MX2011009586A - Proteasa coagulante de leche de tipo mejorado derivada de microorganismo. - Google Patents

Abstract

Proteasa de tipo mejorado que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a SEQ ID NO: 3, en donde dicha proteasa de tipo mejorado tiene al menos una mutación que se selecciona del grupo que consiste en: (A) sustitución de la glutamina que corresponde a la glutamina de la posición 265 de SEO ID NO: 3 por un aminoácido ácido; y (B) sustitución de la glutamina de la posición 266 de SEQ ID NO: 3 por un aminoácido ácido, y en donde dicha proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de leche.

Description

PROTEASA COAGULANTE DE LECHE DE TIPO MEJORADO DERIVADA DE MICROORGANISMO Campo técnico La presente invención se relaciona con una proteasa, que tiene actividad mejorada como proteasa coagulante de leche, derivada de un microorganismo. La proteasa se usa preferentemente para la producción de queso.

Arte previo Durante muchos años se ha usado cuajo de ternero como una enzima coagulante de la leche para la producción de queso. La actividad coagulante de la leche del cuajo de ternero es principalmente atribuida a la quimosina, la cual es una proteasa ácida y tiene actividad proteasa especifica de sitio sobre la caseína de la leche con baja actividad no específica de sitio (digiere específicamente el enlace peptídico entre fenilalanina en la posición 105 y metionina en la posición 106 en la secuencia de aminoácidos de ?-caseína) . Se piensa que la actividad proteasa no . específica lleva a la reducción del rendimiento en la producción de queso y a la generación de un péptido de sabor amargo durante la maduración. Por esta razón, la quimosina es una enzima excelente como coagulante de la leche.

Sin embargo, la disminución en la matanza de terneros y el aumento en la demanda de queso ha hecho difícil proveer el cuajo de ternero. En la actualidad, una enzima coagulante de la leche derivada de microorganismos tales como Rhizomucor miehei y Rhizomucor pusillus, y una quimosina recombinante producida por introducción de un gen de quimosina de ternero en hongos o levaduras se usa ampliamente como una enzima coagulante de la leche.

La enzima coagulante de la leche derivada de un microorganismo que se mencionó anteriormente, en comparación con la quimosina de ternero o quimosina recombinante, tiene una alta actividad como proteasa no especifica. Es un problema que la relación C/P (relación de actividad coagulante de leche con actividad proteasa) , que es importante como característica de la enzima coagulante de la leche, sea baja. Con el objetivo de resolver dicha desventaja se ha expresado, en Rhizomucor pusillus, y evaluado un gen variante de la enzima coagulante de la leche obtenida por mutagénesis sitio dirigida con ingeniería genética. En la variante, la relación C/P ha mejorado para ser mejor que el tipo salvaje por reemplazo de ácido glutámico en la posición 19 por alanina en la secuencia de aminoácidos de la enzima coagulante de la leche (documento no patente 1) .

Sin embargo, debido a que la actividad coagulante de leche de la variante de enzima coagulante de la leche disminuye aproximadamente 40 por ciento con el reemplazo de los aminoácidos, ha sido difícil usar dicha enzima en una aplicación práctica. Por lo tanto, se ha deseado una enzima coagulante de la leche derivada de un microorganismo en la cual la relación C/P sea alta y la actividad coagulante de leche se mantenga o mejore.

Aún más, se ha intentado la acilación de la enzima coagulante de la leche derivada de microorganismos tales como Rhizomucor pusillus y i izo/nucor miehei con anhídrido dicarboxilico con el objetivo de mejorar la relación C/P (documento Patente 1) . Con este método, se han obtenido algunas mejoras; sin embargo, aquellas aún no son satisfactorias.

[Documento Patente 1] Patente Japonesa No. 2-18834B [Documento no patente 1] J. Biochem. 129, 791-794, 2001 Síntesis de la invención Un objetivo de la presente invención es proveer una proteasa adecuada para la coagulación de la leche en la cual una actividad (de aquí en adelante también referida como una "actividad proteasa no específica") para digerir un enlace peptídico diferente del enlace entre fenilalanina en la posición 105 y metionina en la posición 106 en la secuencia de aminoácidos de ?-caseína sea baja y se mantenga o mejore una actividad coagulante de leche.

Los inventores de la presente invención estudiaron intensivamente cómo superar el problema descrito anteriormente, y aislaron, entre cepas mutantes de microorganismos que producen una enzima coagulante de la leche, una cepa mutante que produce una enzima coagulante de la leche cuya relación C/P está mejorada debido a una reducción en la actividad proteasa no especifica; aislaron un gen de la enzima coagulante de la leche de tipo mejorado; determinaron la secuencia de nucleótidos del mismo; expresaron el gen; y midieron la actividad coagulante de leche y la relación C/P de la enzima del tipo coagulante de la leche mejorada, completando de este modo la presente invención.

De este modo, la presente invención provee una proteasa derivada de un microorganismo que tiene la actividad coagulante de la leche, cuya actividad coagulante de leche se mantiene o aumenta y la relación C/P se aumenta, también provee un ADN que codifica para esta proteasa, un vector que contiene el ADN y una célula transformada en la cual se ha introducido el vector.

Un aspecto de la presente invención es proveer una proteasa de tipo mejorado que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 3, en donde dicha enzima de tipo mejorado tiene al menos una mutación que se selecciona del grupo que consiste en: (A) sustitución de la glutamina que corresponde a la glutamina de la posición 265 de la SEQ ID NO: 3 por un aminoácido ácido; y (B) sustitución de la glutamina de la posición 266 de SEQ ID NO: 3 por un aminoácido ácido, y en donde dicho tipo de proteasa tiene actividad coagulante de la leche.

Otro aspecto de la presente invención es proveer la enzima de tipo mejorado como se describe anteriormente, que se selecciona del grupo que consiste en: (A) una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 43 excepto que la glutamina de la posición 265 y/o la glutamina de la posición 266 se reemplaza (n) por un aminoácido ácido; (B) una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 43 excepto que la glutamina de la posición 265 y/o la glutamina de la posición 266 se reemplaza (n) por un aminoácido ácido y no más de 10 aminoácidos (preferentemente, no más de 5 aminoácidos, más preferentemente no más de 3 aminoácidos, aún más preferentemente no más de 2 aminoácidos) en posiciones diferentes de 265 y 266 son sustituidos, eliminados, insertados o agregados, y en donde dicha proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

Otro aspecto de la presente invención es proveer una proteasa de tipo mejorado como se describe anteriormente, en donde dicho aminoácido ácido es ácido glutámico o ácido aspártico .

Otro aspecto de la presente invención es proveer la proteasa de tipo mejorado como se describe anteriormente, en donde el ácido glutámico de lá posición 19 es reemplazado por valina, alanina, isoleucina o leucina.

Otro aspecto de la presente invención es proveer la proteasa de tipo mejorado como se describe anteriormente, en donde la treonina de la posición 81 es reemplazada por glutamina o ácido aspártico.

Aún otro aspecto de la presente invención es proveer un ADN que codifica para la proteasa de tipo mejorado como se describe anteriormente.

Aún otro aspecto de la presente invención es proveer un vector de expresión que comprende el ADN como se describe anteriormente.

Aún otro aspecto de la presente invención es proveer una célula transformada en la cual se introduce un vector de expresión como se describe anteriormente.

Aún otro aspecto de la presente invención es proveer la célula transformada como se describe anteriormente, en donde dicha célula transformada es Saccharomyces cerevisiae.

Aún otro aspecto de la presente invención es proveer un método para producir una proteasa de tipo mejorado que tiene actividad coagulante de la leche, que comprende los pasos de cultivar la célula transformada como se describe anteriormente en un medio de cultivo y colectar la proteasa de tipo mejorado del medio de cultivo.

Debido a que la actividad coagulante de leche se mantiene o mejora y la relación C/P es alta, se espera un mayor rendimiento en la producción de queso con la enzima de tipo mejorado de la presente invención. Aún más, una mayor relación C/P implica generalmente que el desarrollo de sabor amargo en el queso durante la maduración se reduce, es decir que con la enzima mejorada se puede fabricar un queso de calidad malta.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra la estructura de. un vector de expresión JS4.

La Figura 2 muestra el alineamiento de secuencia de la proteasa de Rhizomucor pusillus (RMPP) y la proteasa de Rhizomucor miehei (RMMP) .

Descripción de las formas de realización de la invención La presente invención se ilustrará en detalle más abajo. 1. La proteasa de tipo mejorado (enzima coagulante de la leche) de la presente invención La proteasa de tipo mejorado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a SEQ ID NO: 3, y tiene al menos una mutación que se selecciona del grupo que consiste en: (A) sustitución de la glutamina que corresponde a la glutamina de la posición 265 de SEQ ID NO: 3 por un aminoácido ácido; y (B) sustitución de la glutamina de la posición 266 de SEQ ID NO: 3 por un aminoácido ácido, y que tiene actividad coagulante de la leche.

Los Ejemplos de los aminoácidos ácidos mencionados anteriormente incluyen a ácido glutámico y ácido aspártico.

La proteasa de tipo mejorado de la presente invención preferentemente tiene una identidad de secuencia no menor del 90%, más preferentemente no menor del 95% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 3.

En una forma de realización, la proteasa de tipo mejorado de la presente invención se puede obtener por introducción de mutación (es) en una proteasa del tipo salvaje derivada de Rhizomucor miehei (SEQ ID NO: 3). En esta forma de realización, la proteasa de tipo mejorado de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en: (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 excepto que la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina de la posición 266 se reemplaza (n) por un aminoácido ácido; (B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 excepto que la glutamina de la posición 265 y/o la glutamina de la posición 266 se reemplaza (n) por un aminoácido ácido y no más de 10 aminoácidos en las posiciones diferentes de 265 y 266 son sustituidos, eliminados, insertados o agregados, y tiene actividad coagulante de la leche.

La Fig. 2 muestra el alineamiento de secuencia de la proteasa de Rhizomucor pusillus y la proteasa de Rhizomucor miehei. En ambas secuencias, los aminoácidos en las posiciones 265 y 266 están conservados, de modo que la proteasa de tipo mejorado de la presente invención también se puede obtener por introducción de la o las mutaciones en una proteasa del tipo salvaje de Rhizomucor pusillus (SEQ ID NO: 43) . Esto es, en otra forma de realización, la proteasa de tipo mejorado de la presente invención puede ser una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 excepto que la glutamina de la posición 265 y/o la glutamina de la posición 266 se reemplaza (n) por un aminoácido ácido. Además, esta proteasa de tipo mejorado puede tener otras mutaciones (sustituciones, eliminaciones, inserciones, o agregados de no más de 10 aminoácidos) diferentes del o los reemplazos de glutamina de la posición 265 y/o la glutamina de la posición 266 siempre que tenga actividad coagulante de la leche.

En la proteasa de tipo mejorado de la presente invención, el ácido glutámico en la posición 19 y treonina en la posición 81 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 43 pueden ser reemplazados por otros aminoácidos. El ácido glutámico en la posición 19 preferentemente se reemplaza por valina, alanina, isoleucina o leucina, mientras que la treonina en la posición 81 preferentemente se reemplaza por glutamina o ácido aspártico.

En la presente invención, "posición 265", "posición 266", "posición 19" y "posición 81" no necesariamente indica una posición absoluta desde el N-terminal de la proteasa sino que indica una posición relativa en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 43. Por ejemplo, en la proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 43, cuando se produce la eliminación de un aminoácido en una posición del lado N-terminal de la posición 265, la posición 265 que se mencionó anteriormente es entonces la posición 264. Incluso en dicho caso, el aminoácido en la posición 264 contado desde el residuo N-terminal es el aminoácido de la "posición 265" en la presente invención. La posición absoluta del aminoácido está determinada por alineamiento de la secuencia de aminoácidos de una proteasa de interés con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 43. El aminoácido indicado por el término "que corresponde a" también significa un aminoácido en la posición relativa en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 43.

SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 43 son secuencias de aminoácidos de la proteasa de tipo madura. La proteasa de tipo mejorado de la presente invención puede incluir la secuencia de aminoácidos de un péptido señal, propéptido y similares .

Con el método como se describe en los Ejemplos de esta descripción, por entrecruzamiento de una cepa mutante que produce una proteasa de tipo mejorado con alta relación C/P de un microorganismo que produce una proteasa de tipo salvaje que tiene la actividad coagulante de leche con una relación C/P comparativamente baja y cultivo de la cepa mutante en un medio, la proteasa de tipo mejorado de la presente invención se puede obtener de la célula de la cepa mutante o del medio. Entre los ejemplos del microorganismo que produce la proteasa de tipo salvaje con la relación C/P comparativamente baja se incluyen la cepa de Rhizomucor miehei de tipo salvaje (ATCC16457) , i¾izoinucor pusillus (ATCC16458), y cepas derivadas de las mismas. La proteasa de tipo mejorado de la presente invención también se puede obtener por aislamiento de un ADN que codifica para la proteasa de tipo mejorado de la cepa mutante que se mencionó anteriormente y expresión del ADN.

Adicionalmente, la proteasa de tipo mejorado de la presente invención también se puede obtener por aislamiento de un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 43 de la cepa de tipo salvaje de Rhizoiriucor miehei (ATCC16457), Rhizomucor pusillus (ATCC16458), o cepas derivadas de las mismas y modificación del ADN por mutagénesis sitio dirigida de modo de codificar la proteasa de tipo mejorado de la presente invención, seguido por la expresión del ADN modificado.

La expresión del ADN que se mencionó anteriormente se puede llevar a cabo por construcción de un vector de expresión conteniendo el ADN que se mencionó anteriormente e introducirse en una célula huésped. A pesar de que la célula huésped puede ser una célula procariota o célula eucariota, se prefiere una célula eucariota. Entre los ejemplos de la célula eucariota se incluyen célula de levadura, una célula de hongo, y una célula vegetal. Se prefiere una célula de levadura y particularmente se prefiere una célula de Saccharomyces cerevisiae.

Aún más, la expresión del ADN que se mencionó anteriormente también se puede realizar en un sistema libre de células.

La relación C/P de la proteasa de tipo mejorado de la presente invención es mayor que la relación C/P de la correspondiente proteasa de tipo salvaje (SEQ ID NO: 3 ó 43). La relación C/P de la proteasa de tipo mejorado de la presente invención es preferentemente no menor de 1,2 veces, más preferentemente no menor de 1,5 veces, aún más preferentemente no menor de 2,0 veces de grande como la relación C/P de la proteasa de tipo salvaje (SEQ ID NO: 3 ó 43) .

En la presente, la relación C/P indica [actividad coagulante de leche (MCA) ]/ [actividad de proteasa (PA)]. La medida de PA y MCA se puede llevar a cabo con los siguientes métodos. Como para la medida de MCA, a pesar que hay un Método Estándar Internacional (descrito en IS015174, IDF176; primera edición 2002-09-01, Self-imposed Specifications for Food Additives) , se calcula un valor de MCA en la presente descripción por el siguiente método (en la presente, denominado método Meito) . [1] Medida de PA Se disuelve caseína hecha de leche (fabricada por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) en una solución de fosfato disódico de hidrógeno 0,05 M y se ajusta a pH 6,0 con solución de ensayo de ácido clorhídrico 1 mol/1, para preparar una solución de sustrato caseína 0,6%. Se agrega una solución de ensayo (0,2 mi), diluida apropiadamente, a 1 mi de esta solución sustrato. La mezcla se deja reaccionar a 37 °C entre 10 y 30 minutos y luego se termina la reacción por el agregado de 1 mi de una solución de detención de reacción (una solución mezcla de ácido tricloroacético 0,11 mol/1, acetato de sodio anhidro 0,21 mol/1, y de ácido acético 0,33 mol/1) . El sobrenadante se obtiene por centrifugación, y se agrega 1 mi de carbonato de sodio anhidro 0,55 mol/1 a 0,4 mi del sobrenadante, y luego se agregan 0,2 mi de un reactivo de fenol fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd. (reactivo de Folin-Ciocalteu) diluido dos veces. La mezcla se deja reaccionar a 37 °C durante 30 minutos y luego se mide la absorbancia (longitud de camino óptico: 1 cm) a 660 nm. Por otra parte, se agrega 1 mi de la solución de detención de reacción a 1 mi de la solución sustrato, seguido por la adición de 0,2 mi de una muestra de ensayo. Luego, la mezcla se prepara en los mismos procedimientos y lo resultante se usa como un blanco. Se convierte un valor obtenido por sustracción de la absorbancia del blanco a la absorbancia de la muestra de ensayo en la cantidad de tirosina libre para calcular un valor de PA. La unidad de PA es Unidad/ml. Esta 1 Unidad se refiere a la cantidad de enzima que produce un aumento en la sustancia de coloración del reactivo de fenol equivalente a 1 µ???? de tirosina en 1 minuto en el método que se mencionó anteriormente. Además, la ecuación de correlación de tirosina y la sustancia de coloración del reactivo de fenol se obtiene por preparación de una curva de calibración de tirosina como se describe más adelante.

Curva de calibración de tirosina Se seca un estándar de tirosina (peso molecular 181,2, fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) a 105°C durante 3 horas. Luego se pesan en forma precisa 0,050 g del estándar y se disuelven en solución de ensayo de ácido clorhídrico 0,2 mol/1 para obtener exactamente un volumen final de 50 mi. Se miden en forma precisa 1, 2, 3 y 4 mi de esta solución y se agrega solución de ensayo de ácido clorhídrico 0,2 mol/1 a cada uno para obtener exactamente un volumen de 100 mi. Se miden en forma precisa dos mi de cada solución. Luego, se agregan 5 mi de solución de ensayo de carbonato de sodio 0,55 mol/1 y 1 mi del reactivo de fenol diluido dos veces. Inmediatamente luego de ello, la mezcla se mezcla por agitación y se deja reposar a 37±0,5°C durante 30 minutos. De la solución obtenida, solo te toman 2 mi de la solución obtenida y se miden las absorbancias Al, A2, A3, y A4 a la longitud de onda de 660 nm junto con una solución control que se preparó de un modo similar. Tomando la absorbancia Al, A2, A3, y A4 en un eje vertical y la cantidad de tirosina (µp???) en 2 mi de cada solución en un eje horizontal, se prepara la curva de calibración para determinar la cantidad de tirosina (µp???) para una diferencia de absorbancia de 1. [2], Método de ensayo para MCA (Método Meito) Se disuelve leche en polvo descremada (10%), preferentemente fabricada por CHR.HANSEN, en cloruro de calcio 0,01 M (pH 6,0) para ser usada como sustrato. Se agrega una solución de muestra de ensayo (0,5 mi)' preparada en una concentración a la cual se forman fragmentos de cuajos entre 2 y 5 minutos, preferentemente en 2 minutos y 30 segundos, a 5 mi de este sustrato, y la mezcla se deja a 35°C. Mientras se agita la mezcla con una varilla de vidrio, se observa la formación de fragmentos de cuajo para medir el tiempo de formación. Comparando con un valor del estándar cuya MCA es conocida, cuyo valor se mide de forma similar, se determina MCA por cálculo de cuánta más (en veces) cantidad de sustrato puede coagular una cantidad unidad de la muestra de ensayo en una unidad de tiempo. La ecuación para el cálculo es la siguiente: MCA (Mu/ml) = S* (TS*WS) / (T*W) S: actividad especifica de la enzima coagulante de la leche del estándar (Mu/g) Ts: tiempo para la coagulación de la leche de la solución estándar (segundos) W3: cantidad del estándar en 1 mi de la solución estándar (g) T: tiempo para la coagulación de la leche de la solución de muestra de ensayo (segundos) W: cantidad de la muestra de ensayo en 1 mi de la solución de la muestra de ensayo (mi) Adicionalmente, también se puede calcular MCA por unidad de cantidad de proteina mediante cuantificación de la cantidad total de proteínas contenidas en ' la muestra de ensayo. En el Ejemplo 13 descrito más adelante, MCA se calcula por 1 mg de proteina (Mu/mg de proteina) .

El valor de MCA calculado por el método que se mencionó anteriormente tiene una correlación con el valor de MCA calculado por el Método Estándar Internacional (descrito en IS015174, IDF176; primera edición 2002-09-01, Self-imposed Specifications for Food Additives) . La correlación se puede mostrar por medio de la siguiente fórmula. 1 unidad estándar internacional (IMCU/ml) =» 1 unidad del método Meito (Mu/ml) /100 La MCA de la proteasa de la presente invención preferentemente es sustancialmente igual a o mayor que la MCA de la proteasa de tipo salvaje. Cuando la proteasa de la presente invención y la proteasa de tipo salvaje (SEQ ID NO: 3 ó 43) se preparan bajo condiciones idénticas para comparar la MCA, la MCA de la proteasa de -tipo mejorado de la presente invención es preferentemente no menor de 0,8 veces, más preferentemente no menor de 0,9 veces, aún más preferentemente no menor de 1,0 veces tan alto como MCA de la proteasa de tipo salvaje.

Un ejemplo de preparación de la proteasa de tipo mejorado de la presente invénción y de la proteasa de tipo salvaje bajo condiciones idénticas incluye incorporar el ADN que codifica para cada proteasa en un vector idéntico para la expresión del gen, introducir cada uno de estos vectores de expresión en una célula de una cepa idéntica en una condición idéntica, y cultivar la célula bajo una condición de cultivo idéntica para obtener un cultivo como una solución de proteasa. El cultivo obtenido se puede ser condensar en una forma idéntica o purificado en una forma idéntica para el uso . 2. ADN que codifica para la proteasa de tipo mejorado de la presente invención El ADN de la presente invención es ADN que codifica para la proteasa de tipo mejorado de la presente invención. Los ejemplos específicos del ADN de la presente invención incluyen un ADN que comprende nucleótidos entre 208 y 1290 en SEQ ID NO:l y un ADN que comprende una secuencia que hibridiza con la secuencia de nucleótidos complementaria a los nucleótidos entre 208 y 1290 en SEQ ID N0:1 bajo condiciones severas; y que codifica para la proteasa de tipo mejorado que tiene las propiedades mencionadas anteriormente. Los ejemplos específicos del ADN de la presente invención también incluye un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 42 y un ADN que comprende una secuencia que hibridiza con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 42 bajo condiciones severas; y que codifica para la proteasa de tipo mejorado que tiene las propiedades mencionadas anteriormente. Condiciones severas significa condiciones en las cuales se forma el llamado híbrido específico mientras que no se forma el híbrido no específico. A pesar de que las condiciones pueden variar dependiendo de la secuencia de nucleotidos o su longitud, los ejemplos de las mismas incluyen condiciones en las cuales el ADN con alta homología, por ejemplo, ADNs que tienen una homología de no menos del 75%, preferentemente no menor de 90%, más preferentemente no menor de 95%, hibridiza mutuamente, y ADNs que tienen una homología con menos que eso que no hibridizan, o condiciones de hibridización, que es una condición corriente para el lavado en hibridización Southern, a 60°C y lxSSC, SDS 0,1%, preferentemente 0,1*SSC y una concentración de sal equivalente a SDS 0,1%.

El AD que codifica para la proteasa de la presente invención se puede aislar de la cepa mutante que tienen la proteasa de tipo mejorado que se mencionó anteriormente con un método de clonado de genes convencional. Por ejemplo, se puede aislar seleccionando el ADN de una biblioteca genética de la cepa mutante que se mencionó anteriormente por hibridización con una sonda de oligonucleótidos sintética basada en la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO:l ó 42.

Además, el ADN que codifica para la proteasa de tipo mejorado de la presente invención se puede obtener diseñando cebadores basados en la secuencia de nucleotidos de ADN genómico conocido o ADNc del gen de la proteasa de tipo salvaje, y amplificar el ADN del ADN genómico y biblioteca de ADNc de la cepa mutante que se mencionó anteriormente usando los cebadores.

El ADN obtenido por introducción de una 'mutación sitio dirigida en un ADN de tipo salvaje también se incluye en ADN que codifica para la proteasa de la presente invención.

Por ejemplo, un ADN que codifica para la proteasa de tipo mejorado de la presente invención se puede obtener fácilmente por aislamiento de un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 de la cepa de tipo salvaje de Rhizomucor miehei (ATCC16457) o su cepa derivada, e introducción en la misma de la mutación sitio dirigida. Un ADN que codifica para la proteasa de tipo mejorado de la presente invención también se puede obtener por aislamiento de un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 de la cepa de tipo salvaje de Rhizomucor pusillus (ATCC16458) o su cepa derivada, e introducción en la misma de la mutación sitio dirigida.

La introducción de la mutación sitio dirigida se puede realizar por un método conocido por aquellos con experiencia en el arte. Por ejemplo, las mutaciones se pueden introducir por síntesis de cebadores que tienen un sitio de olivado para una enzima de restricción en un extremo y contiene el sitio de mutación en el otro extremo, y por reemplazo de la porción correspondiente en un gen no mutado por la porción mutada (método de mutación en cásete) .

Como método para introducir la mutación sitio dirigida, por ejemplo, el método Gapped dúplex y el método Kunkel son conocidos. El método Kunkel se basa en un principio en el cual el gen no mutado se clona en un fago de simple hebra; y una hebra complementaria se sintetiza usando ADN sintético conteniendo un falta de coincidencia en un punto mutado como cebador; y luego se hace un nuevo fago ADN replicado sólo con la hebra complementaria obtenida conteniendo la mutación como molde. La mutagénesis sitio dirigida se puede realizar usando un conjunto de elementos disponible comercialmente. 3. Vector de expresión de la presente invención El vector de expresión de la presente invención se usa para expresar la proteasa de tipo mejorado de la presente invención. Puede tener una estructura en la cual una secuencia promotora que controla la expresión del ADN se une corriente arriba del ADN que codifica para la proteasa de tipo mejorado de la presente invención. Aún más, también se puede unir un terminador corriente debajo del ADN.

Como el promotor que se mencionó anteriormente, cuando un huésped es E. coli, se puede usar trp, lac, taq, XPL o similar. Cuando un huésped es levadura, se prefiere el promotor de GAL7, ADH, TPI o PH05 o similar, y entre ellos, se prefiere GAL7 ya que promueve fuertemente la expresión de genes (Nogi Y. et al. Nucí. Acids Res. 11, 8555-8568 (1983)).

Entre los ejemplos de terminador se incluyen TPI, GAPDH, y GALIO. Por unión del promotor que se mencionó anteriormente, ADN que codifica para la proteasa de tipo mejorado de la presente invención, el terminador que se mencionó anteriormente en el orden de 5 ' corriente arriba hacia 3' corriente abajo e inserción del resultante en un vector, se puede construir el vector de expresión de la presente invención.

Como un vector con capacidad de replicación en levaduras, se puede usar cualquier tipo del plásmido del llamado YIp, YRp, YEp e YCp. Desde el punto de vista del número de copias y estabilidad, se prefiere el tipo YEp. Debido a que estos plásmidos generalmente no contienen una secuencia innecesaria, en consideración de la estabilidad del plásmido, o con el objetivo de facilitar la modificación del plásmido, se prefiere eliminar la secuencia no necesaria.

También se puede insertar en el vector de expresión de la presente invención un gen marcador de selección para la selección de un recombinante o un gen marcador para confirmar la expresión del gen introducido. Entre los ejemplos del gen marcador de selección se incluyen genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a kanamicina, y genes de resistencia a ampicilina. Entre los ejemplos de gen marcador se incluyen genes de beta-glucuronidasa (GUS) , genes de cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) , genes de luciferasa (LUC) y genes de GFP. Más aún, con el objetivo de expresar la proteasa de tipo mejorado de la presente, invención como un tipo secretorio para facilitar la purificación de la proteasa expresada, se puede incluir una secuencia adicional en el vector de expresión de la presente invención. En este caso, la proteasa de la presente invención se expresa como una proteínas de fusión con una proteina o péptido codificado, por la secuencia! adicional. Entre los ejemplos de la secuencia adicional se incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido señal o propéptido y una secuencia de nucleótidos que codifica para una marca de His, o marca de GST. 4. Célula transformada de la presente invención Una célula transformada de la presente invención es una célula en la cual se ha introducido el vector de expresión de la, presente invención, en donde la célula tiene la capacidad de producir la proteasa de tipo mejorado de la presenté invención. A pesar de que la célula puede ser una célula procariota o puede ser una célula eucariota, se prefiere que sea una célula eucariota.

Entre los ejemplos de una célula eucariota se incluyen célula de levadura, célula de hongo y, célula vegetal. Se prefiere una célula de levadura siendo particularmente preferida la de Saccharomyces cerevisiae. Entre los ejemplos de Saccharomyces cerevisiae se incluyen a las cepas de SHY3, D13-1A y MC16.

Un método para introducir el vector de expresión en la célula huésped se puede seleccionar en forma apropiada dependiendo de los tipos de células huésped. Dichos métodos son conocidos por aquellas personas con experiencia en el arte. Un transformante de Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo, se puede obtener por medio del siguiente método.

Se inocula Saccharomyces cerevisiae cultivado en medio de cultivo YPD (extracto de levadura 1% (fabricado por Difco) , Bactopeptona 2% (fabricado por Difco) y glucosa 2%) durante la noche en un volumen final de 10% en un medio de cultivo YPD fresco, y se cultiva a 30°C durante 4 horas. El cultivo obtenido (1,5 mi) se somete a centrifugación suave con una centrifuga de mesada para colectar las células. Las células se lavan con LiSCN 0,2 M (fabricado por Kanto Chemical Co., Inc.) y se suspenden en 0,02 mi de LiSCN G .

Posteriormente, se mezclaron 0,01 mi de una solución que contiene el vector de expresión (aproximadamente entre 1 y 10 \ig) y 0,03 mi de PEG4000 70%, y la mezcla se mantuvo a 30 °C durante 1 hora. Esta mezcla se diluyó por agregado de 0,14 mi de agua esterilizada y luego se plaqueó en dos placas SDah (base de nitrógeno Bacto-levadura sin aminoácidos 0,67%, glucosa 2%, sulfato de adenina 0,002%, L-histidina-HCl 0,002%, agar 2%). Luego de incubar a 30°C entre 2 y 3 días, se puede obtener el transformante. 5. Método para producir la proteasa de tipo mejorado que tiene la actividad coagulante de leche de la presente invención Por cultivo de la célula transformada de la presente invención, se puede producir la proteasa de tipo mejorado de la presente invención, y por expresión de la proteasa de tipo mejorado de la presente invención como una proteina de fusión con un péptido señal para la secreción, se puede acumular en un medio la proteasa de tipo mejorado de la presente invención. Cuando se usa un promotor inducible, la inducción preferentemente se realiza durante el cultivo. A pesar que un método para el cultivo de la célula transformada varia dependiendo del tipo de célula, se pueden emplear métodos convencionales.

Un ejemplo del método para el cultivo del transformante de Saccharomyces cerevisiae se describirá a continuación.

El transformante se cultiva con agitación a 30°C durante dos días en 50 mi de medio de cultivo YPD en un frasco Sakaguchi de 500 mi para proliferar las células de levadura. El medio de cultivo se centrifuga a 1000xg durante 5 minutos para colectar las células. Las células se suspenden nuevamente en 100 mi de medio de cultivo YPGal (extracto de levadura 1%, Bactopeptona 2%, galactosa 4% (fabricado por ako Puré Chemical Industries, Ltd.)), y se cultiva con agitación en un frasco Sakaguchi de 500 mi a 30 °C durante tres días.

La proteasa que tiene la actividad coagulante de la leche, proteasa que se secreta en el medio, se puede usar como se encuentra en el estado de existencia en el sobrenadante de, cultivo y también se puede usar por condensación del sobrenadante de cultivo. La proteasa que tiene la actividad coagulante de la leche, proteasa que se secreta en el medio, se puede purificar o purificar parcialmente. Usando un método general para purificar una proteina, se puede realizar la purificación o purificación parcial. Por ejemplo, se puede usar una técnica que incluye cromatografía tal como de intercambio iónico o de filtración en gel, precipitación por salado con sulfato de amonio o sedimentación con un solvente orgánico.

La enzima purificada también se puede condensar por liofilización, ultrafiltración en membrana, sedimentación con el solvente orgánico o similar.

EJEMPLOS De aquí en adelante, la presente invención se describirá ahora concretamente por medio de Ejemplos pero el alcance técnico de la presente invención no se restringe a esas ilustraciones ej emplificativas . Además, todas las manipulaciones genéticas se pueden realizar como se describen en Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

[Ejemplo 1] Adquisición de cepa mutante de Rhizomucor miehei que produce una proteasa con relación C/P mejorada Se sometió una cepa parental de Rhizomucor miehei (CBS182-67 (una cepa derivada de ATCC16457) ) que produce una proteasa a un tratamiento de mutagénesis, de este modo se obtuvo una cepa mutante que secreta una proteasa con relación C/P -mejorada. Los detalles se ilustran más adelante. (1) Tratamiento de mutagénesis La cepa parental de Rhizomucor miehei se hizo crecer en una placa con malta (extracto de malta 2%, glucosa 2%, peptona 0,1%, agar 2%), y se mantuvo entre 3 dias y 1 semana a 37 °C para permitir la formación de esporos. Estos esporos se suspendieron en agua esterilizada usando un sembrador de vidrio.

Se agregó nitrosoguanidina (N-metil- ' -nitro-N-nitrosoguanidina, fabricada por SIGMA CHEMICAL CO.) a esta suspensión de esporos a una concentración final de 200 µg/ml. Se trató la mezcla a temperatura ambiente entre 5 y 20 minutos de modo que la tasa de mortalidad sea de 90%. Se plaqueó una cantidad apropiada de esta mezcla sobre la placa con malta, y se mantuvo la placa resultante a 37°C. Al día siguiente, se inoculó cada grupo de hifas fúngicas diminutas obtenido en 8 mi de medio de cultivo YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa), y se usó el sobrenadante de cultivo luego de cultivar a 37°C durante 4 días como muestra para medir la actividad proteasa (PA) y la actividad coagulante de leche (MCA) . Se almacenaron las células a -80°C. (2) Búsqueda de proteasa de tipo mejorado Como resultado de la medida de MCA y PA mediante el método que se describió previamente, se obtuvo un tipo de proteasa mejorada cuya PA fue mucho menor que la de la cepa parental y cuya relación C/P (MCA/PA) se incrementó grandemente en 4,6 veces comparada con la cepa parental.

[Ejemplo 2] Aislamiento de un gen de proteasa a partir de la cepa mutante (1) Adquisición, del ADN cromosómico de la cepa mutante y de la cepa parental La cepa mutante que se obtuvo en el Ejemplo 1 y la cepa parental se crecieron en una placa con malta, y se mantuvieron a 37°C entre tres días y una semana para permitir la formación de esporos. Estos esporos se resuspendieron en agua esterilizada usando un sembrador de vidrio. Esta suspensión de esporos se sembró en 200 mi de medio liquido YPD en un recipiente Sakaguchi de 500 mi de modo que cada recipiente contuvo aproximadamente 1 x 108 esporos, y se cultivaron durante dos días a 37°C. En el momento en que las células formaron un pelet con un tamaño de aproximadamente entre 0,5 y 2 mm, se filtró el medio para eliminar la humedad en exceso y de esa forma se obtuvo un peso húmedo de aproximadamente 5 g de células.

Luego de congelar con nitrógeno liquido, se transfirieron las células a un mortero y se agregaron 3 g de arena de mar (entre 850 y 1400 µp?) . Se molió finamente la mezcla a polvo con una mano de mortero enfriada con nitrógeno liquido. Esto se resuspendió en 15 mi de una solución que contenia EDTA 0,05 M pH 8,5 y 0,2% de SDS, solución que se precalentó a 68°C, y se mantuvo el resultante a 68°C durante 15 minutos. Luego, se dejó reposando y de permitió que llegue hasta temperatura ambiente, y se colectó el sobrenadante turbio mediante centrifugación. Luego de agregar 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M a la solución conectada, se agitó la mezcla suavemente y se colectó el sobrenadante mediante centrifugación. Luego, al agregar 15 mi de isopropanol al sobrenadante que se colectó y mezclando tranquilamente, apareció un grumo de ADN genómico y de proteínas. Luego de lavar el precipitado que se generó con 70% de etanol, se secó el resultando bajo presión reducida, se disolvió en 400 µ? de TE, y 10 µ? de solución de RNasa (10 mg/ml) . Se mantuvo la mezcla a 37°C durante 1 hora. Luego del final del tratamiento con RNasa, se llevó a cabo una tratamiento con fenol/cloroformo y un tratamiento con cloroformo, seguidos por precipitación con etanol, mediante lo cual se obtuvo el ADN genómico. (2) Aislamiento del gen de proteasa del ADN cromosómico de la cepa mutante y de la cepa parental Se aisló el gen de proteasa mediante PCR usando el ADN cromosómico que deriva de la cepa mutante que se obtuvo previamente y de la cepa parental como moldes. En base a la secuencia de la proteasa de Rhizomucor miehei registrada en el banco de genes (DDBJ número de acceso: E01264) , se prepararon los cebadores de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Las condiciones de PCR fueron (a) a 94°C durante 2 minutos; (b) 28 ciclos de 94°C durante 30 segundos - 55°C durante 30 segundos - 72°C durante 3 minutos; y (c) 72°C durante 5 minutos. Como polimerasa, se usó TaKaRa Ex Taq (fabricada por Takara Bio Inc.) . Como ciclador térmico, se usó el TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient (fabricado por Takara Bio Inc.). Como resultado de la determinación de la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN que se obtuvo por PCR, se reveló que la secuencia de aminoácidos codificada por el ADN que se amplificó con el ADN cromosómico de la cepa parental como molde contenia la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos codificada por el ADN que se amplificó con el ADN cromosómico de la cepa mutante como molde contenia la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 por lo cual se reemplazó el aminoácido de la posición 19 por valina y el aminoácido de la posición 266 se reemplazó por ácido glutámico.

De aqui en adelante, la proteasa que deriva de la cepa parental de Rhizomucor miehei se denomina RMMP de tipo salvaje, y la proteasa de tipo mejorado se denomina "RMMP mejorada" y un gen que codifica para la proteasa de tipo mejorado se denomina "gen de RMMP mejorada".

[Ejemplo 3] Construcción de un vector plasmidico JS4 para expresar una proteina extraña usando levadura de panadería {Saccharomyces cerevisiae) MC16 como huésped.

El JS5 (descrito en Patente Japonesa No. 3012377

[0109]) se usó como material de partida para la construcción del vector plasmidico JS4.

Primero, se llevó a cabo una PCR usando los cebadores de ADN de SEQ ID NOs:7 y 8 con JS5 como molde, con lo que se obtuvo el producto de PCR de 0,55 kpb con una región promotora de GAL7. Las condiciones de PCR fueron (a) 94°C durante 2 minutos; (b) 30 ciclos de 98°C durante 10 segundos - 52°C durante 30 segundos - 72°C durante 1 minuto; y (c) 72°C durante 5 minutos. Como polimerasa, se usó la TaKaRa Ex Taq (fabricada por Takara Bio Inc.). Como ciclador térmico, se usó el TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient (fabricado por Takara Bio Inc.).

Luego, se digirió el producto de PCR obtenido con las enzimas de restricción EcoR I y BamH I y se insertó en pUC18 que también estaba digerido con EcóR I y BamH I. El plásmido que se obtuvo se introdujo en E. coli DH5 , y se distribuyeron las células en una placa de agar con LB con 100 ug/ml de ampicilina, IPTG 0,1 mM y X-GAL 0,04 mg/ml, y se incubaron a 37°C durante 16 horas. La colonia blanca que apareció se cultivó, con agitación, en medio liquido LB con 100 µg/ml de ampicilina a 37°C entre 14 y 16 horas. A partir de los transformantes colectados por centrifugación, se extrajo el plásmido usando el conjunto de componentes QIAprep Miniprep (QIAGEN, de aquí en adelante todas las extracciones de plásmido se llevaron a cabo usando este conjunto de componentes) . Para el fragmento insertado, se llevó a cabo una secuenciación para confirmar que no se habían introducido mutaciones indeseadas.

A continuación, se digirió el plásmido que contiene el fragmento como inserto con £coR I y BamH I para obtener un fragmento de ADN de 0,55 kpb, y luego se ligaron este fragmento de ADN y el fragmento de ADN de aproximadamente 6 kpb que se obtuvo mediante la digestión de JS5 con BamH I seguido por digestión parcial con EcoR I. El plásmido resultante se introdujo en E. coli DH5oc y se cultivaron las E. coli transformantes en medio de agar LB con 100 pg/ml de ampicilina a 37°C durante 16 horas. Las colonias que aparecieron se cultivaron con agitación en el mismo medio líquido a 37°C entre 14 y 16 horas y luego, a partir de los transformantes que se obtuvieron por centrifugación, se extrajo el plásmido. Este plásmido se digirió con las enzimas de restricción EcoR I, BamH I, y Pst I, para confirmar un patrón de migración mediante análisis por electroforesis en gel de agarosa. De esta forma, se preparó el vector de expresión JS4.

Como material de partida para construir este vector plasmídico, además de JS5, por ejemplo, también se puede usar JS52 (número de acceso FERM BP-3898) que se describe en el párrafo 0112 de la Patente Japonesa No. 3012377.

[Ejemplo 4] Construcción del vector plasmídico para expresar el gen de la RMMP de tipo salvaje y el gen de RMMP mejorada Usando cebadores (SEQ ID NOs : 9 y 10) diseñados para tener un sitio BamH I en ambos extremos de la secuencia de nucleótidos que contiene el ADN que codifica para RMMP de tipo salvaje o para RMMP mejorada con las mutaciones Glul9Val/Gln266Glu, que se obtuvo en el Ejemplo 2, se llevó a cabo una PCR. El producto de PCR obtenido se digirió con BamH I, se insertó en JS4 que estaba similarmente digerido con Bamñ I y desfosforilado, y se introdujo el vector obtenido en E. coli DH5a.

Usando un cebador directo que se puede alinear con el promotor GAL7 y un cebador inverso que se puede alinear con el extremo 3' del gen RMMP (SEQ ID NOs:ll y 10), se llevó a cabo una PCR directa sobre colonias. Se sometió un transformante de E. coli, con el vector plasmidico en el que se había confirmado que la dirección del gen insertado era correcta, a un cultivo liquido como se describió anteriormente. Se extrajo el plásmido y se sometió a secuenciación para confirmar que no se habían introducido errores no deseados, con lo que se obtuvieron los vectores plasmídicos para expresar el gen de RMMP de tipo salvaje y el gen de RMMP mejorada.

[Ejemplo 5] Construcción del vector de expresión de los genes de RMMP mejoradas en los que se introduce la mutación sitio dirigida (I) El producto de PCR del gen de RMMP de tipo salvaje que se obtuvo mediante el método que se describe en el Ejemplo 4, que contiene una secuencia prepro y los sitios BamH I en cada extremo, se digirió con Bamti I y se insertó en pUC18 el que se había digerido similarmente con BamH I y desfosforilado . El plásmido resultante se introdujo en E. coli DH5a y luego se extrajo el plásmido a partir del transformante obtenido y se confirmó su secuencia de nucleótidos y así se obtuvo pRMMP-wt .

Luego, mediante una PCR usando pRMMP-wt como molde, los pares de cebadores de SEQ ID NOs:12 y 13, SEQ ID NOs:14 y 15, SEQ ID N0s:16 y 17, SEQ ID N0s:18 y 19, SEQ ID NOs:20 y 21, SEQ ID NO: 22 y 23, o SEQ ID NOs:24 y 25 y el conjunto de componentes PrimeSTAR Mutagenesis Basal it (Takara Bio Inc., de aquí en adelante denominado como un "conjunto de componentes" para cortas), se introdujeron mutaciones de modo de que se reemplazó un residuo ya sea de ácido glutámico en la posición 19 o de glutamina de la posición 266 de SEQ ID NO: 3 por otro aminoácido. El diseño de los cebadores para introducir la mutación y la PCR se llevaron a cabo en referencia al manual que acompaña a este conjunto de componentes. Los experimentos de mutagénesis se llevaron a cabo de acuerdo con el manual.

Los productos de PCR obtenidos se introdujeron en E. coli DH5a, y se sembraron las células en una placa de agar con LB con 100ug/ml de ampicilina, y se incubaron a 37°C durante 16 horas, mediante lo que se obtuvieron transformantes. A partir de estos transformantes, se extrajeron plásmidos mediante el mismo método que se describió previamente y se sometieron a secuenciación para confirmar que no se introdujeron mutaciones no deseadas.

Mediante dichos procedimientos, se prepararon genes que codifican para las RMMP mejoradas que tienen la mutación Glul9Val, Glul9Ala, Glul9Ile, Glul9Leu, Glul9Phe, Gln266Glu o Gln266Asp. Estos vectores plasmidicos que contienen el gen de RMMP mejorada se denominaron respectivamente como pRMMP-E19V, pR MP-E19A, pRMMP-E19I, pRMMP-E19L, pRMMP-E19F, pRMMP-Q266E y pRMMP-Q266D.

Además, usando pR MP-Q266E o pRMMP-Q266D como molde, los pares de cebadores de SEQ ID N0s:12 y 13, SEQ ID NOs:14 y 15, SEQ ID NOs:16 y 17 o SEQ ID N0s:18 y 19 asi como también el conjunto de componentes antes mencionado, se llevó a cabo una PCR. Los productos de PCR obtenidos se introdujeron en E. coli DH5a y luego se extrajeron los plásmidos a partir de los transformantes obtenidos del mismo modo como se describió anteriormente y se secuenciaron, con lo que se obtuvieron los genes que codifican para las RMMP mejoradas que tienen las mutaciones Glul9Val/Gln266Asp, Glul9Ala/Gln266Glu, Glul9Ala/Gln266Asp, Glul9Ile/Gln266Glu, Glul9Ile/Gln266Asp, o Glul9Leu/Gln266Glu. Estos vectores plasmidicos que contienen los genes de RMMP mejoradas se denominaron respectivamente como pRMMP-E19VQ266D, pRMMP-E19AQ266E, pRMMP-E19AQ266D, pRMMP-E19IQ266E, pRMMP-E19IQ266D, y pRMMP-E19LQ266E.

Los vectores plasmidicos que se obtuvieron de este modo se digirieron con Bamti I, los fragmentos que se obtuvieron se insertaron en JS4 mediante el método que se describió previamente, con lo que se obtuvieron los vectores de expresión para cada uno de los genes de RMMP mejoradas antes mencionados.

[Ejemplo 6] Construcción del vector de expresión de los genes de RMMP mejoradas en los que se introduce la mutación sitio dirigida (II) Además, usando pRMMP-wt como molde, usando los pares de cebadores de SEQ ID NOs:26 y 27, SEQ ID NOs:28 y 29, SEQ ID NOs:30 y 31, SEQ ID NOs:32 y 33, SEQ ID NOs:34 y 35 o SEQ ID NOs:36 y 37 asi como también el conjunto de componentes que se mencionó anteriormente, se llevó a cabo una PCR. Los productos de PCR obtenidos se introdujeron en E. coli DH5a y luego se extrajeron los plásmidos a partir de los transformantes obtenidos del mismo modo como se describió anteriormente y se secuenciaron, con lo que se obtuvieron los genes que codifican para las RMMP mejoradas que tienen las mutaciones Gln265Glu, Gln265Asp, Gln265Glu/Gln266Glu, Gln265Glu/Gln266Asp, Gln265Asp/Gln266Glu o Gln265Asp/Gln266Asp. Estos vectores plasmidicos que contienen los genes de RMMP mejoradas se denominaron respectivamente como pRMMP-Q265E, pRMMP-Q265D, pRMMP-Q265EQ266E, pRMMP-Q265EQ266D, pRMMP-Q265DQ266E y pRMMP-Q265DQ266D.

Se obtuvieron los genes de RMMP mejoradas mediante la digestión de los vectores plasmidicos asi obtenidos con BamR I y se insertaron en JS4 mediante el método que se describió previamente, con lo que se obtuvieron los vectores de expresión de los genes de RMMP mejoradas que se mencionaron anteriormente.

[Ejemplo 7] Construcción de los vectores de expresión de los genes de RMMP mejoradas en los que se introdujo la mutación sitio dirigida (III) Usando pRM P-E19V, pRM P-E19A o pRMMP-E19I como molde, los pares de cebadores de SEQ ID NOs:30 y 31, SEQ ID NOs:32 y 33, SEQ ID NOs:34 y 35, o SEQ ID NOs:36 y 37 asi como también el conjunto de componentes que se mencionó anteriormente, se llevó a cabo una PCR. Los productos de PCR obtenidos se introdujeron en E. coli DH5 y luego se extrajeron los plásmidos de cada uno de los transformantes que se obtuvo del mismo modo como se describió anteriormente y se secuenciaron, con lo que se obtuvieron los genes que codifican para las RMMP mejoradas que tienen las mutaciones Glul9Val/Gln265Glu/Gln266Glu, Glul9Val/Gln265Glu/Gln266Asp, Glul9Val/Gln265Asp/Gln266Glu, Glul9Val/Gln265Asp/Gln266Asp, Glul9Ala/Gln265Glu/Gln266Glu, Glul9Ala/Gln265Glu/Gln266Asp, Glul9Ala/Gln265Asp/Gln266Glu, Glul9Ala/Gln265Asp/Gln266Asp, Glul9Ile/Gln265Glu/Gln266Glu, Glul9Ile/Gln265Glu/Gln266Asp, Glul9Ile/Gln265Asp/Gln266Glu o Glul9Ile/Gln265Asp/Gln266Asp . Estos vectores plasmidicos que contienen los genes de RMMP mejoradas se denominaron respectivamente como pRMMP-E19VQ265EQ266E, pRMMP-E19VQ265EQ266D, pRMMP-E19VQ265DQ266E, PRMMP-É19VQ265DQ266D, pRMMP-E19AQ265EQ266E, pRMMP-E19AQ265EQ266D, pRMMP-E19AQ265DQ266E, pRMMP-E19AQ265DQ266D, pRMMP-E19IQ265EQ266E, pRMMP-E19IQ265EQ266D, pRMMP- E19IQ265DQ266E y pRMMP-E19IQ265DQ266D.

Se obtuvieron los genes de RMMP mejoradas mediante la digestión de los vectores plasmidicos que se obtuvieron de este modo con Bamñ I y se insertaron en JS4 mediante el método que se describió previamente, con lo que se obtuvieron los vectores de expresión para los genes de RMMP mejoradas que se mencionaron anteriormente.

. [Ejemplo 8] Transformación de levaduras de panadería MC16 con el vector de expresión que contiene el gen de tipo salvaje o el de RMMP mejorada Los vectores de expresión producidos como se describe anteriormente se introdujeron en la levadura de panadería MC16 (MATct, leu2, his4, ade2) mediante el método de Gietz y Schiestl (1995), y se sembraron las células en una placa SDah, y se incubaron a 30°C durante 3 días, con lo que se obtuvieron los transformantes.

[Ejemplo 9] Expresión secretoria de la RMMP de tipo salvaje y mejorada Los transformantes que se obtuvieron mediante el método que se describió previamente se cultivaron con agitación a 200 rpm en 100 mi de medio líquido YPD, que se preparó anteriormente en un frasco Erlenmeyer de 500 mi con deflectores, y 30°C durante 24 horas. Las células de levadura colectadas mediante centrifugación se resuspendieron en el doble de cantidad de medio liquido YPGal, se transfirieron a un frasco Erlenmeyer estéril con deflectores, y se cultivaron además con agitación de la misma manera entre 72 y 96 horas para estudiar la expresión secretoria. Luego del cultivo, se centrifugó el medio de cultivo, con lo que se obtuvo el sobrenadante del cultivo que contiene la RMMP que se mencionó anteriormente .

[Ejemplo 10] Medida de MCA y PA y evaluación de la Proporción C/P Como para el sobrenadante del cultivo que contiene la RMMP, se midieron MCA y PA para calcular la relación C/P. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

[Tabla 1] No, Mutaciones Relación C/P relativa (La relación C/P del tipo salvaje se toma como 1. ) Tipo RMMP de tipo salvaje 1,0 salvaje Glul9Val/Gln266Glu 3,8 Tipo mejorada 1. Glul9Val 1,9 2. Glul9Ala 2,2 3 Glul9Ile 1,7 4. Glul9Leu 0,9 5. Glul9Phe N, D, 6. Gln266Glu 1,4 7. Gln266Asp 1,7 8. Glul9Ala/Gln266Glu 2,9 9. Glul9Ile/Gln266Glu 2, 6 10. Glul9Leu/Gln266Glu 1,7 11. Glul9Val/Gln266Asp 3,7 12. Glul9Ala/Gln266Asp 2,7 13. Glul9Ile/Gln266Asp 3,0 14. Gln265Glu 1,3 15. Gln265Asp 1,5 16. Glu265Glu/Gln266Glu 2,2 17. Gln265Glu/Gln266Asp 2,8 18. Gln265Asp/Gln266Glu 2,7 19. Gln265Asp/Gln266Asp 3,0 20 Glul9Val/Gln265Glu/Gln266Glu 4,9 1. Glul9Val/Gln265Glu/Gln266Asp 5,1 2. Glul9Val/Gln265Asp/Gln266Glu 4,0 3. Glul9Val/Gln265Asp/Gln266Asp 4,7 4. Glul9Ala/Gln265Glu/Gln266Glu 3, 5 25. Glul9Ala/Gln265Glu/Gln266Asp 3, 3 26. Glul9Ala/Gln265Asp/Gln266Glu 3,2 27. Glul9Ala/Gln265Asp/Gln266Asp 3,3 28. Glul9Ile/Gln265Glu/Gln266Glu 3,5 29. Glul9Ile/Gln265Glu/Gln266Asp 3,6 30. Glul9Ile/Gln265Asp/Gln266Glu 3,5 31. Glul9Ile/Gln265Asp/Gln266Asp 3, 5 N.D.: no detectado (La actividad coagulante de leche y la actividad proteasa no se pudieron detectar.) La relación C/P de la RMMP que tiene la mutación Glul9Val/Gln266Glu derivada de Rhizomucor miehei (cepa mutante) fue 3,8 veces más grande que la de tipo salvaje.

Las RMMP que tienen la mutación Glul9Val, Glul9Ala, y Glul9Ile exhibieron una mayor relación C/P. En Rhizomucor pusillus, la mutaicon Glul9Ala ya era conocida (J. Biochem. 129, 791-794, 2001) .

En la RMMP de tipo salvaje, como se muestra en SEQ ID NO: 3, los aminoácidos de la posiciones 265 y 266 son ambos glutamina. Se confirmó que la relación C/P of RMMP que tiene como único reemplazo la glutamina de la posición 265 por un aminoácido ácido, Gln265Glu y Gln265Asp (las de tipo mejorada 14 y 15 de la Tabla 1) fue mayor en ambos casos, en comparación con la de tipo salvaje. Similarmente, la relación C/P de la RMMP que tiene como único reemplazo la glutamina de la posición 266 por el aminoácido ácido, Gln266Glu y Gln266Asp (la de tipo mejorada 6 y 7 de la Tabla 1) fue mayor para ambos casos, en comparación con la de tipo salvaje.

La presente invención ha revelado por primera vez que la relación C/P se incrementa mediante la sustitución de la glutamina de la posición 265 o 266.

Además, se confirmó que cuando se combinan la sustitución de la glutamina de la posición 266 por los aminoácidos ácidos y el reemplazo del ácido glutámico de la posición 19 (las de tipo mejorada 8 a 13 de la Tabla 1), la relación C/P se hace mayor que en el caso en donde solo se remplazó la glutamina de la posición 266.

Además, la relación C/P de RMMP con la mutación Gln265Glu/Gln266Glu, Gln265Glu/Gln266Asp, Gln265Asp/Gln266Glu y Gln265Asp/Gln266Asp, en donde se reemplazaron simultáneamente los aminoácidos de las posiciones 265 y 266 por aminoácidos ácidos (las de tipo mejorada 16 a 19 de la Tabla 1) , fue significativamente mayor que la de la RMMP que tiene la mutación en donde se reemplazó solo la glutamina de la posición 265 o solo la glutamina de la posición 266 por aminoácidos ácidos.

Además, la relación C/P de las RMMPs que tienen la mutación Glul9Val/Gln265Glu/Gln266Glu, Glul9Val/Gln265Glu/Gln266Asp, Glul9Val/Gln265Asp/Gln266Glu y Glul9Val/Gln265Asp/Gln266Asp, en donde se reemplazaron simultáneamente los aminoácidos de las posiciones 265, 266 y 19 por aminoácidos ácidos (las de tipo mejorado 20 a 23 de la Tabla 1) , fue significativamente mayor (en hasta cinco veces), en comparación con la RMMP de tipo salvaje. Se confirmó que las proteasas de tipo mejorado fueron extremadamente excelentes como enzimas coagulantes de la leche .

[Ejemplo 11] Construcción del vector de expresión de los genes de RMMP mejoradas en donde se introduce la mutación sitio dirigida (IV) A continuación, se preparó un vector de expresión del gen de RMMP que tiene la mutación en donde se reemplazó la treonina de la posición 81 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 por glutamina o ácido aspártico.

Usando pRMMP-wt o pRMMP-Q265EQ266E como molde, cebadores de SEQ ID NOs:38 y 39, asi como también el conjunto de componentes que se mencionó anteriormente, se llevó a cabo una PCR. Los productos de PCR obtenidos se introdujeron en E. coli DH5 y luego se extrajeron los plásmidos a partir de los transformantes obtenidos del mismo modo como se describió anteriormente y se secuenciaron, con lo que se obtuvieron los genes que codifican para las RMMP mejoradas que tienen las mutaciones Thr81Gln y Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu. Estos vectores plasmidicos que contienen los genes de RMMP mejoradas se denominaron respectivamente pRMMP-T81Q y pRMMP-T81QQ265EQ266E.

A continuación, usando pRMMP-Q265EQ266D como molde, ADNs cebadores de SEQ ID NOs:40 y 41, asi como también el conjunto de componentes que se mencionó anteriormente, se llevó a cabo una PCR. El producto de PCR obtenido se introdujo en E. coli DH5OÍ y luego se extrajo el plásmido a partir del transformante obtenido del mismo modo como se describió anteriormente y se secuenciaron, con lo que se obtuvo el gen que codifica para la RMMP mejorada que tiene las mutaciones Thr81Asp/Gln265Glu/Gln266Asp. El vector plasmidico que contiene el gen de RMMP mejorada se denominó pRMMP-T81DQ265EQ266D.

Además, usando pRMMP-E19VQ265EQ266E, pRMMP-E19VQ265EQ266D, pRMMP-El9VQ265DQ266E, pRMMP-E19VQ265DQ266D, pRMMP-E19AQ265EQ266E, pRMMP-E19AQ265EQ266D, pRMMP- E19IQ265EQ266E, pRMMP-E19IQ265EQ266D, pRMMP-E19IQ265DQ266E o PRMMP-E19IQ265DQ266D como molde, cebadores de SEQ ID NOs:38 y 39, asi como también el conjunto de componentes que se mencionó anteriormente, se llevó a cabo una PCR. Los productos de PCR obtenidos se introdujeron en E. coli DH5o¡ y luego se extrajeron los plásmidos a partir de los transformantes obtenidos del mismo modo como se describió anteriormente y se secuenciaron, con lo que se obtuvieron los genes que codifican para las RMMP mejoradas que tienen las mutaciones Glul9Val/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu, Glul9Val/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp, Glul9Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu, Glul9Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Asp, Glul9Ala/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu, Glul9Ala/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp, Glul9Ile/Thr81Gln/Gln265Glu7Gln266Glu, Glul9Ile/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp, Glul9Ile/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu, o Glul9Ile/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Asp. Estos vectores plasmidicos que contienen los genes de RMMP mejoradas se denominaron respectivamente como pRMMP-E19VT81QQ265EQ266E, pRMMP-E19VT81QQ265EQ266D, pRMMP-E19VT81QQ265DQ266E, pRMMP-E19VT81QQ265DQ266D, pRMMP-E19AT81QQ265EQ266E, pRMMP- E19AT81QQ265EQ266D, pRMMP-E19IT81QQ265EQ266E, pRMMP-E19IT81QQ265EQ266D, pRMMP-E19IT81QQ265DQ266E y pRMMP-E19IT81QQ265DQ266D.

Se obtuvieron los genes de RMMP mejoradas mediante la digestión de los vectores plasmidicos que se obtuvieron de este modo con BamH I, y se insertaron en JS4 mediante el método que se describió previamente, con lo que se obtuvieron los vectores de expresión de los genes de RMMP mejoradas que se mencionaron anteriormente.

[Ejemplo 12] De acuerdo con los métodos que se describieron anteriormente en los Ejemplos 8 a 10, los vectores de expresión que se prepararon en el Ejemplo 11 se introdujeron en la levadura de panadería MCI6 y se sometió a los transformantes a cultivo líquido, con lo que se obtuvo un sobrenadante de cultivo conteniendo la RMMP mejorada. Como para el sobrenadante de cultivo con la RMMP, se midieron MCA y PA para calcular la proporción C/P. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

[Tabla 2] No. Mutaciones Relación C/P relativa (La relación C/P de tipo salvaje se toma como 1. ) Tipo RMMP de tipo salvaje 1,0 salvaje Glul9Val/Gln266Glu 3,8 Tipo mejorado 32. Thr81Gln 1,1 33. Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu 2,6 34. Thr81Asp/Gln265Glu/Gln266Asp 4,4 35. Glul9Val/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu 4,3 36. Glul9Val/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp 3,8 37. Glul9Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu 4,8 38. Glul9Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Asp 2,9 39. Glul9Ala/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu 3,2 40. Glul9Ala/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp 3,0 41. Glul9Ile/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu 3,0 42. Glul9Ile/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp 2,8 43. Glul9Ile/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu 2,7 44. Glul9Ile/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Asp 3,0 Como se muestra en la Table 2, se confirmó que la RMMP que tiene los reemplazos de treonina de la posición 81 por glutamina o ácido aspártico y las glutaminas de las posiciones 265 y 266 por aminoácidos ácidos (las de tipo mejorado 33 y 34 de la Tabla 2) exhibieron una mayor relación C/P que la RMMP de tipo salvaje. En particular, la relación C/P de la RMMP que tiene las mutaciones Thr81Asp/Gln265Glu/Gln266Asp se incrementó tanto como 4,4 veces, en comparación con la RMMP de tipo salvaje.

En los casos en donde se combinó el reemplazo de ácido glutámico de la posición 19 con los reemplazos mencionados, la relación C/P fue mayor que, en la RMMP de tipo salvaje (las de tipo mejorado 35 a 44 de la Tabla 2). En particular, la relación C/P de la RMMP que tiene la mutación Glul9Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu se incrementó tanto como 4,8 veces, en comparación con la RMMP de tipo salvaje.

Los resultados que se muestran en la Tabla 1 y Tabla 2 indican que cuando la(s) glutamina de las posiciones 265 y/o 266 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 es (son) sustituid (s) por el aminoácido ácido, la relación C/P se incrementa, en comparación con la RMMP de tipo salvaje, y mediante la combinación del/los reemplazo (s) de/los aminoácido (s) de las posicione(s) 19 y/o 81, la relación C/P se incrementa adicionalmente .

[Ejemplo 13] Purificación de RMMP tipo salvaje y mejoradas y evaluación de enzima purificada La levadura de panadería MC16 portando el vector de expresión que contiene el gen de RMMP de tipo salvaje o los genes de RMMP mejoradas que tienen las mutaciones Glul9Val/Gln266Glu, Glul9Val, Glul9Ala, Gln266Glu, Gln266Asp, Glul9Ala/Gln266Glu, Gln265Glu, Gln265Asp, Gln265Glu/Gln266Glu, Gln265Glu/Gln266Asp, Gln265Asp/Gln266Glu, Gln265Asp/Gln266Asp, Glul9Val/Gln265Glu/Gln266Asp o Glul9Val/Gln265Asp/Gln266Asp se cultivó con el método que se describió anteriormente para permitir la expresión secretoria de la RMMP. Se aplicó el sobrenadante de cultivo colectado por centrifugación a una columna rellena con HiTrap Q HP (fabricado por GE Healthcare) , que se habla equilibrado con una solución amortiguadora de acetato de sodio 50 mM, pH5,5, previamente, para que absorba la proteina RMMP. Luego de lavar la columna con la misma solución amortiguadora, se eluyó la proteina con solución amortiguadora de NaCl 0,3 M. Se colocaron dos µ? de la fracción sobre una placa con leche deslipidada (1% de leche deslipidada (fabricada por Difco) , solución amortiguadora de ácido acético 100 mM pH5,2, y 1% de agar) y se incubó a 37°C durante 10 minutos, la fracción activa se detectó con la aparición de un halo turbio.

La fracción activa que se obtuvo se concentró con una membrana de ultrafiltración y luego se purificó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento usando una columna de filtración por gel Super SW3000 (fabricada por Tosoh Corporation) . Cuando se analizó la fracción purificada por SDS-PAGE, se observó una banda única.

Los resultados de la medida de MCA para la RMMP purificada obtenida de esa manera se muestran en la Tabla 3.

La cuantificación de proteínas se llevó a cabo con reactivo BCA Protein Assay Reagent (fabricado por Pierce) .

[Tabla 3] Mutaciones MCA ( x 103Mu/mg -proteína) RMMP de tipo salvaje 3,89 Glul9Val/Gln266Glu 4, 15 Glul9Val 2, 19 Glul9Ala 2, 43 Gln266Glu 4,24 Gln266Asp 4, 01 Glul9Ala/Gln266Glu 4,23 Gln265Glu 4,22 Gln265Asp 4, 03 Gln265Glu/Gln266Glu 3, 91 Gln265Glu/Gln266Asp 3, 74 Gln265Asp/Gln266Glu 3, 90 Gln265Asp/Gln266Asp 3, 92 Glul9Val/Gln265Glu/Gln266Asp 4, 52 Glul9Val/Gln265Asp/Gln266Asp 4, 27 A partir de estos resultados, MCA disminuyó con el reemplazo de ácido glutámico en la posición 19 solo, mientras que MCA se incrementó con el reemplazo de glutamina de la posición 265 o 266. MCA también se incrementó con los reemplazos en las posiciones 19 y 266 y con los reemplazos en las posiciones 19, 265 y 266.

[Ejemplo 14] Medida del peso de materia seca en suero El rendimiento del queso es una de las características más importantes en el uso comercial de una enzima coagulante de leche. La medida del peso de materia seca en suero es un índice útil para evaluar el rendimiento del queso. Un menor peso de materia seca en el suero de leche indica un mayor rendimiento de queso.

Luego, se describirá la medida del peso de materia seca en el suero usando la RMMP de tipo salvaje y RMMP E19V/Q266E, ambas expresadas en levadura.

La levadura de panadería MC16 que porta el vector de expresión que contiene el gen de RMMP de tipo salvaje o el gen de RMMP mejorada que tiene las mutaciones Glul9Val/Gln266Glu se cultivó mediante el método que se describió previamente para permitir la expresión secretoria de la RMMP. Se centrifugó el sobrenadante de cultivo colectado mediante centrifugación mediante una membrana de ultrafiltración y se usó el resultante como enzima coagulante de la leche. (1) Operación de coagulación de leche Se pone leche de vaca pasteurizada no homogeneizada comercial (Takanashi milk products Co. Ltd.) (500 g) en un vaso de precipitados y se calienta a 32°C. En el punto en el que la temperatura de la leche de vaca alcanza 32°C, se agrega 0,4 g de D-(+) glucono-1, 5-lactona (ácido D-glucónico d-lactona, fabricado por Wako Puré Chemical) y se agita y luego se agrega en forma gradual cloruro de calcio (fabricado por Wako Puré Chemical) hasta una concentración final de 1 niM y se agita. Luego del agregado de los reactivos, se agrega la enzima coagulante de la leche (2.000 Mu), se agita durante 1 minuto, y se mantiene a 32°C. Treinta minutos luego de agregar la enzima coagulante de la leche se toma como tiempo de formación de cuajo. Se. corta la cuajada de a trozos de entre 1 y 1,5 cm cuadrados, y se deja reposar durante 10 minutos. Luego de que se deja reposar, se rompen suavemente los cuajos. Se- mantienen los cuajos a 32°C durante 20 minutos, mientras que se agitan ocasionalmente en forma suave. Luego, se transfiere el vaso de precipitados a un incubador de 37°C y se incrementa la temperatura interna a 37°C (de a 0,5°C por minuto). En el punto en el que los cuajos alcanzan los 37°C, los mismos se dejan reposar durante otros 30 minutos, mientras que se agitan ocasionalmente en forma suave. Luego de que los cuajos se dejaron reposar, se separan los cuajos y el suero con una gasa. Se envuelven los cuajos colectados en la gasa, y se ponen en un molde exclusivo para la producción de quesos. Mediante la aplicación de presión (5 MPa durante 90 minutos), se extrae más suero y se colecta. Todo el suero de leche que se colectó se mezcla y se filtra con papel de filtro cualitativo No.l (ADVANTEC) .. El resultante se usa como suero total. (2) Medida del peso de materia seca en suero Previamente se seca un vaso de precipitados a 105°C con un horno de secado. No menos de 30 minutos después, se coloca el vaso de precipitados que se sacó del horno de secado en un desecador, y se mide el peso. Aproximadamente 25 g del suero que se obtuvo anteriormente se coloca dentro del vaso de precipitados, y se seca en el horno de secado a 105°C entre 12 y 15 horas o más. Luego del secado, se coloca el vaso de precipitados en el desecador. No menos de 30 minutos después, se mide el peso.. El valor que se obtiene mediante la sustracción del peso preliminar del vaso de precipitados que se midió se establece como peso de materia seca.

De acuerdo al método que se describió anteriormente, se midieron el contenido de materia seca de 15 lotes de suero y el peso de materia seca total por duplicado, y los resultados se muestran en la Tabla 4 Tabla 4 Contenido de materia seca en suero (p/p %) Materia seca total en suero (g) Lote No. RMMP de tipo RM P Lot No. RMMP de RMMP salvaje Glul9Val/ tipo Glul9Val/ Gln266Glu salvaje Gln266Glu 7,257 7,141 1 28,648 28,238 7,248 7,183 2 28,605 28, 468 7, 190 7,168 3 28,891 28,218 7, 177 7,058 4 28, 651 28,219 5 7, 128 7,025 5 28, 621 27,890 6 7,133 7,032 6 28,502 28,300 7 7,054 6,977 7 28,397 27, 985 8 7, 153 6,966 8 28,514 28, 104 9 7,270 7,087 9 29,053 28, 526 10 7, 129 7,086 10 28, 637 28, 23 11 7, 167 7,019 11 28,789 28, 142 12 7, 135 7,010 12 28,231 27, 521 13 7,037 6, 976 13 27, 656 27, 577 14 7,098 7,189 14 27,696 27,792 15 7, 181 7,080 15 28,323 27,364 Promedio 7,157 7,066 Promedio 28,481 28,051 SD 0, 065 0,071 SD 0,203 0,214 La materia seca total en el suero de la RMMP de tipo salvaje y de la RMMP Glul9Val/Gln266Glu fue 28,4810 g y 28,0511 g, respectivamente. La presencia de una diferencia significativa se confirmó usando prueba de t Student (prueba de dos colas) . Se encontró una diferencia significativa entre ellos (p< 0,01). O sea, se encontró que la RMMP Glul9Val/Gln266Glu puede producir un mayor rendimiento de queso en comparación con la RMMP de tipo salvaje, o sea,. puede producir aproximadamente 1,51% más de queso que la RMMP de tipo salvaje. Esto es equivalente a 85,97 kg en el caso de una producción de queso usando 100 toneladas de leche.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una proteasa de tipo mejorado, CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a SEQ ID NO: 3, en donde dicha proteasa de tipo mejorado tiene al menos una mutación que se selecciona del grupo que consiste en: (A) sustitución de la glutamina que corresponde a una glutamina de la posición 265 de SEQ ID NO: 3 por un aminoácido ácido; y (B) sustitución de la glutamina de la posición 266 de SEQ ID NO: 3 por un aminoácido ácido, y en donde dicha proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

2. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADA PORQUE se selecciona del grupo que consiste de: (A) una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 43 excepto en que la glutamina de la posición 265 y/o la glutamina de la posición 266 se reemplaza (n) por un aminoácido ácido; (B) una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 43 excepto en que la glutamina de la posición 265 y/o la glutamina de la posición 266 se reemplaza (n) por un aminoácido ácido, y en donde no más de 10 aminoácidos en posiciones distintas a 265 y 266 se sustituyen, eliminan, insertan o agregan, y en donde dicha proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

3. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo a la reivindicación 1 o 2, CARACTERIZADA PORQUE dicho aminoácido ácido es ácido glutámico o ácido aspártico.

4. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, CARACTERIZADA PORQUE el ácido glutámico de la posición 19 se reemplaza por valina, alanina, isoleucina o leucina.

5. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADA PORQUE la treonina en la posición 81 se reemplaza por glutamina o ácido aspártico.

6. Un ADN CARACTERIZADO PORQUE codifica para la proteasa de tipo mejorado, de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector de expresión, CARACTERIZADO PORQUE comprende el ADN de acuerdo a la reivindicación 6.

8. Una célula transformada, CARACTERIZADA PORQUE se introduce en dicha célula transformada el vector de expresión de acuerdo a la reivindicación 7.

9. La célula transformada de acuerdo a la reivindicación 8, CARACTERIZADA PORQUE es Saccharomyces cerevisiae.

10. Un método para producir una proteasa de tipo mejorado qué tiene actividad coagulante de leche, CARACTERIZADO PORQUE comprende los pasos de cultivar la célula transformada de acuerdo a la reivindicación 8 o 9 en un medio de cultivo y colectar la proteasa de tipo mejorado del medio de cultivo.