CZ304223B6 - Rekombinantní chimérický urikázový protein - Google Patents

Rekombinantní chimérický urikázový protein Download PDF

Info

Publication number
CZ304223B6
CZ304223B6 CZ2001-466A CZ2001466A CZ304223B6 CZ 304223 B6 CZ304223 B6 CZ 304223B6 CZ 2001466 A CZ2001466 A CZ 2001466A CZ 304223 B6 CZ304223 B6 CZ 304223B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
uricase
lys
wall
leu
protein
Prior art date
Application number
CZ2001-466A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2001466A3 (cs
Inventor
Michael Hershfield
Susan J. Kelly
Original Assignee
Duke University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Duke University filed Critical Duke University
Publication of CZ2001466A3 publication Critical patent/CZ2001466A3/cs
Publication of CZ304223B6 publication Critical patent/CZ304223B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12N9/0048—Uricase (1.7.3.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Řešení se týká rekombinantní chimérické urátoxidázy (urikázy) a molekuly nukleové kyseliny, která tento protein kóduje. V tomto proteinu pochází N-koncová část z prasečí urikázy a C-koncová část z paviání urikázy, přičemž tyto části jsou vybrány tak, aby výsledný chimérický protein obsahoval celkem 30 lysinových zbytků, tj. o 1 více než původní prasečí nebo paviání urikáza. Uvedený protein je užitečný jako meziprodukt pro přípravu zlepšených modifikovaných urikázových proteinů se sníženou imunogenicitou a zvýšenou biologickou dostupností.

Description

Rekombinantní chimérický urikázový protein
Předkládaná přihláška si nárokuje právo priority z prozatímní přihlášky USA 60/095,489 podané 6. srpna 1998, jejíž celý obsah je formou odkazu součástí předkládané přihlášky.
Předkládaný vynález byl učiněn s podporou vlády USA formou grantu DK48529 uděleného National Institutes of Health. Tudíž vláda USA má na vynález jistá práva.
Oblast techniky
Předkládaný vynález se obecně týká proteinu urátoxidázy (urikázy) a nukleové kyseliny kódující tento protein. Vynález se zejména týká urikázového proteinu, který je užitečný např. jako meziprodukt pro přípravu zlepšených modifikovaných urikáz se sníženou imunogenicitou a zvýšenou biologickou dostupností. Výhodné modifikované urikázové proteiny podle vynálezu (dále zkráceně urikázy) zahrnují především urikázy kovalentně navázané na polyethylenglykoly nebo polyethylenoxidy. Předkládaný vynález poskytuje tudíž urikázu, protilátky, které se specificky váží na urikázu, molekulu nukleové kyseliny, která kóduje urikázu nebo její fragmenty, vektory obsahující takové molekuly nukleové kyseliny, hostitelské buňky obsahující tyto vektory a také způsoby přípravy urikázy a příslušné nukleové kyseliny.
Dosavadní stav techniky
Dna je nejrozšířenější zánětlivé onemocnění kloubů u mužů nad 40 let (Roubenoff 1990). Bolestivá dnavá artritida se objevuje, když zvýšená hladina kyseliny močové v krvi (hyperurikémie) vede k epizodnímu vytváření mikroskopických krystalů urátu sodného v kloubech. Postupně může chronická hyperurikémie vést až k destruktivním depozitům urátu (fofy) kolem kloubů, v měkkých tkáních a v některých orgánech (Hershfield 1996). Kyselina močová má omezenou rozpustnost v moči, a když je nadměrně secemována (hyperurikosurie), dochází ke vzniku ledvinových kaménků (urikolitiáza). U pacientů s některými maligními onemocněními, zejména leukémií a lymfomem, významná hyperurikémie a hyperurikosurie (v důsledku zvýšeného metabolického obratu a lýze buněk při chemoterapii) představují značné riziko akutního obstrukčního selhání ledvin (Sandberg a kol. 1956, Gold a Fritz 1957, Cohen a kol., 1980, Jones a kol. 1990). Silná hyperurikémie a dna jsou spojeny s renální dysfunkcí z různých příčin, jednou z nich je např. cyklosporinová terapie zabraňující odhojení cizorodého transplantátu (allotransplantátu) (West a kol., 1987, Venkataseshan a kol., 1990, Ahn a kol., 1992, Delaney a kol. 1992, George a Mandeli 1995).
Hyperurikémie je důsledkem buďto nadměrné tvorby urátu neb jeho nedostatečné exkrece (Hershfield a Seegmiller 1976, Kelley a kol. 1989, Becker a Roessler 1995). Pokud je mírná, může být hyperurikémie regulována dietou, ale je-li silná a spojená s vážnými klinickými příznaky, vyžaduje farmakoterapii, a sice buďto podávání urikosurického agens, které podporuje exkreci kyseliny močové (což je neúčinné v případě snížené funkce ledvin) nebo podávání inhibitoru xanthinoxidázy, allopurinolu, který blokuje vytváření urátu. Allopurinol je dnes hlavní terapií u pacientů s dnavými tofy, nedostatečnosti ledvin, leukémií a některými dědičnými nemocemi. Léčení hyperurikémie je obecně účinné aje dobře snášeno. Avšak někteří pacienti s deformující, invalidizující tofickou dnou jsou refraktemí ke všem dostupným léčbám (Becker 1988, Fam 1990, Rosenthal a Ryan 1995). Kromě toho asi u 2 % pacientů léčených allopurinolem se vyvine alergická reakce a vážný syndrom hypersenzitivity se objevuje asi o 0,4 (Singer a Wallace 1986, Arellano a Sacristan, 1993). Tento často život ohrožující syndrom může způsobit akutní selhání ledvin nebo jater, vážné poškození kůže (toxická epidermální nekrolýza, exfoliativní dermatitidy, erythema multiforme, Strevens-Johnonův syndrom). Allopurinol navíc interferuje s metabolismem azathiprinu a 6-merkaptopurinu, což jsou léčiva užívaná k léčení leukémií a k prevenci
-1 CZ 304223 B6 odhojení allotransplantátu, při kterých se často objevuje hyperurikémie a může způsobit silnou dnu nebo ohrozit funkci ledvin.
Hyperurikémie je výsledkem mutační inaktivace lidského genu pro urátoxidázu (urikázu) v průběhu evoluce (Wu a kol. 1989, Wu a kol. 1992). Aktivní urikáza vjatemích peroxisomech u většiny primátů kromě člověka a ostatních savců přeměňuje urát na allantoin (a CO2 a H2O2), který je 80 až lOOx rozpustnější než kyselina močová a je účinněji zpracováván ledvinami. Parenterální přípravek urikázy, připravené z Aspergillus flavus (Uricozyme®, Clin-Midy, Paříž) se užívá k léčení silné hyperurikémie spojené s chemoterapií leukémie ve Francii a Itálii již déle než 20 let (London a Hudson 1957, Kissel a kol. 1968, Brogard a kol. 1972, Kissel a kol. 1972, Potaux a kol. 1975, Zittoun a kol. 1976, Brogard a kol. 1978, Maséra a kol. 1982) a byl také užit nedávno v klinických testech v USA (Piu a kol. 1997). Urikáza má rychlejší nástup účinku než allopurinol (Maséra a kol. 1982, Pui a kol. 1997). U pacientů s dnou mohou iníuze urikázy přerušit akutní dnavý záchvat a zmenšit velikost tofů (Kissel a kol. 1968, Potaux a kol. 1975, Brogard a kol. 1978).
Ačkoliv jsou účinné pro léčení akutní hyperurikémie během krátkodobé chemoterapie, denní infuze urikázy z Aspergillus flavus jsou nevýhodné při léčení rekurentní nebo tofické dny. Navíc účinnost urikázy z Aspergillus flavus rychle klesá u pacientů, u kterých se vyvíjejí protilátky proti urikáze (Kisel a kol. 1968, Brogard a kol. 1978, Escudier a kol. 1984, Mourad a kol. 198, Sibony a kol. 1984). Byl popsán výskyt závažných alergických reakcí, včetně anafylaktického šoku (Donadio a kol. 1981, Montagnac a Schillinger 1990, Pui a kol. 1997). Je evidentní, že pro použití při dlouhodobé terapii je potřebný jiný přípravek urikázy s dlouhodobým účinkem a menší imunogenicitou.
Jeden ze způsobů, jak ochránit exogenní enzym před působením proteáz a imunitním systémem je kovalentní navázání inertního netoxického polymeru, např. monomethoxypolyethylenglykolu (PEG) na povrch proteinu (Harris a Zalipsky 1997). Bylo ukázáno, že použití PEG s relativní molekulovou hmotností (Mr) přibližně 1000 až nejvýše 10 000 prodlužuje u zvířat biologický poločas a snižuje imunogenicitu u několika cizorodých proteinů (Abuchowski a kol. 1977a, Abuchowski a kol. 1977b, Davis a kol. 1981a, Abuchowski a kol. 1984, Davis a kol. 1991). V roce 1990 se hovězí adenosindeamináza (ADA) modifikovaná PEG sMr 5000 (PEG-ADA, ADAGEN®, vyráběný firmou Enzon, lne.) stala prvním PEGylovaným (PEG-modifikovaným) proteinem, který FDA USA schválila pro léčení těžké kombinované imunodeficience, která je důsledkem deficience ADA (Hershfield a kol. 1987). Zkušenosti za uplynulých 12 let ukázaly, že anti-ADA protilátky mohou být detekovány citlivým testem ELISA u většiny pacientů po chronickém léčení PEG-ADA, ale nedochází k žádné alergické nebo hypersenzitivní reakci, zrychlená clearance PEG-ADA byla popsána u několika pacientů, u kterých se tvořily anti-ADA protilátky, ale zpravidla šlo o přechodný jev (Chaffee a kol. 1992, Hershfield 1997). Je třeba připustit, že imunitní funkce u pacientů s deficiencí ADA se obvykle nenormalizují v průběhu léčení PEG-ADA (Hershfield 1995, Hershfield a Mitchell 1995). Tudíž imunogenicita by mohla být závažnějším problémem při vývoji PEGylovaných enzymů pro chronické léčení pacientů, kteří mají normální imunitní funkce.
Odborníkovi je jasné, že imunogenicitou se rozumí indukce imunitní reakce injekcí přípravku fungujícího jako antigen (např. PEG-modifikovaný protein nebo nemodifikovaný protein), zatímco antigenicítou se rozumí reakce antigenu s již dříve existujícími protilátkami. Souhrnně se imunogenicita a antigenicita označují jako imunoreaktivita. V předchozích studiích s urikázou se imunoreaktivita hodnotila různými metodami, např. stanovením reakce in vitro PEG-urikázy s předem vytvořenými protilátkami, měřením syntézy indukovaných protilátek a stanovením zrychlení clearance po opakovaných injekcích.
Bylo ukázáno, že PEGylace snižuje imunogenicitu a prodlužuje u zvířat dobu oběhu urikázy pocházející zhub nebo z prasete (Chen a kol. 1981, Savoca a kol. 1984, Tsuji a kol. 1985, Veronese a kol. 1997). PEG-modifikovaná urikáza z Candida rychle snižovala hladinu urátu
-2CZ 304223 B6 v séru až na nedetekovatelnou hladinu u 5 dobrovolníků s normální urémií (Davis a kol. 1981 b). PEGmodifikovaná urikáza z Arthrobacter produkovaná firmou Enzon Inc. byla užita k léčení ze soucitu allopurinol-hypersenzitivních pacientů s lymfomem, u kterých se vyskytlo selhání ledvin a významný hyperurikémie (Chua a kol. 1988, Greenberg a Hershfield 1989). Čtyři intramuskulámí injekce byly podány v průběhu dvou týdnů. V průběhu této krátké doby byla hyperurikémie pod kontrolou a neobjevily se žádné protilátky proti urikáze, které by byly detekovatelné ELISA testem v plazmě pacientů. K dalšímu použití ani klinickému vývoji tohoto preparátu nedošlo.
Do dnešního dne nebyla vyvinuta žádná forma urikázy ani PEG-modifikované urikázy, která by měla dostatečnou dlouhou dobu cirkulace a přitom dostatečně nízkou imunogenicitu pro bezpečné a spolehlivé použití při dlouhodobém léčení. Proto bylo cílem předkládaného vynálezu zlepšit dosavadní urikázu tak, aby v kombinaci s modifikací PEG splnila výše uvedené požadavky.
Vynález tedy poskytuje jedinečnou rekombinantní urikázu savčího původu, která byla modifikovaná mutací takovým způsobem, který vedl ke zvýšení schopnosti PEG-modifikace maskovat potenciálně imunogenní epitopy.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje nový protein - urikázu a sekvence nukleové kyseliny kódující tento protein.
Konkrétně tento vynález poskytuje rekombinantní chimérický urikázový protein sestávající z prasečí urikázové části a paviání urikázové části, přičemž uvedená paviání urikázová část obsahuje lysinový zbytek v poloze odpovídající aminokyselinové poloze 291 v paviání urikáze (SEQ ID NO: 6), ve kterém N-koncová sekvence tohoto rekombinantního chimérického urikázového proteinu pochází z prasečí urikázy (SEQ ID NO: 7) a C-koncová sekvence tohoto rekombinantního chimérického urikázového proteinu pochází z paviání urikázy (SEQ ID NO. 6), přičemž části tvořené prasečí urikázou a paviání urikázou jsou vybrány tak, aby výsledný rekombinantní chimérický urikázový protein obsahoval celkem 30 lysinových zbytků, přičemž rekombinantní chimérický urikázový protein může být zkrácen na N-konci, na C-konci nebo, jak na N-konci, tak na C-konci, přičemž při zkracování nejsou odstraňovány lysino vé zbytky.
Další aspekt vynálezu poskytuje vektory a hostitelské buňky obsahující sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu a způsoby, kdy se užívají k produkci urikázy.
Vynález se dále týká snižování množství močové kyseliny v tělesných tekutinách u savců tím, že se jim podává přípravek obsahující urikázu podle vynálezu.
Předkládaný vynález poskytuje urikázový protein, který lze použít pro výrobu v podstatě neimunogenní PEG-urikázy, která si uchovává všechnu nebo téměř všechnu urikolytickou aktivitu nemodifikovaného enzymu. Urikolytická aktivita se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) najeden miligram proteinu, přičemž 1 IU je definována jako množství enzymu, které spotřebuje 1 pmol kyseliny močové za 1 minutu.
Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní urikázy savčího původu, která byla modifikována inzercí jednoho nebo více lysino vých zbytků. Rekombinantní protein v předkládané přihlášce označuje jakýkoliv uměle připravený protein, který je odlišný od přírodního proteinu (tj. proteinu tvořeného v tkáni zvířete, které obsahuje pouze původní přírodní gen pro požadovaný protein). Protein obsahuje peptidy a sekvence aminokyselin. Rekombinantní urikáza podle vynálezu je chiméra nebo hybrid ze dvou nebo více savčích proteinů, peptidů nebo aminokyselinových sekvencí. V jednom provedení předkládaného vynálezu se vynález užívá kpřípravě urikázy pocházející ze savce, která je modifikována zvýšením počtu lysino vých zbytků až do stavu, kdy
-3 CZ 304223 B6 po modifikaci PEG je rekombinantní PEG-modifikovaná urikáza v podstatě stejně enzymaticky aktivní jako nemodifikovaná urikáza a přitom PEG-modifikovaný produkt není nepřijatelné imunogenní. Vynález zahrnuje i zkrácené formy urikázy, které postrádají amino- a/nebo karboxylový konec. Výhodně urikáza není zkrácena natolik, že by byl odstraněn lysin.
Odborníkovi je jasné, že konjugáty urikázy s nosičovým komplexem nesmí obsahovat tolik vazeb, že by mohly podstatně snížit enzymatickou aktivitu urikázy ani tak málo vazeb, že by zůstala nepřijatelné imunogenní. Výhodně si konjugát uchová alespoň 70 % až 90 % urikolytické aktivity nemodifikované urikázy, přičemž je stabilnější, čili si uchovává aktivitu při skladování, v savčí plazmě a/nebo séru při fyziologické teplotě na rozdíl od nemodifikované urikázy. Uchování alespoň 80 % až 85 % urikolytické aktivity by bylo přijatelné. Kromě toho konjugát podle výhodného provedení vynálezu projevuje podstatně sníženou imunogenicitu a/nebo imunoreaktivitu ve srovnání s nemodifikovaným proteinem. V jednom provedení vynález poskytuje urikázový protein zde popsaný, který může být modifikován navázáním na netoxický, neimunogenní, farmaceuticky přijatelný nosič jako je např., PEG, kovalentní vazbou alespoň jednoho lysinu obsaženého v urikázovém proteinu. Alternativně je urikáza modifikována kovalentní vazbou k nosiči méně než 10 lysiny své aminokyselinové sekvence. Jako alternativní provedení vynálezu lze uvážit navázání ke 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nebo 9 lysinům.
Urikázový protein podle vynálezu je rekombinantní molekula, která obsahuje segmenty urikázy z ledvin paviána a prasete. Vynález poskytuje také modifikovanou sekvenci opičí urikázy.
V jednom provedení poskytuje vynález chimérickou urikázu prase-pavián (PBC urikáz, viz sekvence id. ě. 2), která obsahuje aminokyseliny (aa) 1 až 225 z prasečí urikázy (sekvence id. ě. 7) a aminokyseliny 226 až 304 z urikázy paviána (sekvence id. č. 6, viz také sekvence na obr. 5). V jiném provedení poskytuje vynález chimérickou urikázu prase-pavián (PKS urikáza), která obsahuje aminokyseliny 1 až 288 z prasečí urikázy a aminokyseliny 289 až 304 z urikázy paviána (sekvence id. č. 4). Vynález zahrnuje i zkrácené deriváty PBC a PKS urikáz. Výhodné zkrácené formy PBC a PKS urikáz jsou zkráceny tak, že je odstraněno 6 aminokyselin z aminokonce proteinu nebo 3 aminokyseliny z karboxylového konce proteinu nebo obojí. Reprezentativní sekvence je zde uvedena jako sekvence id č. 8 (PBC amino-zkrácená), 9 (PBS karboxyzkrácená), 10 (PKS amino-zkrácená) a 11 (PKS karboxy-zkrácená). Každá z PBC urikázy, PKS urikázy nebo jejich zkrácených forem má o 1 až 4 lysiny více než kolik se vyskytuje v ostatních savčích urikázách, které byly dosud klonovány.
Předkládaný vynález poskytuje molekuly nukleové kyseliny (DNA a RNA) včetně izolovaných, purifikovaných a/nebo klonovaných forem molekul nukleové kyseliny, které kódují urikázu a zkrácenou urikázu podle vynálezu. Výhodná provedení jsou zde uvedena jako sekvence id. č. 1 (PBC urikáza) a sekvence id. č. 3 (PKS urikáza).
Předkládaný vynález poskytuje také vektory, expresní a klonovací, obsahující molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu.
Navíc předkládaný vynález poskytuje i hostitelské buňky obsahující vektory podle vynálezu.
Dále vynález poskytuje protilátky, které se specificky váží na urikázový protein podle vynálezu. Protilátky k úseku amino-části prasečí urikázy a karboxylové části urikázy z paviána, když se užijí jako konjugát, jsou užitečné k detekci chimérického proteinu PBC nebo jiných podobných chimérických proteinů. Výhodně protilátky k amino-části chimérické urikázy by neměly rozpoznávat aminokoncovou část urikázy paviána a podobně protilátky ke karboxylovému konci chimérické urikázy by neměly rozpoznávat úsek karboxylového konce prasečí urikázy. Výhodně vynález poskytuje protilátky, které se specificky váží na PBC nebo PKS, ale neváží se na nativní proteiny, jako je prasečí urikáza a/nebo urikáza paviána.
V jiném provedení vynálezu lze užít vynález pro přípravu farmaceutického přípravku ke snížení kyseliny močové v tělních tekutinách jako je moč a/nebo sérum nebo plazma, kterýžto přípravek
-4CZ 304223 B6 obsahuje alespoň jeden urikázový protein nebo urikázový konjugát podle vynálezu a farmaceutický přijatelný nosič, ředidlo nebo excipient.
Předkládaný vynález může být využit ke snížení kyseliny močové v tělních tekutinách savců. Snížení spočívá v tom, že se savci podává přípravek obsahující urikázu nebo urikázový konjugát podle vynálezu v množství, které je účinné pro snížení kyseliny močové, a dále obsahující ředidlo, nosič nebo excipient, kdy jde výhodně o farmaceuticky přijatelné ředidlo, nosič nebo excipient. Savec je výhodně člověk.
Přípravek podle vynálezu lze podávat např. injekci, a sice intravenózní, intradermální, subkutánní, intramuskulámí nebo intraperitoneální. Zvýšená hladina kyseliny močové může být v krvi nebo moči, a může být spojena s dnou, tofy, nedostatečností ledvin, orgánovou transplantací nebo maligním onemocněním.
Jiné provedení předkládaného vynálezu poskytuje izolace a purifikace urikázy z roztoku, který obsahuje urikázu a např. buněčný a subbuněčný debris jako pozůstatek rekombinantního způsobu přípravy. Výhodně způsob purifikace podle vynálezu využívá omezené rozpustnosti savčí urikázy při nízkém pH (Conley a kol. 1979) a opláchnutím surového rekombinantního extraktu při pH 7 až 8,5 odstraní většinu proteinů rozpustných při tomto pH, zatímco aktivní urikáza je solubilizována v pufru, výhodně uhličitanovém pufru, při pH 10 až 11, výhodně 10,2. Solubilizovaná aktivní urikáza se pak nanese na kolonu s iontoměničem, jako je např. kolona s OSepharose, která se propláchne gradientem od nízké do vysoké koncentrace soli v pufru s pH přibližně 8,5, a pak se aktivní purifikovaná urikáza získá elucí gradientem chloridu sodného v pufru uhličitanu sodného spH 10 až 11, výhodně 10,2. Enzym může být dále purifikován gelovou filtrační chromatografií při pH 10 až 11. V tomto stadiu může být enzym ještě dále purifikován snížením pH na hodnotu 8,5 nebo nižší, čímž se selektivně precipituje urikáza, avšak nikoliv rozpuštěné nečistoty. Po opláchnutí při nízkém pH (7 až 8) se pak urikáza solubilizuje při pH přibližně 10,2. Preparát urikázy se pak může analyzovat odborníkovi známými metodami pro analýzu farmaceutických přípravků jako je některý druh vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), jiné chromatografické metody, rozptyl světla, centrifugace a/nebo gelová elektroforéza.
Popis obrázků
Obr. 1. Analýza SDS-merkaptoethanol-PAGE (12 % gel).
Obr. 2. Doba oběhu (biologický poločas) nativní urikázy a PBC urikázy modifikované PEG.
Obr. 3. Vztah mezi aktivitou urikázy v séru a koncentrací kyseliny močové v moči a séru.
Obr. 4. Udržování hladiny urikázové aktivity v oběhu (měřené v séru) po opakovaných injekcích.
Obr. 5. Dedukovaná aminokyselinová sekvence chimérické urikázy prase-pavián (PBC urikázy) (SEQ ID NO: 2) a prasečí urikázy obsahující mutace R291K a T301S (PKS urikáza) (SEQ ID NO: 4) porovnané se sekvencemi urikázy prasete (SEQ ID NO:7) a paviána (SEQ ID NO:6).
Obr. 6. Srovnání aminokyselinových sekvencí PKS (SEQ ID NO:4) a prasečí urikázy (SEQ ID NO:7).
Obr. 7. Srovnání aminokyselinových sekvencí PBC (SEQ ID NO:2) a PKS (SEQ ID NO:4).
Obr. 8. Srovnání aminokyselinových sekvencí PBC (SEQ ID NO:2) a prasečí urikázy (SEQ ID NO:7).
-5CZ 304223 B6
Obr. 9. Srovnání aminokyselinových sekvencí prasečí urikázy (SEQ ID NO:7) a D3H (SEQ ID NO:5).
Obr. 10. Srovnání aminokyselinových sekvencí PBC (SEQ ID NO:2) a D3H (SEQ ID NO:5).
Obr. 11-1 a 11-2. Srovnání kódujících sekvencí cDNA PKS (SEQ ID NO:3) a prasečí urikázy (SEQ ID NO: 12) při dosažení nejlepší shody (algoritmus „Bestfit“ softwaru GCG).
Obr. 12-1 a 12-2. Srovnání kódujících sekvencí cDNA PKS (SEQ ID NO:3) a urikázy paviána (SEQ ID NO: 13) při dosažení nejlepší shody (algoritmus „Bestfit“ softwaru GCG).
Obr. 13-1 a 13-2. Srovnání kódujících sekvencí cDNA PBC (SEQ ID NO:1) a prasečí urikázy (SEQ ID NO: 12) při dosažení nejlepší shody (algoritmus „Bestfit“ softwaru GCG).
Obr. 14-1 a 14-2. Srovnání kódujících sekvencí cDNA PBC (SEQ ID NO:1) a urikázy paviána (SEQ ID NO: 13) při dosažení nejlepší shody (algoritmus „Bestfit“ softwaru GCG).
Předkládaný vynález poskytuje urikázové proteiny, které jsou vhodnými meziprodukty pro zlepšené konjugáty urikázy s polymery, které jsou rozpustné ve vodě, výhodně polyethylenglykoly nebo polyethylenoxidy. Termín urikáza zde označuje jak individuální podjednotky, tak i nativní tetramer, pokud není výslovně uvedeno jinak.
Ačkoliv člověk nevytváří aktivní enzym, transkripty mRNA urikázy byly amplifikovány z RNA z lidských jater (Wu a kol. 1992). Teoreticky je možné, že některé transkripty jsou translatovány, a i když peptidové produkty nemají plnou délku nebo jsou nestabilní, mohou být zpracovány buňkami prezentujícími antigen a tudíž hrát roli pro určení imunitní reakce na exogenní urikázu použitou k léčení. Teoreticky je také možné rekonstruovat a exprimovat lidskou cDNA pro urikázu tím, že se odstraní dvě známé „nonsense“ mutace. Avšak je velmi pravděpodobné, že v nepřítomnosti selekčního tlaku se v lidském genu v průběhu milionů let od vzniku první nonsense mutace nahromadily škodlivé „missense“ mutace (Wu a kol. 1989, Wu a kol. 1992). Identifikovat a „opravit“ všechny mutace, aby se získala maximální katalytická aktivita a stabilita proteinu by však bylo velmi obtížné.
Původci zjistili, že existuje vysoká míra homologie (podobnosti) mezi dedukovanou aminokyselinovou sekvencí lidské urikázy a prasečí urikázy (přibližně 86 %) a urikázy paviána (přibližně 92 %) (viz obr. 6 až 14, pro příklady srovnání podobnosti), zatímco lidská urikáza a urikáza zA.flavus sdílejí homologii (podobnost) menší než 40 % (Lee a kol. 1988, Reddy a kol. 1988, Wu a kol. 1989, Legoux a kol. 1992, Wu a kol. 1992). Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní urikázový protein ze dvou různých savců, který byl navržen tak, že je méně imunoreaktivní pro člověka než podstatně vzdálenější enzymy z baktérií nebo hub. Lze očekávat, že použití derivátů savčí urikázy bude podstatně přijatelnější pro pacienty i pro lékaře.
Zkušenosti ukazují, že aktivovaný PEG, jaký byl použit pro přípravu PEG-ADA a modifikaci jiných proteinů, se váže prostřednictvím primárních aminoskupin aminokyselinových zbytků amino-konce (pokud jsou přítomny a nejsou blokovány) a epsilon-aminoskupin lysino vých zbytků. Tato strategie je užitečná jednak proto, že mohou být užity mírné reakční podmínky, a také proto, že pozitivně nabité lysino vé zbytky mají tendenci být lokalizovány na povrchu proteinu. Tento druhý rys je důležitý, neboť pro jakýkoliv terapeutický protein bude požadovaný účinek modifikace pomocí PEG záviset zčásti na charakteristice PEG polymeru (např. hmotnosti, rozvětvené nebo nerozvětvené struktuře a pod.), ale také na počtu a distribuci vazebných míst proteinu pro PEG vzhledem k epitopům a strukturním elementům, které určují funkci a clearance proteinu. Byla navržena strategie zvýšení schopnosti PEG modifikace „maskovat“ epitopy a snížení imunogenicity semi-selektivním vnesením nových lysinových zbytků pro potenciální adici PEG (Hershfield a kol. 1991). Toto strategie využívá mutagenezi k nahrazení vybraných kodonů pro arginin kodony pro lysin, což je substituce, která zachovává pozitivní náboj a má
-6CZ 304223 B6 minimální efekt na počítačově modelované ukazatele povrchové pravděpodobnosti a antigenicity (užitečné, když je známa pouze aminokyselinová sekvence).
Jako experimentální ověření této strategie byla užita rekombinantní purinnukleosidfosforyláza EPNP zE. coli (Hershfield a kol. 1991). Substituce Lys za Arg byly vneseny ve třech místech, což zvýšilo počet lysino vých zbytků v podjednotce ze 14 na 17, aniž by se změnila katalytická aktivita. Purifikovaná trojitá mutanta si zachovala plnou aktivitu po modifikaci přibližně 70 % dostupných NH2 skupin nadbytkem disukcinyl-PEG5000.
Titrace reaktivních skupin po PEGylaci předpokládá, že trojitá mutanta by mohla ve srovnání s enzymem divokého typu přijmout navíc jeden PEG řetězec na každou podjednotku. PEGylace zvyšuje poločas v oběhu (biologický poločas) jak u enzymu divokého typu tak i mutanty EPNP u myší z asi 4 hodin na více než 6 dnů. Po sérii intraperitoneálních injekcí v týdenní ch/dvoutýdenních intervalech všechny myši léčené oběma nemodifikovanými EPNP, a 10 ze 16 myší (60 %) myší po injekci PEGylovaného EPNP divokého typu vytvořily vysoké hladiny protilátek antiEPNP a výrazně se u nich snížil biologický poločas enzymu. Naproti tomu pouze 2 z 12 myší (17%) léčených PEG-EPNP mutantou projevily rychlou clearance (vymizení), nízká hladina protilátek u těchto myší nekorelovala s biologickým poločasem. Tato strategie byla tedy úspěšná v podstatném snížení imunogenicity, i když pouze jeden ze tří nových lysinů byl modifikován po působení aktivovaného PEG.
Každá z podjednotek urikázy paviána a prasete se skládá z 304 aminokyselinových zbytků, z nichž je 29 lysinových zbytků (tj. přibližně vždy jeden z deseti zbytků). Počáteční pokusy vnést 2 substituce Lys za Arg do klonované cDNA pro urikázu paviána, a také substituce v kodonu pro glycin v poloze 208, kde je v lidské sekvenci urikázy lysin, za lysin, vedly k expresi mutovaného enzymu paviána, který měl výrazně sníženou urikázovou katalytickou aktivitu. Z těchto experimentů bylo zřejmé, že schopnost enzymu zachovat urikázovou aktivitu po záměně argininu lysinem v sekvenci savčí DNA byla nepredikovatelná.
Tudíž bylo oceněno jako výhoda, že aminokyselinový zbytek 291 v sekvenci urikázy paviána je lysin, ale odpovídající zbytek v sekvenci prasete je arginin. Restrikční místo Apal přítomné v obou cDNA bylo využito pro konstrukci chimérické urikázy, kde prvních 225 aminokyselin pochází z prasečí cDNA a 79 aminokyselin karboxylového konce pochází z cDNA paviána. Výsledná chimérická urikáza prase-pavián (PBC urikáza) (viz sekvence id. č. 3) obsahuje 30 lysinových zbytků, tedy o jeden více než každý z parenterálních enzymů. Dalším rysem PBC urikázy je to, že v části pocházející z paviána se liší 4 ze 79 aminokyselinových zbytků od lidské sekvence, zatímco prasečí a lidská sekvence se liší v 10 aminokyselinách ve stejném úseku. Následně byla zkonstruována modifikovaná verze PBC, která má mimořádně lysin v poloze 291 a jinak se liší od prasečí urikázy pouze nahrazením threoninu v poloze 301 serinem („praseKS“ urikáza, sekvence id. č. 4). Vzhledem k výsledkům popsaným v předchozím odstavci, kde se několik dalších inzercí lysinu projevilo škodlivě na aktivitě, nedalo se očekávat, že PBC a PKS chimérické urikázy budou plně aktivní jako nemutovaná nativní prasečí urikáza a přibližně čtyřikrát více aktivnější než nemutovaná urikáza paviána.
Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní chimérickou urikázu prase-pavián, složenou z částí sekvence urikázy z jater prasete a paviána. Jeden příklad takové chimérické urikázy obsahuje prvních 225 aminokyselin ze sekvence prasečí urikázy (sekvence id. č. 7) a posledních 79 aminokyselin ze sekvence urikázy paviána (sekvence id. č. 6), je to urikáza prase-pavián, zkráceně PBC, znázorněná na obr. 6 a sekvenci id. č. 2). Další příklad takové chimérické urikázy obsahuje prvních 288 aminokyselin ze sekvence prasečí urikázy (sekvence id. č. 7) a posledních 16 aminokyselin ze sekvence urikázy paviána (sekvence id. č. 6). Jelikož se tato druhá sekvence liší od prasečí sekvence pouze ve dvou pozicích, má lysin (K) místo argininu v poloze 291 a serin (S) místo threoninu v poloze 301, tato mutanta se označuje jako prase-K-S, zkráceně PKS urikáza.
-7CZ 304223 B6
Předkládaný vynález také poskytuje vektory (expresní a klonovací) obsahující molekuly nukleové kyseliny kódující proteiny podle vynálezu. Výhodné vektory jsou ty, které jsou zde uvedeny v příkladech. Odborníkovi je jasné, že nukleové kyseliny mohou být vloženy do expresního vektoru, např. plazmidu, ve správné orientaci a čtecím rámci vhodném pro expresi. Pokud je to třeba, nukleová kyselina (DNA) se spojí s vhodnými sekvencemi DNA pro regulaci transkripce a translace, které jsou rozpoznávány vdaném hostiteli, ačkoliv takové sekvence jsou obecně dostupné v expresních vektorech, které se v oboru užívají a odborníkovi jsou známy. Vektor je pak standardními metodami vnesen do hostitelské buňky. Obecně platí, že ne všechny hostitelské buňky jsou transformovány vektorem. Je proto potřeba selektovat transformované buňky. Jedna ze známých metod selekce spočívá v tom, že se do sekvence expresního vektoru vloží sekvence DNA, včetně vhodných regulačních prvků, která kóduje selekční markér, tj. znak exprimovaný v transformovaných buňkách, např. rezistenci k antibiotikům. Alternativně gen pro selekční znak může být v jiném vektoru, který je užit pro společnou transformaci (kotransformaci) hostitelské buňky. Vektory obsahují také vhodné promotory, jako je např. prokaryotický promotor schopný řídit expresi (transkripci a translaci) DNA v bakteriální hostitelské buňce, např. E. coli, kteráje vektorem transformovaná.
Odborníkovi je známo, že jsou dostupné mnohé expresní systémy, včetně bakteriálních (např. E. coli a Bacillus subtilis), kvasinkových (např. Saccharomyces cerevisiae), vláknitých hub (např. Aspergillus) a také rostlinných, zvířecích nebo hmyzích buněk.
Vhodné vektory obsahují prokaryotický replikon, jako např. ColEl ori, pro množení v prokaryotických buňkách. Typické prokaryotické plazmidové vektory jsou např. pUC18, pUC19, pUC322 a pBR329 komerčně dostupné od firmy BIORAD Laboratories (Piscataway, NJ). Typickým plazmidovým vektorem pro savčí buňky je pSVL dostupný od firmy Pharmacia (Piscataway, NJ). Tento vektor užívá pozdní promotor SV40 k řízení exprese klonovaného genu a nejvyšší hladina exprese byla zjištěna u buněk tvořících T antigen, jako jsou např. buňky COS-1. Příklad indukovatelného savčího expresního vektoru je pMSG, který je dostupný také od Pharmacia. Tento vektor užívá pro řízení exprese klonovaného genu glukokortikoidem indukovatelný promotor z dlouhé terminální repetice myšího viru rakoviny prsu. Vhodné plazmidové vektory pro expresi v kvasinkách jsou např. pRS403+106 a pRS413 416, které jsou dostupné od firmy Stratagene Cloning Systems (LaJolla, CA). Plazmidy pRS403, pRS404, pRS405 a pRS406 jsou kvasinkové integrující plazmidy (Yip) a obsahují kvasinkové selekční markéry HIS3, TRPÍ, LEU2 a URA3. Plazmidy pRS413-416 jsou kvasinkové centromerové plazmidy (Ycp).
Kromě toho, předkládaný vynález poskytuje hostitelské buňky obsahující takové vektory. K výhodným hostitelským buňkám podle vynálezu patří buňky popsané v příkladech.
Urikázový protein podle předkládaného vynálezu může být konjugován prostřednictvím biologicky stálé, netoxické kovalentní vazby s relativně malým počtem řetězců PEG, aby se zlepšil jeho biologický poločas, zvýšila rozpustnost a snížila imunoreaktivita. K takovým vazbám patří např. uretanové (karbamátové) vazby, vazby sekundární aminové skupiny a amidové vazby. Různé aktivované PEG vhodné pro takovou konjugaci jsou komerčně dostupné např. od Sheawater Polymers, Huntswille, AL.
Předkládaný vynález se také může užít pro výrobu farmaceutického přípravku obsahujícího urikázový protein jako konjugát. Takové konjugáty jsou v podstatě neimunogenní a přitom si uchovávají alespoň 70 %, výhodně alespoň 80 %, a ještě výhodněji alespoň 90 % nebo více urikolytické aktivity původního nemodifikovaného enzymu. Ve vodě rozpustné polymery vhodné pro použití v předkládaném vynálezu obsahují lineární i rozvětvené polyethylenglykoly nebo polyethylenoxidy, obecně známé jako PEG. Jeden příklad rozvětveného PEG je předmětem patentu USA 5 643 575.
V jednom provedení vynálezu je průměrný počet lysinových zbytků vložených v jedné urikázové jednotce mezi 1 a 10. Ve výhodném provedení vynálezuje počet dodatečných lysinů 2 až 8. Je
-8CZ 304223 B6 třeba mít na paměti, že počet lysinů nemůže být příliš velký, aby neměl škodlivý účinek na katalytickou aktivitu urikázového proteinu. Molekuly PEG vkonjugátu jsou výhodně konjugované prostřednictvím lysinových zbytků vurikázovém proteinu, výhodně prostřednictvím lysinového zbytku nebo lysinových zbytků, které se v molekule přirozeně nevyskytují, a které byly vneseny do úseku molekuly zkonstruovaného proteinu, která v přírodním stavu v této poloze lysin neobsahuje.
Předkládaný vynález poskytuje způsob, jak zvýšit dostupná místa vurikázovém proteinu pro připojení PEG, která nejsou škodlivá, kdy se nativní urikázový protein modifikuje takovým způsobem, že se do něho vnese alespoň jeden lysinový zbytek. Výhodně tento způsob obsahuje nahrazení argininových zbytků lysinovými zbytky.
Konjugáty urikáza-PEG podle vynálezu jsou užitečné pro snížení hladin (tj. redukci množství) kyseliny močové v krvi a/nebo moči savců, výhodně člověka, a lze je užít pro léčení zvýšené hladiny kyseliny močové spojené s dnou, dnavými tofy, nedostatečnosti ledvin, orgánovými transplantacemi a maligními onemocněními.
Konjugáty PEG-urikáza se savci, který má příliš vysokou hladinu kyseliny močové, podávají jakýmkoliv známým způsobem, např. perorálně, klystýrem nebo čípkem, intravenózně, subkutánně, intradermálně, intramuskulámě a intraperitoneálně (Patton, J. S. a kol. (1992) Adv. Drug Delivery Rev 8: 179-228.
Účinná dávka PEG-urikázy je závislá na hladině kyseliny močové a velikosti pacienta. V jednom provedení vynálezu je PEG-urikáza podávána ve farmaceuticky přijatelném excipientu nebo ředidle v množství 10 pg až 1 g. Ve výhodném provedení je podávané množství 100 pg až 500 mg. Nejvýhodněji je konjugát PEG-urikáza podáván v množství 1 mg až 100 mg, jako např. 5 mg, 20 mg nebo 50 mg. Tyto uvedené hmotnosti se týkají množství proteinu v konjugátu.
Farmaceutické přípravky obsahující PEG-urikázu se připraví konvenčními technikami, např. jak je popsáno v příručce Remingtoďs Pharmaceutical Sciences, 1985, Easton, P.A., Mack Publishing Co.. K vhodným excipientům pro injikovatelný přípravek patří např. fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, Ringerův roztok s laktátem, voda, polyoly a glycerol. Farmaceutické přípravky pro parenterální injekce obsahují farmaceuticky přijatelné sterilní vodné nebo jiné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze, a také sterilní prášky pro rekonstituci před použitím na sterilní injikovatelný roztok nebo suspenzi. Tyto přípravky mohou obsahovat další složky, jako např. konzervační látky, solubilizační činidla, stabilizační činidla, zvlhčovači činidla, emulgátory, pufry, antioxidanty a ředidla.
PEG-urikáza může být také ve formě přípravku s řízeným uvolňováním (terapeutického systému) pro implantaci pacientovi, který kontinuálně reguluje hladinu kyseliny močové v krvi a moči. Tak např. polymléčná kyselina, polyglykolová kyselina, regenerovaný kolagen, poly-Llysin, alginát sodný, gellanová klovatina, chitosan, agaróza, multilamelámí liposomy a mnohé další konvenční depotní přípravky obsahující bioerodovatelné nebo biodegradovatelné materiály mohou být formulovány s biologicky účinnými látkami. Tyto materiály, když jsou implantovány nebo injikovány, se postupně rozpadají a uvolňují účinnou látku do okolní tkáně. Tak např. jedna metoda enkapsulace PEG-urikázy obsahuje způsob popsaný v patentu USA 5653 974, kterýje zahrnut formou odkazu. Použití biologicky erodovatelných nebo biologicky degradovatelných nebo i jiných depotních přípravků výslovně spadá do rozsahu předkládaného vynálezu. Použití infuzní pumpy a matricového zásobníkového systému pro podávání PEG-urikázy spadá také do rozsahu vynálezu. PEG-urikáza může být také výhodně uzavřena v micelách nebo liposomech. Technologie enkapsulace do lipozomů je odborníkům dostatečně známa, viz např. Lasic, D. a kol. (ed.), Stealth Liposomes, Boča Raton, FL, CRC Press.
Farmaceutické přípravky obsahující PEG-urikázu podle předkládaného vynálezu sníží potřebu hemodialýzy u pacientů s vysokým rizikem urátem indukovaného renálního selhání, např.
-9CZ 304223 B6 u příjemců orgánového transplantátu (viz Venkataseshan, V.S. a kol., 1990, Nephron 56: 317— 321) a pacientů s některými maligními chorobami. U pacientů s velkou akumulací krystalického urátu (toťy) takové farmaceutické přípravky zlepší kvalitu života rychleji než v současnosti dostupné přípravky.
Následující příklady, které vynález nijak neomezují, ilustrují různé aspekty předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
A. Konstrukce cDNA pro PBC, PKS a příbuzné urikázy
Standardní metody, a kde to bylo přiměřené, také instrukce výrobce, byly užity pro přípravu celkové buněčné RNA a PCR amplifikaci (patenty USA 4 683195, 4 683 202, 4 965 188 a 5 075 216) různých cDNA urátoxidázy, také pro klonování a sekvencování těchto cDNA (Erlich 1989, Sambrook a kol., 1989, Ausubel 1998). Oligonukleotidové primery pro PCR (polymerázovou řetězovou reakci) urátoxidázy prasete a paviána (tabulka 1) byly navrženy na základě publikovaných kódujících sekvencí (Wu a kol., 1989) pomocí programového vybavení PRIME (Genetics Computer Group, lne.).
Tabulka 1
Primery pro PCR amplifikaci cDNA pro urátoxidázu
cDNA urikázy z jater prasete
„sense 5' gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA 3'
„antisense 5'gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC 3'
cDNA urikázy z jater paviána D3H
„sense 5'gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3'
„antisense 5'gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT 3'
Sekvence pro restrikění enzymy (uvedené malými písmeny) vnesené na konce primerů jsou „sense“ EcoRI a Ncol sekvence a „antisense“ Ncol, Hindlll a Xbal (pro prase) a Ncol (pro paviána). V případě „sense“ primeru pro paviána, třetí kodon GAC (aspartát) přítomný v urátoxidáze paviána (Wu a kol., 1992) byl nahrazen CAC (histidin), tj. kodonem, kterýje v této pozici přítomen v lidském pseudogenu urátoxidázy (Wu a kol. 1992). Z tohoto důvodu rekombinantní urátoxidáza paviána vytvořená užitím těchto primerů byla nazvána D3H urátoxidáza paviána.
Celková buněčná RNA zjater prasete a paviána byla reverzně transkribována pomocí soupravy pro syntézu prvního řetězce cDNA (Pharmacia Biotech lne., Piscatawy, NJ). PCR amplifikace užitím Taq DNA polymerázy (GIBCO BRL, Lige Technologies, Gaithersburg, MD) byla provedena v teplotním cyklovacím termostatu (Ericomp, San Diego, CA) s programem (30 s-95 °C, 30 s-55 °C, 60 s - 72 °C, po 20 cyklů, pak následovalo 10 cyklů 30 s -95 °C, 60 s, 70 °C). PCR produkty urátoxidázy byly naštěpeny EcoRI a Hindlll a klonovány do vektoru pUC18 (v případě prasete) nebo byly klonovány přímo (v případě paviána i prasete) pomocí TA klonovacího systému (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA klony byly transformovány do kmenu
-10CZ 304223 B6
XLl-Blue E. coli (Stratagene, La Jolla, CA). Plazmidová DNA obsahující klonovanou cDNA pro urátoxidázu byla připravena a vložená cDNA sekvence byla sekvencována standardním terminačním postupem s dideoxynukleotidy. Klony, které obsahovaly publikovanou kódující sekvenci DNA urátoxidázy (s výjimkou substituentu D3H vurátoxidáze paviána v tabulce 1), byly zkonstruovány a ověřeny v sérii dalších kroků s využitím standardních metod rekombinantní DNA (genového inženýrství).
cDNA prasete a D3H cDNA paviána obsahující kódující sekvence plné délky byly vloženy do expresního vektoru pET (Novagen, Madison, WI) následujícím postupem: D3H urikáza paviána byla vystřižena z TA plazmidů pomocí restrikčních enzymů Ncol a BamHI a pak byla subklonována do klonovacích míst Ncol a BamHI expresních plazmidů pET3d a pET9d. cDNA urikázy prasete v plné délce byla vystřižena z klonu v plazmidů pUC restrikčními enzymy EcoRi a HindlII a subklonována do klonovacích míst EcoRi a HindlII v pET28b. Kódující úsek cDNA prasete byl také vložen do míst Ncol a BlpI expresního plazmidů pET9d po vystřižení míst Ncol a BlpI pET28b.
Chimérická cDNA prase-pavián (PBC) byla zkonstruována vystřižením restrikčního fragmentu Ncol-Apal velikosti 624 bp z cDNA D3H urikázy paviána zpET3d-D3H klonu paviána a nahrazením segmentu D3H paviána odpovídajícím fragmentem Ncol-Apal velikosti 624 bp z prasečí cDNA. Výsledná cDNA PBC urátoxidázy obsahovala kodony 1 až 225 prasečí urotoxidázy spojené ve čtecím rámci s kodony 226 až 304 urátoxidázy paviána.
cDNA urátoxidázy prase-KS byla zkonstruována vystřižením restrikčního fragmentu Ncol-Ndel velikosti 864 bp z cDNA urátoxidázy D3H paviána zpET3d-D3H klonu, a pak nahrazením úseku D3H segmentu paviána odpovídajícím fragmentem Ncol-Ndel z prasečí cDNA velikosti 864 bp. Výsledná cDNA pro PKS urátoxidázu obsahuje kodony 1 až 228 prasečí urátoxidázy spojené ve čtecím rámci s kodony 289 až 304 urátoxidázy paviána.
Aminokyselinové sekvence urátoxidázy D3H paviána, prasete, PBC a PKS jsou ukázány na obr. 5 ajsou také uvedeny v seznamu sekvencí. Standardní metody byly použity k přípravě 15% glycerolových zásobních roztoků všech těchto transformovaných baktérií a byly uloženy do -70 °C. Když byly tyto buňky rozmraženy a byl izolován rekombinantní enzym (tab. 2), ukázalo se, že prasečí urikáza, PBC chiméra a prase-KS urikáza měly velmi podobnou specifickou aktivitu, která byla přibližně 4 až 5 x vyšší než specifická aktivita rekombinantní urátoxidázy paviána. Zvýšení tohoto řádu bylo potvrzeno i v několika dalších experimentech. Specifická aktivita PBC urikázy připravené několika odlišnými postupy se lišila řádově 2 až 2,5x.
Tabulka 2
Srovnání exprimovaných savčích urikáz
Konstrukt Specifická aktivita* (U/mg) Relativní aktivita
PBC 7,02 1,00
Prase-KS 7,17 1,02
Prase 5,57 0,79
Pavián 1,36 0,19
* Protein byl stanoven metodou podle Lowryho. Aktivita urikázy byla stanovena spektrofotometricky (Priest a Pitts 1972). Test byl proveden při 23 až 25 °C v lem křemenné kývete
-11 CZ 304223 B6 obsahující 1 ml reakční směsi (O,1M borát sodný, pH 8,6, O,1M kyselina močová). Vymizení kyseliny močové bylo monitorováno sledováním snižování absorbance při 292 nm. Jedna mezinárodní jednotka (IU) urikázy katalyzuje vymizení 1 pmol kyseliny močové za 1 minutu.
E. coli BL21 (DE3)pLysS transformanty surikázovými cDNA-pET konstrukty uvedenými v tabulce 2 byly vysety na LB agar obsahující antibiotika pro selekci (karbenilicin a chloramfenikol pro pET3d (praseKS), kanamycin a chloramfenikol pro pET9d (PBC, prase, pavián) podle instrukcí v příručce pro pET systém, (Novagen, madison, WI). 5ml kultury (LB plus antibiotika) byly inokulovány jedinou transformovanou kolonií a kultivováno 3 hodiny při 37 °C. Pak byly přeneseny alikvóty po 0,1 ml do 100 ml LB média obsahujícího selektivní antibiotika a ,1% laktózu (pro indukci exprese urikázy). Po kultivaci ve 37 °C přes noc byly bakteriální buňky z 0,5ml alikvotu z kultury extrahovány do nanášecího pufru SDS-PAGE a pak byly analyzovány na SDS-merkaptoethanol-PAGE, to zajistilo, že bylo exprimováno srovnatelné množství urikázového proteinu v každé ze 4 kultur (výsledky nejsou ukázány). Zbývající buňky z každé 100 ml kultury byly sklizeny centrifugací a promyty v PBS. Pak byly buňky resuspendovány ve 25 ml PBS, pH 7,4 (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) obsahujícím lmM AEBSF inhibitor proteáz (Calbiochem, San Diego, CA) a pak lyžovány na ledu v zařízení pro rozrušení bakteriálních buněk (Bacterial Cell Disruptor, Microfluidics, Boston, MA). Nerozpustný materiál (obsahující urikázu) byl peleto ván centrifugací (20 190 x g, 4 °C, 15 minut). Pelety byly opláchnuty dvakrát 10 ml PBS a pak byly extrahovány přes noc ve 4 °C ve 2 ml IM Na2CO3, pH 10,2. Extrakty byly naředěny na 10 ml vodou a pak centrifugovány (20 190 x g, 4 °C, 15 minut). Nakonec byly stanoveny koncentrace proteinu a aktivita urikázy.
Příklad 2
Exprese a izolace rekombinantní PBC urikázy (příprava ve 41 fermentoru)
Buňky transformované vektorem pET3d-PBC urikáza byly vysety z glycerolových zásobních roztoků na plotny s LB agarem obsahující karbenicilin a chloramfenikol podle instrukcí v příručce k systému pET. Z jediné počáteční kolonie bylo připraveno 200 ml inokula v kapalném LBmédiu s antibiotiky v rotační třepačce (250 rpm) při 37 °C, a sice postupem doporučeným v příručce k systému pET pro maximalizaci retence plazmidů. Při OD525 2,4 byly buňky z této 200 ml kultury sklizeny centrifugací a byly resuspendovány v 50 ml čerstvého média. Tato suspenze byla přenesena do fermentoru s vysokou hustotou obsahujícího 4 1 média SLBH s karbenicilinem a chloramfenikolem (složení média SLBH a funkce fermentoru jsou popsány v publikaci Sadlera a kol. 1974). Po 20 hodinách kultivace s O2 ve 3 °C (OD525 = 19) byl přidán isopropylthiogalaktosid (IPTG) v koncentraci 0,4mM, aby indukoval produkci urikázy. Po dalších šesti hodinách (OD525 = 37) byly bakteriální buňky sklizeny centrifugací (10 410 x g, 10 minut, 4 °C), jednou opláchnuty PBS a uloženy zamražené v -20 °C.
Bakteriální buňky (189 g) pak byly resuspendovány ve 200 ml PBS a lyžovány sonikací (sonikátor Heat System Sonicator XL, sonda model CL, Farmingdale, NY) čtyřikrát opakovaným 40vteřinovým pulzem se 100% intenzitou a s 1 minutovou přestávkou mezi pulzy, přičemž byly umístěny v lázni led/sůl. Materiál nerozpustný v PBS (který zahrnuje také urikázu) byl peletován centrifugací ((10410xg, 10 minut, 4 °C), pak pětkrát opláchnut 200 ml PBS. Urikáza z peletu nerozpustného v PBS byla extrahována do 80 ml IM Na2CO3, pH 10,2, obsahujícího lmM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) a 130 pg/ml aprotininu. Nerozpustné zbytky byly odstraněny centrifugací (20 190 x g, 2 hodiny, 4 °C). Všechny další kroky purifikace byly provedeny ve 4 °C (výsledky jsou shrnuty v tabulce 3).
Extrakt s pH 10,2 byl naředěn na 1800 ml lmM PMSF (Na2CO3 se snížil na 0,075M). Pak byl nanesen na kolonu (2,6 x 9 cm) naplněnou čerstvou Q-Sepharose (Pharmacia Biotech, lne., Piscataway, NJ), která byla ekvilibrovaná 0,075M Na2CO3, pH 10,2. Po nanesení byla kolona postupně promyta 1) 0,075M Na2CO3, pH 10,2, dokud absorbance na výtoku A280 nebyla
-12CZ 304223 B6 shodná z pozadím, 2) lOmM NaHCO3, pH 8,5, dokud hodnota pH neklesla na 8,5, 3) 50 ml ÍOmM NaHCO3, pH 8,5, 0,15M NaCl, 4) lOOml gradientu 0,15M až 1,5M NaCl v ÍOmM NaHCO3, pH 8,5, 5) 150 ml ÍOmM NaHCO3, pH 8,5, 1,5M NaCl, 6) ÍOmM NaHCO3, pH 8,5, 7) O,1M Na2CO3 pH 11, dokud na výtoku nebylo zvýšeno pH na 11. Nakonec byla urikáza eluovaná 500ml gradientu 0 až 0,6M NaCl v 0,lM Na2CO3 pH 11. Aktivity eluované ve dvou vrcholech absorbujících ve 280 nm byly odděleně sloučeny (frakce A a frakce B, viz tabulka 3). Urikáza z každého ze sloučených vzorků pak byla precipitována snížením pH na 7,1 pomalým přidáváním 1M kyseliny octové a následnou centrifugací (7000 x g, 10 minut). Výsledné pelety byly rozděleny v 50 ml 1M Na2CO3 pH 10,2 a uchovány při 4 °C.
Tabulka 3
Purifikace rekombinantní chimérické PBC (prase-pavián) urikázy. Výchozí hmotnost buněčné hmoty indukované IPTG = 189,6 g
Frakce Celkový protein (mg) Aktivita urikázy (O/ml) Celkem jednotek urikázy Specifická aktivita (U/mg)
pH 7 sonikace + pH 7 promytí 74,9
pH 10,2 extrakt 4712 82,7 11,170 2,4
Q-Sepharose
Frakce A 820 11,5 1,081* 1,9
Frakce B 1809 31,7 4,080 2,3
pH 7,1 precipitace + nové rozpuštění
Frakce A 598 35,0 1,7458 3,0
Frakce B 1586 75,5 3,773 2,4
Celkový výtěžek 2184 5,521
* Urikáza přítomná ve frakci A začala precipitovat spontánně po eluci z kolony. Tudíž aktivita měřená v této fázi purifikace byla podhodnocena.
Příklad 3
Preparace a PEGylace rekombinantní PBC urikázy v malém měřítku
Tento příklad ukazuje, že purifikovaná rekombinantní PBC urikáza může být využita pro přípravu PEGylované (modifikované PEG) urikázy. V této reakci byly všechny podjednotky urikázy modifikovány (viz obr. 1, dráha 7) s retencí přibližně 60 % katalytické aktivity (tab. 4).
A. Exprese a izolace PBC urikázy v malém měřítku (viz tab. 4 a obr. 1) kultura buněk E. coli BL21 (DE3)pLysS transformovaných pET3d-PBC cDNA byla inkubována na rotační třepačce (250 rpm) ve 37 °C. Při dosažené OD525 0,7 byla kultura indukována IPTG (0,4M, 6 hodin). Buňky byly sklizeny a zmrazený v -20 °C. Buňky (15,3 g) byly
-13 CZ 304223 B6 rozrušeny mražením a táním a pak extrahovány 1M Na2CO3, pH 10,2, lmM PMSF. Po centrifugaci (12000 x g, 10 minut, 4 °C) byl supernatant (85 ml) naředěn 1:10 vodou a pak chromatografován na koloně s QSepharose, jak bylo popsáno v příkladu 1. Sloučené frakce obsahující urikázovou aktivitu byly koncentrovány tlakovou ultrafiltrací užitím membrány PRM30 (Amicon, beverly, MA). Koncentrát byl chromatografován na koloně (2,5 x 100 cm) naplněné Sephacryl S-200 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), která byla ekvilibrována a pak použita s 0,lM Na2CO3 pH 10,2. Frakce obsahující urikázovou aktivitou byly sloučeny a koncentrovány tlakovou ultrafiltrací, jak bylo popsáno výše.
B. PEGylace
100 mg koncentrované Sephacryl S-200 PBC urikázy (5 mg/ml, 2,9 pmol enzymu, 84,1 μηιοί lysinu) v 0,lM Na2CO3, pH 10,2, bylo ponecháno reagovat s dvojnásobným nadbytkem (mol PEG:mol lysiny urikázy) aktivované formy PEG 60 minut ve 4 °C. PEGylovaná urikáza byla oddělena od nezreagovaných nebo hydrolyzovaných PEG tangenciální průtokovou diafiltrací. V tomto kroku byla reakce naředěna 1:10 0,lM Na2CO3, pH 10,2 a diafiltrována proti 3,5 násobku objemu 0,lM Na2CO3, pH 10,2, pak proti 3,5 násobku objemu 0,05M NaH2PO4,0,15M NaCl, pH 7,2. Filtrací sterilizovaný enzym byl stabilní ve 4 °C nejméně 1 měsíc.
Tabulka 4
Souhrnné údaje o purifikaci a PEGylaci rekombinantní chimérické urikázy prase-pavián (PBC urikázy)
Frakce Celkový protein (mg) Celková urikázové aktivita (pmol/min) Specifická aktivita (gmol/min/mg) Výtěžek aktivity (%)
A. Purifíkace
Surový extrakt 1565 1010 0, 6 100
Q-Sepharose 355 1051 3,0 104
Sephacryl S-200 215 1170 5,5 116
B. PEGylace
S-200 urikáza 100 546 5,5 100
PEG-urikáza 97 336 3,5 62
Obr. 1 ukazuje analýzu frakcí získaných při purifikaci a PEGylaci rekombinantní chimérické urikázy prase-pavián (PBC urikázy) pomocí SDS-merkaptoethanol PAGE (12% gel). Jednotlivé dráhy znamenají: 1 = markéry (standardy) molekulové hmotnosti, 2 = SDS extrakt z neindukovaných buněk transformovaných pET3d-PBC cDNA (E. coli BL21 (DE3)pLysS), 3 = SDS extrakt z buněk transformovaných pET3d-PBC cDNA indukovaných IPTG, 4 = surový extrakt (viz tab. 5), 5 = sloučené koncentrované frakce urikázy z Q-Sepharose, 6 = sloučené koncentrované frakce urikázy ze Sephacryl S-200, 7 = PEGylovaná rekombinantní PBC urikáza ze Sephacryl S-200.
Výsledky uvedené v tab. 4 ukazují, že purifikovaná PBC urikáza může být modifikována se zachováním přibližně 60 % katalytické aktivity. V této PEGylační reakci byly všechny urikázové podjednotky modifikovány (obr. 1, dráha 7). Ve studiích, které zde nejsou ukázány, měl PEGylo- 14CZ 304223 B6 váný enzym podobné kinetické vlastnosti jako nemodifikovaná PBC urikáza (KM 10 až 20 μΜ). Důležité je, že modifikovaný enzym měl vyšší rozpustnost než nemodifikovaný enzym při fyziologickém pH (> 5 mg/ml v PBS ve srovnání s < 1 mg/ml). PEGylovaný enzym může být lyofilizován a pak rekonstituován v PBS, pH 7,2 s minimální ztrátou aktivity. V jiném experimentu původci srovnali aktivity PEG-PBC urikázy z klinickým přípravkem urikázy z A. flavus. Při pH 8,6 v borátovém pufru enzym z A. flavus měl 10 až 14 x vyšší Vmax a 2 x vyšší hodnotu KM. Avšak v PBS, pH 7,2 PEG-PBC urikáza a nemodifikovaný enzym z houby se lišily v urikázové aktivitě méně než dvakrát.
Příklad 4
Doba oběhu (biologický poločas) nemodifikovaná a PEGylované urikázy
Obr. 2 ukazuje dobu oběhu (tj. dobu, po kterou zůstává účinná látka v oběhu) nativní a PEGylované PBC urikázy. Skupiny myší (Tři pro každý časový bod) byly i.p. injikovány 1 jednotkou nativní (kroužky) nebo PEG-modifikované (čtverečky) rekombinantní PBC urikázy (vlastní přípravek popsán v příkladu 3). V uvedených časových bodech byla odebrána krev skupině 3 myší a byla určena aktivita urikázy v séru. PEGylovaná urikáza (popsaná v příkladu 3) měla biologický poločas přibližně 48 hodin, zatímco nemodifikovaný enzym méně než 2 hodiny (viz obr. 2).
Příklad 5
Účinnost PEGylované urikázy podle vynálezu
Obr. 3 ukazuje vztah mezi aktivitou urikázy v séru a koncentrací kyseliny močové v moči. V tomto experimentu homozygotní myši, Wu a kol. 1994) dostaly dvě injekce, v 0. a 72. hodině, 0,4 IU rekombinantní PBC urikázy, která byla modifikována PEG. „Knock-out“ myši deficientní na urikázu byly v tomto pokusu použity proto, že na rozdíl od normálních myší, které mají urikázu, tyto myši, podobně jako lidé, mají vysokou hladinu kyseliny močové v krvi a tělních tekutinách a vylučují vysoké hladiny kyseliny močové v moči. Tato vysoká hladina kyseliny močové způsobuje u myší vážná poškození ledvin, která jsou často fatální (Wu a kol. 1994).
Experimenty uvedené na obr. 3 demonstrují, že intraperitoneální injekce PEGylovaného přípravku rekombinantní PBC urikázy vedly u myší deficientních na urikázu ke zvýšení urikázové aktivity v séru, která byla doprovázena výrazným poklesem koncentrace kyseliny močové v séru a moči.
Příklad 6
Komplex konstrukt-nosič je neimunogenní
PEGylovaná rekombinantní PBC urikáza byla injikována opakovaně homozygotním myším deficientním na urikázu, aniž by došlo k urychlení clearance, což jev souladu s tím, že není přítomna výrazná imunogenicita. To bylo také potvrzeno ELISA testem. Obr. 4 ukazuje udržování stálé hladiny urikázy v oběhu (měřené v séru) po opakovaných injekcích. PEGylovaná PBC urikáza byla podávána intraperitoneální injekcí v 6 až 10 denních intervalech. Aktivita urikázy v séru byla měřena 24 hodin po injekci.
- 15CZ 304223 B6
Příklad 7
Kovalentní vazba na lysin vnesený mutací
PEGylace purifikované rekombinantní PBC urikázy by měla vést k navázání PEG na nový lysinový zbytek (zbytek 291). V tomto experimentu preparát PBC urikázy byl modifikován PEGylací. Může být stanoveno metodami odborníkovi známými, zda peptid obsahující nově vnesený lysin (zbytek 291) byl modifikován PEGylací.
Seznam citované literatury
Abuchowski A, Kazo GM, Verhoest CR, Jr., van Es T, Kafkewitz D, Nucci ML, Viau AT et al (1984) Cancer therapy with modified enzymes. I. Antitumor properties of polyethylene glycol asparaginase conjugates. Cancer Biochem Biophys 7:175-186
Abuchowski A, McCoy JR, Palczuk NC, van Es T, Davis FF (1977a) Effect of attrachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase. J Biol. Chem. 252:3582-3586
Abuchowski A, van Es T, Palczuk NC, Davis FF (1977b) Alteration of immunological properties of bovine sérum albumin by covalent attrachment of polyethylene glycol. J Biol Chem 252:35783581
Ausubel FM (1998) Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons
Ahn KJ, Kim YS, Lee HC, Park K, Huh KB (1992) Cyclosporine-induced hyperuricemia after renal transplant: Clinical characteristics and mechanisms. Transplantation Proceedings 24:13911392
Arellano F, Sacristan JA (1993) Allopurinol hypersensitivity syndrome: A review. Ann Pharmacother 27:337-343
Becker MA (1988) Clinical aspects of monosodium uráte monohydrate crystal deposition disease (gout). Rheumatic Disease Clinics of North America 14:377-394
Becker MA, Roessler BJ (1995) Hyperuricemia and gout. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7 th ed. McGraw-Hill, New York, pp 1655-1677
Brogard JM, Coumaros, D, Frankhauser J, Stáhl A, Stáhl J (1972) Enzymatic uricolysis: A study of the effect of a fůngal urate-oxydase. Eur J Clin Biol Res 17:890-895
Brogard JM, Stáhl A, Stáhl J (1978) Enzymatic uricolysis and its use in therapy. In: Kelley WN, Arnold WJ, Weiner IM (eds) Uric Acid, Springer-Verlag, New York, pp515-524
Chaffee S, Mary A, Stiehm ER, Girault D, Fischer A, Hershfield MS (1992) IgG antibody response to polyethylene glycol-modified adenosine deaminase (PEG-ADA) in patients with adenosine deaminase deficiency. J Clin Invest 89: 1643-1651
Chen RHL, Abuchowski A, van Es T, Palczuk NC, Davis FF (1981) Properties of two uráte oxidases modified by the covalent attachment of poly(ethylene glycol). Biochim Biophys Acta 660:293-298
-16CZ 304223 B6
Chua CC, Greenberg ML, Viau AT, Nucci M, Brenckman WD, Jr., Hershfield MS (1988) Use of polyethylene glycol-modified uricase (PEG-uricase) to treat hyperuricemia in a patient with non-Hodgkin lymphoma. Ann Int Med 109:114-117
Cohen LF, Balow JE, Magrath IT, Poplack DG, Ziegler JL (1980) Acute tumor lysis syndrome: A review of 37 patients with Burkitťs lymphoma. Am J Med 64:468^191
Conley TG, Priest DG (1979) Purification of uricase from mammalian tissue. Preparative Biochemistry 9:197-203
Davis FF, Kazo GN, Nucci ML, Abuchowski A (1991) Reduction of immunogenicity and extension of circulating life of peptides and proteins. In: Lee VHL (eds) Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York, pp831-864
Davis S, Abuchowski A, Park YK, Davis FF (1981a) Alteration of the circulating life and antigenic properties of bovine adenosine deaminase in mice by attrachment of polyethylene glycol. Clin Exp Immunol 46:649-652
Davis S, Park YK, Abuchowski A, Davis FF (1981b) Hypouricaemic effect of polyethylene glycol modified uráte oxidase. Lancet 1:281-283
Delaney V, Sumrani N, Daskalakis P, Hong JH, Sommer BG (1992) Hyperuricemia and gout in renal allograft recipients. Transplantation Proceedings 24:1773-1774
Donadio D, Errera J, Navarro M, Izam P (1981) Anaphylaxis-like manifestations after intravenous injection of uráte oxidase in an asthmatic child with aceute leukemia (letter). Noův Presse Med 10:711-712
Erlich HA (1989) PCR Technology. Principles and applications for DNA amplification Stockton Press, New York
Escudier B, Leclercq B, Tandonnet F, Nitenberg G (1984) Hyperuricemia resistant to uráte oxidase. Efficacy of high doses (letter). Presse Med 13:1340
Fam AG (1990) Strategies and controversies in the treatment of gout and hyperuricaemia. Balliere's Clinical Rheumatology 4:177-192
George T, Mandeli BF (1995) Gout in the transplant patient. J Clin Rheumatol 1:328-334
Gold GL, Fritz BD (1957) Hyperuricemia associated with the treatment of leukemia. Ann Int Med 47:428^434
Greenberg ML, Hershfield MS (1989) A radiochemical-high-performance liquid chromatographic assay for uráte oxidase in human plasma. Anal Biochem 176:290-293
Harris JM, Zalipsky S (Ed.) (1997) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, DC
Hershfield M, S. (1997) Biochemistry and immunology of polyethylene glycol)modified adenosine deaminase (PEG-ADA). In: Harris JM, Zalipsky S (eds) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, DC, ppl45-154
Hershfield MS (1995) PEG-ADA replacement therapy for adenosine deaminase deficiency: An update after 8.5 years. Clin Immunol Immunophatol 76:S228-S232
-17CZ 304223 B6
Hershfield MS (1996) Gout and uric acid metabolism. In: Bennet JC, Plum F (eds) Cecil Textbook of Medicine, XX ed. WB Saunders, New York, pp.1508-1515
Hershfield MS, Buckley RH, Greenberg ML, Melton AL, Schiff R, Hatem C, Kurtzberg J et al (1987) Treatment of adenosine deaminase deficiency with polyethylene glycolmodified adenosine deaminase. N. Engl J Med 316:589-596
Hershfield MS, Chaffee S, Koro-Johnson L. Mary A, Smith AA, Short SA (1991) Use of sitedirected mutagenesis to enhance the epitope shielding effect of covalent modification of proteins with polyethylene glycol. Proč. Nati. Acad Sci. USA 88:7185-7189
Hershfield MS, Mitchell BS (1995) Immunodeficiency diseases caused by adenosine deaminase deficiency and purine nucleoside phosphorylase deficienty. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7 th ed. McGraw-Hill, New York, ppi725-1768
Hershfield MS, Seegmiller JE (1976) Gout and the regulation of purine biosynthesis. In: Quagliariello E (eds) Horizons in Biochemistry and Biophysics, Addison-Wesley, Reading, MA, ppi34-162
Jones DP, Stapleton FB, Kalwinsky D, McKay CP, Kellie SJ, Pui CH (1990) Renal dysfunction and hyperuricemia at presentation and relapse of acute lymphoblastic leukemia. Med Pediatr Oncol 18:283-286
Kelley WN, Fox IH, Pallela TD (1989) Gout and related disorders of purine metabolism. In: Kelley WN, Harris ED, Ruddy S, Sledge CG (eds) Textbook of Rheumatology, 3rd ed. WB Saunders, Philadelphia, ppi395-1448
Kissel P, Lamarche M, Royer R (1968) Modification of uricaemia and the excretion of uric acid nitrogen by an enzyme of íungal origin. Nátuře 217:72-74
Kissel P, Schmitt J, Streiff F, Makuary G, Schmidt C, Toussain P (1972) L'urate oxydase: son intérét dans la prévention des hyperuricemies therapeutiques en hematologie. Ann Med Nancy 11:519-535
Lee CC, Wu X, Gibbs RA, Cook RG, Muzny DM, Caskey CT (1988) Generation of cDNA directed by amino acid sequence: Cloning of uráte oxidase. Science 239:1288-1291
Legoux R, Delpech B, Dumont X, Guillemot JC, Ramond P, Shire D, Caput D et al (1992) Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding Aspergillus flavus uráte oxidase. J Biol Chem 267:8565-8570
London M. Hudson PM (1957) Uricolytic activity of purified uricase in two human beings. Science 125:937-938
Maséra G, Jankovic M, Zurlo MG, Locasciulli A, Rossi MR, Uderzo C, Recchia M (1982) Urate-oxidase prophylaxis of uric acid-induced renal damage in childhood leukemia. J Pediatr 100:152-155
Montagnac R, Schillinger F (1990) Anaphylactic complication tied to intravenous injection of uráte oxidase. Nephrologie 11:259
Mourad G, Cristol JP, Chong G, Andary M, Mion C (1984) Role of precipitating antiurate oxidase antibodies in uráte oxidase-resistant hyperuricemia (letter). Presse Med 13:2585
-18CZ 304223 B6
Potaux L, Aparicio M, Maurel C, Ruedas ME, Martin-Dupont CL (1975) Uricolytic therapy. Value of uráte oxidase in the treatment of hyperuricemias. Noův Presse Med 4:1109-1112
Priest DG, Pitts OM (1972) Reaction intermediate effects on the spectrophotometric uricase assay. Analytical Biochemistry 50:195-205
Pui C-H. Relling MV, Lascombes F, Harrison PL, Struxiano A, Mondesir J-M, Riberio RC et al (1997) Uráte oxidase in prevention and treatment of hyperuricemia associated with lymphoid malignancies. Leukemia 11:1813-1816
Reddy PG, Nemalí MR, Reddy MK, Reddy MN, Yuan PM, Yuen S, Laffler TG et al (1988) Isolation and sequence determination of a cDNA cloně for rat peroxisoma uráte oxidase: Liverspecifíc expression in the rat. Proč. Nati. Acad Sci USA 85:9081-9085
Rosenthal AK, Ryan LM (1995) Treatment of refractory crystal-associated arthritis. Rheum Dis Clin North Amer 21:151-161
Roubenoff R (1990) Gout and hyperuricemia. Rheumatic Disease Clinics of North America 16:539-550
Sadler JR, Miwa J, Maas P, Smith T (1974) growth of high density bacterial cultures; a simple device. Laboratory Practice 23:632-643
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. A laboratory manual 2 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Pages
Sandberg AA, Cartwright GB, Wintrobe MM (1956) Studies on leukemia. I. Uric acid excretion. Blood 11:154-166
Savoca KV, Davis FF, Palczuk NC (1984) Induction of tolerance in mice by uricase and monomethoxypolyethylene glycol-modified uricase. Int Arch Allergy Appl Immunol 75:58-67
Sibony G, North ML, Bergerat JP, Lang JM, Oberling F (1984) Hyperuricemia resistant to uráte oxidase. Role of anti-serum uráte oxidase precipitating antibodies (letter). Presse Med 13:443
Singer JZ, Wallace SL (1986) The allopurinol hypersensitivity syndrome. Unnecessary morbidity and mortality. Arthritis Rheum 29:82-87
Tsuji J, Hirose K, Kasahara E, Naitoh M. Yamamoto I (1985) Studies on the antigenicity of the polyethylene glycol-modified uricase. Int J Immunopharmacol 7:725-730
Venkataseshan VS, Feingold R, Dikman S, Churg J (1990) Acute hyperuricemic nephropathy and renal failure afiter transplantation. Nephron 56:317-321
Veronese FM, Caliceti P, Schiavon O (1997) New synthetic polymers for enzyme and liposome modification. In: Harris JM, Zalipsky S (eds) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, DC, pp 182-192
West C, Carpenter BJ, Hakala TR (1987) The incidence of gout in renal transplant recipients. Am J Kidney Dis 10:369-371
Wu X, Lee CC, Muzny DM, Caskey CT (1989) Uráte oxidase: Primary structure and evolutionary implications. Proč Nati Acad Sci USA 86:9412-9416
- 19CZ 304223 B6
Wu X, Muzny DM, Lee CC, Caskey CT (1992) Two independent mutational events in the loss of uráte oxidase. J Mol Evol 34:78-84
Wu X. Wakamiya M, Vaishnav S, Geske R, Montgomery CM, Jr., Jones P, Bradley A et al 5 (1994) Hyperuricemia and uráte nephropathy in uráte oxidase-deficient mice. Proč Nati Acad Sci
USA 91:742-746
Zittoun R, Dauchy F, Teillaud C, Barthelemy M, Bouchard P (1976) Le traitment des hyperuricemies en hematologie par 1'urate-oxydase et rallopurinol. Ann Med Inteme 127:479 482 io
Všechny uvedené publikace jsou formou odkazu zahrnuty v popisu vynálezu.
-20CZ 304223 B6
Seznam sekvencí <110> HERSHFIELD, MICHAEL S. KELLY, SUSAN J.
<120> URÁTE OXIDASE <130> 1579-379 <140> PCT/US99/17678 io <141> 1999-08-05 <160> 13 <170> Patentln Ver. 2.0 15 <210> 1 <211> 915 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(915) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Chiméra PBC <400> 1
atg gct cat tac cgt aat gac tac aaa aag aat gat gag gta gag ttt 48
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
gtc ega act ggc tat ggg aag gat atg ata aaa gtt ctc cat att cag 96
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
ega gat gga aaa tat cac agc att aaa gag gtg gca act tca gtg caa 144
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
ctg act ttg agc tcc aaa aaa gat tac ctg cat gga gac aat tca gat 192
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
gtc atc cct aca gac acc atc aag aac aca gtt aat gtc ctg gcg aag 240
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
ttc aaa ggc atc aaa agc ata gaa act ttt gct gtg act atc tgt gag 288
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
cat ttc ctt tet tcc ttc aag cat gtc atc aga gct caa gtc tat gtg 336
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
30 100 105 110
-21 CZ 304223 B6
gaa Glu gaa gtt Glu Val 115 cct tgg aag Lys cgt Arg ttt Phe 120 gaa aag aat gga gtt Val 125 aag Lys cat His gtc Val 384
Pro Trp Glu Lys Asn Gly
cat gca ttt att tat act cct act gga acg cac ttc tgt gag gtt gaa 432
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
cag ata agg aat gga cct cca gtc att cat tet gga atc aaa gac cta 480
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
aaa gtc ttg aaa aca acc cag tet ggc ttt gaa gga ttc atc aag gac 528
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
cag ttc acc acc ctc cct gag gtg aag gac cgg tgc ttt gcc acc caa 576
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
gtg tac tgc aaa tgg ege tac cac cag ggc aga gat gtg gac ttt gag 624
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
gcc acc tgg gac act gtt agg age att gtc ctg cag aaa ttt get ggg 672
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
ccc tat gac aaa ggc gag tac tca ccc tet gtg cag aag acc ctc tat 720
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
gat atc cag gtg ctc tcc ctg age ega gtt cct gag ata gaa gat atg 768
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
gaa atc age ctg cca aac att cac tac ttc aat ata gac atg tcc aaa 816
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
atg ggt ctg atc aac aag gaa gag gtc ttg ctg cca tta gac aat cca 864
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
tat gga aaa att act ggt aca gtc aag agg aag ttg tet tca aga ctg 912
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300 tga 915 <210>2 <211> 304 <212>PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Chiméra PBC
-22CZ 304223 B6
<400> 2
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met lle Lys Val Leu His lle Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser lle Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val lle Pro Thr Asp Thr lle Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly lle Lys Ser lle Glu Thr Phe Ala Val Thr lle Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val lle Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe lle Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin lle Arg Asn Gly Pro Pro Val lle His Ser Gly lle Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe lle Lys Asp
165 170 175·
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser lle Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp lle Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu lle Glu Asp Met
245 250 255
Glu lle Ser Leu Pro Asn lle His Tyr Phe Asn lle Asp Met Ser Lys
260 265 270
-23 CZ 304223 B6
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 3
<211> 915
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(915)
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Chiméra PKS
<400> 3
atg gct cat tac cgt aat gac tac aaa aag aat gat gag gta gag ttt 48
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
gtc ega act ggc tat ggg aag gat atg ata aaa gtt ctc cat att cag 96
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
ega gat gga aaa tat cac age att aaa gag gtg gca act tea gtg caa 144
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
ctg act ttg age tcc aaa aaa gat tac ctg cat gga gac aat tea gat 192
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
gtc atc cct aca gac acc atc aag aac aca gtt aat gtc ctg gcg aag 240
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
ttc aaa ggc atc aaa age ata gaa act ttt gct gtg act atc tgt gag 288
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
cat ttc ctt tet tcc ttc aag cat gtc atc aga gct caa gtc tat gtg 336
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
gaa gaa gtt cct tgg aag cgt ttt gaa aag aat gga gtt aag cat gtc 384
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
cat gca ttt att tat act cct act gga acg cac ttc tgt gag gtt gaa 432
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
-24CZ 304223 B6
cag Gin 145 ata agg aat gga cct cca gtc att cat tet gga atc aaa gac cta 480
Ile Arg Asn Gly Pro 150 Pro Val Ile His Ser 155 Gly Ile Lys Asp Leu 160
aaa gtc ttg aaa aca acc cag tet ggc ttt gaa gga ttc atc aag gac 528
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
cag ttc acc acc ctc cct gag gtg aag gac cgg tgc ttt gcc acc caa 576
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
gtg tac tgc aaa tgg cgc tac cac cag ggc aga gat gtg gac ttt gag 624
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
gcc acc tgg gac act gtt agg agc att gtc ctg cag aaa ttt gct ggg 672
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
ccc tat gac aaa ggc gag tac tcg ccc tet gtc cag aag aca ctc tat 720
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
gac atc cag gtg ctc acc ctg ggc cag gtt cct gag ata gaa gat atg 768
Asp Ile Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
gaa atc agc ctg cca aat att cac tac tta aac ata gac atg tcc aaa 816
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
atg gga ctg atc aac aag gaa gag gtc ttg cta cct tta gac aat cca 864
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
tat gga aaa att act ggt aca gtc aag agg aag ttg tet tca aga ctg 912
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300 tga 915 <210>4 <211>304 s <212>PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Description of Artificial Sequence:pks chiméra o
<400>4
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe 15 10 15
-25 CZ 304223 B6
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met 25 Ile Lys Val Leu His 30 Ile Gin
20
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300 <210>5 <211> 304 <212>PRT <213> Umělá sekvence
-26CZ 304223 B6 <220>
<223> Popis umělé sekvence: Chiméra D3H <400>5
Met Ala His Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe GlU Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
-27CZ 304223 B6
Glu Ile Ser Leu 260 Pro Asn Ile His Tyr 265 Phe Asn Ile Asp Met 270 Ser Lys
Met Gly Leu 275 Ile Asn Lys Glu Glu 280 Val Leu Leu Pro Leu 285 Asp Asn Pro
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300 <210> 6 <211> 304 <212>PRT <213> pavián
<400> 6
Met Ala Asp Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phé Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
-28CZ 304223 B6
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300 <210> 7 <211>304 <212>PRT <213> prase <400> 7
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
-29CZ 304223 B6
His Ala Phe 130 Ile Tyr Thr Pro 135 Thr Gly Thr His Phe 140 Cys Glu Val Glu
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu
290 295 300 <210> 8 <211> 298 <212> PRT <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence:PBC zkrácená na aminokonci
<400> 8
Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly
15 10 15
Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr His
20 25 30
Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin Leu Thr Leu Ser Ser Lys
35 40 45
30CZ 304223 B6
Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile 60 Pro Thr Asp Thr
50 55
Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser
65 70 75 80
Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe
85 90 95
Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val Glu Glu val Pro Trp Lys
100 105 110
Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr
115 120 125
Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gin Ile Arg Asn Gly Pro
130 135 140
Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr
145 150 155 160
Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu Pro
165 170 175
Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin Val Tyr Cys Lys Trp Arg
180 185 190
Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val
195 200 205
Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu
210 215 220
Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin Val Leu Ser
225 230 235 240
Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn
245 250 255
Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys
260 265 270
Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly
275 280 285
Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 <210> 9 <211> 301 <212>PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:PBC zkrácená na C-konci
-31 CZ 304223 B6
<400> 9
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
-32CZ 304223 B6
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg 290 295 <210> 10 <211> 298 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence:PKS zkrácená na aminokonci <400> 10 Lys Leu Ser 300
Asp 1 Tyr Lys Lys Asn 5 Asp Glu Val Glu Phe 10 Val Arg Thr Gly Tyr 15 Gly
Lys Asp Met Ile Lys 20 Val Leu His Ile Gin 25 Arg Asp Gly Lys 30 Tyr His
Ser Ile Lys 35 Glu Val Ala Thr Ser Val Gin 40 Leu Thr Leu 45 Ser Ser Lys
Lys Asp Tyr 50 Leu His Gly Asp 55 Asn Ser Asp Val Ile Pro 60 Thr Asp Thr
Ile 65 Lys Asn Thr Val Asn 70 Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly 75 Ile Lys Ser 80
Ile Glu Thr Phe Ala 85 Val Thr Ile Cys Glu 90 His Phe Leu Ser Ser 95 Phe
Lys His Val Ile Arg 100 Ala Gin Val Tyr Val 105 Glu Glu Val Pro 110 Trp Lys
Arg Phe Glu 115 Lys Asn Gly Val Lys His Val 120 His Ala Phe 125 ile Tyr Thr
Pro Thr Gly 130 Thr His Phe Cys 135 Glu Val Glu Gin Ile Arg 140 Asn Gly Pro
Pro 145 Val Ile His Ser Gly 150 Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu 155 Lys Thr Thr 160
Gin Ser Gly Phe Glu 165 Gly Phe Ile Lys Asp 170 Gin Phe Thr Thr Leu 175 Pro
Glu Val Lys Asp Arg 180 Cys Phe Ala Thr Gin 185 Val Tyr Cys Lys 190 Trp Arg
Tyr His Gin 195 Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu 200 Ala Thr Trp 205 Asp Thr Val
-33 CZ 304223 B6
Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu
210 215 220
Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin Val Leu Thr
225 230 235 240
Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn
245 250 255
Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys
260 265 270
Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly
275 280 285
Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 <210> 11 <211> 301 <212>PRT <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis i umělé sekvence:PKS zkrácená na Ckonci
<400> 11
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
-34CZ 304223 B6
His Ala Phe 130 lle Tyr Thr Pro Thr Gly Thr 135 His Phe 140 Cys Glu Val Glu
Gin lle Arg Asn Gly Pro Pro Val lle His Ser Gly lle Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe lle Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser lle Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp lle Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu lle Glu Asp Met
245 250 255
Glu lle Ser Leu Pro Asn lle His Tyr Leu Asn lle Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu lle Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys lle Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser
290 295 300
<210> 12 <211> 915 <212>DNA <213> prase <400> 12 atggctcatt accgtaatga ctacaaaaag aatgatgagg tagagtttgt ccgaactggc 60 tatgggaagg atatgataaa agttctccat attcagcgag atggaaaata tcacagcatt 120 aaagaggtgg caacttcagt gcaactgact ttgagctcca aaaaagatta cctgcatgga 180 gacaattcag atgtcatccc tacagacacc atcaagaaca cagttaatgt cctggcgaag 240 ttcaaaggca tcaaaagcat agaaactttt gctgtgacta tctgtgagca tttcctttct 300 tccttcaagc atgtcatcag agctcaagtc tatgtggaag aagttccttg gaagcgtttt 360 gaaaagaatg gagttaagca tgtccatgca tttatttata ctcctactgg aacgcacttc 420 tgtgaggttg aaeagataag gaatggacct ccagtcattc attctggaat caaagaccta 480 aaagtcttga aaacaaccca gtctggcttt gaaggattca tcaaggacca gttcaccacc 540 ctccctgagg tgaaggaccg gtgctttgcc acccaagtgt actgcaaatg gcgctaccac 600 cagggcagag atgtggactt tgaggccacc tgggacactg ttaggagcat tgtcctgcag 660 aaatttgctg ggccctatga caaaggcgag tactcgccct ctgtccagaa gacactctat 720 gacatccagg tgctcaccct gggccaggtt cctgagatag aagatatgga aatcagcctg 780 ccaaatattc actacttaaa catagacatg tccaaaatgg gactgatcaa caaggaagag 840 gtcttgctac ctttagacaa tccatatggc aggattactg gtacagtcaa gaggaagctg 900 acttcaaggc tgtga 915
-35CZ 304223 B6 <210> 13 <211>915 <212> DNA <213> pavián <400 13 atggccgact accataacaa ctataaaaag aatgatgaat tggagtttgt ccgaactggc 60 tatgggaagg atatggtaaa agttctccat attcagcgag atggaaaata tcacagcatt 120 aaagaggtgg caacttcagt gcaacttact ctgagttcca aaaaagatta cctgcatgga 180 gataattcag atatcatccc tacagacacc atcaagaaca cagttcatgt cttggcaaag 240 tttaagggaa tcaaaagcat agaagccttt ggtgtgaata tttgtgagta ttttctttct 300 tcttttaacc atgtaatccg agctcaagtc tacgtggaag aaatcccttg gaagcgtctt 360 gaaaagaatg gagttaagca tgtccatgca tttattcaca ctcccactgg aacacacttc 420 tgtgaagttg aacaactgag aagtggaccc cccgtcattc attctggaat caaagacctc 480 aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt gaaggtttca tcaaggacca gttcaccacc 540 ctccctgagg tgaaggaccg atgctttgcc acccaagtgt actgcaagtg gcgctaccac 600 cagtgcaggg atgtggactt cgaggctacc tggggcacca ttcgggacct tgtcctggag 660 aaatttgctg ggccctatga caaaggcgag tactcaccct ctgtgcagaa gaccctctat 720 gatatccagg tgctctccct gagccgagtt cctgagatag aagatatgga aatcagcctg 780 ccaaacattc actacttcaa tatagacatg tccaaaatgg gtctgatcaa caaggaagag 840 gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga aaaattactg gtacagtcaa gaggaagttg 900 tcttcaagac tgtga 915

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Rekombinantní chimérický urikázový protein sestávající z prasečí urikázové části a paviání urikázové části, přičemž uvedená paviání urikázová část obsahuje lysinový zbytek v poloze odpovídající aminokyselinové poloze 291 v paviání urikáze SEQ ID NO: 6, ve kterém Nkoncová sekvence tohoto rekombinantního chimérického urikázového proteinu pochází z prasečí urikázy SEQ ID NO: 7 a C-koncová sekvence tohoto rekombinantního chimérického urikázového proteinu pochází z paviání urikázy SEQ ID NO: 6, přičemž části tvořené prasečí urikázou a paviání urikázou jsou vybrány tak, aby výsledný rekombinantní chimérický urikázový protein obsahoval celkem 30 lysinových zbytků, přičemž rekombinantní chimérický urikázový protein může být zkrácen na N-konci, na C-konci nebo, jak na N-konci, tak na C-konci, přičemž při zkracování nejsou odstraňovány lysino vé zbytky.
  2. 2. Rekombinantní chimérický urikázový protein podle nároku 1, kde rekombinantní chimérický urikázový protein obsahuje 304 aminokyselin, přičemž prvních 225 N-koncových aminokyselin z uvedených 304 aminokyselin jsou aminokyseliny 1 až 225 z prasečí urikázy SEQ ID NO: 7 a zbývajících 79 aminokyselin z uvedených 304 aminokyselin jsou aminokyseliny 226 až 304 z paviání urikázy SEQ ID NO: 6.
  3. 3. Rekombinantní chimérický urikázový protein podle nároku 1, kde rekombinantní chimérický urikázový protein obsahuje 304 aminokyselin, přičemž prvních 288 N-koncových aminokyselin z uvedených 304 aminokyselin jsou aminokyseliny 1 až 288 z prasečí urikázy SEQ ID NO: 7 a zbývajících 16 aminokyselin z uvedených 304 aminokyselin jsou aminokyseliny 289 až 304 z paviání urikázy SEQ ID NO: 6.
  4. 4. Rekombinantní urikázový protein podle nároku 1 obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo 4.
    -36CZ 304223 B6
  5. 5. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny kódující rekombinantní urikázu, jakje definována v nároku 1.
  6. 6. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny kódující rekombinantní urikázu definovanou v nároku 2.
  7. 7. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny kódující rekombinantní urikázu podle nároku 3.
  8. 8. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny kódující rekombinantní urikázu podle nároku 4.
  9. 9. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 8 obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1.
  10. 10. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 8 obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 3.
  11. 11. Vektor obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje rekombinantní urikázu definovanou v jednom z nároků 1 až 4.
  12. 12. Vektor obsahující nukleotidovou sekvenci podle kteréhokoli z nároků 5 až 10.
  13. 13. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 11.
  14. 14. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 12.
  15. 15. Způsob zvýšení počtu dostupných neškodlivých míst pro navázání PEG na urikázový protein, vyznačující se tím, že zahrnuje nahrazení aminokyselinového zbytku odpovídajícího poloze 291 prasečího urikázového proteinu lysinovým zbytkem.
CZ2001-466A 1998-08-06 1999-08-05 Rekombinantní chimérický urikázový protein CZ304223B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9548998P 1998-08-06 1998-08-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2001466A3 CZ2001466A3 (cs) 2001-07-11
CZ304223B6 true CZ304223B6 (cs) 2014-01-15

Family

ID=22252247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2001-466A CZ304223B6 (cs) 1998-08-06 1999-08-05 Rekombinantní chimérický urikázový protein

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7056713B1 (cs)
EP (2) EP1100880B1 (cs)
JP (3) JP2002524053A (cs)
KR (1) KR100841634B1 (cs)
CN (2) CN1322243A (cs)
AT (1) ATE483797T1 (cs)
AU (1) AU766421B2 (cs)
BR (1) BRPI9913360B8 (cs)
CA (1) CA2337967C (cs)
CY (1) CY1111001T1 (cs)
CZ (1) CZ304223B6 (cs)
DE (1) DE69942834D1 (cs)
DK (1) DK1100880T3 (cs)
ES (1) ES2352451T3 (cs)
HK (3) HK1037214A1 (cs)
HU (1) HU229774B1 (cs)
IL (3) IL141221A0 (cs)
NZ (1) NZ509633A (cs)
PL (1) PL207369B1 (cs)
PT (1) PT1100880E (cs)
RU (1) RU2290439C2 (cs)
WO (1) WO2000008196A2 (cs)
ZA (1) ZA200100974B (cs)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060188971A1 (en) * 1998-08-06 2006-08-24 Duke University Urate oxidase
EP1100542B1 (en) * 1998-08-06 2005-06-22 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
CZ304223B6 (cs) * 1998-08-06 2014-01-15 Duke University Rekombinantní chimérický urikázový protein
CA2338665C (en) 1998-08-06 2011-01-18 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
CN100371439C (zh) * 2003-04-07 2008-02-27 北京双鹭药业股份有限公司 一种重组假丝酵母尿酸氧化酶的制备方法
CN100334207C (zh) * 2004-04-27 2007-08-29 杭州北斗生物技术有限公司 一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法
EP2947145A1 (en) 2005-04-11 2015-11-25 Crealta Pharmaceuticals LLC Variant forms of urate oxidase and use thereof
AU2011257764B2 (en) * 2005-04-11 2012-04-05 Horizon Therapeutics Usa, Inc. A variant form of urate oxidase and use thereof
US8148123B2 (en) 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
CZ2007700A3 (cs) 2005-04-11 2008-02-27 Savient Pharmaceuticals, Inc. Variantní forma urátoxidázy a její použití
WO2008051178A2 (en) 2006-04-12 2008-05-02 Savient Pharmaceuticals, Inc. Purification of proteins with cationic surfactant
CN101402688B (zh) * 2008-11-18 2011-04-20 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种融合蛋白及其编码基因与应用
NZ595078A (en) 2009-03-24 2012-07-27 Meito Sangyo Kk Improved type milk-clotting protease derived from a microorganism
PL398781A1 (pl) 2009-06-25 2012-11-19 Savient Pharmaceuticals, Inc. Sposoby i zestawy do prognozowania ryzyka wystapienia reakcji na wlew oraz zaniku odpowiedzi której posrednicza przeciwciala poprzez monitorowanie kwasu moczowego w surowicy podczas terapii z zastosowaniem pegylowanej urykazy
CN102051348B (zh) * 2009-10-27 2012-10-03 重庆富进生物医药有限公司 人源化重组尿酸酶及其突变体
RU2460793C2 (ru) * 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
WO2011127393A2 (en) 2010-04-08 2011-10-13 Georgia Tech Research Corporation Variants of ancestral uricases and uses thereof
CN102634492B (zh) * 2011-02-14 2015-06-10 重庆富进生物医药有限公司 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用
CN102757945B (zh) * 2011-04-28 2015-03-18 杭州俊丰生物工程有限公司 人尿酸氧化酶蛋白及其制备方法和其聚乙二醇结合物
CN102260653B (zh) * 2011-06-30 2013-04-03 荣俊 一种peg化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及应用方法
WO2014170916A2 (en) * 2013-04-17 2014-10-23 Council Of Scientific & Industrial Research Novel uricase mutants
CN103834623B (zh) * 2014-02-11 2017-11-07 中国药科大学 具有催化活性的人源尿酸氧化酶
CN104388467A (zh) * 2014-10-27 2015-03-04 李长贵 一种构建自发性高尿酸血症小鼠模型的方法及其用途
MY190411A (en) 2015-05-15 2022-04-21 Medimmune Llc Improved uricase sequences and methods of treatment
CN106554948B (zh) 2015-09-29 2019-06-25 上海生物制品研究所有限责任公司 突变型尿酸酶、peg修饰的突变型尿酸酶及其应用
CN108103079B (zh) * 2017-06-20 2021-07-13 北京锦篮基因科技有限公司 一种高尿酸血症的基因治疗药物
CN109554376B (zh) * 2018-11-13 2022-03-22 广西大学 一种碱性尿酸氧化酶及其在检测试剂盒和降低食品中尿酸的应用
US12121566B2 (en) 2019-01-30 2024-10-22 Horizon Therapeutics Usa, Inc. Methods for treating gout
CN111088268B (zh) * 2019-03-05 2022-08-02 北京锦篮基因科技有限公司 一种高尿酸血症的基因治疗药物
EP3967754A4 (en) 2019-05-10 2023-07-26 Peg-Bio Biopharm Co., Ltd. (Chongqing) URATE OXIDASE MODIFIED BY POLYETHYLENE GLYCOL
CN112646790A (zh) * 2019-10-11 2021-04-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法
CN111920942A (zh) * 2020-08-24 2020-11-13 深圳前海鹰岗生物科技有限公司 一种用于快速溶解痛风石的聚合物微针及制备方法和应用
CN114438048B (zh) 2020-11-05 2024-10-22 重庆派金生物科技有限公司 尿酸氧化酶制剂及其应用
CN114438047A (zh) 2020-11-05 2022-05-06 重庆派金生物科技有限公司 制备聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的方法
CN112852772A (zh) * 2021-01-19 2021-05-28 中国科学院过程工程研究所 一种基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶及其制备方法
CN112662640A (zh) * 2021-01-28 2021-04-16 中国药科大学 一种具有催化活性的尿酸氧化酶
CN113244412B (zh) * 2021-06-25 2021-10-26 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法
AU2022340814A1 (en) * 2021-09-01 2024-02-15 Ginkgo Bioworks, Inc. Recombinant cells for treating diseases associated with uric acid and methods of use thereof
WO2024138370A1 (zh) * 2022-12-27 2024-07-04 北京炫景瑞医药科技有限公司 一种治疗高尿酸相关疾病的核酸药物及其制备方法和用途
CN118360300A (zh) * 2023-01-10 2024-07-19 优环(苏州)生物医药科技有限公司 一种表达尿酸氧化酶的环状rna、制备方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1100880A2 (en) * 1998-08-06 2001-05-23 Duke University Urate oxidase

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279486C (cs)
US3613231A (en) 1969-07-25 1971-10-19 Paul F Pugh Method for manufacturing high voltage cable systems
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE3126759A1 (de) 1981-07-07 1983-01-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Loesliche leber-uricase, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5075216A (en) 1988-09-23 1991-12-24 Cetus Corporation Methods for dna sequencing with thermus aquaticus dna polymerase
US5349052A (en) 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5382518A (en) 1989-07-13 1995-01-17 Sanofi Urate oxidase activity protein, recombinant gene coding therefor, expression vector, micro-organisms and transformed cells
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5653974A (en) 1990-10-18 1997-08-05 Board Of Regents,The University Of Texas System Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor
AU6240494A (en) 1993-02-16 1994-09-14 Enzon, Inc. Ribosome inactivating protein compositions having reduced antigenicity
WO1995000162A1 (en) 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
AU697440B2 (en) 1994-12-07 1998-10-08 Novozymes A/S Polypeptide with reduced allergenicity
JPH09154581A (ja) 1995-12-05 1997-06-17 Asahi Chem Ind Co Ltd ウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物
JP2001511162A (ja) 1997-02-06 2001-08-07 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 付加され、そして／又は除去された付着基を有するポリペプチド−ポリマー結合体
CA2338665C (en) 1998-08-06 2011-01-18 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
EP1100542B1 (en) 1998-08-06 2005-06-22 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1100880A2 (en) * 1998-08-06 2001-05-23 Duke University Urate oxidase

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chen a kol. (1981) Biochim. Biophys. Acta 660, 293-298 *
Chua a kol. (1988) Ann. Intern. Med. 109, 114-117 *
Davis a kol. (1981) Lancet 2, 281-283 *
Hershfield a kol. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7185-89 *
Tsuji a kol. (1985) Int. J. Immunopharmacol. 7, 725-730 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL197339A0 (en) 2011-07-31
EP2277998A1 (en) 2011-01-26
RU2290439C2 (ru) 2006-12-27
AU5336599A (en) 2000-02-28
JP2010158244A (ja) 2010-07-22
NZ509633A (en) 2003-04-29
HUP0103205A3 (en) 2006-01-30
PL207369B1 (pl) 2010-12-31
CA2337967A1 (en) 2000-02-17
WO2000008196A3 (en) 2000-03-30
IL141221A (en) 2010-06-16
DK1100880T3 (da) 2011-01-24
CA2337967C (en) 2011-11-01
EP1100880B1 (en) 2010-10-06
DE69942834D1 (de) 2010-11-18
BR9913360B1 (pt) 2013-09-24
PL346222A1 (en) 2002-01-28
JP2013215199A (ja) 2013-10-24
KR20010053633A (ko) 2001-06-25
IL141221A0 (en) 2002-03-10
HU229774B1 (en) 2014-07-28
CY1111001T1 (el) 2015-06-11
HK1125402A1 (en) 2009-08-07
WO2000008196A2 (en) 2000-02-17
JP5721954B2 (ja) 2015-05-20
CZ2001466A3 (cs) 2001-07-11
US7056713B1 (en) 2006-06-06
ES2352451T3 (es) 2011-02-18
JP2002524053A (ja) 2002-08-06
BR9913360A (pt) 2001-07-03
AU766421B2 (en) 2003-10-16
HK1037214A1 (en) 2002-02-01
BRPI9913360B8 (pt) 2021-05-25
IL197339A (en) 2015-02-26
KR100841634B1 (ko) 2008-06-26
WO2000008196A9 (en) 2000-07-13
PT1100880E (pt) 2011-01-13
CN1322243A (zh) 2001-11-14
ZA200100974B (en) 2002-06-26
HK1153508A1 (zh) 2012-03-30
EP2277998B1 (en) 2016-04-20
CN101280293B (zh) 2013-09-11
EP1100880A2 (en) 2001-05-23
EP1100880A4 (en) 2002-04-17
ATE483797T1 (de) 2010-10-15
CN101280293A (zh) 2008-10-08
HUP0103205A2 (hu) 2001-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2337967C (en) Recombinant uricase protein
US9885024B2 (en) PEG-urate oxidase conjugates and use thereof
AU2006235495B2 (en) Variant forms of urate oxidase and use thereof
KR100488848B1 (ko) 피이지-유레이트 옥시데이즈 접합체 및 그의 이용
PL215157B1 (pl) Wyizolowana urykaza, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna, kodujacy ja wyizolowany kwas nukleinowy, zawierajacy go wektor i obejmujaca ten wektor komórka gospodarza oraz sposoby wytwarzania urykazy oraz zawierajacej urykaze kompozycji farmaceutycznej
NZ520434A (en) Urate oxidase free of aggregates larger than octamers, for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
US20060188971A1 (en) Urate oxidase
MXPA01001342A (en) Urate oxidase
PL203492B1 (pl) Koniugat urykazy i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna
MXPA01001272A (en) Peg-urate oxidase conjugates and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180805