CN113181377A - Abcg2蛋白在制备改善、治疗或辅助治疗高尿酸血症伴高血脂、高血糖的制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因治疗的药物技术领域，具体涉及ABCG2蛋白在制备改善、治疗或辅助治疗高尿酸血症伴高血脂、高血糖的制剂中的应用。本发明将AAV介导的目的基因过表达技术与ABCG2基因结合，靶向ABCG2基因的使其过表达，促进尿酸在肾小管和小肠管腔上皮细胞中的泵出量，以制备调节血尿酸增高伴血糖血脂代谢异常的药物提供思路和方法。
Description
技术领域
本发明属于基因治疗的药物技术领域，具体涉及ABCG2蛋白在制备改善、治疗或辅助治疗高尿酸血症伴高血脂、高血糖的制剂中的应用。
背景技术
高尿酸血症是以嘌呤代谢紊乱、尿酸增高为特征的疾病,当细胞外液的尿酸升高到饱状态时,尿酸盐便集结一起，形成单钠尿酸盐结晶，沉积在关节皮下等组织，可引起痛风。痛风可并发肾脏病变，严重者可出现关节破坏、肾功能损害，常伴发高脂血症、糖尿病、高血压病、动脉硬化及冠心病等。目前，人群饮食结构在悄然变化，含有更多的糖、脂类、蛋白质尤其是嘌呤高的食物成为人们饮食的常态。因此近年来高尿酸血症的发病率明显增高,且发病年龄提前。降低血尿酸可以降低血脂、血糖，预防痛风的发病，提高人们的健康水平。
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)，也称腺伴随病毒,是一类无法自主复制、无被膜的微小病毒，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV无辅助病毒系统(AAV Helper-Free System)可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒(recombination adeno-associated virus,rAAV)。应用生物工程基因重组技术，通过AAV病毒辅助系统将目的基因ABCG2重组到AAV病毒，使其过表达，已达到促进尿酸排出，降血糖血脂控制体重的目的。
发明内容
根据现有技术上存在的缺陷，结合目前的研究前沿，本发明提供了ABCG2蛋白在制备改善、治疗或辅助治疗高尿酸血症伴高血脂、高血糖的制剂中的应用，将AAV介导的目的基因过表达技术与ABCG2基因结合，靶向ABCG2基因的使其过表达，以制备调节血尿酸增高伴血糖血脂代谢异常的药物提供思路和方法。
本发明是采用以下的技术方案实现的：
本发明提供了一种ABCG2蛋白在制备改善、治疗或辅助治疗高尿酸血症伴高血脂、高血糖的制剂中的应用。
其中，所述高尿酸血症为肾小管上皮细胞和小肠上皮细胞分泌尿酸的能力不足引起的血液尿酸增高。
本发明还提供一种ABCG2基因在制备改善、治疗或辅助治疗高尿酸血症伴高血脂、高血糖的制剂中的应用，所述ABCG2基因表达上述ABCG2蛋白。
具体的，所述制剂包括核酸分子或过表达腺相关病毒，核酸分子含有ABCG2基因的ORF核苷酸序列，腺相关病毒含有ABCG2基因的核苷酸序列。
具体的，所述腺相关病毒通过AAV无辅助病毒系统制备。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明采用的rAAV是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广(对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力)、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。ABCG2基因属于ABC转运蛋白超家族G亚家族第2成员(ABCG2)编码，主要定位于细胞膜上，依靠ATP提供能量，将细胞内异物药物等泵出体外，ABCG2基因蛋白表达下降，降低了肾小管上皮细胞和小肠上皮细胞分泌尿酸的能力，从而使血尿酸增高。通过AAV过表达ABCG2蛋白，靶向ABCG2基因的使其过表达，从而增加尿酸的排除，达到预防、改善、治疗和辅助治疗高尿酸血症伴高血脂、高血糖的作用。
附图说明
根据本文给出的发明详述和伴随的附图，将更全面地理解本发明，这些发明详述和附图仅以说明的方式给出，而不限制预期的发明范围。
图1为实施例2中以TCMK1为靶细胞，3分组利用RT-PCR检测ABCG2的mRNA转录量对比图；
图2为实施例2中以TCMK1为靶细胞，3分组利用Western blots检测ABCG2表达量对比图，β-actin为内部参照；
图3为实施例3中TCMK1细胞内、外的尿酸浓度对比图，与空白对照组相比，P<0.05；
图4为实施例4、5中KM雄性小鼠3分组的0、4、6、8周SUA变化结果；
图5为实施例4、5中KM雄性小鼠3分组的0、4、6、8周UUA变化结果；
图6为实施例4、5中KM雄性小鼠3分组的0、4、6、8周TG变化结果；
图7为实施例4、5中KM雄性小鼠3分组的0、4、6、8周T-CHO变化结果；
图8为实施例4、5中KM雄性小鼠3分组的0、4、6、8周Glu变化结果；
图9为实施例4、5中KM雄性小鼠3分组的0、4、6、8周Weight变化结果；
图10为实施例6中第8周KM雄性小鼠3分组的血清肌酐Cr的含量图10(A)、血尿素氮BUN的含量图10(B)；黄嘌呤氧化酶XOD的变化图10(C)；
图11为实施例6中第8周KM雄性小鼠3分组的肾脏皮质(图11(A))和小肠回肠(图11(B))用ELISAI方法检测促炎因子L-1β的变化图；
图12为实施例6中第8周KM雄性小鼠3分组的小肠内容物尿酸的变化图；
图13为实施例6中第8周KM雄性小鼠3分组的肾脏皮质(图13(A))和小肠回肠(图13(B))的HE染色免疫组化图；
图14为实施例6中第8周KM雄性小鼠3分组的肾脏皮质(图14(A))和小肠回肠(图14(B))的免疫组化ABCG2蛋白质的表达变化图。
图15为ABCG2基因开放阅读框包装为rAAV示意图。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
1、下列实施例采用的材料如下：
小鼠肾小管上皮细胞(TCMK1)，待融合率80-90％时1:3传代。
TCMK1细胞培养基溶液：体积比为87％DMEM,高糖+12％FBS+1％双抗。FBS:胎牛血清，购自公司大连美仑生物技术有限公司，货号PWL001；双抗:100U/ml青霉素/链霉素溶液，购自公司，货号；DMEM,高糖，购自Thermo FisherScientific公司，货号11965118)。
AAV-293细胞，AAV-293细胞购于汉恒生物，细胞生长到汇合率达到80％～90％时传代。
AAV-293细胞培养基溶液：同TCMK1细胞培养基溶液。
AAV病毒及包装组分过程：AAV9血清型载体；AAV Helper-Free System腺相关病毒三质粒包装系统质粒pAAV-MCS、pAAV-RC和pHelper。
腺相关病毒为无包膜的单链线状DNA病毒。野生型-AAV(wt-AAV)基因组约4700bp，包括分别位于5’和3’的2个反向末端重复序列(ITR)和2个开放阅读框(编码rep、cap两个多功能蛋白)。AAV是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。重组腺相关病毒(rAAV)就是在无辅助病毒的条件下，在AAV无辅助病毒系统(AAV Helper-Free System)协助下——此系统由pAAV-MCS,pAAV-RC和pHelper三个质粒和AAV-293细胞组成——将wt-AAV中编码rep、cap的基因删除，替代为目的基因(本发明为ABCG2),并整合入能使其在宿主细胞内复制增值的重组腺相关病毒。
在AAV Helper-Free System中，生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物(如：E2A，E4等基因)大部分由pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供；在辅助质粒的帮助下，wt-AAV基因组中的rep和cap基因从病毒载体中被转移到质粒pAAV-RC中，ITRs仍位于病毒载体中，仅需两端的ITR就能携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒，因此，rep和cap基因的转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度；pAAV-MCS质粒：利用基因重组的方法将目的基因(ABCG2)的ORF整合入本质粒的MCS处。将以上三个质粒共培养AAV-293细胞，在细胞内将能完成重组过程，生成携带目的基因的rAAV。
LipofiterTM脂质体转染试剂购自汉恒生物科技(上海)有限公司，产品编号HB-LF-1000，使用说明参考LipofiterTM说明书。
高血尿酸颗粒饲料，配制按质量分数比例为：10％酵母粉(OXOID；LP0021)+10％果糖(Macklin；F875004)+20％五花肉+60％基础饲料(济南朋悦实验动物繁育有限公司)。
基础饲料，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，普通环境实验鼠饲料。
尿尿酸UUA、血清尿酸SUA、甘油三酯TG、总胆固醇T-CHO、血清肌酐Cr、操血尿素氮BUN检测试剂盒：Uric acid(UA)Test Kit(Enzyme Colorimetry)、Triglyceride assaykit(GPO-PAP enzymatic method)、Total cholesterol assay kit(Single reagent GPO-PAP method)、Creatinine(Cr)Assay kit(sarcosine oxidase)和Urea Assay Kit，以上试剂盒均购自南京建成生物工程公司，货号C012-2-1、A110-1-1、A111-2-1、C011-2-1、C013-2-1，所有操作按照试剂盒说明进行。
血糖Glu检测试剂盒：Glucose assay kit(Glucose oxidase method；Rsbio.com)，所有操作按照试剂盒说明进行。
小鼠IL-1βELISA试剂盒：购自Liankebio公司，目录号70-EK201B/3-96。
2、实验过程
AAV病毒包装操作：
三种质粒共同转染AAV-293宿主细胞后，AAV病毒开始复制和包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。一般情况下rAAV的滴度在1012～1013VG/ml，完全可以满足整体实验的使用要求。
(A)质粒扩增：构建好的AAV载体、包装质粒和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1μg/μl，A260/280在1.7-1.8间方可用以包毒。使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。
(B)利用LipofiterTM转染试剂做脂转complex进行AAV-293宿主细胞转染。
(C)AAV病毒收毒和浓缩。
(D)AAV病毒纯化。
AAV病毒包装滴度测定(采用Q-PCR法)
(1)取20μl浓缩病毒液，加入1μl RNAse-free DNAse，混匀，37℃水浴反应30min。
(2)4℃,12 000rpm/min，离心10min，取10μl上清到另一个无菌的1.5mlEP管中。
(3)加入90ul Dilution Buffer(1mM Tris-HCl,pH 8.0，0.1mM EDTA，150mMNaCl)，混匀，37℃金属浴反应30min。
(4)自然冷却至室温，加入1μl蛋白酶K，65℃水浴反应1h。
(5)100℃金属浴反应0min，自然冷却至室温。
(6)进行Q-PCR检测滴度。
AAV病毒细胞共培养：6孔板培养板TCMK1细胞种板,细胞分组为空白组(BC)、AAV阴性对照组(AAV-NC)和AAV-ABCG2组病毒，各6个复孔；待细胞融合60％左右，更换新培养液：从-80℃冰箱内取出对照和AAV-ABCG2病毒，置冰上融化，BC组正常培养基培养，AAV-NC组和AAV-ABCG2组，分别滴加AAV-NC和AAV-ABCG2，30μL/孔，前后左右移动混匀。72小时后，裂解细胞，取RNA和蛋白质做RT-PCR和WB实验，检测RNA和蛋白质的表达。
Real-time PCR操作：用TRIzol(Sigma)裂解细胞，用异丙醇RNA提取，然后由乙醇沉淀。使用1μg RNA逆转录得第一链cDNA(南京Vazyme)。根据
III RT SuperMix的qPCR(南京Vazyme)试剂盒说明书配制PCR反应体系为：用2μl的cDNA产物进行20μl的终体积反应，其中含有2×ChamQ-SYBR-Color-qPCR-Master混合物10μl(Vazyme)、0.4μl的正、反义引物、ddH2O 7.2μl。基因表达值标准化用内参照管家基因GAPDH。用于PCR的基因特异性引物序列和所用反应条件如表1所示。
表1、ABCG2基因的RT PCR特异性引物序列和所用反应条件表
Western blots操作：用RIPA(Solarbio)裂解细胞，提取蛋白。用15μg蛋白质进行蛋白质印迹(Western blotting)。简单地说，电泳并转移到PVDF印迹膜中，将膜在5％脱脂奶粉中封闭1h，然后在4℃下与兔抗人ABCG2(1:1000；abcam)与辣根酶标记的山羊抗兔抗体(Zsbio)孵育40min，通过化学发光方法检测条带，Image-pro plus 8.软件计算灰度值。β-actin为内参照蛋白。
肝匀浆检测黄嘌呤氧化酶XOD操作：处死小鼠，迅速取出肝脏样本，置冰上，与生理盐水1:9混合,匀浆。匀浆液在4℃条件下12,000r/min离心10min，取上清液，上清液在4℃条件下继续以12,000r/min离心10min，取上清液用Xanthine Oxidase(XOD)assay kit(Colorimetric method)试剂盒(南京建成生物工程公司,A002-1-1)测定小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性，操作按照试剂盒说明进行。
促炎因子IL-1β检测ELISAI操作：
处死小鼠，迅速取出肾皮质和小肠回肠部分，做匀浆，取上清，方法同肝匀浆。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测肾皮质和回肠中IL-1β的含量：
基本步骤如下：
(1).包被：用碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10μg/ml。在聚苯乙烯酶标板的每孔加100μl，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。(一般商品化的试剂盒中已包被好抗体，此步骤可省略)
(2).封闭：每孔加入200μl封闭液，37℃孵育1-2h。
(3).洗涤：小心揭掉封板膜，放入洗板机，洗涤3-5遍。也可以手动洗板：弃去液体，每孔加入300μl洗液，浸泡1-2min，在吸水纸上拍干，重复3-5遍。(一般商品化的试剂盒中已包被好抗体，前三个步骤可省略)
(4).加样：加适当稀释的待检样品100μl于上述已包被的反应孔中。(同时做空白孔，倍比稀释的标准品孔，有条件可加做阴性对照孔及阳性对照孔作为质控点)。
(5).温育：用封板膜封板后置37℃孵育1-2h。
(6).洗涤：同步骤3。
(7).加抗体：于各孔中加稀释好的生物素化抗体工作液100μl。
(8).温育：用封板膜封板后置37℃孵育1h。
(9).洗涤：同步骤3。
(10).加酶结合物：于各孔中加稀释好的酶结合物工作液100μl。
(11).温育：用封板膜封板后置37℃避光孵育30min。
(12).洗涤：同步骤3。
(13).加显色底物：于各孔中加入TMB底物溶液100μl，37℃避光反应10～30min，直到倍比稀释的标准品孔出现明显的颜色梯度为止。
(14).终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸100μl，颜色由蓝色变为黄色。
(15).结果测定：10min内，在酶标仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。
全小肠内容物尿酸含量检测：实验结束前一晚禁食，处死各组小鼠，立即切除全部小肠(从十二指肠上端到回肠下端)。然后将其放在无菌台上，纵向切开，尽可能刮除所有肠道内容物，4℃条件下12,000r/min离心10min,取上清液,上清液在4℃条件下继续以12000r/min离心10min。取上清液测定尿酸的方法与先前上述。
HE染色免疫组化：
(A)HE染色：处死各组小鼠，取肾皮质和回肠组织，用4％多聚甲醛固定，经浸蜡包埋,切片(4μm)与贴片，脱蜡，HE染色，脱水透明，封片，显微镜观察，扫描或拍照。
(B)免疫组化：取小鼠肾皮质和回肠组织4μm石蜡切片，用抗ABCG2(1:10000)的多克隆抗体，通过与生物素标记的抗体(1:200，37℃1h)和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:200，37℃，1h)的反应，鉴定了免疫反应性，显微镜观察，扫描或拍照。
3、KM雄性小鼠分组
4周龄KM雄性小鼠在12：12小时白昼晚上交替，室温状况下喂养，适应性喂养1周，自由饮食。模拟人的不健康的高嘌呤、高糖、高脂和高蛋白生活习惯制备模型饲料：按质量分数10％酵母粉+10％果糖+20％含猪五花肉+60％基础饲料。40只小鼠随机等分为四组：
正常饲料对照组(a blank control group，BCG)：基础饲料饮食；
高尿酸模型饲料组(a hyperuricemia model group，MG)：模型饲料饮食；
AAV病毒阴性对照(AAV Negative Control Group，AAV-NCG)：1-4周模型饲料饮食，4-8周模型饲料饮食+AAV病毒尾静脉注射(注射量1.3ml/kg每3天一次)；
AAV病毒包装的ABCG2组(AAV-ABCG2)：1-4周模型饲料饮食，4-8周模型饲料饮食+AAV-ABCG2尾静脉注射(注射量1.3ml/kg每3天一次)。
4、统计
所有实验数据均用SPSS Statistics.26软件计算，经邦佛伦尼矫正和T-test,用mean±SD表示。统计的显著性用单因素方差分析两两比较(组间比较)和多因素方差分析两两比较(组间比较和组内比较)确定，统计显著性为P<0.05.显著性用字母标记法标记：如果组间比较或者组内比较有相同的字母(或符号)，意味着没有显著性差异；如果没有相同的字母(或符号)，意味着有显著性差异。
实施例1、AAV包装ABCG2全长mRNA CDs序列
在NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站的Gene中获取Mus musculus ATPbinding cassette subfamily G member 2(Junior blood group)(Abcg2),transcriptvariant 1,mRNA(NM_011920.3)CDs序列，以AAV9为载体，用三种质粒共同转染AAV-293宿主细胞方法包装小鼠ABCG2过表达载体。包装后的ABCG2过表达载体命名为AAV-ABCG2，以AAV病毒为阴性对照(AAV-NCG)进行后续实验。
实施例2、AAV病毒转染效果验证
将TCMK1分组为3组，正常培养基培养的空白对照组(Blank Control，BC)；AAV病毒对照组(AAV Control,AAV-NC)和AAV病毒包装的ABCG2组(AAV-ABCG2)共培养后72小时提取细胞的总RNA和蛋白质，做Real-time PCR和Western blots，结果如图1、图2所示。结果显示：Q-PCR统计分析、WB条带灰度分析，AAV-ABCG2在mRNA和蛋白水平表达显著上调作用。
实施例3、细胞水平过表达效果验证——尿酸吸收实验
TCMK1细胞分为4个实验组分别为：正常培养基培养组(Normal Control Group，NCG)，用正常培养基培养；尿酸组(Uric Acid Group，UAG)、AAV病毒对照组(AAV ControlGroup,AAV-NCG)和AAV病毒包装的ABCG2组(AAV-ABCG2)。UAG、AAV-NCG和AAV-ABCG2组，用含400μmol/L尿酸的培养基培养24后，吸干净培养液，用PBS洗3次，UAG换正常培养基培养，AAV-NCG组共培养AAV病毒、AAV-ABCG2组共培养AAV-ABCG2，24h后，分别取细胞外培养基和细胞裂解后的上清，测细胞内外尿酸浓度的变化(如图3所示)，结果显示AAV-ABCG2有显著的促进尿酸外排作用。
实施例4、高尿酸血症伴高血脂、高血糖小鼠模型建立验证
1-4周模型建立正常饲料对照组和高尿酸模型组，在第4周末，所有小鼠前一晚上禁饮食，提尾膀胱刺激法取尿、尾静脉取血、每周测量体重测血清尿酸(SUA)、尿尿酸(UUA)、甘油三脂(TG)、总胆固醇(T-CHO)、血糖(Glu)和Weight见表2。
表2、高尿酸伴高血脂高血糖建模4周，正常饲料对照组和高尿酸模型组SUA、UUA、TG、T-CHO、Glu和Weight的变化表
MG组和AAV-NCG组和AAV-ABCG2组经4周的模型饲料饮食，取尿、取血检测各指标，每周测量体重显示：MG组、AAV-NCG组和AAV-ABCG2组小鼠的SUA、UUA、TG、T-CHO、Glu和Weight显著高于BCG(P<0.05)。说明高尿酸伴高血脂高血糖小鼠建模成功。
实施例5、小鼠模型AAV-ABCG2过表达初步结果验证
实验第6周尾静脉取血、取尿和每周测量体重测SUA、UUA、TG、T-CHO、Glu和Weight，实验第8周结束，各实验组小鼠摘眼球测量上述参数，测试方法与实施例4中一致。结果如图4～9所示。
0-4周动物模型建立，结果MG组的SUA、UUA、TG、T-CHO、Glu和Weight显著高于BCG(P<0.05)，说明高尿酸伴高血脂高血糖小鼠建模成功，并且MG组小鼠体重显著高于BCG组。
4-8周为各实验组不同处理疗效：AAV-ABCG2显著降低血尿酸、甘油三酯、总胆固醇和血糖的水平，增加尿尿酸排出。随着MG组小鼠模型饲料饮食时间的增加，UUA排出减少而AAV-ABCG2组小鼠UUA排出增加。AAV-NCG组和MG组各项指标无差异。AAV-NCG组和MG组小鼠模型饲料饮食时间的增加，体重增加，AAV-ABCG2组小鼠，体重下降。
实施例6、小鼠模型AAV-ABCG2过表达最终结果验证
实验第8周结束，各实验组小鼠：
(1)检测血清肌酐Cr的含量(图10(A))、血尿素氮BUN的含量(图10(B))；取肝做肝匀浆检测黄嘌呤氧化酶XOD的变化(图10(C))；结果显示：以上3个指标BCG组低于MG组、AAV-NCG组和AAV-ABCG2组(P<0.05)，MG组和AAV-NCG组高于BCG组和高于AAV-ABCG2组(P<0.05),AAV-ABCG2组低于MG组和AAV-NCG组(P<0.05)高于BCG组(P<0.05)。MG组和AAV-NCG组无差异。结果说明：AAV病毒对小鼠的各项指标无影响，ABCG2过表达能降低血肌酐，血尿素氮水平，对肾脏具有保护作用；对高嘌呤高血脂高血糖饮食引起的高血尿酸伴高血脂高血糖有降低作用；能降低高嘌呤高血脂高血糖饮食引起的XOD和ADA的活性，减少尿酸的生成。
(2)取肾脏皮质(图11(A))和小肠回肠(图11(B))用ELISAI方法检测促炎因子L-1β的变化；结果显示：BCG组低于MG组、AAV-NCG组和AAV-ABCG2组(P<0.05)，MG组和AAV-NCG组高于BCG组和AAV-ABCG2组(P<0.05)；AAV-ABCG2组低于MG组和AAV-NCG组(P<0.05)高于BCG组(P<0.05)。MG组和AAV-NCG组无差异。结果说明：AAV病毒对小鼠的各项指标无影响，ABCG2过表达能降低高嘌呤高血脂高血糖饮食引起的肾脏小肠促炎因子IL-1β的水平，对高尿酸血症引起肾脏小肠炎症具有保护作用。
(3)取全小肠内容物检测小肠内容物尿酸的变化(图12)；BCG组高于MG组，AAV-NCG组和AAV-ABCG2组(P<0.05)；MG组和AAV-NCG组无差异；MG组和AAV-NCG低于BCG组AAV-ABCG2组(P<0.05),AAV-ABCG2组低于BCG组(P<0.05)高于AAV-NCG组(P<0.05)。结果说明：MG组，模型饲料饮食小鼠从小肠排出尿酸减少，AAV病毒对小鼠的小肠排尿素无影响；AAV-ABCG2组小鼠小肠排尿酸增加。
(4)取肾脏皮质和小肠回肠做HE染色免疫组化检测肾脏和小肠结构的变化(图13(A)、13(B))，以及免疫组化ABCG2蛋白质的表达变化(图14(A)、14(B))；显示在肾脏，小肠内ABCG2蛋白质的表达：MG组和AAV-NCG组小鼠ABCG2蛋白质表达低于BCG组和AAV-ABCG2组(P<0.05)；AAV-ABCG2高于BCG组、MG组和AAV-NCG组。
从图13(A)可以看出，HE染色肾脏结构的改变：虚线箭头指的是肾小球、肾小囊的改变，MG组、AAV-NCG组肾小囊腔隙增宽。实线箭头指的是肾小管上皮细胞及其排列紊乱程度，BCG组，显示细胞排列整齐，管腔内少见粘液性渗出；MG组、AAV-NCG组细胞排列紊乱，管腔内有粘液性渗出；AAV-ABCG2组细胞排列欠整齐，管腔内有少许粘液性渗出。
从图13(B)可以看出，HE染色小肠绒毛结构改变：虚线箭头是小肠上皮细胞及其排列紊乱程度，BCG组，AAV-ABCG2组，显示,细胞排列整齐；MG组、AAV-NC组绒毛肿胀，细胞排列紊乱。实线箭头指的是绒毛内毛细血管血流状态改变，MG组、AAV-NC组血流状态改变。
当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.ABCG2蛋白在制备改善、治疗或辅助治疗高尿酸血症伴高血脂、高血糖的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高尿酸血症为肾小管上皮细胞和小肠上皮细胞分泌尿酸的能力不足引起的血液尿酸增高。
3.ABCG2基因在制备改善、治疗或辅助治疗高尿酸血症伴高血脂、高血糖的制剂中的应用，其特征在于，所述ABCG2基因表达权利要求1或2任一项所述ABCG2蛋白。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂包括核酸分子或过表达腺相关病毒，核酸分子含有ABCG2基因的ORF核苷酸序列，腺相关病毒含有ABCG2基因的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述腺相关病毒通过AAV无辅助病毒系统制备。
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