ES2352704A1 - Secuencia de nucleotido y proteina b-galactosidasa de streptococcus mitis, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. - Google Patents
Secuencia de nucleotido y proteina b-galactosidasa de streptococcus mitis, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Secuencia de nucleótido y proteína {be}-galactosidasa de Streptococcus mitis, procedimiento de obtención y sus aplicaciones. La presente invención describe una proteína inédita {be}-galactosidasa de Streptococcus mitis que presenta motivos de unión a colina en su estructura y que no se inhibe en presencia de elevadas concentraciones de glucosa. También se·describen dos procedimientos de purificación de {be}-galactosidasas modificadas en un hospedador heterólogo (Escherichia coli).
Description
Secuencia de nucleótido y proteína
\beta-galactosidasa de Streptococcus mitis,
procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
Sector biotecnológico con aplicaciones en la
industria agroalimentaria, al análisis de carbohidratos y a la
biosíntesis de oligosacáridos, y más concretamente tecnología
enzimática aplicada a los productos lácteos.
La
\beta-D-galactosidasa (EC
3.2.1.23) (en lo sucesivo \beta-galactosidasa),
también llamada lactasa, tiene como función primaria la hidrólisis
de la lactosa en D-galactosa y
D-glucosa. Por ello, la aplicación fundamental de
las \beta-D-galactosidasas se
circunscribe por lo general al ámbito de los productos y
subproductos lácteos [Pivarnik, L.F.; Senecal, A.G. y Rand, A.G.
1995. "Hydrolytic and transgalactosylic activities of commercial
\beta-galactosidase (lactase) in food
processing". Adv. Food Nutrit. Res. 38, 1-102].
Además, esta enzima posee actividad transgalactosilasa y se utiliza
para la síntesis de galactosil-oligosacáridos,
compuestos con un interés creciente en el área agroalimentaria y
farmacéutica.
Como alternativa no enzimática a la hidrólisis
con \beta-galactosidasas se puede utilizar la
hidrólisis química, pero produce efectos no deseables (p. ej.:
pérdida de nutrientes, defectos organolépticos, etc.) [Gekas, V. y
López-Leiva, M. 1985. "Hydrolysis of lactose: A
literature review". Process. Biochem. 20,
1-12].
Las \beta-galactosidasas se
emplean en la industria agroalimentaria para reducir el contenido en
lactosa de productos lácteos y derivados, lo que tiene un interés
muy variado. En primer lugar, el problema más complejo sería hacer
accesibles estos alimentos a los afectados de hipolactasia, que
constituyen el 70% de la población mundial, para lo que
necesitaremos hidrolizar el 100% de la lactosa de la leche
[Savaiano, D.A. y Kotz, C. 1988. "Recent advances in the
management of lactose intolerance". Contemp. Nutr. 13,10; Wolin,
M.J. 1981. "Fermentation in the rumen and human large
intestine". Science 213, 1463-1468; Phillips,
M.C. y Briggs, G.M. 1975. "Milk and its role in the American
diet". J. Dairy Sci. 58, 1751-1763; Birge, S.J.;
Keutmann, H.T.; Cuatrecases, P. y Whedon, G.D. 1963.
"Osteoporosis, intestinal lactase deficiency and low dietary
calcium intake". N. Engl. J. Med. 276,
445-448].
En las demás utilizaciones, la exigencia de
hidrólisis totales puede estar disminuida. Por ejemplo, el uso de
\beta-galactosidasas para revalorizar los sueros
de lechería mediante su transformación en jarabes de
glucosa-galactosa [Mahoney, R.R. 1985.
"Modification of lactose and lactose-containing
dairy products with \beta-galactosidase". En
"Developments in Dairy Chemistry: Lactose and minor
constituents". Fox, F. (Ed), pp.69-108.
Elsevier, Nueva York; Short, J.L. 1975. ``Prospects for the
utilization of deproteinated whey in New Zealand-A
review. N.Z.J. Dairy Sci. Technol. 13,181-194],
evitando lo que -por otra parte- sería un grave problema
medioambiental, debido a la alta demanda bioquímica de oxígeno de la
lactosa de los mencionados sueros, y dado que sólo se procesa la
mitad del que se produce vertiéndose el resto a los cauces fluviales
[Pivarnik, L.F.; Senecal, A.G. y Rand, A.G. 1995. "Hydrolytic and
transgalactosylic activities of commercial
\beta-galactosidase (lactase) in food
processing". Adv. Food Nutrit. Res. 38, 1-102]
(para hacernos una idea del problema, 1 Kg de queso requiere, como
media, 10 L de leche).
Por otro lado, leches con la lactosa hidrolizada
son mejores sustratos para la fermentación, de forma que este
proceso tiene interés para acelerar la producción de derivados
fermentados de la leche (quesos, yogures...). También es interesante
considerar que la lactosa tiene una solubilidad reducida cuando se
la compara con la de la galactosa y glucosa, con lo que su
hidrólisis evita problemas de aparición de cristales de lactosa en
leches condensadas, helados, etc, además de añadir un sabor dulce al
alimento.
Otra aplicación no hidrolítica sino
transglicosílica, sería en la industria alimentaria y farmacéutica:
síntesis de galactosil-oligosacáridos por
transglicosilación [Zárate, S. y López-Leiva, M.H.
1990. "Oligosaccharide formation during enzymatic lactose
hidrolysis: A literatura review". J. Food Prot. 53,
262-268], pudiendo emplearse con fines de interés
alimentario [Pivarnik, L.F.; Senecal, A.G. y Rand, A.G. 1995.
"Hydrolytic and transgalactosylic activities of commercial
\beta-galactosidase (lactase) in food
processing". Adv. Food Nutrit. Res. 38, 1-102] y
farmacéutico [Nilsson K.G.I. 1988 "Enzymatic synthesis of
oligosaccharides" Trends Biotechnol, 6,
256-264].
Una propiedad importante que ha recibido poca
atención en la literatura es el nivel de pureza de las preparaciones
comerciales de \beta-galactosidasas, especialmente
en lo relacionado a la presencia de otras enzimas, como las
proteasas. Estos posibles contaminantes pueden tener un impacto
severo en la estabilidad de la enzima, provocando cambios
indeseables en los productos lácteos durante su almacenamiento. La
elevada afinidad del dominio de unión a colina por este aminoalcohol
o sus análogos estructurales tales como el dietilaminoetanol (DEAE)
(J.M. Sanz, R. López, J.L. García "Structural requirements of
choline derivatives for "conversión" of pneumococcal amidase A
new single-step procedure for purification of this
autolysin" FEBS Letters 232 (1988) 308-312)
permite aumentar la pureza de la
\beta-galactosidasa recombinante de
Streptococcus mitis mediante cromatografía de afinidad de
DEAE-celulosa (A. Vian, A.V. Carrascosa, J.L.
García, E. Cortés. "Structure of the
\beta-galactosidase gene from Thermus sp
T2: Expression in Escherichia coli and purification in a
single step of an active fusión protein". Applied and
Environmental Microbiology 64 (1998) 2187-2191).
Teniendo en cuenta las ventajas que el dominio
de unión a colina ofrece para la purificación de enzimas se ha
reportado previamente la fusión de diversas
\beta-galactosidasas a dominios de unión a
colina:
- \bullet
- \beta-galactosidasa de Escherichia coli fusionada al dominio de unión a colina de N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa (C-LYTA) de Streptococcus pneumoniae (J. Madoz, B.A. Kuznetzov, F.J. Medrano, J.L. García, V.M. Fernández ``Functionalization of Gold Surfaces for Specific and Reversible Attachment of a Fused \beta-Galactosidase and Choline-Receptor Protein J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 1043-1051).
- \bullet
- \beta-galactosidasa de E. coli con el dominio de unión a colina de la amidasa autolítica de neumococo, LytA, fusionada a su región N-terminal (J.M. Sánchez-Puelles, J.M. Sanz, J.L. García, E. García "Immobilization and single-step purification of fusión proteins using DEAE-cellulose" Eur. J. Biochem. 203 (1992) 153-159),
- \bullet
- \beta-galactosidasa termoestable de Thermus sp. Strain T2 fusionada al dominio de unión a colina de la principal autolisina de neumococo (A. Vián, A.V. Carrascosa, J.L. García, E. Cortés. "Structure of the \beta-galactosidase gene from Thermus sp T2: Expression in Escherichia coli and purification in a single step of an active fusión protein" Applied and Environmental Microbiology 64 (1998) 2187-2191).
- \bullet
- Patente española nº 9701759 (7 de Agosto de 1997): "Un procedimiento para producir \beta-galactosidasa de Thermus sp. (Cepa T2) en células hospedantes, y purificarla en un sólo paso cromatográfico". Inventores: A. Vián; A.V. Carrascosa; J.L García y E. Cortés.
La presente invención se basa en que los
inventores han identificado y aislado una secuencia de nucleótidos
novedosa correspondiente a la \beta-galactosidasa
de Streptococcus mitis. Posteriormente, han creado dos
métodos de expresión y purificación de
\beta-galactosidasas modificadas: i) método de
expresión y purificación de \beta-galactosidasa
sin péptido señal y ii) método de expresión y purificación de
\beta-galactosidasa con
poli-histidinas.
La nueva proteína
\beta-galactosidasa de S. mitis es una
proteína consistente en 2.411 aminoácidos con un peso molecular
aproximado de 268 kDa, presenta 5 motivos repetidos de unión a
colina. Estas repeticiones son un rasgo característico de las
proteínas de unión a colina de S. pneumoniae, lo que permite
su purificación de manera sencilla a través de una columna
cromatográfica de DEAE-celulosa y su empleo para
diferentes aplicaciones.
Más concretamente, se ha aislado la secuencia de
nucleótidos (SEQ ID NO1) que corresponde a un gen estructural de
S. mitis NCTC (226)^{T} que codifica una
\beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) (localizada
entre las posiciones 64190 y 71425). Se facilita la secuencia de
aminoácidos (SEQ ID NO2) deducida de la secuencia de nucleótidos. La
eliminación de los nucleótidos correspondientes al péptido señal de
la \beta-galactosidasa en la secuencia de
nucleótidos SEQ ID NO1 origina la nueva secuencia de nucleótidos SEQ
ID NO3, correspondiente a la \beta-galactosidasa
sin péptido señal. La secuencia SEQ ID NO4 es la secuencia de
aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID
NO3.
Las secuencias de nucleótidos correspondientes a
la \beta-galactosidasa con el péptido señal (SEQ
ID NO1) y sin el péptido señal (SEQ ID NO3) se insertaron en el
plásmido pUC19 para la creación de los plásmidos pBSF01 y pBSF02 que
expresan, respectivamente, la \beta-galactosidasa
con y sin péptido señal de S. mitis en un hospedador
heterólogo. El plásmido pUC19 es comercial, tiene la capacidad de
producir un alto número de copias y está compuesto por 2.686 pares
de bases. Además, tiene una zona que confiere resistencia al
antibiótico ampicilina, y otra zona que contiene el gen del
regulador de la expresión de Lac Z.
El hospedador heterólogo utilizado es la cepa
MC4100, de la especie E. coli, que carece de actividad
\beta-galactosidasa por llevar una deleción
completa del operón de la lactosa, obteniéndose como resultado final
la cepa E. coli MC4100 (pBSF01 o pBSF02). De estas dos cepas,
una de ellas, E. coli MC4100 (pBSF02) ha sido depositada en
la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el nº de depósito
7433.
En el proceso de purificación de la
\beta-galactosidasa sin péptido señal se utilizan
columnas de afinidad de DEAE-celulosa, aprovechando
la ventaja de disponer de una enzima con un módulo de unión a colina
de forma natural. Con objeto de obtener un producto lo más
purificado posible, y teniendo en cuenta el elevado peso molecular
de la proteína recombinante, se empleó una columna cromatográfica
preparativa de exclusión por tamaño.
En otro aspecto de la invención, los inventores
han creado una \beta-galactosidasa en la que se
han introducido seis restos de histidina en el extremo
N-terminal de la proteína
\beta-galactosidasa sin péptido señal, que
denominaremos IMAC/\beta-galactosidasa en
referencia al proceso cromatográfico de purificación (ver más
adelante), cuya secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO5, que se
corresponde con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO6. Esta
proteína modificada se puede purificar por cromatografía de afinidad
a iones metálicos inmovilizados (IMAC, del inglés immobilized
metal ion chromatography), consiguiendo una mejora en el
rendimiento del proceso de purificación respecto al proceso de
purificación de la \beta-galactosidasa sin péptido
señal comentados previamente.
Los inventores insertaron esta secuencia SEQ ID
NO5 en el plásmido pBSF02, obteniéndose como resultando el plásmido
pHGM02. El hospedador heterólogo utilizado en esta ocasión fue
nuevamente la cepa E. coli MC4100. Dicho hospedador se
transformó con el plásmido pHGM02, obteniéndose como resultado final
la cepa E. coli MC4100 (pHGM02). Esta cepa ha sido depositada
en la CECT con el nº de depósito 7434, y produce la proteína
IMAC/\beta-galactosidasa con
poli-histidinas (SEQ ID NO6).
La producción y purificación de la proteína
IMAC/\beta-galactosidasa se realizó mediante la
obtención de extractos enriquecidos en la proteína siguiendo un
procedimiento análogo al descrito previamente para la
\beta-galactosidasa sin péptido señal. La
purificación se realizó utilizando soportes cromatográficos IMAC
comerciales.
A diferencia de lo que ocurre generalmente con
otras \beta-galactosidasas, la actividad
enzimática de las proteínas recombinantes descritas no se inhibe en
presencia de elevadas concentraciones de glucosa, lo que hace que
estas enzimas encuentren aplicación principalmente en el sector
agroalimentario-sanitario, para la hidrólisis de
\beta-galactósidos de mala digestibilidad
presentes en diversos alimentos de gran consumo.
La enzima \beta-galactosidasa
sin péptido señal, purificada en columnas cromatográficas de
DEAE-celulosa y Sephacryl 300, presenta una
actividad específica de 2.209 ó 956 U/mg en condiciones estándar
(30ºC, 4 min de hidrólisis) cuando se usa ONPG o lactosa,
respectivamente, como sustrato y conserva el 100% de su actividad
ONPGasa inicial después de mantenerla 55 días a temperatura ambiente
(sin estabilizadores).
Por lo tanto, un aspecto de la invención lo
constituye una secuencia de nucleótidos (en adelante secuencia de
nucleótidos de la invención) de la
\beta-galactosidasa que comprende una de las
secuencias pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos de la \beta-galactosidasa (SEQ ID NO1),
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b).
- d)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a), b) y c).
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "secuencia de nucleótidos" es una secuencia de ADN,
ADNc o ARNm.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye la secuencia de nucleótidos de la
\beta-galactosidasa SEQ ID NO1.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye un fragmento de la secuencia de nucleótidos de la
\beta-galactosidasa SEQ ID NO1 en la que el
fragmento es la \beta-galactosidasa sin péptido
señal SEQ ID NO3.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO5 que comprende la
secuencia de nucleótidos SEQ ID NO3 y una secuencia de nucleótidos
codificante de seis histidinas en el extremo
N-terminal de la SEQ ID NO3.
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de
nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID NO1, SEQ ID NO3 o
SEQ ID NO5 por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de
nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la
inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más
nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la
deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el
interior de la secuencia.
En general, una secuencia de nucleótidos análoga
es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos
identificada como la SEQ ID NO1 o SEQ ID NO3 o SEQ ID NO5. En el
sentido utilizado en esta descripción, la expresión
"sustancialmente homologa" significa que las secuencias de
nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de
aminoácidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un
85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
Una realización particular de la invención lo
constituye una construcción genética (en adelante construcción
genética de la invención) que comprende la secuencia de nucleótidos
de la \beta-galactosidasa SEQ ID NO1, SEQ ID NO3 o
SEQ IDNO5.
Esta construcción genética de la invención,
también puede comprender, en caso necesario y para permitir un mejor
aislamiento, detección o secreción al exterior de la célula del
péptido de interés expresado, una secuencia de nucleótidos que
codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de
aislamiento, detección o secreción de dicho péptido. Por tanto, un
objeto particular de la presente invención lo constituye una
construcción genética de la invención que comprende cualquier otra
secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia
peptídica que permita el aislamiento, la detección o la secreción al
exterior de la célula del péptido expresado, por ejemplo, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, una
secuencia peptídica reconocible por un anticuerpo monoclonal (por
ejemplo, para su identificación, o cualquier otra que sirva para
purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de
inmunoafinidad: péptidos etiqueta tales como c-myc,
HA, E-tag) (Using antibodies: a laboratory manual.
Ed. Harlow and David Lañe (1999). Cold Spring Harbor Laboratory
Press. New York. Capítulo: Tagging proteins. Pp.
347-377).
La construcción genética de la invención
descrita previamente puede aislarse y obtenerse por un experto
mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de
la técnica (Sambrook et al. ``Molecular cloning, a Laboratory
Manual 2nd ed., Cold Sping Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 vol
1-3). Dichas secuencias de nucleótidos pueden estar
integradas en un vector de expresión génica que permite la
regulación de la expresión de la misma en condiciones adecuadas en
el interior de las células.
Por tanto, otro aspecto de la invención lo
constituye un vector de expresión (en adelante vector de expresión
de la invención) que comprende la secuencia de nucleótidos de la
\beta-galactosidasa SEQ ID NO1, SEQ ID NO3 o SEQ
ID NO5.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye un vector de expresión de la invención constituido por el
plásmido pBSF01, pBSF02 o pHGM02.
En general, un vector de expresión comprende,
además de la construcción genética descrita en la invención, un
promotor que dirige su transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc,
ptac, pBAD, ret, etc.), al que está operativamente enlazado, y otras
secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha
transcripción y, en su caso, la traducción del producto de interés,
por ejemplo, señales de inicio y terminación de transcripción (tlt2,
etc.), señal de poliadenilación, origen de replicación, secuencias
de unión a ribosomas (RBS), secuencias codificantes de reguladores
transcripcionales, (enhancers), silenciadores transcripcionales
(silencers), represores, etc. Ejemplos de vectores de expresión
apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y
necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión,
vectores virales (ADN o ARN), cósmidos, cromosomas artificiales,
etc. que pueden contener, además, marcadores utilizables para
seleccionar las células transfectadas o transformadas con el gen o
genes de interés. La elección del vector dependerá de la célula
huésped y del tipo de uso que se quiera realizar. Por tanto, según
un modo de realización particular de la presente invención dicho
vector es un plásmido o un vector viral. La obtención de dicho
vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los
técnicos en la materia al igual que para la transformación de
microorganismos y células eucariotas se pueden utilizar diferentes
métodos ampliamente conocidas - transformación química,
electroporación, microinyección, etc. - descritos en diversos
manuales [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989).
Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.].
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye una secuencia de aminoácidos
\beta-galactosidasa (en adelante secuencia de
aminoácidos de (a invención) que comprende una de las secuencias de
aminoácidos pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la \beta-galactosidasa de S. mitis (SEQ ID NO2),
- b)
- una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia a),
- c)
- un fragmento cualquiera de las secuencias de a) y b),
- d)
- una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera de a), b) y c).
\vskip1.000000\baselineskip
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye la secuencia de aminoácidos de la invención de la
\beta-galactosidasa SEQ ID NO2.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la
\beta-galactosidasa SEQ ID NO2 en la que el
fragmento es la \beta-galactosidasa sin péptido
señal SEQ ID NO4.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO6 que comprende la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO4 y una secuencia de seis
histidinas en el extremo N-terminal de la SEQ ID
NO4.
Otro aspecto de la invención lo constituye un
uso de la secuencia de aminoácidos de la invención (SEQ ID NO2, SEQ
ID NO4 o SEQ ID NO6) en la reducción del contenido de lactosa en
alimentos o residuos de procesos alimentarios pertenecientes, a
título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: productos lácteos y derivados, sueros de
lechería.
Otro aspecto de la invención lo constituye una
célula huésped, en adelante célula huésped de la invención, que
comprende la construcción genética o el vector de expresión de la
invención, preferentemente una célula procariota.
Una realización particular de la invención lo
constituye una célula huésped de la invención constituida por una
célula E. coli, preferentemente células E. coli
MC4100.
Otra realización particular de la invención lo
constituye una célula huésped de la invención constituida por
células de la cepa E. coli con el número de depósito CECT
7433 o 7434.
Otro aspecto de la invención lo constituye el
uso de la célula huésped de la invención en la reducción del
contenido de lactosa en alimentos o residuos de procesos
alimentarios pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite
el alcance de la invención, al siguiente grupo: productos lácteos y
derivados, sueros de lechería.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la invención lo constituye un
procedimiento de obtención (en adelante procedimiento de obtención
de la \beta-galactosidasa de la invención) de la
secuencia de aminoácidos de la invención SEQ ID NO2 que comprende
las siguientes etapas:
- a)
- obtención de una construcción genética que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO1, y del vector de expresión que comprende esta construcción genética,
- b)
- transformación de una célula huésped, preferentemente de E. coli, en la que la construcción genética o el vector de expresión de a) bajo control de los promotores adecuados expresa la proteína codificada por la SEQ ID NO1, y purificación del extracto crudo de las células,
- c)
- inmovilización de la proteína en matrices de DEAE-celulosa mediante el paso del extracto crudo de b) a través de la matriz,
- d)
- disociación de la proteína de la matriz cromatográfica mediante lavado de la matriz con un medio que comprende colina,
- \quad
- y, opcionalmente
- e)
- posterior purificación de la proteína mediante el paso del eluído de d) a través de una matriz cromatográfica de exclusión por tamaño.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye un procedimiento de obtención de
\beta-galactosidasa de la invención en el que la
secuencia de nucleótidos de a) es la secuencia de nucleótidos SEQ ID
NO3.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un procedimiento de obtención de la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO6 caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
- a)
- obtención de una construcción genética que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO5, y del vector de expresión que comprende esta construcción genética,
- b)
- transformación de una célula huésped, preferentemente de E. coli, en la que la construcción genética o el vector de expresión de a) bajo control de los promotores adecuados expresa la proteína codificada por la SEQ ID NO5, y purificación del extracto crudo de las células,
- c)
- inmovilización de la proteína en matrices de cromatografía de afinidad a iones metálicos inmovilizados mediante el paso del extracto crudo de b) a través de la matriz,
- d)
- disociación de la proteína de la matriz cromatográfica mediante lavado de la matriz con un medio que comprende imidazol.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La secuencia del genoma de la cepa tipo de S.
mitis NCTC (226)^{T} se conoce sólo en fragmentos no
ordenados (llamados contigs). El análisis in silico de
las correspondientes fases de lectura abierta permitió deducir la
existencia de, al menos, 14 proteínas de unión a colina. Una de
ellas codificaba una proteína de 2411 aminoácidos, con un posible
péptido señal, alta similitud con otras
\beta-galactosidasas, y que presentaba 5 motivos
repetidos de unión a colina. Estos resultados sugirieron que la
proteína podría tratarse de una
\beta-galactosidasa extracelular probablemente
diseñada para realizar su función en la envuelta celular, y que
poseería características diferentes y especiales con respecto a
otras \beta-galactosidasas intracelulares.
\newpage
Ejemplo
2
Los plásmidos construidos se denominan pBSF01
(con péptido señal) y pBSF02 (sin péptido señal) y para su
realización se utilizaron técnicas de ADN recombinante
convencionales [Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. 1989.
Molecular Cloning. CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York].
En primer lugar se extrajo el ADN de S.
mitis, y tras su purificación, se amplificó la secuencia
adecuada mediante la técnica de PCR.
Para llevar a cabo la amplificación de la parte
de ADN de interés, se eligieron unos oligonucleótidos cebadores para
que la polimerasa actuara a partir de las posiciones deseadas. Se
utilizaron 2 oligonucleótidos diferentes en el sentido
5-3', uno incluyendo la parte del péptido señal, y
el otro sin ella. Además, en los cebadores se incluyeron secuencias
de restricción para posteriormente fragmentar el producto
amplificado por los sitios adecuados y unirlo posteriormente al
vector de expresión.
Se eligió introducir una secuencia de corte para
XbaI en el cebador 5'-3' y EcoRV en el
cebador 3'-5', puesto que no hay sitios de corte
para estas enzimas de restricción en el gen. Además, se introdujo la
secuencia que determina el sitio de unión del ribosoma (ribosome
binding site, RBS), y codones STOP en las lecturas desfasadas de la
secuencia de interés. Finalmente, también se introdujo el codón ATG,
que codifica el aminoácido metionina, que indica el inicio del
gen.
Después de purificar el producto de PCR obtenido
con los oligonucleótidos mencionados con un kit de purificación se
realizó la digestión con las enzimas de restricción XbaI y
EcoRV.
Para construir los plásmidos recombinantes
(pBSF01 y pBSF02) se partió del plásmido pUC19. El plásmido pUC19 se
cortó con las enzimas de restricción adecuadas (XbaI y
SmaI), para su posterior ligación al inserto del gen de la
\beta-galactosidasa.
Los productos de la digestión del plásmido y del
gen amplificado de la \beta-galactosidasa se
purificaron en un gel de agarosa y con un kit de purificación de
ADN.
Los productos purificados de la digestión del
plásmido y del gen amplificado de
\beta-galactosidasa se unieron covalentemente con
ADN ligasa. Con la mezcla de ligación antedicha se transformaron
células competentes de E. coli MC4100. El plásmido
resultante, que se denominó pBSF02, hace que las células que lo
portan sean resistentes a ampicilina, y es capaz de expresar
actividad \beta-galactosidasa correspondiente al
gen estructural de S. mitis, SEQ ID NO1.
De los varios clones ensayados se eligió el más
productivo, que es el clon de E. coli MC4100 (pBSF02)
depositado en la CECT con el nº de depósito 7433.
El plaqueo de las células competentes de E.
coli MC4100 (pBSF02) se hizo en agar LB con ampicilina,
X-Gal
(5-Bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido)
e IPTG
(isopropil-\beta-D-1-tiogalactopiranósido),
incubándose a 37ºC. Se escogió una colonia azul.
Tal colonia se reaisló y se hizo una
minipreparación de su ADN plasmídico. Tras comprobar que el patrón
de restricción con diversas enzimas era el esperado, se hizo una
verificación final mediante secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
De las placas con las colonias azules del clon
antes mencionado, se eligió una suficientemente aislada, que se
inoculó en medio de cultivo LB con ampicilina (100 \mug/ml) y se
cultivó toda la noche a 37ºC con agitación a 250 rpm. Al día
siguiente, un volumen adecuado del cultivo crecido se diluyó en
medio LB con ampicilina (100 \mug/ml) e IPTG (1.0x10^{-4} M) y
se dejó crecer durante toda la noche. Tras medir su densidad óptica
a 600 nm, el cultivo se centrifugó a 8000 rpm durante 10 minutos a
4ºC. Las células de E. coli MC4100 (pBSF02) cosechadas por
centrifugación y resuspendidas en un volumen menor del original de
tampón fosfato sódico 20 mM (pH 6.9), como método de concentración,
se ultrasonicaron para romperlas. Tras una centrifugación adicional,
que separa restos celulares, se obtuvo un sobrenadante claro con
elevada actividad \beta-galactosidasa.
\newpage
Ejemplo
3
Obtenido el extracto crudo se siguió su
purificación, en una columna cromatográfica de afinidad de
DEAE-celulosa [J.M. Sánchez-Puelles,
J.M. Sanz, J.L. García, E. García. 1992 "Immobilization and
single-step purification of fusión proteins using
DEAE-cellulose" Eur. J. Biochem., 203,
153-159]. Después de cargar el extracto (\sim 12.5
mg de proteína por mL de soporte empaquetado) se lavó con tampón
fosfato 20 mM pH 6.9. A continuación se eluyó por la columna tampón
salino (fosfato 20 mM, pH 6,9 con 1,5 M NaCl) y se recogieron las
fracciones de interés con un colector, cuando se hizo pasar por la
columna tampón con colina (fosfato 20 mM, pH 6,9, con 1,5 M NaCl y
2%
colina).
colina).
Para comprobar la eficacia del proceso de
purificación, se realizaron electroforesis en geles de
poliacrilamida en presencia de SDS (7.5%) y ensayos de actividad
\beta-galactosidasa y determinación de proteínas
por el método de Bradford.
Para mejorar la pureza del producto final se
utilizó una columna cromatográfica de afinidad por exclusión de
tamaño. Tras equilibrar la columna (90x30 cm,
Sephacryl-300) con tampón fosfato 20 mM pH 6.9, se
cargó el extracto semipurificado y empleando la misma disolución
reguladora y con ayuda de una bomba peristáltica (con un flujo de
0.2 mL/min) se recogieron las fracciones de interés. La enzima
purificada se guardó a -20ºC.
Experimentos de ultracentrifugación analítica
demostraron que la enzima recombinante purificada era monomérica (en
tampón fosfato 20 mM, pH 6.9, conteniendo 50 mM de NaCl, en ausencia
y en presencia de 2% de colina).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El plásmido construido se denomina pHGM02 y para
su construcción se emplearon protocolos convencionales, partiendo
del plásmido pBSF02. Con el fin de introducir los 6 residuos de
histidinas en la región N-terminal se realizó la
amplificación de una región de 758 bp del plásmido recombinante
pBSF02 con los oligonucleótidos adecuados. En estos oligonucleótidos
se incluyeron secuencias de restricción para posteriormente
fragmentar el producto amplificado por los sitios adecuados, para su
posterior unión al vector de expresión.
Se ha elegido introducir una secuencia de corte
para XbaI en un oligonucleótido y SpeI en el otro,
puesto que estas enzimas cortan cohesivamente y en posición única el
gen de la \beta-galactosidasa de S. mitis
pero no el pUC19. Además, se introdujo la secuencia que determina el
sitio de unión del ribosoma (ribosome binding site, RBS), y codones
STOP en las lecturas desfasadas de la secuencia de interés.
Finalmente, también se introdujo el codón ATG, que codifica el
aminoácido metionina, que indica el inicio del gen.
El fragmento PCR obtenido se purificó y se ligó
al vector de clonación pGEMT-Easy (Promega). La
selección del plásmido portador del inserto y las posteriores
manipulaciones para obtener el plásmido recombinante pHGM02 fueron
similares a las explicadas en el ejemplo 2.1 y siguieron el esquema
que se explica en Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir la proteína
IMAC/\beta-galactosidasa se siguió un
procedimiento análogo al descrito para la producción de la
\beta-galactosidasa sin péptido señal (ejemplo
2.2). Además, se realizaron estudios bioquímicos comparativos entre
ambas proteínas, encontrándose resultados similares a nivel de
expresión y características bioquímicas.
\vskip1.000000\baselineskip
En el proceso de purificación se utilizaron
columnas IMAC, en cartuchos comerciales (BioRad) siguiendo el
protocolo recomendado. La adsorción de la proteína al soporte se
realizó a pH 6.9 y 25ºC. Seguidamente se realizó la desorción de la
proteína del soporte, usando concentraciones crecientes de imidazol
(desde 5 hasta 250 mM), encontrando que a 200 mM eluía el 100% de la
enzima de S. mitis.
Para comprobar la eficacia del proceso de
purificación, se realizaron electroforesis en geles de
poliacrilamida en presencia de SDS (7.5%) y ensayos de actividad
\beta-galactosidasa y determinación de proteínas
por el método de Bradford. La muestra correspondiente a la proteína
purificada tras separación electroforética se muestra en la
Figura 4.
Figura 4.
Ejemplo
5
Las actividades enzimáticas de las dos proteínas
recombinantes purificadas, la \beta-galactosidasa
sin péptido señal (codificada por el plásmido pBSF02) y la
IMAC/\beta-galactosidasa (codificada por el
plásmido pHGM02), fueron similares en términos de actividad
específica.
A continuación se presentan los resultados
obtenidos a la actividad enzimática de la enzima
\beta-galactosidasa sin péptido señal:
- 1.
- Sustratos: Hidroliza ONPG con una actividad específica de 2.209 unidades a pH 6,5 y a 30ºC. Hidroliza lactosa con una actividad específica de 956 unidades. (Se refieren a las unidades definidas en el ejemplo 1).
- 2.
- pH de la reacción: El pH óptimo de la hidrólisis se sitúa entre el 5,5 y 6,5. Se detecta claramente actividad en un rango de pH de 5,5 a 7,5.
- 3.
- Temperatura óptima: se alcanzó el máximo de actividad entre 35-40ºC a pH 7,0.
- 4.
- Termoestabilidad: La enzima soluble conserva el 79% de la actividad después de un calentamiento de 5 minutos a 40ºC y pH 7,0, y pierde totalmente su actividad enzimática después de calentarla 5 min a 42,5ºC y pH 7,0.
- 5.
- Inhibición por productos de reacción: En los ensayos con la enzima soluble a 30ºC y pH 6,5, se conserva el 100% de la actividad de la enzima en presencia de 200 mM de glucosa. La galactosa, a una concentración de 10 mM, disminuye la actividad en un 64%.
- 6.
- Conservación. La enzima soluble se puede conservar a temperatura ambiente (sin estabilizadores) durante al menos 55 días, reteniendo el 100% de su actividad inicial.
Figura 1.- Esquema del método seguido para
construir los plásmidos que contienen el gen de la
\beta-galactosidasa con y sin péptido señal del
microorganismo S. mitis . Se representan sólo los aspectos
más relevantes de los plásmidos. Para detalles, ver el texto
(ejemplo 2). Sólo se indican los sitios de restricción y las
estructuras más importantes para poder comprender mejor el esquema.
La flecha gruesa representa el gen estructural que codifica la
\beta-galactosidasa de S. mitis. Rectángulo
negro: Péptido señal. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa SMC:
Sitio múltiple de clonación.
Figura 2.- Secuencias de oligonucleótidos
utilizados en los experimentos de PCR. A) Oligonucleótido
utilizado para la construcción del plásmido pBSF01 (1 en Figura 1).
B) Oligonucleótido utilizado para la construcción del plásmido
pBSF02 (2 en Figura 1). C) Oligonucleótido utilizado para la
construcción de los plásmidos pBSF01 y pBSF02 (3 en Figura 1). D)
Oligonucleótido utilizado para la construcción del plásmido pHGM02
(4 en Figura 3). E) Oligonucleótido utilizado para la construcción
del plásmido pHGM02 (5 en Figura 3).
Figura 3.- Esquema del método seguido para
construir un plásmido que contine el gen de la
IMAC/\beta-galactosidasa del microorganismo S.
mitis . Se representan sólo los genes más relevantes de los
plásmidos. Para detalles, ver el texto (ejemplo 4). Sólo se indican
los sitios de restricción y las estructuras más importantes para
poder comprender mejor el esquema. La flecha gruesa representa el
gen estructural que codifica la
\beta-galactosidasa de S. mitis. PCR:
Reacción en cadena de la polimerasa.
Figura 4.- Análisis de proteínas por
electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes al 7,5% (SDS-PAGE). Calle x,
proteínas marcadoras de peso molecular, indicadas en el margen
izquierdo, en kDa. Calle y, \beta-galactosidasa
sin péptido señal de S. mitis purificada por
DEAE-celulosa y Sephacryl S-300.
Calle z, IMAC/\beta-galactosidasa de S.
mitis purificada por IMAC.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\hskip1cmUNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS Y
PROTEÍNAS DE LA BETA-GALACTOSIDASA DE
STREPTOCOCCUS MITIS, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS
APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> beta-gal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7266
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus mitis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(7263)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
beta-galactosidasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6898)..(6957)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo de unión a colina 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6958)..(7017)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo de unión a colina 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7018)..(7083)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo de unión a colina 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7084)..(7149)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo de unión a colina 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (7150)..(7215)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo de unión a colina 5
\newpage
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 2411
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<212> PRT
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<213> Streptococcus mitis
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 7101
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> beta-galactosidasa
sin péptido señal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(7101)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> beta-galactosidasa
sin péptido señal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2366
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Synthetic Construct
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> beta-galactosidasa
sin péptido señal con poli-histidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(7119)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> beta-galactosidasa
sin péptido señal con poli-histidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Etiqueta
poli-his
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Synthetic Construct
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Secuencia de nucleótidos caracterizada
porque comprende una de las secuencias pertenecientes al siguiente
grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos de la \beta-galactosidasa SEQ ID NO1,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b).
- d)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a), b) y c).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 1 caracterizada porque es la secuencia de la
\beta-galactosidasa SEQ ID NO1.
3. Secuencia de nucleótidos según reivindicación
1 caracterizada porque la secuencia de nucléotidos de c) es
un fragmento de la \beta-galactosidasa sin péptido
señal (SEQ ID NO3).
4. Secuencia de nucleótidos según reivindicación
1 caracterizada porque es la secuencia SEQ ID NO5, que
comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO3 y una secuencia de
nucleótidos codificante de seis histidinas en el extremo
N-terminal de la SEQ ID NO3.
5. Secuencia de nucleótidos según
reivindicaciones 1 a 4 caracterizada porque es una secuencia
de ADN, ADNc o ARNm.
6. Construcción genética caracterizada
porque comprende una secuencia de nucleótidos según reivindicaciones
1 a 5.
7. Vector de expresión caracterizado
porque comprende una secuencia de nucleótidos según reivindicaciones
1 a 6.
8. Vector de expresión según la reivindicación 7
caracterizado porque el vector de expresión es el plásmido
pBSF01, pBSF02 o pHGM02.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Secuencia de aminoácidos caracterizada
porque comprende una de las secuencias de aminoácidos pertenecientes
al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la \beta-galactosidasa de S. mitis (SEQ ID NO2),
- b)
- una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia a),
- c)
- un fragmento cualquiera de las secuencias de a) y b),
- d)
- una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera de a), b) y c).
\vskip1.000000\baselineskip
10. Secuencia de aminoácidos según
reivindicación 9 caracterizada porque es la secuencia de la
\beta-galactosidasa SEQ ID NO2.
11. Secuencia de aminoácidos según
reivindicación 9 caracterizada porque la secuencia de
aminoácidos de c) es un fragmento de la
\beta-galactosidasa sin péptido señal (SEQ ID
NO4).
12. Secuencia de aminoácidos según
reivindicación 9 caracterizada porque es la secuencia de la
\beta-galactosidasa modificada SEQ ID NO6, que
comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO4 y una secuencia de
seis histidinas en el extremo N-terminal de la SEQ
ID NO4.
13. Uso de la secuencia de aminoácidos según
reivindicaciones 9 a 12 en la reducción del contenido de lactosa en
alimentos o residuos de procesos alimentarios pertenecientes, a
título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: productos lácteos y derivados, sueros de
lechería.
14. Célula huésped, preferentemente procariota,
caracterizada porque comprende una construcción genética
según reivindicaciones 1 a 6.
15. Célula huésped, preferentemente procariota,
caracterizada porque comprende el vector de expresión según
reivindicaciones 7 a 8.
16. Célula huésped según reivindicaciones 14 y
15 caracterizada porque es una célula de Escherichia
coli, preferentemente células E. coli MC4100.
17. Célula huésped según reivindicación 16
caracterizada porque es una célula de la cepa E. coli
con el número de depósito CECT 7433 o E. coli con el número
de depósito CECT 7434.
18. Uso de la célula huésped según
reivindicaciones 14 a 17 en la reducción del contenido de lactosa en
alimentos o residuos de procesos alimentarios pertenecientes, a
título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: productos lácteos y derivados, sueros de
lechería.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Procedimiento de obtención de la secuencia
de aminoácidos SEQ ID NO2 caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
- a)
- obtención de una construcción genética que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO1, y del vector de expresión que comprende esta construcción genética,
- b)
- transformación de una célula huésped, preferentemente de E. coli, en la que la construcción genética o el vector de expresión de a) bajo control de los promotores adecuados expresa la proteína codificada por la SEQ ID NO1, y purificación del extracto crudo de las células,
- c)
- inmovilización de la proteína en matrices de DEAE-celulosa mediante el paso del extracto crudo de b) a través de la matriz,
- d)
- disociación de la proteína de la matriz cromatográfica mediante lavado de la matriz con un medio que comprende colina,
- \quad
- y, opcionalmente
- e)
- posterior purificación de la proteína mediante el paso del eluído de d) a través de una matriz cromatográfica de exclusión por tamaño.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Procedimiento de obtención según
reivindicación 19 caracterizado porque la secuencia de
nucleótidos de a) es la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO3.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Procedimiento de obtención de la secuencia
de aminoácidos SEQ ID NO6 caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
- a)
- obtención de una construcción genética que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO5, y del vector de expresión que comprende esta construcción genética,
- b)
- transformación de una célula huésped, preferentemente de E. coli, en la que la construcción genética o el vector de expresión de a) bajo control de los promotores adecuados expresa la proteína codificada por la SEQ ID NO5, y purificación del extracto crudo de las células,
- c)
- inmovilización de la proteína en matrices de cromatografía de afinidad a iones metálicos inmovilizados mediante el paso del extracto crudo de b) a través de la matriz,
- d)
- disociación de la proteína de la matriz cromatográfica mediante lavado de la matriz con un medio que comprende imidazol.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802310A ES2352704B1 (es) | 2008-08-08 | 2008-08-08 | Secuencia de nucleotido y proteina b-galactosidasa de streptococcus mitis, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802310A ES2352704B1 (es) | 2008-08-08 | 2008-08-08 | Secuencia de nucleotido y proteina b-galactosidasa de streptococcus mitis, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2352704A1 true ES2352704A1 (es) | 2011-02-22 |
| ES2352704B1 ES2352704B1 (es) | 2012-06-14 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200802310A Expired - Fee Related ES2352704B1 (es) | 2008-08-08 | 2008-08-08 | Secuencia de nucleotido y proteina b-galactosidasa de streptococcus mitis, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
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| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2352704B1 (es) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092209A2 (en) * | 2003-04-15 | 2004-10-28 | Intercell Ag | S. pneumoniae antigens |
-
2008
- 2008-08-08 ES ES200802310A patent/ES2352704B1/es not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092209A2 (en) * | 2003-04-15 | 2004-10-28 | Intercell Ag | S. pneumoniae antigens |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MADOZ, J. et al. Functionalization of Gold Surfaces for Specific an Reversible Attachment of a Fused ß-Galactosidase and Choline-Receptor Protein. J.AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. 05.02.1997. Volumen 119, pág. 1043-1051. DOI: 10.1021/ja963465r. Resumen e introducción * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2352704B1 (es) | 2012-06-14 |
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