PL202799B1 - Sposób izolowania urykazy w postaci tetramerycznej oraz wyizolowana tetrameryczna urykaza - Google Patents
Sposób izolowania urykazy w postaci tetramerycznej oraz wyizolowana tetrameryczna urykazaInfo
- Publication number
- PL202799B1 PL202799B1 PL380583A PL38058399A PL202799B1 PL 202799 B1 PL202799 B1 PL 202799B1 PL 380583 A PL380583 A PL 380583A PL 38058399 A PL38058399 A PL 38058399A PL 202799 B1 PL202799 B1 PL 202799B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- uricase
- peg
- kda
- conjugates
- activity
- Prior art date
Links
- 229940005267 urate oxidase Drugs 0.000 title abstract 2
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 294
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 abstract description 195
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 39
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 39
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 19
- 108010068701 Pegloticase Proteins 0.000 abstract description 16
- -1 poly(ethylene glycol) Polymers 0.000 abstract description 6
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 abstract description 4
- 230000001751 uricolytic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 66
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 38
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 31
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 28
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 26
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 25
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 25
- 241000235646 Cyberlindnera jadinii Species 0.000 description 23
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 19
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 14
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 12
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 201000001431 Hyperuricemia Diseases 0.000 description 11
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 10
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 10
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 10
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 10
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 9
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 9
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 8
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 5
- 206010051364 Hyperuricosuria Diseases 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 241000186074 Arthrobacter globiformis Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N allantoin Chemical compound NC(=O)NC1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 4
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- ZJIFDEVVTPEXDL-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) hydrogen carbonate Chemical group OC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZJIFDEVVTPEXDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical compound OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N Lys-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N Thr-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 102100026383 Vasopressin-neurophysin 2-copeptin Human genes 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 201000010064 diabetes insipidus Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 3
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LTTLSZVJTDSACD-OWLDWWDNSA-N Ala-Thr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O LTTLSZVJTDSACD-OWLDWWDNSA-N 0.000 description 2
- POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N Allantoin Natural products NC(=O)N[C@@H]1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N 0.000 description 2
- WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N Arg-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N Arg-Asp-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- BHQQRVARKXWXPP-ACZMJKKPSA-N Asn-Asp-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N BHQQRVARKXWXPP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N Asn-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 101000767281 Aspergillus flavus Uricase Proteins 0.000 description 2
- BUXAPSQPMALTOY-WHFBIAKZSA-N Cys-Glu Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BUXAPSQPMALTOY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 2
- 241000255313 Drosophila pseudoobscura Species 0.000 description 2
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- WZSHYFGOLPXPLL-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WZSHYFGOLPXPLL-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N Gly-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FLUVGKKRRMLNPU-CQDKDKBSSA-N His-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FLUVGKKRRMLNPU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N Lys-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N Lys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N Lys-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- LCMWVZLBCUVDAZ-IUCAKERBSA-N Lys-Gly-Glu Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC([O-])=O LCMWVZLBCUVDAZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- ALGGDNMLQNFVIZ-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N ALGGDNMLQNFVIZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- ALEVUGKHINJNIF-QEJZJMRPSA-N Lys-Phe-Ala Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ALEVUGKHINJNIF-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N Lys-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 2
- RYOLKFYZBHMYFW-WDSOQIARSA-N Lys-Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 RYOLKFYZBHMYFW-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- PSVAVKGDUAKZKU-BZSNNMDCSA-N Lys-Tyr-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O PSVAVKGDUAKZKU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- AUJWXNGCAQWLEI-KBPBESRZSA-N Phe-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O AUJWXNGCAQWLEI-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- YFXXRYFWJFQAFW-JHYOHUSXSA-N Phe-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O YFXXRYFWJFQAFW-JHYOHUSXSA-N 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- CLJLVCYFABNTHP-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CLJLVCYFABNTHP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- QUBVFEANYYWBTM-VEVYYDQMSA-N Pro-Thr-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QUBVFEANYYWBTM-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 2
- FYXCBXDAMPEHIQ-FHWLQOOXSA-N Pro-Trp-Lys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O FYXCBXDAMPEHIQ-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 2
- CWZUFLWPEFHWEI-IHRRRGAJSA-N Pro-Tyr-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CWZUFLWPEFHWEI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- AWJGUZSYVIVZGP-YUMQZZPRSA-N Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AWJGUZSYVIVZGP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 108010079005 RDV peptide Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 2
- YKCXQOBTISTQJD-BZSNNMDCSA-N Tyr-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N YKCXQOBTISTQJD-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- ZOBLBMGJKVJVEV-BZSNNMDCSA-N Tyr-Lys-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O ZOBLBMGJKVJVEV-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N Val-Arg-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- HHSILIQTHXABKM-YDHLFZDLSA-N Val-Asp-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O HHSILIQTHXABKM-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- MLADEWAIYAPAAU-IHRRRGAJSA-N Val-Lys-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N MLADEWAIYAPAAU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- CFIBZQOLUDURST-IHRRRGAJSA-N Val-Tyr-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CFIBZQOLUDURST-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N Val-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 2
- 229960000458 allantoin Drugs 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 238000012436 analytical size exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 2
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) carbonochloridate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(Cl)=O)C=C1 NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVGVQTOQSNJTJI-UHFFFAOYSA-N 8-azaxanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NN=N2 KVGVQTOQSNJTJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- KUDREHRZRIVKHS-UWJYBYFXSA-N Ala-Asp-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KUDREHRZRIVKHS-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- LBFXVAXPDOBRKU-LKTVYLICSA-N Ala-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LBFXVAXPDOBRKU-LKTVYLICSA-N 0.000 description 1
- OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N Ala-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- WESHVRNMNFMVBE-FXQIFTODSA-N Arg-Asn-Asp Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)CN=C(N)N WESHVRNMNFMVBE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NONSEUUPKITYQT-BQBZGAKWSA-N Arg-Asn-Gly Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N)CN=C(N)N NONSEUUPKITYQT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BBYTXXRNSFUOOX-IHRRRGAJSA-N Arg-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BBYTXXRNSFUOOX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DPLFNLDACGGBAK-KKUMJFAQSA-N Arg-Phe-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N DPLFNLDACGGBAK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SUMJNGAMIQSNGX-TUAOUCFPSA-N Arg-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O SUMJNGAMIQSNGX-TUAOUCFPSA-N 0.000 description 1
- 101000767280 Arthrobacter globiformis Uricase Proteins 0.000 description 1
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ICAYWNTWHRRAQP-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)CN=C(N)N ICAYWNTWHRRAQP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ITGFVUYOLWBPQW-KKHAAJSZSA-N Asp-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ITGFVUYOLWBPQW-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241001204504 Awaous flavus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010521 Cicer Nutrition 0.000 description 1
- 241000220455 Cicer Species 0.000 description 1
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 description 1
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- GMXSSZUVDNPRMA-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMXSSZUVDNPRMA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VIRYODQIWJNWNU-NRPADANISA-N Cys-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N VIRYODQIWJNWNU-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 208000006558 Dental Calculus Diseases 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical class C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 1
- ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N Glu-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QJCKNLPMTPXXEM-AUTRQRHGSA-N Glu-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QJCKNLPMTPXXEM-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N Glu-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- LZEUDRYSAZAJIO-AUTRQRHGSA-N Glu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LZEUDRYSAZAJIO-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- CLODWIOAKCSBAN-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CLODWIOAKCSBAN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- YDIDLLVFCYSXNY-RCOVLWMOSA-N Gly-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN YDIDLLVFCYSXNY-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000767315 Glycine max Uricase-2 isozyme 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000767285 Glycine max Uricase-2 isozyme 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- AVQOSMRPITVTRB-CIUDSAMLSA-N His-Asn-Asn Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N AVQOSMRPITVTRB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WPUAVVXYEJAWIV-KKUMJFAQSA-N His-Phe-Cys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N WPUAVVXYEJAWIV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SVVULKPWDBIPCO-BZSNNMDCSA-N His-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SVVULKPWDBIPCO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ZHHLTWUOWXHVQJ-YUMQZZPRSA-N His-Ser-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)O)N ZHHLTWUOWXHVQJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UPJODPVSKKWGDQ-KLHWPWHYSA-N His-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O UPJODPVSKKWGDQ-KLHWPWHYSA-N 0.000 description 1
- DAKSMIWQZPHRIB-BZSNNMDCSA-N His-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DAKSMIWQZPHRIB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- MRVZCDSYLJXKKX-ACRUOGEOSA-N His-Tyr-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N MRVZCDSYLJXKKX-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LAGPXKYZCCTSGQ-JYJNAYRXSA-N Leu-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LAGPXKYZCCTSGQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108010062166 Lys-Asn-Asp Proteins 0.000 description 1
- OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N Lys-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- CNGOEHJCLVCJHN-SRVKXCTJSA-N Lys-Pro-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CNGOEHJCLVCJHN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000608112 Mus musculus Uricase Proteins 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 241000282515 Papio hamadryas Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- OXUMFAOVGFODPN-KKUMJFAQSA-N Phe-Asn-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N OXUMFAOVGFODPN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZIQQNOXKEFDPBE-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N ZIQQNOXKEFDPBE-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- KBUAPZAZPWNYSW-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 KBUAPZAZPWNYSW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010061481 Renal injury Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101000608029 Sus scrofa Uricase Proteins 0.000 description 1
- UDNVOQMPQBEITB-MEYUZBJRSA-N Thr-His-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O UDNVOQMPQBEITB-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N Tyr-Gly-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- JKUZFODWJGEQAP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O JKUZFODWJGEQAP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- SCZJKZLFSSPJDP-ACRUOGEOSA-N Tyr-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SCZJKZLFSSPJDP-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 description 1
- 238000008114 Uric Acid Assay Methods 0.000 description 1
- DBOXBUDEAJVKRE-LSJOCFKGSA-N Val-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N DBOXBUDEAJVKRE-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- FOADDSDHGRFUOC-DZKIICNBSA-N Val-Glu-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N FOADDSDHGRFUOC-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- XBRMBDFYOFARST-AVGNSLFASA-N Val-His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N XBRMBDFYOFARST-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N Val-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- KTEZUXISLQTDDQ-NHCYSSNCSA-N Val-Lys-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N KTEZUXISLQTDDQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- RYQUMYBMOJYYDK-NHCYSSNCSA-N Val-Pro-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N RYQUMYBMOJYYDK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 235000002098 Vicia faba var. major Nutrition 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N allopurinol Chemical compound OC1=NC=NC2=C1C=NN2 OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003459 allopurinol Drugs 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- OZMJXAQDMVDWBK-UHFFFAOYSA-N carbamic acid;ethyl carbamate Chemical compound NC(O)=O.CCOC(N)=O OZMJXAQDMVDWBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012818 gel-diffusion assay Methods 0.000 description 1
- 235000010492 gellan gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000037806 kidney injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003334 secondary amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 150000003918 triazines Chemical class 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
- C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania urykazy w postaci tetramerycznej oraz wyizolowana tetrameryczna urykaza.
Niniejszym opisano również sposoby otrzymywania koniugatów poli(glikoli etylenowych) lub poli(tlenków etylenowych) z urykazą (oksydazą moczanową) otrzymaną sposobem według wynalazku, co zasadniczo usuwa immunogenność urykazy, a jednocześnie nie ogranicza jej aktywności rozkładania kwasu moczowego.
Oksydazy moczanowe (urykazy; E.C. 1.7.3.3) są enzymami katalizującymi utlenianie kwasu moczowego do bardziej rozpuszczalnego produktu, allantoiny, metabolitu purynowego, który jest łatwiejszy do usuwania. Człowiek nie wytwarza enzymatycznie aktywnej urykazy, co jest wynikiem szeregu mutacji w genie urykazy, które zaszły w trakcie ewolucji wyższych naczelnych. Wu, X, i wsp., (1992) J. Mol. Evol. 34: 78-84. W konsekwencji u obarczonych tym osobników, nadmierne stężenie kwasu moczowego we krwi (hiperurykemia) i w moczu (hiperurykozuria) może prowadzić do bolesnego zapalenia stawów (skaza moczanowa), zniekształcających bezpostaciowych złogów moczanowych (guzki) oraz niewydolności nerek. U niektórych, dotkniętych tym osobników dostępne leki, takie jak allopurynol (inhibitor syntezy kwasu moczowego) wywołują efekty uboczne ograniczające leczenie lub niedostatecznie usuwają objawy. Hande, KR, i wsp., (1984) Am. J. Med. 76: 47-56; Fam AG, (1990)
Bailliere's Clin Rheumatol 4: 177-192. Wstrzyknięcie urykazy może co najmniej przejściowo zmniejszać hiperurykemię i hiperurykozurię. Ze względu na fakt, że urykaza jest dla ludzi białkiem obcym, to nawet pierwsze wstrzyknięcie niezmodyfikowanego białka z Aspergillus flavus wywołało u kilku procent leczonych pacjentów reakcje anafilaktyczne (Pui, C-H, i wsp., (1997) Leukemia 11: 1813-1816), a odpowiedzi immunologiczne ograniczają jego zastosowanie do długotrwałego lub okresowego leczenia. Donadio, D, i wsp., (1981) Nouv Presse Med 10: 711-712; Leaustic, M, i wsp., (1983) Rev Rhum Osteoartic 50:553-554.
Od kilku dziesięcioleci uznaje się działanie dostępnych sposobów leczenia hiperurykemii za suboptymalne. Kissel, P, i wsp., (1968) Nature 217:72-74. Podobnie od wielu lat dostrzegana była możliwość czerpania korzyści przez określone grupy pacjentów z ostrą skazą moczanową z bezpiecznej i skutecznej postaci wstrzykiwalnej urykazy. Davis, FF, i wsp., (1978) w GB Broun, i wsp., (red.) Enzyme Engineering, tom 4 (str. 169-173), Nowy Jork, Plenum Press; Nishimura, H, i wsp., (1979) Enzyme 24: 261-264; Nishimura, H, i wsp., (1981) Enzyme 26: 49-53; Davis, S, i wsp., (1981) Lancet 2(8241): 281-283; Abuchowski, A, i wsp., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219: 352-354; Chen, RH-L, i wsp., (1981) Biochim Biophys Acta 660: 293-298; Chua, CC, i wsp., (1988) Ann Int Med 109:114 -117; Greenberg, ML, i wsp., (1989) Anal Biochem 176: 290-293. Urykazy otrzymywane z narządów zwierząt są prawie nierozpuszczalne w rozpuszczalnikach, które są bezpieczne do podawania w postaci zastrzyków. Patent U.S. 3616231. Określone urykazy pochodzenia roślinnego lub z mikroorganizmów są lepiej rozpuszczalne w medycznie dopuszczalnych rozpuszczalnikach. Jednakże wstrzyknięcie pochodzących z mikroorganizmów enzymów szybko wywołuje reakcje immunologiczne, które mogą prowadzić do zagrażających życiu reakcji alergicznych lub do inaktywacji i/lub przyspieszonego usuwania urykazy z krążenia. Donadio, i wsp., (1981); Leaustic, i wsp., (1983). Enzymy oparte na wydedukowanych sekwencjach aminokwasowych urykaz ssaków, takich jak świnie i pawiany, lub z owadów, takich jak przykładowo Drosophila melanogaster lub Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, i wsp., (1990) Mol Cell Biol 10: 5114-5127) nie są użytecznymi kandydatami do zastosowań klinicznych z uwagi na problemy z immunogennością i rozpuszczalnością przy fizjologicznym pH.
Białka kowalencyjnie zmodyfikowane poli(glikolem etylenowym) lub poli(tlenkiem etylenu) (oba określane jako PEG) były stosowane w celu zwiększenia półokresu trwania białek i zmniejszania ich immunogenności. Patenty U.S. 4179337, 4766106 i 4847325; Saifer, MGP, i wsp., (1994) Adv Exp Med Biol 366:377-387.
Przyłączanie PEG o wysokiej masie cząsteczkowej prowadzi do otrzymania koniugatów o wydłużonym czasie krążenia i/lub zmniejszonej immunogenności, które zachowują funkcjonalną aktywność, co wcześniej wykazano dla innego enzymu, dysmutazy nadtlenkowej (Somack, R, i wsp., (1991) Free Rat Res Commun 12-13: 553-562; Patenty U.S. 5283317 i 5468478) i dla innych rodzajów białek np. cytokin (Saifer, MGP, i wsp., (1997) Polym Preprints 38: 576-577; Sherman, MR, i wsp., (1997) w JM Harris, i wsp., (red.) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (str. 155-169) Waszyngton, DC: American Chemical Society). Opisane były również koniugaty urykazy z polimerami innymi niż PEG. Patent U.S. 4460683.
PL 202 799 B1
W prawie wszystkich próbach modyfikowania urykazy PEG, o których donoszono (np. kowalencyjnego przyłączania PEG do urykazy) PEG był przyłączany głównie do grup aminowych, włącznie z resztami koń ca aminowego i dostę pnymi resztami lizyny. W powszechnie stosowanych urykazach, całkowita liczba reszt lizynowych w każdej z czterech identycznych podjednostek wynosi pomiędzy 25 (Aspergillus flavus (patent U.S. 5382518)), a 29 (świnia (Wu, X, i wsp., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9412-9416)). Niektóre z lizyn w natywnej konformacji enzymu są niedostępne dla procesu modyfikacji PEG. Najczęstszym sposobem ograniczenia immunogenności urykazy jest sprzęganie znacznej liczby łańcuchów niskocząsteczkowego PEG. Prowadzi to niezmiennie do znacznego ograniczenia aktywności enzymatycznej uzyskiwanych koniugatów.
Wcześniej naukowcy stosowali wstrzyknięcia urykazy celem skatalizowania in vivo przekształcenia kwasu moczowego w allantoinę. Patrz Pui, i wsp., (1997). Stanowi to podstawę do stosowania we Francji i we Włoszech urykazy z grzyba Aspergillus flavus (Uricozyme®) do zapobiegania lub okresowej poprawy hiperurykemii towarzyszącej cytotoksycznemu leczeniu złośliwych chorób krwi i do przejściowego ograniczenia ostrej hiperurykemii u pacjentów ze skazą moczanową. Potaux, L, i wsp., (1975) Nouv Press Med 4:1109-1112; Legoux, R, i wsp., (1992) J Biol Chem 267: 8565-8570; Patenty U.S. 5382518 i 5541098. Z uwagi na krótki czas krążenia Uricozyme® wymaga codziennego wstrzykiwania. Ponadto, z uwagi na swoją immunogenność nie jest preparatem dobrze nadającym się do długotrwałego leczenia.
Pojedyncze, dożylne wstrzyknięcie preparatu urykazy z Candida utilis związanej z 5 kDa PEG ograniczyło moczany w surowicy do niewykrywalnych poziomów u pięciu osób, u których przed wstrzyknięciem stężenie moczanu w surowicy wynosiło 6,2 mg/dl, co mieści się w prawidłowym zakresie. Davis i wsp., (1981). U osób tych zastosowano dodatkowe wstrzyknięcia cztery tygodnie później, lecz ich reakcja nie została opisana. Stosując względnie nisko czułe oznaczenie dyfuzji w żelu, po drugim (i ostatnim) zastrzyku nie wykryto przeciwciał przeciwko urykazie. Publikacja ta nie przedstawia wyników długotrwałego leczenia ludzi lub zwierząt doświadczalnych.
Preparat urykazy z Arthrobacter protoformiae związany z 5 kDa PEG był stosowany do czasowego kontrolowania hiperurykemii u pojedynczego pacjenta z chłoniakiem, u którego przed zastrzykiem stężenie moczanu w surowicy wynosiło 15 mg/dl. Chua i wsp., (1998). Z uwagi na poważny stan pacjenta i krótki czas leczenia (cztery zastrzyki w ciągu 14 dni) oszacowanie długotrwałej skuteczności lub bezpieczeństwa koniugatu nie było możliwe.
W niniejszym zgłoszeniu określenie „immunogenny” odnosi się do wywoływania odpowiedzi odpornościowej przez wstrzyknięcie preparatu urykazy zmodyfikowanej PEG lub niezmodyfikowanej (antygen), podczas gdy „antygenowość” określa reakcję antygenu z wcześniej istniejącymi przeciwciałami. Łącznie antygenowość i immunogenność określane są jako „immunoreaktywność”. We wcześniejszych badaniach różnymi metodami oceniano immunoreaktywność urykazy zmodyfikowanej PEG, w tym przez: 1) reakcję in vitro urykazy zmodyfikowanej PEG z wcześniej uzyskanymi przeciwciałami; 2) pomiar indukcji syntezy przeciwciała; oraz 3) przyśpieszenie poziomu usuwania po kolejnych wstrzyknięciach.
Wcześniejsze próby wykluczenia immunogenności urykaz pochodzących z szeregu źródeł, przez przyłączenie szeregu łańcuchów PEG za pośrednictwem różnorodnych łączników, zakończyły się umiarkowanym powodzeniem. Urykaza zmodyfikowana PEG była po raz pierwszy ujawniona przez FF Davis i przez Y Inada i ich współpracowników. Davis i wsp., (1978); Patent U.S. 4179337; Nishimura i wsp., (1979); Patenty japońskie 55-99189 i 62-55079. Koniugat ujawniony w patencie '337 był syntetyzowany przez poddanie urykazy o nieokreślonym pochodzeniu reakcji z 2000-krotnym molarnym nadmiarem PEG o masie 750 Daltonów, z jednoczesnym wskazaniem, że duża liczba cząsteczek polimeru była prawdopodobnie przyłączona do każdej cząsteczki urykazy. W opisie patentowym '337 ujawniono przyłączenie PEG albo poli(glikolu propylenowego) o masie cząsteczkowej 500 do 20,000 Daltonów, korzystnie około 500 do 5000 Daltonów, w celu dostarczenia aktywnych, rozpuszczalnych w wodzie, nieimmunogennych koniugatów różnych hormonów polipeptydowych i enzymów, łącznie z oksydoreduktazą, której jednym z trzech przykładów była urykaza. Ponadto patent '337 kładzie nacisk na przyłączenie 10 do 100 łańcuchów polimeru do cząsteczki enzymu i zachowania przynajmniej 40% aktywności enzymatycznej. Nie przedstawiono wyników eksperymentalnych dotyczących stopnia sprzęgania PEG do dostępnych grup aminowych urykazy, zachowanej specyficznej aktywności rozkładania kwasu moczowego lub immunoreaktywności koniugatu.
Dane z 13 prac dotyczących modyfikacji urykazy PEG są podsumowane w Tabeli 1. Niektóre z tych wyników są również przedstawione graficznie na Fig. 1A-2B. Siedem z tych publikacji opisuje
PL 202 799 B1 znaczące zmniejszenie aktywności rozkładania kwasu moczowego, mierzonej in vitro, spowodowanej przyłączeniem różnej liczby łańcuchów PEG do urykazy z Candida utilis. Przyłączenie dużej liczby łańcuchów PEG o masie 5 kDa do urykazy z wątroby świni daje podobne wyniki, jak to opisano w obu publikacjach Chen i w wystąpieniu na sympozjum tej samej grupy. Chen, i wsp., (1981); Davis i wsp., (1978).
Wśród badań podsumowanych w Tabeli 1 immunoreaktywność urykazy modyfikowanej PEG była zmniejszona w przypadku siedmiu i wyeliminowania w przypadku pięciu z nich. W trzech z pięciu późniejszych badań, wyeliminowanie immunoreaktywności wiązało się ze znacznym zmniejszeniem aktywności rozkładania kwasu moczowego - do maksymalnie 15%, 28% lub 45% aktywności początkowej. Nishimura i wsp., (1979) (15% aktywności); Chen i wsp., (1981) (28% aktywności); Nishimura i wsp., (1981) (45% aktywności). W czwartej publikacji donoszono o przyłączeniu PEG do 61% dostępnych reszt lizyny, lecz nie oceniono zachowanej specyficznej aktywności. Abuchowski i wsp., (1981). Jednakowoż zespół badawczy, w którego skład wchodzili dwaj z wyżej wymienieni naukowcy, stosując te same metody, donosił niezależnie, że ten zakres przyłączania pozostawia jedynie 23-28% aktywności. Chen i wsp., (1981). Publikacje z 1981 roku Abuchowski i wsp., i Chen i wsp., wykazują, że aby zasadniczo ograniczyć immunogenność urykazy, PEG musi być związany z około 60% dostępnych lizyn (Tabela 1). Piąta publikacja, w której donoszono o usunięciu immunoreaktywności urykazy nie ujawniła stopnia przyłączenia PEG, zachowanej aktywności rozkładania kwasu moczowego lub charakteru przyłączenia PEG-białko. Veronese FM, i wsp., (1997) w JM Harris, i wsp., (red.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (str. 182 -192) Waszyngton DC; American Chemical Society.
Sprzęganie PEG do mniejszej części reszt lizynowych urykazy ogranicza, lecz nie wyklucza jej immunoreaktywności u zwierząt doświadczalnych. Tsuji, J, i wsp., (1985) Int J Immunopharmacol 7:725730 (28-45% grup aminowych uległo sprzęganiu); Yasuda, Y, i wsp., (1990) Chem Pharm Bull 38:20532056 (38% grup aminowych uległo sprzęganiu). Zachowana aktywność rozkładania kwasu moczowego odpowiadających adduktów mieściła się w zakresie od <33% (Tsuji i wsp.,) do 60% (Yasuda i wsp.,) wartości wyjściowej. Tsuji i wsp., zsyntetyzowali koniugaty urykaza-PEG z PEG o masie 7,5 kDa i 10 kDa, i dodatkowo PEG o masie 5 kDa. Wszystkie uzyskane koniugaty były w pewnym stopniu immunogenne i antygenowe, równocześnie wykazując ograniczoną aktywność enzymatyczną (Tabela 1; Fig. 1A-1B).
PEGylowane preparaty urykazy z Candida utilis, które były bezpiecznie podawane dwukrotnie każdemu z pięciu ludzi opisano jako te, które zachowały jedynie 11% swojej wyjściowej aktywności. Davis i wsp., (1981). Kilka lat później, urykaza z Arthrobacter protoformiae zmodyfikowana PEG była podawana czterokrotnie jednemu pacjentowi z zaawansowanym chłoniakiem i ostrą hiperurykemią. Chua i wsp., (1988). Podczas gdy zachowana aktywność preparatu enzymu nie była mierzona, Chua i wsp. wskazali na nieobecność przeciwciał przeciwko urykazie w surowicy pacjentów w 26 dni po pierwszym wstrzyknięciu urykazy-PEG, co wykryto stosując enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA).
Jak podsumowano w Tabeli 1, wcześniejsze badania nad urykazą zmodyfikowaną PEG pokazały, że aktywność katalityczna jest znacząco zmniejszona przez przyłączenie dostatecznej liczby łańcuchów PEG w celu zasadniczego zmniejszenia immunoreaktywności. Ponadto, większość wcześniejszych preparatów urykazy-PEG syntetyzowano z zastosowaniem PEG, który był aktywowany chlorkiem cyjanurowym, pochodną triazyny (2,4,6-trichloro-1,3,5-triazyna), co jak wykazano wprowadziło nowe determinanty antygenowe i wywołało tworzenie przeciwciał u królików. Tsuji i wsp., (1985).
T a b e l a 1
Charakterystyka urykaz-PEG z wcześniejszych badań
| Źródło urykazy | Wiązanie sprzęgające | Masa cząsteczkowa PEG (kDa) | Procent lizyn związanych z PEG | Zachowana aktywność rozkładania kwasu moczowego (%) | Antygenowość lub immunogenność, komentarze | Literatura |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Nie podano | Azydek | 0,7 (diol) | Nie podano | Nie podano | Nie podano | Patent U.S. 4179337 |
PL 202 799 B1 ciąg dalszy tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Candida utilis | Triazyna (chlorek cyjanu- rowy) | 5 | % z | Antygenowość z surowicą królika (% antygenowości niezmodyfikowanego enzymu) | Nishimura I wsp., 1979 | |
| „98” | ||||||
| 20 | 31 | 70% | ||||
| 26 | 21 | 6% | ||||
| 43 | 15 | 0 | ||||
| 48 | 5 | 0 | ||||
| Candida utilis | PEG2 triazyna | 2 x 5 | 22 25 | 87 70 | 86% 49% | Nishimura i wsp., 1981 |
| 36 | 45 | 0 | ||||
| 46 | 31 | 0 | ||||
| 50 | 27 | 0 | ||||
| Candida utilis | Triazyna | 5 | 71 | 11 | Pięciu mężczyzn tolerowało dwa zastrzyki w ciągu 30 dni | Davis, i wsp., 1981 |
| Candida utilis | Triazyna, według Chen, | 5 | 49 | Nie podano | U ptaków immunogenność podobna do natywnej urykazy | Abuchowski i wsp., 1981 |
| i wsp., 1981 | 61 | Nie podano | Immunogenność ujemna | |||
| Wątroba świni | Triazyna | 5 | 37 | 60 | Przyśpieszone usuwanie u myszy | Chen, i wsp., 1981 |
| 47 | 45 | „ | ||||
| 58 | 28 | Stałe usuwanie (półokres ok. 8 godzin) | ||||
| Candida utilis | Triazyna | 5 | 57 | 23 | Stałe usuwanie (półokres ok. 8 godzin) | |
| Candida utilis | Triazyna, według Chen, i wsp, 1981 | 5 | 35 70 | Nie podano Nie podano | PEG zmniejsza immunogenność u królików | Savoca, KV, i wsp. (1984) Int Arch Allergy Appl Immunol 75:58-67 |
| Candida utilis | T riazyna | 5 | Nie podano | Nie podano | PEG-urykazę podano kurczakowi doustnie w liposomach (jednokrotnie). | Nishida, Y, i wsp, (1984) J Pharm Pharmacol 36:354-355 |
PL 202 799 B1 ciąg dalszy tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Candida utilis | T riazyna | 5 7,5 10 | 44 45 28 37 41 45 | 9,4 7,8 32 11 3 7,3 | Ograniczona immunogenność lecz pozytywne u królika (przeciwciała nie dla urykazy, reagują krzyżowo z dysmutazą nadtlenkową PEG) Antygenowość badana przeciwciałami świnki morskiej była ograniczona. | Tsuji, i wsp. 1988 |
| Arthrobacter protoformiae | Nie podano | 5 | Nie podano | Nie podano | Po 26 dniach od pierwszego z czterech wstrzyknięcie urykazy-PEG nie wykryto przeciwciał w teście ELISA | Chua, i wsp. 1988 |
| Candida utilis | PEG2 triazyna | 2 x 5 | 10 12 | 90 89 | Nie podano Nie podano | Yasuda, i wsp, 1990 |
| 15 | 80 | Nie podano | ||||
| 21 | 70 | Nie podano | ||||
| 38 | 60 | Antygenowość badana surowicą królika była zmniejszona o 75% | ||||
| Candida utilis | PEG2 triazyna | 2x5 | 22 | 68 | Pojedynczy zastrzyk, PEG wydłuża półokres trwania, u myszy, z ok. 1 godz. do ok. 8 godz. PEG blokuje usuwanie przez wątrobę, śledzionę i nerki (24 godz. okres badania) | Fujita, i wsp, 1991 |
| Nie podano | PEG | Nie podano | Nie podano | Nie podano | Immunogenność u myszy zmniejszona o 98% (PEG) lub 100%(PEG2) | Veronese, i wsp, 1997 |
| PEG2 Nie określono wiązania | Wskazano, że tak samo jak dla PEG | Nie podano |
Japoński patent 3-148298 dla A Sano i wsp., ujawnia zmodyfikowane białka, w tym urykazę, modyfikowane PEG o masie cząsteczkowej 1-12 kDa, które wykazują ograniczenie antygenowości i „udoskonalone, wydłużone” działanie i sposoby wytwarzania takich derywatyzowanych peptydów. Jednakże brak jest ujawnień w odniesieniu do liczby łańcuchów, oznaczeń enzymatycznych, testów biologicznych lub znaczenia określenia „udoskonalone wydłużone” działanie. Japońskie Patenty 55-99189 i 62-55079, oba dla Y Inada, ujawniają koniugaty urykazy wytworzone odpowiednio z zastosowaniem triazyny-PEG lub triazyny-bis-PEG (określonej w Tabeli 1 jako PEG2). Patrz Nishimura, i wsp., (1979 i 1981). Dla pierwszego rodzaju koniugatów masa cząsteczkowa PEG wynosił a 2 kDa i 5 kDa, podczas gdy w drugim zastosowano jedynie PEG o masie cząsteczkowej 5 kDa. Nishimura i wsp., (1979) donosił o odzyskaniu 15% aktywności rozkładania kwasu moczowego po modyfikacji 43% dostępnych lizyn liniowym PEG o masie 5 kDa, podczas gdy Nishimura i wsp., (1981) donosili o odzyskaniu 31% lub 45% aktywnoś ci rozkł adania kwasu moczowego, po modyfikacji odpowiednio 46% lub 36% lizyn z zastosowaniem PEG2.
Wcześniejsze badania ujawniają, że gdy osiągnięta jest znacząca redukcja immunogenności i/lub antygenowości urykazy przez modyfikację PEG, to jest ona niezmiennie związana z zasadniczą
PL 202 799 B1 utratą aktywności rozkładania kwasu moczowego. Bezpieczeństwo, wygoda i koszt odczynników biofarmaceutycznych są wszystkie negatywnie dotknięte przez zmniejszenie ich mocy, a w efekcie potrzebę podania zwiększonych dawek. Co za tym idzie, istnieje potrzeba bezpiecznej i skutecznej alternatywy w celu obniżania poziomu kwasu moczowego w płynach ciała, w tym w krwi i moczu.
W publikacji Montalbini i wsp., Planta 202: 277-283 (1997) przedstawiono sposób otrzymywania urykazy z liści ciecierzycy (Cicer arietimum), bobu (Vicia faba major) i pszenicy (Triticum aestivum), przy czym głównym etapem oczyszczania urykazy była chromatografia powinowactwa na żelu agarozowo-ksantynowym. Opisane tam wyniki elektroforezy żelowej prowadzonej w warunkach niedenaturyzujących wskazują na uzyskanie urykazy w postaci różnych agregatów, co zostało również potwierdzone w badaniach nad aktywnością enzymatyczną otrzymanej urykazy. W publikacji tej nie dostarczono żadnych danych świadczących o tym, że otrzymana urykaza jest w postaci wolnej od agregatów lub w postaci izolowanej urykazy tetramerycznej.
Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania urykazy w postaci tetramerycznej z roztworu zawierającego wielopodjednostkową postać urykazy, tj. w postaci tetramerów i agregatów urykazy. Sposób według wynalazku obejmuje etapy: nanoszenia roztworu na przynajmniej jedną kolumnę do rozdziału o pH pomiędzy 9 i 10,5, korzystnie 10,2; oraz odzyskiwania frakcji eluatu i identyfikacji tych, które zawierają tetrameryczna postać urykazy, przy czym jedna lub większa liczba frakcji jest zasadniczo wolna od agregatów urykazy. Korzystnie rozdział na kolumnie może być oparty na wymianie jonowej lub rozdziale pod względem wielkości. Można jednak wykorzystywać jakiekolwiek inne skuteczne zasady rozdziału. Sposób może również obejmować analizę frakcji w celu określenia obecności tetramerów urykazy i/lub braku agregatów urykazy. Korzystnie taka analiza może obejmować wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC), inne metody chromatograficzne, rozproszenie światła, wirowanie i/lub elektroforezę. Korzystnie oczyszczona tetrameryczna urykaza może zawierać mniej niż około 10% agregatów urykazy.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowana tetrameryczna urykaza wytworzona sposobem według wynalazku.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają otrzymanie zasadniczo nieimmunogennego koniugatu urykazy z PEG, który zachowuje całą lub prawie całą aktywność rozkładania kwasu moczowego niezmodyfikowanego enzymu.
Urykaza poddana rozdziałowi w sposobie według wynalazku może być urykazą rekombinowaną. Niezależnie od tego czy jest rekombinowana czy też nie, urykaza może pochodzić od ssaka. Urykaza może być urykazą wątrobową świni, wołu lub owcy. Urykaza może też być białkiem chimerowym. Chimerowa urykaza może zawierać część urykazy z wątroby świni i/lub wątroby pawiana. Przykładowo chimerowa urykaza może być chimerową urykazą świnia-pawian (urykaza PBC) lub świńską urykazą zawierającą mutacje R291K i T301S (urykaza PKS) (patrz sekwencje z Fig. 6 i wyniki badań fizjologicznych i immunologicznych z Fig. 7-12). Alternatywnie urykaza może pochodzić z wątroby pawiana, przy czym tyrozynę 97 zastąpiono histydyną, a co za tym idzie specyficzna aktywność urykazy może być zwiększona o przynajmniej 60%. Urykaza poddana rozdziałowi w sposobie według wynalazku, niezależnie od pochodzenia, może również być w postaci skróconej, zarówno na końcu aminowym lub końcu karboksylowym, lub na obu końcach. Podobnie urykaza może być urykazą grzybową lub pochodzącą z mikroorganizmu. Urykaza grzybowa lub pochodząca z mikroorganizmu, może być występującą naturalnie lub rekombinowaną urykazą z Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis lub Candida utilis. Alternatywnie urykaza może pochodzić od bezkręgowca, tak jak przykładowo, występująca w naturze lub rekombinowana urykaza z Drosophila melanogaster lub Drosophila pseudoobscura. Urykaza, może być również urykazą roślinną, przykładowo występującą naturalnie lub rekombinowaną urykazą z brodawek korzeniowych soi (Glycine max). Gdy urykaza jest w zrekombinowanej postaci, którejkolwiek ze wspomnianych tu urykaz, postać zrekombinowana może mieć zasadniczo sekwencję postaci występującej w naturze.
Urykaza tetrameryczna otrzymana sposobem według wynalazku może być koniugowana z PEG (urykaza-PEG) i stosowana wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem w kompozycji farmaceutycznej do obniżania poziomu kwasu moczowego w płynach ciała.
Niniejszym opisano również sposób obniżania poziomu kwasu moczowego przez podanie ssakowi otrzymanego z urykazy wyizolowanej sposobem według wynalazku koniugatu urykaza-PEG, który skutecznie obniża poziom kwasu moczowego. W koniugacie urykaza-PEG każda podjednostka może być kowalencyjnie połączona ze średnio 2 do 10 łańcuchami liniowego lub rozgałęzionego PEG, a każda cząsteczka PEG może mieć masę cząsteczkową pomiędzy około 5 kDa i 100 kDa. Ssakiem
PL 202 799 B1 może być człowiek, a etap podania może być przykładowo realizowany przez zastrzyk dożylny, doskórny, podskórny, domięśniowy lub dootrzewnowy, lub jak inhalacja preparatów aerozolowych. Podwyższony poziom kwasu moczowego we krwi, moczu i/lub innych płynach ciała lub tkankach i może być związany ze skazą moczanową, guzkami dnawymi, niewydolnością nerek, przeszczepem narządu lub chorobą o charakterze złośliwym.
Krótki opis figur
Fig. 1A przedstawia zachowanie aktywności urykazy z Candida utilis zmodyfikowanej PEG w funkcji liczby łań cuchów przyłączonego PEG na podjednostkę.
Fig. 1B przedstawia zachowanie aktywności urykazy z Candida utilis zmodyfikowanej PEG w funkcji cał kowitej masy przyłączonego PEG na podjednostkę .
Fig. 2A przedstawia zachowanie aktywności urykazy z wątroby świni zmodyfikowanej PEG w funkcji liczby ł a ń cuchów przyłączonego PEG na podjednostkę .
Fig. 2B przedstawia zachowanie aktywności urykazy z wątroby świni zmodyfikowanej PEG w funkcji cał kowitej masy przyłączonego PEG na podjednostkę .
Fig. 3A przedstawia zachowanie aktywności chimerowej urykazy świnia-pawian (PBC) zmodyfikowanej PEG w funkcji liczby łańcuchów przyłączonego PEG na podjednostkę.
Fig. 3B przedstawia zachowanie aktywności chimerowej urykazy świnia-pawian (PBC) zmodyfikowanej PEG w funkcji całkowitej masy przyłączonego PEG na podjednostkę.
Fig 4A przedstawia zachowanie aktywności urykazy z Aspergillus flavus zmodyfikowanej PEG w funkcji liczby ł a ń cuchów przyłączonego PEG na podjednostkę .
Fig. 4B przedstawia zachowanie aktywności urykazy z Aspergillus flavus zmodyfikowanej PEG w funkcji cał kowitej masy przyłączonego PEG na podjednostkę .
Fig. 5A przedstawia zachowanie aktywności rekombinowanej urykazy z brodawek korzeniowych soi zmodyfikowanej PEG w funkcji liczby łańcuchów przyłączonego PEG na podjednostkę.
Fig. 5B przedstawia zachowanie aktywności rekombinowanej urykazy z brodawek korzeniowych soi zmodyfikowanej PEG w funkcji całkowitej masy przyłączonego PEG na podjednostkę.
Fig. 6 przedstawia wydedukowaną sekwencję aminokwasową chimerowej urykazy świnia-pawian (urykaza PBC), urykazy PBC, która jest skrócona zarówno na końcu aminowym jak i karboksylowym (PBC-NT-CT) i ś wiń skiej urykazy zawierają cej mutacje R291K i T301S (urykaza PKS), w porównaniu z sekwencjami świńską i pawiana.
Fig. 7 przedstawia aktywność urykazy w surowicy myszy w 24 godziny po podaniu każdego z czterech lub pięciu dootrzewnowych zastrzyków urykazy PBC zmodyfikowanej PEG, w stosunku do wartości uzyskanej w 24 godziny po pierwszym zastrzyku.
Fig. 8 przedstawia odwrotną zależność pomiędzy aktywnością wstrzykniętej urykazy PBC zmodyfikowanej PEG w surowicy myszy z niedoborem urykazy i stężeniami kwasu moczowego w surowicy i moczu.
Fig. 9 przedstawia zmniejszenie ciężkości zaburzenia zagęszczania moczu u myszy z niedoborem urykazy (uox-/-), które były leczone urykazą PBC zmodyfikowaną PEG.
Fig. 10 przedstawia zmniejszenie ostrości przebiegu zespołu kłębuszkowej moczówki prostej u myszy z niedoborem urykazy (uox-/-), które był y leczone urykaz ą PBC zmodyfikowaną PEG.
Fig. 11 przedstawia zmniejszenie ostrości przebiegu zespołu nefropatii indukowanej przez kwas moczowy, co uwidoczniono przez mikroskopię rezonansu magnetycznego, u myszy z niedoborem urykazy (uox-/-), które były leczone urykazą PBC zmodyfikowaną PEG.
Fig. 12 przedstawia przyspieszone usuwanie z krążenia myszy BALB/c wstrzykniętego oktameru urykazy PBC w porównaniu z tetramerem, gdzie oba były związane z 5-6 10 kDa łańcuchami PEG na podjednostkę.
Szczegółowy opis wynalazku
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają otrzymanie udoskonalonych koniugatów rozpuszczalnych w wodzie polimerów, korzystnie poli(glikoli etylenowych) lub poli(tlenków etylenu) z urykazami. Koniugaty te są zasadniczo nieimmunogenne i zachowują co najmniej 75%, korzystnie 85% i najkorzystniej 95% lub większą aktywność rozkładania kwasu moczowego niezmodyfikowanego enzymu. Urykazy otrzymywane sposobem według wynalazku, które mogą być koniugowane z rozpuszczalnymi w wodzie polimerami, obejmują naturalnie wystę pujące oksydazy moczanowe izolowane z bakterii, grzybów i tkanek roślin i zwierząt, zarówno kręgowców jak i bezkręgowców, jak również rekombinowane postacie urykazy, łącznie ze zmutowanymi, hybrydowymi i/lub skróconymi enzymatycznie aktywnymi wariantami urykazy. Rozpuszczalne w wodzie polimery obejmują liniowe
PL 202 799 B1 i rozgałęzione poli(glikole etylenowe) lub poli(tlenki etylenu), wszystkie powszechnie znane jako PEG. Przykłady rozgałęzionych PEG są przedmiotem patentu U.S. 5643575. Przykładem liniowego PEG jest monometoksyPEG o ogólnym wzorze CH3O-(CH2CH2O)nH, w którym n przyjmuje wartość od około 100 do około 2300.
Urykazą ssaczą może być rekombinowana chimerowa urykaza świnia-pawian, zbudowana z części sekwencji urykazy z wą troby świni i urykazy z wą troby pawiana, z których obie po raz pierwszy zostały określone przez Wu i wsp., (1989). Jeden przykład takiej chimerowej urykazy zawiera pierwsze 225 aminokwasów z sekwencji urykazy świni (SEK NR ID: 1) i ostatnie 79 aminokwasów z sekwencji urykazy pawiana (SEK NR ID: 2) (urykaza ś winia-pawian lub urykaza PBC; patrz Fig. 6). Kolejny przykład takiej chimerowej urykazy zawiera reszty 7-225 sekwencji świni (SEK NR ID: 1) i reszty 226-301 z sekwencji pawiana (SEK NR ID: 2); jest ona równoważnikiem urykazy PBC, która jest skrócona zarówno na aminowym, jak i karboksylowym końcu (PBC-NT-CT; patrz Fig. 6). Kolejny przykład takiej chimerowej urykazy zawiera pierwsze 288 aminokwasów z sekwencji świni (SEK NR ID: 1) i ostatnie 16 aminokwasów z sekwencji pawiana (SEK NR ID: 2). Ponieważ ta ostatnia sekwencja różni się od sekwencji świńskiej tylko w dwóch pozycjach - z lizyną (K) zamiast argininy w pozycji 291 oraz seryną (S) zamiast treoniny w pozycji 301, mutant ten jest określony jako świnia-K-S lub urykaza PKS. Każda z urykaz PKS, PBC i PBC-NT-CT posiada jedną lizynę więcej, a co za tym idzie jedno więcej potencjalne miejsce modyfikacji przez PEG, niż sekwencja świńska jak i pawiana.
Sekwencje cDNA dla różnych ssaczych urykaz, włącznie z urykazą PBC, urykazą PKS i rekombinowaną urykazą typu urykazy pawiana, zosta ł y sklonowane, a optymalne warunki dla ekspresji w E. coli określono standardowymi metodami. Patrz Erlich, HA, (red.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification, Nowy Jork: Stockton Press; Sambrook, J, i wsp., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Rekombinowane urykazy ekstrahowano i oczyszczano, a ich stabilność i aktywność oznaczano przy pomocy zmodyfikowanych i standartowych testów. Patrz Fridovich, I, (1965) J Biol Chem 240: 2491-2494; Nishimura i wsp., (1979) oraz Przykład 1.
Urykaza może być skoniugowana za pośrednictwem biologicznie stabilnego, nietoksycznego, kowalencyjnego wiązania ze względnie niewielką liczbą łańcuchów PEG. Wiązania takie mogą obejmować wiązania uretanowe (karbaminianowe), drugorzędowe wiązania aminowe i wiązania amidowe. Różnorodne aktywowane PEG stosowne dla tego rodzaju koniugacji są dostępne na rynku z Shearwater Polymers, Hundsville, AL.
Przykładowo, wiązania uretanowe z urykazą mogą być wytworzone przez inkubację urykazy w obecnoś ci pochodnych PEG modyfikowanych w ę glanem sukcynoimidylowym (SC) lub wę glanem 4-nitrofenylowym (NPC). SC-PEG może być syntetyzowany z zastosowaniem procedury opisanej w Patencie U.S. 5612460, który jest włączony tu na drodze odniesienia. NPC-PEG moż e być zsyntetyzowany przez reakcję PEG z chloromrówczanem 4-nitrofenylu zgodnie ze sposobami opisanymi w Veronese, FM, i wsp., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11: 141-152 i w patencie U.S. 5286637, które są włączone niniejszym na drodze odniesienia. Sposoby opisane w patencie '637 są przystosowane dla PEG o większej masie cząsteczkowej przez dopasowanie stężeń reagentów, aby zachować podobną stechiometrię. Alternatywnie sposób syntezy NPC-PEG jest opisany przez Biittner, W, i wsp. we wschodnioniemieckim opisie patentowym DD 279 486 A1.
Wiązania amidowe z urykazą mogą być uzyskane z zastosowaniem estru N-hydroksysukcynoimidowego pochodnej karboksylowej PEG z (Shearwater Polymers). Drugorzędowe wiązania amidowe mogą być utworzone z zastosowaniem 2,2,2-trifluoroetanosulfonylu PEG (tresyl PEG; Shearwater Polymers) lub przez redukcyjną alkilację z zastosowaniem aldehydu PEG (Shearwater Polymers) i cyjanoborowodorku sodu.
W koniugatach zawierających PEG o masie cząsteczkowej pomiędzy 5 kDa i 30 kDa, maksymalna liczba łańcuchów PEG, która została przyłączona do podjednostki, przy zachowaniu co najmniej 75% aktywności rozkładania kwasu moczowego niezmodyfikowanego enzymu, zawierała się w zakresie od średnio dwóch łańcuchów dla urykazy z soi do ponad 10 łańcuchów dla urykazy PBC (patrz warunki testów w Przykładzie 1 i wyniki na Fig 1A - 5B), przy czym górna granica tego zakresu PEGylacji odpowiada około jednej trzeciej wszystkich grup aminowych. Średnia liczba łańcuchów PEG, które mogą być przyłączone do podjednostki urykazy wynosi od 2 do 10, korzystnie od 3 do 8, a korzystniej od 4 do 6. Masa cząsteczkowa PEG stosowanego w reakcji sprzęgania może wynosić pomiędzy 5 kDa i 100 kDa, korzystnie pomiędzy 10 kDa i 60 kDa, a korzystniej pomiędzy 20 kDa i 40 kDa, tak jak, na przykład, 30 kDa.
PL 202 799 B1
Istnieje kilka czynników, które mogą wpływać na wybór optymalnej masy cząsteczkowej i liczby łańcuchów PEG do przyłączenia do danej postaci urykazy. Ogólnie ograniczenie lub wyeliminowanie immunogenności bez zasadniczej utraty aktywności rozkładania kwasu moczowego może wymagać przyłączenia stosunkowo większej ilości łańcuchów PEG o niższej masie cząsteczkowej, w porównaniu do stosunkowo mniejszej liczby łańcuchów PEG o wyższej masie cząsteczkowej. Przykładowo, zarówno sześć 20 kDa łańcuchów PEG na podjednostkę lub cztery 30 kDa łańcuchy PEG na podjednostkę mogą być optymalnie skuteczne. Podobnie, każda inna postać urykazy może mieć inne optimum w odniesieniu do wielkości i liczby łańcuchów. Patrz Fig. 1A-5B.
Koniugacja z PEG czyni wszystkie badane urykazy rozpuszczalnymi i trwałymi w buforach o fizjologicznym pH, bez konieczności dodawania analogu substratu lub inhibitora, takiego jak 8-azaksantyna, który jest stosowany jako stabilizator dla grzybowej urykazy (Uricozyme®) wprowadzanej na rynek we Francji i Włoszech przez Sanofi Winthrop. Dwa różne koniugaty urykazy PBC, jeden zawierający około sześciu 10 kDa łańcuchów PEG na podjednostkę i drugi zawierający około dwóch 19 kDa łańcuchów PEG na podjednostkę, zachowują znaczącą aktywność po inkubacji w mysiej surowicy przez ponad miesiąc w 37°C. Dodatkowo szereg koniugatów z urykazą otrzymaną zgodnie ze sposobem według wynalazku posiada półokres krążenia u myszy większy niż dwa dni w przeciwieństwie do około 8 lub 24 godzinnego półokresu trwania, o którym wcześniej donoszono dla modyfikowanych PEG urykaz ssaczych i z mikroorganizmów. Chen i wsp., (1981); Fuertges, F, i wsp., (1990) J Contr Release 11: 139-148; Fujita, T, i wsp., (1991) J Pharmacobiodyn 14: 623-629. Dłuższy półokres trwania wstrzykiwanych leków białkowych czyni je bardziej efektywnymi cenowo i może sprzyjać stosowaniu się pacjenta do wskazówek przyjmowania leku. Wydłużony półokres trwania jest również charakterystyczny dla produktów, które są lepiej tolerowane przez organizm.
Gdy koniugaty PEG z urykazą PBC są przygotowane z izolowanej według wynalazku tetramerycznej postaci enzymu (4 podjednostki 35 kDa), wykazują one u myszy znacząco ograniczoną immunogenność (Fig. 7), w przeciwieństwie do umiarkowanej immunogenności koniugatów PEG z większymi postaciami enzymów (np. oktamerami 35 kDa podjednostek; patrz Fig. 12) i do bardzo wysokiej immunogenności niezmodyfikowanego enzymu. Powtarzane nastrzykiwanie myszy z niedoborem urykazy urykazą-PEG, wytworzoną z urykazy otrzymanej zgodnie ze sposobem według wynalazku, wyklucza występowanie u nich hiperurykemii na więcej niż dwa miesiące oraz chroni strukturę i funkcję ich nerek przed uszkodzeniami spowodowanymi kwasem moczowym (Fig. 8-11).
Wstrzyknięcie całkowicie aktywnych koniugatów PBC urykazy z PEG 10 kDa (Fig. 3A-3B) dramatycznie ogranicza hiperurykemię u homozygotycznych myszy z niedoborem urykazy (Fig. 8). Również dramatycznej redukcji uległ poziom kwasu moczowego w moczu u wszystkich myszy z niedoborem urykazy, które były poddane działaniu urykazy PBC zmodyfikowanej PEG. Myszy z niedoborem urykazy otrzymały serię zastrzyków z preparatu urykazy-PEG podobną do stosowanej w celu uzyskania wyników z Fig. 8. Takie leczenie ogranicza ciężkość zaburzenia zagęszczania moczu, co przedstawiono przez pomiar osmolalności moczu, w normalnych warunkach i po 12 godzinnym okresie niepodawania wody (Fig. 9) oraz przez określenie konsumpcji wody i wydalania moczu (Fig. 10), w porównaniu do równoległego pomiaru dokonanego na nieleczonych, genetycznie podobnych myszach. Pokazano również, że 10 tygodniowy okres leczenia, poczynając od pierwszych 10 dni życia, homozygotycznych myszy z niedoborem urykazy w wyniku „nokautu” genowego (uox -/-), przy pomocy urykazy-PEG otrzymanej z urykazy według wynalazku, zmniejsza ostrość indukowanych moczanem uszkodzeń struktury nerki, co uwidoczniono przez mikroskopię rezonansu magnetycznego (Fig. 11). Metody mikroskopowe zostały omówione w Hedlund, LW, i wsp., (1991) Fund Appl Toxicol 16: 787-797; Johnson, GA, i wsp., (1992) w JC Gore (red.), Reviews of Magnetic Resonance in Medicine, tom 4 (str. 187-219) Nowy Jork: Pergamon Press.
Oczyszczone preparaty naturalnej i zrekombinowanej urykazy zawierają zazwyczaj, poza postacią tetrameryczną (140 kDa), mieszaninę agregatów enzymu. Procent zawartości formy tetramerycznej w każdym z preparatów urykazy ogólnie waha się od około 20% do 90%. Pomimo danych, że niezmodyfikowane PEG agregaty szeregu innych białek są wysoce immunogenne (patrz np., Moore, WV, i wsp., (1980) J Clin Endocrinol Metab 51: 691-697), wcześniejsze badania urykazy-PEG nie wykazały jakichkolwiek ograniczeń w zawartości agregatów, co sugeruje, że nie była rozważana potencjalna immunogenność agregatów zmodyfikowanych PEG. Na podstawie obserwacji twórców wynalazku wydaje się prawdopodobnym, że takie agregaty były obecne w preparatach enzymu użytych we wcześniejszych syntezach urykazy-PEG. Ich obecność utrudniała wytworzenie nieimmunogennych koniugatów. Wydaje się również, że znaczna utrata aktywności rozkładania kwasu moczowego obPL 202 799 B1 serwowana we wcześniejszych próbach modyfikowania urykazy PEG była związana z dużą liczbą przyłączanych łańcuchów PEG o niskiej masie cząsteczkowej. Z drugiej strony sposób oczyszczania urykazy według wynalazku i opisany niniejszym sposób PEGylacji pozwalają na kowalencyjne przyłączenie aż dziesięciu łańcuchów PEG do podjednostki przy jednoczesnym zachowaniu ponad 75% aktywności rozkładania kwasu moczowego, przynajmniej dla określonych urykaz, np. chimerowej urykazy świnia-pawian i enzymu z A. flavus (patrz Fig. 3A i 4A).
W korzystnej postaci zasadniczo wszystkie agregaty formy tetramerycznej enzymu mogą być usunięte przez chromatografię jonowymienną lub wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek przy pH pomiędzy około 9 i 10,5, korzystnie 10,2, co daje preparat urykazy złożony zasadniczo z tetramerów. Masa molekularna urykazy w każdej frakcji z preparatywnej kolumny może być monitorowana przy pomocy technik analitycznych różnicujących pod względem wielkości, w tym przykładowo HPLC, tradycyjnej chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, wirowania, rozpraszania światła, elektroforezy kapilarnej lub elektroforezy żelowej w buforze niedenaturyzującym. Podczas izolacji tetramerycznej urykazy przy pomocy chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek jedynie frakcje zawierające postać enzymu 140 kDa mogą być łączone i stosowane do koniugacji z PEG. W przypadku tetramerycznych postaci urykazy izolowanych przez chromatografię jonowymienną, frakcje z kolumny jonowymiennej mogą być analizowane pod kątem wielkości, w celu określenia, która z frakcji zawiera istotną ilość postaci tetramerycznej bez wykrywalnych ilości agregatów. W takich połączonych frakcjach urykazy co najmniej 90% może być w postaci tetramerycznej; w ten sposób niepożądane agregaty mogą stanowić jedynie tak niewiele, jak 10%, 5%, 2% lub mniej całkowitej, wyizolowanej urykazy.
Przedstawione tu wyniki wskazują, że większe niż tetrameryczne postaci urykazy PBC, nawet modyfikowane PEG w dużym stopniu, są wysoce immunogenne u myszy (Fig. 12). Ponadto, u myszy, które były raz nastrzyknięte koniugatami PEG agregatów urykazy, aktywność rozkładania kwasu moczowego po kolejnym nastrzyknięciu zarówno modyfikowanymi PEG tetramerami lub modyfikowanymi PEG agregatami była gwałtownie usuwana z układu krążenia. Przeciwnie, koniugaty przygotowane z urykazy zawierającej mniej niż 5% agregatów mogły być wstrzykiwane wielokrotnie bez jakiegokolwiek zwiększenia szybkości ich usuwania (Fig. 7) i bez wykrywalnego tworzenia przeciwciał, co zmierzono przez czuły test immunoenzymatyczny. Zastosowanie wysoko oczyszczonej tetramerycznej urykazy otrzymanej zgodnie ze sposobem według wynalazku wyróżnia opisane niniejszym koniugaty od wcześniej znanych preparatów urykazy-PEG. Obecność znaczącej części (np. więcej niż 10%) agregatów w preparatach urykazy stosowanych we wcześniejszych badaniach może prowadzić do przyłączenia do nich dużej liczby łańcuchów PEG, w celu zahamowania immunogenności. W konsekwencji zasadniczemu zmniejszeniu ulegała aktywność enzymatyczna uzyskiwanych koniugatów. Niniejszym opisane zostały również urykazy zmodyfikowane PEG w nietetramerycznych postaciach, takich jak przykładowo dimery urykazy, przy czym preparaty takich koniugatów urykazy zachowują, co najmniej około 75% aktywności rozkładania kwasu moczowego i są zasadniczo nieimmunogenne.
W poniższych przykładach udokumentowano również, że zmieniona przez mutację urykaza z wątroby pawiana wykazuje nieoczekiwanie zwiększoną aktywność względem niezmutowanego enzymu. Taka ulepszona urykaza z naczelnego została przygotowana tradycyjnymi technikami rekombinacji DNA. Szczególnie nieoczekiwanym było to, że podstawienie pojedynczego aminokwasu (histydyny za tyrozynę w pozycji 97) w urykazie pawiana daje w wyniku zasadnicze zwiększenie specyficznej aktywności enzymatycznej. Gdy to zmienione przez mutacje białko jest wyrażane w E. coli wykazuje o co najmniej 60% wyższą aktywność enzymatyczną, niż rekombinowany enzym pawiana, od którego pochodzi.
Aktywność specyficzna jest zwiększana i/lub rozpuszczalność niemodyfikowanego PEG enzymu jest poprawiona przez ekspresję skróconych wariantów świńskiej lub chimerowej urykazy świnia-pawian, z której co najmniej 6 pierwszych aminokwasów z końca aminowego i/lub co najmniej 3 aminokwasy z końca karboksylowego są usunięte z wyrażanego białka (patrz Fig. 6). Rekombinowana urykaza skrócona na końcu karboksylowym może być lepiej rozpuszczalna przed modyfikacją PEG, ponieważ usuwana jest sekwencja nakierowywująca na peroksysomy. Patrz Miura, S, i wsp., (1994) Eur J Biochem 223: 141-146.
Ujawnione w niniejszym opisie koniugaty urykaza-PEG są użyteczne do obniżania poziomu kwasu moczowego w płynach ciała i tkankach ssaków, korzystnie ludzi, i co za tym idzie mogą być stosowane do leczenia podwyższonego poziomu kwasu moczowego związanego ze stanami obejmu12
PL 202 799 B1 jącymi skazę moczanową, guzki dnawe, niewydolność nerek, przeszczep organu i choroby o charakterze złośliwym. Koniugaty urykaza-PEG mogą być wstrzyknięte ssakowi z podwyższonym poziomem kwasu moczowego jakąkolwiek z dróg podania, w tym drogą dożylną, podskórną, śródskórną, domięśniową i dootrzewnową. Alternatywnie, mogą być one rozpylone i inhalowane. Patrz Patton, JS, (1996) Adv Drug Delivery Rev 19:3-36 i Patent U.S. 5458135. Skuteczna dawka urykazy-PEG będzie zależała od poziomu kwasu moczowego i wielkości osobnika. Koniugat urykaza-PEG jest podawany z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką lub rozcieńczalnikiem w ilości od około 10 μg do około 1 g, korzystnie od 100 μg do 500 mg, a korzystniej w ilości od 1 mg do 100 mg, na przykład, w ilości 5 mg, 20 mg lub 50 mg. Podane powyżej dawki odnoszą się do ilości białka w koniugacie.
Preparaty farmaceutyczne zawierające urykazę-PEG mogą być przygotowane tradycyjnymi technikami np. jak to opisano w Gennaro, AR (red.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 wydanie, Easton, PA: Mack Publishing Co. Użyteczne zaróbki do przygotowania nadającego się do wstrzyknięcia roztworu obejmują przykładowo buforowany fosforanem roztwór soli, roztwór Ringera z dodatkiem mleczanów, wodę, poliole oraz glicerol. Farmaceutyczna kompozycja do podania dootrzewnowego obejmuje farmaceutycznie dopuszczalne, sterylne, wodne lub niewodne ciecze, dyspersje, zawiesiny lub emulsje, jak również jałowe pudry do rekonstytucji, bezpośrednio przez użyciem, do postaci jałowych, nadających się do wstrzyknięcia roztworów lub dyspersji. Takie preparaty mogą zawierać dodatkowe składniki, takie jak przykładowo środki konserwujące, substancje ułatwiające rozpuszczanie, substancje stabilizujące, czynniki zwilżające, emulgatory, bufory, przeciwutleniacze i rozcieńczalniki.
Urykaza-PEG może być również dostarczona jako kompozycja uwalniana w sposób kontrolowany do wszczepienia osobnikowi celem ciągłego kontrolowania podwyższonego poziomu kwasu moczowego w płynach ciała. Polikwas mlekowy, polikwas glikolowy, regenerowany kolagen, poli-L-lizyna, alginian sodu, guma gellan, chitozan, agaroza, wielolamellarne liposomy i inne konwencjonalne preparaty typu depot obejmujące materiały ulegające bioerozji lub biodegradacji mogą być, przykładowo, sformułowane z biologicznie aktywnymi kompozycjami. Materiały te, gdy wszczepione lub wstrzyknięte, stopniowo rozpadają się i uwalniają do otaczających je tkanek aktywny materiał. Przykładowo, jeden sposób enkapsulacji urykazy-PEG obejmuje sposób ujawniony w Patencie U.S. 5653974, który jest włączony niniejszym na drodze odniesienia. Zastosowanie preparatów ulegających bioerozji i biodegradacji oraz innych typu depot jest szczególnie korzystne do podawania koniugatów. W celu dostarczenia urykazy-PEG korzystne jest zastosowanie pomp infuzyjnych i układów do zatrzymywania w macierzy (ang. matrix entrapment system). PEG-urykaza może również być zamknięta w micelach lub liposomach. Technologia enkapsulacji w liposomach jest dobrze znana w dziedzinie. Patrz np. Lasic, D, i wsp., (red.) (1995) Stealth Liposomes, Boca Raton, FL: CRC Press.
Zastosowanie kompozycji farmaceutycznych urykazy-PEG, zmniejszy potrzebę hemodializy u pacjentów o wysokim ryzyku indukowanej moczanami niewydolności nerek np. u biorcy przeszczepu narządu (patrz Venkataseshan, VS, i wsp., (1990) Nephron 56: 317-321) i pacjentów z pewnymi chorobami o charakterze złośliwym. U pacjentów ze znacznym nagromadzeniem krystalicznego moczanu (guzki dnawe), takie kompozycje farmaceutyczne będą poprawiały jakość życia szybciej niż obecnie dostępne sposoby leczenia.
Poniższe przykłady, które nie zostały skonstruowane, aby w jakikolwiek sposób ograniczać wynalazek, ilustrują różne aspekty powyższego ujawnienia. Przykłady te opisują urykazy-PEG wytworzone przez aktywowane sprzęganie (np. elektrofilowe) pochodnych PEG o różnych wielkościach i składzie z występującymi naturalnie urykazami - świńską, grzybową lub bakteryjną, lub ze zrekombinowanymi urykazami - sojową, świńską lub chimerową świnia-pawian. Przedstawiono wyniki badań nad aktywnością, rozpuszczalnością i stabilnością, oraz badań farmakokinetycznych, farmakodynamicznych i immunologicznych. Dane z Fig. 8-11 potwierdzają zdolność urykazy PBC modyfikowanej PEG do zmniejszenia hiperurykemii i hiperurykozurii oraz do ochrony struktury i funkcji nerek w modelu zwierzęcym, w którym hiperurykemia i hiperurykozuria występują powodując poważne uszkodzenie nerek. Wu, X, i wsp., (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 742-746. Przykłady te dostarczają wskazówek osobie o przeciętnych umiejętnościach, jak wytworzyć zasadniczo nieimmunogenne koniugaty urykazy, które zachowują co najmniej około 75% aktywności rozkładania kwasu moczowego nie zmodyfikowanego enzymu.
PL 202 799 B1
P r z y k ł a d 1
Oczyszczanie tetramerycznej postaci urykazy
Tetrameryczna postać urykazy (masa cząsteczkowa około 140 kDa) została oczyszczona z roztworu urykazy z wą troby ś wini przez preparatywną chromatografi ę wykluczania zależ nego od wielkości cząsteczek lub jonowymienną, a następnie analityczną chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek. Urykaza z wątroby świni została otrzymana z Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, nr katalogowy U2350 lub U3377 lub z Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.
Preparatywna i analityczna chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek była prowadzona przy pH 10-10,5, korzystnie 10,2, w 10 mM buforze węglanu sodu zawierającym 0,1 M NaCl na kolumnach Superdex 200, które wcześniej kalibrowano białkiem o znanej masie cząsteczkowej. Superdex otrzymano z Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ. Użyty może być jakikolwiek bufor, który może utrzymać pożądane pH i który jest zgodny ze środowiskiem reakcji chemicznej, która następnie będzie stosowana do przyłączenia PEG. Bufory takie są dobrze znane w dziedzinie. Absorbancję w ultrafiolecie eluatu z preparatywnej kolumny monitorowano przy 280 nm i frakcje zawierające urykazę o masie cząsteczkowej odpowiadającej pożądanej formie tetramerycznej i wolne od indywiduów o wysokiej masie cząsteczkowej zbierano w celu zastosowania w syntezie zasadniczo nieimmunogennej urykazy-PEG, jak to opisano w Przykładzie 2. Alternatywnie tetrameryczne postacie urykazy mogą być izolowane za pomocą innych złóż, na których rozdział zachodzi z uwagi na wielkość cząsteczkową, takich jak przykładowo Superose 12, (Amersham Pharmacia) lub jakiegokolwiek innego złoża, które jest odpowiednie dla łagodnie alkalicznego roztworu i wykazuje odpowiedni zakres frakcjonowania według wielkości. Złoża takie są dostępne od ręki i są dobrze znane w dziedzinie.
Chromatografia jonowymienna była prowadzona przy pH 10-10,5, korzystnie 10,2 na kolumnach Mono Q (Amersham Pharmacia, Piscataway NJ), które równoważono 0,1 M buforem węglanu sodu. Stosowany może być jakikolwiek bufor, który jest zgodny ze środowiskiem reakcji sprzęgania PEG, może utrzymać pożądane pH i być stosowany przy dostatecznie niskiej sile jonowej pozwalającej na adsorpcję urykazy na kolumnie. Bufory takie są dobrze znane w dziedzinie. Absorbancję eluatu w ultrafiolecie monitorowano przy 280 nm podczas elucji urykazy z ż ywicy jonowymiennej przez zwiększanie siły jonowej nanoszonego roztworu buforu, np. stosując liniowy gradient 0-0,5 M NaCl w buforze węglanu sodu. Następnie stosowano HPLC wykluczania zależnego od wielkości czą steczek w celu identyfikacji w eluacie frakcji zawierających pożądaną tetrameryczną postać urykazy bez wykrywalnych agregatów, do syntezy zasadniczo nieimmunogennej urykazy-PEG. Alternatywnie tetrameryczna postać urykazy może być wyizolowana przy pomocy innego nośnika będącego wymieniaczem jonowym, takiego jak Q-Sepharose (Amersham Pharmacia) lub któregokolwiek innego nośnika, który jest odpowiedni dla lekko alkalicznych roztworów. Nośniki takie są dostępne od ręki i dobrze znane w dziedzinie.
Aktywność urykazy oznaczono stosując modyfikację standartowej metody. Patrz, np. Fridovich (1965); Nishimura i wsp., (1979). Codziennie świeżo przygotowywano roztwory kwasu moczowego w 50 mM buforze boranu sodu, pH 9,2, tak aby uzyskać stężenia do oznaczeń 6-150 μΜ. Preparaty urykazy rozpuszczano w buforze boranowym zawierającym albuminę surowicy bydlęcej (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, nr katalogowy A-7030), tak, że w oznaczeniu końcowe stężenie albuminy wynosiło 0,1 mg/ml. Po wymieszaniu różnych rozcieńczeń enzymu z substratem w studzienkach płytki do mikromiareczkowania śledzono w czytniku do płytek przy 292 nm poziom zaniku kwasu moczowego w 25°C wykonując pomiar co 4 sekundy przez 3 minuty. Z próbek dla których w ciągu 3 minut przekształconych zostało pomiędzy 10% i 40% substratu, przynajmniej 20 punktów informatywnych użyto w celu obliczenia maksymalnej szybkości zaniku absorbancji na minutę. Jedna jednostka międzynarodowa (IU) aktywności urykazy jest definiowana jako ilość enzymu, która zużywa jeden mikromol kwasu moczowego w ciągu jednej minuty; aktywność specyficzna jest wyrażona jako IU/mg białka. Pewne dane dla względnej aktywności urykazy podane na Fig. 1A-5B zostały uzyskane w oznaczeniu z 100 μM kwasem moczowym. Inne wyniki dla szybkości przy 100 μM kwasie moczowym (V100) zostały obliczone z wartości stałej Michaelisa (KM) i maksymalnej szybkości (VM) dla reprezentatywnych preparatów enzymu, przy zastosowania wzoru:
V100 = 100 x Vmax/(KM + 100) w którym KM jest wyrażona w jednostkach mikromolarnych.
PL 202 799 B1
P r z y k ł a d 2
Przyłączanie PEG do tetramerycznej urykazy świni
Do roztworu tetramerycznej urykazy w 0,1 M buforze węglanu sodu pH 10,2, dodano 10-200 moli aktywowanej pochodnej monometoksyPEG, np. węglanu 4-nitrofenylu (NPC-PEG) o różnych wielkościach (5 kDa do 30 kDa) na każdy mol podjednostki urykazy (masa cząsteczkowa 35 kDa). Te i inne użytecznie aktywowane PEG są dostępne z Shearwater Polymers. Instrukcje dotyczące przyłączania PEG do białek podano w katalogu Shearwater Polymers w Internecie na stronie www.swpolymers.com i w JM Harris i wsp., (red.) (1997) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680, Waszyngton DC: American Chemical Society. Reakcja przyłączania przebiegała w 0-8°C, aż do momentu, kiedy zakres sprzęgania PEG nie zmieniał się znacząco w czasie. Nieprzereagowany PEG oddzielano od produktów reakcji przez chromatografię i/lub ultrafiltrowanie.
Liczbę łańcuchów przyłączonych do podjednostki urykazy określano stosując dostosowaną metodę opisaną przez Kunitani, M, i wsp., (1991) J Chromatogr 588:125-137; Saifer i wsp., (1997) i Sherman i wsp., (1997). Pokrótce, próbki PEGylacyjnej mieszaniny reakcyjnej lub frakcje z preparatywnej chromatografii jonowymiennej lub wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, charakteryzowano przez analityczny HPLC wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na kolumnie TSK 5000 PWXL w temperaturze pokojowej w 10 mM buforze węglanu sodu, pH 10,2, zawierającym 0,1 M NaCl. Kolumnę HPLC otrzymano z TosoHaas, Montgomeryville, PA. Białka i PEG monitorowano z zastosowaniem absorbancji w ultrafiolecie i detektorów współ czynnika zał amania ś wiatł a. Ilość biał ka w koniugacie obliczano na podstawie absorbancji w ultrafiolecie względem absorbancji odpowiedniego standardu niezmodyfikowanej urykazy. Ilość PEG w koniugacie obliczano na podstawie powierzchni piku współczynnika załamania światła, skorygowanego o wkład białka do współczynnika załamania światłą, względem powierzchni piku współczynnika załamania światła dla standardu odpowiedniego PEG.
Fig. 2A przedstawia zachowanie aktywności urykazy z wątroby świni modyfikowanej PEG w funkcji liczby ł a ń cuchów PEG przyłączonych na podjednostkę . Dane otrzymane przez twórców wynalazku (▲,□) są porównane z danymi Chen i wsp., (1981). Dane w dużych okręgach odnoszą się do koniugatów, dla których Chen i wsp., (1981) donosili, że są nieimmunogenne. Jak przedstawiono na Fig. 2A, koniugaty tetramerycznej urykazy świńskiej z maksymalnie sześcioma 30 kDa łańcuchami PEG na podjednostkę lub maksymalnie siedmioma 5 kDa łańcuchami PEG na podjednostkę zachowują przynajmniej 75% aktywności niezmodyfikowanego enzymu. Obserwowany wzrost aktywności specyficznej wraz ze zwiększającą się liczbą łańcuchów 5 kDa lub 30 kDa PEG (aż do około 4 łańcuchów na podjednostkę) może odpowiadać względnej nierozpuszczalności lub niestabilności niezmodyfikowanego enzymu, w porównaniu z koniugatami. Jak przedstawiono na Fig. 2B, koniugaty urykazy świni średnio z więcej niż trzema 30 kDa łańcuchami PEG na podjednostkę wykazują większą masę PEG niż, jak to stwierdził Chen i wsp., (1981), jest potrzebne, aby wystarczająco zapobiec immunoreaktywności.
P r z y k ł a d 3
Właściwości koniugatów PEG tetramerycznej zrekombinowanej urykazy PBC cDNA zrekombinowanej chimerowej urykazy świnia-pawian (PBC) subklonowano do wektora ekspresyjnego pET3d (Novagen, Madison, WI) i otrzymane konstrukty plazmidowe wprowadzano przez transformację do szczepu Escherichia coli PL21(DE3)pLysS (Novagen). Procedurę tą przeprowadzono stosując sposoby dobrze znane w dziedzinie biologii molekularnej. Patrz Erlich (1989); Sambrook i wsp., (1989); Ausubel, F, i wsp., (red.), (1997) Short Protocols in Molecular Biology, Nowy Jork: Wiley & Sons.
Fig. 6 przedstawia wydedukowaną sekwencję aminokwasową urykazy PBC (aminokwasy 1-225 SEK NR ID: 1 i aminokwasy 226-304 SEK NR ID:2) w porównaniu z sekwencją świni (SEK NR ID:1) i pawiana (SEK NR ID: 2). Pogrubioną czcionką wskazano aminokwasy w sekwencji pawiana, które są inne niż w sekwencji świni. Sekwencje świńska i z pawiana po raz pierwszy zostały określone przez Wu, i wsp., (1989). Sekwencje te zostały potwierdzone przez twórców wynalazku. SEK NR ID: 1 jest identyczna z sekwencją z GenBank o numerze dostępu p16164, z tym wyjątkiem, że w sekwencji z GenBank brak jest początkowej reszty metionylowej. SEK NR ID: 2 jest identyczna z sekwencją dostępną w GenBank pod numerem dostępu p25689, z tym wyjątkiem, że w sekwencji z GenBank nieobecna jest początkowa reszta metionylowa, a histydyna w pozycji 153 jest zamieniona na treoninę (pozycja 154 na Fig. 6).
PL 202 799 B1
Izolowano tetrameryczną postać urykazy PBC i wiązano ją z PEG o różnych masach cząsteczkowych, jak to opisano w Przykładach 1 i 2. Koniugaty przygotowane z PEG 5 kDa, 10 kDa, 19 kDa lub 30 kDa zawierały do 10 łańcuchów PEG na podjednostkę. Te przygotowane z PEG o masie 10 kDa zachowywały ponad 95% wyjściowej aktywności specyficznej zrekombinowanej urykazy (Fig. 3A-3B).
Poniższe właściwości koniugatów tetramerycznej urykazy PBC z około 6 łańcuchami PEG na podjednostkę zilustrowano na podanych figurach.: brak immunogenności (Fig. 7) i skuteczność u myszy z niedoborem urykazy w 1) poprawie hiperurykemii i hiperurykozurii (Fig. 8); 2) zmniejszeniu ciężkości zaburzenia zagęszczania moczu (Fig. 9) i 3) zmniejszeniu ostrości kłębuszkowej moczówki prostej (Fig. 10). Dodatkowo urykaza-PEG zmniejsza ostrość zależnego od kwasu moczowego uszkodzenia nerek, co uwidoczniono przez mikroskopię rezonansu magnetycznego (Fig. 11).
Fig. 7 przedstawia aktywność urykazy PBC w surowicy myszy w 24 godz. po każdym z czterech lub pięciu dootrzewnowych zastrzyków z urykazy-PEG, względem wartości otrzymanej w 24 godz. po pierwszym zastrzyku. Koniugaty PEG przygotowano z trzech różnych preparatów urykazy PBC, stosując dwie różne techniki aktywacji PEG. Jeden preparat (•) testowano na myszach z niedoborem urykazy (uox -/-); dwa inne (Δ, ) testowano na prawidłowych myszach BALB/c. Najbardziej immunoreaktywny preparat (Δ) przygotowano z oczyszczonej urykazy PBC zawierającej nieokreśloną ilość agregatów urykazy do których przyłączono średnio siedem 5 kDa łańcuchów PEG na podjednostkę, stosując pochodną PEG modyfikowaną węglanem sukcynoimidylowym (SC-PEG). Zalipsky, Patent U.S. 5612460, włączony niniejszym na drodze odniesienia. Średnio immunoreaktywne preparaty () zostały przygotowane przez przyłączenie do preparatu urykazy PBC, zawierającego 11% agregatów, średnio dwóch 19 kDa łańcuchów PEG na podjednostkę, z zastosowaniem pochodnej PEG modyfikowanej węglanem 4-nitrofenylowym (NPC-PEG). Sherman i wsp., (1997). Najmniej immunoreaktywny koniugat (•) został przygotowany przez przyłączenie średnio sześciu 10 kDa łańcuchów NPC-PEG na podjednostkę do preparatu urykazy PBC zawierającego <5% agregatów urykazy.
Fig. 8 przedstawia odwrotność zależności pomiędzy stężeniem kwasu moczowego w surowicy i moczu i aktywnością wstrzykniętej urykazy-PEG, w surowicy myszy z niedoborem urykazy (uox -/-). Wstrzykiwano w czasie 0 i po 72 godz. 0,43 IU modyfikowanej PEG urykazy PBC połączonej średnio z sześcioma 10 kDa łańcuchami PEG na podjednostkę enzymu.
Fig. 9 pokazuje, że leczenie myszy z niedoborem urykazy z zastosowaniem urykazy PBC modyfikowanej PEG zmniejszało ciężkość zaburzenia zagęszczania moczu. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe danych dla osmolalności moczu od dwóch myszy posiadających po jednej kopii prawidłowego mysiego genu dla urykazy (uox +/-), sześciu nieleczonych homozygotycznych myszy z niedoborem urykazy (uox -/-) i sześciu homozygotycznych myszy z niedoborem urykazy, które nastrzyknięto dziesięciokrotnie 95 albo 190 mlU urykazy-PEG pomiędzy trzecim i 72 dniem życia. Myszy o każdym podłożu genetycznym albo otrzymywały wodę bez ograniczeń (słupki lite) albo nie otrzymywały wody przez 12 godz. (słupki kreskowane) przed zebraniem moczu.
Fig. 10 pokazuje, że leczenie myszy z niedoborem urykazy przy pomocy modyfikowanej PEG urykazy PBC zmniejszało ostrość kłębuszkowej moczówki prostej, charakteryzującej się anormalnie wysoką konsumpcją wody i anormalnie wysokim wydalaniem moczu. Podłoże genetyczne myszy i protokół postępowania były takie same jak na Fig. 9. Dla trzech grup złożonych z sześciu myszy podano wartości średnie i odchylenie standardowe dziennego spożycia wody (słupki lite) i oddawania moczu (słupki kreskowane).
Fig. 11 pokazuje, że leczenie myszy z niedoborem urykazy za pomocą zmodyfikowanej PEG urykazy PBC obniża ostrość wywoływanej kwasem moczowym nefropatii, co uwidoczniono przez mikroskopię rezonansu magnetycznego. Podłoże genetyczne trzech grup myszy i protokół leczenia były takie same jak na Fig. 9 i 10. Mikroskopię rezonansu magnetycznego przeprowadzono w Center for in vivo Microscopy, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina.
Ponadto do wyników podsumowanych na Fig. 8-11 wykazano, że u wszystkich myszy z niedoborem urykazy poziomy kwasu moczowego w moczu zmniejszyły się znacząco po leczeniu urykaząPBC zmodyfikowaną PEG. Fig. 12 pokazuje, że w odróżnieniu od zmodyfikowanej PEG tetramerycznej postaci urykazy PBC, postać oktameryczna (masa cząsteczkowa = 280 kDa), nawet jeśli silnie zmodyfikowana PEG, jest dla myszy immunogenna. Właściwość ta znajduje odbicie w przyśpieszonym usuwaniu oktameru zmodyfikowanego PEG w ciągu 5 dni po pojedynczym wstrzyknięciu dootrzewnowym. Te same myszy zostały ponownie nastrzyknięte taką samą dawką preparatów urykazy-PEG w dniu 8 i 15-tym. W dwadzieścia cztery godziny po drugim nastrzyknięciu, w surowicy myszy nastrzykniętych zmodyfikowanym PEG oktamerem, nie wykrywalna była aktywność
PL 202 799 B1 rozkładania kwasu moczowego. Jednakże aktywność ta była łatwa do wykrycia w surowicy tych myszy, które nastrzyknięto tetramerem modyfikowanym PEG. To ujawnienie w połączeniu z przyśpieszonym usuwaniem oktameru zmodyfikowanego PEG, które obserwowano po pierwszym nastrzyknięciu (Fig. 12), wskazuje na potrzebę usuwania, przed modyfikacją enzymu PEG, wszystkich postaci urykazy większych niż tetramer.
P r z y k ł a d 4
Koniugowanie urykazy z Candida utilis z PEG
Urykazę z Candida utilis otrzymano z Sigma-Aldrich (St. Louis, MO; nr katalogowy. U1878) lub z Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ; nr katalogowy URYW). Postępując jak to opisano w Przykładach 1 i 2, wyizolowano postać tetrameryczną i zsyntetyzowano koniugaty z PEG 5 kDa, 10 kDa lub 30 kDa (Fig. 1A-1B). Fig. 1A przedstawia zachowanie aktywności przez zmodyfikowaną PEG urykazę z Candida utilis w funkcji liczby łańcuchów PEG przyłączonych na podjednostkę. Dane twórców wynalazku (▲,·,□) porównano z uzyskanymi przez Nishimura i wsp., (1979); Nishimura i wsp., (1981); Chen i wsp., (1981); Davis i wsp., (1981); Tsuji i wsp., (1985); Yasuda i wsp., (1990) i Fujita i wsp., (1991). Wartości zaznaczone dużymi kołami odnoszą się do koniugatów, o których Nishimura i wsp., (1979 lub 1981) donosili, że są nieantygenowe lub do koniugatów, o których Chen i wsp., (1981) donosili, że są nieimmunoreaktywne.
Fig. 1B przedstawia zachowanie aktywności przez urykazę z Candida utilis zmodyfikowanej PEG w funkcji całkowitej masy przyłączonego PEG na podjednostkę.
Wyniki twórców wynalazku (▲,·,□) są porównane z tymi, o których wspomniano przy Fig. 1A. Wartości zaznaczone dużymi kołami mają taki sam sens jak na Fig. 1A.
Jak pokazano na Fig. 1A i Fig. 1B, koniugaty o średnio do 6 łańcuchów PEG 5 kDa lub 30 kDa lub do 9 łańcuchów PEG 10 kDa na podjednostkę zachowują co najmniej 75% aktywności niezmodyfikowanego enzymu. Obserwowany wzrost aktywności specyficznej wraz ze zwiększającą się liczbą przyłączonych 30 kDa łańcuchów PEG (do 5 lub 6 łańcuchów na podjednostkę) może odzwierciedlać nierozpuszczalność lub niestabilność niezmodyfikowanego enzymu w porównaniu z koniugatami.
P r z y k ł a d 5
Koniugowanie urykazy z Aspergillus flavus z PEG
Urykaza z Aspergillus flavus została uzyskana z Sanofi Winthrop (Gentilly Cedex, Francja). Postępując jak to opisano w Przykładzie 2, zsyntetyzowano koniugaty z PEG o różnych masach cząsteczkowych (Fig. 4A-4B). Koniugaty przygotowano przez sprzęganie enzymu z A. flavus, średnio z maksymalnie dwunastoma 5 kDa łańcuchami PEG lub maksymalnie siedmioma 30 kDa łańcuchami PEG na podjednostkę, zachowując co najmniej 75% początkowej aktywności urykazy grzybowej.
P r z y k ł a d 6
Koniugowanie urykazy sojowej z PEG
Zrekombinowana urykaza z brodawek korzeniowych soi (nazywana również noduliną 35) była przygotowana i oczyszczana jak to opisali Kahn i Tipton (Kahn, K, i wsp., (1997) Biochemistry 36: 4731-4738) i dostarczona przez dr Tipton (University Missouri, Columbia, MO). Postępowano jak to opisano w Przykładach 1 i 2. Postać tetrameryczna była wyizolowana i przygotowano koniugaty z PEG o różnej masie cząsteczkowej (Fig. 5A-5B). W przeciwieństwie do urykazy z Candida utilis (Fig. 1A), urykazy świńskiej (Fig. 2A), chimerowej urykazy świnia-pawian (Fig. 3A) i urykazy z Aspergillus flavus (Fig. 4A) enzym z soi tolerował jedynie przyłączenie około 2 łańcuchów PEG o masie 5 kDa lub 30 kDa na podjednostkę przy zachowaniu co najmniej 75% początkowej aktywności rozkładania kwasu moczowego.
P r z y k ł a d 7
Koniugowanie urykazy z Arthrobacter globiformis z PEG
Urykazę z Arthrobacter globiformis otrzymano z Sigma-Aldrich (nr katalogowy U7128). Patrz japoński patent 9-154581. Postępując tak, jak to opisano w Przykładach 1 i 2, wyizolowano tetrameryczne formy i przygotowano koniugaty z PEG 5 kDa i 30 kDa. Podczas gdy koniugaty o średnio więcej niż trzech łańcuchach PEG 5 kDa na podjednostkę zachowywały mniej niż 60% początkowej aktywności specyficznej, koniugaty o średnio około dwóch łańcuchach PEG 30 kDa na podjednostkę zachowywały co najmniej 85% początkowej aktywności specyficznej.
P r z y k ł a d 8
Koniugowanie urykazy świńskiej i PBC skróconych na końcu aminowym z PEG
Rekombinowane urykazy świńską i PBC, w których pierwsze sześć aminokwasów na końcu aminowym usunięto, wyrażano i oczyszczano z E. coli z zastosowaniem standardowych sposobów,
PL 202 799 B1 jak opisano w Przykładzie 3. Postępując jak to opisano w Przykładach 1 i 2 zsyntetyzowano koniugaty urykaz o skróconym końcu aminowym z PEG z wytworzeniem zasadniczo nieimmunogennych koniugatów, które zachowały co najmniej 75% początkowej aktywności specyficznej.
P r z y k ł a d 9
Koniugowanie urykazy świńskiej i PBC skróconych na końcu karboksylowym lub równocześnie skróconych na końcach aminowym i karboksylowym z PEG
Rekombinowane urykazy świńskie i PBC, z których usunięto co najmniej trzy aminokwasy z końca karboksylowego były wyrażane i oczyszczane z E. coli z zastosowaniem standardowych sposobów, jak opisano w Przykładzie 3. Takie skrócenie karboksylowych końców może zwiększać rozpuszczalność niezmodyfikowanych enzymów, bowiem zostaje usunięty sygnał naprowadzający na peroksysomy. Patrz Miura i wsp., (1994). Postępując jak to opisano w Przykładach 1 i 2, zsyntetyzowano koniugaty PEG urykaz skróconych na końcu karboksylowym w celu wytworzenia zasadniczo nieimmunogennych koniugatów, które zachowały co najmniej 75% początkowej aktywności specyficznej. Sekwencje rekombinowanej urykazy PBC skrócono o sześć aminokwasów na końcu aminowym i o trzy aminokwasy na końcu karboksylowym (PBC-NT-CT) co przedstawiono na Fig. 6. Urykaza ta jest wyrażana, oczyszczana i modyfikowana PEG, jak to opisano w Przykładach 1, 2 i 3 celem wytworzenia zasadniczo nieimmunogennych koniugatów, które zachowały co najmniej 75% wyjściowej aktywności specyficznej.
P r z y k ł a d 10
Koniugowanie z PEG mutantów świńskiej urykazy zawierających zwiększoną liczbę miejsc przyłączenia PEG
Rekombinowane świńskie urykazy są przygotowane jak to opisano w Przykładzie 3, przy czym liczba potencjalnych miejsc przyłączenia PEG jest zwiększona przez zastąpienie lizyną jednej lub większej liczby reszt argininy. Patrz Hershfield, MS, i wsp., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 7185 -7189. Sekwencja aminokwasowa jednego przykładowego takiego mutanta (urykaza PKS), w którym arginina w pozycji 291 jest zastąpiona przez lizynę i treonina w pozycji 301 jest zastąpiona przez serynę została przedstawiona na Fig. 6. Postępując jak to opisano w Przykładach 1 i 2, PEG jest przyłączany do urykazy z wytworzeniem zasadniczo nieimmunogennych koniugatów, które zachowały co najmniej 75% początkowej aktywności rekombinowanej urykazy.
P r z y k ł a d 11
Koniugowanie mutanta rekombinowanej urykazy pawiana z PEG
Stosując standardowe metody biologii molekularnej, jak w Przykładzie 3, skonstruowano rekombinowaną urykazę pawiana posiadającą podstawienie aminokwasu (histydyna za tyrozynę) w pozycji 97 (patrz Fig. 6). Postępując jak opisano w Przykładzie 1 i 2, koniugaty PEG tetramerycznej postaci mutanta rekombinowanej urykazy pawiana są syntetyzowane w celu wytworzenia koniugatów o zasadniczo ograniczonej immunogenności, które zachowały co najmniej 75% pierwotnej aktywności specyficznej rekombinowanej urykazy.
P r z y k ł a d 12
Immunogenność koniugatów PEG z Candida utilis, Aspergillus flavus i Arthrobacter globiformis
Urykaza z Candida utilis, Aspergillus flavus i Arthrobacter globiformis jest uzyskana jak opisano odpowiednio w Przykładach 4, 5 i 7. Postępując jak opisano w Przykładach 1 i 2, koniugaty PEG syntetyzowano z PEG 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa lub 30 kDa. Immunogenność tych koniugatów jest zasadniczo ograniczona lub wyeliminowana.
PL 202 799 B1
Lista sekwencj i <110> Williams, L. David
Hershfield, Michael S.
Kelly, Susan J.
Saifer, Mark G.P.
Sherman, Merry R.
<120> Sposób izolowania urykazy w postaci tetraraerycznej oraz wyizolowana tetrameryczna urykaza <130> MVIEW.001VPC <140>
<141>
<150> 09/130,392 <151> 1998 08-06 <160> 2 <170> FastSEQ dla Windows wersja 3.0 <210> 1 <211> 304 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 1
| Met | Ala | His | Tyr | Arg | Asn | Asp | Tyr | Lys | Lys | Asn | Asp | Glu | Val | Glu | Phe |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Val | Arg | Thr | Gly | Tyr | Gly | Lys | Asp | Met | Ile | Lys | Val | Leu | His | Ile | Gin |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Arg | Asp | Gly | Lys | Tyr | His | Ser | Ile | Lys | Glu | Val | Ala | Thr | Ser | Val | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Leu | Thr | Leu | Ser | Ser | Lys | Lys | Asp | Tyr | Leu | His | Gly | Asp | Asn | Ser | Asp |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Val | Ile | Pro | Thr | Asp | Thr | Ile | Lys | Asn | Thr | Val | Asn | Val | Leu | Ala | Lys |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Phe | Lys | Gly | Ile | Lys | Ser | Ile | Glu | Thr | Phe | Ala | Val | Thr | Ile | Cys | Glu |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| His | Phe | Leu | Ser | Ser | Phe | Lys | His | Val | Ile | Arg | Ala | Gin | Val | Tyr | Val |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Glu | Glu | Val | Pro | Trp | Lys | Arg | Phe | Glu | Lys | Asn | Gly | Val | Lys | His | Val |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| His | Ala | Phe | Ile | Tyr | Thr | Pro | Thr | Gly | Thr | His | Phe | Cys | Glu | Val | Glu |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Gin | Ile | Arg | Asn | Gly | Pro | Pro | Val | Ile | His | Ser | Gly | Ile | Lys | Asp | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Lys | Val | Leu | Lys | Thr | Thr | Gin | Ser | Gly | Phe | Glu | Gly | Phe | Ile | Lys | Asp |
| 165 | 170 | 175 |
PL 202 799 B1
| Gin | Phe | Thr | Thr 180 | Leu | Pro | Glu | Val | Lys 185 | Asp Arg | Cys | Phe | Ala 190 | Thr | Gin |
| Val | Tyr | Cys | Lys | Trp | Arg | Tyr | His | Gin | Gly Arg | Asp | val | Asp | Phe | Glu |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||
| Ala | Thr | Trp | Asp | Thr | Val | Arg | Ser | Ile | Val Leu | Gin | Lys | Phe | Ala | Gly |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||
| Pro | Tyr | Asp | Lys | Gly | Glu | Tyr | Ser | Pro | Ser Val | Gin | Lys | Thr | Leu | Tyr |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||
| Asp | Ile | Gin | Val | Leu | Thr | Leu | Gly | Gin | Val Pro | Glu | Ile | Glu | Asp | Met |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| Glu | Ile | Ser | Leu | Pro | Asn | Ile | His | Tyr | Leu Asn | Ile | Asp | Met | Ser | Lys |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| Met | Gly | Leu | Ile | Asn | Lys | Glu | Glu | Val | Leu Leu | Pro | Leu | Asp | Asn | Pro |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Tyr | Gly | Arg | Ile | Thr | Gly | Thr | Val | Lys | Arg Lys | Leu | Thr | Ser | Arg | Leu |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| <210> | 2 | |||||||||||||
| <211> | 304 | |||||||||||||
| <212> | PRT | |||||||||||||
| <213> | Papio hamadryas | |||||||||||||
| <400> | 2 | |||||||||||||
| Met | Ala | Asp | Tyr | His | Asn | Asn | Tyr | Lys | Lys Asn | Asp | Glu | Leu | Glu | Phe |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Val | Arg | Thr | Gly | Tyr | Gly | Lys | Asp | Met | Val Lys | Val | Leu | His | Ile | Gin |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Arg | Asp | Gly | Lys | Tyr | His | Ser | Ile | Lys | Glu Val | Ala | Thr | Ser | Val | Gin |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Leu | Thr | Leu | Ser | Ser | Lys | Lys | Asp | Tyr | Leu His | Gly | Asp | Asn | Ser | Asp |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Ile | Ile | Pro | Thr | Asp | Thr | Ile | Lys | Asn | Thr Val | His | Val | Leu | Ala | Lys |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
| Phe | Lys | Gly | Ile | Lys | Ser | Ile | Glu | Ala | Phe Gly | Val | Asn | Ile | Cys | Glu |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
| Tyr | Phe | Leu | Ser | Ser | Phe | Asn | His | Val | Ile Arg | Ala | Gin | Val | Tyr | Val |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||
| Glu | Glu | ile | Pro | Trp | Lys | Arg | Leu | Glu | Lys Asn | Gly | Val | Lys | His | Val |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||
| His | Ala | Phe | Ile | His | Thr | Pro | Thr | Gly | Thr His | Phe | Cys | Glu | Val | Glu |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||
| Gin | Leu | Arg | Ser | Gly | Pro | Pro | Val | Ile | His Ser | Gly | Ile | Lys | Asp | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||
| Lys | Val | Leu | Lys | Thr | Thr | Gin | Ser | Gly | Phe Glu | Gly | Phe | Ile | Lys | Asp |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||
| Gin | Phe | Thr | Thr | Lys | Pro | Glu | Val | Lys | Asp Arg | Cys | Phe | Ala | Thr | Gin |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||
| Val | Tyr | Cys | Lys | Trp | Arg | Tyr | His | Gin | Cys Arg | Asp | Val | Asp | Phe | Glu |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||
| Ala | Thr | Trp | Gly | Thr | Ile | Arg | Asp | Leu | Val Leu | Glu | Lys | Phe | Ala | Gly |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||
| Pro | Tyr | Asp | Lys | Gly | Glu | Tyr | Ser | Pro | Ser Val | Gin | Lys | Thr | Leu | Tyr |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||
| Asp | Ile | Gin | Val | Leu | Ser | Leu | Ser | Arg | Val Pro | Glu | Ile | Glu | Asp | Met |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| Glu | Ile | Ser | Leu | Pro | Asn | Ile | His | Tyr | Phe Asn | Ile | Asp | Met | Ser | Lys |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| Met | Gly | Leu | Ile | Asn | Lys | Glu | Glu | Val | Leu Leu | Pro | Leu | Asp | Asn | Pro |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Tyr | Gly | Lys | Ile | Thr | Gly | Thr | Val | Lys | Arg Lys | Leu | Ser | Ser | Arg | Leu |
| 290 | 295 | 300 |
Claims (8)
1. Sposób izolowania urykazy w postaci tetramerycznej z roztworu urykazy zawierającego tetramery i agregaty urykazy, znamienny tym, że obejmuje etapy:
nanoszenia roztworu na co najmniej jedną kolumnę do rozdziału przy pH od około 9 do 10,5;
oraz odzyskiwania z kolumny jednej lub większej liczby frakcji zawierającej wyizolowane tetramery urykazy, przy czym jedna lub więcej frakcji są zasadniczo wolne od agregatów urykazy.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór urykazy jest nanoszony na kolumnę o pH 10,2.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozdział oparty jest na właściwościach wybranych z grupy obejmującej wymianę jonową i rozdział z uwagi na wielkość.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap analizowania frakcji w celu określenia co najmniej jednej właściwości wybranej z grupy obejmującej występowanie tetramerycznej urykazy i brak agregatów urykazy.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że etap analizy obejmuje co najmniej jedną analizę wybraną z grupy obejmującej chromatografię, wirowanie, rozpraszanie światła i elektroforezę.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że chromatografia jest wysokosprawną chromatografią cieczową.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wyizolowana tetrameryczna urykaza zawiera mniej niż około 10% agregatów urykazy.
8. Wyizolowana tetrameryczna urykaza wytworzona sposobem określonym w zastrz. 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13039298A | 1998-08-06 | 1998-08-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL202799B1 true PL202799B1 (pl) | 2009-07-31 |
Family
ID=22444494
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL383331A PL220873B1 (pl) | 1998-08-06 | 1999-08-02 | Roztwór chromatograficznie oczyszczonej tetramerycznej urykazy |
| PL380583A PL202799B1 (pl) | 1998-08-06 | 1999-08-02 | Sposób izolowania urykazy w postaci tetramerycznej oraz wyizolowana tetrameryczna urykaza |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL383331A PL220873B1 (pl) | 1998-08-06 | 1999-08-02 | Roztwór chromatograficznie oczyszczonej tetramerycznej urykazy |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1100542B1 (pl) |
| JP (3) | JP5183836B2 (pl) |
| KR (2) | KR100488848B1 (pl) |
| AU (1) | AU770014B2 (pl) |
| BR (2) | BRPI9917760B8 (pl) |
| CZ (1) | CZ303751B6 (pl) |
| HU (2) | HU226294B1 (pl) |
| IL (3) | IL141220A0 (pl) |
| NZ (1) | NZ509595A (pl) |
| PL (2) | PL220873B1 (pl) |
| RU (3) | RU2278680C2 (pl) |
| TW (1) | TW570981B (pl) |
| WO (1) | WO2000007629A2 (pl) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2338665C (en) | 1998-08-06 | 2011-01-18 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof |
| EP2277998B1 (en) | 1998-08-06 | 2016-04-20 | Duke University | Urate oxidase |
| HU226294B1 (en) * | 1998-08-06 | 2008-08-28 | Mountain View Pharmaceuticals | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof |
| US6783965B1 (en) | 2000-02-10 | 2004-08-31 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
| AU2006203252B8 (en) * | 2000-02-10 | 2009-06-18 | Duke University | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
| EP1279406A4 (en) | 2000-04-03 | 2007-10-24 | Santen Pharmaceutical Co Ltd | TRANSPORTERS AND DRUG DISPENSING SYSTEMS USING THESE |
| US7799794B2 (en) | 2000-06-28 | 2010-09-21 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Treatment for cardiovascular disease |
| DE60229958D1 (de) | 2001-06-28 | 2009-01-02 | Mountain View Pharmaceuticals | Polymerstabilisierte proteinasen |
| US6913915B2 (en) * | 2001-08-02 | 2005-07-05 | Phoenix Pharmacologics, Inc. | PEG-modified uricase |
| US8129330B2 (en) | 2002-09-30 | 2012-03-06 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
| US20040062748A1 (en) | 2002-09-30 | 2004-04-01 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
| MXPA05012314A (es) | 2003-05-12 | 2006-04-18 | Affymax Inc | Radical separador para peptido modificado con polietilenglicol. |
| DK1625156T3 (da) | 2003-05-12 | 2013-01-07 | Affymax Inc | Peptider, der bindes til erythropoietinreceptoren |
| WO2006005058A2 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Polymer-factor ix moiety conjugates |
| WO2008051178A2 (en) * | 2006-04-12 | 2008-05-02 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Purification of proteins with cationic surfactant |
| US7811800B2 (en) | 2005-04-11 | 2010-10-12 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Variant form of urate oxidase and use thereof |
| US8148123B2 (en) | 2005-04-11 | 2012-04-03 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| US8188224B2 (en) | 2005-04-11 | 2012-05-29 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Variant forms of urate oxidase and use thereof |
| WO2006121995A2 (en) | 2005-05-09 | 2006-11-16 | Tap Pharmaceutical Products, Inc. | Methods for treating nephrolithiasis |
| US7550433B2 (en) | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| JP4890132B2 (ja) * | 2006-07-20 | 2012-03-07 | 東洋紡績株式会社 | ウリカーゼの比活性を向上させる方法、および比活性の向上した改変型ウリカーゼ |
| RU2382048C1 (ru) * | 2008-12-25 | 2010-02-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" | Лекарственное средство на основе модифицированного интерферона альфа с пролонгированным терапевтическим действием |
| EP4635567A3 (en) | 2009-06-25 | 2025-12-03 | Horizon Therapeutics USA, Inc. | Methods and kits for preventing infusion reaction risk and antibody-mediated loss of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricase therapy |
| WO2012033941A1 (en) | 2010-09-10 | 2012-03-15 | Takeda Pharmaceuticals North America, Inc. | Methods for concomitant treatment of theophylline and febuxostat |
| CN102634492B (zh) | 2011-02-14 | 2015-06-10 | 重庆富进生物医药有限公司 | 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用 |
| US9744175B2 (en) | 2012-04-06 | 2017-08-29 | Indus Pharmaceuticals, Inc. | Compositions of combinations of non-covalent DNA binding agents and anti-cancer and/or anti-inflammatory agents and their use in disease treatment |
| CN110251675A (zh) | 2013-05-03 | 2019-09-20 | 西莱克塔生物科技公司 | 降低或预防响应于非变应原性抗原的过敏反应的致耐受性合成纳米载体 |
| AU2016265677B2 (en) * | 2015-05-15 | 2021-12-09 | Medimmune, Llc | Improved uricase sequences and methods of treatment |
| CN105412942B (zh) * | 2015-12-23 | 2019-02-26 | 沈阳三生制药有限责任公司 | 聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂 |
| CN110234340A (zh) | 2016-11-11 | 2019-09-13 | 好利恩风湿病制药有限责任公司 | 泼尼松和尿酸酶分子的组合疗法及其用途 |
| US20200237881A1 (en) | 2019-01-30 | 2020-07-30 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Reducing immunogenicity to pegloticase |
| ES3036482T3 (en) | 2017-03-11 | 2025-09-19 | Cartesian Therapeutics Inc | Methods and compositions related to combined treatment with anti-inflammatories and synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant |
| AU2020287627A1 (en) | 2019-06-04 | 2021-11-18 | Selecta Biosciences, Inc. | Formulations and doses of PEGylated uricase |
| CN112980808B (zh) * | 2019-12-12 | 2024-10-29 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 尿酸酶、及其制备方法和用途 |
| KR20230110281A (ko) | 2020-11-03 | 2023-07-21 | 프로탈릭스 리미티드 | 변형된 유리카제(uricase) 및 이의 용도 |
| CN114438048B (zh) * | 2020-11-05 | 2024-10-22 | 重庆派金生物科技有限公司 | 尿酸氧化酶制剂及其应用 |
| CN114438047B (zh) * | 2020-11-05 | 2024-11-22 | 重庆派金生物科技有限公司 | 制备聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的方法 |
| CA3211023A1 (en) | 2021-02-10 | 2022-08-18 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Uricase activator and uric acid measurement reagent |
| CN114181917B (zh) * | 2022-02-14 | 2022-06-03 | 潍坊华卓生物科技有限公司 | 一种改造尿酸酶、基因序列、制备方法及应用 |
| US12269875B2 (en) | 2023-08-03 | 2025-04-08 | Jeff R. Peterson | Gout flare prevention methods using IL-1BETA blockers |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR6301M (pl) * | 1967-03-29 | 1968-09-09 | ||
| US3616231A (en) * | 1968-11-14 | 1971-10-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the production of uricase |
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| JPS6031472B2 (ja) * | 1978-12-14 | 1985-07-22 | 協和醗酵工業株式会社 | 酸性ウリカ−ゼ |
| JPS55135590A (en) * | 1979-04-05 | 1980-10-22 | Mihama Hisaharu | Modified asparaginase and uricase and their preparation |
| JPS57192435A (en) * | 1981-05-20 | 1982-11-26 | Toyobo Co Ltd | Modified polypeptide |
| JPS6255079A (ja) * | 1986-04-23 | 1987-03-10 | Mihama Hisaharu | 修飾ウリカ−ゼ |
| NZ234453A (en) * | 1989-07-13 | 1993-01-27 | Sanofi Sa | Recombinant dna encoding urate oxidase, and vector, host, protein and pharmaceutical compositions associated therewith |
| US6783965B1 (en) * | 2000-02-10 | 2004-08-31 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
| EP2277998B1 (en) * | 1998-08-06 | 2016-04-20 | Duke University | Urate oxidase |
| HU226294B1 (en) * | 1998-08-06 | 2008-08-28 | Mountain View Pharmaceuticals | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof |
-
1999
- 1999-08-02 HU HU0103003A patent/HU226294B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-08-02 CZ CZ20010317A patent/CZ303751B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-08-02 IL IL14122099A patent/IL141220A0/xx active IP Right Grant
- 1999-08-02 RU RU2004104953/15A patent/RU2278680C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-08-02 NZ NZ509595A patent/NZ509595A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-08-02 PL PL383331A patent/PL220873B1/pl unknown
- 1999-08-02 RU RU2001103144/15A patent/RU2246318C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-08-02 WO PCT/US1999/017514 patent/WO2000007629A2/en not_active Ceased
- 1999-08-02 KR KR10-2001-7001569A patent/KR100488848B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-02 AU AU52515/99A patent/AU770014B2/en not_active Ceased
- 1999-08-02 HU HU0800112A patent/HU228916B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-08-02 EP EP99937745A patent/EP1100542B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-02 BR BRPI9917760A patent/BRPI9917760B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-08-02 KR KR1020047014428A patent/KR100614212B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-02 JP JP2000563311A patent/JP5183836B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-02 PL PL380583A patent/PL202799B1/pl unknown
- 1999-08-02 BR BRPI9912974A patent/BRPI9912974B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-08-05 TW TW088113406A patent/TW570981B/zh not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-02-01 IL IL141220A patent/IL141220A/en not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-03-09 RU RU2006107111/15A patent/RU2349341C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-06-14 IL IL183948A patent/IL183948A/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-07-24 JP JP2009173148A patent/JP5290901B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-11-12 JP JP2012248770A patent/JP5291235B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2338665C (en) | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof | |
| AU770014B2 (en) | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof | |
| PL203492B1 (pl) | Koniugat urykazy i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna | |
| HK1037330B (en) | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof | |
| HK1141738B (en) | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof | |
| HK1103303B (en) | A method for isolating a tetrameric uricase | |
| MXPA01001272A (en) | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof | |
| HK1155080B (en) | Isolated tetrameric uricase | |
| HK1155080A (en) | Isolated tetrameric uricase |