CN112852772A - 一种基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,具体地,本发明涉及一种提高尿酸氧化酶(UOX)四聚体稳定性的方法以及基于该方法的聚乙二醇修饰尿酸氧化酶制剂及其制备工艺。上述方法是利用化学小分子试剂双(3,5‑二溴水杨基)延胡索酸酯分子内交联尿酸氧化酶,与原酶相比,分子内交联的UOX具有更好的pH稳定性、热稳定性和抗酶解能力;上述制剂是用聚乙二醇共价修饰分子内交联的尿酸氧化酶得到的,与用聚乙二醇直接修饰尿酸氧化酶的产物相比,它具有更好的酶比活性、pH稳定性、热稳定性和抗酶解能力,具有更低的免疫原性,特别适用于痛风、高尿酸症等的临床治疗,具有较好的应用前景和产业化价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地,涉及一种提高尿酸氧化酶四聚体稳定性的方法和一种治疗痛风和高尿酸血症的蛋白质药物制剂,尤其是涉及一种用双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯分子内交联尿酸氧化酶以提高其四聚体稳定性的方法,和一种聚乙二醇修饰分子内交联的尿酸氧化酶及其制备方法和应用。
背景技术
在生物体内的嘌呤代谢过程中,嘌呤核苷酸分解产生的黄嘌呤可以在黄嘌呤氧化酶作用下产生尿酸。尿酸在尿酸氧化酶(Urate oxidase,EC 1.7.3.3,UOX)作用下可进一步分解为溶解度较高的尿囊素等终产物。因此,尿酸氧化酶是生物体内嘌呤代谢的关键酶之一。但是,人类和一些灵长类动物体内缺乏有活性的尿酸氧化酶,无法代谢尿酸。尿酸的溶解度较低,不易排出体内,尿酸累积速率和肾脏排泄速率失衡就会导致高尿酸症的产生。研究表明,高尿酸症是导致痛风、肾结石、血管类疾病的主要元凶之一。
目前,治疗痛风和高尿酸症的药物主要是化学药,包括秋水仙碱、苯溴马隆、丙磺舒、别嘌醇、非布司他等。它们都需要长期服药,且具有较高的副作用,如严重的胃肠道反应等。国外已有两种治疗高尿酸症的生物药上市,即(Rasburicase)和(Pegloticase)。前者是源于黄曲霉的重组尿酸氧化酶,主要用于治疗肿瘤裂解综合征引起的高尿酸血症。后者是PEG修饰的尿酸氧化酶,主要用于治疗高尿酸引起的顽固性痛风。虽然二者具有一定的疗效,但它们的半衰期依然较短,需要频繁注射,并且存在产生过敏反应和严重抗体反应的风险。国内已有一项注射用重组尿酸氧化酶完成临床试验(登记号CTR20191617),主要用于治疗儿童高负荷患者急性高尿酸症;另有两项聚乙二醇修饰的重组尿酸氧化酶进入临床试验(登记号CTR20191260和CTR20171006);一项重组尿酸氧化酶临床试验(登记号CTR20132897)已被暂停。因此,迫切需要开发一种高效、安全的尿酸氧化酶制剂。
尿酸氧化酶作为一种外源性蛋白,人体对其具有较强的免疫反应;在结构上,它是由四个亚基组成的同源四聚体,一般认为这四个亚基的完整性是保持尿酸氧化酶活性的主要因素。然而,尿酸氧化酶的同源四聚体并不稳定,特别是在偏酸性的环境下易解聚形成二聚体或单体,从而导致其活性丧失;此外,尿酸氧化酶在一定条件下易聚集,形成八聚体或者多聚体,这样就会增强其免疫原性。因此,保持尿酸氧化酶的四聚体稳定性预计可以降低尿酸氧化酶的免疫原性,并维持其生物活性。
聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一种无毒的亲水性高分子化合物,可以用来对蛋白质进行共价修饰,以延长其体内半衰期,并降低免疫原性和毒性,已被美国FDA批准用于人体。目前已有多种PEG修饰蛋白质药物被批准上市,如PEG修饰的干扰素-α2a(Pegasys)、PEG化重组人粒细胞激落刺激因子等。PEG修饰作为一种较为成熟的技术,也被广泛用于降低尿酸氧化酶免疫原性和提高其循环半衰期方面。例如,(Pegloticase)即为一种PEG化尿酸氧化酶;PEG修饰尿酸氧化酶也申请了相关的专利保护(专利号CN102634492B、CN105412942B和CN109852623A)。PEG修饰后,尿酸氧化酶的活性损失较大,其免疫原性的下降幅度较小,可能原因是忽略了如何保持四聚体的稳定性这一核心问题。
双(3,5-二溴水杨酸)延胡索酸酯(DBBF)是一种无毒、廉价的小分子交联剂,常用于血红蛋白的分子内交联。DBBF可在血红蛋白分子内将两个α-亚基共价交联,抑制血红蛋白四聚体的解聚,改善血红蛋白的性质。DBBF的一个羰键可以与血红蛋白α-亚基上的第99位赖氨酸(Lys-99(α))残基反应形成酰胺键,同时二溴水杨酸基团被取代;另一个羰键与血红蛋白另一个α-亚基上的Lys-99(α)残基形成酰胺键,取代另一个二溴水杨酸基团。相似地,DBBF也可以对尿酸氧化酶进行分子内交联。因此,为了维持尿酸氧化酶四聚体的稳定性,本发明先用DBBF对尿酸氧化酶的亚基进行分子内交联,再用PEG进行修饰。这种新型的聚乙二醇修饰重组尿酸氧化酶具有较低的免疫原性、较高的四聚体稳定性、较高的酶活和较长的循环半衰期,适用于代谢紊乱导致的高尿酸血症、顽固性痛风及肿瘤引起的急性高尿酸血症。
发明内容
本发明的目的是提供一种小分子试剂,即双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯(DBBF),用于分子内交联尿酸氧化酶以提高其四聚体稳定性,以及用聚乙二醇(PEG)修饰分子内交联的尿酸氧化酶,达到降低尿酸氧化酶免疫原性、延长循环半衰期,以及保持其酶活性。修饰产物可用于治疗代谢紊乱导致的高尿酸血症、顽固性痛风及肿瘤引起的急性高尿酸血症。
为实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
以源于黄曲霉的重组尿酸氧化酶为对象,用DBBF对尿酸氧化酶进行分子内交联,交联的条件为:DBBF与尿酸氧化酶的摩尔比为1:(1-120)、pH值6-10、温度2-30℃、反应时间2-24小时。
本交联方法中,优选地,DBBF与尿酸氧化酶的摩尔比为1:(10-80)。
本交联方法中,优选地,用DBBF交联尿酸氧化酶时所用缓冲液的pH控制在7.0-8.5之间。
本交联方法中,优选地,用DBBF交联尿酸氧化酶时的温度控制在2-25℃。
本交联方法中,优选地,用DBBF交联黄曲霉尿酸氧化酶的反应时间为3-12小时。
本交联方法制备的黄曲霉尿酸氧化酶交联物(UOX-DBBF)与原酶(UOX)相比:在55℃加热1小时处理后,前者活性还剩余26.4%,后者活性还剩余5.0%;pH 4.4处理20分钟后,前者活性还剩余40.7%,后者活性还剩余8.2%;终浓度为0.05mg/ml的胰蛋白酶在37℃条件下处理5分钟,前者活性还剩余38.6%,后者活性还剩余19.8%左右。因此,本交联方法显著提高了黄曲霉尿酸氧化酶的稳定性,包括热稳定性、pH稳定性和抗胰蛋白酶水解的稳定性。本发明所涉及的一种基于DBBF交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其制备过程包括:用DBBF交联尿酸氧化酶;用聚乙二醇修饰分子内交联的尿酸氧化酶。
本发明所用的黄曲霉尿酸氧化酶是通过基因工程技术采用大肠杆菌表达系统获得的重组尿酸氧化酶。
本发明所用的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯,其分子量在2-20kDa之间;优选地,所用PEG的分子量为3-7kDa;特别优选地,本发明所用的PEG平均分子量为5kDa。本发明还提供一种基于DBBF分子内交联和聚乙二醇修饰尿酸氧化酶的制备方法:聚乙二醇修饰DBBF交联的尿酸氧化酶,修饰反应的摩尔比为1:(20-720),反应缓冲液的pH范围在6.0-9.0之间,反应时间为3-24小时,反应温度为2-30℃,最后用Superdex 200凝胶过滤层析对修饰产物进行分离纯化。
本发明提供的基于DBBF分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,具有以下优势:
(1)修饰产物(UOX-DBBF-PEG)的活性保持率远远高于用聚乙二醇共价修饰尿酸氧化酶(UOX-PEG)。
(2)与原酶(UOX)和UOX-PEG相比,UOX-DBBF-PEG具有更强的热稳定性、pH稳定性和抗酶解能力。
(3)与UOX和UOX-PEG相比,UOX-DBBF-PEG的免疫原性更低。
附图说明
图1 SDS-PAGE电泳分析制备的样品。泳道1-5分别为:标准蛋白、UOX、UOX-DBBF、UOX-PEG和UOX-DBBF-PEG。
图2凝胶过滤层析色谱鉴定制备的样品。所用分析型凝胶过滤柱为Superose 6(1厘米×30厘米)。分析条件:流动相为20mM磷酸缓冲液(pH 7.4),流速0.5毫升/分钟,检测波长为280纳米。
图3圆二色光谱检测样品的二级结构。
图4内源荧光光谱检测样品的三级结构。
图5 UOX样品的体外相对活性。
图6 UOX样品的热稳定性。
图7 UOX样品的pH稳定性(pH范围4.4-10.4)。
图8 UOX样品的抗酶解能力测定。
图9 UOX样品的免疫原性评价。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1:双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯交联尿酸氧化酶
取适量黄曲霉尿酸氧化酶(UOX),按摩尔比1:50加入双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯(DBBF),反应体系为20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4),置于4℃条件下反应3小时,最后透析至20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)以除去过量的DBBF,得到DBBF分子内交联的UOX(UOX-DBBF)。
实施例2:聚乙二醇修饰DBBF交联的尿酸氧化酶
称适量分子量为5kDa的PEG-琥珀酰亚胺酯,加20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)溶解,按摩尔比1:420(UOX:PEG)加入UOX-DBBF溶液,置于4℃条件下反应12小时,用Superdex 200凝胶过滤柱(1.6厘米×60厘米)对得到的修饰混合物进行纯化,所用洗脱液为20mM磷酸盐缓冲液(含0.15M氯化钠,pH 7.4)。收集PEG修饰的UOX-DBBF(UOX-DBBF-PEG)对应的洗脱峰。
实施例3:聚乙二醇修饰尿酸氧化酶
制备了PEG修饰的尿酸氧化酶(UOX-PEG),作为UOX-DBBF-PEG的对照。称适量分子量为5kDa的PEG-琥珀酰亚胺,加20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)溶解,按摩尔比1:560(UOX:PEG)加入UOX溶液,置于4℃条件下反应12小时,用Superdex 200凝胶过滤柱(1.6厘米×60厘米)对反应混合物进行纯化,所用洗脱液为20mM磷酸盐缓冲液(含0.15M氯化钠,pH 7.4)。浓缩后得到样品UOX-PEG。
实施例4:纯化结果鉴定
用SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。如图1所示,UOX(第2泳道)在电泳胶上呈现出一条主要的电泳条带,对应的分子量约为35kDa。这是因为在电泳条件下,UOX四聚体(~140kDa)解聚为单体(35kDa)。UOX-DBBF(第4泳道)在电泳胶上呈现出两条主要的电泳条带,对应的分子量约为35kDa和70kDa。这是因为DBBF对UOX的亚基进行了分子内交联,部分亚基交联后在电泳条件下不会解聚,而未交联的部分亚基解聚为单体。UOX-PEG(第3泳道)和UOX-DBBF-PEG(第5泳道)在电泳胶上均呈现出弥散的电泳条带,对应的分子量约为90-200kDa。
用Superose 6凝胶过滤柱(1厘米×30厘米)鉴定纯化结果。如图2所示,经缓冲液洗脱后,4种样品均出现单一的洗脱峰,表明它们具有较高的纯度。此外,UOX-DBBF与UOX的出峰时间基本一致。这表明DBBF交联后,UOX的分子量未发生显著变化。因此,DBBF对UOX进行了分子内交联,而且避免了UOX的分子间交联反应。与UOX相比,UOX-PEG和UOX-DBBF-PEG的出峰时间大幅提前,且两者的出峰时间基本一致。这表明PEG修饰显著增加了UOX的分子量,而且两者的PEG修饰度基本相同。
实施例5:样品的结构表征
由圆二色光谱法表征样品UOX、UOX-PEG、UOX-DBBF和UOX-DBBF-PEG的二级结构。如图3所示,UOX在208nm和216nm附近有明显负峰,表明UOX具有典型的α-螺旋结构特征。与UOX相比,其它三种样品在该处的结构特征稍微减弱。这表明用DBBF分子内交联或PEG修饰会轻微改变UOX的二级结构。
由内源荧光光谱法表征样品UOX、UOX-PEG、UOX-DBBF和UOX-DBBF-PEG的三级结构。如图4所示,在280nm波长激发下,4个样品的最大吸收峰波长均在332nm附近,没有发生蓝移或红移现象,这表明用DBBF分子内交联或PEG修饰并没有改变UOX的三级结构特征。然而,与UOX的荧光强度相比,其它样品的荧光强度均有所降低,并且UOX-DBBF-PEG的荧光强度最低。这表明DBBF分子内交联或PEG修饰可能会对UOX的荧光强度有一定的淬灭作用。
实施例6:样品的生物活性
采用紫外分光光度计法测定UOX样品的酶活。其原理是UOX能特异性地将尿酸氧化为尿囊素,一定范围内尿酸在292nm波长下的光吸收值与其浓度成正比。酶活测定的反应体系为50mM硼酸-硼砂缓冲液(pH 8.5),以该缓冲液校准调零后,取2.5ml浓度为10μg/ml的尿酸标准液,加0.5ml缓冲液,光吸收值A0作为空白对照;样品组体积为0.5ml,含UOX样品5μg,与2.5ml的尿酸标准液反应5分钟。UOX的光吸收值记为An,UOX-PEG、UOX-DBBF和UOX-DBBF-PEG的光吸收值均记为AUOX。以UOX的酶活作为100%,其它样品的相对活性=(A0-An)/(A0-AUOX)×100%。
如图4所示,与UOX的活性相比,UOX-PEG的活性约为26%,而UOX-DBBF-PEG的活性仍保持约90%。这表明由PEG直接修饰会显著降低UOX的酶活。DBBF分子内交联UOX后,UOX的活性几乎不变。PEG修饰UOX-DBBF后,UOX的酶活仅发生轻微的下降。这是由于DBBF的分子内交联会提高UOX的四聚体稳定性,抑制了PEG修饰对其微环境的改变,从而大体上保留了UOX的酶活。
实施例7:样品的稳定性测定
(1)热稳定性
用50mM硼酸-硼砂缓冲液(pH 8.5)将UOX样品调整蛋白浓度至0.5mg/ml,置于55℃水浴中加热处理,每隔1小时取出适量样品进行酶活测定。以样品加热前的酶活作为100%,计算加热处理后样品的相对酶活性。
如图5所示,经55℃加热1小时后,UOX的活性几乎完全丧失,而UOX-PEG活性还剩下约26%,其它样品的活性可以保持60%以上。其中,UOX-DBBF-PEG的活性保持率最高,可到达约82%。加热2小时后,UOX-PEG的酶活低于10%,而UOX-DBBF-PEG的活性可保持60%以上。加热3小时后,UOX-PEG的活性几乎完全丧失,但UOX-DBBF-PEG的活性仍能保持约20%。因此,直接PEG修饰可在一定程度上提高UOX的热稳定性,而DBBF交联后再用PEG修饰可以显著提高UOX的热稳定性。
(2)pH稳定性
配制pH 4.4-10.4的缓冲液,包括0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH 4.4和5.4)、0.2M磷酸盐缓冲液(pH 6.4、7.4和8.4)和0.2M硼酸盐缓冲液(pH 9.4和10.4)。将各种样品分别用上述缓冲液稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml,于4℃放置20分钟后测活性。各种样品以缓冲液pH值为8.4的相应酶活作为100%,计算处理后各种样品的相对酶活性。
如图6所示,在pH 7.4-9.4之间,UOX具有较好的相对活性,当pH下降至6.4时,其活性开始急剧下降。特别是在pH 4.4条件下,UOX的活性还剩余29%;在pH 4.4-6.4之间,UOX-PEG的活性保持率明显高于原酶UOX,但显著低于UOX-PEG-PEG的活性保持率。特别是在pH4.4的条件下,样品UOX-PEG-PEG的活性仍可保持82%,而UOX-PEG的活性仅剩余38%。以上结果表明,直接用PEG修饰会增加UOX的pH稳定性,但先用DBBF交联再用PEG修饰会进一步提高其pH稳定性,增加UOX的pH适应范围。
(3)抗酶解能力
在37℃和50mM硼酸盐缓冲液(pH 8.5)中,用终浓度为0.05mg/ml的胰蛋白酶处理终浓度为0.15mg/ml的UOX样品。处理5分钟后,取出样品测定酶活。样品以胰蛋白酶处理前的活性为100%,计算其剩余相对活性。如图7所示,胰蛋白酶处理5分钟后,UOX的剩余活性约为30%,UOX-PEG和UOX-DBBF-PEG的剩余活性分别为34%和43%左右。以上结果表明,直接用PEG修饰可以轻微提高UOX的抗酶解能力,但先用DBBF交联再用PEG修饰会进一步提高其抗酶解能力,增加UOX的稳定性。
实施例8:样品的免疫原性测定
取20只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠,每组5只,分为4组,分别对应PBS组、UOX组、UOX-PEG组和UOX-DBBF-PEG组。尾静脉分别注射各UOX样品,注射剂量为20μg/只,在第0天和第7天各注射一次。在第14天取血,于4℃放置30分钟后离心收集血清,置于-80℃保存备用。
采用ELISA法测定UOX样品的免疫原性,按空白孔吸光值的2.1倍所对应的稀释倍数作为该实验组的抗体滴度。如图8所示,PBS对照组未检测到抗UOX的抗体,UOX组产生较高的UOX特异性抗体滴度(1.6×104)。UOX-PEG组产生的UOX特异性抗体滴度为1.0×104,表明PEG修饰可以降低UOX特异性抗体滴度。UOX-DBBF-PEG组产生的UOX特异性抗体滴度为3.7×103。以上结果表明PEG修饰可以降低UOX的免疫原性,而DBBF交联后再用PEG修饰可以进一步降低其免疫原性。这可能是因为DBBF交联抑制UOX四聚体解聚,可以降低UOX抗原决定簇与机体的识别机率,从而减少了免疫应答的发生。
Claims (11)
1.一种基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶是由双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯分子内交联尿酸氧化酶和聚乙二醇化学修饰分子内交联的尿酸氧化酶制备而成。
2.根据权利要求1所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,制备方法包括以下步骤:(1)用双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯分子内交联尿酸氧化酶;(2)用聚乙二醇共价修饰双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯分子内交联的尿酸氧化酶;(3)分离纯化得到目的产物。
3.根据权利要求1所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,用双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯分子内交联尿酸氧化酶时,二者的摩尔比为(1-120):1,优选比例在(10-80):1之间。
4.根据权利要求1所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,用双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯交联尿酸氧化酶时所用缓冲液的pH范围在6-10之间,优选范围为7-8.5。
5.根据权利要求1所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,用双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯交联尿酸氧化酶的反应温度为2-30℃,优选温度为2-25℃,反应时间为2-24小时,优选时间为3-12小时。
6.根据权利要求1所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,所述的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯活化分子,其分子量在2-20kDa之间;优选的分子量为5kDa。
7.根据权利要求6所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯选自单甲氧基聚乙二醇羧甲基琥珀酰亚胺酯、甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺己酸酯、甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯等中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯为单甲氧基聚乙二醇羧甲基琥珀酰亚胺酯。
9.根据权利要求1所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,聚乙二醇与重组尿酸氧化酶发生共价结合反应摩尔比为(20-720):1,优选比例在(50-560):1。
10.根据权利要求1所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,聚乙二醇与重组尿酸氧化酶发生共价结合反应时pH范围在6-9之间,反应时间为3-24小时,反应温度为2-30℃。
11.根据权利要求1所述的基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶,其特征在于,分离纯化目标产物采用凝胶过滤层析色谱法,优选使用Superdex 200凝胶过滤柱。
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---|---|---|---|---|
US7056713B1 (en) * | 1998-08-06 | 2006-06-06 | Duke University | Urate oxidase |
CN101928704A (zh) * | 2010-03-04 | 2010-12-29 | 杭州北斗生物技术有限公司 | 黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物及其制备方法 |
CN111499732A (zh) * | 2020-04-22 | 2020-08-07 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
洪民等: "PEG和DBBF 修饰猪血红蛋白及其携氧性质", 《生物化学与生物物理学报》 * |
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