JP2023547675A - ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法を提供する。該ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのアミノ酸サイトとして、Ｔ１、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ３０、Ｋ３５、Ｋ７６、Ｋ７９、Ｋ９７、Ｋ１１２、Ｋ１１６、Ｋ１２０、Ｋ１５２、Ｋ１７９、Ｋ２２２、Ｋ２３１、Ｋ２６６、Ｋ２７２、Ｋ２８５、Ｋ２９１、Ｋ２９３のうちの少なくとも１１つがＰＥＧ修飾を有し、該製造方法は、尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールをカップリング反応させるステップを含み、ポリエチレングリコールは酸性溶液の形態で提供され、尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（５６～９４）であり、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼを取得するようにする。【選択図】なし

Description

本発明はバイオ医薬の分野に関し、具体的に、本発明はポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法に関し、より具体的に、本発明はポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法、尿酸オキシダーゼの免疫原性を低下させる方法、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ、薬物組成物、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製薬用途に関する。

痛風はプリン代謝の乱れによって引き起こされる疾患で、その臨床特徴は高尿酸血症であり、尿酸塩が皮下、関節、腎臓に沈着することで痛風石を形成する。人体内のプリンは一連の変化を経て、最終的に形成された産物は尿酸であり、血液尿酸濃度が７０ｍｇ／Ｌを超えると、高尿酸血症を引き起こす。５％～１２％の高尿酸患者は痛風に発展する可能性がある。血液または滑嚢液中で、尿酸ナトリウム濃度が飽和状態に達すると、尿酸ナトリウム塩の微晶体が形成され、痛風性関節炎を引き起こす。時間の経過とともに、慢性高尿酸血症も関節週囲、軟部組織及び一部の臓器に沈着して破壊的な結晶性尿酸沈着物を生成し、痛風性急性関節炎、痛風石性慢性関節炎及び関節奇形などの疾患を引き起こす。腎臓障害は、痛風の２番目の一般的な臨床症状と考えられる。慢性高尿酸血症が徐々に進行し、髄質、尿細管及び腎間質内尿酸塩沈着を引き起こし、局所を刺激し、炎症反応を引き起こし、慢性尿酸塩腎症と呼ばれ、重度の高尿酸血症患者（例えば一部の悪性腫瘍、特に白血病とリンパ腫患者）は、短期間に大量の尿酸が腎臓の集合管、腎盂、腎杯及び尿管に沈着し、管腔の閉塞、尿閉が発生し、急性腎不全（尿酸腎症とも呼ばれる）を引き起す可能性がある。

ここ数十年来、人々の生活の質の向上と飲食と生活習慣の変化に伴い、高タンパク質と高プリンの食摂取が増加し、痛風患者の数は年々増加している傾向がある。ヨーロッパでは痛風患者の数は過去２０年間で約２倍になった。わが国の現在の高尿酸血症と痛風の発病率は約２～３％に上昇した。高尿酸血症に臨床症状が現れなければ、食事をコントロールすればよく、それに起因する臨床症状が現れた場合、薬物治療を行う必要がある。現在臨床で使用されている一般的な治療手段は、主に痛風性関節炎の急性発作症状を制御し、関節の局所的な疼痛、腫れ及び炎症を解消するためのコルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、イブプロフェン（ｂｕｐｒｏｆｅｎ）、ナプロキセン（ｎａｐｒｏｘｅｎ）などの鎮痛消炎系薬物、プロベニシド（ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）、スルフィンピラゾン（ｓｕｌｆｉｎｐｙｒａｚｏｎｅ）、ベンゾブロモマロロン（ｂｅｎｚｂｒｏｍａｒｏｎｅ）などの尿酸排泄を促進する促尿酸尿剤（腎機能が低下すれば無効）、アロプリノール（ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ）などの尿酸合成を抑制する薬物がある。痛風石性痛風、腎機能不全、白血病及び一部の遺伝病を患っている患者にとって、アロプリノールは主な治療薬物であり、キサンチンオキシダーゼを抑制し、ヒポキサンチン及びキサンチンが尿酸に変換できないようにし、それ自体が人体内で徐々に酸化し、水に溶けやすいイソキサンチン（ｏｘｉｐｕｒｉｎｏｌ）を生成して尿を通して排出する。しかしながら、全ての通常の治療法は、痛風石を形成した慢性痛風の患者を治癒することは困難である。なお、上記薬物を長期間服用した後、患者は、白血球の減少、心臓機能の損傷、肝腎機能の損傷、胃腸系の刺激、再生障害性貧血による糖尿病、痛風などの合併症を避けることができない。

ヒト高尿酸血症はヒトの進化過程における尿酸酵素遺伝子の変異不活性化と関係しており、変異はヒト尿酸酵素遺伝子のコード配列に早期終止コドン（Ｗｕ Ｘ、Ｌｅｅ Ｃ Ｃ、Ｍｕｚｎｙ Ｄ Ｍ、Ｃａｓｋｅｙ Ｃ Ｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ．１９８９．８６ ：９４１２－９４１６．）を導入しているため、ヒトは自分で活性尿酸酵素を合成することができず、ヒトのプリン体の分解代謝が尿酸（Ｗｕ Ｘ、Ｍｕｚｎｙ Ｄ Ｍ、Ｌｅｅ Ｃ Ｃ、Ｃａｓｋｅｙ Ｃ Ｔ．Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．１９９２．３４ ：７８－８４．）で終了する。非ヒト霊長目動物や他の哺乳動物の肝臓ペルオキシダーゼ体中の活性尿酸酵素は、溶解性の低い尿酸塩（～１１ｍｇ／１００ｍｌ水）をより溶けやすいアラントイン（～１４７ｍｇ／１００ｍｌ水）に変換し、腎からより効果的に排泄することができる（Ｗｏｒｔｍａｎｎ Ｒ Ｌ、Ｋｅｌｌｅｙ Ｗ Ｎ．Ｋｅｌｌｅｙ’ｓ ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（６ｔｈ）．２００１ ：１３３９－１３７６）。欧米では、アフラトキシン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）で製造される尿酸酵素（Ｕｒｉｃｏｚｙｍｅ）は腫瘍化学療法に関連する重症高尿酸血症の治療に１０年以上に達している（Ｚｉｔｔｏｕｎ Ｒ、Ｄａｕｃｈｙ Ｆ、Ｔｅｉｌａｕｄ Ｃ、Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ Ｍ、Ｂｏｕｃｈａｒｄ Ｐ．Ａｎｎ Ｍｅｄ Ｉｎｔｅｒｎｅ．１９７８．１２７ ：４７９－４８２．）。フランスのＳａｎｏｆｉ社が開発したビール酵母発酵で生産された組換えアフラトキシン尿酸酵素薬物ＥＬＩＴＥＫは２００２年にＦＤＡ認証を取得し、腫瘍化学療法による深刻な高尿酸血症の短期治療に使用され（Ｐｕｉ Ｃ Ｈ、Ｒｅｌｌｉｎｇ Ｍ Ｖ、Ｌａｓｃｏｍｂｅｓ Ｆ、ＨａｒｒｉｓｏｎＰ Ｌ、Ｓｔｒｕｘｉａｎｏ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９７．１１ ：１８１３－１８１６．）、同時に、ＥＬＩＴＥＫの点滴は痛風石の体積を減らすこともできることを証明した（Ｐｏｔａｕｘ Ｌ、Ａｐａｒｉｃｉｏ Ｍ、Ｍａｕｒｅｌ Ｃ、Ｒｕｅｄａｓ Ｍ Ｅ、Ｍａｒｔ ｉｎ Ｃ Ｌ．Ｎｏｕｖ ＰｒｅｓｓｅＭｅｄ．１９７５．４ ：１１０９－１１１２．）。２０１０年９月にＦＤＡが市販を承認した米国Ｓａｖｉｅｎｔ社製のＰＥＧ修飾組換えブタ由来尿酸酵素（Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ）は、頑固性痛風の治療に用いられたが、免疫原性の問題を解決していないため、臨床応用では約５０％の患者が無効であった。

尿酸酵素（Ｅ Ｃ １．７．３．３）は微生体（バチルス‐ファスティディオスス、モノカンジダ、アフラトキシン）、植物（大豆、ひよこ豆）、動物（豚、牛、犬、ヒヒ）に広く存在し（Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ、Ｓａｋａｓｅｇａｗａ Ｓ、Ｍｉｓａｋｉ Ｈ、ＳｕｇｉｙａｍａＭ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．２００４．９８ ：１５３－１５８）、酸素の存在下で尿酸がアラントインを酸化することを触媒し、二酸化炭素を放出することができる（Ｒｅｔａｉｌｌｅａｕ Ｐ、Ｃｏｌｌｏｃ’ｈ、Ｄｅｎｉｓ Ｖ、Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ Ｂ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ．２００４．６０ ：４５３－４６２．）。

活性を持つ尿酸酵素は四量体タンパク質であり、同じサブユニットで構成され、各サブユニットの分子量は３４ｋＤ程度であり、３０１－３０４個のアミノ酸で構成される。各溶液中の尿酸酵素の酵素活性が最も高いｐＨ値は８．０（Ｂａｙｏｌ Ａ ｅｔａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．１９９５．５４ ：２２９－２３５．）である。現在知られている全ての由来の尿酸酵素の中で、活性が最も高いのはアフラトキシン由来で、２７ＩＵ／ｍｇに達し、次に、バチルス‐ファスティディオススに由来し、その活性は１３ＩＵ／ｍｇに保持される（ＨｕａｎｇＳ Ｈ、Ｗｕ Ｔ Ｋ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４．２７１ ：５１７－５２３．）。また、豆類植物由来の尿酸酵素は、その活性が２～６ＩＵ／ｍｇだけであり、哺乳類動物由来の尿酸酵素は、組換え発現を経た後、豚の尿酸酵素活性は５ＩＵ／ｍｇに達することができ、ヒヒの尿酸酵素の酵素活性は１ＩＵ／ｍｇだけであり（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈ、Ｓｕｓａｎ Ｊ．Ｋ．２００６．ＵＳ７０５６７１３Ｂ１）、ヒト由来の尿酸酵素は不活性である。

人体応用として、微生体尿酸酵素の高活性と哺乳動物の尿酸酵素の低免疫原性により、この２つの主要な由来の尿酸酵素は現在開発応用されている組換え尿酸酵素の研究の焦点となっている。しかし、アフラトキシン由来の尿酸酵素と推定されるヒト由来尿酸酵素との相同性は４０％未満であり（Ｌｅｅ Ｃ Ｃ、Ｗｕ Ｘ、Ｇｉｂｂｓ Ｒ Ａ、Ｃｏｏｋ Ｒ Ｇ、Ｍｕｚｎｙ Ｄ Ｍ、ＣａｓｋｅｙＣ Ｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８．２３９ ：１２８８－１２９１．）、人体では抗尿酸酵素抗体が発生しやすく、アフラトキシン尿酸酵素の効果が急速に弱めると同時に、深刻なアレルギー反応を引き起こし、長期治療には使用できない。ヒト尿酸酵素遺伝子が変異して活性を失い、偽遺伝子となる。

このため、尿酸オキシダーゼに基づく高尿酸血症の治療技術は依然とし更なる開発と改善が必要である。

本願は、発明者の以下の事実と問題に対する発見と認識に基づいて作成されたものである。

活性尿酸オキシダーゼは相同四量体タンパク質であり、そのうちの三分の一のアミノ酸は強疎水性アミノ酸であり、四量体タンパク質同士が凝集して八量体及びより大きな重合体を形成しやすい。分子量が１００ｋＤａを超える分子は生体の免疫反応を効果的に誘導できるが、未修飾ポリ尿酸オキシダーゼタンパク質の分子量はすでに１４０ｋＤａに達しており、より大きな分子量の多量体尿酸酵素はより高い免疫原性を有する。人体は抗尿酸酵素抗体を産生しやすく、その効果を迅速に弱め、同時に深刻なアレルギー反応を引き起こし、長期治療には使用できない。ＰＥＧでタンパク質を共有修飾することで、タンパク質の免疫原性を低下させ、タンパク質の溶解度を増加させ、タンパク質の半減期を延長できることが証明された。

デューク大学（Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）と山景会社（Ｓａｖｉｅｎｔ）は、豚由来とヒヒ由来のキメラ尿酸酵素の研究を行った（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈ、Ｓｕｓａｎ Ｊ．Ｋ．２００６．ＵＳ７０５６７１３Ｂ１）。この研究の方法は、酵素活性が明らかに減少しないことを保証したまま、分子量が１０ＫＤａのメトキシ基含有ポリエチレングリコール（１０ＫＤａ－ｍＰＥＧ－ＮＰＣ）で豚由来の尿酸酵素リシン残基のε－アミノ基を修飾することで（得られた修飾製品はＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅである）、人体で頑固性痛風を治療する目標を初歩的に達成した。発明者は、上記の研究成果は薬物による免疫原性の問題を徹底的に解決するものではなく、臨床被験者が何度も注射した後、尿酸酵素の治療効果がなくなる現象が現れたことを発見し、これはＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅタンパク質の分子量が大きすぎる（Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ分子量が５４０ ｋＤａである）ことに関係があるかもしれないと推測し、同時にｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅは注射に適しておらず、静脈注射に適しているため、被験者の長期間使用のコンプライアンスを低下させ、臨床応用を厳重に制限した。これまで、免疫原性がより低いものや皮下注射を採用できる長寿命尿酸オキシダーゼ薬はなかった。

本発明は、関連技術における技術的問題の一つを少なくとも一定の程度で解決することを主旨とする。

本発明の第１の態様では、本発明はポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法を提案する。本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのアミノ酸サイトとして、Ｔ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３のうちの少なくとも１１つがＰＥＧ修飾を有し、前記方法は、尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールをカップリング反応させるステップを含み、前記ポリエチレングリコールは酸性溶液の形態で提供され、前記尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（５６～９４）であり、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼを取得するようにする。本発明の実施例による方法によって製造されるポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは、その修飾サイトＴ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３のうちの少なくとも１１つのサイトはＰＥＧ修飾を有する。なお、本願による「尿酸オキシダーゼ」は広義に理解されるべきであり、実際の生産実践において、同一のバッチで産出される尿酸オキシダーゼの混合物の総称である。本発明の実施例による方法によって得られるポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは、酵素活性を最大限に確保した上で、尿酸オキシダーゼの体内安定性を大幅に向上させ、免疫原性を低下させることができ、また、筋肉注射後の体内薬効は原研薬の静脈注射後に相当する体内薬効に達することができる。

本発明の実施例によれば、上記方法は、次の付加的な技術的特徴の少なくとも１つをさらに含んでもよい。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコールは酸性溶液の形態で提供される。発明者は、ＰＥＧを酸性溶液に溶解することにより、ポリエチレングリコールがタンパク質と反応する前に活性基の加水分解を起こすことを防止することができ、さらに、ポリエチレングリコールの有効な活性化効率を効果的に確保することができ、同時に、ポリエチレングリコールの固体がカップリング反応緩衝液に直接溶解する時に現れた局所的な濃度が高すぎて、溶解が不均一であり、ポリエチレングリコールとカップリングタンパク質の接触が不均一で、気泡が発生してカップリング反応を妨害するなどの欠陥を解決し、尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのカップリング反応効率を効果的に向上させることができることを発見した。

本発明の実施例によれば、前記酸性溶液は、有機酸と無機酸から選ばれる少なくとも１種を含む酸性溶液である。

本発明の実施例によれば、前記有機酸は、
酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、酪酸、シクロペンチルプロピオン酸、ジグルコン酸、ラウリル硫酸、エタンスルホン酸、ギ酸、トランスブテン二酸、グルコヘプトン酸、グリセリンリン酸、グルコン酸、ヘプタン酸、カプロン酸、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸、ラクトウロン酸、乳酸、ラウリン酸、ラウリル硫酸、リンゴ酸、マロン酸、メタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ペクチン酸、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸、プロピオン酸、ステアリン酸、パラトルエンスルホン酸、ウンデカン酸、吉草酸から選ばれる。
本発明の実施例によれば、前記無機酸は、
塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、過塩素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、過硫酸、ホウ酸、重クロム酸、ケイ酸、クロム酸、チオシアン酸から選ばれる。

本発明の実施例によれば、前記酸性溶液中の水素イオンの濃度は１～５ｍｍｏｌ／Ｌである。

本発明の実施例によれば、前記酸性溶液は塩酸または硫酸または氷酢酸を含む。

本発明の実施例によれば、前記酸の酸性溶液での濃度は１～５ｍｍｏｌ／Ｌである。

本発明の実施例によれば、前記尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（４５～１１０）である。

本発明の実施例によれば、前記尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（５６～９４）である。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコールの前記酸性溶液中の濃度は１００～３００ｍｍｏｌ／Ｌである。発明者は、ポリエチレングリコールの酸中の濃度は上記濃度範囲内にあり、反応溶液の粘稠度が適切であり、反応効率を高め、工業生産を拡大するのに有利であることを発見した。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール分子量は６ＫＤ以下である。発明者は、分子量が６ＫＤ以下であるポリエチレングリコールと尿酸オキシダーゼとのカップリング反応により、得られたポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの体内での長寿命性がさらに向上し、且つ抗尿酸酵素抗体が産生しなく、抗ＰＥＧ抗体がほとんど産生されなく、すなわち免疫原性がさらに低下すると発見した。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコールはモノメトキシまたは水酸基を有する。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコールは直鎖または分岐鎖構造である。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコールと尿酸オキシダーゼとはアミド結合によりカップリングされる。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコールは修飾性ポリエチレングリコールであり、前記修飾性ポリエチレングリコールの修飾基は、
Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドカーボネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドアセテート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドプロピオン酸エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド酪酸エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドコハク酸エステル及びｐ－ニトロフェニルカーボネートから選ばれる。

本発明の実施例によれば、前記修飾性ポリエチレングリコールの修飾基はＮ－ヒドロキシスクシンイミドである。

本発明の実施例によれば、前記カップリング反応は炭酸塩緩衝溶液の中で行う。

本発明の実施例によれば、前記炭酸塩緩衝溶液のｐＨは９～１１である。発明者は、緩衝ｐＨが９．０以下の場合、尿酸酵素の溶解性に深刻な影響を与え、次の修飾反応を行うことができなく、また、緩衝ｐＨが１１以上の場合、尿酸酵素の活性に深刻な影響を与え、同時に、ポリエチレングリコールと尿酸オキシダーゼのカップリング効率も低下させることを発見した。

本発明の実施例によれば、前記尿酸オキシダーゼのカップリング反応系での濃度は１０ｍｇ／ｍｌである。発明者は、尿酸オキシダーゼのカップリング反応系での濃度は上記濃度内にあり、反応溶液の粘稠度が適切であり、反応効率を高め、工業生産を拡大するのに有利であることを発見した。同時に、発明者は、尿酸オキシダーゼのタンパク質濃度は尿酸オキシダーゼの平均修飾度に影響を与え、取得された尿酸オキシダーゼは同じＰＥＧ平均修飾度を有する下で、１０ｍｇ／ｍｌの尿酸オキシダーゼは必要なＰＥＧ投入比が低く、生産コストを節約できることを発見した。

本発明の実施例によれば、前記カップリング反応は５～３０℃の条件で少なくとも６０分間行う。前記カップリング反応は上記温度条件で少なくとも６０分間行うことによって、尿酸オキシダーゼのＴ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３のうちの少なくとも１１つのサイトがＰＥＧ修飾を発生させることが効果的に実現される。

本発明の実施例によれば、カップリング反応生成物を限外濾過及び／又は精製処理するステップをさらに含む。未修飾のポリエチレングリコールや副生成物、例えばＮＨＳを効果的に除去し、得られたポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの純度を効果的に向上させることができる。

本発明の実施例によれば、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^２２２及びＫ^２３１のアミノ酸サイトの少なくとも１つはＰＥＧ修飾を有する。

本発明の実施例によれば、前記アミノ酸サイトの局在化はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列で局在化される。
ＴＹＫＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＩＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＴＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＬＨＧＤＮＳＤＶＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＮＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＴＦＡＶＴＩＣＥＨＦＬＳＳＦＫＨＶＩＲＡＱＶＹＶＥＥＶＰＷＫＲＦＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＹＴＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＩＲＮＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＱＶＹＣＫＷＲＹＨＱＧＲＤＶＤＦＥＡＴＷＤＴＶＲＳＩＶＬＱＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＬＴＬＧＱＶＰＥＩＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＬＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＫＩＴＧＴＶＫＲＫＬＳＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。

本発明の実施例によれば、前記尿酸オキシダーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７で示されるアミノ酸配列を有する。
ＭＡＨＹＲＮＤＹＫＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＩＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＬＨＧＤＮＳＤＶＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＮＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＴＦＡＶＴＩＣＥＨＦＬＳＳＦＫＨＶＩＲＡＱＶＹＶＥＥＶＰＷＫＲＦＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＹＴＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＩＲＮＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＱＶＹＣＫＷＲＹＨＱＧＲＤＶＤＦＥＡＴＷＤＴＶＲＳＩＶＬＱＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＬＴＬＧＱＶＰＥＩＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＬＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＲＩＴＧＴＶＫＲＫＬＴＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
ＭＹＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＶＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＶＹＧＤＮＳＤＩＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＨＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＴＦＡＭＮＩＣＥＨＦＬＳＳＦＮＨＶＩＲＡＱＶＹＶＥＥＶＰＷＫＲＦＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＨＮＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＭＲＳＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＫＶＹＣＫＷＲＹＨＱＧＲＤＶＤＦＥＡＴＷＤＴＶＲＤＩＶＬＥＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＨＳＬＳＲＶＰＥＭＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＦＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＫＩＴＧＴＶＫＲＫＬＳＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
ＭＡＨＹＨＮＤＹＫＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＶＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＶＹＧＤＮＳＤＩＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＨＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＴＦＡＭＮＩＣＥＨＦＬＳＳＦＮＨＶＩＲＡＱＶＹＶＥＥＶＰＷＫＲＦＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＨＮＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＭＲＳＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＫＶＹＣＫＷＲＹＨＱＧＲＤＶＤＦＥＡＴＷＤＴＶＲＤＩＶＬＥＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＨＳＬＳＲＶＰＥＭＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＦＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＲＩＴＧＴＡＫＲＫＬＡＳＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
ＭＡＨＹＨＮＤＹＱＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＶＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＮＳＲＲＥＹＬＨＧＤＮＳＤＩＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＱＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＴＦＡＭＮＩＣＥＨＦＬＳＳＦＮＨＶＩＲＶＱＶＹＶＥＥＶＰＷＫＲＦＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＨＴＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＬＲＳＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＬＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＱＶＹＣＫＷＲＹＨＱＧＲＤＶＤＦＥＡＴＷＥＡＶＲＧＩＶＬＫＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＬＳＬＳＱＬＰＥＩＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＦＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＲＩＴＧＴＶＫＲＫＬＴＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）。
ＭＡＨＹＨＮＤＹＫＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＶＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＬＨＧＤＮＳＤＩＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＨＡＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＡＦＡＶＮＩＣＱＨＦＬＳＳＦＮＨＶＩＲＴＱＶＹＶＥＥＩＰＷＫＲＬＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＨＴＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＬＲＳＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＡＱＶＹＣＫＷＲＹＨＱＣＲＤＶＤＦＥＡＴＷＤＴＩＲＤＶＶＬＥＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＶＳＬＳＱＶＰＥＩＤＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＦＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＫＩＴＧＴＶＫＲＫＬＳＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
ＭＡＤＹＨＮＮＹＫＫＮＤＥＬＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＶＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＬＨＧＤＮＳＤＩＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＨＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＡＦＧＶＮＩＣＥＹＦＬＳＳＦＮＨＶＩＲＡＱＶＹＶＥＥＩＰＷＫＲＬＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＨＴＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＬＲＳＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＱＶＹＣＫＷＲＹＨＱＣＲＤＶＤＦＥＡＴＷＧＴＩＲＤＬＶＬＥＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＬＳＬＳＲＶＰＥＩＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＦＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＫＩＴＧＴＶＫＲＫＬＳＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列は、豚由来とヒヒ由来のキメラ尿酸酵素（豚ヒヒ）のアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列は豚由来の尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列は犬由来とヒヒ由来（犬ヒヒ）のキメラ尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列は犬由来の尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるアミノ酸配列は牛由来の尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列はサルの尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるアミノ酸配列はヒヒの尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列である。

なお、本願のリシンの局在化はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列に基づいて行われ、例えばＫ^４とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいて、第４位に位置するリシンである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７に示されるアミノ酸配列を有する尿酸酵素またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は添加を有するポリペプチドは構造的に相同性を有し、当業者は、配列比較により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は添加を有するポリペプチドに、Ｔ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３サイトに対応する対応サイトを決定することができ、さらに、上記ポリペプチドが比較する上での対応サイトにＰＥＧ修飾を起こし、本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの低い免疫原性、高い体内安定性、筋肉注射に適する利点が実現される。

例えば、本発明の実施例によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列のＴ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３サイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^９、Ｋ^１０、Ｋ^３６、Ｋ^４１、Ｋ^８２、Ｋ^８５、Ｋ^１０３、Ｋ^１１８、Ｋ^１２２、Ｋ^１２６、Ｋ^１５８、Ｋ^１８５、Ｋ^２２８、Ｋ^２３７、Ｋ^２７２、Ｋ^２７８、Ｋ^２９７、Ｋ^２９９を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列の対応するサイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^３、Ｋ^２９、Ｋ^３４、Ｋ^７５、Ｋ^７８、Ｋ^１１１、Ｋ^１１５、Ｋ^１１９、Ｋ^１５１、Ｋ^１７８、Ｋ^２２１、Ｋ^２３０、Ｋ^２６５、Ｋ^２７１、Ｋ^２８４、Ｋ^２９０、Ｋ^２９２を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列の対応するサイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^９、Ｋ^１０、Ｋ^３６、Ｋ^４１、Ｋ^８２、Ｋ^８５、Ｋ^１１８、Ｋ^１２２、Ｋ^１２６、Ｋ^１５８、Ｋ^１８５、Ｋ^２２８、Ｋ^２３７、Ｋ^２７２、Ｋ^２７８、Ｋ^２９７、Ｋ^２９９を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列の対応するサイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^１０、Ｋ^３６、Ｋ^４１、Ｋ^８２、Ｋ^８５、Ｋ^１１８、Ｋ^１２２、Ｋ^１２６、Ｋ^１５８、Ｋ^１８５、Ｋ^２２８、Ｋ^２３７、Ｋ^２７２、Ｋ^２７８、Ｋ^２９７、Ｋ^２９９を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列の対応するサイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^９、Ｋ^１０、Ｋ^３６、Ｋ^４１、Ｋ^８２、Ｋ^８５、Ｋ^１１８、Ｋ^１２２、Ｋ^１２６、Ｋ^１５８、Ｋ^１８５、Ｋ^２２８、Ｋ^２３７、Ｋ^２７２、Ｋ^２７８、Ｋ^２９１、Ｋ^２９７、Ｋ^２９９を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列の対応するサイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^９、Ｋ^１０、Ｋ^３６、Ｋ^４１、Ｋ^８２、Ｋ^８５、Ｋ^１１８、Ｋ^１２２、Ｋ^１２６、Ｋ^１５８、Ｋ^１８５、Ｋ^２２８、Ｋ^２３７、Ｋ^２７２、Ｋ^２７８、Ｋ^２９１、Ｋ^２９７、Ｋ^２９９を含む。発明者は試験により、上記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７で示されるアミノ酸配列の対応するサイトの少なくとも１１つのサイトにＰＥＧ修飾を発生させた後、得られたＰＥＧ修飾の尿酸オキシダーゼは低い免疫原性、高い体内安定性、筋肉注射に適する利点を有すると発見した。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのペプチドマップはポリエチレングリコールで修飾されていない前記尿酸オキシダーゼのペプチドマップと比べて、少なくとも１１つの所定のペプチドセグメントを有するピーク面積が減少する相対割合は７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。本発明の実施例によるポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは低い免疫原性、高い体内安定性、筋肉注射に適する利点を有する。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのペプチドマップは表８で示されるピーク面積低下ペプチドセグメントを有する。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのペプチドマップは図６または図７に示される。

本発明の第２の態様では、本発明は、尿酸オキシダーゼの免疫原性を低下させる方法を提供する。本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのＴ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３のアミノ酸サイトのうちの少なくとも１１つがＰＥＧ修飾を発生させ、前記方法は、尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールをカップリング反応させ、前記ポリエチレングリコールは酸性溶液の形態で提供され、前記尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（５６～９４）であるステップを含み、本発明の実施例の方法によれば、尿酸オキシダーゼの免疫原性を効果的に低下させることができ、得られた尿酸オキシダーゼの体内安全性がより高く、作用がより長寿命である。

理解できることとして、以上のようなポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法の付加的な技術的特徴と付加的な技術的特徴が備える技術的効果は本発明の実施例による上記尿酸オキシダーゼの免疫原性を低下させる方法の付加的な技術的特徴に適用し、本発明の実施例による上記尿酸オキシダーゼの免疫原性を低下させる方法の付加的な技術的特徴について、ここで繰り返して説明しない。

本発明の第３の態様では、本発明はポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼを提供する。本発明の実施例によれば、前記尿酸オキシダーゼは以上のような方法によって得られる。本発明の実施例によるポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは、酵素活性を最大限に確保した上で、尿酸オキシダーゼの体内安定性を大幅に向上させ、免疫原性を低下させることができ、筋肉注射後の体内薬効はすでに市販されている類似薬の静脈注射後に相当する体内薬効に達する。

本発明の第４の態様では、本発明は薬物組成物を提供する。本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は以上のような尿酸オキシダーゼを含む。本発明の実施例による薬物組成物は低い免疫原性、高い体内安定性、筋肉注射に適する利点を有し、高尿酸関連疾患の治療や予防に用いることができる。

本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は、次の付加的な技術的特徴の少なくとも１つをさらに含む。

本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は薬学的に許容できる補助剤をさらに含む。

本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は、高尿酸関連疾患を治療または予防する他の薬物をさらに含む。

本発明の第５の態様では、本発明は以上のような尿酸オキシダーゼまたは以上のような薬物の、組成物の薬物製造での使用を提供し、前記薬物は、高尿酸関連疾患を治療し、被験者が必要な生体流体中の尿酸レベルを低下するために使用される。本発明の実施例による尿酸オキシダーゼは低い免疫原性、高い体内安定性、筋肉注射に適する利点を有し、高尿酸関連疾患の治療に顕著な優位性がある。

本発明の実施例によれば、上記使用は、次の付加的な技術的特徴の少なくとも１つをさらに含んでもよい。

本発明の実施例によれば、前記高尿酸関連疾患は、慢性高尿酸血症、痛風、腎臓疾患、高尿酸性関節炎、腎臓結石、痛風性結節、高血圧、糖尿病、高トリグリセリド血症、メタボリックシンドローム、冠状動脈性心臓病から選ばれる疾患を含む。

本発明の実施例によれば、前記生体流体は尿または血液である。

本発明の実施例によるＰＨＣ理化学対照品－ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶ検出図である。 本発明の実施例によるＰＨＣ理化学対照品－ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＲＩ検出図である。 本発明の実施例によるＰＥＧ参照品－ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＲＩ検出図である。 本発明の実施例によるＰＵ５修飾生成物－ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶ検出図である。 本発明の実施例によるＰＵ５修飾生成物－ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＲＩ検出図である。 本発明の実施例によるＰＨＣとＰＵ５の、それぞれＬｙｓ－ｃとトリプシンを用いた二重酵素切断比較図である。 本発明の実施例によるＰＵ５ Ｌｙｃ酵素切断図である。 本発明の実施例によるモデルラットに異なる薬投与量を筋肉投与した後の血清尿酸レベルである。 本発明の実施例による腎損傷壊死及び炎症スコア図である。 本発明の実施例によるＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を同量（１．０ ｍｇ／ｋｇ）で１回静脈注射した後の各群の平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤ ラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅと異なる投与量のポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を１回筋肉注射した後の各群の平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットに異なる投与量のポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を１回筋肉注射した後の各群の平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットに異なる投与量のＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を１回筋肉／静脈注射した後の各群の異なる時間の血尿酸平均値－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を同量（１．０ ｍｇ／ｋｇ）で初めて（Ｄａｙ１）静脈注射した後のオスとメスの平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を同量（１．０ ｍｇ／ｋｇ）で最後（Ｄａｙ２２）に静脈注射した後のオスとメスの平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を同量（１．０ ｍｇ／ｋｇ）で初めて（Ｄａｙ１）筋肉注射した後のオスとメスの平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を同量（１．０ ｍｇ／ｋｇ）で最後（Ｄａｙ２２）に静脈注射した後のオスとメスの平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を複数回静脈注射した後の異なる時間血尿酸平均値－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を複数回筋肉注射した後の異なる時間血尿酸平均値－時間曲線図である。

以下、本発明の実施例を詳細に説明し、前記実施例の例が図面に示される。以下、図面を参照して説明する実施例は例示的なものであり、本発明を解釈することを主旨とし、本発明を制限するものとして理解されるべきではない。

本発明の目的は、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法を提供することである。

本発明の他の一つの目的は、新しいポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼを提供することである。

本発明の別の一つの目的は、尿酸オキシダーゼの免疫原性を効果的に低下させる方法を提供することであり、該技術は、尿酸オキシダーゼの免疫原性を効果的に低下させ、尿酸オキシダーゼの体内安全性と安定性を向上させることができる。

本発明の別の一つの目的は、上記得られたポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼカップリング物の応用を提供することであり、該カップリング物は、体内の長期的かつ顕著な血液尿酸レベルの低下効果を実現でき、高尿酸血症及び痛風の治療に用いることができる。

本明細書に使用されるように、「尿酸オキシダーゼ」、「尿酸酵素」という用語は、交換して使用することができ、本発明に記載の尿酸を触媒酸化してアラントインと過酸化水素を産生できる酵素の一種を指す。「尿酸オキシダーゼ類似物」、「尿酸酵素類似物」、「尿酸酵素誘導体」という用語は交換でき、いずれも尿酸を特異的に触媒してアラントインと過酸化水素に変換する尿酸オキシダーゼの活性を保った上で、尿酸オキシダーゼのタンパク質構造配列の一部のアミノ酸の置換、欠失または添加等の構造改造を行うことができ、さらに、本例の免疫原性の低下、タンパク質の安定性の向上、ポリエチレングリコール修飾の更なる促進などを含むが、これらに制限されないことが実現される。

尿酸オキシダーゼは特に制限されなく、任意の由来の尿酸オキシダーゼ及びその尿酸オキシダーゼ類似物であってもよく、代表的な例として、哺乳動物由来、微生体、植物などを含むが、これらに制限されない。

他の好ましい例において、前記の尿酸オキシダーゼ及びその尿酸オキシダーゼ類似物は哺乳動物由来である。好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列、より好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である。

本発明に記載の異種由来尿酸オキシダーゼは、天然抽出、化学合成、遺伝子工学的組換え発現などの様々な方法で得られることができるが、これらに限定されるものではない。

他の好ましい例において、尿酸オキシダーゼは組換え技術により、尿酸オキシダーゼタンパク質配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のコード配列を宿主細胞で組換え発現させる。

他の好ましい例において、大腸菌または酵母を宿主として、組換え発現菌株を構築する方法によって製造され、大腸菌を宿主菌として組換え発現を行うことがより好ましい。

本明細書に使用されるように、本発明に記載のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼとは、ポリエチレングリコールにより尿酸オキシダーゼを共有結合修飾することによって取得されるものである。前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とは、エチレンオキシドの重縮合体と水の混合物であり、一般式Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）ｎＯＨで示され、ｐＨが中性で、無毒で、水溶性の高い親水性ポリマーであり、線状または分岐状の構造を呈する。ＰＥＧは無毒且つ良好な生体適合性のため、現在ＦＤＡはすでに多種のＰＥＧ修飾組換えタンパク質薬物の市販を承認し、ＰＥＧがタンパク質の免疫原性を低下させ、タンパク質の溶解性を高め、タンパク質の半減期を延ばすために使用できることを証明した。ＰＥＧがタンパク質と結合するには、ＰＥＧの一端または多端を活性化することができ、修飾された目標タンパク質にアミノ基、メルカプト基、カルボキシル基または水酸基等に応じて対応する修飾基を選択して活性化することができる。

他の好ましい例において、本発明の尿酸オキシダーゼ及び尿酸酵素類似物のＰＥＧ修飾に用いられるサイトはリシン残基のεアミノ基であるが、Ｎ末端リシン残基のαアミノ基の修飾も少量ある。尿酸オキシダーゼは、ウレタン結合、第２級アンモニウム結合またはアミド結合を介してＰＥＧの修飾基と共有結合し、ポリエチレングリコール分子と尿酸オキシダーゼがカップリングしてアミド結合を形成することが好ましく、そのポリエチレングリコールの修飾基は、Ｎヒドロキシスクシンイミド系を含むが、これらに制限されなく、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドカーボネート（ＳＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドアセテート（ＳＣＭ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドプロピオン酸エステル（ＳＰＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド酪酸エステル（ＳＢＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドコハク酸エステル（ＳＳ）などを含むが、これらに制限されなく、ここで、ポリエチレングリコールのブロック基はモノメトキシ、エトキシ基、グルコースまたはガラクトースを含むが、これらに制限されなく、好ましくはモノメトキシである。

他の好ましい例において、ポリエチレングリコールは直鎖または直鎖である。

他の好ましい例において、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼに用いられるポリエチレングリコールの相対分子量は６ＫＤ以下であり、好ましくは１ＫＤ～５ＫＤであり、最も好ましくは５ＫＤである。なお、本願に記載の「ポリエチレングリコール相対分子量」とは、修飾基を持たないポリエチレングリコールの相対分子量であり、当該分野での一般的な意味を有し、ＰＥＧが活性化基によって活性化された後の総相対分子量は５ＫＤよりやや大きく、例えば５ＫＤ＋１０％の範囲内である。

他の好ましい例において、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは次の特徴を有する。
（１）尿酸オキシダーゼ中の下記アミノ酸サイトのうちの少なくとも１１つはＰＥＧ修飾を有する。
Ｔ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３。
（２）１つの尿酸オキシダーゼの分子は平均１１～１３個のポリエチレングリコール分子をカップリングする。
（３）Ｓｅｇ ＩＤ ＮＯ：１ 尿酸オキシダーゼ配列に位置するＫ^３０及び／又はＫ^３５を含み、Ｋ^２２２及び／又はＫ^２３１はポリエチレングリコールカップリング修飾を発生させる。
（４）ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼはより低い体内免疫原性を有する。

本発明の他の態様では、尿酸オキシダーゼの免疫原性を効果的に低下させる方法を提供し、該技術は、尿酸オキシダーゼの免疫原性を効果的に低下させ、尿酸オキシダーゼの体内安定性を向上させることができる。

本明細書に使用されるように、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは、尿酸オキシダーゼは特に制限されなく、任意の由来の尿酸オキシダーゼ及びその尿酸オキシダーゼ類似物であってもよく、代表的な例として、哺乳動物由来、微生体、植物などを含むが、これらに制限されないことを特徴とする。

他の好ましい例において、前記の尿酸オキシダーゼ及びその尿酸オキシダーゼ類似物は哺乳動物由来である。好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列、より好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である。

本発明に記載の異種由来尿酸オキシダーゼは、天然抽出、化学合成、遺伝子工学的組換え発現などの様々な方法で得られることができるが、これらに限定されるものではない。

他の好ましい例において、大腸菌または酵母を宿主として、組換え発現菌株を構築する方法によって製造され、大腸菌を宿主菌として組換え発現を行うことがより好ましい。

本発明に記載の尿酸オキシダーゼの大腸菌への組換え発現は大量の尿酸オキシダーゼを得ることができ、発現した尿酸オキシダーゼは細胞内で、または細胞膜上で発現し、または細胞外に分泌することができる。必要に応じて、当業者がよく知られている方法で高純度の尿酸オキシダーゼを得ることができる。これらの方法は、例として、遠心分離、破菌、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー及びその他の様々な技術の組合わせを含むが、これらに制限されない。

上記で得られた尿酸オキシダーゼは、当該分野で知られている方法を使用して連結基を介してポリエチレングリコールを共有結合するものである。

他の好ましい例において、ポリエチレングリコールは尿酸オキシダーゼの空間構造表面のリシン残基を配向修飾する。尿酸オキシダーゼはアミド結合を介してＰＥＧの修飾基（活性基と呼ばれてもよい）に共有結合し、そのポリエチレングリコールの修飾基（活性基と呼ばれてもよい）はＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドカーボネート（ＳＣ）、Ｎヒドロキシスクシンイミドアセテート（ＳＣＭ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドプロピオン酸エステル（ＳＰＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド酪酸エステル（ＳＢＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドコハク酸エステル（ＳＳ）を含むが、これらに制限されなく、ここで、ポリエチレングリコールのブロック基はモノメトキシ、エトキシ基、グルコースまたはガラクトース、好ましくはモノメトキシを含むが、これらに制限されない。

他の好ましい例において、ポリエチレングリコールは直鎖または分岐鎖であってもよい。

他の好ましい例において、ポリエチレングリコールの相対分子量は６ＫＤ以下であり、好ましくは１ＫＤ～５ＫＤであり、より好ましくは２ＫＤ、５ＫＤであり、最も好ましくは５ＫＤである。

他の好ましい例において、本発明はポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法を提供し、以下の１つまたは複数の特徴を有し、
（１）、尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールの修飾投入モル比は１：４５～１：１５０（尿酸オキシダーゼ：ポリエチレングリコール）であり、好ましくは１：４５～１：１１０の投入モル比で修飾し、より好ましくは１：５６～１：９４の投入モル比で修飾する。
（２）、カップリング反応系は炭酸塩緩衝液であり、その修飾ｐＨ範囲が９～１１である。
（３）、カップリング反応系中の尿酸オキシダーゼタンパク質濃度は１０ｍｇ／ｍｌである。

上記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法は、複数の精製手段を用いて高純度のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼを得る。

他の好ましい例において、修飾サンプルの精製には、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、接線流限外濾過、または組合わせを含むが、これらに制限されない方法を採用する。より好ましくは分子篩クロマトグラフィー、接線流限外濾過である。

本発明の他の態様では、上記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ及びその応用を提供する。該カップリング物は、体内の長期的かつ顕著な血液尿酸レベルの低下効果を実現でき、高尿酸血症及び痛風の治療に用いることができる。

前記のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼは、慢性高尿酸血症または痛風の治療薬物及びその組成物としてより適する。前記高尿酸血症及び痛風の主要な症状は尿酸性腎症と痛風性関節炎を含むが、これらに制限されない。

前記のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼの投与経路は静脈注射、皮下注射、筋肉注射及び腹腔内注射などを含むが、これらに制限されなく、好ましくは静脈注射、筋肉注射であり、より好ましくは筋肉注射である。

前記のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼはより低い体内免疫原性を有する。

前記のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼは低い免疫原性を有するのは、人または動物の体内にポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼを筋肉注射した後、生体がポリエチレングリコール分子に対抗する抗体を産生しなく、または低滴度の抗ポリエチレングリコール分子抗体を産生することを指す。尿酸オキシダーゼに対する抗体を産生しない。

前記のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼは、筋肉注射後に体内でより長い半減期と体内尿酸レベルの低下効果を有する。

本発明のいくつかの実施例によれば、本発明のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼを含む薬物組成物は、薬物に許容される担体を含んでもよく、且つ薬物組成物の剤形と投与方法は特に制限されない。注射製剤の場合、薬物に許容される担体は緩衝剤、防腐剤、鎮痛剤、可溶化剤、アイソトニックエージェント（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）及び安定剤を含んでもよい。局所投与の製剤の場合、薬物に許容される担体は、アルカリ、賦形剤、潤滑剤及び防腐剤を含んでもよい。本発明の薬物組成物は上記の薬物に許容される担体と結合して様々な剤形に製造することができる。

ここで、本発明のいくつかの具体例によれば、薬物処方に適した担体のうちの賦形剤と希釈液は、乳糖、グルコース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルトースアルコール、デンプン、アラブゴム、アルギン酸塩、ゲル、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシフェニルプロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油を含むことができる。

本発明の他のいくつかの実施例によれば、本発明の薬物組成物に充填剤、抗凝固剤、潤滑剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、保湿剤、芳香剤及び防腐剤などをさらに含んでもよい。

本発明の実施例によれば、本発明のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼと薬物組成物は酵素活性を最大限に確保する前提で、尿酸オキシダーゼの体内安定性を大幅に向上させ、免疫原性を低下させることができ、また、筋肉注射後の体内薬効は原研薬の静脈注射後に相当する体内薬効に達することができる。このため、本発明のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ及び該ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼを含む薬物組成物は、高尿酸関連疾患の治療または予防時に投与されることができる。

本明細書に使用される「投与」という用語とは、所定の量の物質がある適切な方式で患者に導入される。本発明のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは、所望の組織に到達できれば、任意の通常の方法で投与されることができる。投与の様々な方式は予想されることができ、腹膜、静脈、肌肉、皮下、皮質、経口、局所、鼻腔、肺部及び直腸などを含むが、本発明はこれらの例示される投与方式に制限されない。しかしながら、経口投与の場合、経口投与された組成物の活性成分は胃部での分解を防ぐためにコーティングまたは調製されるべきである。好ましくは、本発明の組成物は注射製剤で投与されることができる。なお、本発明の薬物組成物は活性成分を標的細胞に伝達する特定の器具を使用して投与することができる。

本発明の薬物組成物の投与頻度と投与量は、治療対象の疾患の種類、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び疾患の重症度及び活性成分である薬物の種類を含む複数の関連要素によって決定することができる。

「治療有効量」という用語は、疾患または病態に関連するある症状を顕著に改善するのに十分な化合物の量、即ち特定の病態と投与手段に治療効果を提供する量である。例えば、慢性高尿酸血症または痛風治療では、疾患または病態の任意の症状を減少、予防、遅延、抑制または阻害する薬物または化合物は治療に有効でなければならない。治療有効量の薬物または化合物は疾患または病態を治癒する必要がないが、疾患または病態のために治療を提供し、個体の疾患または病態の発作が遅延、阻止または予防されたり、疾患または病態の症状が緩和されたり、疾患または病態の期期間が変更されたり、例えば疾患または病態が深刻にならなかったり、回復が加速されたりする。

「治療」という用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。前記効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に予防することについて、予防的であり、及び／又は、疾患及び／又は疾患による不良作用を部分的にまたは完全に治癒することについて、治療的であってもよい。本明細書に使用される「治療」は哺乳動物、特に人の疾患（主に高尿酸関連疾患を指す）の治療をカバーし、（ａ）病気にかかりやすいが、まだ病気と診断されていない個体で病気を予防し、（ｂ）疾患を抑制し、例えば疾患の発展を阻害し、または（ｃ）疾患を緩和し、例えば疾患に関連する症状を軽減する。本明細書に使用される「治療」は、薬物または化合物を個体に投与して個体の疾患を治療、治癒、緩和、改善、軽減または抑制する任意の投薬をカバーし、本明細書に記載のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼを必要とする個体に投与することを含むが、これらに制限されない。

本発明の実施例によれば、本発明のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼまたは薬物組成物は通常の治療方法及び／又は療法と組み合わせて使用したり、通常の治療方法及び／又は療法と個別に使用したりすることができる。本発明のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼまたは薬物組成物を他の薬物との併用療法で投与する場合、それらは順次または同時に個体に投与することができる。または、本発明の薬物組成物は本発明のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ、薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤、及び当技術分野で公知の他の治療薬または予防薬の組み合わせを含むことができる。

「平均修飾度」という用語とは、尿酸酵素単体ごとに結合するＰＥＧの個数を指す。

本明細書では、特に説明がない限り、「アミノ酸サイトにＰＥＧ修飾を有する」という表現は、対応するポリペプチドの立体構造の中で、ＰＥＧ分子がそのアミノ酸サイトを覆い、該アミノ酸サイトの少なくとも一部の基が露出されていないことを意味する。理解できることとして、当業者は通常の技術的手段により特定のアミノ酸サイトがＰＥＧ分子によって修飾されるかどうかを判定することができ、例えば、本願の実施例３「ポリエチレングリコール修飾サイトの検出」の部分に例示的な方法を参照して同定することができる。簡単にすれば、該方法は、１）非ポリエチレングリコール化とポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼを１種または複数種の酵素で酵素切断し、例えばＬｙｓ－ＣまたはＴｒｙｐｓｉｎで単酵素切断してもよいし、Ｌｙｓ－ＣとＴｒｙｐｓｉｎで二酵素切断してもよいステップと、２）高速液体クロマトグラフィー法により酵素切断断片を分離し、非ポリエチレングリコール化とポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼのクロマトグラム、即ちペプチドマップを生成するステップと、３）非ポリエチレングリコール化とポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼのペプチドマップの違いを比較し、予定内標準ペプチドセグメントを参照して、ポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼ中の特定のアミノ酸サイトが存在するペプチドセグメントのピークの減少または消失の相対割合を決定し、さらに、ペプチドセグメント上の該特定のアミノ酸サイトがＰＥＧによって修飾されるかどうかを判定するステップと、を含む。具体的に、本願の実施例３では、特定のアミノ酸サイトが存在するペプチドセグメントのピーク面積の減少または消失の相対割合は以下の式によって計算することができ、
Ｐ（％）＝（Ａ_２－ Ａ_１）／ Ａ_２×１００％、
ただし、Ａ_１＝Ａ_０×ｔとする。
Ａ_０は測定対象修飾タンパク質の特定のアミノ酸サイトが存在するペプチドセグメントの実測ピーク面積であり、ｔはＰＨＣペプチドマップと測定対象修飾タンパク質ペプチドマップにおける内部参照ペプチドセグメントのピーク面積比の平均値であり、
Ｐ（％）は特定のアミノ酸サイトが存在するペプチドセグメントのピーク面積の減少または消失の相対割合であり、Ａ_２は特定のアミノ酸サイトが存在するペプチドセグメントのＰＨＣペプチドマップにおけるペプチドセグメントのピーク面積であり、Ａ_１は内部参照による換算後の特定のアミノ酸サイトが存在するペプチドセグメントの測定対象修飾タンパク質ペプチドマップにおけるピーク面積である。

理解すべきこととして、本発明の範囲内で、本発明の上記各技術的特徴と以下（例えば実施例）の具体的に説明する様々な技術的特徴同士は互いに組み合わせることができ、これにより、新しいまたは好ましくい技術的解決手段を構成し、以下の例を参照してそれをより明らかに理解することができる。紙面に限り、この例は説明の目的のためであり、本発明を制限することを意図するものではない。

以下、本発明の実施例を更に詳細に説明し、前記実施例の例示は図面に示される。以下、図面を参照して説明する実施例は例示的なものであり、本発明を解釈するために使用され、本発明を限定するものと理解されない。

実施例１ 組換え尿酸オキシダーゼの製造

１．１ 尿酸酵素発現のための遺伝子と発現プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉコドン使用嗜好データに基づき、コドン嗜好性及びＧＣ含有量などの要素を結合して、尿酸酵素タンパク質（コードネーム：ＰＨＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のｃＤＮＡ配列を設計し、全遺伝子合成を行い、ｐＵＣ－５７－ＰＨＣプラスミドと名付けた。Ｎｄｅ ＩとＢａｍＨ Ｉを目的遺伝子としてサイトに挿入し、ｐＥＴ－３０ａプラスミドを発現担体（ｐＥＴ－３０ａ－ＰＨＣ）として使用する。

１．２ 発現プラスミドの細菌宿主細胞への変換
ＣａＣｌ_２法を用いて発現担体ｐＥＴ－３０ａ－ＰＨＣを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入し、Ｋａｎａｍｙｃｉｎが耐性スクリーニングを行い、高発現クローンをスクリーニングし、元の種子バンク菌種（Ｅ３Ｂ）を保存し、これらのステップは分子生物学分野でよく用いられる方法に従って実施される。

１．３ 組換え尿酸オキシダーゼの製造
変換したエンジニアリング菌種を発酵槽で発酵発現させ、まず３０℃、ｐＨが約７．２でＯＤ_６００＝３０以上に培養し、次に温度を約３７℃まで上げ、ＩＰＴＧを０．５ｍｍｏｌ／Ｌまで添加し、尿酸オキシダーゼが蓄積するように引き続き３ｈ以上誘導することを制御条件とする。細胞を遠心分離して収集し、次に、－１５℃以下で保存する。

凍結保存菌体を取り、２５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ緩衝液に懸濁し、懸濁割合は１：１０（Ｗ／Ｖ）である。高圧で細菌細胞を破いた後、尿酸オキシダーゼの沈殿を遠心分離して収集し、沈殿を５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ_３で一回洗浄した後、濃縮した尿酸酵素沈殿を１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａ_２ＨＣＯ_３（ｐＨ９．７～１０．３）緩衝液に懸濁し、懸濁割合は１：５０（Ｗ／Ｖ）であり、室温で攪拌して一晩溶解し、その後遠心分離して上清を収集する。

尿酸オキシダーゼはいくつかのクロマトグラフィーステップを経てさらに精製され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの検出純度は９５％以上で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムで純度が９５％以上で、凝集体の形態がないと検出され、Ｌｏｗｒｙ法でタンパク質濃度を測定し、分光光度計で尿酸オキシダーゼ活性を測定し、１単位（Ｕ）酵素活性は、反応温度が３７℃で、最適ｐＨが９．０の緩衝液条件下で、毎分１μｍｏｌの尿酸を変換するには必要な酵素の量と定義される。

実施例２ ポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼの製造

異なる分子量の（５００～２００００Ｄａ）モノメトキシＰＥＧ誘導体、例えば５Ｋ分子量のＮ－スクシンイミドプロピオン酸エステルＰＥＧ（５Ｋ－ＰＥＧ－ＳＰＡ）を１～５ｍｍｏｌ／Ｌの酸溶液で１００～３００ｍｍｏｌ／ＬのＰＥＧ溶液に溶解し、溶解後、１：４５～１：１５０のモル比（尿酸オキシダーゼ：５Ｋ－ＰＥＧ－ＳＰＡ）で、尿酸オキシダーゼを溶けた炭酸塩濃度が０．１～０．３ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨが１０．０の炭酸塩緩衝液に入れ、ＰＥＧと尿酸オキシダーゼをカップリング反応させ、カップリング反応の尿酸オキシダーゼの濃度は１０ｍｇ／ｍｌであり、カップリング反応は、ＰＥＧカップリング程度が経時的に変化しなくなるまで、５～３０℃の条件下で６０分間以上攪拌して反応させる。反応終了後、限外濾過及び／又はクロマトグラフィー法により未修飾のＰＥＧ及び副生成物を反応から除去する。修飾副生成物の分離除去は、適切な分子篩クロマトグラフィー媒体を用いて行うことができる。最後に、無菌濾過で５Ｋ修飾のポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼ（コードネームがＰＵ５である）に示される。

実施例３ ポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼの特性分析

３．１ 平均修飾度及び酵素活性検出
Ｌｏｗｒｙ法でタンパク質濃度を測定し、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ活性は分光光度計で測定される。尿酸酵素基質尿酸の最大紫外吸収波長は２９３ｎｍであるのに対して、生成物であるアラントインの最大紫外吸収波長は２２４ｎｍであり、一定の濃度範囲内で、尿酸が２９３ｎｍでの吸収値はその濃度に比例し、分光光度計法で尿酸の定量測定を行うことができる。具体的な過程は以下の通りであり、紫外可視分光光度計を開き、波長を２９３ｎｍに調整し、該装置の水浴循環システムを開いて温度を３７℃に保つ。四ホウ酸ナトリウム緩衝液をブランク対照として、ゼロ点を校正し、基質反応液（０．１ｍｏｌ／Ｌの四ホウ酸ナトリウム、１００μｍｏｌ／Ｌの尿酸、ｐＨが９．５で、３７℃で予熱）を２．９５ｍｌ取って石英キュベットに入れ、次に、５０μｌの供試品を入れて迅速に均一に混合した後２９３ｎｍで吸収値を測定する。２９３ｎｍでの吸収度の変化を連続的に測定し、Ｃ＝Ａ／εＬ（ここで、Ａは特定の濃度の尿酸が２９３ｎｍでの吸光値であり、εは尿酸モル消光係数であり、Ｌはキュベットの光路であり、Ｃはモル濃度である）によって尿酸分解濃度を計算し、酵素活性を計算し、酵素活性は、最適な反応温度３７℃で、最適な反応ｐＨ９．５である場合、毎分１μｍｏｌの尿酸を変換するには必要な酵素の量が１つの活性単位（Ｕ）として定義される。

ＳＥＣ－ＨＰＬＣタンデムＵＶ／ＲＩ（紫外と屈折率検出器の併用）を用いてポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼの平均修飾度の検出を行う。タンパク質によると、紫外２８０ｎｍに最大の吸収ピークがあり、該波長でＰＥＧが吸収されないと同時に、示差屈折検出器はタンパク質とＰＥＧに対して一定の範囲内で吸収値がその各種濃度に比例する。このため、ＰＥＧ参照品とＰＨＣ理化学対照品の外標準方式でポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼ中のＰＥＧとタンパク質部分のそれぞれの含有量を得ることができ、更に、以下の計算方式によって尿酸オキシダーゼ単体あたりのＰＥＧ分子数、即ち平均修飾度を取得することができる。
ＰＥＧ尿酸オキシダーゼ平均修飾度＝（尿酸オキシダーゼサブユニットの相対分子量×サンプル中のＰＥＧの量）／（ＰＥＧ相対分子量×サンプル中のタンパク質の量）。

ここで、ＰＨＣ理化学対照品、ＰＥＧ参照品、ＰＵ５修飾生成物ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶ／ＲＩ検出図を図１～図５に示す。

実施例２において、異なる投入比下で、得られたポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼの酵素活性と平均修飾度を表１に示す。

実施例２において、異なるＰＥＧの分子量で、タンパク質とＰＥＧ投入のモル比が１：６８で、得られたポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼの酵素活性と平均修飾度を表２に示す。

表１及び表２から分かるように、本願のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼの平均修飾度は１１個以上に安定し、且つ酵素活性が未修飾の尿酸オキシダーゼに比べて、酵素活性保留率が高く、酵素活性が低下せず、上昇し、且つ酵素活性が相対的に安定する。原研薬が教えている低分子量のＰＥＧ修飾が酵素活性の低下をもたらすという観点とは一致せず、且つ本願で得られたポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのポリエチレングリコールの平均修飾度がより高く、酵素活性保留上で予想外の技術的効果が得られた。

同時に、出願者は異なる分子量ＰＥＧ修飾で得られた尿酸オキシダーゼの免疫原性を同時に測定し、実験結果を表３に示す。

実験では、マウスをグループ分けし、各群に８匹であり、動物１匹に１ｍｇ／ｋｇの静脈投与を行い、週に１回投与し、４回連続投与した後に採血して抗ＰＥＧと抗尿酸オキシダーゼ免疫原性の評価を行う。表３結果から分かるように、平均修飾度が一致する場合で、ＰＥＧ分子量が大きいほど、産生した抗ＰＥＧ抗体陽性率が高くなり、ＰＥＧ分子量が５ＫＤを超えると、抗ＰＥＧ抗体陽性率と抗体価が顕著に増加する。抗尿酸オキシダーゼの結果分析から分かるように、ＰＥＧ修飾は尿酸オキシダーゼの抗体陽性率と抗体価を顕著に低下させることができ、また、平均修飾度が一致する場合で、２～５Ｋ範囲内で、ＰＥＧ分子量の増加に伴って、産生した抗尿酸オキシダーゼの抗体陽性率と抗体価が低くなり、ＰＥＧ分子量が５Ｋより大きいと、抗尿酸酵素抗体のリスクもある。以上のように、２～５ＫＰＥＧ修飾尿酸オキシダーゼは１０ＫＰＥＧ修飾尿酸オキシダーゼ群より優れ、より好ましくは５ＫＤである。

最後に、発明者は、得られた尿酸オキシダーゼを異なる酸溶解ＰＥＧで修飾した酵素活性と平均修飾度を同時に測定し、使用する酸溶液は、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、酪酸、シクロペンチルプロピオン酸、ジグルコン酸、ラウリル硫酸、エタンスルホン酸、ギ酸、トランスブテン二酸、グルコヘプトン酸、グリセリンリン酸、グルコン酸、ヘプタン酸、カプロン酸、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸、ラクトウロン酸、乳酸、ラウリン酸、ラウリル硫酸、リンゴ酸、マロン酸、メタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ペクチン酸、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸、プロピオン酸、ステアリン酸、パラトルエンスルホン酸、ウンデカン酸、吉草酸などの有機酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、過塩素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、過硫酸、ホウ酸、重クロム酸、ケイ酸、クロム酸、チオシアン酸などの無機酸から選ばれることができる。異なるタイプの酸溶液はすべてＰＥＧの溶解を実現して尿酸酵素を修飾することができる。異なるＰＥＧの投入方式と投入比を表４に示す。

発明者は、ＰＥＧを投入する前に、ドライパウダー直接投入よりも酸溶解の方式を選択すると、得られたタンパク質の修飾率がより高く、酵素活性がより高く、且つ効果的にＰＥＧの投与量を効果的に節約すると発見した。

３．２ ポリエチレングリコール修飾サイトの検出

以下のステップでは、発明者は従来の市販製品及び実施例で得られた尿酸オキシダーゼに対して修飾サイトの検出を行う。

ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのＰＥＧ修飾サイトは、非ポリエチレングリコール化とポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼに対して１種または複数種の酵素で酵素切断を行い、次に、クロマトグラフィー検出により、クロマトグラム、即ちペプチドマップを取得することによって確認される。非ポリエチレングリコール化とポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼに対して単酵素切断（Ｌｙｓ－ＣまたはＴｒｙｐｓｉｎ）及び／又は二酵素切断（Ｌｙｓ－ＣとＴｒｙｐｓｉｎの併用）で酵素切断を行うことができる。逆相カラムで酵素切断断片を分離し、内部参照ペプチドセグメントにより校正してペプチドセグメントの消失または低下割合を比較し、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼの修飾サイト及びサイトのポリエチレングリコール修飾パーセントを判断して計算する。

トリプシンとＬｙｓ－Ｃ二酵素切断質量ペプチドマップにおける修飾サイトの分析原理：Ｌｙｓ－Ｃがリシン（Ｋ）Ｃ末端に特異的に酵素切断を行うことができ、トリプシンは塩基性アミノ酸－アルギニン（Ｒ）とリシン（Ｋ）を酵素切断サイトとして、そのＣ末端ペプチド結合に特異的に酵素切断を行う。ＰＨＣとＰＵ５中の酵素切断前後の対応する各ペプチドセグメントの変化状況を比較し、内標準ペプチドセグメントを参照することで、ＰＥＧ修飾ペプチドセグメントの減少または消失の相対割合を分析して確認する。ペプチドセグメントの減少または消失の相対割合により、ペプチドセグメント上の該リシンサイトのＰＥＧで修飾される相対百分率を判定することができ、特定のペプチドセグメント上の特定のアミノ酸（例えばリシン）がＰＥＧで修飾されるかどうかを知ることができる。

具体的に以下の通りである。
（１）サンプル処理：尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼをそれぞれ酵素切断緩衝液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％アセトニトリル、ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍＬに溶解希釈し、それぞれ１００μＬを取り、２μＬのＬｙｓ－Ｃを入れ、３７℃で４時間酵素切断する。即ち該溶液を膵酵素反応管（１：１００の割合）に移り、３７℃で２時間引き続き酵素切断し、４μＬのＴＣＥＰ還元溶液で３０分間引き続き反応し、さらに１０μＬの１ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液を加えて反応を終了する。
（２）分析条件：
装置：Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ、ＭＳＱ Ｐｌｕｓ；
クロマトグラフィーカラム：月旭 Ｗｅｌｃｈ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ μｌｔｉｍａｔｅ^(R)ＸＢ－Ｃ１８ （４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）；
分析条件：Ａ液（０．１％のＴＦＡを含む水溶液）、Ｂ液（０．１％のＴＦＡを含むアセトニトリル溶液）；
勾配：０－７０ｍｉｎ、Ｂ ３－７０％；
ＬＣ検出波長：２１４ｎｍ。
イオン源：ＥＳＩ；
イオンタイプ：プラスイオン；
テーパ電圧：５０Ｖ；
走査範囲：３００－２０００Ｄａ；
走査時間：１ｓ；
カラム後分流が約０．３ｍＬ／ｍｉｎである。
サンプル量を１００μＬ注入し、クロマトグラムを記録する。

（３）結果処理：
尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼのクロマトグラム（ペプチドマップ）を比較し、差分ペプチドセグメント面積が減少する相対割合を計算する。

（４）実験結果を表５～表８、及び図６～図７に示す。

ＰＵ５ペプチドセグメントピーク面積の低下パーセントの計算方法：
以下の式によってＰＵ５とＰＨＣが同じ濃度で対応するＰＵ５ペプチドセグメントピーク面積を計算することができる。
Ａ_１＝Ａ_０×ｔ
ここで、Ａ_１は２つの内部参照ペプチドセグメントによる換算後のＰＵ５ペプチドセグメントピーク面積であり、Ａ_０はＰＵ５ペプチドマップペプチドセグメントの実測ピーク面積であり、ｔはＴ３０、Ｔ３１番号の内部参照ペプチドセグメント中のＰＨＣペプチドマップとＰＵ５ペプチドマップのピーク面積比の平均値、即ち０．５８８である。

内部参照による換算後のペプチドセグメントピーク面積とＰＨＣペプチドマップピーク面積は以下の式によって、ＰＵ５ペプチドマップ中のあるペプチドセグメントピーク面積が減少する相対割合を計算することができる。
Ｐ（％）＝（Ａ_２－ Ａ_１）／ Ａ_２×１００％
ただし、Ａ_２はあるペプチドセグメントがＰＨＣペプチドマップにおけるペプチドセグメントピーク面積であり、Ａ_１は内部参照による換算後の該ペプチドセグメントのＰＵ５ペプチドセグメントピーク面積である。

本実施例のタンパク質配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）分析から分かるように、尿酸オキシダーゼが修飾される潜在的なサイトはＴ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^１７、Ｋ^２１、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^４８、Ｋ^４９、Ｋ^６６、Ｋ^７４、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１５５、Ｋ^１５８、Ｋ^１６９、Ｋ^１７９、Ｋ^１９０、Ｋ^２１５、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３などの３１個のサイトがある。

実施例２で得られたポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ修飾サイトに対する分析から分かるように、表５、表６、表７、表８及び図６の分析に示されるように、ＰＵ５酵素切断後のペプチドセグメントが９０％以上消失したサイトはＫ^３、Ｋ^４、Ｋ^３５、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^２２２、Ｋ^２６６、Ｋ^２８５があり、ＰＵ５酵素切断後のペプチドセグメントが８０％～９０％範囲内で消失したサイトはＫ^７６、Ｋ^２３１がある。

同時に発明者は、本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの修飾サイトは、市販されている薬物よりも、修飾サイトがより多く、顕著な違いがあると発見し、単酵素を切断することにより、本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼはＫ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^２２２及びＫ^２３１の４つのサイトが存在するペプチドセグメントの消失割合が８０％以上であり、この４つのサイトが存在するペプチドセグメントでは市販されている類似薬はほとんど消失しなく、即ちＫ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^２２２及びＫ^２３１の４つのサイトでの市販されている類似薬の修飾率は本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼよりはるかに低い。また、本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは、市販されている薬物に比べて、免疫原性が顕著に低下し、発明者は、修飾サイトの多少と修飾サイトの違いに関係している可能性があると推測している。

以下、本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ（ＰＵ５）の動物体内評価を詳細に説明し、実験に用いられるｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとは、市販されている類似薬であり、バッチ番号は５０８５Ｂである。

実施例４ ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ体内薬効学研究

４．１、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼのモデルラットでの体内薬効評価
オキサジン酸カリウム飲用水と高尿酸飼料を併用してラット慢性高尿酸血症モデルを誘導し、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ（ＰＵ５）がラット慢性高尿酸血症に対する治療作用を評価する。

モデルラットを４０匹選択し、ランダムに４群に分け、即ちモデル群、ポリエチレングリコール化尿酸酵素低投与量投与群（０．３ｍｇ／ｋｇ）、ポリエチレングリコール化尿酸酵素中投与量投与群（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ポリエチレングリコール化尿酸酵素高投与量投与群（３．０ ｍｇ／ｋｇ）であり、グループごとに１０匹であり、正常なＳＤラットを１０匹別途に選択してブランク対照群とする。試験は５週間連続的にモデリングし、１週モデリングした後に筋肉投与を開始し、週に１回投与し、４週連続投与し、投与前及び各投与の７日後のラット血清尿酸、血清尿素窒素、血清クレアチニンレベルをそれぞれ検出し、試験終了後にラット腎臓組織学的変化を観察した。

図８の結果から示すように、モデリング後の７、１４、２１、２８及び３５日目には、ブランク対照群と比較して、モデル対照群の血尿酸レベルはすべて顕著に増加し、モデリング後７日目にモデル群のラットの血清尿素窒素、クレアチニン及び尿酸はそれぞれブランク対照群におけるラットの２．７３倍、２．４０倍及び７．８３倍である。腎臓病理から見ると（図９に示すように）、モデル対照群の尿細管拡張、壊死、炎症及び線維化スコアはすべて顕著に増加し、同時に尿酸塩結晶数も顕著に増加した。被験物のポリエチレングリコール化尿酸酵素中高投与量はすべて血清尿酸レベルを顕著に低下させ、且つ投与量との相関性を示し、１４日～３５日の間、中投与量群の血尿酸レベルの平均値は３０３．８０－６６０．６０μｍｏｌ／Ｌに維持され、高投与量群の血尿酸レベルの平均値は１５３．７０－４０３．４０μｍｏｌ／Ｌに維持され、モデル群と比べて、中投与量群の血尿酸の低下幅は３４．４６－６７．９４％であり、高投与量群の血尿酸の低下幅度は６５．６７－８３．７８％である。モデル対照群と比べて、ポリエチレングリコール化尿酸酵素の各投与群は尿細管拡張、腎臓壊死及び炎症に対してすべて顕著に改善な作用がある。

４．２、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼラットの体内単回投与評価
ＳＤラットを３６匹取り、雌雄各半分をランダムに６群に分け（表９参照）、即ち市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射群、筋肉注射群、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ静脈注射群及びポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ低、中、高（０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｋｇ）投与量筋肉注射群であり、投与の具体的な手段と投与量を表９に示す。頚静脈採血によりＰＫとＰＤを検出する。

４．２．１、薬物動態比較
ＳＤラットの投与前の全ての個体の血清薬物濃度レベルは定量下限（ＬＬＯＱ：３１２．５００ｎｇ／ｍＬ）より低く、０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｋｇ１回に筋肉注射し、０～１６８ｈ（０～７日）範囲内で、ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液（ＰＵ５）後の血清薬物濃度は投与量の相関性があり、全体のレベルが薬投与量の増加に伴って増加し、１６８ｈを超えた後、ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ筋肉投与群の血中濃度は定量下限より低く、ＰＵ５筋肉投与群は２４０ｈ以上引き続き維持できる。

投与後、１．０ｍｇ／ｋｇ Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射及び筋肉注射群、１．０ｍｇ／ｋｇポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液静脈注射及び０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｋｇポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液筋肉注射群の各群の雌性と雄性ＳＤラット体内Ｃ_ｍａｘ（Ｃ_５ｍｉｎ）比は０．７５～０．９９範囲内であり、ＡＵＣ_ｌａｓｔ比が０．５４～０．９４範囲内で、ＡＵＣ_０－∞比が０．５８～０．９７範囲内である。これから分かるように、Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素（ＰＵ５）注射液はＳＤラット体内での曝露レベルに明らかな性差はなかった。

しかしながら、ＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）の市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅを投与し、静脈投与群のＡＵＣ_ｌａｓｔは４２６．４８±６５．３４であり、筋肉注射群のＡＵＣ_ｌａｓｔは２６４．１９±７８．２２であり、ＰＵ５注射液静脈投与群のＡＵＣ_ｌａｓｔは５６５．６１±１６１．６０であり、筋肉注射群のＡＵＣ_ｌａｓｔは３３７．８６±２２７．３４である。同量で、同じ投与方式条件下で、ＰＵ５のＡＵＣ_ｌａｓｔは市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅよりも高い。

ＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）の市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅを投与し、静脈投与群ｔ１／２（ｈ）は４９．５１±８．１２であり、筋肉投与群ｔ１／２（ｈ）は５５．２１±１３．５０である。ＰＵ５注射液静脈投与群ｔ１／２（ｈ）は８６．１２±３３．８２であり、筋肉投与群ｔ１／２（ｈ）は６０．４５±２１．３７である。同量で、同じ投与方式条件下で、ＰＵ５注射液のｔ１／２（ｈ）は市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅより長い。

上記薬物動態結果を表１０～表１５、図１０～図１２に示す。

４．２．２、体内薬効比較（尿酸）
０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｋｇ ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を１回筋肉注射した後、投与後１日、３日に尿酸濃度はいずれも低いレベルに維持され、投与後７日に各投与量群の尿酸レベルが回復し始め、薬投与量が高いほど、尿酸が体内で低レベルを維持する時間は長くなる。同量静脈注射群と比較して、ＰＵ５静脈注射群の血清尿酸が低濃度レベルを維持する時間はいずれもｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射群より長い。同量筋肉注射群と比較して、ＰＵ５筋肉注射群血清尿酸が低濃度レベルを維持する時間はいずれもｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ筋肉注射群より長い。同量群と比較して、ＰＵ５静脈注射または筋肉注射群の血清尿酸が低濃度レベルを維持する時間はいずれもｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射群または筋肉注射群よりも長く、即ちＰＵ５が体内で低濃度レベルを維持する時間はいずれもｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅよりも長い。結果を図１３に示す。

４．３、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼラット体内複数回投与評価
本試験では４個の群を設定し、それぞれ市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射群、筋肉注射群、ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液（ＰＵ５）静脈注射群、筋肉注射群であり、群ごとに８匹であり、雌雄各半分、合計３２匹のＳＤラットである。Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ及びポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液静脈注射群には静脈注射を採用し、Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液筋肉注射群には筋肉注射を採用する。薬投与量はいずれも１．０ｍｇ／ｋｇである。週に１回投与し、４回連続投与する。

結果分析から分かるように、
ＳＤラットに１．０ｍｇ／ｋｇ Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を複数回静脈／筋肉注射した。ラットの一般的な状况に薬物関連の異常な変化が見られなかった。

４．３．１ 抗ＰＥＧ抗体検出
ＳＤラットに４回連続投与した後、初めて投与する前に、全ての個体動物から抗ＰＥＧ抗体と抗ＰＨＣ抗体が検出されなく、投与終了後、全ての動物から抗ＰＨＣ抗体が検出されなく、Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈、筋肉注射群、ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液静脈、筋肉注射群の各群から抗ＰＥＧ抗体が検出され、陽性結果の割合はそれぞれ３／８、１／８、１／８、１／８である。ＰＥＧ免疫組織化学検査により、ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射群と筋肉注射群の脾臓、肝臓及び腎臓にＰＥＧの弱い陽性発現が見られた。ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液静脈注射群と筋肉注射群にはＰＥＧ陽性発現が見られなかった。結果を表１６に示す。

以上の分析から分かるように、ＰＵ５とｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅにより産生された抗体は尿酸オキシダーゼ部分に対する抗体ではなく、主にＰＥＧ部分に対する抗体である。

ＰＥＧ抗体及びＰＥＧ免疫組織化の結果から分かるように、ＰＵ５とｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅはいずれも筋肉投与群が静脈投与群より優れ、その中、静脈投与群で産生された抗ＰＥＧ抗体は、ＰＵ５がｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅより優れ、筋肉投与群で産生された抗ＰＥＧ抗体は、ＰＵ５がｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅより優れる。

４．３．２ 薬物動態検出
ＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を複数回静脈、筋肉注射で投与した後、各群の動物主要薬物動態パラメータに明らかな性差がない。４回連続投与した後、２種の薬物がラットの体内でわずかに蓄積されている。

ＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）の市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅを複数回静脈／筋肉注射で投与し、初めて投与後、ラット体内での絶対的バイオアベイラビリティはそれぞれ５１．３５％であり、最後投与後、ラット体内での絶対的バイオアベイラビリティはそれぞれ４５．９８％である。ＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を複数回静脈／筋肉注射で投与し、初めて投与後、ラット体内での絶対的バイオアベイラビリティはそれぞれ５８．２９％であり、最後投与後、ラット体内での絶対的バイオアベイラビリティはそれぞれ５２．６０％である。

４．３．３ 体内薬効比較（尿酸）
ＳＤラットに１．０ｍｇ／ｋｇ Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を４回（１回／週）連続静脈、筋肉注射し、投与後ごとに血清尿酸濃度はいずれも低いレベルに維持され、最後投与後の１４日にＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ筋肉注射群が回復し始め、他の各群は最後投与後の１８日に回復し始める。同量の市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅと比べて、２種の薬物静脈注射群の維持時間が比較的一致し、ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液筋肉注射群の維持時間は市販薬よりも長く、即ちＰＵ５は筋肉投与の治療効果がＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅより優れる。

上記結果を表１７～表２０、図１４～図１９に示す。

本明細書の説明では、「一実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体例」、または「いくつかの例」という参考用語などの説明は、該実施例または例を組み合わせて説明する具体的な特徴、構造、材料または特点は本発明の少なくとも１つの実施例または例に含まれる。本明細書では、上記用語例示的な叙述は必ずしも同じ実施例または例を対象とする必要がない。また、説明する具体的な特徴、構造、材料または特点はいずれかまたは複数の実施例または例では適切な方式で結合することができる。なお、互いに衝突しない場合、当業者は本明細書に説明される異なる実施例または例以及び異なる実施例または例の特徴を結合と組み合わせることができる。

Claims (51)

1. ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法であって、尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールをカップリング反応させ、前記ポリエチレングリコールは酸性溶液の形態で提供され、前記尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（５６～９４）であり、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼを取得するようにする、ことを特徴とするポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法。
2. 前記酸性溶液は、有機酸及び／又は無機酸から選ばれる少なくとも１種を含む酸性溶液である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記有機酸は、
   酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、酪酸、シクロペンチルプロピオン酸、ジグルコン酸、ラウリル硫酸、エタンスルホン酸、ギ酸、トランスブテン二酸、グルコヘプトン酸、グリセリンリン酸、グルコン酸、ヘプタン酸、カプロン酸、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸、ラクトウロン酸、乳酸、ラウリン酸、ラウリル硫酸、リンゴ酸、マロン酸、メタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ペクチン酸、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸、プロピオン酸、ステアリン酸、パラトルエンスルホン酸、ウンデカン酸、吉草酸から選ばれ、
   前記無機酸は、
   塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、過塩素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、過硫酸、ホウ酸、重クロム酸、ケイ酸、クロム酸、チオシアン酸から選ばれる、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記酸性溶液中の水素イオンの濃度は１～５ｍｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
5. 前記酸性溶液は塩酸または硫酸または氷酢酸を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
6. 前記酸の酸性溶液での濃度は１～５ｍｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 前記尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（４５～１１０）である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（５６～９４）である、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 前記ポリエチレングリコールが前記酸性溶液での濃度は１００～３００ｍｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記ポリエチレングリコール分子量は６ＫＤ以下である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 前記ポリエチレングリコールはモノメトキシまたは水酸基を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. 前記ポリエチレングリコールは直鎖または分岐構造である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. 前記ポリエチレングリコールと尿酸オキシダーゼとはアミド結合によりカップリングされる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
14. 前記ポリエチレングリコールは修飾性ポリエチレングリコールであり、前記修飾性ポリエチレングリコールの修飾基は、
    Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドカーボネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドアセテート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドプロピオン酸エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド酪酸エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドコハク酸エステル及びｐ－ニトロフェニルカーボネートの少なくとも１種から選ばれる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 前記修飾性ポリエチレングリコールの修飾基はＮ－ヒドロキシスクシンイミドプロピオン酸エステルである、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 前記カップリング反応は炭酸塩緩衝溶液の中で行う、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. 前記炭酸塩緩衝溶液のｐＨは９～１１である、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 前記尿酸オキシダーゼのカップリング反応系での濃度は１０ｍｇ／ｍｌである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
19. 前記カップリング反応は５～３０℃の条件で少なくとも６０分間行う、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
20. 前記尿酸オキシダーゼのアミノ酸サイトとして、Ｔ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３のうちの少なくとも１１つはＰＥＧ修飾を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
21. 前記アミノ酸サイトの局在化はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列で局在化される、ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
22. 前記尿酸オキシダーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７で示されるアミノ酸配列を有する、または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを有する、または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は添加を有するポリペプチドを有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
23. 前記尿酸オキシダーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～４で示されるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
24. 前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは、
    Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^２２２及びＫ^２３１の４つのアミノ酸サイトの少なくとも１つにＰＥＧ修飾を有する、ことを特徴とする請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記アミノ酸サイトの局在化はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列で局在化される、ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. 前記尿酸オキシダーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７で示されるアミノ酸配列を有する、または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを有する、または
    選択的に、前記尿酸オキシダーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７で示されるアミノ酸配列を有する、または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを有する、または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は添加を有するポリペプチドを有する、ことを特徴とする請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記尿酸オキシダーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～４で示されるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
28. 前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのペプチドマップはポリエチレングリコールで修飾されていない前記尿酸オキシダーゼのペプチドマップと比べて、少なくとも１１つの所定のペプチドセグメントを有するピーク面積が減少する相対割合は７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である、ことを特徴とする請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのペプチドマップは表８で示されるピーク面積低下ペプチドセグメントを有する、ことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
30. 前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのペプチドマップは図６または図７に示される、ことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
31. 尿酸オキシダーゼの免疫原性を低下させる方法であって、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのアミノ酸サイトとして、Ｔ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３のうちの少なくとも１１つにＰＥＧ修飾が発生し、前記方法は、
    尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールをカップリング反応させるステップであって、前記ポリエチレングリコールは酸性溶液の形態で提供され、前記尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（５６～９４）であるステップを含む、ことを特徴とする尿酸オキシダーゼの免疫原性を低下させる方法。
32. 前記酸性溶液は有機酸及び無機酸から選ばれる少なくとも１種を含む、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
33. 前記有機酸は、
    酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、酪酸、シクロペンチルプロピオン酸、ジグルコン酸、ラウリル硫酸、エタンスルホン酸、ギ酸、トランスブテン二酸、グルコヘプトン酸、グリセリンリン酸、グルコン酸、ヘプタン酸、カプロン酸、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸、ラクトウロン酸、乳酸、ラウリン酸、ラウリル硫酸、リンゴ酸、マロン酸、メタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ペクチン酸、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸、プロピオン酸、ステアリン酸、パラトルエンスルホン酸、ウンデカン酸、吉草酸の少なくとも１つから選ばれるものを含み、
    前記無機酸は、
    塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、過塩素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、過硫酸、ホウ酸、重クロム酸、ケイ酸、クロム酸、チオシアン酸の少なくとも１つから選ばれるものを含む、ことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
34. 前記酸性溶液中の水素イオンの濃度は１～５ｍｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
35. 前記酸性溶液は塩酸または硫酸または氷酢酸を含む、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
36. 前記酸の酸性溶液での濃度は１～５ｍｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
37. 前記尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（４５～１１０）である、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
38. 前記尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコールのモル比は１：（５６～９４）である、ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
39. 前記ポリエチレングリコールが前記酸性溶液での濃度は１００～３００ｍｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
40. 前記ポリエチレングリコール分子量は６ＫＤ以下である、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
41. 前記カップリング反応は炭酸塩緩衝溶液の中で行う、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
42. 前記炭酸塩緩衝溶液のｐＨは９～１１である、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
43. 前記尿酸オキシダーゼのカップリング反応系での濃度は１０ｍｇ／ｍｌである、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
44. 前記カップリング反応は５～３０℃の条件で少なくとも６０分間行う、ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
45. ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼであって、前記尿酸オキシダーゼは請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法によって製造されるものである、ことを特徴とするポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ。
46. 請求項４５に記載の尿酸オキシダーゼを含む、ことを特徴とする薬物組成物。
47. 薬学的に許容できる補助剤をさらに含む、ことを特徴とする請求項４６に記載の薬物組成物。
48. 高尿酸関連疾患を治療または予防する他の薬物をさらに含む、ことを特徴とする請求項４７に記載の薬物組成物。
49. 請求項４５に記載の尿酸オキシダーゼまたは請求項４６～４８のいずれか１項に記載の薬物組成物の、薬物製造での使用であって、前記薬物は、高尿酸関連疾患を治療し、被験者体液中の尿酸レベルを低下させるために使用される、使用。
50. 前記高尿酸関連疾患は慢性高尿酸血症、痛風、腎臓疾患、高尿酸性関節炎、腎臓結石、痛風性結節、高血圧、糖尿病、高トリグリセリド血症、メタボリックシンドローム及び／又は冠状動脈性心臓病である、ことを特徴とする請求項４９に記載の使用。
51. 高尿酸関連疾患を治療または予防するための方法であって、
    被験者に薬学に許容できる量の請求項４５に記載の尿酸オキシダーゼまたは請求項４６～４８のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする高尿酸関連疾患を治療または予防するための方法。

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