ES2445710T3

ES2445710T3 - Proteasa coagulante de la leche de tipo mejorado derivada de un microorganismo

Info

Publication number: ES2445710T3
Application number: ES10711273.2T
Authority: ES
Inventors: Kazunori Harada; Hiroyuki Kobayashi; Taro Suga; Hiroyuki Yamaguchi; Akira Tsunoda; Shigeaki Kato
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 2009-03-24
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2014-03-04
Anticipated expiration: 2030-03-19
Also published as: AU2010229341B2; BRPI1013484A8; JP5643766B2; CA2756752C; EP2411512A1; JP2012521188A; DK2411512T3; EP2411512B1; BRPI1013484A2; US20120040436A1; CN102361975A; MX2011009586A; CA2756752A1; WO2010110464A1; RU2011142793A; US8609389B2; AR075932A1; AU2010229341A1; RU2495931C2; NZ595078A

Abstract

Una proteasa de tipo mejorado que comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 75 % idéntica ala SEC. ID. Nº 3, dicha proteasa de tipo mejorado tiene al menos una mutación seleccionada de entre el grupo queconsiste en: (A) sustitución de la glutamina correspondiente a la glutamina en la posición 265 de la SEC ID Nº 3 con unaminoácido ácido; y (B) sustitución de la glutamina en la posición 266 de la SEC ID Nº 3 con un aminoácido acido, y en la que dichaproteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

Description

Proteasa coagulante de la leche de tipo mejorado derivada de un microorganismo

5 Campo de la técnica

La presente invención se refiere a una proteasa que tiene una actividad coagulante de la leche mejorada derivada de un microorganismo. La proteasa se utiliza preferentemente para la producción de queso.

Técnica antecedente

Durante muchos años se ha utilizado el cuajo de ternero como enzima coagulante de la leche para la producción de queso. La actividad coagulante de la leche del cuajo de ternero se atribuye principalmente a la quimosina, que es una proteasa ácida y que tiene una actividad proteasa específica del sitio para la caseína de la leche con una baja

15 actividad no específica del sitio (digiere específicamente la unión peptídica entre fenilalanina en la posición 105 y metionina en la posición 106 en la secuencia aminoacídica de la κ-caseína). La actividad proteasa no específica se cree que da lugar a la reducción en el rendimiento de la producción de leche y a generar un péptido de sabor amargo durante la maduración. Por esta razón, la quimosina es una enzima coagulante de la leche excelente.

Sin embargo, el descenso de la matanza de terneros y el aumento de la demanda de queso han hecho que sea difícil el suministro de cuajo de ternero. Hoy día, se utiliza ampliamente como enzima coagulante de la leche una enzima coagulante de la leche derivada de microorganismos tales como Rhizomucor miehei y Rhizomucor pusillus, y una quimosina recombinante producida por la introducción del gen de la quimosina de ternero en hongos o levaduras.

25 La enzima coagulante de la leche mencionada anteriormente derivada de un microorganismo, cuando se compara con la quimosina de ternero o la quimosina recombinante, tiene una actividad proteasa no específica más alta. Es un problema cuando la relación C/P (relación entre actividad de coagulación láctea con respecto a la actividad proteasa), que es una importante característica de la enzima de coagulación láctea, es baja. Con el fin de resolver este problema, se expresó y se evaluó una variante del gen de la enzima que coagula la leche en Rhizomucor pusillus, obtenida por mutagénesis dirigida al sitio por manipulación genética. En la variante, la relación C/P se mejoró para que fuera mejor que el tipo silvestre sustituyendo el ácido glutámico de la posición 19 con alanina en la secuencia aminoacídica de la enzima coagulante de la leche (Documento No patente 1).

35 Sin embargo, aunque la actividad coagulante de la leche de la enzima coagulante de la leche desciende aproximadamente en un 40 % con la sustitución de aminoácidos, era difícil poner dicha enzima en una aplicación práctica. Por tanto, se desea una enzima coagulante de la leche derivada de un microorganismo en la que la relación C/P sea alta y la actividad coagulante de la leche se mantenga o se mejore.

Además, se ha intentado la acilación de la enzima coagulante de la leche derivada de microorganismos tales como Rhizomucor pusillus y Rhizomucor miehei con anhídrido dicarboxílico con el fin de mejorar la relación C/P. (Documento patente 1). Con este procedimiento, se obtuvo alguna mejoría, sin embargo no es aún satisfactorio.

[Documento Patente 1] Patente Japonesa Nº 3-18834B

45 [Documento No Patente 1] J. Biochem. 129, 791-794, 2001

Sumario de la Invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una proteasa adecuada para la coagulación láctea en la que la actividad (a partir de ahora denominada “actividad proteasa no específica”) para digerir un enlace peptídico distinto del enlace entre fenilalanina en la posición105 y metionina en la posición 106 de la secuencia aminoacídica de la κcaseína es baja, y se mantiene o mejora la actividad coagulante de la leche.

55 Los inventores de la presente invención han estudiado intensamente para superar el problema descrito anteriormente, y aislaron, entre las cepas mutantes de microorganismos que producen una enzima coagulante de la leche, una cepa mutante que produce una enzima coagulante de la leche en la que la relación C/P está mejorada debido a la reducción de la actividad proteasa no específica; aislaron un gen de la enzima coagulante de la leche de tipo mejorado; determinaron la secuencia de nucleótidos del mismo; expresaron el gen: y midieron la actividad coagulante de la leche y la relación C/P de la enzima coagulante de la leche de tipo mejorado, completando de esta manera la presente invención.

En consecuencia, la presente invención proporciona una proteasa derivada de los microorganismos que tienen una actividad coagulante de la leche, cuya actividad coagulante de la leche se mantiene o está aumentada y la relación

65 C/P está aumentada, también proporciona un ADN que codifica esa proteasa, un vector que contiene el ADN y una célula transformada en la que se ha introducido el vector.

Un aspecto de la presente invención es proporcionar una proteasa de tipo mejorado que comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 75 % idéntica a la SEC ID Nº 3, dicha proteasa de tipo mejorado tiene al menos una mutación seleccionada de entre el grupo que consiste en:

5 (A) sustitución de la glutamina correspondiente a la glutamina en la posición 265 de la SEC ID Nº 3 con un aminoácido ácido; y

(B) sustitución de la glutamina en la posición 266 de la SEC ID Nº 3 con un aminoácido ácido, y en el que dicha proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar la proteasa de tipo mejorado como se describió anteriormente, la cual se selecciona de entre el grupo que consiste en:

(A) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43 excepto por que la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina en la posición 266 se ha(n) sustituido con un aminoácido ácido.

15 (B) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID Nº 3 o 43 excepto por que la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina en la posición 266 se ha(n) sustituido con un aminoácido ácido y no más de 10 aminoácidos (preferentemente no más de 5 aminoácidos, más preferentemente no más de 3 aminoácidos, más preferentemente no más de 2 aminoácidos) en posiciones distintas de 265 y 266 se han sustituido, borrado, insertado o añadido, y en el que dicha proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar la proteasa de tipo mejorado como se ha descrito anteriormente, en el que dicho aminoácido ácido es ácido glutámico o ácido aspártico. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar la proteasa de tipo mejorado que se ha descrito anteriormente, en la que el ácido glutámico de la posición 19 se sustituye con valina, alanina, isoleucina o leucina.

25 Otro aspecto de la presente invención es proporcionar la proteasa de tipo mejorado que se ha descrito anteriormente, en la que la treonina de la posición 81 se ha sustituido con glutamina o ácido aspártico. Un aspecto más de la presente invención es proporcionar un ADN que codifica la proteasa de tipo mejorado que se ha descrito anteriormente. Un aspecto más de la presente invención es proporcionar un vector de expresión que comprende el ADN que se ha descrito anteriormente. Un aspecto más de la presente invención es proporcionar una célula transformada en la que se ha introducido el vector de expresión descrito anteriormente. Un aspecto más de la presente invención es proporcionar la células transformada que se ha descrito anteriormente, siendo dicha célula transformada Saccharomyces cerevisiae.

35 Un aspecto más de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir una proteasa de tipo mejorado que tiene una actividad coagulante de la leche, que comprende las etapas de cultivo de la célula transformada que se ha descrito anteriormente en un medio de cultivo y la recolección de la proteasa del tipo mejorado en el medio de cultivo.

Como la actividad coagulante de la leche se mantiene o se mejora y la relación C/P es alta, se espera que el rendimiento de producción de queso sea más alto con la enzima de tipo mejorado de la presente invención. Además, generalmente una relación C/P más alta implica que el desarrollo de sabor amargo en el queso durante la maduración se reduce, es decir se puede fabricar queso de alta calidad con la enzima mejorada.

45 Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la estructura de un vector de expresión JS4. La Figura 2 muestra el alineamiento de la secuencia de la proteasa proveniente de Rhizomucor pusillus (RMPP) y la proteasa proveniente de Rhizomucor miehei (RMMP).

Descripción de las realizaciones de la invención

La presente se ilustrará en detalle a continuación.

55 1. Proteasa de tipo mejorado (enzima de coagulante de la leche) de la presente invención

La proteasa tipo mejorado de la presente invención comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 75 % idéntica a la SEC ID Nº 3, y tiene al menos una mutación seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(A): la sustitución de glutamina correspondiente a la glutamina en la posición 265 de la SEC ID Nº 3 por un aminoácido ácido; y

(B): la sustitución de glutamina en la posición 266 de la SEC ID Nº 3 por un aminoácido ácido, y que tiene actividad de coagulación láctea.

65 Ejemplos del aminoácido ácido mencionado anteriormente incluyen el ácido glutámico y el ácido aspártico. La proteasa de tipo mejorado de la presente invención tiene preferentemente una identidad de secuencia no menor del 90 %, más preferentemente no menor del 95 % con la secuencia aminoacídica completa SEC ID Nº 3,

En una realización, la proteasa de tipo mejorado de la presente invención se puede obtener introduciendo la(s) mutación(es) en una proteasa de tipo silvestre derivada de Rhizomucor miehei (SEC ID Nº 3). En esta realización, la 5 proteasa tipo mejorado de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en:

(A): una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 excepto por la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina en la posición 266 que se ha(n) sustituido con un aminoácido ácido.

(B): una proteína que comprende secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 excepto por la glutamina en la posición

10 265 y/o la glutamina en la posición 266 que se ha(n) sustituido con un aminoácido ácido y además no se han sustituido, delecionado, insertado o añadido más de 10 aminoácidos en las otras posiciones distintas de la 265 y

266.

La Fig. 2 muestra el alineamiento de la secuencia de la proteasa de Rhizomucor pusillus y la proteasa de

15 Rhizomucor miehei. En ambas secuencias, los aminoácidos de las posiciones 265 y 266 se conservan, por lo que la proteasa de tipo mejorado de la presente invención también se pueden obtener introduciendo una(s) mutación(es) en una proteasa tipo silvestre de Rhizomucor pusillus (SEC ID Nº 43). Por eso, en otra realización, la proteasa de tipo mejorado de la presente invención puede ser una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 43 excepto que la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina en la posición 266 se ha(n) sustituido por un

20 aminoácido ácido. Además, esta proteasa de tipo mejorado puede tener otra mutación (sustituciones, delecciones, inserciones, o adiciones de no más de 10 aminoácidos) distinta de la(s) sustitución(es) en la glutamina de la posición 265 y/o la glutamina de la posición 266, siempre y cuando tenga actividad coagulante de la leche.

En la proteasa de tipo mejorado de la presente invención, el ácido glutámico en la posición 19 y la treonina en la

25 posición 81 de la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43 se pueden sustituir con otros aminoácidos. El ácido glutámico en la posición 19 se sustituye, preferentemente, con valina, alanina, isoleucina o leucina, mientras que la treonina en la posición 81 se sustituye preferentemente con glutamina o ácido aspártico.

En la presente invención, “posición 265”, “posición 266”, “posición 19” y “posición 81” no indica necesariamente una

30 posición absoluta a partir del extremo N de la proteasa sino que indica una relación relativa en comparación con la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43. Por ejemplo, en la proteasa que tiene la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43, cuando se produce la deleción de un aminoácido en el lado del extremo N desde la posición 265, la posición 265 mencionada anteriormente entonces es la posición 264. Incluso en tal caso, el aminoácido en la posición 264 contada desde el resto del extremo N es el aminoácido de “posición 265” en la presente invención. La

35 posición absoluta del aminoácido se determina por el alineamiento de la secuencia aminoacídica de una proteasa de interés con la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43. El aminoácido indicado por la expresión “que corresponde a” también significa un aminoácido en una posición relativa comparada con la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3

o 43.

40 Las SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 43 son secuencias aminoacídicas de la proteasa tipo maduro. La proteasa tipo mejorado de la presente invención puede incluir la secuencia aminoacídica de un péptido de señal, un propéptido y similares.

Con el procedimiento que se describe en los Ejemplos de esta descripción, reproduciendo una cepa mutante que

45 produce una proteasa de tipo mejorado con una relación C/P alta a partir de un microorganismo de tipo silvestre que produce una proteasa que tiene una actividad coagulante de la leche con una relación C/P comparativamente baja y cultivando la cepa mutante en un medio, se puede obtener la proteasa de tipo mejorado de la presente invención a partir de la célula de la cepa mutante o del medio. Ejemplos de microorganismos que producen la proteasa de tipo silvestre con una relación C/P comparativamente baja incluye una cepa del tipo silvestre de Rhizomucor miehei

50 (ATCC 16457), Rhizomucor pusillus (ATCC 16458), y cepas derivadas de las mismas. Estas cepas se pueden se pueden adquirir en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108 EEUU). La proteasa de tipo mejorado de la presente invención también se puede obtener aislando un ADN que codifica la proteasa de tipo mejorado de la cepa mutante mencionada anteriormente y expresando el ADN.

55 Además, la proteasa tipo mejorado de la presente invención también se puede obtener aislando un ADN que codifica la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43 de una cepa tipo silvestre de Rhizomucor miehei (ATC 16457), Rhizomucor pusillus (ATCC 16458), o cepas derivadas de las mismas y modificando el ADN por mutagénesis dirigida al sitio para que codifique la proteasa de tipo mejorado de la presente invención, y a continuación expresando el ADN modificado.

60 La expresión del ADN mencionado anteriormente puede llevarse a cabo construyendo un vector de expresión que contenga el ADN mencionado anteriormente e introduciéndolo en una célula huésped. Aunque la célula huésped puede ser una célula procariota o una célula eucariota, es preferible que sea una célula eucariota. Ejemplos de células eucariotas incluyen células de levaduras, células de hongos, y células vegetales. Se prefieren las células de

65 levaduras y son particularmente preferidas las células de Saccharomyces cerevisiae.

La relación C/P de la proteasa tipo mejorado de la presente invención es mayor que la relación C/P de la proteasa tipo silvestre correspondiente (SEC ID Nº 3 o 43). La relación C/P de la proteasa tipo mejorado de la presente invención es preferentemente no menos de 1,2 veces, más preferentemente no menos de 1,5 veces, y más preferentemente aún, no menos de 2,0 veces más alta que la relación C/P de la proteasa de tipo silvestre (SEC ID

5 Nº 3 o 43). La relación C/P en el presente documento indica [actividad coagulante de la leche (ACL)] / [actividad proteasa (AP)]. La medición de AP y ACL se puede llevar a cabo con los procedimientos descritos a continuación. Aunque para la medición de la ACL hay un Procedimiento de Referencia Internacional (descrito en ISO15174, IDF 176; Cebadora edición , Especificaciones Autoimpuestas para Aditivos Alimentarios), el valor de ACL en la presente descripción se calculó por procedimiento siguiente (denominado en el presente documento como procedimiento Meito).

[1] Medición de AP

15 La caseína producida a partir de leche (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) se disuelve en una solución de fosfato hidrógeno disódico 0,05 M y se ajusta el pH a 6,0 con una solución de ensayo de ácido clorhídrico a 1 mol/l, para preparar una solución sustrato de caseína al 0,6 %. Una muestra de ensayo (0,2 ml), que se había diluido adecuadamente, se añade a 1 ml de esta solución sustrato. La mezcla de deja reaccionar a 37 ºC durante 10 a 30 minutos y luego se finaliza la reacción añadiendo 1 ml de una solución de parada de reacción (una solución que es una mezcla de ácido tricloroacético a 0,11 mol/l, acetato sódico anhidro a 0,21 mol/l, y ácido acético a 0, 33 mol/l). Se obtiene el sobrenadante por centrifugación y se añade 1 ml de carbonato sódico anhidro 0,55 mol/l a 0,4 ml de sobrenadante, y luego se añaden 0,2 ml de una reactivo de fenol fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (reactivo de Folin-Ciocalteu) diluido dos veces. La mezcla se deja reaccionar a 37 ºC durante 30 minutos y se mide la absorbancia (longitud del camino óptico) a 660 nm. De manera separada, se añade un mililitro

25 de la solución de parada de reacción a 1 ml de la solución sustrato, y a continuación se añaden 0,2 ml de una muestra de ensayo. A partir de entonces, se prepara la mezcla de la misma manera y el resultante se utiliza como un blanco. Un valor obtenido restando la absorbancia del blanco de la absorbancia de la muestra de ensayo se convierte en cantidad de tirosina libre para calcular el valor de la AP. La unidad de AP es Unidades/ml. Esta 1 Unidad se refiere a la cantidad de enzima que produce un aumento en la coloración de la sustancia reactivo de fenol equivalente a 1 μmol de tirosina en 1 minuto en el procedimiento mencionado anteriormente. También, la ecuación de correlación entre la tirosina y la coloración de una sustancia reactiva de fenol se obtiene preparando una curva de calibración de tirosina como se describe a continuación.

Curva de calibración de tirosina

35 Se seca una tirosina de referencia (peso molecular 181,2, fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a 105 ºC durante 3 horas. Luego se pesan con precisión 0,050 g de la tirosina de referencia y se disuelve en solución de ensayo de ácido clorhídrico a 0,2 mol/l hasta alcanzar exactamente un volumen final de 50 ml. Se miden precisamente 1, 2, 3 y 4 ml de esta solución y se añade a cada una solución de ensayo de ácido clorhídrico a 0,2 mol/l hasta alcanzar un volumen exacto de 100 ml. Se miden precisamente dos ml de cada solución. Luego se añaden 5 ml de solución de ensayo de carbonato sódico de 0,55 mol/l y 1 ml de reactivo de fenol diluido dos veces. Inmediatamente después de esto, la mezcla se mezcla con agitado y se deja permanecer a 37±0,5 ºC durante 30 minutos. De la solución obtenida se toman 2 ml y se miden las absorbancias A1, A2, A3 y A4 a una longitud de onda de 660 nm junto a una solución de control preparada de forma similar. Poniendo las absorbancias A1, A2, A3 y A4 a

45 lo largo del eje vertical y la cantidad de tirosina (μmol) en 2 ml de cada solución a lo largo del eje horizontal, se prepara la curva de calibración para determinar la cantidad de tirosina (μmol) para una diferencia de absorbancia de

1.

[2] Procedimiento de ensayo para ACL (procedimiento Meito)

Se disuelve leche desnatada desecada, preferentemente fabricada por CHR.HANSEN (al 10 %) en cloruro cálcico 0,01 M (pH 6,0) para usarla como sustrato. Una solución de muestra de ensayo (0,5 ml) preparada a una concentración a la que se forman coágulos durante 2 a 5 minutos, preferentemente cada 2 minutos 30 segundos, se añaden a 5 ml de este sustrato, y la mezcla de mantiene a 35 ºC. Mientras se agita la mezcla con una varilla de

55 cristal, se observa la formación de coágulos para medir el tiempo de formación. Se compara con un valor de la referencia de la cual se conoce la ACL, que es un valor que se mide de manera similar, se determina la ACL calculando cuánta (veces adecuadas) cantidad más de sustrato se necesita para coagular el sustrato en una unidad de tiempo. La ecuación para calcularlo es la siguiente:

ACL (Mu/ml) = S x (TS x WS) / (T x W)

S: actividad específica de la enzima coagulante de la leche de la referencia (Mu/g) TS: Tiempo para la coagulación de la solución de referencia (segundos) WS: cantidad de la referencia en 1 ml de solución de referencia (g)

65 T: tiempo para la coagulación de leche de la solución de la muestra de ensayo (segundos)

W: cantidad de la muestra de ensayo en 1 ml de la solución de la muestra de ensayo (ml) Además, la ACL se puede calcular también por cantidad de unidad proteica cuantificando la cantidad total de proteínas contenida en la muestra de ensayo. En el Ejemplo 13 descrito posteriormente, se calcula la ACL por 1 mg de proteína (Mu/mg de proteína).

5 El valor de la ACL calculada por el procedimiento mencionado anteriormente tiene una correlación con el valor de ACL calculado por el Estándar Internacional (descrito en ISO15174, IDF 176; Cebadora edición , Especificaciones Autoimpuestas para Aditivos Alimentarios). La correlación se puede mostrar con la siguiente fórmula.

1 unidad estándar internacional (IMCU/ml) 1 unidad procedimiento Meito (Mu/ml) / 100

La ACL de la proteasa de la presente invención es preferentemente sustancialmente igual a o mayor que la ACL de la proteasa de tipo silvestre. Cuando la proteasa de la presente invención y la proteasa del tipo silvestre (SEC ID Nº 3 o 43) se preparan bajo condiciones idénticas para comparar sus ACL, la ACL de la proteasa de tipo mejorado de la

15 presente invención es preferentemente no menor de 0,8 veces, más preferentemente no menor de 0,9 veces, más preferentemente aún no menor de 1,0 vez más alta que la ACL de la proteasa de tipo silvestre. Un ejemplo de preparación de la proteasa tipo mejorado de la presente invención y la proteasa tipo silvestre bajo condiciones idénticas incluye la incorporación del ADN que codifica cada proteasa en un vector idéntico para la expresión génica, introduciendo cada uno de estos vectores de expresión en una célula de una cepa idéntica en unas condiciones idénticas, y cultivar la célula bajo condiciones idénticas de cultivo para obtener un cultivo como una solución de proteasa. El cultivo obtenido se puede condensar de una manera idéntica o purificar de manera idéntica para utilizarse.

2. ADN que codifica la proteasa tipo mejorado de la presente invención

25 El ADN de la presente invención es un ADN que codifica la proteasa de tipo mejorado de la presente invención. Ejemplos específicos del ADN de la presente invención incluyen un ADN que comprende los nucleótidos 208 a 1.290 de la SEC ID Nº 1 y un ADN que comprende una secuencia que se hibrida con la secuencia de nucleótidos complementaria a los nucleótidos 208 a 1.290 de la SEC ID Nº 1 bajo condiciones estrictas; y que codifica la proteasa de tipo mejorado que tiene las propiedades mencionadas anteriormente. Ejemplos específicos del ADN de la presente invención incluyen también un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 42 y un ADN que comprende una secuencia que se hibrida con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 42 bajo condiciones estrictas; y que codifica la proteasa tipo mejorado que tiene las propiedades descritas anteriormente. Condiciones estrictas significa condiciones en las que se forma el denominado

35 híbrido específico mientras que no se forma un híbrido no específico. Aunque las condiciones varían dependiendo de la secuencia de nucleótidos o su longitud, los ejemplos de las mismas incluyen condiciones en las que el ADN con alta homología, por ejemplo los ADN que tienen una homología no menor del 75 %, preferentemente no menor del 90 %, más preferentemente no menor del 95 %, se hibridan mutuamente, y los ADN que tienen una homología menor no se hibridan, o condiciones de hibridación, que sean las condiciones normales para el lavado en la hibridación de Southern, a 60 ºC y SSC 1x, un 0,1 % SDS, preferentemente SSC 0,1x y una concentración de sal equivalente a un 0,1 % de SDS.

El ADN que codifica una proteasa de la presente invención se puede aislar de la cepa mutante que tiene la proteasa tipo mejorado mencionada anteriormente por procedimientos convencionales de clonación genética. Por ejemplo, se

45 puede aislar seleccionando el ADN de una biblioteca de genes de la cepa mutante mencionada anteriormente por hibridación con una sonda de oligonucleótidos sintética que tenga como base la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 1 o 42.

También, se puede obtener el ADN que codifica una proteasa de tipo mejorado de la presente invención diseñando cebadores basados en la secuencia de nucleótidos conocida del ADN genómico o del ADNc del gen de la proteasa del tipo silvestre, y amplificando el ADN que proviene de la biblioteca de ADN genómico o del ADNc de la cepa mutante mencionada anteriormente utilizando los cebadores.

El ADN obtenido introduciendo una mutación dirigida al sitio en un ADN tipo silvestre está incluido también entre los 55 ADN que codifican una proteasa de la presente invención.

Por ejemplo, un ADN que codifica la proteasa de tipo mejorado de la presente invención se puede obtener fácilmente aislando un ADN que codifique la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 de la cepa tipo silvestre de Rhizomucor miehei (ATCC 16457) o su cepa derivada, e introduciendo la mutación dirigida al sitio en él. También se puede obtener un ADN que codifica la proteasa de tipo mejorado de la presente invención aislando el ADN que codifica la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 43 de la cepa tipo silvestre de Rhizomucor pusillus (ATCC 16458) o su cepa derivada, e introduciendo la mutación dirigida al sitio en él.

La introducción de la mutación dirigida al sitio se puede llevar a cabo por un procedimiento que es conocido por los

65 expertos en la técnica. Por ejemplo, las mutaciones se pueden introducir sintetizando cebadores que tienen un sitio de escisión de enzimas de restricción en un extremo y que contienen el sitio de mutación en el otro extremo, y sustituyendo una parte correspondiente en un gen no mutado con la parte mutada (procedimiento mutación con casete).

Como procedimientos para la introducción de la mutación dirigida al sitio, por ejemplo, se conocen el procedimiento

5 dúplex Gapped y el procedimiento Kunkel. El procedimiento Kunkel se basa en un principio en el cual el gen no mutado se clona en un fago de cadena sencilla; y se sintetiza una cadena complementaria utilizando un ADN sintético que contiene una falta de coincidencia para un punto mutado como cebador, y luego se producen un nuevo fago y un ADN replicado solamente con la cadena complementaria obtenida que contiene la mutación como matriz. La mutagénesis dirigida al sitio puede llevarse a cabo utilizando un kit disponible comercialmente.

3. Vector de expresión de la presente invención

El vector de expresión de la presente invención se utiliza para expresar la proteasa de tipo mejorado de la presente invención. Puede tener una estructura en la que una secuencia promotora que controla la expresión del ADN está

15 ligada corriente arriba del ADN que codifica la proteasa de tipo mejorado de la presente invención. Además, también puede haber un terminador ligado corriente abajo del ADN.

Se puede utilizar como promotor mencionado anteriormente, cuando el huésped es E. coli, trp, lac, taq, λPL o similares. Cuando el huésped es una levadura, se prefieren los promotores GAL7, ADH, TPI, o PHO5 o similares, y entre estos, se prefiere GAL7 debido a que promueve la expresión génica fuertemente (Nogi Y. y col. Nucl. Acids Res. 11, 8555-8568 (1983)).

Ejemplos del terminador incluyen TPI, GAPDH, y GAL 10. El vector de la presente invención se puede construir uniendo el promotor mencionado anteriormente, el ADN que codifica la proteasa de tipo mejorado de la presente

25 invención, el terminador mencionado anteriormente en orden desde el 5’ corriente arriba al 3’ corriente abajo e insertando el resultado en un vector.

Como un vector capaz de replicarse en levaduras, se puede utilizar cualquier tipo de los plásmidos denominados Ylp, YRp, YEp y YCp. Desde el punto de vista del número de copias y de estabilidad, se prefiere el tipo YEp. Aunque estos plásmidos generalmente contienen una secuencia innecesaria, en atención a la estabilidad del plásmido, o con el fin de facilitar la modificación del plásmido, se prefiere eliminar la secuencia innecesaria.

Se puede insertar también en el vector de expresión de la presente invención, un gen marcador de selección para seleccionar un recombinante o un gen indicador para comprobar la expresión del gen introducido. Ejemplos del gen

35 marcador incluyen los genes de resistencia a la hidromicina, genes resistentes a la kanamicina, y genes de resistencia a la ampicilina. Ejemplos de genes indicadores incluyen genes beta-glucuronidasa (GUS), genes de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), genes de la luciferasa (LUC) y genes GFP. Además, se puede incluir una secuencia adicional en el vector de expresión de la presente invención con el fin de expresar la proteasa de tipo mejorado de la presente invención como un tipo secretor o para facilitar la purificación de la proteasa que se expresa. En este caso la proteasa de la presente invención se expresa como una proteína de fusión con una proteína o péptido que están codificados por la secuencia adicional. Ejemplos de la secuencia adicional incluyen una secuencia de nucleótidos que codifican un péptido de señal o propéptido y la secuencia de nucleótidos que codifican una marca His, o una marca GST.

45 4. Célula transformada de la presente invención

Una célula transformada de la presente invención en la que se ha introducido el vector de expresión de la presente invención, es una célula capaz de producir la proteasa de tipo mejorado de la presente invención. Aunque la célula puede ser una célula procariota o puede ser una célula eucariota, se prefiere que sea una célula eucariota. Ejemplos de células eucariotas incluyen células de levaduras, células de hongos, y células vegetales. Se prefieren las células de levaduras y particularmente se prefiere el Saccharomyces cerevisiae. Ejemplos de Saccharomyces cerevisiae incluyen las cepas SHY3, D13-1A y MC 16.

Un procedimiento para introducir el vector de expresión en la célula huésped se puede seleccionar apropiadamente

55 dependiendo de los tipos de células huésped. Tales procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica. Un transformante de Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo, se puede obtener por el siguiente procedimiento.

El Saccharomyces cerevisiae cultivado en el medio de cultivo YPD (un 1 % de extracto de levadura (fabricado por Difco), un 2 % de Bactopeptona (fabricado por Difco) y un 2 % de glucosa) durante una noche, se inocula en un medio de cultivo YPD recién preparado hasta un volumen final del 10 %, se cultiva a 30 ºC durante 4 horas. El cultivo obtenido (1,5 ml) se somete a centrifugación ligera con una centrífuga desk-top para recolectar las células. Las células se aclaran con LiSCN 0,2 M (fabricado por Kanto Chemical Co. Inc.) y se suspenden en 0,02 ml de LiSCN 1 M.

65 Posteriormente, se mezclan 0,01 ml de una solución que contiene el vector de expresión (aproximadamente 1 a 10 μg) y 0,02 ml de PEG4000, y la mezcla se mantiene a 30 ºC durante 1 hora. Esta mezcla se diluyó añadiendo 0,14 ml de agua estéril y luego se colocaron en dos placas SDah (un 0,67 % de Bacto-yeast con base de nitrógeno con o sin aminoácidos, un 2 % de glucosa, un 0,002 % de sulfato de adenina, un 0,002 % de L-histidina-HCl, un 2 % de agar). Después de incubarse a 30 ºC durante 2 o 3 días, se obtuvieron los transformantes.

5 5. Procedimiento para producir la proteasa de tipo mejorado que tiene actividad coagulante de la leche de la presente invención

Se puede producir la proteasa de tipo mejorado de la presente invención cultivando la célula transformada de la presente invención, y se puede, expresando la proteasa de tipo mejorado de la presente invención como una proteína de fusión con un péptido de señal para la secreción, acumular en un medio la proteasa de tipo mejorado de la presente invención. Cuando se utiliza un promotor inducible, la inducción se lleva a cabo preferentemente durante el cultivo. Aunque varían los procedimientos de cultivo de la célula transformada dependiendo de los tipos de célula, se pueden emplear los procedimientos convencionales. Un ejemplo de procedimiento para cultivar los transformantes de Saccharomyces cerevisiae se describirá

15 posteriormente.

El transformante se cultiva con agitado a 30 ºC durante dos días en 50 ml de medio de cultivo YPD en un matraz de Sakaguchi de 500 ml para la proliferación de células de levadura. El medio de cultivo se centrifuga a 1000x g durante 4 minutos para recolectar las células. Las células se vuelven a suspender en 100 ml de medio de cultivo YPGal (un 1 % de extracto de levadura, un 2 % de Bactopeptona, un 4 % de galactosa (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) y se cultivan con agitado en el matraz de Sakaguchi de 500 ml a 30 ºC durante tres días.

La proteasa que tiene actividad coagulante de la leche, proteasa que se segrega en el medio, se puede utilizar en el estado en el que está en el sobrenadante del cultivo y también se puede utilizar condensando el sobrenadante del

25 cultivo. La proteasa que tiene actividad coagulante de la leche, proteasa que se segrega en el medio, puede purificarse o purificarse parcialmente. Se puede llevar a cabo la purificación o la purificación parcial, utilizando un procedimiento general para purificar proteínas. Por ejemplo, se puede utilizar una técnica que incluya una cromatografía tal como de intercambio iónico o por filtración en gel, aplicando una sal de sulfato amónico o sedimentando con un disolvente orgánico.

La enzima purificada se puede condensar también por liofilización, ultrafiltración por membrana, sedimentación con el disolvente orgánico o similar.

Ejemplos

35 0053 En adelante, la presente invención se describirá ahora concretamente por medio de ejemplos pero el ámbito técnico de la presente invención no se restringe a estas ilustraciones ejemplares. También, todas las manipulaciones genéticas se pueden llevar a cabo como se describe en Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

[Ejemplo 1]

Adquisición de la cepa mutante de Rhizomucor miehei que produce una proteasa con una relación C/P mejorada Se sometió una cepa parental de Rhizomucor miehei (CBS 182-67 (una cepa derivada de ATCC 16457)) que

45 produce una proteasa a un tratamiento de mutagénesis, obteniéndose de este modo una cepa mutante que segrega una proteasa con la relación C/P mejorada. Los detalles se ilustran posteriormente.

(1) Tratamiento de mutagénesis

La cepa parental de Rhizomucor miehei se cultivó en una placa de malta (2 % de extracto de malta, 2 % de glucosa, 0,1 % de peptona, 2 % de agar), y se mantuvo durante 3 días a una semana a 37 ºC para permitir la formación de esporas. Estas esporas se resuspendieron en agua estéril utilizando un esparcidor de cristal.

Se añadió Nitrosoguanidina (N-metil- N’- nitro- N-nitrosoguanidina, fabricada por SIGMA CHEMICAL CO.) a la

55 suspensión de esporas hasta una concentración final de 200 μg/ml. La mezcla se trató a temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos hasta una tasa de mortalidad del 90 %. Una cantidad apropiada de esta mezcla se colocó en la placa malta, y la placa resultante se mantuvo a 37 ºC. Al día siguiente, cada grupo de diminutas hifas fúngicas obtenidas se inocularon en 8 ml de medio de cultivo YPD (1 % de extracto de levadura, 2 % de peptona, 2 % de glucosa), y se utilizó el sobrenadante del cultivo después de cultivarlas a 37 ºC durante 4 días, como muestra para medir la actividad proteasa (AP) y la actividad coagulante de la leche (ACL). Las células se almacenaron a -80 ºC.

(2) Búsqueda de la proteasa de tipo mejorado

Según el resultado de la medición de ACL y AP por el procedimiento descrito anteriormente se había obtenido una

65 proteasa de tipo mejorado cuya AP era mucho menor que la de la cepa parental y cuya relación C/P (ACL/AP) se había aumentado mucho, como 4,6 veces al compararse con la cepa parental.

[Ejemplo 2]

Aislamiento de un gen de proteasa de la cepa mutante

5 (1) Adquisición del ADN cromosómico de la cepa mutante y la cepa parental

La cepa mutante obtenida en el Ejemplo 1 y la cepa parental se cultivaron en placas de malta, y se mantuvieron a 37 ºC durante tres días a una semana para permitir la formación de esporas. Estas esporas se suspendieron en agua estéril utilizando un dispersador de cristal. Esta suspensión de esporas se sembró en 200 ml de medio YPD líquido en un matraz de Sakaguchi de 500 ml de forma que cada matraz contenía aproximadamente 1x108 esporas, y se cultivaron durante dos días a 37 ºC. En el momento que las células formaron un aglomerado con un tamaño de aproximadamente 0,5 a 2 mm, el medio se filtró y se eliminó la humedad excesiva para obtener un peso húmedo de aproximadamente 5 g de células.

15 Después de congelarlas con nitrógeno líquido, las células se transfirieron a un mortero preenfriado y se añadieron 3 g de arena marina (850 a 1400 μm). La mezcla se molió finamente con una mano de mortero bajo enfriamiento con nitrógeno líquido, hasta que se pulverizó. Se suspendió este polvo en 15 ml de una solución que contenía EDTA 0,05 M pH 8,5 y 0,2 % de SDS, dicha solución se había precalentado a 68 ºC durante 14 minutos. Luego se dejó estar y se permitió que se enfriara hasta alcanzar la temperatura ambiente, y se recogió el sobrenadante turbio por centrifugación. Después de añadir un volumen 1/10 de acetato sódico 3 M a la solución recolectada, la mezcla se agitó medianamente y se recolectó el sobrenadante por centrifugación. A continuación, cuando se añadieron 15 ml de isopropanol al sobrenadante recolectado y se mezcló lentamente, apareció un conglomerado de ADN genómico y proteínas. Después, se aclaró el precipitado generado con etanol al 70 %, y el resultante se secó bajo presión reducida, se disolvió en 400 μl de TE, y 10 μl de solución de RNasa (10 mg/ml). La mezcla se mantuvo a 37 ºC

25 durante 1 hora. Después del final del tratamiento con RNasa, se llevó a cabo un tratamiento con fenol/cloroformo y un tratamiento con cloroformo, seguidos por una precipitación en etanol, obteniéndose de esta manera el ADN genómico.

(2) Aislamiento del gen de la proteasa del ADN cromosómico de la cepa mutante y la cepa parental

El gen de la proteasa se aisló por PCR utilizando el ADN cromosómico derivado de la cepa mutante que se obtuvo anteriormente y la cepa parental como matriz. Basándose en la secuencia de la proteasa de Rhizomucor miehei registrada en el banco de genes (número de registro DDBJ: E01264), se prepararon los cebadores de la SEC ID Nº 5 y SEC ID Nº 6. Las condiciones de la PCR fueron (a) a 94 ºC durante 2 minutos; (b) 28 ciclos de 94 ºC durante 30

35 segundos- 55 ºC durante 30 segundos- 72 ºC durante 3 minutos; y (c) 72 ºC durante 5 minutos. Se utilizó como polimerasa TaJaRa Ex Taq (fabricada por Takara Bio Inc.). Como resultado de la determinación de la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN obtenido por PCR, se reveló que la secuencia aminoacídica codificada por el ADN amplificado con el ADN cromosómico de la cepa parenteral como matriz contenía la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3. La secuencia aminoacídica codificada por el ADN amplificado con el ADN cromosómico de la cepa mutante como matriz contenía la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 4, de forma que el aminoácido en la posición 19 se había sustituido valina y el aminoácido en la posición 266 había sido sustituido con ácido glutámico. De aquí en adelante, la proteasa derivada de la cepa parental de Rhizomucor miehei se denomina RMMP tipo silvestre, y la proteasa de tipo mejorado se llama “RMMP mejorada” y un gen que codifica la proteasa tipo mejorado se llama “gen RMMP mejorado”.

45 [Ejemplo 3]

Construcción de un plásmido vector JS4 para expresar un proteína ajena utilizando como huésped levadura germinada (Saccharomyces cerevisiae) MC16.

Se utilizó el JS5 (descrito en la Patente Japonesa Nº 3012377 [0109]) como material de partida para construir el plásmido vector JS4. Cebadoro, se llevó a cabo una PCR utilizando cebadores ADN de la SEC ID Nº 7 y 8 con JS5 como matriz, obteniéndose de esta manera el producto de PCR de 0,55 kpb que contenía una región promotora GAL7. Las

55 condiciones de la PCR fueron (a) 94 ºC durante 2 minutos (b) 30 ciclos de 98 ºC durante 10 segundos-52 ºC durante 30 segundos-72 ºC durante 1 minuto; y (c) 72 ºC durante 5 minutos. Se utilizó como polimerasa TaKaRa Ex Taq (fabricada por Takara Bio Inc.). Como ciclador térmico se utilizó el Thermal Cycler Dice Gradient PCR TaKaRa (fabricado por Takara Bio Inc.).

Después, el producto PCR obtenido se digirió por las enzimas de restricción EcoR I y BamHI y se insertó en pUC18 el cual también había sido digerido por EcoR I y BamHI. El plásmido obtenido se introdujo en E. coli DH5α, y las células se dispersaron en una placa LB agar que contenía 100 μg/ml de ampicilina, IPTG 0,1 mM y 0,04 mg/ml de X-GAL, y se incubaron a 37 ºC durante 14 a 16 horas. Se extrajo el plásmido de las células recolectadas por centrifugación utilizando el kit QIAprep Miniprep (QIAGEN, de aquí en adelante todas las extracciones de plásmido

65 se llevaron a cabo utilizando este kit). Se llevó a cabo la secuenciación del fragmento insertado para confirmar que no se habían introducido mutaciones no deseadas.

Posteriormente, el plásmido que contenía el fragmento insertado se digirió con EcoR I y BamHI para obtener un fragmento de ADN de 0,55 kpb, y luego se unieron este fragmento de ADN y el fragmento de ADN de aproximadamente 6 kpb obtenido por digestión del JS5 con BamHI seguida por la digestión parcial con EcoR I. El plásmido resultante se introdujo en E. coli DH5α y la E. coli transformada se cultivó en medio LB agar que contenía

5 100 μg/ml de ampicilina a 37 ºC durante 16 horas. La colonia que apareció se cultivó con agitado en mismo medio de cultivo a 37 ºC durante 14 a 16 horas y a continuación se extrajo el plásmido del transformante recolectado por centrifugación. Este plásmido se digirió con las enzimas de restricción EcoR I, BamH I, y Pst I, para confirmar el patrón de migración por el análisis de electroforesis en gel de agarosa. De esta manera se preparó el vector de expresión JS4.

10 Como material de partida para construir este plásmido vector, además del JS5, también se puede utilizar por ejemplo, el JS52 (número de registro FERM BP-3898) descrito en el párrafo 0112 de la Patente Japonesa Nº 3012377.

[Ejemplo 4]

15 Construcción del plásmido vector para la expresión el gen RMMP tipo silvestre y el gen RMMP mejorado

Utilizando los cebadores (SEC ID Nº 9 y 10) diseñados para tener un sitio BamHI en ambos extremos de la secuencia de nucleótidos que contiene el ADN que codifica la RMMP tipo silvestre o la RMMP mejorada con las

20 mutaciones Glu19Val/Gln266Glu, que se obtuvo en el Ejemplo 2, se llevó a cabo la PCR. El producto de la PCR que se obtuvo se digirió con BamHI, se insertó en el JS4 que igualmente se había desfosforilado y digerido con BamHI, y el vector obtenido se introdujo en E. coli DH5α.

Utilizando un cebador directo que se puede hibridar con el promotor GAL7 y un cebador inverso que se puede

25 hibridar con el extremo 3’ del gen RMMP (SEC ID Nº 11 y 10), se llevó a cabo la PCR directa de la colonia. Se sometió un transformante de E. coli que tenía el plásmido vector en el que se había confirmado que la dirección del gen insertado era correcta, a cultivo líquido como se describió anteriormente. El plásmido se extrajo y se sometió a secuenciación para confirmar que no se habían introducido errores no deseados, y de esta manera se obtuvieron los plásmidos vectores para expresar el gen RMMP tipo silvestre y el gen RMMP mejorado.

30 [Ejemplo 5]

Construcción del vector de expresión de los genes RMMP mejorados en los que se introduce la mutación dirigida al sitio (I)

35 El producto PCR del gen RMMP de tipo silvestre obtenido por el procedimiento descrito en el Ejemplo 4, que contenía una secuencia prepro y los sitios BamH I en cada extremo, se digirió con BamH I y se insertó en pUC18 que igualmente se digirió con BamHI y se desfosforiló. El plásmido resultante se introdujo en E. coli DH5α y luego se extrajo el plásmido del transformante obtenido y se confirmó su secuencia de nucleótidos y de esta manera se

40 obtuvo el pRMMP-wt.

A continuación llevando a cabo una PCR utilizando el pRMMP-wt como matriz, los pares cebadores de SEC ID Nº 12 y 13, SEC ID Nº 14 y 15, SEC ID Nº 16 y 17, SEC ID Nº 18 y 19, SEC ID Nº 20 y 21, SEC ID Nº 22 y 23, o SEC ID Nº 24 y 25 y el kit básico de mutagénesis PrimeSTAR (Takara Bio Inc., de aquí en adelante denominado “kit” para

45 acortar), se introdujeron mutaciones tales como la sustitución de un resto de ácido glutámico en la posición 19 o glutamina en la posición 266 de la SEC ID Nº 3 con otro aminoácido. Los experimentos de diseño de cebadores para introducir la mutación y la PCR se llevaron a cabo en referencia al manual adjunto de este kit. Los experimentos de mutagénesis se llevaron a cabo según el manual.

50 Los productos obtenidos por PCR se introdujeron en E. coli DH5α, y las células se dispersaron en una placa LB agar que contenía 100 μg/ml de ampicilina, y se incubaron a 37 ºC durante 16 horas, obteniéndose así los transformantes. Se extrajeron los plásmidos de estos transformantes por el mismo procedimiento que se describe anteriormente y se sometieron a secuenciación para confirmar que no se habían introducido mutaciones no deseadas.

55 Por tales procedimientos, se prepararon los genes que codificaban las RMMP mejoradas que tenían una mutación de Glu19Val, Glu19Ala, Glu19Ile, Glu19Leu, Glu19Phe, Gln266Glu, o Gln266Asp. Estos plásmidos vectores que contenían el gen RMMP mejorado se denominaron respectivamente como pRMMP-E19V, pRMMP-E19A, pRMMP-E19I, pRMMP-E19L, pRMMP-E19F, pRMMP-Q266E y pRMMP-Q266D.

60 Después, se llevó a cabo la PCR utilizando pRMMP-Q266E y pRMMP-Q266D como matriz, los pares cebadores SEC ID Nº 12 y 13, SEC ID Nº 14 y 15, SEC ID Nº 16 y 17 o SEC ID Nº 18 y 19 así como el kit mencionado anteriormente. Los productos obtenidos por PCR se introdujeron en E. coli DH5α y luego se extrajeron los plásmidos de los transformantes obtenidos de la misma manera que se describe anteriormente y se secuenciaron, de forma

65 que se obtuvieron los genes que codificaban la RMMP mejorada que tenían las mutaciones Glu19Val / Gln266Asp, Glu19Ala / Gln266Glu, Glu19Ala / Gln266Asp, Glu19Ile / Gln266Glu, Glu19Ile / Gln266Asp, o Glu19Leu / Gln266Glu. Estos plásmidos vectores que contenían el gen RMMP mejorado se denominaron respectivamente pRMMP-E19VQ266D, pRMMP-E19AQ266E, pRMMPE19AQ266D, pRMMP-E19IQ266E, pRMMP-E19IQ266D, and pRMMP-E19LQ266E.

5 Los plásmidos vectores obtenidos de esta manera se digirieron con BamH I, se insertaron los fragmentos obtenidos en el JS4 por los procedimientos descritos anteriormente, y de esta manera se obtuvieron los vectores de expresión para cada uno de los genes RMMP mejorados mencionados anteriormente.

[Ejemplo 6]

Construcción del vector de expresión de los genes RMMP mejorados en los que se introduce la mutación dirigida al sitio (II)

15 Posteriormente, utilizando el pRMMP-wt como matriz, utilizando los pares cebadores SEC ID Nº 26 y 27, SEC ID Nº 28 y 29, SEC ID Nº 30 y 31, SEC ID Nº 32 y 33, SEC ID Nº 34 y 35 o SEC ID Nº 36 y 37 así como el kit mencionado anteriormente se llevó a cabo la PCR. Los productos obtenidos de la PCR se introdujeron en E. coli DH5α y se extrajeron los plásmidos de los transformantes obtenidos de la misma manera que se describió anteriormente y se secuenciaron, de esta manera se obtuvieron los genes que codifican la RMMP mejorada que tenían las mutaciones Gln265Glu, Gln265Asp, Gln265Glu / Gln266Glu, Gln265Glu / Gln266Asp, Gln265Asp / Gln266Glu o Gln265Asp / Gln266Asp. Estos plásmidos vectores que contenían el gen RMMP mejorado se denominaron respectivamente pRMMP-Q265E, pRMMP-Q265D, pRMMPQ265EQ266E, pRMMP-Q265EQ266D, pRMMP-Q265DQ266E y pRMMP-Q265DQ266D.

25 Los genes RMMP mejorados se obtuvieron por digestión de los plásmidos vectores así obtenidos con BamH I y se insertaron en JS4 por el procedimiento descrito anteriormente, de esta manera se obtuvieron los vectores de expresión de los genes RMMP mejorados mencionados anteriormente.

[Ejemplo 7]

Construcción de los vectores de expresión de los genes RMMP mejorados en los que se introduce la mutación dirigida al sitio (III)

Se llevó a cabo la PCR utilizando pRMMP-E19V, pRMMP-E19A o pRMMP-E19I como matriz, los pares cebadores

35 SEC ID Nº 30 y 31, SEC IDNº 32 y 33, SEC ID Nº 34 y 35 o SEC ID Nº 36 y 37 así como el kit mencionado anteriormente. Los productos obtenidos de la PCR se introdujeron en E. coli DH5α y se extrajeron los plásmidos de los transformantes obtenidos de la misma manera que se describió anteriormente y se secuenciaron, de esta manera se obtuvieron los genes que codifican la RMMP mejorada que tenían las mutaciones Glu19Val / Gln265Glu / Gln266Glu, Glu19Val / Gln265Glu / Gln266Asp, Glu19Val / Gln265Asp / Gln266Glu, Glu19Val / Gln265Asp / Gln266Asp, Glu19Ala / Gln265Glu / Gln266Glu, Glu19Ala/ Gln265Glu / Gln266Asp, Glu19Ala / Gln265Asp / Gln266Glu, Glu19Ala / Gln265Asp / Gln266Asp, Glu19Ile /Gln265Glu / Gln266Glu, Glu19Ile / Gln265Glu / Gln266Asp, Glu19Ile / Gln265Asp / Gln266Glu o Glu19Ile / Gln265Asp / Gln266Asp. Estos plásmidos vectores que contenían el gen RMMP mejorado se denominaron respectivamente pRMMPE19VQ265EQ266E, pRMMP-E19VQ26SEQ266D, pRMMP-E19VQ265DQ266E, pRMMP-E19VQ265DQ266D, pRMMP-E19AQ265EQ266E,

45 pRMMP-E19AQ265EQ266D, pRMMP-E19AQ265DQ266E, pRMMPE19AQ265DQ266D, pRMMP-E19IQ265EQ266E, pRMMP-E19IQ265EQ266D, pRMMP-E19IQ265DQ266E y pRMMP-E19IQ265DQ266D.

Los genes RMMP mejorados se obtuvieron por digestión de los plásmidos vectores así obtenidos con BamH I y se insertaron en JS4 por el procedimiento descrito anteriormente, de esta manera se obtuvieron los vectores de expresión de los genes RMMP mejorados mencionados anteriormente.

[Ejemplo 8]

Transformación de levadura MC16 en germinación con el vector de expresión que contiene el tipo silvestre o 55 mejorado del gen RMMP

Los vectores de expresión producidos y descritos anteriormente se introdujeron en la levadura MC16 en germinación (MATa, leu2, his4, ade2) por el procedimiento de Gietz y Schiestl (1995), y las células se dispersaron en una placa SDah, y se incubaron a 30 ºC durante 3 días, de esta manera se obtuvieron los transformantes.

[Ejemplo 9]

Expresión secretora de las RMMP tipo silvestre y mejorado

65 Los transformantes obtenidos por el procedimiento descrito anteriormente se cultivaron con agitado a 200 rpm en 100 ml de medio líquido YPD a 30 ºC durante 24 horas, que se había preparado anteriormente en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml. Las células de levadura recolectadas por centrifugación se resuspendieron en una cantidad doble de medio líquido YPGal, y se transfirieron a un matraz de Erlenmeyer estéril, y después se cultivaron con agitado de la misma manera durante 72 a 96 horas para la expresión secretora. Después del cultivo, el medio de cultivo se centrifugó obteniendo así el sobrenadante del cultivo que contenía la RMMP mencionada anteriormente.

5 [Ejemplo 10]

Medición de ACL y AP y evaluación de la relación C/P

10 Así, en el sobrenadante del cultivo que contenía la RMMP, se midieron la ACL y la AP para calcular la relación C/P. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

[Tabla 1]

Nº: Mutaciones Relación C/P relativa (la relación C/P del tipo silvestre se toma como 1)

Tipo Silvestre Tipo Mejorado: RMMP tipo silvestre Glu19Val/Gln266Glu 1,0 3,8

1.: Glu19Val 1,9

2.: Glu19Ala 2,2

3.: Glu19Ile 1,7

4.: Glu19Leu 0,9

5.: Glu19Phe. N.D.

6.: Gln266Glu 1,4

7.: Gln266Asp 1,7

8.: Glu19Ala/Gln266Glu 2,9

9.: Glu19Ile/Gln266Glu 2,6

10.: Glu19Leu/Gln266Glu 1,7

11.: Glu19Val/Gln266Asp 3,7

12.: Glu19Ala/Gln266Asp 2,7

13.: Glu19Ile/Gln266Asp 3,0

14.: Gln265Glu 1,3

15.: Gln265Asp 1,5

16.: Glu265Glu/Gln266Glu 2,2

17.: Gln265Glu/Gln266Asp 2,8

18.: Gln265Asp/Gln266Glu 2,7

19.: Gln265Asp/Gln266Asp 3,0

20.: Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Glu 4,9

21.: Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Asp 5,1

22.: Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Glu 4,0

23.: Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Asp 4,7

24.: Glu19Ala/Gln265Glu/Gln266Glu 3,5

25.: Glu19Ala/Gln265Glu/Gln266Asp 3,3

26.: Glu19Ala/Gln265Asp/Gln266Glu 3,2

27.: Glu19Ala/Gln265Asp/Gln266Asp 3,3

28.: Glu19Ile/Gln265Glu/Gln266Glu 3,5

29.: Glu19Ile/Gln265Glu/Gln266Asp 3,6

30.: Glu19Ile/Gln265Asp/Gln266Glu 3,5

31.: Glu19Ile/Gln265Asp/Gln266Asp 3,5

N.D.: no detectado (La actividad coagulante de la leche y la actividad proteasa no se pudieron detectar).

La relación C/P de la RMMP que tiene la mutación Glu19Val/Gln266Glu derivada de Rhizomucor miehei (cepa 15 mutante) era 3,8 veces mayor que la del tipo silvestre.

La RMMP que tenía las mutaciones de Glu19Val, Glu19Ala, y Glu19Ile mostraban una relación C/P mayor. En Rhizomucor pusillus, la mutación de Glu19Ala ya se conocía (J. Biochem. 129, 791-794, 2001).

20 En la RMMP de tipo silvestre, como se muestra en la SEC ID Nº 3, los aminoácidos en las posiciones 265 y 266 ambos son glutamina. Se confirmó que la relación C/P de la RMMP que tiene solo una sustitución de glutamina en la posición 265 con un aminoácido ácido, Gln265Glu y Gln265Asp (el tipo mejorado 14 y 15 en la Tabla 1) eran mayores ambas, al comparase con las del tipo silvestre. De manera similar, la relación C/P de la RMMP que tienen solamente la sustitución de glutamina en la posición 266 con el aminoácido ácido, Gln266Glu y Gln266Asp (los tipos

25 mejorados 6 y 7 en la Tabla 1) eran ambas mayores, al compararse con el tipo silvestre. La presente invención ha revelado por Cebadora vez que la relación C/P aumenta por la sustitución de glutamina en la posición 265 o 266.

Además, se confirmó que cuando se combinan la sustitución de glutamina en la posición 266 con el aminoácido ácido y la sustitución del ácido glutámico en la posición 19 (los tipos mejorados 8 a 13 en la Tabla 1), la relación C/P es más alta que en el caso en el que solo se sustituía la glutamina en la posición 266.

5 Además, la relación C/P de las RMMP que tienen las mutaciones Gln265Glu/Gln266Glu, Gln265Glu/Gln266Asp, Gln265Asp/Gln266Glu y Gln265Asp/Gln266Asp, en las que los aminoácidos en las posiciones 265 y 266 se sustituyeron simultáneamente con aminoácidos ácidos (los tipos mejorados 16 a 19 en la Tabla 1), era significativamente mayor que la de las RMMP que tenían la mutación en la que se había sustituido solamente la glutamina en la posición 265 o solamente la glutamina en la posición 266 con aminoácidos ácidos.

10 Además, la relación C/P de las RMMP que tienen las mutaciones Glu19Val/Gln265Glu/Gln66Glu, Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Asp, Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Glu y Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Asp, en las que los aminoácidos de las posiciones 265, 266 y 19 se sustituyeron simultáneamente con aminoácidos ácidos (los tipos 20 a 23 en la Tabla 1), era significativamente mayor (hasta aproximadamente cinco veces), al compararse con la RMMP

15 tipo silvestre. Esto confirmaba que las proteasas de tipo mejorado eran extremadamente excelentes como enzimas coagulantes de leche.

[Ejemplo 11]

20 Construcción del vector de expresión de los genes RMMP mejorados en los que se introduce la mutación dirigida al sitio (IV)

Posteriormente, se preparó un vector de expresión del gen RMMP que tiene la mutación en la que la treonina en la posición 81 de la SEC ID Nº 3 se sustituyó por glutamina o ácido aspártico.

25 Se llevó a cabo la PCR utilizando pRMMP-wt o pRMMP-Q265EQ266E como matrices, los cebadores de las SEC ID Nº 38 y 39, así como el kit mencionado anteriormente. Los productos que se obtuvieron por PCR se introdujeron en

E. coli DH5α y luego los plásmidos se extrajeron de los transformantes obtenidos de la misma manera que se describió anteriormente y se secuenciaron, obteniendo los genes que codifican RMMP mejoradas que tienen

30 mutaciones Thr81Gln y Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu. Estos plásmidos vectores que contienen los genes RMMP mejorados fueron denominados respectivamente pRMMPT81Q y pRMMP-T81QQ265EQ266E.

Posteriormente se llevó a cabo una PCR utilizando RMMP-Q265EQ266D como matriz, los ADN cebadores de la SEC ID Nº 40 y 41, así como el kit mencionado anteriormente. El producto obtenido de la PCR se introdujo en E. coli

35 DH5α y luego el plásmido se extrajo de los transformantes obtenidos de la misma manera que se describió anteriormente y se secuenció, obteniendo los genes que codifican RMMP mejoradas que tienen las mutaciones Thr81Asp/Gln265Glu/Gln266Asp. El plásmido vector que contenía el gen RMMP mejorado se denominó pRMMP-T81DQ265EQ266D.

40 Además, se llevó a cabo una PCR, utilizando pRMMP-E19VQ265EQ266E, pRMMP-E19VQ265 EQ266D, pRMMP-E19VQ265DQ266E, pRMMP-E19VQ265DQ266D, pRMMP-E19AQ265EQ266E, pRMMP-E19AQ265EQ266D, pRMMP-E19IQ265EQ266E, pRMMP-E19IQ265EQ266D, pRMMP-E19IQ265DQ266E o pRMMP-E19IQ265DQ266D como matrices, los cebadores de la SEC ID Nº 38 y 39, así como el kit mencionado anteriormente. Los productos que se obtuvieron por PCR se introdujeron en E. coli DH5α y luego los plásmidos se extrajeron de los

45 transformantes obtenidos de la misma manera que se describió anteriormente y se secuenciaron, obteniendo los genes que codifican RMMP mejoradas que tienen las mutaciones Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu, Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp, Glul9Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu,

50 Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Asp, Glu19Ala/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu, Glu19Ala/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp, Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu, Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp,

55 Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu, o Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Asp. Estos plásmidos vectores que contienen los genes RMMP mejorados se denominaron respectivamente pRMMP-E19VT81QQ265EQ266E, pRMMP-E19VT81QQ265EQ266D, pRMMPE19VT81QQ265DQ266E, pRMMP-E19VT81QQ265DQ266D, pRMMP-E19AT81QQ265EQ266E, pRMMPE19AT81QQ265EQ266D, pRMMP-E19IT81QQ265EQ266E, pRMMP-E19IT81QQ265EQ266D,

60 pRMMPE19IT81QQ265DQ266E y pRMMP-E19IT81QQ265DQ266D.

Los genes RMMP mejorados se obtuvieron digiriendo los plásmidos vectores obtenidos de esa manera con BamH I e insertándolos en JS4 por el procedimiento descrito anteriormente, de esta manera se obtuvieron los vectores de expresión de los genes RMMP mejorados que se mencionaron anteriormente.

65 [Ejemplo 12]

De acuerdo con los procedimientos descritos en los Ejemplos 8 a 10, los vectores de expresión que se prepararon en el Ejemplo 11 se introdujeron en levadura MC16 en germinación y los transformantes se sometieron a cultivo

5 líquido, de forma que se obtuvo un sobrenadante del cultivo que contenía la RMMP mejorada. Así, en el sobrenadante del cultivo que contenía la RMMP, se midieron la ACL y la AP para calcular la relación C/P. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

[Tabla 2]

Nº: Mutaciones Relación C/P relativa (la relación C/P del tipo silvestre se toma como 1).

32. 33. 34.: Thr81Gln Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu Thr81Asp/Gln265Glu/Gln266Asp 1,1 2,6 4,4

35. 36. 37. 38.: Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Asp 4,3 3,8 4,8 2,9

39. 40.: Glu19Ala/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu Glu19Ala/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp 3,2 3,0

41. 42. 43. 44.: Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Glu/Glu266Asp Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Asp 3,0 2,8 2,7 3,0

10 Como se muestra en la Tabla 2, se confirmó que la RMMP que tiene las sustituciones en la treonina de la posición 81 con glutamina o ácido aspártico y las glutaminas de las posiciones 265 y 266 con aminoácidos ácidos (los tipos mejorados 33 y 34 en la Tabla 2) mostraron una relación C/P mayor que la de la RMMP tipo silvestre. En particular, la relación C/P de la RMMP que tenía las mutaciones Thr81Asp/Gln265Glu/Gln266Asp aumentaron hasta 4,4 veces, al compararse con la de la RMMP tipo silvestre.

15 En casos en los que la sustitución del ácido glutámico en la posición 19 se combinó con las sustituciones anteriores, la relación C/P fue mayor que la de la RMMP tipo silvestre (los tipos mejorados 35 a 44 en la Tabla 2) En particular, la relación C/P de la RMMP que tenía la mutación Glu19Val/Thr81Gln/ Gln265Asp/Gln266Glu aumentó hasta 4,8 veces, en comparación con el de la RMMP tipo silvestre.

20 Los resultados mostrados en la Tabla 1 y la Tabla 2 indican que cuando la glutamina en las posiciones 265 y/o 266 en la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 se sustituye(n) con aminoácidos ácidos, aumenta la relación C/P, al compararse con la de la RMMP tipo silvestre, y la combinando la(s) sustitución(es) de aminoácidos en las posiciones 19 y/u 81, la relación C/P aumenta más.

25 [Ejemplo 13]

Purificación de las RMMP de tipo silvestre y mejorada y evaluación de la enzima purificada

La levadura MC16 que albergaba el vector de expresión que contenía el gen RMMP de tipo silvestre, o el gen RMMP

30 mejorado que tenía las mutaciones Glu19Val/Gln266Glu, Glu19Val, Glu19Ala, Gln266Glu, Gln266Asp, Glu19Ala/Gln266Glu, Gln265Glu, Gln265Asp, Gln265Glu/Gln266Glu, Gln265Glu/Gln266Asp, Gln265Asp/Gln266Glu, Gln265Asp/Gln266Asp, Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Asp o Glu19Val/ Gln265Asp/ Gln266Asp se cultivó según el procedimiento descrito anteriormente para permitir la expresión secretora de RMMP. Se aplicó el sobrenadante del cultivo recolectado por centrifugación en una columna cargada con HiTrap Q HP(fabricado por GE Healthcare), que

35 se había equilibrado antes con tampón de acetato sódico 50 mM, pH 5,5, para absorber la proteína RMMP. Después del lavado de la columna con el mismo tampón, se eluyó la proteína con tampón de NaCl 0,3 M. Se pusieron dos μl de la fracción en una placa de leche desnatada (un 1 % de leche desnatada (fabricada por Difco), tampón de ácido acético 100 mM pH 5,2, y un 1 % de agar) y se incubó a 37 ºC durante 10 minutos, se detectó la fracción activa por la aparición de un halo turbio.

40 La fracción activa obtenida se concentró con una membrana de ultrafiltración y luego se purificó en por cromatografía líquida de altas prestaciones utilizando la columna de filtración en gel Super SW3000 (fabricada por Tosoh Corporation). Cuando la fracción purificada se analizó por SDS-PAGE, se observó una única banda. Los resultados de la medición de ACL para la RMMP purificada obtenida de este modo se muestran en la Tabla 3.

45 La cuantificación de proteínas se llevó a cabo con el Reactivo de Ensayo Proteico BCA (fabricado por Pierce).

[Tabla 3]

Mutaciones: ACL (x103 Mu/mg·proteína)

RMPP tipo silvestre Glu19Val/Gln266Glu: 3,89 4,15

Glu19Val: 2,19

Glu19Ala: 2,43

Gln266Glu: 4,24

Gln266Asp: 4,01

Glu19Ala/Gln266Glu: 4,23

Gln265Glu: 4,22

Gln265Asp: 4,03

Gln265Glu/Gln266Glu: 3,91

Gln265Glu/Gln266Asp: 3,74

Gln265Asp/Gln266Glu: 3,90

Gln265Asp/Gln266Asp: 3,92

Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Asp: 4,52

Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Asp: 4,27

A partir de estos resultados, la ACL disminuye con la sustitución del ácido glutámico en la posición 19 solo, mientras que se incrementa con la sustitución de la glutamina en la posición 265 o 266. La ACL también se incrementa con las sustituciones en las posiciones 19 y 266 y las sustituciones en las posiciones 19, 265 y 266.

5 [Ejemplo 14]

Medición del peso de sustancia seca en el suero lácteo

10 La producción de queso es una de las características importantes del uso comercial de una enzima coagulante de la leche. La medición del peso de sustancia seca en el suero es un índice útil para evaluar la producción de queso. Un peso bajo de materia seca en el suero de leche indica un rendimiento mayor de queso. A continuación se describirá la medición del peso de la sustancia seca del suero utilizando la enzima RMMP de tipo silvestre y la RMMP E19V/Q266E, ambas se expresan en levaduras.

15 Se cultivó la levadura MC16 en germinación que albergaba el vector de expresión que contenía el gen RMMP tipo silvestre o el gen RMMP mejorado que tenía las mutaciones Glu19Val/Gln266Glu por el procedimiento descrito anteriormente para permitir la expresión secretora de la RMMP. Se recolectó el sobrenadante del cultivo por centrifugación, se concentró por una membrana de ultrafiltración y el resultado se utilizó como una enzima

20 coagulante de la leche.

(1) Operación de la coagulación láctea

Se puso leche de vaca pasteurizada no homogenizada disponible comercialmente (Takanashi milk products Co. Ltd.)

25 (500 g) en un vaso de precipitados y se calentó a 32 ºC. En el momento que la leche de vaca alcanzó los 32 ºC, se añadieron 0,4 g de D-(+) glucono-1,5-lactona (ácido D-glucónico δ-lactona, fabricada por Wako Pure Chemical) y se agitó y luego se añadió gradualmente cloruro cálcico (fabricado por Wako Pure Chemical) hasta una concentración final de 1 mM y se agitó. Después de la adición de los reactivos, se añadió la enzima coagulante de la leche (2.000 Mu), se agitó durante un minuto, y se mantuvo a 32 ºC. Se considera que treinta minutos después de que se añade

30 la enzima coagulante de la leche es el tiempo de cuajado. La cuajada se cortó en cuadrados de 1 a 1,5 cm, y se dejó reposar durante 10 minutos. Después de dejarlo reposar, los coágulos se rompieron con cuidado. Los coágulos se mantuvieron a 32 ºC durante 20 minutos, mientras se agitaban suavemente ocasionalmente. Luego, el vaso de precipitados se transfirió a una incubadora y se aumentó la temperatura interna hasta los 37 ºC (unos 0,5 ºC por 1 minuto). En el momento en que los coágulos alcanzaron los 37 ºC, se dejaron reposar durante otros 30 minutos,

35 mientras se agitaba con cuidado ocasionalmente. Después de que se dejaran reposar los coágulos, se separaron los coágulos y el suero con una gasa. Los coágulos se envolvieron en la gasa, y se puso en un molde exclusivo para producción de queso. Aplicando presión (5 MPa durante 90 minutos), el resto del suero fluyó y se recolectó. Todo el suero de leche recolectado se mezcló y se filtró con un papel de filtro de calidad nº1 (ADVANTEC). El suero resultante se consideró como el suero total.

(2) Medición del peso de sustancia seca del suero

0103 Un vaso de precipitados se seca antes a 105 ºC con un horno de secado. No menos de 30 minutos después, el vaso de precipitados se saca del horno de secado y se coloca en un desecador, y se mide el peso. Se ponen

45 aproximadamente 25 g del suero de leche obtenido anteriormente en el vaso de precipitados, y se seca en el horno de secado a 105 ºC durante 12 a 15 horas o más. Tras el secado, el vaso de precipitados se coloca en el desecador. No menos de 30 minutos después, se mide el peso. El valor que se obtiene restando el peso del vaso de precipitados medido antes se toma como el peso de sustancia seca.

De acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, se midieron por duplicado el contenido de sustancia seca de 15 lotes de suero y el total del peso de sustancia seca, y los resultados se muestran en la Tabla 4

Tabla 4

Sustancia seca contenida en el suero (% p/p): Sustancia seca total en el suero (g)

Lote Nº RMMP tipo silvestre RMMP Glu19Val/ Gln266Glu
Lote Nº RMMP tipo silvestre RMMP Glu19Val/ Gln266Glu

1 7,257 7,141: 1 28,648 28,238

2 7,248 7,183: 2 28,605 28,468

3 7,190 7,168: 3 28,891 28,218

4 7,177 7,058: 4 28,651 28,219

5 7,128 7,025: 5 28,621 27,890

6 7,133 7,032: 6 28,502 28,300

7 7,054 6,977: 7 28,397 27,985

8 7,153 6,966: 8 28,514 28,104

9 7,270 7,087: 9 29,053 28,526

10 7,129 7,086: 10 28,637 28,423

11 7,167 7,019: 11 28,789 28,142

12 7,135 7,010: 12 28,231 27,521

13 7,037 6,976: 13 27,656 27,577

14 7,098 7,189: 14 27,696 27,792

15 7,181 7,080: 15 28,323 27,364

Media 7,157 7,066: Media 28,481 28,051

DS 0,065 0,071: DS 0,203 0,214

El total de sustancia seca en el suero RMMP tipo silvestre y RMMP Glu19Val/ Gln266Glu fue de 28,4810 g y

5 28,0511 g, respectivamente. La presencia de una diferencia significativa se confirmó utilizando el ensayo de Student (de dos colas). Se encontró una diferencia significativa entre ellos (p<0,01). Por tanto, se descubrió que la RMMP Glu19Val/ Gln2 podía alcanzar un mayor rendimiento de queso que la RMMP tipo silvestre, concretamente, puede producir aproximadamente un 1,51 % más de queso que el RMMP tipo silvestre. Esto es equivalente a 85,97 kg en el caso de producir queso utilizando 100 toneladas de leche.

10 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Meito Sangyo Co., Ltd

15 <120> PROTEASA COAGULANTE DE LA LECHE DE TIPO MEJORADO DERIVADA DE UN MICROORGANISMO

<130> C9326-PCT

20 <150> JP2009-071592

<151>

<160> 43

25 <170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 1293

<212> ADN 30 <213> Rhizomucor miehei

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1290) 35

<220>

<223> Cepa parental

<400> 1

<210> 2

<211> 430 5 <212> PRT

<213> Rhizomucor miehei

<220>

<223> Proteasa inmadura de cepa parental 10

<400> 2

<210> 3

<211> 361

<212> PRT

<213> Rhizomucor miehei

<220>

<223> Proteasa madura de cepa parental <400> 3

<210> 4

<211> 361 5 <212> PRT

<213> Rhizomucor miehei

<220>

<223> Proteasa madura de cepa mutante 10

<400> 4

5: <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

10: <220> <223> Cebador <400> 5 gggccaactg taggtagatc 20

15: <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

20: <220> <223> Cebador

<400> 6 cacccaaaca agaataagcg: 20

25: <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

30: <220> <223> Cebador

35: <400> 7 ttgaattcga gctcgcccca <210> 8 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial 20

<220> <223> Cebador

5: <400> 8 ctcagagtgg atcccctt 18

10: <210> 9 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

15: <400> 9 aaggatccat gctcttctct cagattactt ctg 33

20: <210> 10 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> Cebador <400> 10 cgcggatcct tactcgtttt cataagccg 29

30: <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> Cebador

<400> 11 tatgcagagc atcaacatga: 20

40: <210> 12 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> Cebador

50 55: <400> 12 ctggaggtgt atgctattcc ggtctc <210> 13 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador 26

60: <400> 13 agcatacacc tccagatcaa agtcgt 26

65: <210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

5: <400> 14 ctggaggctt atgctattcc ggtctcc 27

10: <210> 15 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

15: <400> 15 agcataagcc tccagatcaa agtcgta 27

20: <210> 16 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> Cebador <400> 16 ctggagattt atgctattcc ggtctcc 27

30: <210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> Cebador

<400> 17 agcataaatc tccagatcaa agtcgta: 27

40: <210> 18 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> Cebador

50 55: <400> 18 ctggagttgt atgctattcc ggtctc <210> 19 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador 26

60: <400> 19 agcatacaac tccagatcaa agtcgta 27

65: <210> 20 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

5: <400> 20 ctggagtttt atgctattcc ggtctcc 27

10: <210> 21 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

15: <400> 21 agcataaaac tccagatcaa agtcgta 27

20: <210> 22 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> Cebador <400> 22 acccaggagg gctgggttgt tccttgc 27

30: <210> 23 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> Cebador

<400> 23 ccagccctcc tgggtttcag tggcatc: 27

40: <210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> Cebador

50 55: <400> 24 acccaggatg gctgggttgt tccttgc <210> 25 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador 27

60: <400> 25 ccagccatcc tgggtttcag tggcatc 27

65: <210> 26 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

5: <400> 26 tgaaaccgag cagggctggg ttgttc

10: <210> 27 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

15: <400> 27 ccctgctcgg tttcagtggc atcagg

20: <210> 28 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> Cebador <400> 28 tgaaaccgat cagggctggg ttgttc

30: <210> 29 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> Cebador

<400> 29 ccctgatcgg tttcagtggc atcagg

40: <210> 30 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> Cebador

50 55: <400> 30 gaaaccgagg agggctgggt tgttcct <210> 31 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador

60: <400> 31 gccctcctcg gtttcagtgg catcagg

65: <210> 32 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

5: <400> 32 accgaggatg gctgggttgt tccttgc 27

10: <210> 33 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

15: <400> 33 ccagccatcc tcggtttcag tggca 25

20: <210> 34 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> Cebador <400> 34 gaaaccgacg agggctgggt tgttcct 27

30: <210> 35 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> Cebador

<400> 35 gccctcgtcg gtttcagtgg catca: 25

40: <210> 36 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> Cebador

50 55: <400> 36 accgacgatg gctgggttgt tccttgc <210> 37 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador 27

60: <400> 37 ccagccatcg tcggtttcag tggcatca 28

65: <210> 38 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

5: <400> 38 aacatccaat acggtactgg cggcgca 27

10: <210> 39 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

15: <400> 39 accgtattgg atgtttaggt tgtagtt 27

20: <210> 40 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> Cebador <400> 40 aacatcgatt acggtactgg cggcgca 27

30: <210> 41 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> Cebador

<400> 41 accgtaatcg atgtttaggt tgtagtt 27

40: <210> 42 <211> 1086 <212> ADN <213> Rhizomucor pusillus

45: <220> <221> CDS <222> (1).. (1083)

50: <400> 42

<210> 43

<211> 361

<212> PRT

<213> Rhizomucor pusillus

<400> 43

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteasa de tipo mejorado que comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 75 % idéntica a

la SEC. ID. Nº 3, dicha proteasa de tipo mejorado tiene al menos una mutación seleccionada de entre el grupo que 5 consiste en:

(A) sustitución de la glutamina correspondiente a la glutamina en la posición 265 de la SEC ID Nº 3 con un aminoácido ácido; y

(B) sustitución de la glutamina en la posición 266 de la SEC ID Nº 3 con un aminoácido acido, y en la que dicha 10 proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.
2. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona de entre el grupo que consiste en:

15 (A) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43 excepto por que la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina en la posición 266 se ha(n) sustituido con un aminoácido ácido.

(B) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43 excepto por que la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina en la posición 266 se ha(n) sustituido con un aminoácido ácido y no más de 10 aminoácidos en posiciones distintas de 265 y 266 se han sustituido, delecionado, insertado o añadido, y en la

20 que dicha proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.
3. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que dicho aminoácido ácido es ácido glutámico o ácido aspártico.

25 4. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el ácido glutámico en la posición 19 se sustituye con valina, alanina, isoleucina o leucina.
5. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la treonina en

la posición 81 se sustituye con glutamina o ácido aspártico. 30
6.

Un ADN que codifica la proteasa de tipo mejorado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7.

Un vector de expresión que comprende el ADN de acuerdo con la reivindicación 6.

35 8. Una célula transformada distinta de una célula humana en la que se introduce el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Una célula transformada de acuerdo con la reivindicación 8 que es una célula de levadura, una célula fúngica o

una célula vegetal. 40
10.

La célula transformada de acuerdo con la reivindicación 8, siendo dicha célula transformada Saccharomyces cerevisiae.
11.

Un procedimiento para producir una proteasa de tipo mejorado que tiene actividad coagulante de la leche, que

45 comprende las etapas de cultivo de la célula transformada de acuerdo con la reivindicación 8, 9 o 10 en un medio de cultivo y la recolección de la proteasa de tipo mejorado en el medio de cultivo.