettiin annos 0,5 mg/kg urospuolisille rhesus-apinoille, joiden ruumiinpaino oli 6,5 ± 1,6 kg laskimon-10 sisäisesti. Määrätyin väliajoin otettiin sitten verinäyt teitä hyytymisparametrien määrittämiseksi. Partiaalinen tromboplastiiniaika (Ρπ) määritettiin sitten seuraavasti (kuvio 2): 0,1 ml sitraattiplasmaa ja 0,1 ml PTT-rea-genssia ihmisverihiutaleista (Behringwerke) sekoitettiin 15 37 °C:seen esilämmitetyssä koeputkessa ja pidettiin tasan 2 minuutin ajan 37 °C:ssa endogeenisen hyytymissysteemin täydelliseksi aktivoimiseksi. Sitten lisättiin 0,1 ml 0,025 M kalsiumkloridiliuosta ja hyytyminen mitattiin koagulometrillä (Schnitgerin ja Grossin mukaan).
20 Esimerkki 9 [Ala1,Thr2]desulfatohirudiinianalogien 20 tunnin stabiilisuus pH:ssa 7 ja 60 °C:ssa
Testattavaa yhdistettä liuotettiin 20 mM NaPi-liuok-seen, pH 7, jossa oli pitoisuus 300 mM NaCl, pitoisuudeksi 25 0,5 mg/ml ja inkuboitiin 20 tunnin ajan 60 °C:ssa. Ajan kohtina t = 0 ja t = 20 tuntia otettiin näytteitä, jotka analysoitiin RP-HPLC:llä (NucleosilR) sekä anioninvaihto-kromatografisesti (Mono QR) . Vastamuodostuneiden sivutuotteiden osuus laskettiin.
16 98309
Taulukko 2
Optimoitujen desulfatohirudiinien stabiilisuus stressiolosuhteissa: 20 tuntia, 60 °C, pH 7 5 Yhdiste % vastamuodostuneita sivutuotteita [Ala-, Thr3] desulfatohirudiini1 23,0 [Ala*, Thr3, Glu33] de sul f atohirudiini 15,2 10 [Ala1, Thr3, Gin53, Glu53, Glu35] desulfato- 14,6 hirudiini [Ala*, Thr3, Glu33, Gin3-, Glu53, Glu35] - 3,2 desulfatohirudiini 1 kantayhdiste 15 Esimerkki 10 [Ala1,Thr2]desulfatohirudiinianalogien stabiilisuus pH:ssa 6,5 ja 60 °C:ssa
Puhdistettuja isohirudiineja liuotettiin kylmäkuivattuna tuotteena pitoisuudeksi 1 mg/ml veteen ja pH sää-20 dettiin arvoon 6,5 lisäämällä 1 M Na^HPO.-liuosta. Sterii- lisuodatuksen jälkeen liuoksia inkuboitiin ravisteluvesi-hauteessa ja pimeässä 60 °C:ssa. Näytteitä otettiin ajankohtina t = 0, 5, 24, 48, 72 ja 96 tuntia, ja niistä analysoitiin sivutuotepitoisuus RP-HPLC:llä (NucleosilR) ja 25 ioninvaihtokromatografisesti (Mono Q'5) . Esitetään puhtaus ajankohtana t = x suhteessa puhtauteen ajankohtana t = 0, jolloin kummastakin analyysisysteemistä kulloinkin epäsuotuisempi arvo otettiin perustaksi (kuvio 4).
Esimerkki 11 30 [Ala1, Thr2] desulf atohirudiinianalogien stabiilisuus pH:ssa 4 ja 60 °C:ssa
Puhdistettuja isohirudiineja liuotettiin kylmäkuivattuna tuotteena veteen pitoisuudeksi 1 mg/ml, ja pH säädettiin arvoon 4 lisäämällä 1 M etikkahappoa. Inkubointi 35 ja analyysit suoritettiin kuten kuvattiin esimerkissä 10 (kuvio 3).
Il
Claims (5)
1. Menetelmä isohirudiinin valmistamiseksi, jonka stabiilisuus on aiempaa parempi ja jossa ovat seuraavat 5 aminohapot: asemassa 33 Glu; asemassa 52 Gin, Glu, Asn tai Asp; asemassa 53 Glu; asemassa 54 Gly tai Ala; ja asemassa 55 Asp tai Glu, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat menetelmävaiheet: a) valmistetaan vektorit, jotka koodittavat mainit- 10 tuja isohirudiineja; b) ilmennetään mainitut vektorit sopivassa isän-täsolussa; ja c) eristetään ilmennetyt isohirudiinit.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- 15. e t t u siitä, että käytetään vektoreita, jotka koodit tavat seuraavan kaavan mukaisia isohirudiineja: A1-A2-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu- 20
20 Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile- 30 40 Leu-Gly-Ser-B-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly- 50 52 53 54 55 Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-C - D - E - F -Phe-Glu-Glu-25 60 Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln jossa A- on Leu, Ala, Ile tai Vai;
30 A2 on Thr tai Vai; B on Glu; C on Gin tai Glu; D on Glu; E on Gly tai Ala; ja 35 F on Asp tai Glu. 98309
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään vektoreita, jotka koodittavat isohirudiineja, joissa on asemassa 1 Ala tai Leu, asemassa 2 Thr, asemassa 33 Glu, asemassa 52 Gin, 5 asemassa 53 Glu, asemassa 54 Gly ja asemassa 55 Glu.
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään vektoreita, jotka koodittavat isohirudiineja, joissa on asemassa 1 Ala tai Leu, asemassa 33 Glu, asemassa 52 Gin, asemassa 53 Glu, 10 asemassa 54 Ala ja asemassa 55 Asp.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä isohirudiinien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että isäntäsoluproteiinit erotetaan saostamalla happamissa olosuhteissa pH:ssa < = 4, minkä jälkeen tuote 15 puhdistetaan erittäin puhtaaksi kasvualustasta toistuvalla kromatografisella puhdistuksella, joka käsittää ainakin kationinvaihto- ja RP-kromatografiän. 98309
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4140381 | 1991-12-07 | ||
| DE4140381A DE4140381A1 (de) | 1991-12-07 | 1991-12-07 | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI925497A0 FI925497A0 (fi) | 1992-12-03 |
| FI925497L FI925497L (fi) | 1993-06-08 |
| FI98309B FI98309B (fi) | 1997-02-14 |
| FI98309C true FI98309C (fi) | 1997-05-26 |
Family
ID=6446509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI925497A FI98309C (fi) | 1991-12-07 | 1992-12-03 | Menetelmä synteettisten isohirudiinien valmistamiseksi, joilla on parantunut stabiilisuus |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5286714A (fi) |
| EP (1) | EP0549915B1 (fi) |
| JP (1) | JP3352128B2 (fi) |
| KR (1) | KR100249577B1 (fi) |
| CN (1) | CN1036934C (fi) |
| AT (1) | ATE152125T1 (fi) |
| AU (1) | AU662574B2 (fi) |
| CA (1) | CA2084552C (fi) |
| DE (2) | DE4140381A1 (fi) |
| DK (1) | DK0549915T3 (fi) |
| ES (1) | ES2100263T3 (fi) |
| FI (1) | FI98309C (fi) |
| GR (1) | GR3023640T3 (fi) |
| HU (2) | HU9203838D0 (fi) |
| IL (1) | IL103987A (fi) |
| NO (1) | NO303784B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ245374A (fi) |
| PH (1) | PH30345A (fi) |
| TW (1) | TW215442B (fi) |
| ZA (1) | ZA929424B (fi) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19543737A1 (de) * | 1995-11-24 | 1997-05-28 | Hoechst Ag | Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices |
| US5733732A (en) * | 1996-01-03 | 1998-03-31 | University Of Iowa Research Foundation | Methods for detecting primary adhalinopathy |
| RU2180218C2 (ru) * | 1997-01-20 | 2002-03-10 | Джапэн Энерджи Корпорейшн | Способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа |
| DE19944870A1 (de) | 1999-09-18 | 2001-03-29 | Aventis Pharma Gmbh | Signalsequenzen zur Herstellung von Leu-Hirudin über Sekretion durch E. coli in das Kulturmedium |
| US7202059B2 (en) * | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| CN1328380C (zh) * | 2001-09-24 | 2007-07-25 | 天津天士力制药股份有限公司 | 高效表达水蛭素及其生产方法 |
| DE602005023429D1 (de) * | 2004-10-19 | 2010-10-21 | Lonza Ag | Verfahren zur festphasen-peptidsynthese |
| CN102286098B (zh) * | 2011-08-18 | 2013-09-04 | 周维官 | 一种天然水蛭素的生产方法 |
| CN113072639B (zh) * | 2021-03-16 | 2023-07-04 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种高纯度重组水蛭素的纯化方法 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3342139A1 (de) * | 1983-11-22 | 1985-05-30 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
| EP0158564B1 (fr) * | 1984-03-27 | 1992-07-15 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformées et procédé de préparation de l'hirudine |
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| ATE64956T1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445532A1 (de) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Hirudin-pa, desulfatohirudine-pa, verfahren zur herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| DE3506992A1 (de) * | 1985-02-27 | 1986-08-28 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Modifizierte hirudine, verfahren zu deren herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| ATE87938T1 (de) * | 1985-04-11 | 1993-04-15 | Hoechst Ag | Hirudin-derivat. |
| DE3738541A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
| DE3541856A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Hoechst Ag | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
| KR900003028B1 (ko) * | 1985-12-13 | 1990-05-04 | 미쓰비시 뎅기 가부시끼가이샤 | 반도체 집적회로장치 |
| AU604925B2 (en) * | 1988-02-23 | 1991-01-03 | Schering Aktiengesellschaft | A hirudin derivative |
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
-
1991
- 1991-12-07 DE DE4140381A patent/DE4140381A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-11-18 TW TW081109204A patent/TW215442B/zh not_active IP Right Cessation
- 1992-12-03 FI FI925497A patent/FI98309C/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-12-03 US US07/985,110 patent/US5286714A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-04 AU AU29920/92A patent/AU662574B2/en not_active Expired
- 1992-12-04 CA CA002084552A patent/CA2084552C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-04 NO NO924681A patent/NO303784B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-12-04 AT AT92120727T patent/ATE152125T1/de active
- 1992-12-04 HU HU9203838A patent/HU9203838D0/hu unknown
- 1992-12-04 ES ES92120727T patent/ES2100263T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-04 EP EP92120727A patent/EP0549915B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-04 DK DK92120727.0T patent/DK0549915T3/da active
- 1992-12-04 NZ NZ245374A patent/NZ245374A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-12-04 ZA ZA929424A patent/ZA929424B/xx unknown
- 1992-12-04 IL IL10398792A patent/IL103987A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-12-04 DE DE59208398T patent/DE59208398D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-04 HU HU9203838A patent/HU214701B/hu unknown
- 1992-12-04 JP JP32525592A patent/JP3352128B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-12-05 KR KR1019920023378A patent/KR100249577B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-07 PH PH45381A patent/PH30345A/en unknown
- 1992-12-07 CN CN92114142A patent/CN1036934C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-07-29 US US08/099,053 patent/US5316947A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-05-30 US US08/452,829 patent/US5616476A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-30 GR GR970401286T patent/GR3023640T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3352128B2 (ja) | 2002-12-03 |
| CA2084552C (en) | 2007-03-27 |
| ZA929424B (en) | 1993-05-27 |
| NZ245374A (en) | 1995-04-27 |
| FI925497A0 (fi) | 1992-12-03 |
| FI925497L (fi) | 1993-06-08 |
| FI98309B (fi) | 1997-02-14 |
| IL103987A (en) | 1997-02-18 |
| NO303784B1 (no) | 1998-08-31 |
| US5286714A (en) | 1994-02-15 |
| AU662574B2 (en) | 1995-09-07 |
| IL103987A0 (en) | 1993-05-13 |
| US5316947A (en) | 1994-05-31 |
| NO924681L (no) | 1993-06-08 |
| KR100249577B1 (ko) | 2000-03-15 |
| EP0549915A1 (de) | 1993-07-07 |
| ATE152125T1 (de) | 1997-05-15 |
| ES2100263T3 (es) | 1997-06-16 |
| AU2992092A (en) | 1993-06-10 |
| DE59208398D1 (de) | 1997-05-28 |
| CA2084552A1 (en) | 1993-06-08 |
| TW215442B (fi) | 1993-11-01 |
| HUT70452A (en) | 1995-10-30 |
| DE4140381A1 (de) | 1993-06-09 |
| JPH05310789A (ja) | 1993-11-22 |
| HU9203838D0 (en) | 1993-03-29 |
| NO924681D0 (no) | 1992-12-04 |
| US5616476A (en) | 1997-04-01 |
| HU214701B (hu) | 1998-08-28 |
| PH30345A (en) | 1997-04-02 |
| CN1036934C (zh) | 1998-01-07 |
| EP0549915B1 (de) | 1997-04-23 |
| GR3023640T3 (en) | 1997-08-29 |
| DK0549915T3 (da) | 1997-10-20 |
| CN1073978A (zh) | 1993-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5874406A (en) | Synthetic peptide analogs of lung surface protein SP-C | |
| FI102076B (fi) | Menetelmä mini-proinsuliinin ja insuliinin valmistamiseksi | |
| JP2551551B2 (ja) | デスルファトヒルジン、その製造及びそれを含む製薬組成物 | |
| EP0216833B1 (en) | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives | |
| KR100467751B1 (ko) | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 | |
| KR20100111683A (ko) | 극히 지연된 시간-작용 프로필을 갖는 신규 인슐린 유도체 | |
| CZ286066B6 (cs) | Způsob přípravy krystalického Lys B28 Pro B29-lidského inzulínu | |
| CN102083855A (zh) | 活性延长的新胰岛素类似物 | |
| BRPI0014464B1 (pt) | Precursor de insulina humana ou seu análogo, e seu emprego | |
| FI98309C (fi) | Menetelmä synteettisten isohirudiinien valmistamiseksi, joilla on parantunut stabiilisuus | |
| Dai et al. | Characteristic, activity and conformational studies of [A6-Ser, A11-Ser]-insulin | |
| US6800606B1 (en) | Monomeric analogues of human insulin | |
| AU660421B2 (en) | Growth factor compositions, preparation and use | |
| JP2006508695A (ja) | 単量体インスリン | |
| WO1990005184A1 (en) | Expression and processing of authentic fgf's in yeast | |
| CA2089143C (en) | Growth factor compositions, preparation and use | |
| AU2004240623A1 (en) | Process for manufacture of Nematode-extracted Anticoagulant Protein (NAP) | |
| HK1000891B (en) | Synthetic peptide analogs of lung surfactant protein sp-c | |
| HK1149772A1 (zh) | 具有超延迟时效特徵的新型胰岛素衍生物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: BAYER SCHERING PHARMA AKTIENGESELLSCHAFT Free format text: BAYER SCHERING PHARMA AKTIENGESELLSCHAFT |
|
| MA | Patent expired |