ES2352451T3 - Urato oxidasa. - Google Patents

Abstract

Proteína que comprende una proteína uricasa recombinante de una especie de mamífero que ha sido modificada para insertar uno o más residuos de lisina, en la que dicha proteína recombinante es una proteína quimérica de dos o más secuencias de aminoácidos de proteínas de mamífero.

Description

Urato oxidasa.

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional Estadounidense Nº 601095,489, presentada el 6 de agosto de 1998.

La invención descrita en la presente memoria se realizó con el apoyo del Gobierno de Estados Unidos bajo Otorgamiento Nº DK48529, concedido por los Institutos Nacionales de Salud. El Gobierno posee ciertos derechos en la invención.

La presente invención se refiere, en general, a proteínas urato oxidasa (uricasa) y moléculas de ácido nucleico que codifican las mismas. En particular, la invención se refiere a proteínas uricasa que son particularmente útiles como, por ejemplo, intermediarios para fabricar proteínas uricasa modificadas mejoradas con inmunogenicidad reducida y biodisponibilidad incrementada, Las proteínas uricasa modificadas preferibles de la presente invención incluyen las proteínas uricasa unidas covalentemente a poli(etilenglicoles) o poli(óxidos de etileno). La presente solicitud describe, por ello, proteínas uricasa, anticuerpos que específicamente se unen con las proteínas, moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas uricasa y fragmentos útiles de las mismas, vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico, células huésped que contienen los vectores y métodos para utilizar y fabricar las proteínas uricasa y moléculas de ácido nucleico.

Antecedentes

La gota es la enfermedad inflamatoria articular más común en los hombres de más de 40 años (Roubenoff 1990). La artritis gotosa dolorosa se produce cuando el nivel sanguíneo elevado de ácido úrico (hiperuricemia) lleva a la formación episódica de cristales microscópicos de urato monosódico monohidrato en las articulaciones. Con el tiempo, la hiperuricemia crónica también puede dar como resultado depósitos de urato cristalino destructivos (tofos) alrededor de las articulaciones, en los tejidos blandos, y en algunos órganos (Hershfield 1996). El ácido úrico tiene solubilidad limitada en la orina y cuando es sobreexcretado (hiperuricosuria) puede causar cálculos renales (uricolitiasis). En pacientes con ciertos cánceres, particularmente leucemia y linfoma, la marcada hiperuricemia e hiperuricosuria (debido al aumento en el recambio y lisis de las células tumorales durante la quimioterapia) representan un riesgo serio de falla renal obstructiva, aguda (Sandberg et al. 1956; Gold y Fritz 1957; Cohen et al. 1980; Jones et al. 1990). La hiperuricemia grave y la gota están asociadas a la disfunción renal a partir de diversas causas, que incluyen terapia con ciclosporina para evitar el rechazo de aloinjerto de órgano (West et al. 1987; Venkataseshan et al. 1990; Ahn et al. 1992; Delaney et al. 1992; George y Mandell 1995).

La hiperuricemia puede resultar de la sobreproducción y excreción insuficiente de urato (Hershfield y Seegmiller 1976; Kelley et al.1989; Becker y Roessler 1995). Cuando es leve, la hiperuricemia puede controlarse con dieta, pero cuando es pronunciada y se asocia a consecuencias clínicas serias, requiere tratamiento con fármacos, un agente uricosúrico que promueve la excreción de ácido úrico (ineficaz si la función renal está reducida), o el inhibidor de la oxidasa xantina alopurinol, que bloquea la formación de urato. El alopurinol es el soporte principal de la terapia en pacientes con gota tofácea, insuficiencia renal, leucemia, y algunos trastornos heredados. El tratamiento para la hiperuricemia es generalmente eficaz y bien tolerado. Sin embargo, algunos pacientes con gota tofácea incapacitante, desfigurante son refractarios a toda terapia convencional (Becker 1988; Fam 1990; Rosenthal y Ryan 1995). Además, \sim2% de los pacientes tratados con alopurinol desarrollan reacciones alérgicas, y un grave síndrome de hipersensibilidad se produce en \sim0,4% (Singer y Wallace 1986; Arellano y Sacristan 1993). Este síndrome a menudo amenazante para la vida puede causar falla hepática y renal aguda, y grave lesión de la piel (necrólisis epidérmica tóxica, dermatitis exfoliativa, eritema multiforme, síndrome de Stevens-Johnson). El alopurinol también interfiere con el metabolismo de azatioprina y 6-mercaptopurina, fármacos utilizados en el tratamiento de leucemia y para la prevención del rechazo de aloinjerto de órganos, afecciones en las que se produce hiperuricemia marcada y puede causar gota grave o amenazar la función renal.

Finalmente, la hiperuricemia es el resultado de la inactivación mutacional del gen humano para la urato oxidasa (uricasa) durante la evolución (Wu et al. 1989; Wu et al. 1992). La uricasa activa en los peroxisomas del hígado de la mayor parte de los primates no humanos y otros mamíferos convierten el urato en alantoína (+ CO_{2} y H_{2}O_{2}), que es 80-100 veces más soluble que el ácido úrico y es manipulada más eficientemente por el riñón. Se ha utilizado la uricasa parenteral, preparada a partir de Aspergillus flavus (Uricozyme®, Clin-Midy, París), para tratar hiperuricemia grave asociada a la quimioterapia de leucemia durante 20 años en Francia e Italia (London y Hudson 1957; Kissel et al. 1968; Brogard et al. 1972; Kissel et al. 1972; Potaux et al. 1975; Zittoun et al. 1976; Brogard et al. 1978; Masera et al. 1982), y se ha utilizado en recientes ensayos clínicos en pacientes con leucemia en Estados Unidos (Pui et al. 1997). La uricasa posee una aparición de acción más rápida que el alopurinol (Masera et al. 1982; Pui et al. 1997). En pacientes con gota, las infusiones con uricasa pueden interrumpir los ataques agudos y disminuir el tamaño de los tofos (Kissel et al. 1968; Potaux et al. 1975; Brogard et al. 1978).

Aunque es efectiva para tratar la hiperuricemia aguda durante un corto transcurso de quimioterapia, la infusión diaria de uricasa de A. flavus sería una grave desventaja para tratar la gota tofácea o recurrente. Además, la eficacia de la uricasa de A. flavus disminuye rápidamente en pacientes que desarrollan anticuerpos anti-uricasa (Kissel et al. 1968; Brogard et al. 1978; Escudier et al. 1984; Mourad et al. 1984; Sibony et al. 1984). Se han producido reacciones alérgicas graves, que incluyen anafilaxis (Donadio et al. 1981; Montagnac y Schillinger 1990; Pui et al. 1997). Claramente se necesita una preparación de uricasa de acción más prolongada, menos inmunogénica para la terapia crónica.

Una metodología para secuestrar las enzimas exógenas de las proteasas y el sistema inmune incluye el acoplamiento covalente del polímero no tóxico, inerte, monometoxipolietilenglicol (PEG) a la superficie de las proteínas (Harris y Zalipsky 1997). Primero se demostró que el uso de PEGs con Mr \sim1.000 a >10.000 prolonga la vida en circulación y reduce la inmunogenicidad de diversas proteínas extrañas en animales (Abuchowski et al. 1977a; Abuchowski et al. 1977b; Davis et al. 1981a; Abuchowski et al. 1984; Davis et al. 1991). En 1990, la adenosina desaminasa bovina (ADA) modificada con PEG de Mr 5000 (PEG-ADA, ADAGEN®, producida por Enzon, Inc.) se convirtió en la primer proteína PEGilada en ser aprobada por la Administración de Fármacos y Alimentos de Estados Unidos, para el tratamiento de la enfermedad de deficiencia inmune combinada grave debido a la deficiencia de ADA (Hershfield et al. 1987). La experiencia en los pasados 12 años ha demostrado que los anticuerpos anti-ADA pueden detectarse mediante ELISA sensible en la mayoría de los pacientes durante el tratamiento crónico con PEG-ADA, pero no ha habido ninguna reacción de hipersensibilidad o alérgica; se ha producido la depuración acelerada de PEG ADA en unos pocos pacientes productores de anticuerpos anti-ADA, pero este usualmente ha sido un efecto transitorio (Chaffee et al. 1992; Hershfield 1997). Debe apreciarse que la función inmune de los pacientes con deficiencia de ADA usualmente no se vuelve normal durante el tratamiento con PEG-ADA (Hershfield 1995; Hershfield y Mitchell 1995). De ese modo, la inmunogenicidad podría ser un problema más significativo en el desarrollo de una enzima PEGilada para el tratamiento crónico de pacientes con función inmune normal.

La inmunogenicidad será entendida por aquel con experiencia común como relacionada con la inducción de una respuesta inmune mediante la preparación inyectada de un antígeno (tal como proteína modificada por PEG o proteína no modificada), mientras la antigenicidad se refiere a la reacción de un antígeno con anticuerpos preexistentes. Colectivamente, la antigenicidad y la inmunogenicidad son denominadas inmunoreactividad. En estudios previos de PEG-uricasa, se evaluó la inmunoreactividad mediante una variedad de métodos, que incluyen: la reacción in vitro de PEG-uricasa con anticuerpos preformados; mediciones de síntesis inducida de anticuerpos; y índices de depuración acelerada después de repetidas inyecciones.

Se ha demostrado que la PEGilación reduce la inmunogenicidad y prolonga la vida en circulación de las uricasas porcinas y micóticas en animales (Chen et al. 1981; Savoca et al. 1984; Tsuji et al. 1985; Veronese et al. 1997). La uricasa de Candida modificada con PEG rápidamente disminuyó el urato sérico hasta niveles no detectables en 5 voluntarios humanos normouricémicos (Davis et al. 1981b). La uricasa de Arthrobacter PEGilada producida por Enzon, Inc. se utilizó en forma compasiva para tratar un paciente hipersensible al alopurinol con linfoma, que presentaba falla renal y marcada hiperuricemia (Chua et al. 1988; Greenberg y Hershfield 1989). Se administraron cuatro inyecciones intramusculares durante aproximadamente dos semanas. Durante este breve período, la hiperuricemia se controló y ningún anticuerpo anti-uricasa puedo detectarse mediante ELISA en el plasma del paciente. No se ha practicado uso adicional y desarrollo clínico de esta preparación.

Hasta la fecha, no se ha desarrollado ninguna forma de uricasa o PEG-uricasa que posea una vida en circulación apropiadamente larga e inmunogenicidad suficientemente reducida para el uso seguro y confiable en la terapia crónica. El objetivo de la presente invención es proporcionar una forma mejorada de uricasa que, en combinación con la PEGilación, puede satisfacer estos requerimientos. La invención es una uricasa recombinante única derivada de mamífero, que ha sido modificada por mutación en una manera que ha demostrado aumentar la capacidad de PEGilación para enmascarar los epítopes potencialmente inmunogénicos.

Compendio de la invención

Es un objeto general de la presente invención proporcionar nuevas proteínas uricasa y secuencias de ácidos nucleicos que codifican las mismas.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar vectores y células huésped que contienen las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria y métodos para utilizarlas para producir las proteínas uricasa codificadas por las mismas.

La actividad uricolítica se expresa en la presente memoria en Unidades Internacionales (UI) por mg de proteína donde una UI de actividad de uricasa está definida como la cantidad de enzima que consume un micromol de ácido úrico por minuto.

La presente invención proporciona una proteína uricasa recombinante de una especie de mamífero que ha sido modificada para insertar uno o más residuos de lisina. La proteína recombinante, según lo utilizado en la presente memoria, se refiere a cualquier proteína artificialmente producida y se distingue de las proteínas producidas naturalmente (es decir, que son producidas en tejidos de un animal que posee solamente el gen natural para la proteína específica de interés). La proteína incluye péptidos y secuencias de aminoácidos. La proteína uricasa recombinante de la presente invención es una proteína quimera o híbrida de dos o más proteínas de mamífero, péptidos o secuencias de aminoácidos. En una realización, la presente invención puede utilizarse para preparar una proteína uricasa recombinante de una especie de mamífero, proteína que ha sido modificada para incrementar el número de lisinas hasta el punto en que, después de la PEGilación de la proteína uricasa recombinante, el producto de uricasa PEGilada es sustancialmente tan activo enzimáticamente como la uricasa no modificada y el producto de uricasa PEGilada no es inaceptablemente inmunogénico. Las formas truncadas de las uricasas de la presente invención también están contempladas donde los extremos terminales amino y/o carboxi de la uricasa pueden no estar presentes. Preferiblemente, la uricasa o está truncada hasta el grado que las lisinas son eliminadas.

Uno con experiencia común apreciará que el complejo conjugado uricasa-vehículo no debe contener tantos enlaces para reducir sustancialmente la actividad enzimática de la uricasa o muy pocos enlaces para permanecer inaceptablemente inmunogénicos. Preferiblemente, el conjugado retendrá al menos aproximadamente el 70% a aproximadamente 90% de la actividad uricolítica de la proteína uricasa no modificada y al mismo tiempo será más estable, de manera tal que retenga su actividad enzimática en almacenamiento, en el plasma de mamífero y/o suero a temperatura fisiológica, en comparación con la proteína uricasa no modificada. La retención de al menos aproximadamente 80% a aproximadamente 85% de la actividad uricolítica sería aceptable. Además, en una realización preferible, el conjugado proporciona una inmunogenicidad y/o inmunoreactividad sustancialmente reducida que la proteína uricasa no modificada. En una realización, la presente invención proporciona una proteína uricasa descrita en la presente memoria que puede modificarse mediante el acoplamiento a un vehículo farmacéuticamente aceptable no inmunogénico, no tóxico, tal como PEG, mediante un enlace covalente a al menos 1 de las lisinas contenidas en la proteína uricasa. Alternativamente, la proteína uricasa es modificada por el acoplamiento covalente a un vehículo a través de menos que aproximadamente 10 lisinas de su secuencia de aminoácidos. El acoplamiento a cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 de las lisinas está contemplado como realizaciones alternativas.

Una proteína uricasa de la presente invención es una molécula recombinante que incluye segmentos de proteínas uricasa de hígado de mandril y porcino. También se proporciona una secuencia modificada de mandril. En una realización, la presente invención proporciona una uricasa quimérica de mandril-cerdo (uricasa PBC (SEQ ID NO:2)) que incluye aminoácidos (aa)1-225 de uricasa porcina (SEQ ID NO:7) y aa 226-304 de uricasa de mandril (SEQ ID NO:6) (véase también la secuencia en la Figura 5). En otra realización, la presente invención proporciona una uricasa quimérica de cerdo- mandril (uricasa PKS) que incluye aa 1-288 de uricasa porcina y aa 289-304 de uricasa de mandril (SEQ ID NO: 4). Los derivados truncados de PBC y PKS también están contemplados. Las formas truncadas preferibles son proteínas PBC y PKS truncadas para eliminar 6 aminoácidos amino terminal o los 3 aminoácidos carboxi terminal, o ambos. Las secuencias representativas se dan en la SEQ ID NO: 8 (PBC amino truncada), 9 (PBC carboxi truncada), 10 (PKS amino truncada) y 11 (PKS carboxi truncada). Cada una de las uricasa PBC, uricasa PKS y sus formas trunca-
das poseen una a cuatro lisinas más que las que se encuentran en otras uricasas de mamíferos que han sido clonadas.

La presente invención proporciona moléculas (secuencias) de ácidos nucleicos (ADN y ARN), que incluyen formas clonadas y/o purificadas, aisladas de las moléculas de ácido nucleico, que codifican las proteínas uricasa y proteínas truncadas descritas en la presente memoria. Las realizaciones preferibles se muestran en la SEQ ID NO:1 (uricasa PBC) y SEQ ID NO:3 (uricasa PKS).

Los vectores (expresión y clonación) que incluyen estas moléculas de ácido nucleico también son proporcionados por la presente invención.

Además, la presente invención proporciona células huésped que contienen estos vectores.

También se describen anticuerpos que específicamente se unen a las proteínas uricasa de la presente invención. Los anticuerpos contra la parte amino de la uricasa de cerdo y los anticuerpos contra la parte carboxi de la uricasa de mandril, cuando se utilizan en conjunción, deben ser útiles en la detección de PBC, u otras proteínas quiméricas similares. Preferiblemente, el anticuerpo contra la parte amino de la uricasa quimérica no debe reconocer la parte amino de la uricasa de mandril y similarmente, el anticuerpo contra la parte carboxi de la uricasa quimérica no debe reconocer la parte carboxi de la uricasa de cerdo. Más preferiblemente, se proporcionan anticuerpos que específicamente se unen a PBC o PKS pero no se unen a las proteínas nativas, tales como uricasas de cerdo y/o mandril.

La presente invención puede utilizarse para preparar una composición farmacéutica para reducir la cantidad de ácido úrico en fluidos corporales, tal como orina y/o suero o plasma, que contienen al menos una de las proteínas uricasa o conjugados de uricasa descritos en la presente memoria y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también puede utilizarse en un método para reducir la cantidad de ácido úrico en fluidos corporales de un mamífero. El método incluye administrar a un mamífero una cantidad efectiva reductora de ácido úrico de una composición que contiene una proteína uricasa o conjugado de uricasa de la presente invención y un diluyente, vehículo o excipiente, que es preferiblemente vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. El mamífero a ser tratado es preferiblemente un ser humano.

La etapa de administración puede ser, por ejemplo, inyección por las vías intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Los niveles elevados de ácido úrico pueden estar en sangre u orina, y pueden estar asociados a gota, tofos, insuficiencia renal, transplante de órgano o cáncer.

La presente solicitud también describe un método para aislar y/o purificar una uricasa a partir de una solución de uricasa que contiene, por ejemplo, restos celulares y subcelulares de, por ejemplo, un proceso de producción recombinante. Preferiblemente, el método de purificación se beneficia de la solubilidad limitada de la uricasa de mamífero a pH bajo (Conley et al. 1979), al lavar el extracto recombinante crudo a un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 para eliminar la mayor parte de la proteínas que son solubles en este intervalo de pH bajo, después de lo que la uricasa activa es solubilizada en un tampón, preferiblemente tampón de carbonato de sodio, a un pH de aproximadamente 10-11, preferiblemente aproximadamente 10,2. La uricasa activa solubilizada después puede aplicarse a una columna de intercambio aniónico, tal como una columna Q Sefarosa, que se lava con gradiente de sal bajo a alto en un tampón a un pH de aproximadamente 8,5, después de lo que se obtiene uricasa purificada al eluir con un gradiente de cloruro de sodio en tampón de carbonato de sodio a un pH de aproximadamente 10 a aproximadamente 11, preferiblemente aproximadamente 10,2. La enzima además puede purificarse mediante cromatografía de filtración en gel a un pH de aproximadamente 10 a aproximadamente 11. En esta etapa, la enzima además puede purificarse al reducir el pH a aproximadamente 8,5 o menos para selectivamente precipitar la uricasa, pero no contaminantes más solubles. Después de lavar a un pH bajo (7-8) la uricasa después se solubiliza a un pH de aproximadamente 10,2. La preparación de uricasa después podría analizarse mediante métodos conocidos en la técnica de preparación farmacéutica, tal como, por ejemplo, una cualquiera de cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC), otros métodos cromatográficos, dispersión de luz, centrifugación y/o electroforesis en gel.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Análisis en SDS-mercaptoetanol PAGE (gel al 12%).

Figura 2. Vida en circulación de uricasa PEGilada y natural.

Figura 3. Relación de la actividad de la uricasa sérica y concentraciones en suero y orina de ácido úrico.

Figura 4. Mantenimiento del nivel en circulación de la actividad de uricasa (medida en suero) después de inyección repetida.

La Figura 5 muestra las secuencias de aminoácidos deducidas de uricasa quimérica de cerdo-mandril (uricasa PBC) y uricasa porcina que contiene las mutaciones R291 K y T301S (uricasa PKS), en comparación con las secuencias de porcino y mandril.

Figura 6. Comparación de las secuencias de aminoácidos de uricasa PKS y de cerdo.

Figura 7. Comparación de las secuencias de aminoácidos de PBC y PKS.

Figura 8. Comparación de las secuencias de aminoácidos de uricasa PBC y de cerdo.

Figura 9. Comparación de la secuencia de aminoácidos de uricasa de cerdo y D3H.

Figura 10. Comparación de las secuencias de aminoácidos de PBC y D3H.

Figura 11-1 y 11-2. Comparación por Bestfit (GCG software) de las secuencias codificantes de los ADNcs de uricasa PKS y de cerdo.

Figura 12-1 y 12-2. Comparación por Bestfit (GCG software) de las secuencias codificantes de los ADNcs de uricasa PKS y de mandril.

Figura 13-1 y 13-2. Comparación por Bestfit (GCG software) de las secuencias codificantes de los ADNcs de uricasa PBC y de cerdo.

Figura 14-1 y 14-2. Comparación por Bestfit (GCG software) de las secuencias codificantes de los ADNcs de uricasa PBC y de mandril.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona proteínas uricasa que son intermediarios útiles para conjugados mejorados de uricasa de polímeros solubles en agua, preferiblemente poli(etilenglicoles) o poli(óxidos de etileno), con uricasas. Uricasa, según lo utilizado en la presente memoria, incluye subunidades individuales así como el tetrámero natural, a menos que se indique lo contrario.

Aunque los seres humanos no fabrican una enzima activa, las transcripciones de ARNm de uricasa se han amplificado a partir de ARN de hígado humano (Wu et al. 1992). Teóricamente es posible que algunas transcripciones de uricasa humana sean traducidas; aún si los productos del péptido no fueran de longitud completa o fueran inestables, podrían ser procesados por células que presentan antígenos y desempeñan un papel en la determinación de la respuesta inmunológica a una uricasa exógena utilizada para el tratamiento. En teoría, puede ser posible reconstruir y expresar un ADNc de uricasa humana al eliminar las dos mutaciones sin sentido conocidas. Sin embargo, en ausencia de presión selectiva, es muy posible que las mutaciones sin sentido dañinas se hayan acumulado en el gen humano durante los millones de años desde que la primer mutación sin sentido fue introducida (Wu et al. 1989; Wu et al.1992). Sería difícil identificar y "corregir" todas las mutaciones para obtener actividad catalítica máxima y estabilidad proteica.

Los presentes inventores han apreciado que existe un alto grado de homología (similaridad) entre la secuencia de aminoácidos deducida de uricasa humana y aquellas de cerdo (aproximadamente 86%) y mandril (aproximadamente 92%) (véanse las Figuras 6-14, por ejemplo de medición de similaridad), mientras que la homología (similaridad) entre uricasa de A. flavus y ser humano es <40% (Lee et al. 1988; Reddy et al. 1988; Wu et al. 1989; Legoux et al. 1992; Wu et al. 1992). La presente invención proporciona proteínas uricasa quiméricas producidas en forma recombinante a partir de dos mamíferos diferentes que han sido diseñadas para ser menos inmunoreactivas a seres humanos que la enzima bacteriana o micótica más vagamente relacionada. Se espera que el uso de un derivado de uricasa de mamífero sea más aceptable para los pacientes y sus médicos.

La experiencia ha demostrado que los PEGs activados tal como han sido utilizados para fabricar PEG-ADA y modificar otras proteínas se acoplan a través de los grupos amino primarios del residuo terminal amino (cuando están presentes y no bloqueados) y grupos épsilon-amino de lisinas. Esta estrategia es útil porque pueden utilizarse condiciones de reacción suaves, y porque las lisinas con carga positiva tienden a estar ubicadas en las superficies de las proteínas. Las últimas son importantes ya que para cualquier proteína terapéutica los efectos deseados de PEGilación dependerán en parte de las características del polímero PEG (por ejemplo masa, estructura ramificada o no ramificada, etc.) así como del número y distribución de los sitios de acoplamiento de PEG de la proteína respecto de los epítopes y elementos estructurales que determinan la función y depuración de la proteína. Se ha ideado una estrategia para aumentar la capacidad de PEGilación para "enmascarar" epítopes y reducir la inmunogenicidad al introducir semiselectivamente nuevos residuos de lisina para la adición potencial de PEG (Hershfield et al. 1991). Esta estrategia emplea mutagénesis para reemplazar codones de arginina seleccionados con codones de lisina, una sustitución que mantiene carga positiva y posee efecto mínimo en los índices previstos por computadora de probabilidad superficial y antigenicidad (útil solamente cuando la secuencia de adición es conocida).

Como un ensayo experimental de esta estrategia, se ha utilizado purina nucleósido fosforilasa de E. coli recombinante (EPNP) (Hershfield et al. 1991). Se introdujeron sustituciones Arg-a-Lys en 3 sitios, lo que incrementa el número de lisinas por subunidad de 14 a 17, sin alterar la actividad catalítica. El triple-mutante purificado retuvo la actividad completa después de la modificación de \sim70% de los grupos NH_{2} accesibles con disuccinil-PEG5000 en exceso. La titulación de los grupos amino reactivos antes y después de la PEGilación sugirió que el triple mutante podría aceptar una hebra de PEG más por subunidad que la enzima de tipo salvaje. La PEGilación incrementó la vida en circulación de las enzimas APNP mutante y de tipo salvaje en ratones desde -4 horas a >6 días. Después de una serie de inyecciones intraperitonales en intervalos semanal/bisemanal, todos los ratones tratados con EPNPs no modificada, y 10 de 16 ratones (60%) inyectados con APNP de tipo salvaje PEGilada, desarrollaron altos niveles de anticuerpo anti-EPNP y una reducción marcada en la vida en circulación. En oposición, solamente 2/12 ratones (17%) tratados con la PEG-EPNP mutante desarrollaron rápida depuración; los bajos niveles de anticuerpo en estos ratones no se correlacionaron con la vida en circulación. Esta estrategia de ese modo fue exitosa en reducir sustancialmente la inmunogenicidad aunque solamente 1 de las 3 nuevas lisinas se modificaron después del tratamiento con PEG activado.

Cada una de las subunidades de uricasa de cerdo y mandril consiste en 304 aminoácidos, 29 de los cuales (es decir 1 en aproximadamente 10 residuos) son lisinas. Inicialmente los intentos por introducir 2 sustituciones Arg-a-Lys en el ADNc clonado para la uricasa de mandril, y también una sustitución de Lys para un codón de Glu en la posición 208, que se conoce que es un Lys en el gen de uricasa humana, dieron como resultado una proteína de mandril mutante expresada que tenía actividad catalítica de uricasa mayormente reducida. Fue evidente a partir de este experimento que la capacidad de mantener la actividad de enzima uricasa después de la mutación de arginina a lisina de la secuencia de ADN de mamífero no era predecible.

Posteriormente, se apreció que el residuo de aminoácido 391 en la uricasa de mandril es lisina, pero el residuo correspondiente en cerdo es arginina. El sitio de restricción Apal presente en ambos ADNcs se explotó para construir una uricasa quimérica en la que los primeros 225 aminoácidos se obtienen del ADNc de cedo y el terminal caboxi 79 se obtiene del ADNc de mandril, La uricasa quimérica (PBC) de cerdo-mandril resultante (SEQ ID NO:2) posee 30 lisinas, una más que cualquier enzima "parental". Una característica adicional de la uricasa PBC es que su parte "mandril" difiere de la uricasa humana en 4 de 79 residuos de aminoácidos, mientras que la uricasa humana y de cerdo difieren en 10 en la misma región. Posteriormente se construyó una versión modificada de PBC, que mantiene la lisina extra en la posición 291 y de otra manera difiere de la uricasa de cerdo solamente por una sustitución de serina por treonina en el residuo 301 ("pigKS" uricasa (SEQ ID NO:4)). En vistas de los resultados descritos en el párrafo precedente en el que varias inserciones de lisinas fueron dañinas para la actividad, fue inesperado que la uricasa quimérica PBC y PKS fueran completamente tan activas en comparación con la uricasa de cerdo natural no mutada y aproximadamente más que cuatro veces activa que la uricasa de mandril natural no mutada.

La presente invención proporciona una uricasa quimérica recombinante de cerdo-mandril, compuesta de porciones de las secuencias de uricasa de hígado de cerdo y mandril. Un ejemplo de dicha uricasa quimérica contiene los primeros 225 aminoácidos de la secuencia de uricasa porcina (SEQ ID NO: 7) y los últimos 79 aminoácidos de la secuencia de uricasa de mandril (SEQ ID NO: 6) (uricasa de cerdo-mandril, o uricasa PBC; Figura 6 y SEQ ID NO:2). Otro ejemplo de dicha uricasa quimérica contiene los primeros 288 aminoácidos de la secuencia porcina (SEQ ID NO: 7) y los últimos 16 aminoácidos de la secuencia de mandril (SEQ ID NO: 6). Debido a que la última secuencia difiere de la secuencia porcina en solamente dos posiciones, con una lisina (K) en lugar de arginina en el residuo 291 y una serina (S) en lugar de treonina en el residuo 301, este mutante se denomina cerdo-K-S o uricasa PKS.

\newpage

También se proporcionan vectores (expresión y clonación) que incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de la presente invención. Los vectores preferibles incluyen aquellos ejemplificados en la presente memoria. Uno con experiencia común apreciara que las moléculas de ácido nucleico pueden insertarse en un vector de expresión, tal como un plásmido, en orientación apropiada y correcto marco de lectura para la expresión. Si es necesario, el ácido nucleico (ADN) puede conectarse a las apropiadas secuencias de nucleótidos reguladoras traduccionales y transcripcionales reconocidas por el huésped deseado, aunque dichos elementos de control están en general disponibles en los vectores de expresión utilizados y conocidos en la técnica. El vector después puede introducirse en las células huésped a través de técnicas estándar. En general, no todas las células huésped serán transformadas por el vector. Puede ser necesario, por ello, seleccionar las células huésped transformadas. Dichos método de selección conocido en la técnica incluye incorporar en el vector de expresión una secuencia de ADN, con cualquier elemento de control necesario, que codifique un rasgo marcador seleccionable en la células transformada, tal como resistencia a antibióticos. Alternativamente, el gen para dicho rasgo seleccionable puede estar en otro vector que es utilizado para co-transformar las células huésped deseadas. Los vectores también pueden incluir un promotor apropiado, tal como un promotor procariótico capaz de la expresión (transcripción y traducción) del ADN en una célula huésped bacteriana, tal como E. coli, transformada con el mismo. Muchos sistemas de expresión están disponibles y son conocidos en la técnica, que incluyen bacterias (por ejemplo E. coli y Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae), hongo filamentoso (por ejemplo Aspergillus), células vegetales, células animales y células de
insectos.

Los vectores apropiados pueden incluir un replicón procariótico, tal como ColEl ori, para la propagación en, por ejemplo, una procariota. Los plásmidos de vectores de procarióticas típicos son pUC18, pUC19, pBR322 y pBR329 disponibles de Biorad Laboratories, (Richmond, CA), y pTrc99A y pKK223-3 disponibles de Pharmacia (Piscataway, NJ). Un plásmido de vector de célula de mamífero típico es pSVL disponible de Pharmacia (Piscataway, NJ). Este vector usa el promotor tardío SV40 para manejar la expresión de genes clonados, el nivel más alto de expresión que se encuentra en las células productoras de antígeno T, tal como las células de COS-1. Un ejemplo de un vector de expresión de mamífero inducible es el pMSG, también disponible de Pharmacia. Este vector usa el promotor de glucocorticoide inducible del terminal largo del virus tumoral mamario de ratón repetido para manejar la expresión del gen clonado. Los vectores de plásmido de levadura útiles son pRS403-406 y pRS413-416 y están generalmente disponibles de Stratagene Cloning Systems (LaJolla, CA). Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrantes de levaduras (Yips) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRPI, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos de centrómeros de levadura (Ycps).

Además, la presente invención proporciona células huésped que contienen estos vectores. Las células huésped preferibles incluyen aquellas ejemplificadas y descritas en la presente memoria.

Las proteínas uricasa de la presente invención pueden conjugarse a través de un enlace covalente, no tóxico, biológicamente estable en un número relativamente pequeño de hebras de PEG para mejorar la semivida biológica y solubilidad de las proteínas y reducir su inmunoreactividad. Dichos enlaces pueden incluir enlaces uretano (carbamato), enlaces amina secundaria, y enlaces amida. Diversos PEGs activados apropiados para dicha conjugación están comercialmente disponibles de Shearwater Polymers, Huntsville, AL.

La invención también puede utilizarse para preparar composiciones farmacéuticas de las proteínas uricasa como conjugados. Estos conjugados son sustancialmente no inmunogénicos y retienen al menos 70%, preferiblemente 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90% o más de la actividad uricolítica de la enzima no modificada. Los polímeros solubles en agua apropiados para el uso en la presente invención incluyen poli(etilenglicoles) o poli(óxidos de etileno) ramificados o lineales, todos comúnmente conocidos como PEGs. Un ejemplo de PEG ramificado es el objeto de la Patente Estadounidense 5.643.575.

En una realización de la invención, el número promedio de lisinas insertadas por subunidad de uricasa está entre 1 y 10. En una realización preferible, el número de lisinas adicionales por subunidad de uricasa está entre 2 y 8. Se entiende que el número de lisinas adicionales no debe ser tanto como para que sea un perjuicio para la actividad catalítica de la uricasa. Las moléculas de PEG del conjugado son preferiblemente conjugadas a través de las lisinas de la proteína uricasa, más preferiblemente, a través de una lisina o lisinas que no son de origen natural que se han introducido en la parte de una proteína diseñada que no contiene naturalmente una lisina en esa posición.

La presente solicitud describe un método para incrementar los sitios de acoplamiento de PEG no nocivo disponibles a una proteína uricasa en la que una proteína uricasa natural es mutada de tal manera para introducir al menos un residuo de lisina en la misma. Preferiblemente, este método incluye el reemplazo de argininas con lisinas.

Los conjugados PEG-uricasa que utiliza la presente invención son útiles para reducir los niveles (es decir, reducir la cantidad) de ácido úrico en la sangre y/u orina de mamíferos, preferiblemente seres humanos, y de ese modo puede utilizarse para el tratamiento de niveles elevados de ácido úrico asociados con afecciones que incluyen gota, tofos, insuficiencia renal, transplante de órgano y cáncer.

Los conjugados PEG-uricasa pueden introducirse en un mamífero que posee niveles de ácido úrico en exceso mediante cualquiera de un número de vías, que incluyen las vías oral, por enema o supositorio, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular e intraperitoneal. Patton, JS, et al., (1992) Adv Drug Delivery Rev 8:179-228.

La dosis efectiva de PEG-uricasa dependerá del nivel de ácido úrico y el tamaño del individuo. En una realización, PEG-uricasa puede administrarse en un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad que varía de 10 \mug a aproximadamente 1 g. En una realización preferible, la cantidad administrada está entre aproximadamente 100 \mug y 500 mg. Más preferiblemente, la uricasa conjugada se administra en una cantidad entre 1 mg y 100 mg, tal como, por ejemplo, 5 mg, 20 mg, o 50 mg. Las masas dadas para las cantidades de dosificación de las realizaciones se refieren a la cantidad de proteína en el conjugado.

Las formulaciones farmacéuticas que contienen PEG-uricasa pueden prepararse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, según lo descrito en Remington's Pharmaceutical Sciences, (1985) Easton, PA: Mack Publishing Co. Los excipientes apropiados para la preparación de soluciones inyectables incluyen, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer lactada, agua, polioles y glicerol. Las composiciones farmacéuticas para inyección parenteral comprenden líquidos no acuosos o acuosos, dispersiones, suspensiones, o emulsiones estériles farmacéuticamente aceptables así como polvos estériles para la reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles previo al uso. Estas formulaciones pueden contener componentes adicionales, tales como, por ejemplo, conservantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, tampones, antioxidantes y diluyentes.

La PEG-uricasa también puede proporcionarse como composiciones de liberación controlada para la implantación en un individuo para controlar continuamente los niveles elevados de ácido úrico en sangre y orina. Por ejemplo, el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, colágeno regenerado, poli-L-lisina, alginato de sodio, goma gellan, quitosano, agarosa, liposomas multilamelares y muchas otras formulaciones de liberación lenta comprenden materiales bioerosionables o biodegradables que pueden formularse con composiciones biológicamente activas. Estos materiales, cuando se implantan o inyectan, gradualmente se degradan y liberan el material activo al tejido circundante. Por ejemplo, un método para encapsular PEG-uricasa comprende el método descrito en la Patente Estadounidense Nº 5.653.974, que se incorpora a la presente por referencia. El uso de formulaciones bioerosionables, biodegradables y otras formulaciones de liberación lenta está expresamente contemplado en la presente invención. El uso de bombas de infusión y sistemas de encapsulación en matriz para el suministro de PEG-uricasa está también dentro del alcance de la presente invención. La PEG-uricasa también puede encerrarse ventajosamente en micelas o liposomas. La tecnología de encapsulación en liposomas es bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Lasic, D, et al., (Eds.) (1995) Stealth Liposomes, Boca Raton, FL: CRC Press.

Las composiciones farmacéuticas de PEG-uricasa descritas en la presente memoria disminuirán la necesidad de hemodiálisis en pacientes con alto riesgo de falla renal inducida por urato, por ejemplo, receptores de transplante de órganos (véase Venkataseshan, VS, et al., (1990) Nephron 56:317-321) y pacientes con algunos cánceres. En pacientes con grandes acumulaciones de urato cristalino (tofos), dichas composiciones farmacéuticas mejorarán la calidad de vida más rápidamente que los tratamientos disponibles actualmente.

Los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como restrictivos de la invención de ninguna manera, ilustran los diversos aspectos descritos más arriba.

Ejemplo 1 A. Construcción de PBC, PKS y ADNcs de uricasas relacionadas

Se utilizaron métodos estándar, y cuando fueran aplicables las instrucciones suministradas por los fabricantes de reactivos, para preparar el ARN celular total, para la amplificación por PCR (Patentes Estadounidenses Nº 4.683.195 y 4.683.202, 4.965.188 y 5.075.216) de ADNcs de urato oxidasa, y para la clonación y secuenciación de estos ADNcs (Erlich 1989; Sambrook et al. 1989; Ausubel 1998). Los cebadores de PCR para uratos oxidasas de cerdo y mandril (Tabla 1) fueron diseñados en base a las secuencias de codificación publicadas (Wu et al. 1989) y mediante la utilización del programa de software PRIME (Genetics Computer Group, Inc.).

TABLA 1 Cebadores para amplificación por PCR de ADNc de Urato Oxidasa

1

Las secuencias de las enzimas de restricción (minúscula) introducidas en los extremos de los cebadores son sentido (cerdo y mandril) EcoRI y NcoI; antisentido (cerdo) NcoI, HindIII, XbaI; antisentido (mandril) NcoI. En el caso del cebador sentido de mandril, el tercer codón GAC (Aspartato) presente en la urato oxidasa de mandril (Wu et al. 1992) se reemplazó con CAC (Histidina), el codón que está presente en esta posición en la secuencia codificante del pseudogen de urato oxidasa humana (Wu et al. 1992). Por esta razón la urato oxidasa recombinante de mandril generada a partir del uso de estos cebadores ha sido denominada urato oxidasa de mandril D3H.

El ARN celular total de hígados de cerdo y mandril se transcribió en forma inversa mediante la utilización de un kit de 1º hebra (Pharmacia Biotech Inc. Piscataway, NJ). La amplificación por PCR mediante la utilización de polimerasa de ADN Taq (GibcoBRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD) se realizó en un termociclador (Ericomp, San Diego, CA) con 20 ciclos de programa [30 seg, 95ºC; 30 seg, 55º; 60 seg, 70º], seguido por 10 ciclos [30 seg, 95ºC; 60 seg, 70º]. Los productos por PCR de urato oxidasa se digirieron con EcoRI y HindIII y se clonaron en pUC18 (cerdo), y también se clonaron directamente (cerdo y mandril D3H) mediante la utilización del sistema de clonación TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los clones de ADNc se transformaron en E. coli cepa XLI-Blue (Stratagene, La Jolla, CA). El ADN de plásmido que contiene ADNcs de uricasa clonado se preparó y la secuencia de inserción de ADNc se analizó mediante la técnica de didesoxi estándar. Los clones que poseían las secuencias codificantes de ADN de urato oxidasa publicadas (excepto por la sustitución de D3H en urato oxidasa de mandril descrita en la Tabla 1) se interpretaron y se verificaron en una serie de etapas posteriores mediante tecnología de ADN recombinante
estándar.

Los ADNcs de cerdo y mandril D3H que contienen secuencias codificantes de longitud completa se introdujeron en vectores de expresión pET (Novagen, Madison, WI) de la siguiente manera. El ADNc de uricasa de mandril D3H se escindió a partir de plásmido TA con enzimas de restricción NcoI y BamHI y después se subclonó en los sitios de clonación NcoI y BamHI de los plásmidos de expresión pET3d y pET9d. El ADNc de uricasa de cerdo de longitud completa se escindió a partir de clon de plásmido pUC con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII y se subclonó en los sitios EcoRI y HindIII de pET28b. La región de codificación de ADNc de cerdo también se introdujo en los sitios NcoI y BlpI del plásmido de expresión pET9d después de la excisión de los sitios NcoI y BlpI de
pET28b.

El ADNc de (PBC) quimera de cerdo-mandril se construyó mediante la escisión del fragmento de restricción 624 bp NcoI-ApaI del ADNc de uricasa de mandril D3H de un clon de pET3d-D3H-mandril, y después el reemplazo de este segmento de mandril D3H con el fragmento de restricción 624 bp NcoI-ApaI correspondiente de ADNc de cerdo. El ADNc de urato oxidasa PBC correspondiente consiste en codones de urato oxidasa de cerdo 1-225 unidos en marco a los codones 226-304 de urato oxidasa de mandril.

El ADNc de urato oxidasa de pig-KS (PigKS) se construyó mediante la escisión del fragmento de restricción 864 bp Ncol-Ndel del ADNc de uricasa de mandril D3H de un clon de mandril pET3d-D3H, y después mediante la escisión de este segmento de mandril D3H con el correspondiente fragmento de restricción con NcoI-NdeI de 864 bp de ADNc de cerdo. El ADNc de urato oxidasa PKS resultante consiste en los codones de urato oxidasa de cerdo 1-288 unidos en marco a codones 289-304 de urato oxidasa de mandril.

Las secuencias de aminoácidos de las urato oxidasas de mandril D3H, cerdo, PBC, y PKS se muestran en la Figura 5 y el LISTADO DE SECUENCIAS). Se utilizaron técnicas estándar para preparar stocks de glicerol al 15% de cada una de estos transformantes, y estos se almacenaron a -70ºC. Cuando cada una de estas especies se expresó y las enzimas recombinantes se aislaron (Tabla 2), las uricasas de cerdo, quimera PBC, y PigKS tenían actividad específica muy similar, que era aproximadamente 4-5 veces más alta que la actividad específica de uricasa recombinante de mandril. Este orden se confirmó en varios otros experimentos.

La actividad específica de uricasa PBC preparada mediante diversos procedimientos distintos varió en un intervalo de 2-2,5 veces.

TABLA 2

2

Los transformantes de E. coli BL21(DE3)pLysS de las 4construcciones de uricasa ADNc-pET indicadas en la Tabla 2 se plaquearon en agar LB que contenía antibióticos selectivos (carbenicilina y cloranfenicol para pET3d (pigKS); canamicina y cloramfenicol para pET9d (PBC, cerdo, mandril)), según lo indicado en el Manual de Sistema pET (Novagen, Madison WI). Se inocularon cultivos de 5 ml (LB más antibióticos) con colonias transformantes únicas y se cultivaron durante 3 horas a 37ºC. Después se transfirieron alícuotas de 0,1 ml a 100 ml de medio LB que contenía antibióticos selectivos y lactosa al 0,1% (para inducir la expresión de uricasa). Después del cultivo durante toda la noche a 37º, las células bacterianas de las alícuotas de 0,5 ml de los cultivos se extrajeron en tampón de carga SDS-PAGE, y se analizaron mediante SDS-PAGE mercaptoetanol: Esto estableció que los niveles comparables de proteína uricasa habían sido expresados en cada uno de los 4 cultivos (resultados no mostrados). Las células restantes de cada uno de los cultivos de 100 ml se cosecharon mediante centrifugación y se lavaron en PBS. Las células después se resuspendieron en 25 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 (PBS) que contenía inhibidor de proteasa AEBSF 1 mM (Calbiochem, San Diego, CA) y después se lisaron en hielo en un Disruptor de células bacterianas (Microfluidics, Boston MA). El material insoluble (que incluía uricasa) se peleteó por centrifugación (20,190 x g, 4º, 15 min). Los pélets se lavaron dos veces con 10 ml de PBS, y después se extrajeron durante toda la noche a 4º con 2 ml de Na_{2}CO_{3}1 M, pH 10,2. Los extractos se diluyeron a 10 ml con agua y después se centrifugaron (20,190 x g, 4º, 15 min). Después se determinaron la actividad de uricasa y concentraciones de proteínas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Expresión y aislamiento de uricasa PBC recombinante (preparación de fermentador de 4 litros)

El transformante de pET3d-uricasa PBC se plaqueó a partir de un stock de glicerol en una placa de agar LB que contenía carbenicilina y cloranfenicol, según lo indicado en el Manual de Sistema pET Novagen. Se preparó un inóculo de 200 ml comenzado a partir de una colonia única en medio líquido LB-antibiótico en un agitador rotatorio (250 r.p.m.) a 37º, mediante la utilización de procedimientos recomendados en el Manual de Sistema pET para maximizar la retención de plásmido pET. A una DO_{525} de 2,4, las células de este cultivo de 200 ml se recolectaron mediante centrifugación y se resuspendieron en 50 ml de medio fresco. Esta suspensión se transfirió a un fermentador de alta densidad que contenía 4 litros de medio SLBH que contenía carbenicilina y cloranfenicol (la composición del medio SLBH, y el diseño y operación del fermentador se describen en (Sadler et al. 1974). Después de 20 horas de cultivo bajo O_{2} a 32º (DO_{525} = 19) se añadió isopropiltiogalactósido (IPTG) hasta 0,4 mM para inducir la producción de uricasa. Después de 6 horas más (DO_{525} = 37) las células bacterianas se cosecharon por centrifugación (10.410 x g, 10 min, 4ºC), se lavaron una vez con PBS, y se almacenaron congeladas a -20ºC.

Las células bacterianas (189 g) se resuspendieron en 200 ml de PBS y se lisaron mientras se enfriaban en un baño de hielo/sal por sonicación (Heat Systems Sonicator XL, modelo de sonda CL, Farmingdale, NY) durante 4 explosiones x 40 segundos a una intensidad del 100%, con un descanso de 1 minuto entre explosiones. El material insoluble en PBS (que incluye uricasa) se peleteó por centrifugación (10.410 x g, 10 min, 4ºC), y después se lavó 5 veces con 200 ml de PBS. Se extrajo la uricasa en el pélet insoluble en PBS en 80 ml de Na_{2}CO_{3}1 M, pH 10,2 que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) y 130 \mug/ml de aprotinina. Los restos insolubles se eliminaron por centrifugación (20.190 x g, 2 horas, 4ºC). Todas las otras etapas en la purificación fueron a 4ºC (resultados resumidos en la Tabla 3).

El extracto de pH 10,2 se diluyó hasta 1800 ml con PMSF 1 mM (para reducir Na_{2}CO_{3} hasta 0,075 M). Esto se aplicó a una columna (2,6 x 9 cm) de Q-Sefarosa fresca (Pharmacia Biotech, inc., Piscataway, NJ), que había sido equilibrada con Na_{2}CO_{3} 0,075 M, pH 10,2. Después de la carga, la columna se lavó sucesivamente con 1) Na_{2}O_{3} 0,075 M, pH 10,2 hasta que la absorbancia A_{280} del efluente alcanzó el fondo; 2) NaHCO_{3}10 mM, pH 8,5 hasta que el pH del efluente cayó hasta 8,5; 3) 50 ml de NaHCO_{3} 10 mM, pH 8,5, NaCl 0,15 M; 4) un gradiente de 100 ml de NaCl 0,15 M a 15 M en NaHCO_{3}10 mM, pH 8,5; 5) 150 ml de NaHCO_{3} 10 mM pH 8,5, NaCl 1,5 M; 6) NaHCO_{3} 10 mM pH 8,5; 7) Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 11 hasta que el pH el efluente se elevó hasta 11. Finalmente, la uricasa se eluyó con un gradiente de 500 ml de NaCl 0 a 0,6 M en Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 11. La actividad eluyó en dos picos de absorción a A_{280}, que se combinaron en forma separada (Fracción A y Fracción B, Tabla 3). La uricasa en cada una de estas combinaciones después se precipitó al reducir el pH a 7,1 mediante la adición lenta de ácido acético 1 M, seguido por centrifugación (7.000 x g, 10 min). Los pélets resultantes se disolvieron en 50 ml de Na_{2}CO_{3}1 M, pH 10,2 y se almacenaron a 4ºC.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

3

\vskip1.000000\baselineskip

La uricasa presente en la fracción A comenzó a precipitar espontáneamente después de la elución de la columna. Por ello la actividad medida en esta etapa de purificación se subestimó.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Preparación a pequeña escala y PEGilación de uricasa PBC recombinante

Este ejemplo muestra que la uricasa PBC recombinante purificada puede utilizarse para producir una uricasa PEGilada. En esta reacción, todas las subunidades de uricasa fueron modificadas (Figura 1, carril 7), con retención de aproximadamente 60% de la actividad catalítica (Tabla 4).

A. Expresión a pequeña escala y aislamiento de uricasa PBC (Tabla 4. Figura 1)

Un cultivo de 4 litros de E. coli BL21 (DE3)pLysS transformada con ADNc pET3d-PBC se incubó en un agitador rotativo (250 r.p.m.) a 37º. A DO_{525} 0,7, el cultivo se indujo con IPTG (0,4 mM, 6 horas). Las células se cosecharon y se congelaron a -20ºC. Las células (15,3 g) se rompieron al congelarlas y descongelarlas, y se extrajeron con Na_{2}CO_{3} 1 M, pH 10,2, PMSF 1 mM. Después de la centrifugación (12.000 x g, 10 min, 4ºC) el sobrenadante (85 ml) se diluyó 1:10 con agua y después se sometió a cromatografía en Q-Sefarosa en una manera similar a aquella descrita en el Ejemplo 1. La actividad de uricasa combinada de esta etapa se concentró mediante ultrafiltración por presión mediante la utilización de una membrana PM30 (Amicon, Beverly, MA). El concentrado se sometió a cromatografía en una columna (2,5 x 100 cm) de Sefacril S-200 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) que se equilibró y se hizo correr en Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 10,2. Las fracciones que contenían actividad de uricasa se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración por presión, como más arriba.

B. PEGilación

Se permitió que 100 mg de uricasa concentrada por PBC Sepahacril S-200 (5 mg/ml, 2,9 \mumol de enzima; 84,1 \mumol de lisina) en Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 10,2 reaccionaran con un exceso de 2 veces (mol de PEG:mol de lisinas de uricasa) de una forma activada de PEG a 4º durante 60 minutos. La uricasa PEGilada se liberó de cualquier PEG sin reaccionar o hidrolizado mediante diafiltración de flujo tangencial. En esta etapa la reacción se diluyó 1:10 en Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 10,2 y se diafiltró vs. 3,5 vol. de Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 10,2, después vs. 3,5 vol. de fosfato de sodio 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,2. La enzima esterilizada por filtración fue estable a 4º durante al menos un mes.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

5

\vskip1.000000\baselineskip

La Figura 1 muestra un análisis de SDS-mercaptoetanol PAGE (gel al 12%) de fracciones obtenidas durante la purificación y PEGilación de uricasa (PBC) quimérica recombinante de cerdo-mandril. Carriles: 1= marcadores de PM; 2= extracto en SDS de células transformadas con ADNc pET3d-PBC no inducidas (E. coli BL21(DE3)pLysS); 3= extracto en SDS de células transformadas con ADNc pET-PBC inducidas con IPTG; 4= extracto crudo (ver Tabla 5); 5= combinación de uricasa concentrada por Q-sefarosa; 6= combinación de uricasa concentrada por Sefacril S-200; 7= uricasa PBC recombinante Sefacril S-200 PEGilada.

\newpage

Los resultados mostrados en la Tabla 4 muestran que la uricasa PBC purificada podría modificarse con retención de aproximadamente 60% de la actividad catalítica. En esta reacción de PEGilación todas las subunidades de uricasa se modificaron (Figura 1, carril 7). En los estudios no mostrados, la enzima PEGilada tenia propiedades cinéticas similares a la uricasa PBC no modificada (K_{M} 10-20 \muM). De manera importante, la enzima modificada era mucho más soluble que la enzima no modificada a pH fisiológico (>5 mg/ml en PBS vs. <1 mg/ml). La enzima PEGilada también pudo liofilizarse y después reconstituirse en PBS, pH 7,2, con mínima pérdida de actividad. En otros experimentos, comparamos las actividades de esta preparación de PEG-uricasa PBC con la preparación clínica de uricasa de A. flavus. A pH 8,6 en tampón de borato, la enzima de A. flavus tenía Vmáx 10-14 veces más alta y un K_{M} 2 veces más alto. Sin embargo, en PBS, pH 7,2, las enzimas micóticas no modificadas y PEG-PBC difirieron en la actividad de uricasa en <2 veces.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Vida en circulación en ratones de uricasa PBC no modificada y PEGilada

La Figura 2 muestra la vida en circulación de uricasa PBC PEGilada y natural. Los grupos de ratones (3 por punto de tiempo) se inyectaron IP con 1 unidad de uricasa PBC natural (círculos) o modificada con PEG (cuadrados) recombinante (preparación descrita en el Ejemplo 3). En los tiempos indicados, se obtuvo sangre de grupos de tres ratones para medir la actividad de uricasa sérica. La uricasa PEGilada (descrita en el Ejemplo 3) tuvo una semivida en circulación de aproximadamente 48 horas, vs. <2 horas para la enzima no modificada (Fig. 2).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Eficacia de la uricasa PEGilada de la invención

La Figura 3 muestra la relación de la actividad de uricasa sérica y las concentraciones en suero y orina de ácido úrico. En este experimento, un ratón knock-out deficiente de uricasa homocigota (Wu et al. 1994) recibió dos inyecciones, a las 0 y 72 horas, de 0,4 UI de uricasa PBC recombinante que había sido PEGilada. El ratón knock-out deficiente en uricasa se utilizó en este experimento porque, a diferencia de los ratones normales que poseen uricasa, estos ratones knock-out, como los seres humanos, poseen altos niveles de ácido úrico en sangre y fluidos corporales y excretan altos niveles de ácido úrico en su orina. Estos altos niveles de ácido úrico causan graves lesiones a los riñones de estos ratones, lo que es a menudo fatal (Wu et al. 1994).

El experimento que se muestra en la Figura 3 demuestra que las inyecciones intraperitoneales de una preparación PEGilada de uricasa PBC recombinante dieron como resultado un incremento en la actividad de uricasa sérica, que estuvo acompañado por una reducción marcada en las concentraciones séricas y urinarias de ácido úrico en un ratón deficiente en uricasa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 No inmunogenicidad del complejo construcción-vehículo

La uricasa PBC recombinante PEGilada se inyectó repetidamente en ratones deficientes en uricasa homocigotas sin inducir la depuración acelerada, consistente con la ausencia de inmunogenicidad significativa. Esto se confirmó mediante ELISA. La Figura 4 muestra el mantenimiento de los niveles en circulación de la actividad de uricasa (medidos en suero) después de inyección repetida. La uricasa PBC PEGilada se administró por inyección intraperitoneal en intervalos de 6-10 días. La actividad de uricasa sérica se determinó 24 horas posteriores a la inyección.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Enlace covalente a la lisina introducida en forma mutacional

La PEGilación de uricasa PBC recombinante purificada debe dar como resultado el acoplamiento de PEG a la nueva lisina (residuo 291). En este experimento una preparación de uricasa PBC podría ser modificada por PEGilación. Puede determinarse por medios conocidos en la técnica si el péptido que contiene la nueva lisina (residuo 291) ha sido modificado por PEGilación.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias

Abuchowski A, Kazo GM, Verhoest CR, Jr., van Es T, Kafkewitz D, Nucci ML, Viau AT et al (1984) Cancer therapy with modified enzymes. I. Antitumor properties of polyethylene glycol-asparaginase conjugates. Cancer Biochem Biophys 7:175-186.

Abuchowski A, McCoy JR, Palczuk NC, van Es T, Davis FF (1977a) Effect of attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase. J Bid Chem 252:3582-3586.

Abuchowski A, van Es T, Paiczuk NC, Davis FF (1977b) Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. J Biol Chem 252:3578-3581.

Ausubel FM (1998) Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons.

Ahn KJ, Kim YS, Lee HC, Park K, Huh KB (1992) Cyclosporine-induced hyperuricemia after renal transplant: Clinical characteristics and mechanisms. Transplantation Proceedings 24:1391-1392.

Arellano F, Sacristan JA (1993) Allopurinol hypersensitivity syndrome: A review. Ann Pharmacother 27:337-343.

Becker MA (1988) Clinical aspects of monosodium urate monohydrate crystal deposition disease (gout). Rheumatic Disease Clinics of North America 14:377-394.

Becker MA, Roessler BJ (1995) Hyperuricemia and gout, In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7º edición McGraw-Hill, Nueva York, páginas 1655-1677.

Brogard JM, Coumaros D, Frankhauser J, Stahl A, Stahl J (1972) Enzymatic uricolysis: A study of the effect of a fungal urate-oxydase. Eur J Clin Biol Res 17:890-895.

Brogard JM, Stahl A, Stahl J (1978) Enzymatic uricolysis and its use in therapy. In: Kelley WN, Arnold WJ, Weiner IM (eds) Uric Acid, Springer-Verlag, Nueva York, páginas 515-524.

Chaffee S, Mary A, Stiehm ER, Girault D, Fischer A, Hershfield MS (1992) IgG antibody response to polyethylene glycol-modified adenosine deaminase (PEG-ADA) in patients with adenosine deaminase deficiency. J Clin Invest 89:1643-1651.

Chen RHL, Abuchowski A, van Es T, Palczuk NC, Davis FF (1981) Properties of two urate oxidases modified by the covalent attachment of poly(ethylene glycol). Biochim Biophys Acta 660:293-298.

Chua CC, Greenberg ML, Viau AT, Nucci M, Brenckman WD, Jr., Hershfield MS (1988) Use of polyethylene glycol-modified uricase (PEG-uricase) to treat hyperuricemia in a patient with non-Hodgkin lymphoma. Ann Int Med 109: 114-117.

Cohen LF, Balow JE, Magrath IT, Poplack DG, Ziegler JL (1980) Acute tumor lysis syndrome: A review of 37 patients with Burkitt's lymphoma. Am J Med 64:468-491.

Conley TG, Priest DG (1979) Purification of uricase from mammalian tissue. Preparative Biochemistry 9:197-203.

Davis FF, Kazo GM, Nucci ML, Abuchowski A (1991) Reduction of immunogenicity and extension of circulating life of peptides and proteins. In: Lee VHL (eds) Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, Nueva York, páginas 831-864.

Davis S, Abuchowski A, Park YK, Davis FF (1981a) Alteration of the circulating life and antigenic properties of bovine adenosine deaminase in mice by attachment of polyethylene glycol. Clin Exp Immunol 46:649-652.

Davis S, Park YK, Abuchowski A, Davis FF (1981b) Hypouricaemic effect of polyethylene glycol modified urate oxidase. Lancet 1:281-283.

Delaney V, Sumrani N, Daskalakis P, Hong JH, Sommer BG (1992) Hyperuricemia and gout in renal allograft recipients. Transplantation Proceedings 24:1773-1774.

Donadio D, Errera J, Navarro M, Izarn P (1981) Anaphylaxis-like manifestations after intravenous injection of urate oxidase in an asthmatic child with acute leukemia (letter). Nouv Presse Med 10:711-712.

Erlich HA (1989) PCR Technology. Principles and applications for DNA amplification. Stockton Press, Nueva York.

Escudier B, Leclercq B, Tandonnet F, Nitenberg G (1984) Hyperuricemia resistant to urate oxidase, Efficacy of high doses (letter). Presse Med 13:1340.

Fam AG (1990) Strategies and controversies in the treatment of gout and hyperuricaemia. Balliere's Clinical Rheumatology 4:177-192

George T, Mandell BF (1995) Gout in the transplant patient. J Clin Rheumatol 1:328-334.

Gold GL, Fritz BD (1957) Hyperuricemia associated with the treatment of leukemia. Ann Int Med 47:428-434.

Greenberg ML, Hershfield MS (1989) A radiochemical-high-performance liquid chromatographic assay for urate oxidase in human plasma. Anal Biochem 176:290-293.

Harris JM, Zalipsky S (Ed.) (1997) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications ACS, Washington, DC.

Hershfield MS. (1997) Biochemistry and immunology of poly(ethylenegiycoi)-modified adenosine deaminase (PEGADA). In: Harris JM, Zalipsky S (ads) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, DC, páginas 145-154.

Hershfield MS (1995) PEG-ADA replacement therapy for adenosine deaminase deficiency: An update after 8.5 years. Clin Immunol Immunopathol 76:S228-S232.

Hershfield MS (1996) Gout and uric acid metabolism. In: Bennett JC, Plum F (eds) Cecil Textbook of Medicine, XX ed. WB Saunders, Nueva York, páginas 1508-1515.

Hershfield MS, Buckley RH, Greenberg ML, Melton AL, Schiff R, Hatem C, Kurtzberg J et al (1987) Treatment of adenosine deaminase deficiency with polyethylene glycol-modified adenosine deaminase, N Engl J Med 316:589-596.

Hershfield MS, Chaffee S, Koro-Johnson L, Mary A, Smith AA, Short SA (1991) Use of site-directed mutagenesis to enhance the epitope shielding effect of covalent modification of proteins with polyethylene glycol. Proc Natl Acad Sd USA 88:7185-7189.

Hershfield MS, Mitchell BS (1995) Immunodeficiency diseases caused by adenosine deaminase deficiency and purine nucleoside phosphorylase deficiency. In: Scriver CR, Beaudet AL. Sly WS, Valle D (eds) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7º edición McGraw-Hill, Nueva York, páginas 1725-1768.

Hershfield MS, Seegmiller JE (1976) Gout and the regulation of purine biosynthesis. In: Quagliariello E (eds) Horizons in Biochemistry and Biophysics, Addison-Wesley, Reading, MA, páginas 134-162.

Jones DP, Stapleton FB, Kalwinsky D, McKay CP, Kellie SJ, Pui CH (1990) Renal dysfunction and hyperuricemia at presentation and relapse of acute lymphoblastic leukemia. Med Pediatr Oncol 18:283-286.

Kelley WN, Fox 1H, Pallela TD (1989) Gout and related disorders of purine metabolism. in: Kelley WN, Harris ED, Ruddy S, Sledge CG (eds) Textbook of Rheumatology, 3º edición. WB Saunders, Philadelphia, páginas 1395-1448.

Kissel P, Lamarche M, Royer R (1968) Modification of uricaemia and the excretion of uric acid nitrogen by an enzyme of fungal origin. Nature 217:72-74.

Kissel P, Schmitt J, Streiff F, Makuary G, Schmidt C, Toussain P (1972) L'urate oxydase: son interet dans la prevention des hyperuricemies therapeutiques en hematologie. Ann Med Nancy 11:519-535.

Lee CC, Wu X, Gibbs RA, Cook RG, Muzny DM, Caskey CT (1988) Generation of cDNA directed by amino acid sequence: Cloning of urate oxidase. Science 239:1288-1291.

Legoux R, Delpech B, Dumont X, Guillemot JC, Ramond P, Shire D, Caput D et al (1992) Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding Aspergillus flavus urate oxidase. J Biol Chem 267:8565-8570.

London M. Hudson PM (1957) Uricolytic activity of purified uricase in two human beings. Science 125:937-938

Masera G, Jankovic M, Zurlo MG, Locasciulli A, Rossi MR, Uderzo C, Recchia M (1982) Urate-oxidase prophylaxis of uric acid-induced renal damage in childhood leukemia. J Pediatr 100:152-155.

Montagnac R, Schillinger F (1990) Anaphylactic complication tied to intravenous injection of urate oxidase. Nephrologie 11:259.

Mourad G, Cristol JP, Chong G, Andary M, Mion C (1984) Role of precipitating anti-urate oxidase antibodies in urate oxidase-resistant hyperuricemia (letter). Presse Med 13:2585.

Potaux L, Aparicio M, Maurel C, Ruedas ME, Martin-Dupont CL (1975) Uricolytic therapy. Value of urate oxidase in the treatment of hyperuricemias. Nov Presse Med 4:1109-1112.

Priest DG, Pitts OM (1972) Reaction intermediate effects on the spectrophotometric uricase assay. Analytical Biochemistry 50:195-205.

Pui C-H, Reliing MV, Lascombes F, Harrison PL, Struxiano A, Mondesir J-M, Riberio RC et al (1997) Urate oxidase in prevention and treatment of hyperuricemia associated with lymphoid malignancies. Leukemia 11:1813-1816.

Reddy PG, Nemali MR, Reddy MK, Reddy MN, Yuan PM, Yuen S, Laffler TG et al (1988) isolation and sequence determination of a cDNA clone for rat peroxisomal urate oxidase: Liver-specific expression in the rat. Proc Natl Acad Sci USA 85:9081-9085.

Rosenthal AK, Ryan LM (1995) Treatment of refractory crystal-associated arthtitis. Rheum Dis Clin North Amber 21:151-161.

Roubenoff R (1990) Gout and hyperuricemia. Rheumatic Disease Clinics of North America 16:539-550.

Sadler JR, Miwa J, Maas P, Smith T (1974) growth of high density bacterial cultures; a simple device. Laboratory Practice 23:632-643.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. A laboratory manual 2 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Pages.

Sandberg AA, Cartwright GB, Wintrobe MM (1956) Studies on leukemia. I. Uric acid excretion. Blood 11:154-166.

Savoca KV, Davis FF, Palczuk NC (1984) Induction of tolerance in mice by uricase and monomethoxypolyethylene glycol-modified uricase. Int Arch Allergy Appl Immunol 75:58-67.

Sibony G, North ML, Bergerat JP, Lang JM, Oberling F (1984) Hyperuricemia resistant to urate oxidase. Role of anti-serum urate oxidase precipitating antibodies (letter). Presse Med 13:443.

Singer JZ, Wallace SL (1986) The allopurinol hypersensitivity syndrome. Unnecessary morbidity and mortality. Arthritis Rheum 29:82-87.

Tsuji J, Hirose K, Kasahara E, Naitoh M, Yamamoto I (1985) Studies on the antigenicity of the polyethylene glycol-modified uricase, Int J Immunopharmacol 7:725-730.

Venkataseshan VS, Feingold R, Dikman S, Churg J (1990) Acute hyperuricemic nephropathy and renal failure after transplantation. Nephron 56:317-321.

Veronese FM, Caliceti P, Schiavon O (1997) New synthetic polymers for enzyme and liposome modification. In: Harris JM, Zalipsky S (eds) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, DC, páginas 182-192.

West C, Carpenter BJ, Hakala TR (1987) The incidence of gout in renal transplant recipients. Am J Kidney Dis 10: 369-371.

Wu X, Lee CC, Muzny DM. Caskey CT (1989) Urate oxidase: Primary structure and evolutionary implications. Proc Natl Acad Sci USA 86:9412-9416.

Wu X, Muzny DM, Lee CC, Caskey CT (1992) Two independent mutational events in the loss of urate oxidase. J Mol Evol 34:78-84.

Wu X, Wakamiya M, Vaishnav S, Geske R, Montgomery CM, Jr., Jones P, Bradley A et al (1994) Hyperuricemia and urate nephropathy in urate oxidase-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 91:742-746.

Zittoun R, Dauchy F, Teillaud C, Barthelemy M, Bouchard P (1976) Le traitement des hyperuricemies en hematologie par I'umte-oxydase et 'allopurinol. Ann Med Interne 127:479-482.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 09548998 P [0001]

\bullet US 4683202 A [0049]

\bullet US 5643575 A [0039]

\bullet US 4965188 A [0049]

\bullet US 5653974 A [0046]

\bullet US 5075216 A [0049]

\bullet US 4683195 A [0049]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bulletPatton, JS et al. Adv Drug Delivery Rev, 1992, vol. 8, 179-228 [0043]

\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 1985 [0045]

\bullet Stealth Liposomes. CRC Press, 1995 [0046]

\bulletVenkataseshan, VS et al. Nephron, 1990, vol. 56, 317-321 [0047]

\bulletAbuchowski A; Kazo GM; Verhoest CR, Jr.; van Es T; Kafkewitz D; Nucci ML; Viau AT et al. Cancer therapy with modified enzymes. I. Antitumor properties of polyethylene glycol-asparaginase conjugates. Cancer Biochem Biophys, 1984, vol. 7, 175-186 [0070]

\bulletAbuchowski A; McCoy JR; Palczuk NC; van Es T; Davis FF. Effect of attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase. J Biol Chem, 1977, vol. 252, 3582-3586 [0070]

\bulletAbuchowski A; van Es T; Palczuk NC; Davis FF. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. J Biol Chem, 1977, vol. 252, 3578-3581 [0070]

\bulletAusubel FM. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1998 [0070]

\bulletAhn KJ; Kim YS; Lee HC; Park K; Huh KB. Cyclosporine-induced hyperuricemia after renal transplant: Clinical characteristics and mechanisms. Transplantation Proceedings, 1992, vol. 24, 1391-1392 [0070]

\bulletArellano F; Sacristan JA. Allopurinol hypersensitivity syndrome: A review. Ann Pharmacother, 1993, vol. 27, 337-343 [0070]

\bulletBecker MA. Clinical aspects of monosodium urate monohydrate crystal deposition disease (gout). Rheumatic Disease Clinics of North America, 1988, vol. 14, 377-394 [0070]

\bullet Hyperuricemia and gout. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. McGraw-Hill, 1995, 1655-1677 [0070]

\bulletBrogard JM; Coumaros D; Frankhauser J; Stahl A; Stahl J. Enzymatic uricolysis: A study of the effect of a fungal urate-oxydase. Eur J Clin Biol Res, 1972, vol. 17, 890-895 [0070]

\bulletBrogard JM; Stahl A; Stahl J. Enzymatic uricolysis and its use in therapy. Uric Acid, 1978, 515-524 [0070]

\bulletChaffee S; Mary A; Stiehm ER; Girault D; Fischer A; Hershfield MS. IgG antibody response to polyethylene glycol-modified adenosine deaminase (PEG-ADA) in patients with adenosine deaminase deficiency. J Clin Invest, 1992, vol. 89, 1643-1651 [0070]

\bulletChen RHL; Abuchowski A; van Es T; Palczuk NC; Davis FF. Properties of two urate oxidases modified by the covalent attachment of poly(ethylene glycol). Biochim Biophys Acta, 1981, vol. 660, 293-298 [0070]

\bulletChua CC; Greenberg ML; Viau AT; Nucci M; Brenckman WD, Jr.; Hershfield MS. Use of polyethylene glycol-modified uricase (PEG-uricase) to treat hyperuricemia in a patient with non-Hodgkin lymphoma. Ann Int Med, 1988, vol. 109, 114-117 [0070]

\bulletCohen LF; Balow JE; Magrath IT; Poplack DG; Ziegler JL. Acute tumor lysis syndrome: A review of 37 patients with Burkitt's lymphoma. Am J Med, 1980, vol. 64, 468-491 [0070]

\bulletConley TG; Priest DG. Purification of uricase from mammalian tissue. Preparative Biochemistry, 1979, vol. 9, 197-203 [0070]

\bullet Reduction of immunogenicity and extension of circulating life of peptides and proteins. Davis FF; Kazo GM; Nucci ML; Abuchowski A. Peptide and Protein Drug Delivery. Marcel Dekker, 1991, 831-864 [0070]

\bulletDavis S; Abuchowski A; Park YK; Davis FF. Alteration of the circulating life and antigenic properties of bovine adenosine deaminase in mice by attachment of polyethylene glycol. Clin Exp Immunol, 1981, vol. 46, 649-652 [0070]

\bulletDavis S; Park YK; Abuchowski A; Davis FF. Hypouricaemic effect of polyethylene glycol modified urate oxidase. Lancet, 1981, vol. 1, 281-283 [0070]

\bulletDelaney V; Sumrani N; Daskalakis P; Hong JH; Sommer BG. Hyperuricemia and gout in renal allograft recipients. Transplantation Proceedings, 1992, vol. 24, 1773-1774 [0070]

\bulletDonadio D; Errera J; Navarro M; Izarn P. Anaphylaxis-like manifestations after intravenous injection of urate oxidase in an asthmatic child with acute leukemia (letter). Nouv Presse Med, 1981, vol. 10, 711-712 [0070]

\bulletErlich HA. PCR Technology. Principles and applications for DNA amplification. Stockton Press, 1989 [0070]

\bulletEscudier B; Leclercq B; Tandonnet F; Nitenberg G. Hyperuricemia resistant to urate oxidase. Efficacy of high doses (letter). Presse Med, 1984, vol. 13, 1340 [0070]

\bulletFam AG. Strategies and controversies in the treatment of gout and hyperuricaemia. Balliere's Clinical Rheumatology, 1990, vol. 4, 177-192 [0070]

\bulletGeorge T; Mandell BF. Gout in the transplant patient. J Clin Rheumatol, 1995, vol. 1, 328-334 [0070]

\bulletGold GL; Fritz BD. Hyperuricemia associated with the treatment of leukemia. Ann Int Med, 1957, vol. 47, 428-434 [0070]

\bulletGreenberg ML; Hershfield MS. A radiochemical-high-performance liquid chromatographic assay for urate oxidase in human plasma. Anal Biochem, 1989, vol. 176, 290-293 [0070]

\bullet Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications ACS. 1997 [0070]

\bullet Biochemistry and immunology of poly(ethylene glycol)-modified adenosine deaminase (PEG-ADA). Hershfield M, S. Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. 1997, 145-154 [0070]

\bulletHershfield MS. PEG-ADA replacement therapy for adenosine deaminase deficiency: An update after 8.5 years. Clin Immunol Immunopathol, 1995, vol. 76, S228-S232 [0070]

\bullet Gout and uric acid metabolism. Hershfield MS. Cecil Textbook of Medicine. WB Saunders, 1996, 1508-1515 [0070]

\bulletHershfield MS; Buckley RH; Greenberg ML; Melton AL; Schiff R; Hatem C; Kurtzberg J et al. Treatment of adenosine deaminase deficiency with polyethylene glycol-modified adenosine deaminase. N Engl J Med, 1987, vol. 316, 589-596 [0070]

\bulletHershfield MS; Chaffee S; Koro-Johnson L; Mary A; Smith AA; Short SA. Use of site-directed mutagenesis to enhance the epitope shielding effect of covalent modification of proteins with polyethylene glycol. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, vol. 88, 7185-7189 [0070]

\bullet Immunodeficiency diseases caused by adenosine deaminase deficiency and purine nucleoside phosphorylase deficiency. Hershfield MS; Mitchell BS. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. McGraw-Hill, 1995, 1725-1768 [0070]

\bullet Gout and the regulation of purine biosynthesis. Hershfield MS; Seegmiller JE. Horizons in Biochemistry and Biophysics. Addison-Wesley, 1976, 134-162 [0070]

\bulletJones DP; Stapleton FB; Kalwinsky D; McKay CP; Kellie SJ; Pui CH. Renal dysfunction and hyperuricemia at presentation and relapse of acute lymphoblastic leukemia. Med Pediatr Oncol, 1990, vol. 18, 283-286 [0070]

\bullet Gout and related disorders of purine metabolism. Kelley WN; Fox IH; Pallela TD. Textbook of Rheumatology. WB Saunders, 1989, 1395-1448 [0070]

\bulletKissel P; Lamarche M; Royer R. Modification of uricaemia and the excretion of uric acid nitrogen by an enzyme of fungal origin. Nature, 1968, vol. 217, 72-74 [0070]

\bulletKissel P; Schmitt J; Streiff F; Makuary G; Schmidt C; Toussain P. L'urate oxydase: son intérêt dans la prévention des hyperuricemies therapeutiques en hematologie. Ann Med Nancy, 1972, vol. 11, 519-535 [0070]

\bulletLee CC; Wu X; Gibbs RA; Cook RG; Muzny DM; Caskey CT. Generation of cDNA directed by amino acid sequence: Cloning of urate oxidase. Science, 1988, vol. 239, 1288-1291 [0070]

\bulletLegoux R; Delpech B; Dumont X; Guillemot JC; Ramond P; Shire D; Caput D et al. Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding Aspergillus flavus urate oxidase. J Biol Chem, 1992, vol. 267, 8565-8570 [0070]

\bulletLondon M.; Hudson PM. Uricolytic activity of purified uricase in two human beings. Science, 1957, vol. 125, 937-938 [0070]

\bulletMasera G; Jankovic M; Zurlo MG; Locasciulli A; Rossi MR; Uderzo C; Recchia M. Urate-oxidase prophylaxis of uric acid-induced renal damage in childhood leukemia. J Pediatr, 1982, vol. 100, 152-155 [0070]

\bulletMontagnac R; Schillinger F. Anaphylactic complication tied to intravenous injection of urate oxidase. Nephrologie, 1990, vol. 11, 259 [0070]

\bulletMourad G; Cristol JP; Chong G; Andary M; Mion C. Role of precipitating anti-urate oxidase antibodies in urate oxidase-resistant hyperuricemia (letter). Presse Med, 1984, vol. 13, 2585 [0070]

\bulletPotaux L; Aparicio M; Maurel C; Ruedas ME; Martin-Dupont CL. Uricolytic therapy. Value of urate oxidase in the treatment of hyperuricemias. Nov Presse Med, 1975, vol. 4, 1109-1112 [0070]

\bulletPriest DG; Pitts OM. Reaction intermediate effects on the spectrophotometric uricase assay. Analytical Biochemistry, 1972, vol. 50, 195-205 [0070]

\bulletPui C-H; Relling MV; Lascombes F; Harrison PL; Struxiano A; Mondesir J-M; Riberio RC et al. Urate oxidase in prevention and treatment of hyperuricemia associated with lymphoid malignancies. Leukemia, 1997, vol. 11, 1813-1816 [0070]

\bulletReddy PG; Nemali MR; Reddy MK; Reddy MN; Yuan PM; Yuen S; Laffler TG et al. Isolation and sequence determination of a cDNA clone for rat peroxisomal urate oxidase: Liver-specific expression in the rat. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, vol. 85, 9081-9085 [0070]

\bulletRosenthal AK; Ryan LM. Treatment of refractory crystal-associated arthtitis. Rheum Dis Clin North Amber, 1995, vol. 21, 151-161 [0070]

\bulletRoubenoff R. Gout and hyperuricemia. Rheumatic Disease Clinics of North America, 1990, vol. 16, 539-550 [0070]

\bulletSadler JR; Miwa J; Maas P; Smith T. growth of high density bacterial cultures; a simple device. Laboratory Practice, 1974, vol. 23, 632-643 [0070]

\bulletSambrook J; Fritsch EF; Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0070]

\bulletSandberg AA; Cartwright GB; Wintrobe MM. Studies on leukemia. I. Uric acid excretion. Blood, 1956, vol. 11, 154-166 [0070]

\bulletSavoca KV; Davis FF; Palczuk NC. Induction of tolerance in mice by uricase and monomethoxypolyethylene glycol-modified uricase. Int Arch Allergy Appl Immunol, 1984, vol. 75, 58-67 [0070]

\bulletSibony G; North ML; Bergerat JP; Lang JM; Oberling F. Hyperuricemia resistant to urate oxidase. Role of anti-serum urate oxidase precipitating antibodies (letter). Presse Med, 1984, vol. 13, 443 [0070]

\bulletSinger JZ; Wallace SL. The allopurinol hypersensitivity syndrome. Unnecessary morbidity and mortality. Arthritis Rheum, 1986, vol. 29, 82-87 [0070]

\bulletTsuji J; Hirose K; Kasahara E; Naitoh M; Yamamoto I. Studies on the antigenicity of the polyethylene glycol-modified uricase. Int J Immunopharmacol, 1985, vol. 7, 725-730 [0070]

\bulletVenkataseshan VS; Feingold R; Dikman S; Churg J. Acute hyperuricemic nephropathy and renal failure after transplantation. Nephron, 1990, vol. 56, 317-321 [0070]

\bullet New synthetic polymers for enzyme and liposome modification. Veronese FM; Caliceti P; Schiavon O. Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. 1997, 182-192 [0070]

\bulletWest C; Carpenter BJ; Hakala TR. The incidence of gout in renal transplant recipients. Am J Kidney Dis, 1987, vol. 10, 369-371 [0070]

\bulletWu X; Lee CC; Muzny DM; Caskey CT. Urate oxidase: Primary structure and evolutionary implications. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, vol. 86, 9412-9416 [0070]

\bulletWu X; Muzny DM; Lee CC; Caskey CT. Two independent mutational events in the loss of urate oxidase. J Mol Evol, 1992, vol. 34, 78-84 [0070]

\bulletWu X; Wakamiya M; Vaishnav S; Geske R; Montgomery CM, Jr.; Jones P; Bradley A et al. Hyperuricemia and urate nephropathy in urate oxidase-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, vol. 91, 742-746 [0070]

\bulletZittoun R; Dauchy F; Teillaud C; Barthelemy M; Bouchard P. Le traitement des hyperuricemies en hematologie par l'umte-oxydase et l'allopurinol. Ann Med Interne, 1976, vol. 127, 479-482 [0070]

<110> HERSHIFIELD, MICHAEL S.

\hskip1cm

KELLY, SUSAN J.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Urato oxidasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 1579-267

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Patente en versión 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 915

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(915)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Quimera PBC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 915

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(915)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia Artificial: pks quimera

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Mandril DH3

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mandril

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cerdo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: PBC amino truncada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: PBC carboxi truncada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: PKS carboxi truncada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: PKS carboxi truncada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

23

Claims (11)

1. Proteína que comprende una proteína uricasa recombinante de una especie de mamífero que ha sido modificada para insertar uno o más residuos de lisina, en la que dicha proteína recombinante es una proteína quimérica de dos o más secuencias de aminoácidos de proteínas de mamífero.

2. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha proteína uricasa recombinante comprende 304 aminoácidos, siendo la primera parte N-terminal de 225 de dichos 304 aminoácidos, los aminoácidos 1-225 de uricasa porcina y siendo los 79 aminoácidos restantes de dichos 304 aminoácidos, los aminoácidos 226-304 de uricasa de mandril.

3. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha proteína uricasa recombinante comprende 304 aminoácidos, siendo la primer parte N-terminal de 288 de dichos 304 aminoácidos, los aminoácidos 1-288 de uricasa porcina y siendo los 16 aminoácidos restantes de dichos 304 aminoácidos, los aminoácidos 289-304 de uricasa de mandril.

4. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína uricasa recombinante se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 2, 4, 8, 9, 10 y 11.

5. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que ha sido modificada para insertar entre dos y ocho residuos de lisina.

6. Molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica la uricasa recombinante según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. Molécula de ácido nucleico aislada y purificada según la reivindicación 6 que posee la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

8. Molécula de ácido nucleico aislada y purificada según la reivindicación 6 que posee la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.

9. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 9.

11. Conjugado de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un poli(etilenglicol) o poli(óxido de etileno).