ES2337666T3

ES2337666T3 - Elaboracion de mutantes de una fosfatasa alcalina, inactivos o de reducida actividad y su expresion en levadura.

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Publication number: ES2337666T3
Application number: ES03006426T
Authority: ES
Inventors: Rainer Dr. Mueller; Johann-Peter Dr. Thalhofer; Frank Dr. Geipel; Werner Dr. Hoelke; Thomas Dr. Kirschbaum
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-03-25
Filing date: 2003-03-21
Publication date: 2010-04-28
Anticipated expiration: 2023-03-21
Also published as: DE50312336D1; US20040072316A1; EP1348760A3; CA2421592A1; EP1348760A2; US7303903B2; DE10213201A1; JP3850806B2; CA2421592C; ATE455169T1; EP1348760B1; JP2004000170A; US20070154941A1; US7202072B2

Abstract

Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, en donde, - la frecuencia a mutar, es la SEQ ID NO:2, y - el mutante, presenta una actividad reducida como mínimo en un factor de 100, en comparación con la del tipo salvaje, el mutante, presente una o varias de las mutaciones que se citan a continuación, y en donde, la posición de la mutación, se encuentra definida con relación a la SEQ ID NO: 2: Ser92:por Ala ó Gly His320:por Asn ó Phe Gly 322:por Phe ó Lys.

Description

Elaboración de mutantes de una fosfatasa alcalina, inactivos o de reducida actividad y su expresión en levadura.

La presente invención, se refiere a un procedimiento para la fabricación recombinante o, respectivamente, la expresión de mutantes de una fosfatasa alcalina eucariótica, los cuales son inactivos de reducida actividad. La invención, se refiere, además, a DNAs con codones optimizados, basados en la secuencia de ácido nucleico, los cuales codifican para una fosfatasa alcalina, altamente activa, y que se modifican mediante una mutagénesis seleccionada como objetivo, de tal forma que, ésta codifique para una fosfatasa alcalina de actividad reducida, o inactiva. La invención, se refiere, además, a un procedimiento para la inserción de los DNA mutantes, en un vector, para la expresión en células de levadura, así como a un procedimiento para la expresión de los mutantes de fosfatasa alcalina.

Las fosfatasas alcalinas (AP), son fosfomonoestearasas no específicas, dímeras, que contienen zinc, las se encuentran tanto en los organismos procarióticos como en los organismos eucarióticos, como por ejemplo, en E. coli y mamíferos (McComb et al., 1979 Alcaline Phosphates, Plenum Press, New York). La comparación de la estructura primaria de las fosfatasas alcalinas, proporcionó un alto grado de homología (un porcentaje del 25-30% de homología, entre
E. coli y mamíferos-AP; Millàn, 1988 Anticancer Res. 8, 995-1004; Harris, 1989, Clin. Chim. Acta 186, 133-150).

En los hombres y en los animales superiores, la familia de las AP (fosfatasas alcalinas), consta de cuatro miembros, los cuales se codifican en diversos locus de genes (Millan, 1988, Anticancer Res. 8, 995-1004; Harris, 1989, Clin. Chim. Acta 186, 133-150). A la familia de las fosfatasas alcalinas, pertenecen las APs específicas de tejidos (AP de placenta (PLP), AP de células de gérmenes (GCAP), y AP del intestino (IAP), y la APs no específicas de tejidos (TnAP), las cuales se encuentran principalmente localizadas en el hígado, lo riñones, y los huesos.

Una propiedad determinante de las APs hasta ahora conocidas, es la gran variabilidad en la actividad catalítica de las APs de los mamíferos, las cuales poseen un valor de k_{cat}, correspondiente a un nivel 10-100 veces mayor que las AP de E. coli. Por debajo de las APs de los mamíferos, las APs del intestino bovino (biAP), son las que presentan las mayores actividades específicas. Esta propiedad, convierte a las biAPs, en atractivas, para la aplicación o utilización bioquímica, como por ejemplo, la aplicación de los correspondientes conjugados enzimáticos como reactivo de diagnóstico, o para la desforolización de DNA. La existencia de diversas fosfatasas alcalinas, procedentes del intestino bovino, con distintas actividades altamente específicas, se describe en el documento de patente europea EP 0 955 363 ó, respectivamente, en Manes et al. (1988), J. Biol. Chem. 273 nº 26, 23353-23360. Hasta ahora, se ha descrito un expresión recombinante de fosfatasas alcalinas eucarióticas de reducida actividad (hasta 3000 U/mg), en diversas líneas celulares eucarióticas como por ejemplo, células CHO (biAP I/WO93/1813 9; Weissig et al. 1993, Biochem J. 260, 503-508), en células COS (humane Placenta-AP/Berger et al., 1987 Biochemistry 84, 4885-4889) o en sistemas de expresión de los Baculovirus (humane Placenta-AP/Davis et al. 1992, Biotechnology 10, 1148-1150). La expresión de APs altamente activas (actividad específica > 3000 U/mg) procedentes del intestino bovino, en células COH (blAP II, III y IV/Manes et al. 1998, J. Biol. Chem. 273 No. 36, 23353-23360), se encuentra también descrita. Un inconveniente de la expresión de fosfatasas alcalinas, en estos sistemas de expresión, reside, no obstante, en el reducido rendimiento o capacidad de expresión, la cual convierte a la fabricación recombinante de fosfatasas alcalinas eucarióticas, en no comercialmente rentables.

Una expresión de fosfatasas alcalinas eucarióticas, en huéspedes de expresión procarióticos, como por ejemplo, E. coli, es de hecho principalmente posible (humane Placenta-AP/Beck and Burtscher, 1994, Protein Expressión and Purification 5, 192-197), pero, no obstante, las fosfatasas alcalinas expresadas en procariotas, no presentan ninguna glicosilación, la cual es esencial, en la fabricación de conjugados enzimáticos, según el procedimiento de conjugación.

Una aplicación frecuente de las fosfatasas alcalinas, como conjugados enzimáticos, es un complejo con un anticuerpo. Junto a ello, la fosfatasa alcalina, se conjuga con un anticuerpo, el cual está dirigido contra un antígeno determinado. En primer lugar, este antígeno, se une, en una primera reacción, a partir de un anticuerpo inmovilizado en la pared vascular, el cual reconoce a otro epítope en el antígeno diana, como un conjugado anticuerpo-AP. Este complejo anticuerpo-antígeno, se identifica entonces, en una segunda reacción, mediante el enlace o unión del conjugado anticuerpo-AP. Mediante los tests de ensayo de ese tipo, se llega siempre a unos resultados de falsos positivos, provocados por un enlace o unión inespecífico del conjugado anticuerpo-AP, con la pared vascular, o con el primer anticuerpo. Estas perturbaciones, puede evitarse mediante la adición de un conjugado con un mutante de AP, inactivo o de reducida actividad, en una cantidad en exceso, como proteína antiparasitaria (de eliminación de las perturbaciones). Con objeto de actuar de una forma muy específica como proteína antiparasitaria (de eliminación de las perturbaciones), es no obstante también un requisito indispensable, además de la reducida actividad, o de la inactividad, una estructura terciaria y cuaternaria de los mutantes de AP, en gran parte igual o semejante.

Correspondientemente en concordancia, la presente invención, tiene la finalidad de producir mutantes de la fosfatasa alcalina, como proteína antiparasitaria, mediante una mutagénesis seleccionada, los cuales son de reducida actividad, o totalmente inactivos, que no obstante, en su secuencia de aminoácidos sólo se encuentran modificados de una forma insignificante, y en la estructura terciara o cuaternaria, de la mejor forma, no se encuentran modificados. Adicionalmente, además, es una finalidad de la presente invención, el desarrollar un procedimiento de expresión, que sea estable y resistente, para la fabricación de mutantes de de fosfatasa alcalina, eucarióticos, glicosilados, los cuales, además, debido a su alto rendimiento o capacidad de expresión, posibiliten una fabricación económicamente rentable de un mutante de fosfatasa alcalina correspondientemente en concordancia.

Son una finalidad de la presente invención, mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, en donde,

\bullet la frecuencia a mutar, es la SEQ ID NO:2, y

\bullet el mutante, presente una actividad reducida como mínimo en un factor de 100, en comparación con la del tipo salvaje,

\bullet el mutante, presente una o varias de las mutaciones que se citan a continuación, y en donde, la posición de la mutación, se encuentra definida con relación a la SEQ ID NO: 2:

Ser92:: por Ala ó Gly

His320:: por Asn ó Phe

Gly 322:: por Phe ó Lys,

Bajo la definición de mutación de las secuencia de aminoácidos, se entiende la sustitución de los aminoácidos de origen natural, en las posiciones deseadas, por cualquier otro aminoácido, a voluntad, que no impida el pliegue en la correcta estructura terciaria y cuaternaria, y que no obstante, no sean funcionales.

La secuencia a mutar (tipo salvaje), puede ser, por ejemplo, la consistente en una AP intestinal, humana, o una AP de placenta, humana. Adicionalmente, además, en concordancia con la presente invención, como AP de tipo salvaje, entran en consideración una AP infraactiva (es decir, de reducida actividad) o una AP hiperactiva, procedente del intestino bovino. Todas estas enzimas, son por lo menos un 77% homólogas a la SEQ ID NO: 2. La homología, se determinó con un sistema informático de Software, del tipo "Open VMS Vax Version V6.2"; (Copyright (c) 1982-2001, Genetics Computer Group, Inc.; A wholly owned subsidiary of Oxford Molecular Group, Inc. All rights reserved. Published research assisted by this software should cite: Wisconsin Package Version 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.).

Los datos de la posición de los aminoácidos a mutar, se refiere a secuencia de aminoácidos de la fosfatasa alcalina según la SEQ IND NO: 2, sin secuencia de señal. Las posiciones de aminoácidos identificadas, son también no obstante transferibles a otras fosfatadas alcalinas procedentes de animales bovinos o de otros organismos; las modificaciones, se refieren a aminoácidos con funciones altamente conservadas, dentro de las proteínas y, así, de este modo, únicamente debe ajustarse la posición, según la secuencia de aminoácidos correspondiente.

Mutagénesis seleccionada de las secuencia de DNA, significa el hecho de que, los condones individuales o los múltiples codones, se modifican vía mutagénesis por PCR. Adicionalmente, además, se realizan tan pocas modificaciones como sea posible, en el triplete de bases, modificándose, en el caso más favorable, únicamente una base de gen optimizado con codones, en concordancia con la SEQ ID NO: 3.

De una forma preferible, se trata, en concordancia con la presente invención, de mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, según la reivindicación 1, en donde, el mutante, presenta una o varias de las mutaciones que se citan a continuación, y en donde, la posición de la mutación, se encuentra definida con relación a la SEQ ID NO: 2:

Ser92:: por Ala ó Gly

His320:: por Asn ó Phe

Gly 322:: por Phe ó Lys.

En concordancia con la presente invención, se prefieren los mutantes anteriormente mencionados, arriba, de la fosfatasa alcalina eucariótica, en donde, la enzima, según la secuencia de tipo salvaje, presenta un actividad específica de más de 700 U/mg. Adicionalmente además, es ventajosa, como secuencia genética, un secuencia de DNA, la cual, basándose en el gen, el cual codifica para un mutante de fosfatasa alcalina eucariótica, con una actividad específica correspondiente a un valor que se encuentra por encima de 700 U/mg, se ha mutado, de una forma seleccionada, en pocas posiciones, de tal forma que, la secuencia de este modo originada, codifica para una secuencia de aminoácidos de los mutantes de fosfatasa alcalina eucariótica, modificados en una o pocas posiciones, a cuyo efecto, las mutaciones, conducen a una reducción de la actividad específica, que puede ser desde muy fuerte hasta total.

Se prefieren, especialmente, los mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, en concordancia con la presente invención, en donde, el mutante, presenta una actividad de la AP, reducida en un valor correspondiente a un factor de 100, en comparación con la enzima del tipo salvaje. Adicionalmente, además, se prefieren los mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, en concordancia con la presente invención, en donde, el mutante, presenta una actividad de la AP, reducida en un valor correspondiente a un factor de 1000, en comparación con la enzima del tipo salvaje. Se prefieren, de una forma muy especial, en concordancia con la presente invención, aquéllos mutantes, en los cuales, la reducción de la actividad específica, se encuentra a un nivel por debajo del margen de identificación (determinado según los tests de ensayo de actividad, realizados en el ejemplo 4).

En concordancia con la presente invención, se han evidenciado como siendo apropiadas, la posiciones de aminoácidos Asp316/His320/His432 (compañero de enlace del átomo de zinc 1), Asp42/Asp357/His358 (compañero de enlace del átomo de zinc 2), Ser155/Glu311 (compañero de enlace del átomo de magnesio), Ser92 (el grupo hidroxi, se desprotoniza, para el ataque nucleofílico sobre el substrato) (Ma and Kantrowitz (1994), J. Biol. Chem, 16 pp. 31614-31619; Ma et al. (1995), Protein Science, 4, pp. 1498-1506; Kimura and Kikuta (2000) JBIC 5, pp. 139-155; Stec et al. (2000), JMB 299 pp. 1303-1311) así como Gly322 (importante para la actividad específica; EP 0 955 369).

En concordancia con la presente invención, entran en consideración las posiciones anteriormente descritas, arriba, como mutantes individuales, o bien, no obstante, también, en todas las combinaciones posibles de las anteriormente descritas posiciones, como mutantes dobles, triples o múltiples. Se prefieren, de una forma especial, todas las secuencias de aminoácidos mutadas (modificadas), según las SEQ ID NO's: 4-7, en donde, la SEQ ID NO.: 4 representa un mutante individual en la posición 92 (Ser92Ala), la SEQ ID NO.: 5 representan un mutante individual en la posición 322 (Gly322Phe), la SEQ ID NO.: 6 representa un mutante doble en las posiciones 320 y 322 (His320Asn/Gly322Phe) y la SEQ ID NO.: 7 representa un mutante triple en las posiciones 92, 320 y 322 (Ser92Ala/His320Asn/Gly322Phe). Las secuencias de DNA que pertenecen adicionalmente, se representan en las SEQ ID NO.: 8-11.

Es una finalidad adicional de la presente invención, un DNA, el cual codifique para los mutantes en concordancia con la presente invención, anteriormente descritos, arriba. Adicionalmente, además, son una finalidad de la presente invención, vectores, los cuales contengan las secuencias de ácidos nucleicos en concordancia con la presente invención. De una forma particular, se trata de aquéllos vectores que contienen una secuencia de ácido nucleico, a cuyo efecto, la secuencia de ácido nucleico, se elige de entre de las secuencias de identificación SEQ ID Nos 4-7. Los vectores apropiados, son conocidos, por parte de las personas expertas en el arte especializado de la técnica, como por ejemplo, pPICZ\alphaA, B, C;pPICZ, pPICZ-E, pPICZ\alpha-E; pPIC6, pPIC6\alphaA, B, C; pGAPZ, pGAPZ\alphaA, B, C; pPIC9; pPIC9K, pPIC3.5, pPIC3.5K, pAO 815, pMET, pMET\alphaA, B, C; pYES-Dest52, pYES2.1/V5-His-TOPO, pYC2-E, pYES2.1-E; vectores Yes, pTEF1/Zeo, pTEF1/Bsd, pNMT-TOPO (como por ejemplo, Invitrogen). Se clonan las respectivas secuencias genéticas, por ejemplo, en los vectores pPICZ\alphaA ó, respectivamente, pPIC9K, los cuales se encuentran comercialmente disponibles en el mercado (de procedencia de la firma Invitrogen), y aquéllas que contienen la secuencias genéticas, según las SEQ ID NO's: 8-11, las cuales se encuentran bajo el control de los promotores AOX1. A título de referencia, para los vectores fabricados en concordancia con la presente invención, cítense los vectores pNaAP31-1 (Fig. 1) y pNaAP31-2 (Fig. 2), los cuales contienen la secuencia genética SEQ ID NO.: 8 respectivamente clonada en pPICZ\alphaA(pNaAP31-1) y pPIC9K (pNaAP31-2).

Los vectores pNaAP31-1 y pNAP31-2, son relevantes, en igual medida, para los vectores producidos en concordancia con la presente invención, ya que, el clon producido, al final, puede contener copias de ambos vectores.

Un vector de expresión obtenido en concordancia con la presente invención, se transforma, de una forma preferible, en diversas cepas de levadura, como por ejemplo, la Pichia pastoris, y se integra, de una forma estable, en el genoma. La integración estable en el genoma de levadura, tiene la ventaja, de un forma particular, consistente en el hecho de que, en la producción posterior de, por ejemplo, los mutantes de fosfatasa alcalina de reducida actividad, o inactivos, en fermentadores de grandes volúmenes, no es necesaria ninguna presión de selección. La integración estable en el genoma, significa el hecho de que, el vector de expresión, se incorpora en el genoma, mediante una recombinación homóloga de, por ejemplo, Pichia pastoris, y con ello, se hereda genéticamente, como una parte integrante fija del genoma de la levadura (Cregg, J.M. et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 3376-3385).

Adicionalmente, además, es una finalidad de la presente invención, una cepa huésped, transformada con uno de los vectores en concordancia con la presente invención. Como huéspedes de levadura, son apropiados, de una forma particular, las levaduras metilótrofas, como por ejemplo, la levaduras Pichia pastoris, Hansenula polymorfa, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica ó Schizosaccharomyces pombe. De una forma especialmente preferida, como cepa huésped, se utiliza la Pichia pastoris. Se prefiere, de una forma especial, la cepa de Pichia pastoris X-33, transformada con uno de los vectores descritos.

Es también una finalidad de la presente invención, un procedimiento para la fabricación de los mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, en concordancia con la presente invención, en células de levadura, que comprende las etapas de: a) clonación de una secuencia genética en concordancia con la presente invención, en distintos vectores, b) transformación de la levadura, c) expresión, y d) purificación de la fosfatasa alcalina, caracterizado por el hecho de que,

- un primer vector, presenta un gen de resistencia, contra un primer marcador de selección,

- los transformantes, los cuales han integrado el gen de resistencia y la secuencia genética deseada, en el genoma, se seleccionan, mediante el crecimiento sobre un medio nutritivo, con una reducida concentración del primer marcador de selección.

- el número de copias genéticas, se aumenta mediante transformación múltiple, a cuyo efecto, las transformaciones múltiples, se seleccionan, mediante el crecimiento sobre un medio nutritivo, con presión de selección elevada,

- se añade un segundo vector, el cual presenta un gen de resistencia contra un segundo marcador de selección,

- el número de copias genéticas, se aumenta mediante transformación múltiple con el segundo vector, a cuyo efecto, los transformantes múltiples, se seleccionan mediante crecimiento sobre el medio nutritivo, con una presión de selección elevada, y

- se seleccionan aquéllos clones, los cuales han integrado, al genoma, varias copias de la secuencia genética y genes de resistencia al marcador de selección.

De una forma preferible, en el procedimiento en concordancia con la presente invención, se utilizan células de levadura metilotrofas. De una forma especialmente preferible, como célula de levadura, se utiliza la Pichia pastoris.

Es adicionalmente preferible, para el procedimiento en concordancia con la presente invención, el hecho de que, como vector, se utilice uno de tal tipo que corresponda a un vector, el cual se elija de entre el siguiente grupo de vectores: pPICZ\alphaA, B, C; pPICZ, pPICZ-E, pPICZ\alpha-E; pPIC6, pPIC6\alphaA, B, C; pGAPZ, pGAPZ\alphaA, B, C; pPIC9; pPIC9K, pPIC3.5, pPIC3.5K, pAO 815, (Invitrogen).

El aumento del número de copias de las secuencia genética mutada (modificada) en las levaduras metilotrofas, se consigue mediante transformación múltiple, mediante el aumento simultáneo de la presión de selección, con un marcador de selección apropiado, como por ejemplo, un antibiótico, como el Zeocin® (zeocina) ó, respectivamente, la gentecita (G18), a cuyo efecto, solo permanecen clones susceptibles de poder vivir, los cuales hayan integrado varias copias del vector de expresión, de una forma estable, en el genoma. Con objeto de ser resistentes contra altas concentraciones de antibiótico utilizado como marcador de selección, es necesario el hecho de que, los clones, produzcan proteínas de resistencia multiplicada (aumentada). Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante una integración múltiple del vector de expresión, el cual, además de la casete de expresión para los respectivos mutantes de AP, como por ejemplo, el mutante de fosfatasa alcalina Ser92Ala, contenga, también, el gen de resistencia para el antibiótico utilizado como marcador de selección.

La función de los mutantes de fosfatasa alcalina, en un procedimiento de expresión, resistente y estable, con una alta capacidad de expresión y, simultáneamente, con un rendimiento productivo económicamente rentable, puede lograrse mediante los procedimientos que se describen a continuación.

La mutagénesis seleccionada para el la fabricación de los mutantes en concordancia con la presente invención, se realizó del siguiente modo: Basándose en el gen que codifica para un mutante de fosfatasa alcalina de animal vacuno (vaca), y el cual se fabricó sintéticamente, se diseñaron oligonucleótidos complementarios o solapados, los unos con los otros, los cuales se modificaron en una o en varias posiciones de bases, con respecto a la SEQ ID NO:3. Uno de estos cebadores, se aplicó, a continuación, como compañero, con los cebadores 5'- ó, respectivamente, 3', que se describen posteriormente, a continuación y, así, de este modo, se amplificó con el gen AP, en dos fragmentos, con la deseada o las deseadas modificaciones de bases.

Los dos segmentos, se analizan, a continuación, por medicación electroforesis en gel de agarosa, se aíslan los productos con la longitud esperada, del gel, mediante un equipo de extracción, a modo de kit, del tipo ``QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen) y, en un reacción de PCR adicional, se sintetizan hasta su conversión en el producto genético completo. La reacción de PCR, se realizó, a dicho efecto, en los primeros 5 ciclos, sin la adición del cebador, en el extremo 5' y en el extremo 3' del gen completo, de tal forma que, en primer lugar, a partir de los dos segmentos, se originen pocos fragmentos del producto genético de la longitud esperada. La temperatura de reasociación, se rige, a dicho efecto, por la temperatura de fusión de la zona de solapado. A continuación, se procedió a añadir los cebadores fijos en los extremos y, la temperatura de reasociación, se incrementó, correspondientemente en concordancia con la temperatura de reasociación de los cebadores. En 25 ciclos adicionales, se amplificó ampliamente, a continuación, el fragmento genético de la longitud esperada.

La preparación resultante de la PCR, se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa y, el fragmento genético, se aisló con el tamaño esperado (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen).

La clonación de un fragmento de PCR correspondientemente en concordancia, la transformación en Pichia pastoris, así como la expresión de los correspondientes mutantes de AP, se encuentran descritos en el ejemplo 2.

La recombinación de mutantes de fosfatasa alifática, pueden aislarse de la biomasa, mediante procedimientos de extracción, los cuales son en principio conocidos por parte de aquéllas personas expertas en el arte especializado de la técnica, como por ejemplo, según "Protein Purification", Springer Verlag, Herausg. Robert Scopes (1982). Mediante procedimientos adecuados de cromatografía, como, especialmente, con la utilización de materiales de columna hidrófobos, y un intercambiador catiónico, se obtiene un producto purificado en bandas.

Mediante la presente invención, se describe así, de este modo, por primera vez, el cual corresponde a una fabricación económicamente rentable de mutantes de fosfatasa alcalina recombinantes, de mamíferos, como por ejemplo, del intestino de animales vacunos (vaca), en levaduras, los cuales contienen un actividad de AP fuertemente reducida, o que no contienen ninguna actividad reactiva y que, por lo demás, no obstante, corresponden, en sus características, a los mutantes de fosfatasa alcalina recombinante procedentes del intestino de animales vacunos. Estos mutantes, pueden emplearse, no obstante, de una forma particular, como proteína desparatizante, en tests de ensayos inmunológicos, en los cuales, la AP, actúa como marcador, como MTP-ELISA.

Figuras

Figura 1

Mapa de plásmido del vector de expresión pNaAP31-1, con la secuencia genética mutante SEQ ID NO: 8 en pICZ\alphaA (Invitrogen).

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Figura 2

Mapa de plásmido del vector de expresión pNaAP31-1, con la secuencia genética mutante SEQ ID NO: 8 en pICZ9K (Invitrogen).

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Ilustraciones de los protocolos se secuencia SEQ ID NO's 1-21

SEQ ID NO: 1 Secuencia de DNA nativa que codifica para la AP altamente activa de animal vacuno, sin señal de secuencia.

SEQ ID NO: 2 Secuencia de aminoácidos de AP altamente activa de animal vacuno.

SEQ ID NO: 3 Secuencia de DNA de gen sintético que codifica para una AP altamente activa, encontrándose, corriente arriba de la secuencia codificante, el sito de corte de restricción EoRI, y corriente abajo el sito de corte de restricción Asp 718.

SEQ ID NO: 4 Secuencia de aminoácidos del mutante individual de AP Ser 92 Ala (tipo salvaje: AP altamente activa de animal vacuno).

SEQ ID NO: 5 Secuencia de aminoácidos del mutante individual de AP Gly 322 Phe (tipo salvaje: AP altamente activa de animal vacuno).

SEQ ID NO: 6 Secuencia de aminoácidos del mutante doble de AP Ser 92 Ala/His 320/Gly 322 Phe (tipo salvaje: AP altamente activa de animal vacuno).

SEQ ID NO: 7 Secuencia de aminoácidos del mutante triple de AP Ser 92 Ala/His 320/Gly 322 Phe (tipo salvaje: AP altamente activa de animal vacuno).

SEQ ID NO: 8 Secuencia de DNA del gen sintético que codifica para el mutante individual de AP Ser 92 Ala los sitios de corte EcoRi, respectivamente, Asp 718, corriente arriba, respectivamente, corriente abajo, de la secuencia codificadora.

SEQ ID NO: 9 Secuencia de DNA del gen sintético que codifica para el mutante individual de AP Gly 322 Phe con los sitios de corte EcoRi, respectivamente, Asp 718, corriente arriba, respectivamente, corriente abajo, de la secuencia codificadora.

SEQ ID NO: 10 Secuencia de DNA del gen sintético que codifica para el mutante doble de AP His 320 Asn/Gly 322 Phe con los sitios de corte EcoRi, respectivamente, Asp 718, corriente arriba, respectivamente, corriente abajo, de la secuencia codificadora.

SEQ ID NO: 11 Secuencia de DNA del gen sintético que codifica para el mutante triple de AP Ser 92 Ala/His 320 Asn/Gly 322 Phe con los sitios de corte EcoRi, respectivamente, Asp 718, corriente arriba, respectivamente, corriente abajo, de la secuencia codificadora.

SEQ ID NO's: 12-21 Secuencias de DNA que sirven como cebadores

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Abreviaturas

YDP:: Levadura peptona dextrosa

YDPS:: Levadura peptona dextrosa sorbitol

BMGY:: Medio de complejo de glicerol tamponado

BMMY:: Medio de complejo de metanol tamponado

MTP:: Placas de microtítulo

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Ejemplos Mutagénesis de la secuencia sintética de DNA, la cual codifica para los mutantes de fosfatasa alcalina procedentes de animales vacunos

Para la mutagénesis de los tripletes de bases, vía reacción de PCR, se procedió a diseñar oligonucleótidos, los cuales poseyeran una secuencia de bases modificada correspondientemente en concordancia, y que fueran complementarios o, respectivamente, parcialmente complementarios, solapándose parcialmente entre ellos. Estos oligonucleótidos, se insertaron, a continuación, como respectivos compañeros, al cebador 5' consistente en el cebador 5'-hAPa, según la SEQ IN NO: 12, y respectivamente, al cebador 3' consistente en el cebador 3'-hAP, según la SEQ ID NO: 13, los cuales hibridan, respectivamente, con el extremo 5' y respectivamente el extremo 3' del gen que codifica a los mutantes de la fosfatasa alcalina procedente de animal vacuno (vaca). Con ello, se amplificaron, en una primera reacción, las secuencias genéticas mutantes, en dos segmentos, a cuyo efecto, el primer segmento, porta la mutación en extremo 3' y, el segundo segmento, porta la mutación en el extremo 5', y una corta secuencia de bases, en el extremo 3', procedente del primer segmento, es idéntica a una corta secuencia de bases del extremo 5' del segundo segmento.

En una segunda reacción de PCR, se procedió, entonces, a fusionar estos dos segmentos al producto genético de longitud total. Adicionalmente, además, se procedió, en primer lugar, a iniciar la reacción, sin los cebadores 5'-hAP y 3'-bAP, según las SQ ID NO: 12 y 13, y se realizaron 15 ciclos. Con ello, se originan pocas moléculas del producto genético de longitud total, en las cuales, la temperatura de reasociación, en estos 5 ciclos, se rija por la temperatura de fusión del sector de solapado de ambos segmentos. A continuación, se añadieron los cebadores 5' y 3' según las SEQ ID NO: 12 y 13, se ajustó la temperatura de reasociación a la temperatura de fusión del cebador con la temperatura de fusión más baja, y se amplificó el producto genético de longitud total, en 25 ciclos adicionales.

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Mutagénesis para la generación del mutante individual Ser92Ala

Para la generación del mutantes individual Ser92Ala, se mutó el triplete de bases en la posición 274-276, con referencia al triplete de bases TTG según la SEQ ID NO: 3 que codifica para los primeros aminoácidos de la fosfatasa alcalina altamente activa procedente de animal vacuno (vaca), de TCT en CGT. Adicionalmente, además, se diseñaron los cebadores parcialmente complementarios el uno con respecto al otro, consistentes en los cebadores 5'-S92A, en concordancia con la SEQ ID NO: 14, y 3'-S92A, en concordancia con la SEQ ID NO: 15. Se procedió, a continuación, a iniciar la primera reacción de PCR, con los pares de cebadores 5'hAP y 3'-S92A así como 5'-S92A y 3'-hAP, separados el uno con respecto al otro, con la secuencia genética SEQ ID NO: 3, a modo de iniciador, de tal forma que, la secuencia genética mutante, en primer lugar, se amplificó en dos segmentos. Los segmentos, se analizaron con gel de agarosa, y se aislaron a partir del gel de agarosa (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen) y, a continuación, se insertaron en la segunda reacción de PCR. En esta segunda reacción de PCR, se fusionaron ambos segmentos, para convertirse en el producto de longitud total, de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba. La secuencia genética de esta forma originada, se clonó correspondientemente en concordancia, con los vectores de clonación por PCR (equipo, a modo de "kit", de clonación de PCR, del tipo PCR Cloning Kit-blund end/Roche Diagnostics), y se comprobó, por mediación de análisis de restricción y secuenciación.

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Mutagénesis para la generación del mutante individual Gly322Phe

Para la generación del mutante individual Gly322Phe, se mutó el triplete de bases en la posición 964-966, con referencia al triplete de bases TTG según la SEQ ID NO: 3 que codifica para los primeros aminoácidos de la fosfatasa alcalina altamente activa procedente de animal vacuno (vaca), de GGT en TTT. Adicionalmente, además, se diseñaron los cebadores parcialmente complementarios el uno con respecto al otro, consistentes en los cebadores 5'-G322F, en concordancia con la SEQ ID NO: 16, y 3'-G322F, en concordancia con la SEQ ID NO: 17. Se procedió, a continuación, a iniciar la primera reacción de PCR, con los pares de cebadores 5'hAP y 3'-G322F así como 5'-G322F y 3'-hAP, separados el uno con respecto al otro, con la secuencia genética según la SEQ ID NO: 3, a modo de iniciador, de tal forma que, la secuencia genética mutante, se amplificó, en primer lugar, en dos segmentos. Los segmentos, se analizaron con gel de agarosa, y se aislaron a partir del gel de agarosa (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen) y, a continuación, se insertaron en la segunda reacción de PCR. En esta segunda reacción de PCR, se fusionaron ambos segmentos, para convertirse en el producto de longitud total, de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba. La secuencia genética de esta forma originada, se clonó correspondientemente en concordancia, con los vectores de clonación por PCR (equipo, a modo de "kit", de clonación de PCR, del tipo PCR Cloning Kit-blund end/Roche Diagnostics), y se comprobó, por mediación de análisis de restricción y secuenciación.

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Mutagénesis para la generación del mutante doble His320Asn/Gly322Phe

Para la generación del mutante individual His320Asn/Gly322Phe, se mutó el triplete de bases en las posiciones 958-966 y, respectivamente, 954-966, con referencia al triplete de bases TTG según la SEQ ID NO: 3 que codifica para los primeros aminoácidos de la fosfatasa alcalina altamente activa procedente de animal vacuno (vaca), de CAT en AAT y, respectivamente, de GGT en TTT. Adicionalmente, además, se diseñaron los cebadores parcialmente complementarios el uno con respecto al otro, consistentes en los cebadores 5'-H320N/G322F, en concordancia con la SEQ ID NO: 18, y 3'-H320N/G322F, en concordancia con la SEQ ID NO: 19. Se procedió, a continuación, a iniciar la primera reacción de PCR, con los pares de cebadores 5'hAP y 3'-H320N/G322F, así como 5'-H320N/G322F y 3'-hAP, separados el uno con respecto al otro, con la secuencia genética según la SEQ ID NO: 3, a modo de iniciador, de tal forma que, la secuencia genética mutante, se amplificó, en primer lugar, en dos segmentos. Los segmentos, se analizaron con gel de agarosa, y se aislaron a partir del gel de agarosa (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen) y, a continuación, se insertaron en la segunda reacción de PCR. En esta segunda reacción de PCR, se fusionaron ambos segmentos, para convertirse en el producto de longitud total, de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba. La secuencia genética de esta forma originada, se clonó correspondientemente en concordancia, con los vectores de clonación por PCR (equipo, a modo de "kit", de clonación de PCR, del tipo PCR Cloning Kit-blund end/Roche Diagnostics), y se comprobó, por mediación de análisis de restricción y secuenciación.

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Generación del mutante triple Ser92Ala/His320Asn/Gly322Phe

Le generación del mutante triple Ser92ALa His320Asn/Gly322Phe, se llevó a cabo mediante la combinación del mutante individual Ser92Ala y del mutante doble His320Asn/Gly322Phe. A continuación, se procedió cortar ambas secuencias genéticas, respectivamente clonadas en vectores de clonación por PCR (equipo, a modo de "kit", de clonación de PCR, del tipo PCR Cloning Kit-blund end/Roche Diagnostics), separadas la una con respecto a la otra, con las endonucleasas de restricción MunI y AspT18, y se separaron del preparado saliente de restricción, mediante electroforesis en agarosa. MunI, corta entre las posiciones de los tripletes procedentes de Ser92 y His320. A partir del mutante individual Ser92Ala, se aisló el fragmento de vector de aproximadamente 3700 pb de longitud, y del mutante doble His320Asn/Gly322Ph3, se aisló el fragmento de aproximadamente 900 pb de longitud, del sector 3' de la secuencia genética mutante, en gel de agarosa, y estos dos fragmentos, se ligaron, en la etapa siguiente, el uno con el otro. La secuencia genética de esta forma producida, se comprobó mediante secuenciación.

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Ejemplo 2 Clonación de las secuencias genéticas mutantes en el vector de expresión pPICCZ\alphaA, para Pichia pastoris

Las secuencias genéticas comprobadas, se cortaron, mediante restricción, con las endonucleasas de restricción EcoRI y Asp718, de los vectores de clonación por PCR, el conjunto resultante de restricción, se separó mediante electroforesis en gel de agarosa y, los fragmentos de aproximadamente 1480 pb de longitud, se aislaron del gel de agarosa (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen). A continuación, se procedió a ligar las secuencias genéticas mutantes con un fragmento de vector linealizado, también, con EcoRI y Asp718, procedente del vector de expresión pPICZ\alphaA. Los sitios de corte de las endonucleasas de restricción para EcoRI y Asp718, se aportaron a la secuencia genética mutante, mediante el cebador 5'-hAP y, respectivamente, 3'-hAP, que contienen la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción EcoRI y, respectivamente, Asp718, corriente arriba y, respectivamente, corriente debajo de las secuencia codificadora. Los vectores de expresión para los mutantes de fosfatasa alcalina de esta forma originados, se denominaron del siguiente modo: pNaAP31-1(Ser92Ala), pNaAP4 3-1 (Gly322Phe), pNaAP51-1 (His320Asn/Gly322Phe) y pNaAP6-1 (Ser92Ala/His320Asn/Gly322Phe).

En este vector, las secuencias mutantes, se encuentran bajo el control del promotor de AOX 1 (promotor para la alcoholoxidasa 1 de la Pichia pastoris), es inducible con metanol, y se clona, en el correcto marco de lectura, detrás del péptido de señal del factor \alpha de la Saccharomyces cerevisae. El fragmento genético de esta forma obtenido, se comprobó, a continuación, en cuanto a lo referente a una secuencia de bases exenta de errores, mediante análisis de restricción y secuenciación. Los vectores de expresión de esta forma originados, los cuales codifican, respectivamente, a una de las secuencias genéticas según las SEQ ID NO's: 8-11, de los mutantes de fosfatasa alcalina eucariótica, se muestran, a título de ejemplos, en el pNaAP31-1 (véase la figura 1).

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Transformación de los vectores de expresión con secuencias genéticas mutantes en Pichia pastoris

Para la transformación de los vectores de expresión con secuencias genéticas mutantes, en Pichia pastoris X-35, con una integración subsiguiente en el genoma, se procedió, en primer lugar la linealizar los vectores, con SacI (Roche Diagnostics GmbH). La transformación, se efectuó mediante electroporación, con el impulsor genético Gene Pulser II (Biorad).

Para ello, se procedió a inocular una colonia de la cepa salvaje de Pichia pastoris en 5 ml de medio de YPD (YPD-Medium de la firma Invitrogen), y se incubó, a una temperatura de 30ºC, durante el transcurso de toda la noche, mediante agitación. El cultivo del transcurso de toda la noche, se sobreinoculó, a continuación, a razón de 1:2000, en 200 ml de medio de YPD (YPD-Medium de la firma Invitrogen), y se incubó, durante el transcurso de tiempo de toda la noche, a una temperatura de 30ºC, mediante agitación, hasta que se obtuviera un OD_{600} de 1,3-15. Se procedió a centrifugar las células (1500 x g/5 minutos) y, el gránulo, se resuspendió en 200 ml de agua helada (º0) estéril. Se procedió a centrifugar las células de nuevo (1500 x g/5 minutos), y se resuspendieron en 100 ml de agua helada (º0) estéril. Las células, se centrifugaron otra vez, de nuevo y se resuspendieron en 10 ml de Sorbitol ICN) 1M, helado. Las células, se centrifugaron otra vez, de nuevo y se resuspendieron en 0,5 ml de Sorbitol ICN) 1M, helado. Las células de este modo obtenidas, se mantuvieron en hielo, y se aplicaron, enseguida, para la transformación.

Se procedió a mezclar 80 \mug de las células con aproximadamente 1 \mug del DNA del vector de expresión linealizado y, la preparación, en su totalidad, se transfirió al interior de una cubeta de electroporación helada (0º), y se incubó durante un transcurso de tiempo adicional de 5 minutos, sobre hielo. A continuación, se procedió a transferir la cubeta al interior del impulsor genético Gene Pulser II (Biorad) y, la transformación, se realizó a 1 kV, 1k\Omega y 25\muF. Después de la electroporación, la preparación, se mezcló con 1 ml de Sorbitol 1M (ICN) y, a continuación, se colocaron de 100 a 150 \mul sobre una placa de Agar de YPDS (Invitrogen) con 100 \mug/ml de Zeocin® (Invitrogen). Las placas, se incubaron, a continuación, durante un transcurso de tiempo de 2-4 días, a una temperatura de 30ºC.

Los clones, se sobreinocularon sobre placas de MD de retículo (MD = Dextrosa mínima), y se analizaron adicionalmente. Los clones desarrollados, se recolectaron, se resuspendieron en 20 \mul de agua estéril, y se disgregaron con 17,5 U de Lyticase (liticasa procedente de la firma Roche Diagnostics GmbH) (durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37ºC), y se procedió, directamente, a su análisis, mediante PCR, en cuanto a lo referente a la correcta integración de la casete de expansión, con la correspondiente secuencia genética mutada.

Los clones, los cuales habían integrado el casete de expresión completo en el genoma, se aplicaron, a continuación, en los ensayos de expresión.

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Ejemplo 3 Expresión de los mutantes de fosfatasa alcalina

Se procedió a inocular los clones positivos, en 3 ml de medio del tipo BMGY-Medium (de la firma Invitrogen), y se procedió a incubarlos, durante el transcurso de toda, la noche, y a una temperatura de 30ºC, bajo régimen de agitación. A continuación, se procedió a determinar el valor de OD a 600 nm, y así, de este modo, se sobreinocularon en 10 ml de medio del tipo BMMY-Medium (de la firma Invitrogen), de tal modo que resultase un valor de OD_{600} de 1. El medio del tipo BMMY-Medium (de la firma Invitrogen), contiene metanol (Mallinckrodt Baker B.V.), el cual induce la expresión de los mutantes de fosfatasa alcalina, sobre el Promotor AOX-1.

Las retortas de agitación, se incubaron, a una temperatura de 30ºC, bajo régimen de agitación, y se extrajeron muestras cada 24 horas, se determinó el valor de OD_{600}, se realizó un test de ensayo de actividad en cuanto a la expresión de los mutantes de fosfatasa alcalina, y respectivamente, con un porcentaje del 0,5% de metanol (de la firma Mallinckrodt Backer B.V.), se condujeron a una inducción subsiguiente. Los ensayo de expresión, transcurrieron durante un período de tiempo de 96 horas.

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Ejemplo 4 Test de ensayo de actividad de los mutantes de fosfatasa alcalina

Se extrajeron, respectivamente, 500 \mul del cultivo de expresión en concordancia con el ejemplo 3, se procedió a determinar el valor de OD_{600} y se centrifugaron las células. Se conservó el sobrenadante (sobrante) y, el gránulo de células, se volvió a suspender en una cantidad de Y-PER® (50 a 300 \mul/Pierce), para la lisis, y se agitó, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente. A continuación, se procedió a centrifugar el lisado (1500 x g/5 minutos), para la separación de los residuos de células y, el sobrenadante (sobrante), se condujo a recipientes de reacción frescos. Se procedió, a continuación, a aplicar los lisados en tests de ensayo de actividad.

El test de ensayo de actividad, funciona según el siguiente principio:

1

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Se mide el aumento de la de absorción a 405 nm.

Se procede a mezclar 3 ml de tampón de dietanolamina (1 mol/l Dietanolamina -(Merck) -, pH 9,8, 0,5 mmol/l MgCl_{2 }(Riedel de Haen), con 50 \mul de solución fosfato de 4-nitrofenilo (0,67 mol/l fosfato de 4-nitrofenilo), sal de Na (Roche diagnostics GmbH) y, la preparación, se atempera a una temperatura de 37ºC. A continuación, la reacción, se inicia mediante la adición de 5 \mul de lisado, y se determina la variación de la absorción, a una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 3 minutos, y, a partir de ello, se calcula el valor de \DeltaE/minuto.

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La actividad, se calculó según la siguiente fórmula:

2

\varepsilon = 18,2 [1 x mmol^{-1} x cm^{-1}]

Factor x = factor de concentración después de la disgregación de células

De una forma análoga, se procedió a determinar la actividad a partir del sobrenadante o sobrante del medio del cultivo de expresión. Aquí, igualmente, se procedió a iniciar la reacción con 50 \mul de sobrenadante, si bien, no obstante, se añadieron, adicionalmente, todavía 0,5 mM ZnCl_{2}. El cálculo, aconteció, no obstante, sin el factor x.

Como controles positivos, se acarrearon respectivamente sobrenadantes o sobrantes de clones, los cuales expresan la fosfatasa alcalina de alta actividad, según la SEQ ID NO: 3, y como clones negativos, los que se habían transformado únicamente con el vector de partida pPICZ\alphaA, sin gen diana.

Con este test de ensayo de la actividad, se procedió a determinar la actividad residual de los mutantes, de la siguiente forma:

Mutante individual Ser92Ala: Reducción de la actividad específica en un factor de aproximadamente 5000

Mutante individual Gly322Phe: Reducción de la actividad específica en un factor de aproximadamente 2500

Mutante doble His320Asn/Gly322Phe: Reducción de la actividad específica en un factor de aproximadamente 10000 (cerca del límite de comprobación)

Mutante triple Ser92Ala/His320Asn/Gly322Phe: Reducción de la actividad específica en un factor de aproximadamente 10000 (cerca del límite de comprobación)

Mutante triple Ser92Ala/His320Asn/Gly322Phe: Reducción de la actividad específica en un factor de aproximadamente 1000 (cerca del límite de comprobación)

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Comprobación de la expresión de los mutantes de AP, por mediación de transferencia de Western

Se procedió a aplicar 10 \mul de sobrenadante (sobrante) no concentrado o, respectivamente, extracto crudo, después de la disgregación de las células, a un gel de SDS al 10% (Novex Pre-Cast Gel/Invitrogen) y, la proteína las proteínas que se encuentran en su interior, se separaron mediante la aplicación de un campo eléctrico, en concordancia con la magnitud. Las proteínas de esta forma separadas, se sometieron a transferencia de Western, sobre una membrana de nitrocelulosa (aparato de transferencia de Western del tipo Novex® Western transfer Apparatus XCell II® Blot Module/Invitrogen). La membrana, se lavó, después de la transferencia, dos veces, con agua ultrapurificada, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos y, a continuación, se sometió a régimen de agitación, en 10 ml de solución de bloqueo (Blocking Solution, de la firma Invitrogen), durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. A continuación, se procedió, de nuevo, a lavar la membrana, con 20 ml de agua ultrapurificada, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos y, después de ello, en 10 ml de solución de bloqueo (Blocking Solution, de la firma Invitrogen), la cual contenía, esta vez, anticuerpo 1 (anticuerpo 1 del tipo Anti AP-rabbit (Rockland Inc, que se encuentra diluido en un valor de 1:5000, a partir de una solución de la cepa correspondiente a 10 mg/ml), durante un transcurso de tiempo de 1 hora. Después de ello, se procedió a lavar con 20 ml de una solución de lavado de anticuerpo (del tipo Antikörperwaschlösung de la firma Invitrogen) durante, respectivamente, un transcurso de tiempo de 5 minutos y, a continuación, la membrana, se incubó con 10 ml de la solución de anticuerpo secundaria (la cual contiene el anticuerpo Anti-Rabbit-antikörper/Invitrogen), durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. Se continúa, otra vez, con un lavado, de cuatro veces, durante respectivamente, un transcurso de tiempo de 5 minutos, con 20 ml de una solución de lavado de anticuerpo (del tipo Antikörperwaschlösung de la firma Invitrogen), y un lavado de tres veces, con 20 ml de agua ultrapurificada, durante, respectivamente, un transcurso de tiempo de 2 minutos. Para la tinción, se procedió, a continuación, a incubar la membrana, en 5 ml de una solución de tinción, (substrato cromógeno/Invitrogen) durante un transcurso de tiempo comprendido dentro de unos márgenes situados entre 1-60 minutos. El tiempo de incubación, se rige por la calidad de la tinción. Después de la tinción óptima, se procede a lavar la membrana, tres veces, con 20 ml de agua ultrapurificaca, durante respectivamente un transcurso de tiempo de 2 minutos y, a continuación, se procede a secar la membrana, a la temperatura ambiente. La totalidad de las soluciones, con la excepción del agua ultrapurificada, procedían del equipo de inmunodetección, a modo de "kit", del tipo Western Breeze Chromogenic Inmunodetection Kit, de la firma Invitrogen, y todas las etapas de incubación, se realizaron a la temperatura ambiente. La realización, se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 6 Aumento de la capacidad de expresión mediante transformación múltiple

Se procedió, otra vez, a preparar los mejores clones procedentes de los ensayos de expresión, para la electroporación, de la misma forma que la que se ha descrito en el ejemplo 2, y se procedió, otra vez, a transformarlos con 1 \mug del vector-DNA del vector de expresión, linealizado y, el preparado de transformación, se colocó sobre placas de Agar de YPDS (Invitrogen) con 1000 a 2000 \mug/ml de Zeocin® (Invitrogen). A continuación, se procede a aumentar la presión de selección, que sólo puedan hacer crecer clones, los cuales hayan integrado, en el genoma, múltiples copias del vector de expresión y, así, con ello, también, varias copias del respectivo gen de resistencia (aquí, en este caso, Zeocin®). La proteína de resistencia consistente en Zeocin®, es el producto del gen de la bleomicina de la Streptoalloteichus hindustanos (Chalmels, T. et al., Curr. Genet. 20 (1991), 301-314; Drocour, D. et al., Nucleic Acid Research 18 (1990), 4009), el cual enlaza a la Zeocin®, en una proporción estequiométrica de concentración y, así, con ello, confiere la resistencia de las células contra la Zeocin®. Cuanto mayor es la concentración en Zeocin®, en las placas de agar de YDPS, más proteína de resistencia debe originar la célula, con objeto de enlazar a la Zeocin®, de una forma cuantitativa y, así, con ello, posibilitar un crecimiento. Esto es posible, entre otras cosas, si se integran múltiples copias del gen de resistencia, en el genoma. Los clones, se sobreinocularon, de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba, con Placas de MD de retículo, y se comprobaron, de nuevo, mediante análisis de PCR, en cuanto a lo referente a los respectivas casetes de expresión. A continuación, se procedió, otra vez, a someter los clones a tests de ensayo, de la forma que se ha descrito en los ejemplos 4 y 5, en cuanto a lo referente a actividad de AP, respectivamente, mediante análisis de transferencia de Western.

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Ejemplo 7 Aumento de la capacidad de expresión mediante la utilización de una segunda presión de selección

Un aumento de la concentración de Zeocin®, por encima de los 200 \mug/ml, no condujo a una capacidad de expresión mejorada de los mutantes de fosfatasa alcalina. Con objeto aumentar adicionalmente el número de copias de genes del gen según las SEQ ID NO's: 8-11, que codifican para los mutantes de fosfatasa alcalina, y que están optimizados para la expresión, en el codón de levadura, en los clones de expresión, se procedió a seleccionar los clones de expresión con la mayor capacidad de expresión, sobre una segunda presión de selección, de una forma preferible, G418 (Roche Diagnostics GmbH). Con esta finalidad, se procedió a aislar el casete de expresión completo, a partir del pNAP31-1, que consta del promotor AOX1, péptido de señal de factor \alpha de la Saccharomyces cerevisae, gen optimizado con codones, para los mutantes de fosfatasa alcalina en concordancia con las SEQ ID NO's: 8-11 y región de terminación de transcripción de AOX1, a través de PCR, mediante los respectivos cebadores seleccionados de AOX1 y, de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba, se clonó en el vector pP1C9K, cuya integración en el genoma de Pichia pastoris, se selecciona por mediación del G418 (Roche Diagnostics GmbH). En el caso de los cebadores 5'-Expr 3'-Expr, se trata de las secuencias SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21.

Se procedió a analizar la preparación resultante de PCR, mediante electroforesis en gel de agarosa, se aisló el fragmento genético con el tamaño esperado (mediante un equipo, a modo de "Kit", del tipo QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen), se cortó posteriormente con SacI y NotI (Roche Diagnostics GmbH) y, a continuación, se aisló, de nuevo, a partir del gel de agarosa (mediante un equipo, a modo de "Kit", del tipo QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen), y se ligó en un fragmento de vector, de PIC9K, igualmente linealizado y aislado, con SacI y NotI (Roche Diagnostics GmbH). Así, de este modo, se garantizó el hecho de que, el casete de expresión en su totalidad, de los respectivos vectores de expresión, se encontraran, en el pPIC9K, de una forma idéntica. El fragmento insertado, se comprobó por mediación de análisis de restricción y secuenciación, con las regiones flanqueantes. Los vectores de expresión para los mutantes de fosfatasa alcalina de esta forma originados, se denominaron del siguiente modo: pNaAP31-2 (Ser92Ala), pNaAP 4 3-2 (Gly322Phe), pNaAP51-2 (His320Asn/Gly322Phe) y pNaAP6-2 (Ser92Ala/His320Asn/Gly322Phe).

Se procedió a preparar los clones con la mayor capacidad de expresión de los mutantes de AP, de la transformación múltiple, con Zeocin®, como marcador de selección, de la misma forma que se ha descrito en el ejemplo 2, para la electroporación y, se transformaron con 1 \mug de fragmento de pNaAP-31-2 y derivados, linealizados con SacI (Roche Diagnostics GmbH), de la misma forma que se ha descrito para el ejemplo 2. El preparado de transformación, se conservó, a continuación, durante un transcurso de tiempo de 1 a 3 días, a una temperatura de 4ºC, en sorbitol 1 M (ICN) (para la formación o desarrollo del gen de resistencia G418) y, a continuación, se depositaron de 100 a 200 \mul sobre pacas de YPD (Invitrogen), con 1,2 ó respectivamente, 4 mg/ml de G418 (Roche Diagnostics GmbH) y se incubaron durante un transcurso de tiempo de 3 a 5 días, a una temperatura de 30ºC. Los clones resultantes de ello, se analizaron, de nuevo, de la misma forma que se ha descrito, en un test de actividad, en cuanto a lo referente a una expresión incrementada de los mutantes eucarióticos de fosfatasa alcalina.

<110> Roche Diagnostics GmbH

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<120> Elaboración de mutantes de una fosfatasa alcalina, inactivos o de reducida actividad y su expresión en levadura.

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<130> W 21227 DE

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<160> 21

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 1464

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<212> DNA

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<213> Bovino

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1464)

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<223>

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<400> 1

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3

4

5

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<210> 2

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<211> 487

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<212> PRT

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<213> Bovino

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<400> 2

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6

7

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<210> 3

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<211> 1476

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<212> DNA

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<213> Ácido nucleico

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<400> 3

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8

9

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<210> 4

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<211> 487

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<212> PRT

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<213> Bovino/mutado

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<400> 4

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10

11

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<210> 5

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<211> 487

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<212> PRT

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<213> Bovino/mutado

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<400> 5

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12

13

14

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<210> 6

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<211> 487

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<212> PRT

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<213> Bovino/mutado

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<400> 6

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15

16

17

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<210> 7

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<211> 487

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<212> PRT

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<213> Bovino/mutado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1476

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1476

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1476

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1476

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cebador 5'-hAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgaattc ttgattccag ctgaagaaga aaatccagct ttttgg

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cebador 3'-hAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcggtacc ttaatctgga atactagtag cagtagctgg agctggc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cebador 5'-S92A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagatgctg ctggtactgc tactgc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cebador 3'-S92A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagtagcag taccagcagc atctggaact tgtc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cebador 5'-G322H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcatggtc atcatgattt taaggcttat atggc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cebador 3'-G322H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccatataag ccttaaaatc atgatgacca tgatc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cebador 5'-H320N/G322H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcatggtc ataatgattt taaggcttat atggc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cebador 5'H320N/G322F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccatataag ccttaaaatc attatgacca tgatc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cebador 5'-Expr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcctag gagatctaac atccaaagac g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cebador 3'-Expr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgcgctag cggatccgca caaacgaag

\hfill

29

Claims

1. Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, en donde,

- la frecuencia a mutar, es la SEQ ID NO:2, y

- el mutante, presenta una actividad reducida como mínimo en un factor de 100, en comparación con la del tipo salvaje,

el mutante, presente una o varias de las mutaciones que se citan a continuación, y en donde, la posición de la mutación, se encuentra definida con relación a la SEQ ID NO: 2:

Ser92:: por Ala ó Gly

His320:: por Asn ó Phe

Gly 322:: por Phe ó Lys.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, según la reivindicación 1, en donde, la enzima, según la secuencia del tipo salvaje, presenta una actividad específica correspondiente a un valor por encima de 7000 U/mg.

3. Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, según una de las reivindicaciones 1 y 2, en donde, los mutantes, presentan una actividad disminuida en por lo menos un factor de 1000, en comparación con la secuencia del tipo salvaje.

4. Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde, los mutantes, presentan una actividad disminuida en por lo menos un factor de 10000, en comparación con la secuencia del tipo salvaje.

5. Mutantes de la fosfatasa alcalina eucariótica, según una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde, estos mutantes, presentan una secuencia de aminoácidos, la cual se selecciona de entre las SEQ IC NO's: 4-7.

6. DNA recombinante, que codifica a un mutante de la fosfatasa alcalina eucariótica, según una de las reivindicaciones 1-5.

7. DNA recombinante, que codifica a un mutante de la fosfatasa alcalina eucariótica, en donde, este mutante, presenta una secuencia de ácido nucleico, la cual se elige entre las SEQ ID NO's: 8-11.

8. Vector que contiene una secuencia de ácido nucleico, la cual se elige entre las SEQ ID NO's: 8-11.

9. Vector, según la reivindicación 8, la cual corresponde a un vector, el cual se elige de entre los siguientes vectores: pPICZ\alphaA, B, C;pPICZ, pPICZ-E, pPICZ\alpha-E; pPIC6, pPIC6\alphaA, B, C; pGAPZ, pGAPZ\alphaA, B, C; pPIC9; pPIC9K, pPIC3.5, pPIC3.5K, pAO815, pMET, pMET\alphaA, B, C; pYES-Dest52, pYES2,1/V5-His-TOPO, pYC2-E, pYES2.1-E; vectores Yes,pTEF1/Zeo, pTEF1/Bsd, pNMT-TOPO.

10. Cepa huésped, transformada con un vector según la reivindicación 8 ó 9.

11. Cepa huésped, según la reivindicación 10, en donde, como cepa huésped, se utiliza la Pichia pastoris.

12. Procedimiento para la fabricación de un mutante de la fosfatasa alcalina eucariótica, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 5, en células de levadura, que comprende las etapas de: a) clonación de una secuencia genética según la reivindicación 6 ó 7, en distintos vectores, b) transformación de la levadura, c) expresión de los mutantes de AP, y d) purificación de la fosfatasa alcalina, caracterizado por el hecho de que,

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, en donde se utilizan células de levadura metilotrofas.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en donde, como célula de levadura metilotrofa, se utiliza la Pichia Pastoris.

15. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 12-14, en donde, como vector, se utiliza uno de tal tipo que corresponda a un vector, el cual se elije de entre el siguiente grupo de vectores: pPICZ\alphaA, B, C; pPICZ, pPICZ-E, pPICZ\alpha-E; pPIC6, pPIC6\alphaA, B, C; pGAPZ, pGAPZ\alphaA, B, C; pPIC9; pPIC9K, pPIC3.5, pPIC3.5K, pAO815.