JPH05103669A

JPH05103669A - 低耐熱性プロテアーゼとその関連物及びその生産法

Info

Publication number: JPH05103669A
Application number: JP3263878A
Authority: JP
Inventors: Takashi Yamashita; 山下　　隆; Susumu Azuma; 晋東; Toshihiko Azuma; 俊彦東; Haruo Machida; 晴夫町田; Shinjiro Iwasaki; 慎二郎岩崎; Teruhiko Beppu; 輝彦別府
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1991-10-11
Publication date: 1993-04-27
Anticipated expiration: 2015-02-21
Also published as: US5332668A; EP0536770A1; JP3012377B2

Abstract

(57)【要約】【目的】耐熱性の低いプロテアーゼを、微生物を用い
て効率よく生産させる。【構成】プロテアーゼ生産菌の突然変異体の内から、
生産性は低いが耐熱性の低下したプロテアーゼを生産す
る変異株を選択し、この酵素の遺伝子を他の微生物で発
現させる。さらに、部位特異的変異により一層耐熱性の
低い酵素を生産させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、低耐熱性の変異プロテ
アーゼ、これを生産するために必要な遺伝子及び遺伝子
を含むプラスミド、そのプラスミドを含む微生物、さら
にその微生物を用いたプロテアーゼの生産法、特にチー
ズ製造に用いる凝乳酵素に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】古くからチーズ製造に用いるプロテアー
ゼすなわち凝乳酵素として、仔ウシレンネットが使用さ
れている。仔ウシレンネットの凝乳活性の大部分は酸性
プロテアーゼであるキモシンが占めているが、乳中のカ
ゼインに対する特異性が高いこと及び耐熱性が低いこと
がキモシンが優れた凝乳酵素である理由となっている。

【０００３】しかし、仔ウシの屠畜数の減少に伴い、仔
ウシレンネットの安定した供給が困難となり、現在では
代替酵素として、ムコール・プシルス（Mucor pusillu
s）の生産するムコールレンネット（ＭＲ）（特公昭４
０−１８８３０号）を始めとするいわゆる微生物レンネ
ットが凝乳酵素のかなりの部分を占めている。

【０００４】しかし、これらの酵素には、凝乳酵素の性
質として重要であるＣ／Ｐ比（プロテアーゼ活性に対す
る凝乳活性の比）が低いものが多く、チーズの風味を損
なうものがある。また、比較的耐熱性が高く、チーズ製
造時のクッキング工程で失活しない酵素が残存するため
に、熟成中に苦みペプチドを生じるものも多い。

【０００５】これらの欠点を解消するために、遺伝子工
学的手法により、仔牛キモシンの遺伝子を大腸菌等に導
入し、生産させることに成功している（特公昭６２−４
０９９９号）。

【０００６】また、微生物レンネットの中では性質の優
れているＭＲを化学修飾することにより耐熱性を低下さ
せること等が試みられている（特公平２−１８８３４
号、特開昭６１−１８５１８６号等）。

【０００７】しかし、これらの方法によりある程度の成
果は得られているが、未だ十分なものではない。したが
って、Ｃ／Ｐ比が高いとともに、耐熱性の低い凝乳酵素
が望まれている。

【０００８】一方、ＭＲ遺伝子はクローニングされてお
り（Tonouchi, N. et al. Nucleic Acids Res. 14, 755
7-7568 (1986)）、酵母で発現させることが本発明者ら
により開示されている（Yamashita, T. et al. Mol. Ge
n. Genet. 210, 462-467 (1987)）。

【０００９】しかし、ＭＲ遺伝子の酵母での発現に用い
たプラスミドはいずれもLEU2遺伝子の一部を欠失してお
り、酵母でのトランスフォーメーション効率が高くな
い。またターミネーター結合部に余分な配列を持ってい
たり、全２μｍＤＮＡの配列を持つために、加工がしに
くいなど取扱いに不便な点があり、またプラスミドが不
安定であるなどの問題点があった。

【００１０】そこで、酵母を用いて性質の優れた凝乳酵
素を安定して供給させるための発現手段が望まれてい
る。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決し、耐熱性の低いプロテアーゼを、微生物を用い
て効率よく生産させることを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、プロテアーゼ生産
菌の突然変異体の内から、生産性は低いが耐熱性の低下
したプロテアーゼを生産する変異株を見出し、この酵素
の遺伝子を他の微生物で効率よく発現させることによ
り、本発明を完成させた。

【００１３】すなわち本発明は、低耐熱性の変異プロテ
アーゼ、これを生産するために必要な遺伝子及び遺伝子
を含むプラスミド、そのプラスミドを含む微生物、さら
にその微生物を用いたプロテアーゼの生産法を提供する
ものである。

【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。＜１＞本発明の低耐熱性プロテアーゼ本発明の低耐熱性プロテアーゼは、配列番号１において
１〜３６１のアミノ酸番号で表されるアミノ酸配列を有
し、このアミノ酸配列のうち１０１番目のアミノ酸がス
レオニンに置換されているプロテアーゼ、あるいはさら
に１８６番目のアミノ酸がグリシン以外の他のアミノ酸
に置換されているプロテアーゼ、又は配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列のうち１８
６番目のアミノ酸がグリシン以外の他のアミノ酸に置換
されているプロテアーゼである。

【００１５】本発明の低耐熱性プロテアーゼは、耐熱性
が比較的高いプロテアーゼを生産する微生物から低耐熱
性プロテアーゼを生産する突然変異株を作製し、この突
然変異株から変異プロテアーゼの遺伝子を単離し、この
遺伝子、あるいは元株から未変異プロテアーゼの遺伝子
を単離し、これらを組み合わせた改変遺伝子をベクター
に組み込み、できたプラスミドを微生物に導入し、得ら
れた形質転換体を培養することにより得られる。

【００１６】また、前記改変遺伝子を部位特異的変異
（site-directed mutagenesis）によってさらに改変す
ることにより本発明のプロテアーゼのうち前記のものと
異なるプロテアーゼを得ることができる。

【００１７】以下、これらの操作について説明する。（１）低耐熱性プロテアーゼ生産変異株の作製人為的突然変異誘発処理により、耐熱性の低い凝乳酵素
を生産する変異株を作製することができる。変異株作製
に使用する元株としては、凝乳酵素として使用可能なプ
ロテアーゼを生産する微生物であれば使用することがで
きるが、酵素の精製の容易を考慮し、菌体外プロテアー
ゼを生産するものが好ましい。

【００１８】このような微生物として、ムコール・プシ
ルス、ムコール・ミーハイ(Mucor miehei)、エンドシア
・パラシティカ(Endothia parasitica)等を挙げること
ができ、この中では、ムコール・プシルスが好ましい。

【００１９】変異処理は特に限定されず、紫外線照射の
ような物理的な方法、あるいはＥＭＳ(ethyl methanesu
lfonate)、ＮＴＧ(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanid
ine)等の突然変異誘発剤による処理等、一般に変異に用
いられる方法を使用することができる。

【００２０】以下に、ムコール・プシルスにおける変異
株作製の例を説明する。ムコール・プシルスをコージプ
レート上で３７℃で培養し、胞子を形成させる。この胞
子をガラス製スプレダーを用いて滅菌水に懸濁させ、ニ
トロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguani
dine）を加え、死滅率９０％となるように室温で５〜２
０分処理する。これを、コージプレートに適量蒔き、３
７℃で培養する。

【００２１】（２）突然変異株の選択耐熱性の低下した酵素を生産する変異株の選択は、変異
処理を行った微生物の培養液をそのままあるいは濃縮
し、加熱処理を行い、加熱処理の前後の凝乳活性を比較
することにより、行うことができる。

【００２２】凝乳活性を測定する方法としては、例え
ば、10mM 塩化カルシウム水溶液に溶かした１０％スキ
ムミルク１ｍｌに０．０１ｍｌの試料を加え、３７℃で
保温し凝乳するまでの時間を測定する方法がある。凝乳
活性は凝固時間の逆数に比例するので、凝乳に要した時
間を加熱の前後の試料で比較することにより、熱処理後
の残存活性率を求めることができ、酵素間で耐熱性を比
較することができる。

【００２３】例えば、前記変異処理を行ったムコール・
プシルスの培養上清に３倍量の冷エタノールを加えてタ
ンパクを沈澱させ、この沈澱を50mM酢酸ナトリウム pH
6.0,５mM EDTA 緩衝液に溶解させる。この溶液の一部を
取り、５５℃で２０分加熱した後、直ちに冷却して室温
に戻す。

【００２４】この試料０．０１ｍｌを10mM 塩化カルシ
ウム水溶液に溶かした１０％スキムミルク（ディフコ(D
IFCO LABORATORIES)社製）１ｍｌに加え、３７℃で保温
し凝乳するまでの時間を、加熱処理の前後で測定し、熱
処理後の残存活性率を求め、元株の生産するＭＲの耐熱
性を大きく下回る変異酵素を生産する変異株を選択す
る。

【００２５】このようにして選択された突然変異株から
変異プロテアーゼ遺伝子を単離し、この遺伝子、あるい
はさらに改変した遺伝子を他の微生物で発現させること
により本発明の低耐熱性プロテアーゼを得ることができ
る。変異遺伝子の単離、プラスミドの作製等の具体的操
作については以下に述べる。

【００２６】＜２＞本発明の低耐熱性プロテアーゼをコ
ードする遺伝子（１）変異遺伝子の単離前記変異処理により、耐熱性の低下したプロテアーゼが
効率よく生産される場合には、その変異株をそのままプ
ロテアーゼ生産に使用することができるが、変異処理に
よりターゲットとなる遺伝子以外にも変異が生じ、生産
量が減少することが多い。このような場合は、プロテア
ーゼ遺伝子を単離し、遺伝子組換え技術により、生産量
を増加させることが好ましい。

【００２７】また、遺伝子が単離されれば、タンパク工
学的手法により、さらに変異を導入することができる。
遺伝子を単離するには、通常の遺伝子のクローニング方
法を使用することができる。例えば、酵素を精製し、ア
ミノ酸配列を決定し、この配列をもとに合成オリゴヌク
レオチドプローブを作製し、ハイブリダイゼーションに
より遺伝子ライブラリーから選択する。

【００２８】ＤＮＡの切断、連結、トランスフォーメー
ションの方法は、各操作に使用する市販の酵素、コンピ
テントセルに添付されている説明書に記載されている。
また、これらの操作、遺伝子の塩基配列の決定、ハイブ
リダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法
は、Molecular cloning(Maniatis T. et al. Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press)に記載されている。

【００２９】例えば、ＭＲ遺伝子はすでにクローニング
されているので、ＭＲ遺伝子を含むプラスミドＪＰ１(M
ol. Gen. Genet. 210, 462-467 (1987))からＭＲ遺伝子
を抜き出し、これをプローブとしてプラークハイブリダ
イゼーション等を行うことにより、前記操作により作製
された低耐熱性プロテアーゼを生産するムコール・プシ
ルス変異株から、低耐熱性プロテアーゼ遺伝子を得るこ
とができる。

【００３０】得られた遺伝子が全長に満たない場合、あ
るいは変異箇所が異なる複数の変異遺伝子が得られた場
合は、変異遺伝子どうし、あるいは変異遺伝子と未変異
遺伝子とを繋ぎ代えることにより、さらに異なる変異遺
伝子を作製することができる。

【００３１】（２）部位特異的変異の導入凝乳酵素遺伝子が単離されれば、さらに変異を計画的に
導入する事ができ、より耐熱性の低い酵素遺伝子を作製
することが期待される。また、Ｃ／Ｐ比の変化した酵素
を得ることも期待される。

【００３２】変異の導入は、例えば、両末端に制限酵素
切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未
変異遺伝子の相当する部分と入れ換える事により、変異
を導入することができる（カセット変異法）。しかし、
変異点近傍に適当な制限酵素部位が存在しない場合には
この方法は困難であることが多い。

【００３３】これに対して、部位特異的変異は、制限酵
素部位の存否に拘らず変異を導入することができるので
より好ましい。部位特異的変異導入法としては、Gapped
duplex法、Kunkel法がある。Kunkel法は、未変異の遺
伝子を１本鎖ファージにクローン化しておき、変異点に
ミスマッチを含む合成ＤＮＡをプライマーとしてこれの
相補鎖を合成し、得られた変異を含む相補鎖だけを鋳型
として、新しいファージおよび複製型ＤＮＡを作るとい
う原理に則っている。

【００３４】部位特異的変異はキットが市販されてお
り、これを使用することができる。変異株の選択は、培
養液の凝乳活性を測定することにより行うことができ
る。

【００３５】＜３＞本発明のプラスミド上記のようにして得られた遺伝子を、適当な宿主−ベク
ター系に導入する。宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵
母、糸状菌、培養細胞等を挙げることができるが、ベク
ターの安定性、活性を有する形での発現、あるいは菌体
外生産の可否等を考慮すると、酵母が好ましい。

【００３６】酵母としては、サッカロマイセス・セレビ
シエ(Sacchromyces cerevisiae) ＳＨＹ３、Ｄ１３−１
Ａ、ＭＣ１６等の株を挙げることができる。これらの菌
株は栄養要求性変異を有するので、それらの変異を相補
する遺伝子を酵母中で複製可能なプラスミドに組み込む
ことにより、ベクターを作製することができる。

【００３７】例えば、ＭＣ１６株は生育にロイシンを要
求する。この要求性を相補する遺伝子をプラスミドにの
せて酵母に入れたとき、ロイシン非要求性となったもの
は、一般にこのプラスミドを保持していると考えられ
る。

【００３８】酵母中で複製可能なプラスミドとしては、
いわゆるYIp、YRp、YEp、YCpのいずれのタイプも使用す
ることができるが、コピー数及び安定性の面からYEpタ
イプが好ましい。これらのプラスミドは一般に不要な配
列を含んでいるので、プラスミドの安定性のため、ある
いはプラスミドの改変を容易にするために、必要でない
配列を削除して用いることが好ましい。

【００３９】例えば、ＹＥｐ１３（J.R.Broach et al.
Gene 9, 287 (1980)）を材料として作製したプラスミド
ＪＳ３（実施例中で詳述する。）を好ましいベクターと
して挙げることができる。

【００４０】適当な宿主−ベクター系を選択、作製した
次のステップとして、変異遺伝子に適当なプロモータ
ー、必要に応じてターミネーターを連結することが必要
となる。ただし、宿主内で元株のプロモーターが効率よ
く機能する場合はこの限りではない。

【００４１】プロモーターとしては、宿主が大腸菌であ
れば、trp、lac、taq、λP_L等を使用することができ
る。宿主が酵母であれば GAL7、ADH、TPI、PHO5等のプ
ロモーターが好ましく、これらの中では、GAL7(Nogi Y.
et al. Nucl. Acids Res. 11,8555-8568 (1983)) が強
力であり、誘導が可能であるので特に好ましい。

【００４２】ターミネーターとしては、TPI、GAPDH、GA
L10等を挙げることができる。上記プロモーター、本発
明の低耐熱性プロテアーゼ遺伝子、上記ターミネーター
をこの順序で連結したものを上記ベクターに挿入するこ
とによって、本発明のプラスミドを作製することができ
る。

【００４３】宿主としてサッカロマイセス・セレビシエ
ＭＣ１６、ベクターとしてＪＳ３を使用し、GAL7プロモ
ーター、GAL10ターミネーターを用いて作製したプラス
ミドの例を後述の実施例に示した。

【００４４】＜４＞本発明のプラスミドを保持するサッ
カロマイセス・セレビシエ上記のようにして作製したプラスミドを微生物に導入す
ることにより、本発明の低耐熱性プロテアーゼを生産す
る微生物を作製することができる。これは、プラスミド
を微生物細胞にトランスフォーメーションすることによ
り得られる。

【００４５】サッカロマイセス・セレビシエのトランス
フォーメーション法の例を以下に説明する。ＹＰＤ培地
（1% イースト・エキストラクト(yeast extract)（ディ
フコ社製）, 2% バクトペプトン(bactopeptone)（ディ
フコ社製）, 2% グルコース）で１晩培養したサッカロ
マイセス・セレビシエを、新鮮なＹＰＤ培地に１０％接
種し、３０℃で４時間培養する。培養液1.5mlを卓上遠
心機で軽く遠心して集菌し、0.2M LiSCN（関東化学株式
会社製）でリンスしたのち、0.02mlの1M LiSCNに懸濁す
る。

【００４６】プラスミド溶液０．０１ｍｌ（約１〜１０
μｇ）と０．０３ｍｌの７０％ＰＥＧ４０００を加え
てよく混合し、３０℃で１時間保温する。これに０．１
４ｍｌの滅菌水を加え、希釈した後２枚のSDahプレート
（0.67% バクト・イースト・ナイトロジェンベース w/o
アミノ酸(Bacto-yeast nitrogen base w/o amino aci
d), 2% グルコース, 0.002% アデニン硫酸塩(adenine s
ulfate)，0.002% ヒスチジン塩酸塩(L-histidine-HC
l)，2%寒天）にプレーティングする。３０℃で２〜３日
インキュベートし、形質転換体を得る。

【００４７】このようにしてサッカロマイセス・セレビ
シエＭＣ１６株に後述の実施例で説明するプラスミドＪ
Ｓ５２，ＪＳ５３，ＪＳ５３Ｒ，ＪＳ５２５をトランス
フォーメーションして得られた形質転換体は、それぞれ
微工研菌寄第１２５１１号、第１２５１４号、第１２５
１２号、第１２５１３号として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。

【００４８】＜５＞低耐熱性プロテアーゼの生産法前記プラスミドを保持する形質転換体を培養することに
より、本発明の低耐熱性プロテアーゼを生産することが
できる。培養に際しては、誘導可能なプロモーターを使
用した場合には誘導を行うことが好ましい。

【００４９】以下に、上記サッカロマイセス・セレビシ
エ形質転換体の培養法の例を説明する。形質転換体を５
００ｍｌ容坂口フラスコに入れた５０ｍｌのＹＰＤ培地
で３０℃、２日間振盪培養し、菌体を増殖させる。培養
液を１０００×ｇで５分間遠心して集菌し、１００ｍｌ
のＹＰＧａｌ培地（1% イースト・エキストラクト, 2%
バクトペプトン, 4%ガラクトース(和光純薬工業株式会
社製)）に再び懸濁し、５００ｍｌ容坂口フラスコで３
０℃で３日間振盪培養する。

【００５０】生産された変異酵素の精製は、通常のタン
パクの精製方法を使用することができる。すなわち、イ
オン交換、ゲル濾過等のクロマトグラフィー、硫安塩
析、有機溶媒沈澱等を挙げることができる。

【００５１】ＭＲの場合の精製方法を以下に例示する。
培養液を１０００×ｇで１０分間遠心して得た上清200m
lを20mM酢酸ナトリウム pH6.0, 5mMEDTA 緩衝液で２倍
に希釈し、同緩衝液で平衝化した30mlの DEAE-トヨパー
ル(TOYOPEARL) 650Mイオン交換体(東ソー株式会社製)を
通す。菌体外に分泌されたＭＲ蛋白は、培養上清中の一
部の色素と共に交換体に吸着され、これを0.4M 食塩を
加えた同緩衝液で溶出する。

【００５２】精製された酵素は、凍結乾燥、限外濾過
膜、有機溶媒沈澱等により濃縮することができる。

【００５３】

【実施例】本発明を実施例により更に詳細に説明する。
尚、プラスミドの作製工程を示す図中のＤＮＡ配列の機
能を表す記号を図１２に示した。

【００５４】本実施例におけるプラスミド構築等の各々
の段階で用いる一般的な操作を、以下に示す。

【００５５】（制限酵素反応）特に断わらないかぎり、
制限酵素反応は、次のような組成で行った。ＤＮＡ０．１〜５．０μｇ汎用緩衝液（１０×）１０μｌ制限酵素（宝酒造）２〜１２単位反応液量１００μｌ汎用緩衝液は、5〜10mMのジチオスライトール、100〜50
0mMのTris-HClあるいはTris-酢酸、100mMの塩化マグネ
シウムあるいは酢酸マグネシウム、及び適当な濃度の塩
化ナトリウム、塩化カリウムあるいは酢酸カリウムを含
むpH7.5〜8.5の緩衝液である。

【００５６】反応液を３７℃の恒温槽中で１時間反応さ
せた後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行い、適当
量のTE(10mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM EDTA)に再溶解させ
た。ここでフェノール抽出とは、等量のＴＥ飽和フェノ
ール（フェノールは和光純薬株式会社製）を加えて充分
攪拌したのち遠心して水層を回収し、これに等量のフェ
ノール・クロロホルム（ＴＥ飽和フェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール＝５０：４９：１）を加え
攪拌遠心後、水層を回収し、水層に残存するフェノール
をジエチルエーテルを用いて抽出除去する操作をいう。
また、エタノール沈澱とは、ＤＮＡ溶液に、１／１０量
の３モル酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールを加
え攪拌後、−８０℃で１０分間冷却し遠心して上清を除
去し、沈澱を得る操作、及び必要に応じてこの沈澱を減
圧乾燥させた後適当な溶媒に溶かす操作をいう。

【００５７】（ＤＮＡ末端の平滑化）制限酵素切断末端
は、宝酒造株式会社製のDNA ブランティング・キット(b
lunting kit)を使い、T4 DNA ポリメラーゼの5'→3'ポ
リメラーゼ活性と3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を利用
して平滑化した。

【００５８】（電気泳動）４０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸，
２ｍＭＥＤＴＡ緩衝液を用い、ミューピッド(Mupid)-2
電気泳動槽（コスモ・バイオ株式会社製）を用いて、１
００Ｖ、または５０Ｖの定電圧で電気泳動を行った。泳
動用ゲルに使用するアガロースは、シーケム(Seakem)ME
またはGTG（宝酒造株式会社から購入）を用い、分離す
べき断片の大きさに応じて、０．８〜４％の濃度で使用
した。

【００５９】（ＤＮＡ断片の精製）ＤＮＡ精製キットと
してGENECLEAN IIキット(BIO 101社製)を用い、ＤＮＡ
断片を含むアガロースをヨウ化カリウム溶液で溶かした
後、ＤＮＡ断片をガラス粉末に吸着させ、低塩濃度の緩
衝液で溶出させた。

【００６０】（ＤＮＡのライゲーション）制限酵素消化
されたＤＮＡ断片、あるいはさらに必要に応じて平滑化
された断片は、T4 DNA リガーゼを用いたDNA ライゲー
ションキット（宝酒造株式会社製）を使用してライゲー
ション（連結）を行った。特に、３断片を連結する場合
には、ベクターの含量を１／３程度に減らし、ライゲー
ション効率の向上を図った。

【００６１】＜１＞低耐熱性凝乳酵素を生産する変異株
の取得ＭＲを生産するムコール・プシルスＩＦＯ４５７８
（＋）株に変異処理を施し、耐熱性の低下したＭＲを分
泌する変異株を取得した。以下、詳説する。

【００６２】（１）変異処理ムコール・プシルスＩＦＯ４５７８（＋）株をコージプ
レート（コウジ抽出液（（株）糀屋三左衛門から購入：
糖度９％まで希釈したのち水酸化ナトリウムでpH6.0に
合わせた）、２％寒天）上に生育させ、３７℃で３日か
ら１週間保温することにより胞子を形成させた。この胞
子をガラス製スプレダーを用いて滅菌水に懸濁させた。

【００６３】この胞子懸濁液に、終濃度200μg/mlのニ
トロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguani
dine，シグマ(SIGMA CHEMICAL CO.)社製）を加え、死滅
率９０％となるように室温で５〜２０分処理した。これ
を、コージプレートに適量蒔き、３７℃で保温した。
翌日生じた微小な菌糸をひと塊づつ、１３ｍｍφ試験管
に入れた２ｍｌのコージ培地に植菌し、３７℃で４日間
振盪培養した培養上清を凝乳活性（以下、ＭＣＡとい
う。）測定用の試料とした。また、菌体は−８０℃で保
存した。

【００６４】（２）変異株の検索上記培養上清に３倍量の冷エタノールを加えてタンパク
を沈澱させ、この沈澱を50mM酢酸ナトリウム pH6.0, ５
mM EDTA 緩衝液に溶解させた。この溶液の一部を取り、
５５℃で２０分加熱した後、直ちに冷却して室温に戻し
た。

【００６５】10mM 塩化カルシウム水溶液に溶かした１
０％スキムミルク(ディフコ社製)１ｍｌに０．０１ｍｌ
の試料を加え、３７℃で保温し凝乳するまでの時間を、
加熱処理の前後で測定し、熱処理後の残存活性率を求め
た。このようにして元株であるＩＦＯ４５７８（＋）株
の生産するＭＲの耐熱性を大きく下回る変異酵素を生産
する変異株を選択した。その結果、ＩＦＯ４５７８
（＋）株よりも大きく耐熱性の低下した変異株が取得さ
れ、３０１−７株と命名した。

【００６６】＜２＞変異ＭＲ遺伝子の単離（１）変異株染色体ＤＮＡの取得上記で得た変異株３０１−７株をコージプレート上に生
育させ、３７℃で３日から１週間保温することにより胞
子を形成させた。この胞子をガラス製スプレダーを用い
て滅菌水に懸濁させた。この胞子懸濁液を、１００ｍｌ
のＹＰＧ液体培地を入れた５００ｍｌ容坂口フラスコ１
０本に、１本あたり約10⁸個となるように植えて、３７
℃で４日間培養した。菌体が０．５ｍｍ〜２ｍｍ程度の
大きさのペレットを形成したところで、培養液を濾過し
余分な水分を除いて、湿重量２６．７ｇの菌体を得た。

【００６７】この菌体を液体窒素で凍らせたのち、
（株）日本精機製作所製ＡＭ−７形ホモジナイザーを
用いて、液体窒素冷却下で粉末化した。これを100mlの
0.5M EDTA pH8.0, 0.5% SDS溶液に懸濁し、終濃度100mg
/mlのプロテイネースＫ（株式会社ニッポンジーンから
購入）を加え55℃で１晩保温した。これを２枚重ねにし
たガーゼで濾過した後、等量のフェノールを加え、攪拌
後水層を回収する処理を２回繰り返した。水層を等量の
ＴＥで希釈したのち、１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムと１／２倍量のエタノールを加え、核酸を沈澱させ、
この沈澱を１ｍｌのＴＥに溶かした。必要に応じて塩化
セシウム密度勾配遠心を行うことにより精製した。

【００６８】（２）染色体ＤＮＡライブラリーの作製３０１−７株のＤＮＡ約１０μｇを２単位の制限酵素Sa
u3AIで部分消化した。反応開始後１分、２分、４分、１
１分後にサンプリングし、その一部をアガロースゲル電
気泳動を行い、１０ｋｂ以上の長さの断片が多く含まれ
る反応液を選択した。これをフェノール処理後、エタノ
ール沈澱を行い、沈澱を４μｌのＴＥに溶かした。

【００６９】ライブラリー用のベクターとしては、λEM
BL3 BamHI Arms（プロメガ(PromegaCorporation)社から
購入）あるいはλDASH/BamHI（ストラタジーン(STRATAG
ENE)社から購入）1μgを使用し、これに上記で得られた
ＤＮＡフラグメントを、ライゲーションキット（宝酒
造）を用いて結合させた。これをアマシャム・ジャパン
株式会社のin vitro packaging kitまたはGigapack pac
kaging kit（ストラタジーン社製）を用いてインビトロ
・パッケージングを行い、指示菌である大腸菌ＬＥ３９
２とともに寒天培地に重層してファージプラークを得
た。

【００７０】ライブラリーの作製を２回行ったところ、
いずれの場合も２０００〜７０００個のプラークを得る
ことができた。

【００７１】（３）変異ＭＲ遺伝子の単離未変異ＭＲ遺伝子を含むプラスミドＪＰ１(Mol. Gen. G
enet. 210, 462-467 (1987))（後述）を制限酵素BamHI
と制限酵素BglIIで消化し、1.4kb断片を回収し、この断
片２５ｎｇに対して、アマシャム社のMultiprime DNA l
abelling systemsを用いて、ランダムプライマー法によ
り³²Pで標識し、プラークハイブリダイゼーション用の
プローブとした。

【００７２】前記プローブを使用して前記ライブラリー
のプラークハイブリダイゼーションを行った。前記組換
えファージのプラークを、ナイロンメンブレン：Colony
/PlaqueScreen (NEN Research Products社製)に移し取
り、メンブレンに添付されているプロトコールに従っ
て、0.5N NaOHと1.0M Tris-HCl pH7.5で処理しメンブレ
ン上にＤＮＡを固定した。プロトコールで推奨された方
法により、６５℃でプレハイブリダイゼーション及びハ
イブリダイゼーションを行い、ついで洗浄、乾燥後ｘ線
フィルムに露出させ、オートラジオグラムを撮った。フ
ィルム上のポジティブシグナルの位置から、プローブが
ハイブリダイズしたプラークを同定した。

【００７３】１回目に作製したライブラリーからは１
個、２回目に作製したライブラリーからは３個のポジテ
ィブプラークが得られた。ポジティブプラークのファー
ジを0.5mlのＳＭ(50mM Tris-HCl pH7.5,0.58% NaCl 0.2
% MgSO₄・7H₂O, 0.01% ゼラチン（ディフコ社製））に懸
濁し、ファージ懸濁液とした。これを、指示菌である大
腸菌ＬＥ３９２とともに、10mM MgSO₄を添加したＬＢプ
レート上に重層した。プラークが形成した後、重層寒天
をかき取り、ＳＭに懸濁させ、濃厚ファージ液を得た。

【００７４】この濃厚ファージ液０．０４ｍｌと、１晩
培養のＬＥ３９２の培養液０．０８ｍｌと、10mM MgSO₄
を添加したＬＢ培地１００ｍｌとを入れた５００ｍｌ容
坂口フラスコを３７℃で６時間振盪培養した。ファージ
による指示菌の溶菌を確認した後、１ｍｌのクロロホル
ムと終濃度１Ｍの食塩を加え、さらに１０分間振盪し、
完全に溶菌させた。

【００７５】溶菌液を８０００×ｇで１０分間遠心し、
上清を回収し、１０ｇのＰＥＧ６０００（和光純薬工業
株式会社製）を加え、４℃で１晩放置した。これを８０
００×ｇで１０分間遠心して得た沈澱を、１ｍｌのＳＭ
に溶かし、終濃度１μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡおよび終
濃度１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを加えて３７℃で３
０分間保温した。この溶液１ｍｌ当り０．５ｇの塩化セ
シウムを加えて溶解し、予め密度を１．６、１．５、
１．４に調整した塩化セシウム（和光純薬工業株式会社
製）溶液各１ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌを遠心管中に重層し
てなる不連続密度勾配上に重層した。

【００７６】これを２０℃、２００，０００×ｇで６時
間遠心後、密度１．４と１．５の塩化セシウム溶液の界
面に収束したファージ粒子を回収した。このファージ粒
子懸濁液の一部をＴＥで希釈し、フェノール処理、エタ
ノール沈澱後４００μｌのＴＥに溶解してファージＤＮ
Ａを得た。

【００７７】次に、サザンブロッティングにより、ＭＲ
遺伝子が含まれるフラグメントの解析を行った。上記で
得られたファージＤＮＡ５μｇを制限酵素PvuII、EcoR
I、HindIIIでそれぞれ消化し、フェノール処理、エタノ
ール沈澱の後、１％アガロースゲルで電気泳動した。

【００７８】泳動後、ゲルを0.25M HClに２０分、 0.6M
NaCl, 0.4N NaOH 溶液に１５分間づつ２回、1.5M NaC
l, 0.5M Tris-HCl(pH7.5)溶液に２０分間、ゆっくり振
盪しながら浸漬した。

【００７９】この後、ゲルを１０×ＳＳＣ（1.5M NaCl
0.15Mクエン酸ナトリウム溶液）に浸した濾紙の上に置
き、さらにその上にナイロンメンブレン：GeneScreen P
lus(NEN Research Products社製)を重ねた。濾紙の端は
１０×ＳＳＣに漬けて、１０×ＳＳＣが吸い上げられる
ようにしておいた。

【００８０】メンブレンの上にさらにペーパータオルを
積み上げて、１０×ＳＳＣがゲル及びメンブレンを通し
て濾紙から吸い上げられるようにした。１晩放置後、メ
ンブレンを純水で簡単に洗浄後、風乾した。これをプラ
ークハイブリダイゼーションと同じ条件で、プローブを
ハイブリダイズさせ、オートラジオグラフを行い、各制
限酵素で切断されたフラグメントのうち、どのフラグメ
ントにＭＲ遺伝子が乗っているかを確認した。

【００８１】その結果、１回目に作製したライブラリー
から得られたファージは、3.5kb EcoRI断片上にＭＲ遺
伝子を乗せている事が分かったので、この断片０．５μ
ｇを電気泳動後のゲルから回収した。

【００８２】一方、プラスミドｐＵＣ１８（宝酒造株式
会社から購入）０．２μｇを制限酵素EcoRIで切断後、
２倍量の1M Tris-HCl pH8.0と大腸菌のアルカリフォス
ファターゼ（宝酒造株式会社から購入）０．３単位を加
え、３７℃で１時間保温し、切断末端の脱リン酸化を行
った。さらにフェノール処理、エタノール沈澱後５μｌ
のＴＥに溶かした。

【００８３】このプラスミドと上記EcoRI断片をライゲ
ーションしたものを大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォー
メーションしてプラスミドｐ３１Ｅを得た。２回目に作
製したライブラリーから得られた３つのファージのうち
の１つ（λ１）は、サザンハイブリダイゼーションの結
果、ｐ３１Ｅとは異なる制限酵素地図を持っていたの
で、ＭＲ遺伝子を持つSalI-HindIII 2kb断片とPvuII-Cl
aI 1kb断片を別個に取り出し、制限酵素SalIとHindII
I、あるいはPvuIIとClaIで消化したpBluescriptII SK+
（ストラタジーン社製）に繋ぎ込んだ。これらをプラス
ミドｐλ１ＳＨ、ｐλ１ＰｖＣとした。

【００８４】以上のようにして得られた変異株由来のＭ
Ｒ遺伝子の塩基配列を、塩基配列決定キット：7-deaza
Sequenase Ver.2 for labeled dCTP kit（東洋紡績株式
会社から購入）を用い、キットに添付のプロトコールに
従ってダイデオキシ法により決定した。また、後に述べ
る部位特異的変異導入箇所近傍の塩基配列の確認もこの
方法で行った。

【００８５】塩基配列決定に用いる１本鎖ＤＮＡは、以
下のようにして得た。まずプラスミドｐ３１Ｅ、ｐλ１
ＳＨ、ｐλ１ＰｖＣを、制限酵素EcoRI、HindIII、Cla
I、HincII、BglII、SalI、BamHI、AccIなどで単独ある
いは２重に消化して得られる断片を、それらと相補性の
ある末端を生じる制限酵素で消化したファージM13 mp18
またはM13 mp19 RF（複製型）ＤＮＡ（宝酒造株式会社
から購入）にサブクローンした。ついで各々のファージ
を持つ大腸菌の培養上清を、上記ＤＮＡ添付のプロトコ
ールに従い、ポリエチレングリコール６０００(PEG600
0)沈澱、フェノール抽出等をすることにより１本鎖ファ
ージを得た。

【００８６】この１本鎖ファージを用いて塩基配列決定
を行った結果、ｐ３１ＥのＭＲ遺伝子は、Ｎ末端から１
０１番目のアミノ酸のコドンが、未変異酵素におけるア
ラニンのコドン（ＧＣＴ）ではなく、スレオニンのコド
ン（ＡＣＴ）となっていた。また、２２３番目以降をコ
ードする部分（下記配列番号１における塩基番号１２２
４より下流）を含んでいなかった。λ１のＭＲ遺伝子
は、１８６番目のアミノ酸のコドンが未変異酵素のグリ
シンでなく、アスパラギン酸のコドン（ＧＡＣ）となっ
ていた。また、５番目までのアミノ酸をコードする部分
（塩基番号５７１より上流）を欠いていた。

【００８７】尚、配列表（配列番号１）に示した塩基配
列及びアミノ酸配列は未変異ＭＲ遺伝子の配列である。
ＭＲはプレプロタンパクとして生産され、１８アミノ酸
からなるシグナルペプチドが切断されてＭＲ前駆体がで
き、さらに４８アミノ酸からなるプロペプチドが切断さ
れて成熟酵素になることが知られている(Mol. Gen. Gen
et. 210, 462-467 (1987))。

【００８８】＜３＞未変異ＭＲ遺伝子発現プラスミドの
作製（１）プラスミドｐ２ΔＢの作製ＭＲ遺伝子を酵母で発現させるためのプラスミドとし
て、ＭＲ遺伝子５’末端側の一部と、GAL7プロモーター
とGAL10ターミネーターを持つプラスミドｐ２ΔＢを、
プラスミドＪＰ１を材料として作製した（図１〜図
６）。

【００８９】このプラスミドＪＰ１は、次のようにして
作製した(Mol. Gen. Genet. 210, 462-467 (1987))（図
１〜２）。ＧＡＬ１０ターミネーター及びＧＡＬ７プロ
モーター配列を有するプラスミドｐＹＦ１０１６(Nogi
and Fukasawa Nucl.Acids Res. 11, 8555 (1983))1.0kb
のHinfI断片を取り出し、BAL31、NcoIでそれぞれ消化し
た後ポリメラーゼ反応により平滑化した。これをプラス
ミドＭ１３ｍｐ１０のSmaI部位に挿入して、Ｍ１３ｍｐ
１０９を得た（図１左上）。このプラスミドは、ＧＡＬ
７プロモーター配列のうち、NcoI部位からＧＡＬ７遺伝
子の開始コドンＡＴＧのＡまでを含む。

【００９０】一方プラスミドｐＪＤＢ２１９の誘導体で
あるプラスミドｐＳＳ２１の平滑化したSalI部位に、Ｍ
Ｒ遺伝子を含むAvaI断片を平滑化して挿入し、ｐＳＳ２
１ＭＲを得た。このプラスミドをHinfIで消化後、HinfI
部位をポリメラーゼ反応により平滑化し、さらにSalIで
消化して得られる595bpのHinfI-SalI断片を取り出し
た。この断片を、BamHI部位を平滑化した後SalIで消化
したＭ１３ｍｐ１０９に挿入し、Ｍ１３ｍｐ１０９ＭＲ
を得た（図１）。尚、前記ＭＲ遺伝子を含むAvaI断片
は、ＭＲ成熟タンパクＮ末端より２０８〜２１３アミノ
酸に相当する合成プローブ（１７ｍｅｒ）を用いて単離
したＭＲ遺伝子を含むプラスミドｐＣＴ１１３(Tonouch
i et al. Nucl. Acids Res. 14, 7557 (1986))より調製
した。

【００９１】ｐＳＳ２１ＭＲのSalI、SacI部位に、Ｍ１
３ｍｐ１０９ＭＲをSalIとSacIで消化し得られる、ＧＡ
Ｌ７プロモーターとＭＲ遺伝子の上流側が連結した断片
を挿入し、プラスミドＪＰ１を得た（図２）。

【００９２】ＪＰ１ＤＮＡ10ngを大腸菌ＪＭ１０９の
コンピテントセル (宝酒造株式会社から購入、052)100
μ1と混合し、氷中で30分放置した。以下使用説明書の
指示に従い、ヒートショックとエクスプレッションを行
ったのちプレートに蒔いて、翌朝、形質転換体のコロニ
ーを得た。

【００９３】プラスミドを保持する形質転換体を、500m
l容の坂口フラスコに入れた200mlのLB培地（10g バクト
・トリプトン(Bacto tryptone), 5g バクト・イースト
・エキストラクト, 5g NaCl, 1g グルコースを1lの水
に溶かし、pHをNaOHで7.5 に合わせ滅菌）に植菌し、５
００ｍｇ／ｌのアンピシリン（株式会社ニッポンジー
ン製）を添加して、37℃で培養した。

【００９４】１５時間後、２５００×ｇで１０分遠心
し、菌体を回収した。７．５ｍｌの50mM Tris-HCl(pH
8.0), 25%シュクロース(和光純薬工業株式会社製) に懸
濁し、５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（シグマ社製）１．５
ｍｌを加え氷中で５分、３ｍｌの0.25M EDTA（株式会社
同仁化学研究所製） pH8.0を加え氷中で５分放置し、
３，７５ｍｌの5M NaClを加えて室温まで温めた。

【００９５】これに１．５ｍｌの１０％ＳＤＳ（ドデシ
ル硫酸ナトリウム(sodium dodecylsulfate)：和光純薬
工業株式会社製）を加え、氷中で30分以上放置した後、
４℃、１０，０００×ｇで３０分遠心した。上清を回収
し、１／４容の５０％ＰＥＧ６０００（和光純薬工業株
式会社製）を加え、４℃で２時間以上放置後、１５００
×ｇで３分間遠心し、上清を捨て、沈澱を回収した。

【００９６】この沈澱を、８ｍｌのＴＥ（10mM Tris-HC
l(pH8.0)、1mM EDTA ）に溶かし、塩化セシウムを加えて
比重１．６２となるようにした。さらに、３０μｌの１
％エチジウムブロマイド（株式会社ニッポンジーン製）
を加え、２０，０００×ｇで１５時間遠心後、プラスミ
ドのバンド部分を採取した。この溶液から、塩化セシウ
ムで飽和させたイソプロパノール（和光純薬工業株式会
社製）でエチジウムブロマイドを抽出除去した後、ＴＥ
に透析することにより塩化セシウムを除き、プラスミド
精製溶液を得た。

【００９７】この様にして精製したプラスミドＪＰ１
ＤＮＡ１０μｇを制限酵素SalIで消化したのち、さら
に制限酵素AccIで消化し、1.OKb SalI-AccI断片を回収
した。この断片を０．２単位の制限酵素AluIで部分消化
するために、反応開始後、５分、１０分、３０分経過時
に、それぞれ原反応液の１／３量づつサンプリングし、
フェノールを加えて酵素反応を停止させた。これらをま
とめてアガロースゲル電気泳動し、0.88kbの断片を回収
した。

【００９８】次いで、プラスミドＭ１３ｍｐ１０９ＭＲ４μｇを制限酵素SalIと制限酵素EcoRIで消化
し、1.1kbの断片を回収した。

【００９９】更に、アンピシリン耐性遺伝子を有するプ
ラスミドｐＢＲ３２２（株式会社ニッポンジーンから購
入）０．５μｇを制限酵素BamHIで消化後、末端を平滑
化し、次いで制限酵素EcoRIで消化した。これをアガロ
ースゲル電気泳動し、4.0kbの断片を回収した。

【０１００】こうして得られた0.88kb、1.1kb、4.0kbの３
断片をライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９にトラ
ンスフォーメーションした。アンピシリン含有プレート
に生ずるコロニーをいくつか選択し、これらからＤＮＡ
を調製し、制限酵素消化解析により、目的とする構造を
持つと思われるプラスミドを選択し、ｐＭＲ−Ａｌｕと
した（図３）。

【０１０１】一方、以下の３断片を連結し、ＧＡＬ７プ
ロモーター、ＭＲ構造遺伝子全長及びＧＡＬ１０ターミ
ネーター、さらにベクター部分にＬＥＵ２遺伝子とＡｐ
^r 遺伝子を含むプラスミドＪＰ２を作製した(Mol. Gen.
Genet. 210, 462-467 (1987))（図４）。

【０１０２】(1)酵母のプラスミドＹＥｐ１３の類縁体
ｐＪＤＢ２０７をBamHIとSphIで消化して得られるベク
ター配列 (2)ＪＰ１をAluIで限定消化した後BamHIで消化して得ら
れる、ＧＡＬ７プロモーターとＭＲ遺伝子３’非コード
領域が短くなった断片 (3)ＧＡＬ１０ターミネーター及びＧＡＬ７プロモータ
ー配列を有するプラスミドｐＹＦ１０１６（上述）から
ＧＡＬ１０遺伝子の下流部分及びターミネーターを含む
０．４２ｋｂのHinfI-NcoI断片を取り出し、SalI、Pst
I、SphIポリリンカーを付け、この断片の３’末端はSph
Iで消化し、５’末端はHinfIで消化後、平滑化した断
片。

【０１０３】このようにして作製したプラスミドＪＰ２
ＤＮＡ８μｇを制限酵素HincIIで消化し、アガロースゲ
ル電気泳動により0.2kbの断片を回収した。この断片を
更に制限酵素AccIで消化した後、末端を平滑化し、0.2k
b 断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。

【０１０４】プラスミドｐＢＲ３２２ 0.2μgを制限酵
素BamHIと制限酵素AccIで消化した後、末端を平滑化
し、4.1kb 断片を得た。これら0.2kbと4.1kbの２断片を
ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォー
メーションした。時計回りにＧＡＬ１０ターミネーター
の入った、制限酵素BamHI切断部位を持つものを選択
し、このプラスミドをｐＧＡＬ１０ｔｅｒｍとした（図
５）。

【０１０５】ｐＭＲ−ＡｌｕとｐＧＡＬ１０ｔｅｒｍ各
々0.5μgづつを制限酵素BamHIおよび制限酵素PstIで消
化し、それそれ2.7kb、1.6kbの断片を回収した。これら
をライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォ
ーメーションし、得られたプラスミドをｐ２ΔＢとした
（図６）。

【０１０６】（２）プラスミドＪＳ３の作製酵母MC16株のロイシン要求性を相補するLEU2遺伝子を持
ち、酵母と大腸菌の双方で増殖が可能な、小さなプラス
ミドＪＳ３を次のように作製した（図７）。

【０１０７】プラスミドＹＥｐ１３(J.R.Broach et al.
Gene 9, 287 (1980)) 1μg を制限酵素BamHIで切断し
た。次いで０．２単位の制限酵素 HpaIで部分消化する
ため、反応開始後、５分、１０分、３０分後に各々１／
３量づつサンプリングし、フェノール処理を行った。こ
れらをまとめてアガロースゲル電気泳動し、5.0kbの断
片を回収した。

【０１０８】一方、プラスミドｐＡＴ１５３（バイオレ
ス(Biores B. V.)から購入）0.5μgを制限酵素BamHIとS
spIで消化し、3.1kbの断片を回収した。これら5.0kbと
3.1kbの２断片をライゲーションし、プラスミドＹＥｐ
ΔＸｈｏを得た。このＹＥｐΔＸｈｏ１μgづつを、制
限酵素PstIあるいはTthIII-Iで消化した後、末端を修復
した。これらを更に制限酵素BamHIで消化し、それぞれ
2.4kb、5.1kbの断片を回収し、これら２断片をライゲー
ションしてプラスミドＪＳ３を得た。

【０１０９】（３）プラスミドＪＳ５の作製プラスミドＪＳ３ 2μg を制限酵素Pstlで消化後、制限
酵素EcoRIで部分消化し、2.5kbの断片を回収した。次い
でプラスミドｐ２ΔＢ１μgを制限酵素PstIおよび制限
酵素EcoRIで消化して、3.5kb 断片を回収した。これら
２断片をライゲーションすることにより、GAL7プロモー
ターの支配下に、未変異ＭＲを酵母培養中に分泌生産す
ることの可能なプラスミドベクターＪＳ５を得た（図
８）。

【０１１０】＜４＞変異ＭＲ発現プラスミドの作製次に、上記で得られた未変異ＭＲ遺伝子発現プラスミド
を用いて、変異ＭＲ遺伝子を発現させるためのプラスミ
ドを作製した（図９〜１１）。

【０１１１】変異ＭＲ遺伝子を含むプラスミドｐ３１Ｅ
2μgを制限酵素SalIとBglIIで消化して得られる0.5kb
断片と、未変異ＭＲ発現プラスミドｐ２ΔＢ 0.5μgを
同様に制限酵素SalIとBglIIで消化して得られる3.8kb断
片とを連結して、プラスミドｐ２−３０１ＡＴを得た
（図９左上）。

【０１１２】次いでこのｐ２−３０１ＡＴ 2μgを制限
酵素SacIとPstIで消化して得られる3.5kb断片と、プラ
スミドＪＳ５ 2μgを同様に制限酵素SacIとPstIで消化
して得られる4.4kb断片とを繋ぎ合わせて、プラスミド
ＪＳ５２を得た（図９）。

【０１１３】同様にしてプラスミドｐλ１ＳＨを制限酵
素SalIとBstPIで消化して得られる断片を、ｐ２ΔＢあ
るいはｐ２−３０１ＡＴの相同断片と交換して得られる
プラスミドをｐ２λ１（図１０中左）及びｐ２λ１−３
０１（図１１中左）とした。これらをＪＳ５２作製の
ときと同様に、制限酵素SacIとPstIで消化して得られる
3.5kb断片を、ＪＳ５の相同断片と交換したものを、それ
ぞれプラスミドＪＳ５３（図１０）およびＪＳ５２５
（図１１）とした。

【０１１４】これらのプラスミドのうちＪＳ５２は、配
列番号１で表されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸
配列のうち１０１番目のアミノ酸がスレオニンに置換さ
れているプロテアーゼをコードする遺伝子を、ＪＳ５３
は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有し、このア
ミノ酸配列のうち１８６番目のアミノ酸がアスパラギン
酸に置換されているプロテアーゼをコードする遺伝子
を、ＪＳ５２５は、配列番号１で表されるアミノ酸配列
を有し、このアミノ酸配列のうち１０１番目のアミノ酸
がスレオニンに、１８６番目のアミノ酸がアスパラギン
酸に置換されているプロテアーゼをコードする遺伝子を
有し、それぞれさらにサッカロマイセス・セレビシエで
発現可能なプロモーターを有し、サッカロマイセス・セ
レビシエで複製可能なプラスミドである。

【０１１５】＜５＞酵母におけるＭＲの生産従来より、酵母の形質転換体から効率よくＭＲを分泌生
産させるために、発現を厳格に誘導・制御することが可
能なＧＡＬ７プロモーター（Nogi and Fukasawa, Nucl.
Acids Res. 11, 8555-8568 (1983))が用いられてい
る。これは、培地の炭素源をガラクトースにし、グルコ
ースが存在しないときに初めて強力に発現を誘導するプ
ロモーターである。本発明においてもこのプロモーター
を使用した。以下に、酵母のトランスフォーメーショ
ン、ＧＡＬ７プロモーターを用いたＭＲ遺伝子の発現お
よびＭＲタンパクの精製法について述べる。

【０１１６】（１）酵母のトランスフォーメーションＹＰＤ培地(1% イースト・エキストラクト（ディフコ社
製）, 2%バクトペプトン（ディフコ社製）, 2% ク゛ルコース)
で１晩培養した酵母ＭＣ１６株を、新鮮なＹＰＤ培地に
１０％接種し、３０℃で４時間培養した。培養液1.5ml
を卓上遠心機で軽く遠心して集菌し、0.2M LiSCN（関東
化学株式会社製）でリンスしたのち、0.02mlの1M LiSCN
に懸濁した。

【０１１７】ＪＳ５、ＪＳ５２、ＪＳ５３、ＪＳ５２５
の各プラスミド溶液０．０１ｍｌ（約３μｇ）と０．０
３ｍｌの７０％ＰＥＧ４０００（和光純薬工業株式会
社製）を加えてよく混合し、３０℃で１時間保温した。
０．１４ｍｌの滅菌水を加え、希釈した後２枚のSDahプ
レート(0.67% バクト・イースト・ナイトロジェンベー
ス w/o アミノ酸(Bacto-yeast nitrogen base w/o amin
o acid)（ディフコ社）, 2% ク゛ルコース, 0.002% アデニン
硫酸塩（和光純薬工業株式会社製），0.002%ヒスチジン
塩酸塩（和光純薬工業株式会社製），2%寒天）にプレー
ティングした。３０℃で２〜３日インキュベートし、形
質転換体を得た。

【０１１８】（２）形質転換体のＭＲ遺伝子の発現得られた形質転換体を５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ
た５０ｍｌのＹＰＤ培地で３０℃、２日間振盪培養し、
菌体を増やした。１０００×ｇで５分間遠心して集菌
し、１００ｍｌのＹＰＧａｌ培地（1% イースト・エキ
ストラクト, 2% バクトペプトン, 4%ガラクトース(和光
純薬工業株式会社製)）に再び懸濁し、５００ｍｌ容坂
口フラスコで３０℃で３日間振盪培養した。この培養上
清の凝乳活性は、スキムミルクプレート（1% スキムミ
ルク（ディフコ社製）, 100mM 酢酸緩衝液 pH5.2, １％
寒天）に２μｌを乗せ、３７℃で１０分間保温し、ハロ
ーの出現で検出した。

【０１１９】（３）ＭＲ蛋白の精製１０００×ｇで１０分間遠心して得た培養上清２００ｍ
ｌを20mM酢酸ナトリウム pH6.0, 5mMEDTA 緩衝液で 2倍
に希釈し、同緩衝液で平衝化した30mlの DEAE-TOYOPEAR
L 650Mイオン交換体（東ソー株式会社製）を充填したカ
ラムを通し、ＭＲタンパクをイオン交換体に吸着させ、
同緩衝液でカラムを洗浄した後、0.4M食塩を加えた同緩
衝液で溶出した。ＭＲタンパクを含む画分は、上記スキ
ムミルクプレート法により検出した。

【０１２０】得られた活性画分を限外濾過膜を用いて濃
縮し、G3000SW（東ソー株式会社製）ゲル濾過カラムを
用いた高速液体クロマトグラフィーにより、精製を行っ
た。活性画分を、SDS-PAGE(ゲルはテフコ(TEF Corporat
ion)社製を使用)でタンパクを検出したところ、単一の
バンドとなった。

【０１２１】＜６＞部位特異的変異ＭＲ遺伝子の作製前述したように、耐熱性の低下した変異ＭＲの１つは、
１８６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異してい
た。この位置のアミノ酸の変異が耐熱性の低下に大きな
影響を与えることを立証するために、他のいくつかのア
ミノ酸への置換を試みた。以下にその方法と結果を示
す。

【０１２２】変異は、Kunkel法により行った。

【０１２３】（１）合成プライマーの作製最初に、変異させるべきアミノ酸を含む近傍のアミノ酸
配列をコードする２０ｍｅｒの１本鎖ＤＮＡを合成し
た。この配列は、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔのいずれかが入る所を
Ｎで表せば、配列番号２に示した配列であり、１８３〜
１８８番目のアミノ酸をコードする配列に相当する。こ
の配列からは、１８６番目のアミノ酸が、トリプトファ
ン、メチオニン、リジン、グルタミンおよびグルタミン
酸を除く他の１５種類のアミノ酸への変異が理論的に期
待できる。

【０１２４】合成ＤＮＡは、ミリジェン／バイオサーチ
(MilliGen/Biosearch Division ofMILLIPORE)社製のCyc
lone Plus DNA 合成器を用い、β-シアノエチル・アミ
ダイト法で合成し、精製は、脱ジメチルトリチルの前後
ともInertsil ODS-2（ジーエルサイエンス株式会社製）
逆相カラムからのアセトニトリル勾配溶出で行った。

【０１２５】精製後、1.5nmolの合成プライマーを、0.0
5mlの緩衝液（0.07 MTris-HCl pH7.5, 5mM MgCl₂, 5mM
ジチオスライトール（和光純薬工業株式会社製）, 1mM
ATP（宝酒造株式会社製））に溶かし10単位のT4 ポリヌ
クレオチドキナーゼを加えて３７℃で１時間反応させ
て、末端をリン酸化した。

【０１２６】（２）変異の導入、Ｍ１３へのサブクロー
ニングプラスミドｐ２ΔＢ１μｇを制限酵素KpnIとBamHIで消
化して得た断片を、同じ酵素で切断したM13 mp19 RF Ｄ
ＮＡ０．１μｇとライゲーションすることにより、ＭＲ
遺伝子の一部を含むファージＤＮＡを得た。この組換え
RF ＤＮＡをＭＲＫＢ／ｍｐ１９と呼ぶ。

【０１２７】ＭＲＫＢ／ｍｐ１９を大腸菌ＢＷ３１３
（宝酒造株式会社から購入）にトランスフォーメーショ
ンし、形質転換体を培養することによりファージを得、
これをＰＥＧ沈澱、フェノール処理して、１本鎖ＤＮＡ
を得た。このＤＮＡは大腸菌ＢＷ３１３の持つ変異のた
め、チミンの一部がデオキシウラシルとなっている。デ
オキシウラシルを含むＤＮＡは通常の大腸菌中では複製
されない。

【０１２８】部位特異的変異導入キットとしてMutan-K
kit（宝酒造株式会社製）を用いた。キット添付のプロ
トコールに従って、デオキシウラシルを含む１本鎖ＤＮ
Ａ0.2pmolとリン酸化した前記合成ＤＮＡ 1pmolをアニ
ールさせた。ついで１単位のT4DNA ポリメラーゼと５０
単位の大腸菌 DNA リガーゼおよびＮＡＤと４種類のヌ
クレオチド（dNTP）を含む緩衝液を加え、２５℃で２時
間保温して相補鎖の合成と環状化を行った。

【０１２９】これを復帰変異を起こしにくい大腸菌BMH7
1-18 mutSにトランスフォーメーションし、大腸菌ＭＶ
１１８４を指示菌としてプラークを形成させた。このプ
ラークのいくつかからファージを培養し、１本鎖ＤＮＡ
を調製し、塩基配列決定を行って変異遺伝子を確認し
た。

【０１３０】その結果、得られた変異遺伝子は、１８６
番目のアミノ酸が、Ala(GCC), Cys(TGC),Ile(ATC), Ser
(AGC), Arg(CGC), Val(GTC)の６種とＪＳ５３と同じ表
現型のもの（Asp:アミノ酸としてはJS53と同じ, コドン
はGAC）の計７種であった。

【０１３１】これらの変異ファージが感染した大腸菌を
培養し、プラスミドの調製と同様にしてRF ＤＮＡを調
製した。これら６種の複製型ＤＮＡを制限酵素KpnIとBa
mHIで切断して生じる１ｋｂの断片各１μｇを、プラス
ミドｐ２ΔＢを同じ酵素で切断して生じる３．３ｋｂの
断片各々０．３μｇとライゲーションし、６種のプラス
ミドｐＭＲＸ−Ａ，ｐＭＲＸ−Ｃ，ｐＭＲＸ−Ｉ，ｐＭ
ＲＸ−Ｓ，ｐＭＲＸ−Ｒ，ｐＭＲＸ−Ｖを得た。

【０１３２】次いで、これら６種のプラスミドを制限酵
素SacIとBamHIで消化して生じる２．１ｋｂの断片各
１．５μｇを、プラスミドＪＳ５を同じ酵素で消化して
生じる６．１ｋｂの断片各々０．５μｇとライゲーショ
ンし、プラスミドを得た。

【０１３３】これらのプラスミドは、配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列のうち１８
６番目のアミノ酸がグリシン以外の他のアミノ酸に置換
されているプロテアーゼをコードする遺伝子を有する。
グリシン以外の他のアミノ酸として、ＪＳ５３Ａはアラ
ニンに、ＪＳ５３Ｃは、システインに、ＪＳ５３Ｉはイ
ソロイシンに、ＪＳ５３Ｓは、セリンに、ＪＳ５３Ｒは
アルギニンに、ＪＳ５３Ｖは、バリンのコドンに置換さ
れている。

【０１３４】これらのプラスミドは、さらにサッカロマ
イセス・セレビシエで発現可能なGAL7プロモーターを有
し、また、複製可能なプラスミドである。これらのプラ
スミドを、ＪＳ５２，ＪＳ５３，ＪＳ５２５と同様に酵
母ＭＣ１６へトランスフォーメーションした。各形質転
換体は、本発明のプラスミドを保持するサッカロマイセ
ス・セレビシエである。

【０１３５】ＪＳ５２、ＪＳ５３、ＪＳ５３Ｒ、ＪＳ５
２５を保持する各形質転換体は、それぞれ、微工研菌寄
第１２５１１号、第１２５１４号、第１２５１２号、第
１２５１３号として工業技術院微生物工業研究所に寄託
した。

【０１３６】上記の株の生産する変異酵素を、前記＜５
＞（２）「形質転換体のＭＲ遺伝子の発現」と同様に調
製した。

【０１３７】（３）変異酵素の性質各変異プラスミドを保持する酵母形質転換体の生産する
酵素の性質を調べた。分子量は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ゲルはテフコ社製）での電気泳動の結果より求めた。

【０１３８】耐熱性は２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
２）中で、５５℃、１５分加熱後の残存活性％により求
めた。凝乳活性のｐＨプロフィールはｐＨ５．５〜７．
０の２０ｍＭリン酸緩衝液に溶かした１０ｍＭ CaCl₂含
有１０％スキムミルクの凝固時間から求めた。

【０１３９】タンパク分解活性は、カゼイン（ディフコ
社製）を基質とし反応後２．５％トリクロロ酢酸水溶液
に対して可溶性となったものの量から求めた。

【０１４０】

【表１】

【０１４１】表１に示した通り、すべての変異酵素は未
変異ＭＲよりも耐熱性が低下しており、１８６番目のア
ミノ酸が、耐熱性に大きく寄与していることが明らかと
なった。この位置のアスパラギン酸がＭＲの立体構造の
維持に重要な役割を果たしていることが推定される。

【０１４２】また、１０１番目のアミノ酸の変異したＪ
Ｓ５２よりも、ＪＳ５３Ａ及びＪＳ５３Ｓを除く他の変
異プラスミドの方が、生産される酵素の耐熱性の低下が
大きいことから、１８６番目の変異の方が影響が大きい
と考えられる。しかし、両方の変異を持つ二重変異酵素
（ＪＳ５２５により生産）は最も耐熱性が低いので、１
０１番目のアミノ酸の変異も重要である。

【０１４３】各変異酵素のｐＨプロフィール及び分子量
は、未変異酵素と大きな違いはなく（図１３）、プロテ
アーゼとして必要な性質は保持していると考えられる。
以上のようにして、耐熱性の低下した変異ＭＲを９種類
作製することに成功した。さらにその遺伝子及び遺伝子
を発現するプラスミド、各変異酵素を生産する酵母を作
製することに成功した。

【０１４４】さらに上記酵母の変異ＭＲ生産量は、ムコ
ール・プシルス変異株に匹敵するものであった。

【０１４５】

【発明の効果】本発明により、耐熱性の低下したＭＲを
酵母により生産することができる。また、この変異ＭＲ
よりも一層耐熱性の低下したＭＲを提供することができ
る。

【０１４６】

【配列表】

【０１４７】配列番号：１配列の長さ：２００９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：ムコール・フ゜シルス(Mucor pusillus) 株名：ＩＦＯ４５７８（＋）配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：３６１．．１６４１特徴を決定した方法：Ｐ特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：３６１．．４１４特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：５５９．．１６４１特徴を決定した方法：Ｅ配列 AATCGGGCAT TGTACAGCGT TTTACCGATC TAAATGACTG TATTCGAGAG AAAGTGGAAA 60 GAGTGGTGTT ATGCATTAGA TGTTACAAGT TCATGCCATA GGTGACACAC ACAATTTCTG 120 CCTTTTTATG ACTTTGTCTG TTTAATCAAT ATGGTAATAC ACCCCGCGGT CCAAGGCAGT 180 ACCCAGTCTT GCAAACACCT TTCCAGGTAA AATCATACAA TTATGGACTC TAACGTTTTT 240 CAAAATGTCA ATTTTGCAGA CGAACGGCAC ACAGATCTTC TAGTGGCCAA ACTGCGTAGA 300 TCCCTTTTTC ATATAAAACC AGCCGGATGC GAGACTCTGA GACCTCATCA AATCCTCAAC 360 ATG CTC TTC TCC AAG ATC TCC TCT GCA ATC CTT TTG ACC GCT GCT TCT 408 Met Leu Phe Ser Lys Ile Ser Ser Ala Ile Leu Leu Thr Ala Ala Ser -65 -60 -55 TTT GCA CTT ACC AGT GCT CGC CCA GTA TCC AAG CAA TCT GAT GCC GAT 456 Phe Ala Leu Thr Ser Ala Arg Pro Val Ser Lys Gln Ser Asp Ala Asp -50 -45 -40 -35 GAC AAG CTA TTG GCT CTT CCC TTG ACA TCC GTC AAC CGC AAA TAC TCT 504 Asp Lys Leu Leu Ala Leu Pro Leu Thr Ser Val Asn Arg Lys Tyr Ser -30 -25 -20 CAA ACC AAA CAC GGA CAG CAG GCT GCC GAA AAA TTG GGC GGT ATC AAG 552 Gln Thr Lys His Gly Gln Gln Ala Ala Glu Lys Leu Gly Gly Ile Lys -15 -10 -5 GCG TTC GCT GAG GGA GAT GGT TCC GTT GAT ACA CCT GGC TTG TAC GAC 560 Ala Phe Ala Glu Gly Asp Gly Ser Val Asp Thr Pro Gly Leu Tyr Asp 1 5 10 TTT GAC TTG GAG GAG TAC GCC ATT CCA GTT TCC ATC GGT ACT CCT GGA 648 Phe Asp Leu Glu Glu Tyr Ala Ile Pro Val Ser Ile Gly Thr Pro Gly 15 20 25 30 CAA GAC TTT TAT CTT TTG TTC GAT ACC GGC AGT TCC GAT ACT TGG GTT 696 Gln Asp Phe Tyr Leu Leu Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Thr Trp Val 35 40 45 CCC CAC AAA GGC TGC GAT AAC TCT GAG GGC TGC GTT GGC AAA CGC TTC 744 Pro His Lys Gly Cys Asp Asn Ser Glu Gly Cys Val Gly Lys Arg Phe 50 55 60 TTC GAT CCT TCC TCT TCT TCC ACC TTC AAA GAA ACC GAC TAC AAC CTG 792 Phe Asp Pro Ser Ser Ser Ser Thr Phe Lys Glu Thr Asp Tyr Asn Leu 65 70 75 AAC ATC ACC TAC GGT ACC GGC GGT GCT AAC GGT ATC TAC TTC CGA GAC 840 Asn Ile Thr Tyr Gly Thr Gly Gly Ala Asn Gly Ile Tyr Phe Arg Asp 80 85 90 AGC ATT ACT GTC GGC GGT GCT ACC GTG AAG CAG CAA ACT TTG GCT TAC 888 Ser Ile Thr Val Gly Gly Ala Thr Val Lys Gln Gln Thr Leu Ala Tyr 95 100 105 110 GTC GAC AAC GTC AGC GGC CCA ACT GCT GAG CAG TCT CCC GAC TCT GAA 936 Val Asp Asn Val Ser Gly Pro Thr Ala Glu Gln Ser Pro Asp Ser Glu 115 120 125 CTC TTC CTT GAT GGT ATC TTC GGC GCA GCC TAC CCT GAC AAC ACT GCC 984 Leu Phe Leu Asp Gly Ile Phe Gly Ala Ala Tyr Pro Asp Asn Thr Ala 130 135 140 ATG GAA GCC GAA TAC GGA GAT ACT TAC AAC ACT GTC CAC GTT AAC CTC 1032 Met Glu Ala Glu Tyr Gly Asp Thr Tyr Asn Thr Val His Val Asn Leu 145 150 155 TAC AAG CAG GGC TTG ATC TCT TCT CCT GTC TTC TCT GTG TAC ATG AAC 1080 Tyr Lys Gln Gly Leu Ile Ser Ser Pro Val Phe Ser Val Tyr Met Asn 160 165 170 ACC AAC GAC GGT GGC GGC CAA GTT GTC TTT GGT GGC GTC AAC AAC ACC 1128 Thr Asn Asp Gly Gly Gly Gln Val Val Phe Gly Gly Val Asn Asn Thr 175 180 185 190 CTT CTC GGA GGA GAC ATT CAA TAC ACT GAC GTT TTG AAG AGC CGA GGC 1176 Leu Leu Gly Gly Asp Ile Gln Tyr Thr Asp Val Leu Lys Ser Arg Gly 195 200 205 GGC TAC TTC TTC TGG GAT GCC CCT GTC ACC GGT GTC AAA ATT GAT GGA 1224 Gly Tyr Phe Phe Trp Asp Ala Pro Val Thr Gly Val Lys Ile Asp Gly 210 215 220 TCT GAC GCT GTC AGC TTC GAC GGC GCC CAG GCA TTC ACC ATC GAT ACC 1272 Ser Asp Ala Val Ser Phe Asp Gly Ala Gln Ala Phe Thr Ile Asp Thr 225 230 235 GGC ACC AAC TTC TTC ATC GCA CCC TCC AGC TTT GCC GAG AAG GTT GTA 1320 Gly Thr Asn Phe Phe Ile Ala Pro Ser Ser Phe Ala Glu Lys Val Val 240 245 250 AAG GCT GCA CTC CCC GAT GCT ACC GAG TCG CAG CAG GGT TAT ACT GTT 1368 Lys Ala Ala Leu Pro Asp Ala Thr Glu Ser Gln Gln Gly Tyr Thr Val 255 260 265 270 CCT TGC TCC AAG TAC CAG GAT TCC AAG ACC ACC TTC AGC CTT GTT CTG 1416 Pro Cys Ser Lys Tyr Gln Asp Ser Lys Thr Thr Phe Ser Leu Val Leu 275 280 285 CAA AAG TCT GGT TCC AGC AGC GAT ACC ATT GAC GTC TCG GTT CCT ATT 1464 Gln Lys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Thr Ile Asp Val Ser Val Pro Ile 290 295 300 AGC AAG ATG CTT CTT CCA GTC GAT AAG TCG GGC GAG ACT TGC ATG TTC 1512 Ser Lys Met Leu Leu Pro Val Asp Lys Ser Gly Glu Thr Cys Met Phe 305 310 315 ATC GTA CTT CCC GAT GGC GGT AAC CAG TTC ATT GTT GGC AAC CTC TTC 1560 Ile Val Leu Pro Asp Gly Gly Asn Gln Phe Ile Val Gly Asn Leu Phe 320 325 330 TTG CGC TTC TTC GTC AAC GTT TAC GAC TTT GGC AAG AAC CGT ATC GGC 1608 Leu Arg Phe Phe Val Asn Val Tyr Asp Phe Gly Lys Asn Arg Ile Gly 335 340 345 350 TTT GCA CCT TTG GCT TCC GGA TAC GAG AAC AAC TAAAGGAATA CTCCCTGTTC 1661 Phe Ala Pro Leu Ala Ser Gly Tyr Glu Asn Asn 355 360 CCGACTTATC TACGTGTTAC GGTACTGTAT CTCTATCTTT ACTTTTTAAC TGTATTCAAT 1721 AAATTATCTT GTTGTACTTT TACATGACTT TTGCGCTTGG TTAGCTCTTT GAAAGCATCA 1781 ATGTCACATT TTTTTCTCAG ACAACGAGGC ACTTTTGCAC TTTAGTCTGC CCGTATGCAA 1841 GTCGCAAAAG CAGCTTGACC TAGCTGACGG TATCATCCGT CAAGGATAAA AAGATCGCAA 1901 CTTAGTAGAC AATTCTGAAA CATTTCAACA ATGAGCAAAC AAACTTTGTT GGACGCATAT 1961 ATAACTCTGC CAAATATGAG ATAATATATT CAAATGAACT CTCAAGTT 2009

【０１４８】配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTCTTTGGTN NCGTCAACCA 20

【０１４９】配列番号：３配列の長さ：８１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸組換えＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：６７．．８１特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATAAAAAAAA CAGTTGAATA TTCCCTCAAA AAGGGGATCA CTCTGAGACC TCATCAAATC 60 CTCAAC ATG CTC TTC TCC AAG 81 Met Leu Phe Ser Lys

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドＭ１３ｍｐ１０＃３９ＭＲ作製工程
を示す図

【図２】プラスミドＪＰ１の作製工程及び構造を示す図

【図３】プラスミドｐＭＲ−Ａｌｕの作製工程を示す図

【図４】プラスミドＪＰ２の作製工程を示す図

【図５】プラスミドｐＧＡＬ１０ｔｅｒｍの作製工程を
示す図

【図６】プラスミドｐ２ΔＢの作製工程を示す図

【図７】プラスミドＪＳ３の作製工程を示す図

【図８】プラスミドＪＳ５の作製工程を示す図

【図９】プラスミドＪＳ５２の作製工程を示す図

【図１０】プラスミドＪＳ５３の作製工程を示す図

【図１１】プラスミドＪＳ５２５の作製工程を示す図

【図１２】ＤＮＡ配列の機能を表す記号を示す図

【図１３】未変異酵素及び変異酵素の凝乳活性のｐＨプ
ロフィールを示す図

【符号の説明】

Ac : AccI Alu : AluI B : BamHI Bst : BstPI (=BstEII) E : EcoRI G : BglII Hc : HincII Hf : HinfI Hp : HpaI N : NcoI P : PstI S : SalI Sc : SacI Sp : SphI Ssp : SspI Tth : TthIIIＩ ( ) : 連結後に制限酵素認識部位を失うことを表すオーバーライン : 修復した末端を表す白抜き星印 : １０１番目のアミノ酸の変異を表す黒塗り星印 : １８６番目のアミノ酸の変異を表す

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成３年１１月６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８９】このプラスミドＪＰ１は、次のようにして
作製した(Mol. Gen. Genet. 210, 462-467 (1987))（図
１〜２）。ＧＡＬ１０ターミネーター及びＧＡＬ７プロ
モーター配列を有するプラスミドｐＹＦ１０１６(Nogi
and Fukasawa Nucl.Acids Res. 11, 8555 (1983))1.0kb
のHinfI断片を取り出し、BAL31、NcoIでそれぞれ消化し
た後ポリメラーゼ反応により平滑化した。これをプラス
ミドＭ１３ｍｐ１０のSmaI部位に挿入して、Ｍ１３ｍｐ
１０＃３９を得た（図１左上）。このプラスミドは、Ｇ
ＡＬ７プロモーター配列のうち、NcoI部位からＧＡＬ７
遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡまでを含む。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９０】一方プラスミドｐＪＤＢ２１９の誘導体で
あるプラスミドｐＳＳ２１の平滑化したSalI部位に、Ｍ
Ｒ遺伝子を含むAvaI断片を平滑化して挿入し、ｐＳＳ２
１ＭＲを得た。このプラスミドをHinfIで消化後、HinfI
部位をポリメラーゼ反応により平滑化し、さらにSalIで
消化して得られる595bpのHinfI-SalI断片を取り出し
た。この断片を、BamHI部位を平滑化した後SalIで消化
したＭ１３ｍｐ１０＃３９に挿入し、Ｍ１３ｍｐ１０＃
３９ＭＲを得た（図１）。尚、前記ＭＲ遺伝子を含むAv
aI断片は、ＭＲ成熟タンパクＮ末端より２０８〜２１３
アミノ酸に相当する合成プローブ（１７ｍｅｒ）を用い
て単離したＭＲ遺伝子を含むプラスミドｐＣＴ１１３(T
onouchi et al. Nucl. Acids Res. 14, 7557 (1986))よ
り調製した。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９１】ｐＳＳ２１ＭＲのSalI、SacI部位に、Ｍ１
３ｍｐ１０＃３９ＭＲをSalIとSacIで消化し得られる、
ＧＡＬ７プロモーターとＭＲ遺伝子の上流側が連結した
断片を挿入し、プラスミドＪＰ１を得た（図２）。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９８】次いで、プラスミドＭ１３ｍｐ１０＃３
９ＭＲ４μｇを制限酵素SalIと制限酵素EcoRIで消化
し、1.1kbの断片を回収した。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年９月２２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９０】一方プラスミドｐＪＤＢ２１９の誘導体で
あるプラスミドｐＳＳ２１の平滑化したSalI部位に、Ｍ
Ｒ遺伝子を含むAvaI断片を平滑化して挿入し、ｐＳＳ２
１ＭＲを得た。このプラスミドをHinfIで消化後、HinfI
部位をポリメラーゼ反応により平滑化し、さらにSalIで
消化して得られる595bpのHinfI-SalI断片を取り出し
た。この断片を、BamHI部位を平滑化した後SalIで消化
したＭ１３ｍｐ１０＃３９に挿入し、Ｍ１３ｍｐ１０＃
３９ＭＲを得た（図１）。ＧＡＬ７プロモーターとＭＲ
遺伝子との連結部位の配列を配列番号３に示す。尚、前
記ＭＲ遺伝子を含むAvaI断片は、ＭＲ成熟タンパクＮ末
端より２０８〜２１３アミノ酸に相当する合成プローブ
（１７ｍｅｒ）を用いて単離したＭＲ遺伝子を含むプラ
スミドｐＣＴ１１３(Tonouchi et al. Nucl. AcidsRes.
14, 7557 (1986))より調製した。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９２】ＪＰ１ＤＮＡ10ngを大腸菌ＪＭ１０９の
コンピテントセル (宝酒造株式会社から購入、＃9052)1
00μ1と混合し、氷中で30分放置した。以下使用説明書
の指示に従い、ヒートショックとエクスプレッションを
行ったのちプレートに蒔いて、翌朝、形質転換体のコロ
ニーを得た。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年１０月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【書類名】明細書

【発明の名称】低耐熱性プロテアーゼとその関連物及
びその生産法

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【０００２】

【００１１】

【００１２】

【００５３】

【００９２】ＪＰ１ＤＮＡ10ngを大腸菌ＪＭ１０９の
コンピテントセル (宝酒造株式会社から購入、＃9052)1
00μ1と混合し、氷中で30分放置した。以下使用説明書
の指示に従い、ヒートショックとエクスプレッションを
行ったのちプレートに蒔いて、翌朝、形質転換体のコロ
ニーを得た。

【００９８】次いで、プラスミドＭ１３ｍｐ１０＃３
９ＭＲ４μｇを制限酵素SalIと制限酵素EcoRIで消化
し、1.1kbの断片を回収した。

【０１２２】変異は、Kunkel法により行った。

【０１４０】

【表１】

【０１４５】

【０１４６】

【配列表】

【０１４７】配列番号：１配列の長さ：２００９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：ムコール・フ゜シルス(Mucor pusillus) 株名：ＩＦＯ４５７８（＋）配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：３６１．．１６４１特徴を決定した方法：Ｐ特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：３６１．．４１４特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：５５９．．１６４１特徴を決定した方法：Ｅ配列 AATCGGGCAT TGTACAGCGT TTTACCGATC TAAATGACTG TATTCGAGAG AAAGTGGAAA 60 GAGTGGTGTT ATGCATTAGA TGTTACAAGT TCATGCCATA GGTGACACAC ACAATTTCTG 120 CCTTTTTATG ACTTTGTCTG TTTAATCAAT ATGGTAATAC ACCCCGCGGT CCAAGGCAGT 180 ACCCAGTCTT GCAAACACCT TTCCAGGTAA AATCATACAA TTATGGACTC TAACGTTTTT 240 CAAAATGTCA ATTTTGCAGA CGAACGGCAC ACAGATCTTC TAGTGGCCAA ACTGCGTAGA 300 TCCCTTTTTC ATATAAAACC AGCCGGATGC GAGACTCTGA GACCTCATCA AATCCTCAAC 360 ATG CTC TTC TCC AAG ATC TCC TCT GCA ATC CTT TTG ACC GCT GCT TCT 408 Met Leu Phe Ser Lys Ile Ser Ser Ala Ile Leu Leu Thr Ala Ala Ser -65 -60 -55 TTT GCA CTT ACC AGT GCT CGC CCA GTA TCC AAG CAA TCT GAT GCC GAT 456 Phe Ala Leu Thr Ser Ala Arg Pro Val Ser Lys Gln Ser Asp Ala Asp -50 -45 -40 -35 GAC AAG CTA TTG GCT CTT CCC TTG ACA TCC GTC AAC CGC AAA TAC TCT 504 Asp Lys Leu Leu Ala Leu Pro Leu Thr Ser Val Asn Arg Lys Tyr Ser -30 -25 -20 CAA ACC AAA CAC GGA CAG CAG GCT GCC GAA AAA TTG GGC GGT ATC AAG 552 Gln Thr Lys His Gly Gln Gln Ala Ala Glu Lys Leu Gly Gly Ile Lys -15 -10 -5 GCG TTC GCT GAG GGA GAT GGT TCC GTT GAT ACA CCT GGC TTG TAC GAC 600 Ala Phe Ala Glu Gly Asp Gly Ser Val Asp Thr Pro Gly Leu Tyr Asp 1 5 10 TTT GAC TTG GAG GAG TAC GCC ATT CCA GTT TCC ATC GGT ACT CCT GGA 648 Phe Asp Leu Glu Glu Tyr Ala Ile Pro Val Ser Ile Gly Thr Pro Gly 15 20 25 30 CAA GAC TTT TAT CTT TTG TTC GAT ACC GGC AGT TCC GAT ACT TGG GTT 696 Gln Asp Phe Tyr Leu Leu Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Thr Trp Val 35 40 45 CCC CAC AAA GGC TGC GAT AAC TCT GAG GGC TGC GTT GGC AAA CGC TTC 744 Pro His Lys Gly Cys Asp Asn Ser Glu Gly Cys Val Gly Lys Arg Phe 50 55 60 TTC GAT CCT TCC TCT TCT TCC ACC TTC AAA GAA ACC GAC TAC AAC CTG 792 Phe Asp Pro Ser Ser Ser Ser Thr Phe Lys Glu Thr Asp Tyr Asn Leu 65 70 75 AAC ATC ACC TAC GGT ACC GGC GGT GCT AAC GGT ATC TAC TTC CGA GAC 840 Asn Ile Thr Tyr Gly Thr Gly Gly Ala Asn Gly Ile Tyr Phe Arg Asp 80 85 90 AGC ATT ACT GTC GGC GGT GCT ACC GTG AAG CAG CAA ACT TTG GCT TAC 888 Ser Ile Thr Val Gly Gly Ala Thr Val Lys Gln Gln Thr Leu Ala Tyr 95 100 105 110 GTC GAC AAC GTC AGC GGC CCA ACT GCT GAG CAG TCT CCC GAC TCT GAA 936 Val Asp Asn Val Ser Gly Pro Thr Ala Glu Gln Ser Pro Asp Ser Glu 115 120 125 CTC TTC CTT GAT GGT ATC TTC GGC GCA GCC TAC CCT GAC AAC ACT GCC 984 Leu Phe Leu Asp Gly Ile Phe Gly Ala Ala Tyr Pro Asp Asn Thr Ala 130 135 140 ATG GAA GCC GAA TAC GGA GAT ACT TAC AAC ACT GTC CAC GTT AAC CTC 1032 Met Glu Ala Glu Tyr Gly Asp Thr Tyr Asn Thr Val His Val Asn Leu 145 150 155 TAC AAG CAG GGC TTG ATC TCT TCT CCT GTC TTC TCT GTG TAC ATG AAC 1080 Tyr Lys Gln Gly Leu Ile Ser Ser Pro Val Phe Ser Val Tyr Met Asn 160 165 170 ACC AAC GAC GGT GGC GGC CAA GTT GTC TTT GGT GGC GTC AAC AAC ACC 1128 Thr Asn Asp Gly Gly Gly Gln Val Val Phe Gly Gly Val Asn Asn Thr 175 180 185 190 CTT CTC GGA GGA GAC ATT CAA TAC ACT GAC GTT TTG AAG AGC CGA GGC 1176 Leu Leu Gly Gly Asp Ile Gln Tyr Thr Asp Val Leu Lys Ser Arg Gly 195 200 205 GGC TAC TTC TTC TGG GAT GCC CCT GTC ACC GGT GTC AAA ATT GAT GGA 1224 Gly Tyr Phe Phe Trp Asp Ala Pro Val Thr Gly Val Lys Ile Asp Gly 210 215 220 TCT GAC GCT GTC AGC TTC GAC GGC GCC CAG GCA TTC ACC ATC GAT ACC 1272 Ser Asp Ala Val Ser Phe Asp Gly Ala Gln Ala Phe Thr Ile Asp Thr 225 230 235 GGC ACC AAC TTC TTC ATC GCA CCC TCC AGC TTT GCC GAG AAG GTT GTA 1320 Gly Thr Asn Phe Phe Ile Ala Pro Ser Ser Phe Ala Glu Lys Val Val 240 245 250 AAG GCT GCA CTC CCC GAT GCT ACC GAG TCG CAG CAG GGT TAT ACT GTT 1368 Lys Ala Ala Leu Pro Asp Ala Thr Glu Ser Gln Gln Gly Tyr Thr Val 255 260 265 270 CCT TGC TCC AAG TAC CAG GAT TCC AAG ACC ACC TTC AGC CTT GTT CTG 1416 Pro Cys Ser Lys Tyr Gln Asp Ser Lys Thr Thr Phe Ser Leu Val Leu 275 280 285 CAA AAG TCT GGT TCC AGC AGC GAT ACC ATT GAC GTC TCG GTT CCT ATT 1464 Gln Lys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Thr Ile Asp Val Ser Val Pro Ile 290 295 300 AGC AAG ATG CTT CTT CCA GTC GAT AAG TCG GGC GAG ACT TGC ATG TTC 1512 Ser Lys Met Leu Leu Pro Val Asp Lys Ser Gly Glu Thr Cys Met Phe 305 310 315 ATC GTA CTT CCC GAT GGC GGT AAC CAG TTC ATT GTT GGC AAC CTC TTC 1560 Ile Val Leu Pro Asp Gly Gly Asn Gln Phe Ile Val Gly Asn Leu Phe 320 325 330 TTG CGC TTC TTC GTC AAC GTT TAC GAC TTT GGC AAG AAC CGT ATC GGC 1608 Leu Arg Phe Phe Val Asn Val Tyr Asp Phe Gly Lys Asn Arg Ile Gly 335 340 345 350 TTT GCA CCT TTG GCT TCC GGA TAC GAG AAC AAC TAAAGGAATA CTCCCTGTTC 1661 Phe Ala Pro Leu Ala Ser Gly Tyr Glu Asn Asn 355 360 CCGACTTATC TACGTGTTAC GGTACTGTAT CTCTATCTTT ACTTTTTAAC TGTATTCAAT 1721 AAATTATCTT GTTGTACTTT TACATGACTT TTGCGCTTGG TTAGCTCTTT GAAAGCATCA 1781 ATGTCACATT TTTTTCTCAG ACAACGAGGC ACTTTTGCAC TTTAGTCTGC CCGTATGCAA 1841 GTCGCAAAAG CAGCTTGACC TAGCTGACGG TATCATCCGT CAAGGATAAA AAGATCGCAA 1901 CTTAGTAGAC AATTCTGAAA CATTTCAACA ATGAGCAAAC AAACTTTGTT GGACGCATAT 1961 ATAACTCTGC CAAATATGAG ATAATATATT CAAATGAACT CTCAAGTT 2009

【図面の簡単な説明】

【図２】プラスミドＪＰ１の作製工程及び構造を示す図

【図３】プラスミドｐＭＲ−Ａｌｕの作製工程を示す図

【図４】プラスミドＪＰ２の作製工程を示す図

【図６】プラスミドｐ２ΔＢの作製工程を示す図

【図７】プラスミドＪＳ３の作製工程を示す図

【図８】プラスミドＪＳ５の作製工程を示す図

【図９】プラスミドＪＳ５２の作製工程を示す図

【図１０】プラスミドＪＳ５３の作製工程を示す図

【図１１】プラスミドＪＳ５２５の作製工程を示す図

【図１２】ＤＮＡ配列の機能を表す記号を示す図

【符号の説明】 Ac : AccI Alu : AluI B : BamHI Bst : BstPI (=BstEII) E : EcoRI G : BglII Hc : HincII Hf : HinfI Hp : HpaI N : NcoI P : PstI S : SalI Sc : SacI Sp : SphI Ssp : SspI Tth : TthIIIＩ ( ) : 連結後に制限酵素認識部位を失うことを表すオーバーライン : 修復した末端を表す白抜き星印 : １０１番目のアミノ酸の変異を表す黒塗り星印 : １８６番目のアミノ酸の変異を表す

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岩崎慎二郎東京都日野市東豊田２−21−17 (72)発明者別府輝彦東京都杉並区堀之内１−５−21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１において１〜３６１のアミノ
酸番号で表されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配
列のうち１０１番目のアミノ酸がスレオニンに置換され
ているプロテアーゼ。
【請求項２】請求項１記載のプロテアーゼであって、
さらに１８６番目のアミノ酸がアスパラギン酸に置換さ
れているプロテアーゼ。
【請求項３】配列番号１において１〜３６１のアミノ
酸番号で表されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配
列のうち１８６番目のアミノ酸がグリシン以外の他のア
ミノ酸に置換されているプロテアーゼ。
【請求項４】前記Ｇｌｙ以外の他のアミノ酸が、アス
パラギン酸、アラニン、システイン、イソロイシン、セ
リン、アルギニン、バリンのうちのいずれか１つのアミ
ノ酸であることを特徴とする請求項３記載のプロテアー
ゼ。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか一項に記載のプ
ロテアーゼをコードする遺伝子。
【請求項６】請求項５記載の遺伝子と、サッカロマイ
セス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)で発現可
能なプロモーターとを有し、サッカロマイセス・セレビ
シエで複製可能なプラスミド。
【請求項７】前記プロモーターがサッカロマイセス・
セレビシエＧＡＬ７プロモーターであることを特徴とす
る請求項８記載のプラスミド。
【請求項８】ＪＳ５２、ＪＳ５３、ＪＳ５２５、ＪＳ
５３Ａ、ＪＳ５３Ｃ、ＪＳ５３Ｉ、ＪＳ５３Ｒ、ＪＳ５
３Ｓ、ＪＳ５３Ｖのいずれか１つであることを特徴とす
る請求項７記載のプラスミド。
【請求項９】請求項６〜８のいずれか一項に記載のプ
ラスミドを保持するサッカロマイセス・セレビシエ。
【請求項１０】請求項９記載のサッカロマイセス・セ
レビシエを培養し、その培養液からプロテアーゼを得る
ことを特徴とするプロテアーゼの生産法。