JP2012521188A - 微生物由来の改良型凝乳プロテアーゼ - Google Patents
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Abstract
(A)配列番号3の265位のグルタミンに相当するグルタミンの酸性アミノ酸への置換、及び
(B)配列番号3の266位のグルタミンの酸性アミノ酸への置換。
Description
下、「非特異的プロテアーゼ活性」ともいう)が低く、凝乳酵素の比活性が維持され、又は向上した、凝乳に適したプロテアーゼを提供することを課題とする。
(A)配列番号3の265位のグルタミンに相当するグルタミンの酸性アミノ酸への置換、及び
(B)配列番号3の266位のグルタミンの酸性アミノ酸への置換。
本発明の他の態様は、以下の(A)および(B)からなる群より選択される前記改良型プロテアーゼを提供することである。
(A)配列番号3または43のアミノ酸配列において、265位のグルタミン及び/又は266位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
(B)配列番号3または43のアミノ酸配列において、265位のグルタミン及び/又は266位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換され、かつ、265位及び266位以外の位置において10個以下(好ましくは5個以下、より好ましくは3個以下、さらに好ましくは2個以下)のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
本発明の他の態様は、前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸又はアスパラギン酸である、前記改良型プロテアーゼを提供することである。
本発明の他の態様は、配列番号3のアミノ酸配列において、19位のアミノ酸が、バリン、アラニン、イソロイシン又はロイシンに置換されている、前記改良型プロテアーゼを提供することである。
本発明の他の態様は、配列番号3のアミノ酸配列において、81位のアミノ酸がグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている、前記改良型プロテアーゼを提供することである。
本発明の他の態様は、前記改良型プロテアーゼをコードするDNAを提供することである。
本発明の他の態様は、前記DNAを含む発現ベクターを提供することである。
本発明の他の態様は、前記発現ベクターが導入された形質転換細胞を提供することである。
本発明の他の態様は、前記形質転換細胞がサッカロマイセス・セレビシエである、前記形質転換細胞を提供することである。
本発明の他の態様は、前記形質転換細胞を培養し、該培養液中に凝乳活性を有するプロテアーゼを蓄積させる工程を含む、凝乳活性を有する改良型プロテアーゼの製造方法を提供することである。
型酵素により凝乳過程における苦味ペプチド等の生成が抑えられ、質の高いチーズの生産が可能になる。
1.本発明に係る改良型プロテアーゼ(凝乳酵素)
本発明に係る改良型プロテアーゼは、配列番号3と少なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、(A)配列番号3のアミノ酸配列における265位のグルタミンに対応するグルタミンの酸性アミノ酸への置換、及び(B)配列番号3のアミノ酸配列における266位のグルタミンの酸性アミノ酸への置換、からなる群より選ばれる少なくとも1つの変異を有し、凝乳活性を有している。
本発明の改良型プロテアーゼは配列番号3の全体に対して好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の配列同一性を有する。
1アミノ酸欠失した場合、前記265位は264位となる。このような場合であっても、N末端から264番目のアミノ酸は、本発明における「265位」のアミノ酸である。アミノ酸の絶対的な位置は、対象のプロテアーゼのアミノ酸配列と配列番号3または43のアミノ酸配列とのアラインメントにより、決定することができる。「相当する」という用語によって示されるアミノ酸は配列番号3または43のアミノ酸配列と比較した相対的な位置のアミノ酸を意味する。
また、前記DNAの発現は、無細胞系で行うこともできる。
ここで、C/P比とは、[凝乳活性(MCA)]/[タンパク質分解活性(PA)]を示し、PA及びMCAの測定は以下の方法で行うことができる。尚、MCAの測定は、国際標準法(ISO15174, IDF176;first edtion 2002−09−01、食品添加物自主規格に記載)が存在するが、本明細書におけるMCAの値は、以下の方法(便宜上、名糖法と呼ぶ)で算出したものである。
0.05Mリン酸水素二ナトリウム溶液に乳製カゼイン(和光純薬工業株式会社製)を溶解させ、1mol/l 塩酸試液によりpH6.0に調製し、0.6%カゼイン基質溶
液を調製する。この基質溶液1mlに適時希釈した試験試料0.2mlを加えて37℃、10〜30分間反応後、反応停止液(0.11mol/lトリクロロ酢酸、0.21mol/l無水酢酸ナトリウム、0.33mol/l酢酸の混合溶液)を1ml加えて反応を停止させる。さらに遠心分離により得られた上澄み液0.4mlに0.55mol/l無水炭酸ナトリウム1mlを加えた後、2倍に希釈した和光純薬工業株式会社製フェノール試薬(フォーリン・チオカルトー試薬)を0.2ml加える。37℃、30分間反応させた後、660nmで吸光度(光路長:1cm)を測定する。別途、基質溶液1mlに反応停止液1mlを加えた後、試験試料0.2mlを加えて、以下同様の手順で調製したものをブランクとする。試験サンプルの吸光度からブランクにおける吸光度を差し引いた値を遊離チロシン量に換算し、PAの値を求める。PAの単位はUnit/mlで表す。この1Unitとは、上記操作法にて1分間にチロシン1μmolに相当するフェノール試薬呈色物質の増加をもたらす酵素量とする。また、チロシンとフェノール試薬呈色物質の相関式は下記のようにチロシン検量線を作成することにより求められる。
チロシン標準品(分子量181.2、和光純薬工業株式会社製)を105℃で3時間乾燥し、その0.050gを正確に量り、0.2mol/l塩酸試液に溶かし、正確に50mlとする。この液1、2、3及び4mlを正確に量り、それぞれに0.2mol/l塩酸試液を加え、正確に100mlとする。それぞれの液2mlを正確に量り、0.55mol/l炭酸ナトリウム試液5ml及び2倍希釈したフェノール試薬1mlをそれぞれ正確に加え、直ちに振り混ぜ、37±0.5℃で30分間放置した後、これらの液につき、0.2mol/l塩酸試液2mlを正確に量り、同様に操作して得た液を対照とし、波長660nmに於ける吸光度A1、A2、A3及びA4を測定する。縦軸に吸光度A1、A2、A3及びA4を、横軸にそれぞれの液2ml中のチロシン量(μmol)をとり、検量線を作成し、吸光度差1に対するチロシン量(μmol)を求める。
0.01M塩化カルシウムに溶解した10%還元脱脂粉乳(pH6.0)、好ましくはCHR.HANSEN社製のものを基質として用い、この基質5mlに対して2〜5分間、好ましくは2分30秒でカードフラグメントを形成するような濃度に調製した試験試料溶液0.5mlを加え、35℃に保温する。時折、ガラス棒で攪拌しながらカードフラグメント形成を観察し、形成時間を測定する。同様に測定した、MCAが既知である標準品の値と比較して、単位量の試験試料が単位時間に何倍量の基質を凝固させることができるか計算することでMCAを求める。計算式は以下の通りである。
MCA(Mu/ml)=S×(TS×WS)/T×W
S:標準品の凝乳酵素の比活性(Mu/g)
TS:標準品溶液の凝乳時間(秒)
WS:標準品溶液1ml中の標準品の量(g)
T:試験試料溶液の凝乳時間(秒)
W:試験試料溶液1ml中の試験試料の量(ml)
1国際標準単位(IMCU/ml)≒1名糖法単位(Mu/ml)/100
本発明に係るプロテアーゼと、配列番号3のアミノ酸配列からなるプロテアーゼとを、同一の条件により調製する例としては、各プロテアーゼをコードするDNAを、それぞれ同一の遺伝子発現用ベクターに組み込み、該発現ベクターそれぞれを、同一株の細胞に同一の条件で導入し、該細胞を同一の培養条件で培養した培養液を各プロテアーゼ溶液とすることが挙げられる。該培養液は、同一の条件で濃縮して使用してもよいし、同一の条件で精製して使用してもよい。
本発明のDNAは、本発明の改良型プロテアーゼをコードするDNAである。本発明のDNAとして具体的には、配列番号1の塩基番号208〜1290の塩基配列を含むDNA、又は、配列番号1の塩基番号208〜1290の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有し、かつ、上記性質を有する改良型プロテアーゼをコードするDNAが挙げられる。また、本発明のDNAとして具体的には、配列番号42の塩基配列を含むDNA、又は、配列番号42の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有し、かつ、上記性質を有する改良型プロテアーゼをコードするDNAが挙げられる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件は、塩基配列やその長さによって異なるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
DNAを単離し、これに部位特異的変異を導入することで容易に得ることもできる。
本発明に係る発現ベクターは、本発明に係る改良型プロテアーゼを発現させるために用いられる。本発明に係る改良型プロテアーゼをコードするDNAの上流に、該DNAの発現を制御するプロモーター配列を連結した構造にすることができる。さらに、該遺伝子の下流にターミネーターを連結させることもできる。
本発明に係る形質転換細胞は、本発明に係る発現ベクターが導入された細胞であって、本発明に係るプロテアーゼを生産し得る細胞である。細胞は、原核細胞であっても真核細
胞であってもよいが、真核細胞であることが好ましい。
真核細胞としては、酵母、カビ、植物細胞などが挙げられるが、酵母であることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエであることが特に好ましい。
サッカロマイセス・セレビシエとしては、SHY3、D13−1A、MC16等の株を挙げることができる。
本発明に係る形質転換細胞を培養することで、本発明に係る改良型プロテアーゼを生産することができ、本発明に係る改良型プロテアーゼを分泌のためのシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現させることで、本発明に係るプロテアーゼを培養液中に蓄積させることができる。培養に際しては、誘導可能なプロモーターを使用した場合には、誘導を行うことが好ましい。形質転換細胞の培養方法は、細胞の種類によって異なるが、そのような方法は当業者によく知られた方法を用いることができる。
以下に、サッカロマイセス・セレビシエの形質転換体の培養方法の一例を説明する。
C/P比が向上したプロテアーゼを生産するリゾムコール・ミーハイ突然変異株の取得
プロテアーゼを生産するリゾムコール・ミーハイ元株(CBS182−67(ATCC16457の誘導株))に変異処理を施し、C/P比の向上したプロテアーゼを分泌する変異株を取得した。以下、詳細に説明する。
(1)変異処理リゾムコール・ミーハイ元株(親株)をマルトプレート(2%マルト・エキストラクト,2%グルコース,0.1%ペプトン,2%寒天)上に生育させ、37℃で3日から1週間保温することにより胞子を形成させた。この胞子をガラス製スプレダーを用いて滅菌水に懸濁させた。
先に記載した方法により、MCA及びPAを測定した結果、元株と比べてPAが大きく下回りC/P比(MCA/PA)が4.6倍と大幅に増加した変異株が取得された。
突然変異株からのプロテアーゼ遺伝子の単離
(1)変異株及び元株の染色体DNAの取得
実施例1で得た変異株と元株をマルトプレート上に生育させ、37℃で3日から1週間保温することにより胞子を形成させた。この胞子をガラス製スプレダーを用いて滅菌水に懸濁させた。この胞子懸濁液を200mlのYPD液体培地を入れた500ml容坂口フラスコに約108個となるように植えて、37℃で2日間培養した。菌体が0.5〜2mm程度の大きさのペレットを形成したところで、培養液を濾過し余分な水分を除いて、湿重量約5gの菌体を得た。
上記で得た変異株及び元株由来の染色体DNAを鋳型にしてPCR法によってプロテアーゼ遺伝子の単離を行った。遺伝子バンクに登録されているリゾムコール・ミーハイのプロテアーゼ(DDBJアクセス番号:E01264)の配列をもとに、配列番号5と配列番号6で示されるプライマーを作製した。PCR条件は(a)94℃で2分、(b)94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で3分、を28サイクル、(c)72℃で5分であり、ポリメラーゼとしてはTaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)を、サーマルサイクラーはTaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient(タカラバイオ社製)を用いた。PCRで得たDNA断片の塩基配列決定を行った結果、元株の染色体DNAを鋳型として増幅したDNAがコードするアミノ酸配列は配列番号3のアミノ酸配列を含み、変異株の染色体DNAを鋳型として増幅したDNAがコードするアミノ酸配列は、配列番号3のアミノ酸配列において、19位のアミノ酸がVal、266位のアミノ酸がGluに置換されている配列を含むことが判った。
以下、リゾムコール・ミーハイの元株由来のプロテアーゼを野生型RMMPと呼び、改良型プロテアーゼを「改良型RMMP」、改良型プロテアーゼをコードする遺伝子を「改良型RMMP遺伝子」と呼ぶ。
出芽酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)MC16を宿主として異種蛋白を発現するためのプラスミドベクターJS4の作製
該プラスミドベクターを構築するための出発材料としてJS5(特許第3012377号公報[0109]に記載)を用いた。
初めに、JS5を鋳型として、配列番号7及び8で示したプライマーDNAを用いてPCRを行い、GAL7プロモーター領域を含む鎖長0.55kbpのPCR産物を得た。PCRの条件は(1)94℃で2分(2)98℃で10秒、52℃で30秒、72℃で1分、を30サイクル、(3)72℃で5分であり、ポリメラーゼはTaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)を、サーマルサイクラーはTaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient(タカラバイオ社製)を用いた。
Miniprep kit(キアゲン社、以降のプラスミド抽出は全て本キットを用いて行った)を用いてプラスミドを抽出後、その挿入断片についてシーケンシングを行い望まない変異が導入されていないことを確認した。
尚、該プラスミドベクターの構築のための出発材料として、JS5の他、例えば特許第3012377号公報[0112]に記載のJS52(受託番号FERM BP−3898)を用いてもJS4を得ることが出来る。
野生型RMMP遺伝子及び変異型RMMP遺伝子を発現させるためのプラスミドベクターの作製
実施例2で得られた、野生型RMMP及びGlu19Val/Gln266Gluの変異を有する変異型RMMPをコードするDNAを含む塩基配列の両末端にBamHI部位が付加されるよう設計したプライマーDNA(配列番号9及び10)を用いてPCRを行い、そのPCR産物についてBamHIで消化後、同じくBamHIで消化し脱リン酸化したJS4に挿入し、大腸菌DH5αへ形質転換した。
部位特異的変異を導入したRMMP遺伝子の発現ベクターの作製(I)
実施例4に記載の方法で得た、両末端にBamHI部位を付加したプレプロ配列を含む野生型RMMP遺伝子のPCR産物をBamHI消化し、同じくBamHI消化して脱リン酸化したpUC18へ挿入して大腸菌DH5αへ形質転換後、得られた形質転換体より先述のようにしてプラスミドを抽出し、塩基配列を確認することでpRMMP−wtを作製した。
Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ社、以降はキットと略す)を用いて、PCR法により、配列番号3における19位のグルタミン酸又は266位のグルタミンの一ヶ所について別のアミノ酸に置換するよう変異を導入した。変異導入用プライマーの設計並びにPCR反応条件は、本キット付属のマニュアルを参考にして行った。以降の変異導入実験も本マニュアルに準拠して行った。
出してシーケンシングを行うことにより、Glu19Val/Gln266Asp、Glu19Ala/Gln266Glu、Glu19Ala/Gln266Asp、Glu19Ile/Gln266Glu、Glu19Ile/Gln266Asp、Glu19Leu/Gln266Gluのアミノ酸置換を有する改良型RMMPをコードする遺伝子を作製した。これらの改良型RMMP遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、pRMMP−E19VQ266D,pRMMP−E19AQ266E,pRMMP−E19AQ266D,pRMMP−E19IQ266E,pRMMP−E19IQ266D,pRMMP−E19LQ266Eとした。
部位特異的変異を導入した改良型RMMP遺伝子の発現ベクターの作製(II)
pRMMP−wtを鋳型にして、配列番号26及び27、配列番号28及び29、配列番号30及び31、配列番号32及び33、配列番号34及び35、配列番号36及び37に示したプライマーDNA、並びに上述のキットを用いてPCRを行って得たPCR産物を大腸菌DH5αへ形質転換し、得られた形質転換体より先述と同様にしてプラスミドを抽出してシーケンシングを行うことにより、Gln265Glu,Gln265Asp,Gln265Glu/Gln266Glu,Gln265Glu/Gln266Asp,Gln265Asp/Gln266Glu,Gln265Asp/Gln266Aspのアミノ酸置換を有する改良型RMMPをコードする遺伝子を作製した。これらの改良型RMMP遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、pRMMP−Q265E,pRMMP−Q265D,pRMMP−Q265EQ266E,pRMMP−Q265EQ266D,pRMMP−Q265DQ266E,pRMMP−Q265DQ266Dとした。
部位特異的変異を導入した改良型RMMP遺伝子の発現ベクターの作製(III)
pRMMP−E19V、pRMMP−E19A又はpRMMP−E19Iを鋳型にして、配列番号30及び31、配列番号32及び33、配列番号34及び35、配列番号36及び37に示したプライマーDNA、並びに上述のキットを用いてPCRを行って得たPCR産物を大腸菌DH5αへ形質転換し、得られた形質転換体より先述と同様にしてプラスミドを抽出してシーケンシングを行うことにより、Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Glu,Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Asp,Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Glu,Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Asp,Glu19Ala/Gln265Glu/Gln266Glu,Glu19Ala/Gln265Glu/Gln266Asp,Glu19Ala/Gln265Asp/Gln266Glu,Glu19Ala/Gln265Asp/Gln266Asp,Glu19Ile/Gln265Glu/Gln266Glu,Glu19Ile/Gln265Glu/Gln266Asp,Glu19Ile/Gln265Asp/Gln266Glu,Glu19Ile/Gln265Asp/Gln266Aspのアミノ酸置換を有する改良型RMMPをコードする遺伝子を作製した。これらの改良型RMMP遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、pRMMP−E19VQ265EQ266E,pRMMP−E19VQ265EQ266D,pRMMP−E19VQ265DQ266E,pRMMP−E19VQ265DQ266D,p
RMMP−E19AQ265EQ266E,pRMMP−E19AQ265EQ266D,pRMMP−E19AQ265DQ266E,pRMMP−E19AQ265DQ266D,pRMMP−E19IQ265EQ266E,pRMMP−E19IQ265EQ266D,pRMMP−E19IQ265DQ266E,pRMMP−E19IQ265DQ266Dとした。
野生型並びに変異型RMMP遺伝子を含む発現ベクターによる出芽酵母MC16の形質転換
上述のようにして作製した発現ベクターを、GietzとSchiestl(1995)の方法にて出芽酵母MC16株(MATα、leu2,his4,ade2)へ形質転換し、SDahプレートへ撒いて30℃で3日間、静置培養することにより形質転換体を得た。
野生型並びに変異型RMMP遺伝子の分泌発現
上に記述した方法で得た形質転換体を、予め500mlのバッフル付き三角フラスコで調製した100mlのYPD液体培地にて30℃24時間200rpmで振とう培養を行った後、遠心して得た菌体を2倍量のYPGal液体培地に再懸濁し、滅菌済み同フラスコに移してさらに72〜96時間同様にして振とう培養を行い分泌発現させた。培養終了後、培養液を遠心することにより、当該RMMPを含む培養上清を得た。
MCA及びPAの測定、ならびにC/P比の評価
上記のようにして得られた当該RMMPを含む培養上清について、MCA及びPAを測定し、C/P比を算出した。結果を表1に示す。
94, 2001)。
265位又は266位のアミノ酸を置換することでC/P比が高まることが本発明により初めて見出されたものである。
部位特異的変異を導入した改良型RMMP遺伝子の発現ベクターの作製(IV)
続いて、配列番号3のアミノ酸配列において、81位のアミノ酸であるスレオニンがグルタミン又はアスパラギン酸に置換された変異を有するRMMP遺伝子の発現ベクターを作製した。
6Aspのアミノ酸置換を有する改良型RMMPをコードする遺伝子を作製した。この改良型RMMP遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、pRMMP−T81DQ265EQ266Dとした。
これらの改良型RMMP遺伝子を含むプラスミドベクターを便宜上、pRMMP−E19VT81QQ265EQ266E,pRMMP−E19VT81QQ265EQ266D,pRMMP−E19VT81QQ265DQ266E,pRMMP−E19VT81QQ265DQ266D,pRMMP−E19AT81QQ265EQ266E,pRMMP−E19AT81QQ265EQ266D,pRMMP−E19IT81QQ265EQ266E,pRMMP−E19IT81QQ265EQ266D,pRMMP−E19IT81QQ265DQ266E,pRMMP−E19IT81QQ265DQ266Dとした。
実施例8〜10に記載した方法に従って、実施例11で作製した発現ベクターで出芽酵母MC16を形質転換し、該形質転換体を液体培養して改良型RMMPを含む培養上清を取得した。この培養上清を用いてC/P比の評価を行った結果を表2に示す。
さらに19位のアミノ酸残基の置換と組み合わせた場合にも、野生型のRMMPと比べて高いC/P比(表1中のmutant35〜44)を示すことが確認でき、特に、Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Gluの変異を有するRMMPにおいては、C/P比が野生型のRMMPに比べて4.8倍も上昇していることが確認できた。
野生型及び変異型RMMPの精製、ならびに精製標品の評価
野生型RMMP遺伝子、及び、Glu19Val/Gln266Glu,Glu19Val,Glu19Ala,Gln266Glu,Gln266Asp,Glu19Ala/Gln266Glu,Gln265Glu,Gln265Asp,Gln265Glu/Gln266Glu,Gln265Glu/Gln266Asp,Gln265Asp/Gln266Glu,Gln265Asp/Gln266Asp,Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Asp並びにGlu19Val/Gln265Asp/Gln266Aspのアミノ酸置換を有する変異型RMMP遺伝子を含む発現ベクター
を保持する出芽酵母MC16を、先に述べた方法により培養し、該RMMPを分泌発現させた。遠心して得られた培養上清について、50mM 酢酸ナトリウムpH5.5の緩衝液で平衡化したHiTrap Q HP(GE ヘルスケア社製)を充填したカラムを通し、RMMPタンパクを吸着させた。同緩衝液でカラムを洗浄した後、0.3M NaClの緩衝液にて溶出した。RMMPを含む画分はスキムプレート(1%スキムミルク(ディフコ社製)、100mM 酢酸緩衝液 pH5.2、1%寒天)に2μlを乗せ、37℃で10分間インキュベートし、タービットハローの出現で検出した。
このようにして得られた精製RMMPについて、MCAを測定した結果を表3に示す。尚、タンパク質の定量はBCA Protein Assay Reagent(Pierce製)で行った。
乳清乾燥物重量測定試験
チーズの収量は、凝乳酵素を商業的に用いる際に重要な性質の一つである。ミルクを凝固させる際に流出される乳清中に含まれる乾燥物重量はチーズの収量を比較する上で有効で
あり、乾燥重量が少ないということは、チーズの収率が高いことを示している。
そこで、酵母にて発現させた野生型RMMPとE19V/Q266E RMMPを用いた乳性乾燥物重量測定試験を挙げる。
市販の低温殺菌無調製牛乳(タカナシ乳業)500gをビーカーに入れ、32℃に保温する。保温した牛乳が32℃に達した所で、D‐(+)グルコノ‐1,5‐ラクトン(D‐グルコン酸δ‐ラクトン、和光純薬製)を0.4g添加、攪拌後、塩化カルシウム(和光純薬製)を終濃度1mMになるよう徐々に添加し、攪拌する。試薬を添加後、凝乳酵素を2,000Mu添加し、1分間攪拌し、保温する。凝乳酵素を添加してから30分後をRenneting timeとし、カードを1〜1.5cm角に切断し、10分間放置する。放置後、カードを緩やかに崩す。時折カードを穏やかに攪拌しながら、20分間保温する。保温後、ビーカーを37℃のインキュベーターへ移し、内部の温度を37℃まで上昇させる(1分間に0.5℃上昇)。カードが37℃に達した所で、時折緩やかに攪拌しながら更に30分間放置する。放置後、ガーゼにてカードと乳清を分離させる。回収したカードはガーゼに包み、チーズ作製用モールドに入れ、加圧(5 MPa、90分間)し、更に乳清を流出させ、回収する。回収した全ての乳清を混合し、定性濾紙No.1(ADVANTEC)により濾過したものを全乳清とする。
予めビーカーを乾熱機にて105℃で乾燥させておく。乾熱機から取り出したビーカーをデシケーターに入れ、30分以上経過した後に、重量を測定する。そのビーカーに上記で得た乳性約25gを入れ、乾熱機にて105℃, 12〜15時間以上乾燥させる。乾燥後、ビーカーをデシケーターに入れ、30分以上経過した後に、重量を測定する。予め測定したビーカー重量を差し引いた値を乾燥重量とする。尚、全て2連で行った。
このようにして得られた15ロットの乳性中の乾燥物含有量、及び全乾燥物重量を表4に示した。
Claims (10)
- 配列番号3に対して少なくとも75%同一性を有するアミノ酸配列を含み、以下の(A)及び(B)から選択される少なくとも1つの変異を有し、凝乳活性を有する改良型プロテアーゼ:
(A)配列番号3の265位のグルタミンに相当するグルタミンの酸性アミノ酸への置換、及び
(B)配列番号3の266位のグルタミンの酸性アミノ酸への置換。 - 以下の(A)および(B)からなる群より選択される請求項1に記載の改良型プロテアーゼ:
(A)配列番号3または43のアミノ酸配列において、265位のグルタミン及び/又は266位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
(B)配列番号3または43のアミノ酸配列において、265位のグルタミン及び/又は266位のグルタミンが酸性アミノ酸に置換され、かつ、265位及び266位以外の位置において10個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。 - 前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸又はアスパラギン酸である、請求項1または2に記載の改良型プロテアーゼ。
- 配列番号3のアミノ酸配列において、19位のアミノ酸が、バリン、アラニン、イソロイシン又はロイシンに置換されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の改良型プロテアーゼ。
- 配列番号3のアミノ酸配列において、81位のアミノ酸がグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の改良型プロテアーゼ。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の改良型プロテアーゼをコードするDNA。
- 請求項6に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項7に記載の発現ベクターが導入された形質転換細胞。
- 前記形質転換細胞がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項8に記載の形質転換細胞。
- 請求項8又は9に記載の形質転換細胞を培養し、該培養液中に凝乳活性を有するプロテアーゼを蓄積させる工程を含む、凝乳活性を有する改良型プロテアーゼの製造方法。
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