CN117959445A - Rna结合蛋白抑制剂在用于制备抑制慢性乙型肝炎病毒复制的药物中的用途 - Google Patents
Rna结合蛋白抑制剂在用于制备抑制慢性乙型肝炎病毒复制的药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开RNA结合蛋白抑制剂在用于制备抑制慢性乙型肝炎病毒复制的药物中的用途，其中，该RNA结合蛋白为胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1。本发明首次证实了宿主因子胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1能够促进慢性乙型肝炎病毒的复制，这种促进作用是通过胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1识别和结合慢性乙型肝炎病毒RNA上的m6A修饰并增加其稳定性实现的。本发明因此提供了一个抗慢性乙型肝炎病毒的新靶点，通过靶向抑制胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1表达或使用葫芦素B抑制胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1与慢性乙型肝炎病毒RNA的结合均可发挥抗慢性乙型肝炎病毒作用，从而为抗慢性乙型肝炎病毒新药物的研发提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及RNA结合蛋白抑制剂在用于制备抑制慢性乙型肝炎病毒复制的药物中的用途。
背景技术
慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是慢性乙型肝炎(chronichepatitis B，CHB)、肝硬化和肝细胞癌的主要病因。HBV作为一种嗜肝DNA病毒，其感染和复制过程需要通过病毒和宿主因子之间的相互作用来完成。但由于对HBV生命周期的认识还不够充分，目前尚缺乏有效治愈CHB的药物。
与宿主细胞mRNA一样，HBV转录本也需要经历一系列的加工处理后才能成为成熟的mRNA，出核并翻译病毒蛋白。HBV RNA的转录后调控主要依赖于其结构中独特的转录后调节元件(post-transcriptional regulatory elements，PREs)，同时也受HBV RNA甲基化修饰的影响，并有多种宿主RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)参与其中。RBP与HBVRNA之间可形成核糖核蛋白复合物(Ribonucleoprotein complexes，RNP)，以高度动态的相互作用方式调节HBV RNA的代谢。
HBV病毒复制的源头是存在于感染肝细胞核内的以微染色体形式存在的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。cccDNA可转录出长度为3.5、2.4、2.1kb以及0.7kb的5种病毒RNA。这些HBV RNA的转录起始位置不同，但共用相同的多聚腺苷酸化(polyadenylation，polyA)信号，因此其转录终止在相同的位置。其中，长度为3.5kb的preC mRNA在细胞质中可翻译产生HBeAg，而同样约为3.5kb的pgRNA既可作为mRNA翻译产生core蛋白和P蛋白，也可作为病毒逆转录的模板被包入核衣壳。长度为2.4kb的PreS1 mRNA翻译形成大表面抗原(L-HBsAg)，2.1kb的PreS2/SmRNA翻译形成中表面抗原(M-HBsAg)和小表面抗原(S-HBsAg)。L-、M-、和S-HBsAg均可分布于成熟病毒(Dane颗粒)的包膜上，而M-和S-HBsAg还可以形成不含病毒核衣壳的管型和小球形亚病毒颗粒。长度为0.7kb的XmRNA可翻译形成HBx蛋白，其在cccDNA的转录调控和HBV致癌中均发挥重要的作用。
N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰是一种常见的碱基修饰，超过25％的哺乳动物转录本带有m6A修饰，并影响多个生物过程。在真核细胞中，m6A修饰位点多位于mRNA的3’、5’非编码区(untranslated region,UTR)和编码区。m6A修饰受甲基转移酶和去甲基酶共同调节，具有可逆性。同时发生m6A修饰的mRNA可被m6A识别蛋白结合，进而调控mRNA的稳定性、翻译和核输出等过程。研究发现，HBV RNA中包含多个m6A修饰位点，其中位于ε区下茎中的A1907位点的m6A修饰水平最高。5种HBV RNA的3’端均有A1907位点的m6A修饰，但仅有3.5kb HBV RNA的5’端带有A1907 m6A修饰位点。
因此，深入解析HBV生命周期的各个环节并确定HBV与宿主相互作用的分子机制，为抗HBV新药研发提供新的潜在靶点，具有重要的科学意义和社会价值。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的技术问题，本发明通过研究发现RNA结合蛋白可通过识别HBVRNA上的m6A修饰特异性结合HBV RNA，增强其稳定性，进而促进HBV病毒的复制。通过靶向敲减IGF2BP1能够抑制HBV复制，此外，葫芦素B可通过抑制IGF2BP1与HBV RNA的结合抑制HBV复制。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供RNA结合蛋白抑制剂在用于制备抑制慢性乙型肝炎病毒复制的药物中的用途，其中，所述RNA结合蛋白为胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述RNA结合蛋白抑制剂包括以下中的至少一种：
(1)基因表达抑制剂，其能够下调胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1的表达；
(2)蛋白活性抑制剂，其能够降低或抑制胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1的活性或使其失活；
(3)蛋白阻断剂，其能够抑制或阻断胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1与慢性乙型肝炎病毒RNA的结合。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述RNA结合蛋白抑制剂通过抑制或阻断胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1与m6A修饰的慢性乙型肝炎病毒RNA结合，使得慢性乙型肝炎病毒复制得到抑制。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述基因表达抑制剂包括CRISPR/Cas9系统、小干扰RNA、反义寡核苷酸和/或甲基化抑制剂。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述小干扰RNA具有以下所示的序列：GGCUCAGUAUGGUACAGUA。
本发明的第二方面，提供一种筛选对于抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用的化合物的方法，其包括：
(1)使用胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1过表达试剂构建细胞或动物模型；
(2)测定所述细胞或动物模型的慢性乙型肝炎病毒DNA的量；
(3)将待测化合物施用至所述细胞或动物模型；
(4)测定施用所述化合物后的慢性乙型肝炎病毒DNA的量，其中，若施用所述化合物后的慢性乙型肝炎病毒DNA的量降低，则所述待测化合物对抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用；若施用所述化合物后的慢性乙型肝炎病毒DNA的量不变或升高，则所述待测化合物对抑制慢性乙型肝炎病毒复制无用。
在某些实施方案中，根据本发明所述的筛选对于抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用的化合物的方法，其中，所述过表达试剂包括基因工程试剂，优选包含使胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1过表达的重组质粒。
在某些实施方案中，根据本发明所述的筛选对于抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用的化合物的方法，其中，所述细胞为体外细胞。
在某些实施方案中，根据本发明所述的筛选对于抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用的化合物的方法，其中，所述动物为哺乳动物。
在某些实施方案中，根据本发明所述的筛选对于抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用的化合物的方法，其中，所述哺乳动物包括大鼠、小鼠、兔或猴。
本发明首次证实了宿主因子IGF2BP1会促进HBV的复制，这种促进作用是通过IGF2BP1识别和结合HBV RNA上的m6A修饰并增加其稳定性实现的。本发明提供了一个抗HBV的新靶点IGF2BP1，通过靶向抑制IGF2BP1表达或用葫芦素B抑制IGF2BP1与HBV RNA的结合均可发挥抗HBV作用，从而为抗HBV新药物的研发提供了新思路。
附图说明
图1示出了在HepG2细胞中共同瞬时转染了prcccDNA/pCMV-Cre质粒和IGF2BP1质粒后2天。A：qPCR法检测细胞培养上清的HBV DNA。B&C：通过化学发光免疫分析仪检测细胞培养上清的HBeAg和HBsAg。D：western blot检测细胞内core蛋白及preS1蛋白。E：northernblot实验检测胞内HBV RNA。F：RT-qPCR实验检测胞内HBV RNA。在稳定产毒HepAD38细胞过表达IGF2BP1质粒后2天。G：qPCR法检测细胞培养上清的HBV DNA。H&I：通过化学发光免疫分析仪检测细胞培养上清的HBeAg和HBsAg。J：western blot检测细胞内core蛋白及preS1蛋白。K：northern blot实验检测胞内HBV RNA。L：RT-qPCR实验检测胞内HBV RNA。(三次重复实验后进行统计学分析：**，P<0.01；*，P<0.05；ns，没有统计学意义)。
图2示出了在HepG2细胞中瞬时转染了prcccDNA/pCMV-Cre质粒并敲减IGF2BP1后2天。A：qPCR法检测细胞培养上清的HBV DNA。B&C：通过化学发光免疫分析仪检测细胞培养上清的HBeAg和HBsAg。D：western blot检测细胞内core蛋白及preS1蛋白。E：northern blot实验检测胞内HBV RNA。F：RT-qPCR实验检测胞内HBV RNA。在稳定产毒HepAD38细胞敲减IGF2BP1后2天。G：qPCR法检测细胞培养上清的HBV DNA。H&I：通过化学发光免疫分析仪检测细胞培养上清的HBeAg和HBsAg。J：western blot检测细胞内core蛋白及preS1蛋白。K：northern blot实验检测胞内HBV RNA。L：RT-qPCR实验检测胞内HBV RNA。(三次重复实验后进行统计学分析：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05)。
图3为使用浓缩后的HBV病毒感染HepG2-NTCP细胞，在感染后第3天敲减IGF2BP1后。A：qPCR法检测细胞培养上清的HBV DNA。B&C：通过化学发光免疫分析仪检测细胞培养上清的HBeAg和HBsAg。D：western blot检测细胞内core蛋白。E：RT-qPCR实验检测胞内HBVRNA。(三次重复实验后进行统计学分析：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05)。
图4A：使用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG，与转染了prcccDNA/pCMV-Cre重组质粒系统的HepG2细胞裂解液进行共孵育，对沉淀的RNA进行RT-qPCR检测及琼脂糖凝胶电泳实验。B：使用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG，与稳定产毒的HepAD38细胞裂解液进行共孵育，对沉淀的RNA进行RT-qPCR检测及琼脂糖凝胶电泳实验。C：使用生物素标记的preCRNA、pgRNA、2.4kb、2.1kb及0.7kb HBV RNA分别与HepG2细胞裂解液共孵育，并利用链霉亲和素磁珠进行pulldown，检测不同HBV RNA结合的蛋白。D：在敲减IGF2BP1并瞬时转染了prcccDNA/pCMV-Cre质粒的HepG2细胞中加入放线菌素D抑制新生RNA产生，并在加药后不同时间点收获细胞，并以0h为基准标化，检测不同时间点3.5kb HBV RNA的相对表达水平。E：在过表达IGF2BP1并瞬时转染了prcccDNA/pCMV-Cre质粒的HepG2细胞中加入放线菌素D抑制新生RNA产生，并在加药后不同时间点收获细胞，并以0h为基准标化，检测不同时间点3.5kb HBV RNA的相对表达水平。F：在敲减IGF2BP1的稳定产毒HepAD38细胞中加入放线菌素D抑制新生RNA产生，并在加药后不同时间点收获细胞，并以0h为基准标化，检测不同时间点3.5kb HBV RNA的相对表达水平。G：在过表达IGF2BP1的稳定产毒HepAD38细胞中加入放线菌素D抑制新生RNA产生，并在加药后不同时间点收获细胞，并以0h为基准标化，检测不同时间点3.5kb HBV RNA的相对表达水平。H：使用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG分别对敲减METTL3及METTL14并瞬时转染了prcccDNA/pCMV-Cre重组质粒系统的HepG2细胞裂解液进行RNA免疫共沉淀，对沉淀的HBV RNA进行RT-qPCR检测。I：使用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG分别对敲减METTL3及METTL14的稳定产毒HepAD38细胞裂解液进行RNA免疫共沉淀，对沉淀的HBV RNA进行RT-qPCR检测。J：使用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG分别对转染了突变后的prccc-A1907C质粒及野生型prccc-WT质粒与pCMV-cre质粒瞬时转染的HepG2细胞裂解液进行RNA免疫共沉淀，对沉淀的HBV RNA进行RT-qPCR检测。K：使用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG，与转染了1.2x HBV质粒、1.2x HBV-3’A1907质粒、1.2x HBV-5’A1907C质粒及1.2x HBV-5’&3’A1907C质粒的HepG2细胞裂解液进行共孵育，对沉淀的RNA进行RT-qPCR检测。(三次重复实验后进行统计学分析：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05)。
图5A：在稳定产毒的HepAD38中加入1nM的葫芦素B培养48小时后，使用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG分别对细胞裂解液进行RNA免疫共沉淀，对沉淀的HBV RNA进行RT-qPCR检测。B：在稳定产毒的HepAD38细胞中加入0.5nM与1nM的CuB处理3天及5天，分别检测细胞培养上清中HBV DNA水平。C：向6-8周龄的C57BL/6J小鼠尾静脉水压动力注射1.2x HBV质粒，并在水压动力注射后第2、5、7、9、12天分别通过尾静脉给药的方式给予小鼠1ng/ml或10ng/ml的CuB，经小鼠内眦取血检测小鼠血清中HBsAg的表达，并在尾静脉水压动力注射后第9天处死部分小鼠，取肝脏进行HBcAg免疫组化染色及检测肝脏内HBV RNA和蛋白水平。D&E：尾静脉水压动力注射1.2x HBV质粒后不同时间点小鼠血清中HBsAg表达水平。F：尾静脉水压动力注射后第9天小鼠肝组织HBcAg免疫组化染色。G：用ImageJ分析HBcAg免疫组化染色样本的AOD值(每组3个样本)。H：western blot实验检测尾静脉水压动力注射后第9天小鼠肝组织的蛋白表达。I：RT-qPCR检测尾静脉水压动力注射后第9天小鼠肝组织内HBV RNA水平。(三次重复实验后进行统计学分析：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
用途
本发明的一个方面，提供了RNA结合蛋白抑制剂在用于制备抑制慢性乙型肝炎病毒(本文简称为HBV)复制的药物中的用途，其中所述RNA结合蛋白为胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1(本文简称为IGF2BP1)，本发明人首先发现并验证了IGF2BP1能够识别并结合HBV RNA，参与HBV mRNA的运输，调控靶HBV RNA的稳定性及翻译能力，增强靶HBV RNA的表达，并调控HBV复制。本发明人还发现，IGF2BP1能够与m6A修饰的HBV RNA结合，从而抑制HBV复制。
本发明中，术语“RNA结合蛋白抑制剂”是指任何能够抑制IGF2BP1的小分子物质(例如小分子化合物)和/或大分子物质(例如核酸、多肽、抗体、蛋白等)。抑制剂的抑制作用应作广义理解，其包括但不限于以下的至少一种情形：抑制或阻断IGF2BP1与靶RNA(即HBVRNA)的结合，抑制、降低或下调IGF2BP1的表达，抑制或降低IGF2BP1的量，抑制或降低IGF2BP1的活性或者使其失活。
本发明中，抑制或降低IGF2BP1的活性或者使其失活是指相较于未处理的IGF2BP1，经抑制剂处理的IGF2BP1的活性降低至少50％，优选至少80％，还优选至少90％，进一步优选至少95％，例如降低至少96％、97％、98％、99％、99.9％，甚至是100％的活性，该活性包括其发挥与HBV RNA结合的特性，特别是与m6A修饰的HBV RNA结合的特性，以及进一步抑制HBV复制的特性。
在一个优选的实施方案中，RNA结合蛋白抑制剂为基因表达抑制剂，其能够下调IGF2BP1的表达。还优选地，基因表达抑制剂包括CRISPR/Cas9系统、小干扰RNA、反义寡核苷酸和/或甲基化抑制剂。进一步优选地，基因表达抑制剂为siRNA或shRNA。最优选地，siRNA具有以下所示的序列：GGCUCAGUAUGGUACAGUA。
在一个优选的实施方案中，RNA结合蛋白抑制剂为抗IGF2BP1抗体，其通过与IGF2BP1特异性结合，从而使其构象发生改变，使IGF2BP1活性降低或失活。在某些实施方案中，本发明中，所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或鼠源抗体或来源其的片段，所述片段可以是Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、scFv、scFv Fc片段或单链抗体ScAb。
在一个优选的实施方案中，RNA结合蛋白抑制剂为葫芦素B，其通过抑制或阻断IGF2BP1与HBV RNA的结合，从而抑制慢性乙型肝炎病毒复制。
本发明中，抑制慢性乙型肝炎病毒复制可以通过测定HBV DNA的水平(量)来确定。此外，IGF2BP1的水平(量)可采用本领域已知的任何方法进行确定，对此不特别限定，本领域技术人员熟知如何确定相关基因的表达量或相关蛋白的量，例如使用特异性结合上述蛋白的抗体、或相关基因的探针，或能够扩增所述相关基因而设计的引物等。
筛选方法
本发明进一步提供一种用于筛选对于抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用的化合物的方法，其包括(1)使用胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1过表达试剂构建细胞或动物模型；(2)测定所述细胞或动物模型的慢性乙型肝炎病毒DNA的量；(3)将待测化合物施用至所述细胞或动物模型；(4)测定施用所述化合物后的慢性乙型肝炎病毒DNA的量。
本文中，IGF2BP1过表达试剂可以是能够使IGF2BP1蛋白的量增加的任何试剂，例如基因工程试剂，这样的试剂包括但不限于包含能够使IGF2BP1过表达的载体，如质粒等。过表达可以采用本领域已知的方法，例如构建过表达IGF2BP1的巨细胞病毒载体，向宿主细胞转染载体后收集病毒；滴加病毒液感染细胞；纯化并浓缩病毒；通过哺乳动物，如小鼠静脉注射使IGF2BP1过表达。此外，IGF2BP1激动剂也可用于本发明，该激动剂实例可以是本领域已知的小分子化合物或核酸等。
当确定化合物或候选药物是否有效时，可以测定细胞或动物模型，例如，来自细胞或动物模型的不同时间点，如施用待测化合物或候选药物前后的HBV DNA的量确定待测试化合物或候选药物是否对于抑制HBV复制有效。在一个优选的实施方案中，本发明的细胞模型为肝癌细胞(HepG2)。在另一个优选的实施方案中，本发明的动物模型为大鼠或小鼠。
本发明中，待测化合物或候选药物包括但不限于小分子化合物、多肽、蛋白和抗体等。
实施例
1、实验方法
1.1荧光定量PCR
取cDNA产物20μl使用双蒸水稀释至100μl，充分混匀。取2μl作为实时荧光定量PCR的模板，使用Roche Light Cycle 480IIPCR仪进行检测。反应条件：95℃5分钟；95℃10秒，60℃30秒，72℃30秒，40个循环。通过溶解曲线分析引物的特异性。根据各反应孔的阈值循环数Ct值，采用2-△△Ct方法，以CtBP1作为内参，计算基因的相对表达量。
1.2蛋白质印记实验
在含有酶抑制剂(Roche，Basel，Switzerl)的预冷过的RIPA缓冲液(Invitrogen，California，USA)中裂解细胞。然后将细胞裂解物在4℃下以12000rpm离心10分钟，收集上清液并通过BCA蛋白质测定试剂(Pierce，Illinois，USA)测定蛋白质浓度。在NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen，California，USA)上分离蛋白质裂解物并转移至PVDF膜(Millipore，Massachusetts，USA)。用抗体进行杂交。使用Odyssey Imager(LI-CORBiosciences,North Carolina,USA)观察蛋白质-抗体复合物。
1.3siRNA的转染
将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，计数后接种到6孔培养板，密度为3×105个/mL。取两支无RNA酶的EP管，分别加入600μl Opti-MEM溶液，其中一只加入180pmolsiRNA，另一只加入15μl Lipofectamine RNAiMAX。混匀后静置室温5分钟。将上述两管溶液混合，轻轻混匀，并在室温静置20分钟。将混合液加入到6孔培养板中，每孔加200μl。5％CO2、37℃培养箱中培养。
1.4RNA半衰期检测(RNA turnover)
细胞进行相应的处理后，加入终浓度为5μg/mL的放线菌素D抑制新生RNA产生，并在加药后不同时间点收获细胞，使用TRIzol(Invitrogen，California，USA)和三氯甲烷提取RNA，通过RT-qPCR实验检测不同时间点RNA的相对表达水平。采用2-ΔΔCt方法，以CtBP1作为内参，计算基因相对表达量。以0h时间点为基准对其他时间点表达值进行标化，计算相对表达量。
1.5Northern印迹杂交
收获不同处理组和对照组的HBV体外复制模型的细胞沉淀和HBV复制小鼠肝组织，采用TRIZOL试剂提取组织或细胞RNA。取5μg总RNA进行变性处理，配制琼脂糖凝胶，采用70V恒压条件下电泳5-7h。转印至尼龙膜后依次进行紫外交联固定、预杂交、探针杂交、封闭和抗体孵育，并通过ECL显影进行比较分析。
1.6RNA免疫共沉淀实验(RNA Immunoprecipitation，RIP)
在Polysome lysis buffer中裂解细胞，使用Dynabeads蛋白G(Invitrogen，California，USA)混合IGF2BP1抗体(proteintech，Rosemont，USA)对细胞裂解液进行免疫共沉淀实验，后使用NT2 buffer清洗磁珠后使用酸化酚氯仿提取磁珠拽下的RNA，通过RT-qPCR实验检测RNA的表达水平。
2、实验结果
2.1表达外源IGF2BP1促进HBV复制
为了研究IGF2BP1在HBV复制中的作用，本发明在瞬时转染了prcccDNA/pCMV-Cre质粒的HepG2细胞中外源过表达了IGF2BP1，结果显示，过表达IGF2BP1显著增加了培养上清的HBV DNA、HBeAg、HBsAg水平，以及胞内core蛋白和preS1蛋白水平(图1A-D)。同时，过表达IGF2BP1增加了胞内HBV RNA水平(图1E&F)。此外，在HBV复制模型HepAD38细胞(图1G-L)中也观察到了类似的结果。综上，本发明在HBV体外复制细胞模型中确认了过表达IGF2BP1可促进HBV复制。
2.2敲减IGF2BP1抑制HBV复制
为了进一步确认IGF2BP1在HBV复制中的作用，本发明在瞬时转染了prcccDNA/pCMV-Cre质粒的HepG2细胞中使用siRNA敲减了内源IGF2BP1。结果显示，敲减IGF2BP1显著降低了细胞培养上清中的HBV DNA、HBeAg、HBsAg水平，以及胞内core蛋白及preS1蛋白水平(图2A-D)。同时，敲减IGF2BP1降低了胞内HBV RNA水平(图2E&F)。此外，在HepAD38(图2G-L)及HBV体外感染细胞模型(图3)中也观察到了类似的结果。综上，本发明在HBV体外复制、感染细胞模型中确认了敲减内源IGF2BP1可抑制HBV的复制。
2.3IGF2BP1可与HBV RNA结合并提高其稳定性
为证实IGF2BP1与HBV RNA的相互作用，本发明用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG，与转染了prcccDNA/pCMV-Cre重组质粒系统的HepG2细胞裂解液或稳定产毒的HepAD38细胞裂解液进行共孵育，之后对沉淀的RNA进行RT-qPCR检测。结果显示，IGF2BP1抗体沉淀的HBV RNA水平均显著高于对照IgG(图4A-B)。利用生物素标记的preC RNA、pgRNA、2.4kb、2.1kb及0.7kb HBV RNA分别与HepG2细胞裂解液共孵育，并利用链霉亲和素磁珠进行pulldown，结果显示，生物素标记的5种HBV RNA均可在体外结合细胞裂解液中的IGF2BP1(图4C)，进一步证实了IGF2BP1与HBV RNA的结合。
为了探究IGF2BP1结合HBV RNA后调控HBV RNA表达的机制，本发明分别在敲减IGF2BP1及过表达IGF2BP1并转染了prcccDNA/pCMV-Cre重组质粒系统的HepG2细胞中加入放线菌素D抑制新生RNA产生，并在加药后不同时间点收获细胞，并以0h为基准标化，检测不同时间点3.5kb HBV RNA的相对表达水平，探究IGF2BP1对HBV RNA降解速度的影响。结果显示，敲减IGF2BP1后3.5kb HBV RNA降解速度变快(图4D)；过表达IGF2BP1使3.5kb HBV RNA降解速度变慢(图4E)。此外，在HepAD38细胞(图4F-G)中也观察到了类似的结果。综上，本发明确认了过表达IGF2BP1可增强HBV RNA稳定性，敲减IGF2BP1降低HBV RNA的稳定性。
2.4IGF2BP1通过识别HBV RNA上A1907位点的m6A修饰结合HBV RNA
为了进一步探究IGF2BP1与HBV RNA结合的具体位点，本发明通过敲减甲基转移酶METTL3和METTL14抑制胞内RNA的m6A修饰水平后，使用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG分别对转染了prcccDNA/pCMV-Cre重组质粒系统的HepG2细胞裂解液进行RNA免疫共沉淀，结果显示m6A修饰水平降低后IGF2BP1结合的HBV RNA减少(图4H)。在HepAD38细胞(图4I)中也观察到了类似的结果，说明IGF2BP1与HBV RNA的结合依赖于HBV RNA上的m6A修饰。突变prcccDNA质粒上的A1907位点，使其无法进行m6A修饰，分别将prccc-WT及突变后的prccc-A1907C质粒与pCMV-cre质粒瞬时转染HepG2细胞，并使用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG分别对细胞裂解液进行RNA免疫共沉淀，结果显示m6A修饰位点A1907C突变后IGF2BP1结合的HBV RNA减少(图4J)。由于在3.5kb HBV pgRNA的5’和3’端各有一个可进行m6A修饰的A1907位点，本发明在pBB4.5-1.2xHBV质粒的基础上构建了5’和3’端A1907位点分别单突变及双突变的质粒，同样转染入HepG2细胞后，发现IGF2BP1结合的3.5kb HBV RNA在5’和3’分别单突变后减少，在5’和3’双突变后进一步减少(图4K)，说明IGF2BP1与3.5kb的HBV RNA两端的A1907位点均可结合。由于A1907C突变后，IGF2BP1结合的HBV RNA虽然有所减少，但仍有部分结合，因此推测除了A1907外，HBV RNA上还有其他的IGF2BP1结合位点。
2.5葫芦素B(cucurbitacin B，CuB)通过抑制IGF2BP1与HBV RNA的结合抑制HBV复制
为了探究葫芦素B(cucurbitacin B，CuB)是否影响HBV复制，本发明首先在稳定产毒的HepAD38中加入1nM的葫芦素B培养48小时后，使用IGF2BP1的特异性抗体及同种属IgG分别对细胞裂解液进行RNA免疫共沉淀，结果显示加入1nM CuB处理后IGF2BP1结合的HBVRNA减少(图5A)，说明CuB可抑制IGF2BP1与HBV RNA的结合。
进一步，本发明探究了CuB是否可以抑制HBV复制，在稳定产毒HepAD38细胞加入0.5nM与1nM的CuB处理3天及5天，分别检测细胞培养上清中HBV DNA水平，发现CuB可降低HBV DNA水平，其中低浓度(5nM)CuB抑制HBV DNA的效果更好(图5B)。
另外，向6-8周龄的C57BL/6J小鼠尾静脉水压动力注射1.2x HBV质粒构建HBV复制小鼠模型，并在注射后第2、5、7、9、12天分别通过尾静脉给药的方式给予小鼠PBS或1ng/ml或10ng/ml的CuB，经小鼠内眦取血检测小鼠血清中HBsAg的表达，并在尾静脉水压动力注射后第9天处死部分小鼠，取肝脏进行HBcAg免疫组化染色及检测肝脏内HBV RNA和蛋白水平(图5C)。尾静脉注射CuB可抑制小鼠血清中HBsAg的水平(图5D&E)，免疫组化和westernblot结果显示CuB抑制小鼠肝组织中HBcAg的表达(图5F-H)，同时肝内HBV RNA水平也被CuB抑制(图5I)。与细胞内结果相符，CuB可以抑制小鼠HBV复制模型中HBV的复制，其中低浓度(1ng/ml)对HBV复制的抑制效果更强。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (10)
1.RNA结合蛋白抑制剂在用于制备抑制慢性乙型肝炎病毒复制的药物中的用途，其特征在于，所述RNA结合蛋白为胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述RNA结合蛋白抑制剂包括以下中的至少一种：
(1)基因表达抑制剂，其能够下调胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1的表达；
(2)蛋白活性抑制剂，其能够降低或抑制胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1的活性或使其失活；
(3)蛋白阻断剂，其能够抑制或阻断胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1与慢性乙型肝炎病毒RNA的结合。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述RNA结合蛋白抑制剂通过抑制或阻断胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1与m6A修饰的慢性乙型肝炎病毒RNA结合，使得慢性乙型肝炎病毒复制得到抑制。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述基因表达抑制剂包括CRISPR/Cas9系统、小干扰RNA、反义寡核苷酸和/或甲基化抑制剂。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述蛋白活性抑制剂包括抗体或其片段。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述蛋白阻断剂包括葫芦素B。
7.一种用于筛选对于抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用的化合物的方法，其特征在于，包括：
(1)使用胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1过表达试剂构建细胞或动物模型；
(2)测定所述细胞或动物模型的慢性乙型肝炎病毒DNA的量；
(3)将待测化合物施用至所述细胞或动物模型；
(4)测定施用所述化合物后的慢性乙型肝炎病毒DNA的量，其中，若施用所述化合物后的慢性乙型肝炎病毒DNA的量降低，则所述待测化合物对抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用；若施用所述化合物后的慢性乙型肝炎病毒DNA的量不变或升高，则所述待测化合物对抑制慢性乙型肝炎病毒复制无用。
8.根据权利要求7所述的用于筛选对于抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用的化合物的方法，其特征在于，所述过表达试剂包括基因工程试剂，优选包含使胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1过表达的重组质粒。
9.根据权利要求7所述的用于筛选对于抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用的化合物的方法，其特征在于，所述细胞为体外细胞。
10.根据权利要求7所述的用于筛选对于抑制慢性乙型肝炎病毒复制有用的化合物的方法，其特征在于，所述动物为哺乳动物，所述哺乳动物优选包括大鼠、小鼠、兔或猴。
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