TW570981B

TW570981B - PEG-urate oxidase conjugates and use thereof

Info

Publication number: TW570981B
Application number: TW088113406A
Authority: TW
Inventors: L David Williams; Mark G P Saifer; Merry R Sherman; Michael S Hershfield; Susan J Kelly
Original assignee: Mountain View Pharmaceuticals; Univ Duke
Priority date: 1998-08-06
Filing date: 1999-08-05
Publication date: 2004-01-11
Also published as: HU226294B1; BR9917760B1; PL383331A1; WO2000007629A3; HU228916B1; CZ2001317A3; KR20040088585A; RU2004104953A; IL141220A; IL183948A0; JP5290901B2; JP5291235B2; IL183948A; RU2006107111A; EP1100542B1; RU2349341C2; BR9912974A; PL202799B1; BRPI9917760B8; RU2246318C2

Description

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570981 A7 B7 五、發明說明Ο ) 政府權利之磬明在此申請書中所描述的一部分硏究是由國家衛生院（ National Institntes of Health)所提供的補助金 DK48529 所屬造。因此美國政府對此發明具一定權利。發明領域本發明是關於蛋白質的化學性修飾，用以延長它們的血液循環生命期及降低它們的免疫原性。更特別的是本發明關於聚（乙二醇）或聚（環氧乙烷）結合到尿酸氧化酶，且大至上除去尿酸氧化酶免疫原性但不影響其分解尿酸的活性。發明背景在此背景段落中所包含的聲明陳述不構成先前技藝的承認，但反應出此 ''發明者〃在製造此發明時對此技藝陳述的個人主觀評論及說明。這些說明包括個人迄今尙未揭示之內容，以及不在先前技藝部分的發明者見識。尿酸氧化酶（尿酸酶；E · C · 1 · 7 · 3 · 3 )是一可催化尿酸被氧化成較易溶解之產物-尿膜素（allantoin )的酵素，而尿膜素是較易被快速排泄的嘌呤代謝產物。人類無法製造具酵素活性的尿酸酶，這是因爲在高等靈長類演化期間後天性尿酸酶基因多處突變所導致的結果。 Wu，X，et al.，（1992) J Mol Evol 34: 78-84。因此，在較易感受的個體中，血液中的尿酸濃度過高（高尿酸血症）和尿液中尿 --------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -4- 570981 A7 B7 五、發明說明^ ) 酸濃度過高（高尿酸尿症）能導致疼痛的關節炎（痛風），損毁性的尿酸鹽沈積（痛風石）及腎衰竭。在一些受疾病侵襲的個體，可使用異嘌呤醇（allopunnol) (·尿酸合成的抑制劑）藥物作最少副作用的治療，或緩和這些狀況。Hande，KR，et al.，（ 1 984)Am J Med 76:47-56 ;

Fam.AG. ( 1990)Bailliere’s Clin Rheumatol 4:177-192。注身寸尿酸酶可暫時降低高尿酸血症及高尿酸尿症。然而尿酸酶對人類而言是一外來蛋白質，因此即使在被治療的病人中有許多百分比的病人第一次注射來自黃麴菌的未修飾蛋白質時會引起過敏反應（Pm，C-H，et al.，（ 1 997)Leukenna 1 1:1 8 1 3 -1 8 1 6 )，及免疫反應因而限制它使用於慢性或間歇性治療。Donadio，D，et al.，（1981)Nouv Presse Med 10:711-712 i Leaustic,M,et al., ( 1 9 8 3) Re v Rhum Mai Osteoartic 50:553-5 54。此類次適當可獲得之用於治療高尿酸血症的行爲已被確認數十年。Kissel，P. et al.，（1968)Nature 217:72-74。同樣的，一些嚴重痛風病人也可能受益於安全及有效率之可注射形式的尿酸酶。而此治療被確認很多年了。DaV1s，FF，et al.，（ 1 97 8)in GB Broun, et al.，（Eds · )Enzy me Engineering，

Vol.4(pp. 1 69- 1 73)New York,Plenum Press ;Nishimura,H, et al.(1979)Enzyme 24 :261-264;Nishimura，H，et al.，（1981)Enzyme 26:49-53;Davis,S, et al. (1981)Lancet2(824 1 ): 28 1 - 28 3 ； AbuchowskiA,et al.,(1981)J Pharmacol Exp Ther 2 1 9:3 5 2-3 54 ；Chen,RH-L,et al.,(1 98 1)Bιochim Biophys Acta 660:293-298 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -5 - (請先閱讀背面之注音？事項Η 裝--- I寫本頁) -I線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570981 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明§ ) ^ Chua,CC,et al., ( 1 9 8 8) Ann Int Med 1 09 : 1 1 4 -1 1 7 : Greenberg ML，et al.，（ 1 9 89)Anal Biochem 1 76:290-293。從動物器官所衍生的尿酸酶幾乎不溶於可用於安全注射的溶劑中。美國 •專利3，6 1 6，2 3 1。一些衍生自植物或微生物的尿酸酶較溶於醫學上可接受的溶劑內。然而注射微生物的酵素很快就引起蛋白質反應，可能導致生命受威脅的過敏反應，或使尿酸酶去活性以及/或加速尿酸酶從血液循環中淸除。D〇nadio，et al.，（1981);Leaustic，et al. ,(1983).以來自哺乳動物豬和狒狒，或昆蟲類果蠅（Drosophila melanogaster 或 Drosophila pseudoobscura(Wallrath,LL，et al.,( 1 990)M〇1 Cell B1〇l 10:5 114-5 127)的尿酸酶爲酵素所演繹的胺基酸序列，尙未適用於作爲臨床使用的候選者，主要是因爲免疫原性及在生理P Η値下不溶性的問題。以聚（乙二醇）或聚（環氧乙烷）（二者皆稱爲 P E G )共價修飾的蛋白質，已被使用於增加蛋白質半衰期及降低免疫原性。美國專利4，1 7 9，3 3 7 ; 4，766，1〇6及4，847，325; Saifer，MGP,et al.,( 1 994)Adv Exp Meel Biol 3 66:377 -3 87。與高分子量的P E G結合以製造可延長血液循環壽命和/或降低免疫原性之共軛物，且仍保留功能活性的例子，先前已有另一酵素過氧化物岐化酶（superoxide dismutase)被證明（somack，R，et al.，1991)Free Rad Commun 12-13:533-562; 美國專利5，283，317和5，468，478)，以及其它種類蛋白質，譬如細胞激素（Saif〇r，MGP，et 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -6 - (請先閱讀背面之注咅？事項寫本頁) 裝 . ;線_ 570981 A7 B7 五、發明說明f ) al.,( 1 997)Polym Prephints 3 8 : 576-577 ;Sherman,MR,et al. ? ( 1 997) in JM Harris,et al.,(Eds),Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications.ACS Symposium Series '6 80(pp.l55-169)Washiongton,DC:Amerocan Chemical Society )。除了 P E G以外之聚合物與尿酸酶結合形成共軛物也已被描述。美國專利，4，4 6 0，6 8 3。幾乎全部報告P E G化的尿酸酶（亦即P E G共價結合到尿酸酶）中，P E G主要是附著到胺基，包括殘基的胺端和可獲得的離胺酸殘基。在常用的尿酸酶中，4個相同次單位的每一次單位離胺酸全部數目位於2 5 (黃麴菌 (美國專利 5，3 8 2，5 1 8 )和 2 9 (豬（Wn，X，et al.，（ 1 989)Proc.Natl Acad Sci USA 86:94 1 2-94 1 6 )之間。在此酵素的天然構形中，某些離胺酸無法用於P E G化。最常用於降低尿酸酶免疫原性的方法是將許多股低分子量的 P E G結合上去。所得之共軛物常常大大的降低酵素活性〇過去硏究者在活體內曾注射尿酸酶來催化尿酸轉換成尿膜素。參閱Pui，et al.，（ 1 997)。這是基於在法國及義大利，使用來自黃麴菌真菌的尿酸酶（Uncozyme® )來防止高尿酸血症或聯合用於惡性血液疾病之毒殺性治療的暫時性醫治高尿酸血症，以及用於痛風病人的暫時降低嚴重的高尿酸血症。？〇以11又，1^1&1.( 1 975川〇1^?代86从64 4:1109-1112;LeXg〇ux，R，et al.，（ 1 992)J B1〇l Chem 267:8565 - 8570;美國專利5 ，382 ，518和5 ，541 ，〇98。由於本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項t寫本頁) 線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570981 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明$ ) U r 〇 c p z y m e ®在血液循環中的生命期很短。因此需每天注射。再者，它的免疫原性也使其不適合長期治療使用。以靜脈內注射單一劑之結合5仟道耳頓P E G之製備 •自產蛋白念珠菌（Candida utilis )的尿酸酶到5位受試人類中，而注射前的平均血淸尿酸鹽濃度在6 · 2毫克/每1 0 0毫升的正常範圍內，注射後則降低到無法偵測的程度。Davis，et al.，（1981)。四週後，這5位受試者再注射一次，但他們的反應就沒被報告了。而第二次注射（及最後一次）後，使用相當不敏感的凝膠擴散分析並沒偵測到尿酸酶的抗體。此參考資料從人類病人或實驗動物之慢性或亞慢性治療報告沒有結果。一製備自原形節桿菌（Arthrobacterprotoformiae)的尿酸酶且結合到5仟道耳頓P E G的共軛物，使用於一淋巴瘤病人作爲暫時的高尿酸血症調控。而其注射前血淸尿酸鹽濃度爲1 5毫克/每1 0 0毫升。Chua，et al.，（ 1 988)。由於此病人處於危急狀況及其短期的治療（1 4天內注射 4次），因此無法評估此共軛物的長期效能或安全性。在此專利申請書中， ''免疫原性〃是指經由注射一 P E G修飾過之製備物或未修飾之尿酸酶（抗原）所引發的免疫反應，然而 ''抗體原性〃是指一抗原對事已存在之抗體的反應。綜合言之，抗體原性及免疫原性皆指a免疫反應活性〃。在先前的P E G -尿酸酶硏究中，以許多方法評估免疫反應活性，包括：1 )在活體外P E G -尿酸酶對已形成之抗體反應：2 )引發抗體合成之測量；和3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）_ 8 _ --------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) --線· 570981 A7 B7 五、發明說明$ ) )重複注射後加速淸除之速率。 (請先閱讀背面之注意事項β寫本頁) 過去曾嚐試使用不同結合者將不同股數的p E G結合到尿酸酶以消除免疫原性，但成功之結果有限。p E G _ 尿酸酶第一次被揭示是由FF Davis及γ Inada和其同事。

Davis，et al.，（ 1 97 8);美國專利 4，1 7 9 ，3 3 了； Nishimura，etal.，（1979);曰本專利 5 5 — 9 9 1 8 9 及 6 2 - 5 5 0 7 9。在‘ 3 3 7專利所揭示之共_尼物的合成是將未指定來源之尿酸酶與超過2 0倍莫耳數之7 5 0 道耳頓P E G反應而成，表示有很多聚合物分子可能附著到每一尿酸酶次單位上。’ 3 3 7專利揭示將分子量5〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 0到20，000道耳頓之PEG或聚（丙二醇），以 5〇0到5，0 0 0道耳頓爲佳，結合到不同的多胜肽激素和氧化還原酶、尿酸酶酵素上，以提供具活性、水溶性、非免疫原性的共軛物。此外，‘ 3 3 7專利中強調每分子的酵素結合1 0到1 〇〇股聚合物，且保留至少4 0 % 的酵素活性。沒有測試結果是報告P E G結合到尿酸酶胺基之範圍，分解尿酸活性之專一殘基，或此共軛物之免疫原性。在表1中有來自1 3個引證關於尿酸酶P E G化的數據摘要。一些結果也以圖表呈現於圖1 A - 2 B中。這些發表中有7個敍述來自產蛋白念珠菌的尿酸酶與不同股數之P E G結合後，在活外所測量的分解尿酸活性顯著降低。將大量數目之5仟道耳頓P E G結合到豬肝臟尿酸酶也得到類似結果，如同Chen之發表及此相同團體在討論會中本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-9 · 570981 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（）所報告之結果。Chen,et al，（1981);Davis，et al(1978)〇在表1硏究的摘要中，其中有7個經過P E G化後會降低尿酸酶的免疫原性，且有5個是已消除免疫原性。在住後5個硏究中有3個在消除免疫原性上與分解尿酸活性之顯著降低有所關聯，其分解尿酸活性最高只達原始活性的 1 5 %，2 8 % 或 4 5 %。Nishimura，et al.，（1979)(15 %活性）；Chen，et al.，（ 1 98 1 )(28% 活性）；Nishimura，et al.，（ 1 98 1 (45 %活性）。在第4個報告中，P E G可與6 1 %之可獲得之離胺酸殘基結合，但殘基之專一活性沒有陳述。 Abuchowski，et al，（1981)。然而，包括兩相同科學家的硏究團隊中，使用相同方法使結合所得之殘基活性只有2 3 - 2 8 %。Chen，et al.(1981)。Chem et al.，及 Abuchowski et al·，在1 9 8 1的發表中指出要降低尿酸酶的免疫原性，需將P E G結合到近6 0 %的可獲之離胺酸殘基上（表1 )。在第5項發表中的尿酸酶免疫反應活性已消除，但沒揭示P E G結合的範圍，殘基之分解尿酸活性，或天然的 P E G —蛋白質聯合處。Veronese，FM，et al.(1997)in JM Harris,et al. ,(Eds),poly(ethylene glyco)Chemistry and Biological Applications,ACS Symposium Series 680(pp. 182-192)Washington，DC:Amercican Chemical Society o 在實驗動物體內，P E G結合到尿酸酶的較少部分離胺酸殘基上時可降低其免疫反應活性，但不會完全消除。 Tsuji,J,et al., ( 1 9 8 5 )Int J Immunopharmacol 7:725 -7 30(28 %-45%的結合胺基）；Yasuda ,Y，et al.，（1990)Chem Pharm Bull (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) •裝訂： -.線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 10 570981 A7 --—__B7 五、發明說明（10 ) A.San◦等人的日本專利3 — 1 4 8 2 9 8揭示修飾過之蛋白質，包括尿酸酶以具有分子量1 - 1 2仟道耳頓的 P E G衍生化，顯示抗體原性降低及、、促進延長〃作用， •也揭示製造此類衍生化胜肽的方法。然而，並沒有揭示需考慮多少股P E G，酵素分析，生物學測試或、、促進延長 "的意義。Y.Inada的兩個日本專利5 5 — 9 9 1 8 9及 6 2 — 5 5 0 7 9揭示以PEG —三吖畊或雙一 P EG — 三吖畊（在表1中記爲P E G 2 )分別製備的尿酸酶共軛物。參閱Nishimura，et al.(1979及1981)。在第一型的共軛物中 ’ P E G s的分子量爲2仟道耳頓及5仟道耳頓，然而在桌一型中，只使用5仟道耳頓的P E G。Nishimura等人（ 1 9 7 9 )曾公布將4 3 %可獲之離胺酸以線形5仟道耳頓P E G修飾之後可回收1 5 %的分解尿酸活性，然而 Nishimura等人（1 9 8 1 )公布將4 6%或3 6%可獲之離胺酸以P E G 2修飾，分別可回收3 1 %或4 5 %的分解尿酸活性。發明槪述先前的硏究得知當尿酸酶P E G化達到顯著降低免疫原性和/或抗體原性時，必然也部分失去分解尿酸的活性。生物藥劑會因減少其效能及需要增加給與劑量而不利衝擊其安全性、方便性及成本效用。因此需要一個安全且有效率的改變方法來降低血液和尿液等體液內所提高之尿酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -^1 ϋ ϋ ϋ ·1 ϋ .1 ϋ I- I · ϋ ϋ (請先閱讀背面之注意事項wlm寫本頁) 線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -13- 570981 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（Μ ) 濃度。本發明提供一大致非-免疫原性的P E G -尿酸酶，保留全部或幾乎全部的未修飾酵素之分解尿酸活性。本發明的實施例之一是一尿酸氧化酶（尿酸酶）共軛物，且保留至少約7 5 %的未共軛物結合之尿酸酶的分解尿酸活性及降氐其免疫原性。此實施例包括一純化的尿酸酶，其每個次單位共價結合到平均2到1 0股的P E G上，此P E G可以是直線型或分支狀，其中每個P E G分子的分子量約介於5仟道耳頓和1 0 0仟道耳頓之間。本發明此觀點的尿酸酶可以是重組體。不論爲重組體與否，此尿酸酶可以是哺乳動物來源。在此實施例之一狀況中，尿酸酶是豬、牛或羊肝尿酸酶。在此實施例的另一狀況中，尿酸酶可以是嵌合體。此嵌合體尿酸酶包含部分豬肝和/ 或狒狒狒肝臟的尿酸酶。譬如，此嵌合體尿酸酶可能是豬狒狒的嵌合體尿酸酶（P B C尿酸酶），或包含突變 R 2 9 1 Κ及Τ 3〇1 S的豬尿酸酶（P K S尿酸酶）（參閱圖6及生理和免疫學硏究結果在圖7 - 1 2 )。另一方面，此尿酸酶可以是狒狒肝臟尿酸酶，其等9 7酪胺酸被組胺酸取代而可藉此增加至少約6 0 %的尿酸酶專一活性。本發明之尿酸酶，不論其來源爲何皆爲切掉頂端的形式。可以是切除胺基牺或竣基纟而或兩端。同樣的’此尿酸酶可能是真菌或微生物的尿酸酶。在此實施例的一狀況中，可能是天然發生的真菌或微生物尿酸酶，或黃麹菌、球形節桿菌或產蛋白念珠菌所形成之重組尿酸酶。另外’此尿酸酶可以是無脊椎動物的尿酸酶，譬如天然發生或從黃本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐）~_ 14-""""" (請先閱讀背面之注咅？事項 r本頁) --裝訂 --線- 570981 A7 B7 五、發明說明（(2 ) ---------------裝—— (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 猩果蠅或假暗色果蠅所形成之重組尿酸酶。本發明的尿酸酶也可能是植物的尿酸酶，譬如天然發生或從黃豆根（大量甘胺酸）所形成之重組尿酸酶。P E G平均分子量約5 仟道耳頓及1 0 0仟道耳頓；以1 0到6 0仟道耳頓爲佳 ;更佳是2 0到4 0仟道耳頓，譬如3 0仟道耳頓。每個尿酸酶次單位共價結合P E G的平均股數爲2到1 〇股；以3到8股爲佳；更佳是4到6股。在此實施例一狀況中，尿酸酶可能是四聚物◦每股P E G是透過胺基甲酸乙酯 (胺基甲酸），二級胺，和/或醯胺共價連結到尿酸酶上。當尿酸酶是文中曾提及之任一至組形式之尿酸酶時，其大部分序列爲天然發生形式之序列。 --線· 本發明的另一實施例是一用於降低體液內之尿酸濃度的藥學組成分，包含任何敍述如上之P E G -尿酸酶共軛物及一藥學上可接受的攜帶者。此組成分可能經由凍乾來穩定之，以及在重新組合時迅速溶解以提供可適用於非經腸道給與時之溶液。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明也提供一方法用於使哺乳動物體液及組織內的尿酸濃度降低。此方法包括給與一哺乳動物有效量之 P E G -尿酸酶有效降低尿酸濃度。此P E G -尿酸酶可能是一純化的尿酸酸，具有兩個或更多的次單位，其每個次單位平均與2到1 0股的線形或分支狀P E G共價結合，其中每分子P E G的分子量約介於5到1 0 0仟道耳頓之間，且在一藥劑上可接受的攜帶者內。此哺乳動物可能是人類。給與的步驟可經由注射靜脈、皮內、皮下、肌內本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）_ j 5 570981 A7 B7 五、發明說明彳3 ) 或fe膜內路徑；或吸入一藥液霧狀化的製備物。尿酸濃度可能在血液、尿液和/或其它體液及組織內升高，且可能請先閱讀背面之注意事項本頁) 關聯於痛風、痛風石、腎機能不全、器官移植或惡性疾病〇本發明的其他實施例是一方法，用於從含有多形式尿酸酶的水溶液中分離四聚物形式的尿酸酶，及此方法之產物°最初此水溶液可能包含四聚物尿酸酶及尿酸酶凝集團。此方法包括的步驟：將此溶液運用到至少一 P η 9到 1 0 · 5間的分離管柱，譬如1 〇 t 2 ;回收溶離液部分並鑑定可能分離出的四聚物尿酸酶，其中大致上已無尿酸酶凝集團；然後匯集分離出的四聚物尿酸酶。此分離管柱是以離子交換，大小排除，或任何其它有效分離特性爲基礎。此方法可能包括分析分層部分以決定四聚物尿酸酶的存在’和/或缺乏尿酸酶凝集團。此類分析包括高壓液相色層分析法（Η P L C )，其它色層分析法，光線散射法 ’離心和/或電泳法。在此實施例之一狀況中，純化的四聚物尿酸酶可能含有少於1 〇 %的尿酸酶凝集團。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製圖式之簡單說明圖1 Α顯示來自產蛋白念珠菌的尿酸酶，以每個次單位與不同股數之P E G結合爲函數的P E G化之後所保留的活性功能。圖1 B顯示來自產蛋白念珠菌的尿酸酶，以每個次單位與全部質量之P E G結合爲函數的P E G化之後所保留本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-16 - 570981 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（!4 ) 的活性功能。圖2 A顯示來自豬肝尿酸酶’以每個次單位與不同股數之P E G結合爲函數的P E G化之後所保留的活性功能 ,〇圖2 B顯示來自肝尿酸酶，以每個次單位與全部質量之P E G結合爲函數的P E G化之後所保留的活性功能。圖3 A顯示來自豬一狒狒嵌合體（P B C )尿酸酶，以每個次單位與不同股數之P E G結合爲函數的P E G化之後所保留的活性功能。圖3 B顯示來自P B C尿酸酶，以每個次單位與全部質量之P E G結合爲函數的P E G化之後所保留的活性功能。圖4 A顯示來自黃麴菌的尿酸酶，以每個次單位與不同股數之P E G結合爲函數的P E G化之後所保留的活性功能。圖4 B顯示來自黃麴菌的尿酸酶，以每個次單位與全部質量之P E G結合爲函數的P E G化之後所保留的活性功能。圖5 A顯示重組之黃豆根瘤尿酸酶，以每個次單位與不同股數之P E G結合爲函數的P E G化之後所保留的活性功能。圖5 B示重組之黃豆根瘤尿酸酶，以每個次單位與全部質量之P E G結合爲函數的P E G化之後所保留的活性功能。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -17- I I I-------I--. I I (請先閱讀背面之注咅？事項寫本頁) 訂：線· 570981 A7 __ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

五、發明說明ϋ5 ) 圖6顯示豬狒狒嵌合體尿酸酶（P B C尿酸酶）所推論的胺基酸序列與豬及狒狒序列比較時P B C尿酸酶在胺基和羧基兩端皆切掉（P B C - N T - C T )且豬尿酸酶 •含有突變R29 1K及T3〇1S (PKS尿酸酶）。圖7顯示相對於第一次注射P E G -修飾過之P B C 尿酸酶2 4小時後之每四或五次腹膜內注射2 4小時後的老鼠血淸中尿酸酶的活性値。圖8顯示注射P E G -修飾之P B C尿酸酶於尿酸酶 -缺乏老鼠後的血淸及尿液之尿酸濃度與尿酸酶活性的反比關係。圖9顯示以P E G -修飾之P B C尿酸酶治療尿酸酶一缺乏（U〇X - / 一）老鼠之減少尿液濃縮不足的嚴重性。圖1 0顯示以P E G -修飾之P B C尿酸酶治療尿酸酶一缺乏（U〇X - / 一）老鼠之減少腎性糖尿病尿崩症的嚴重性。圖1 1顯示以P E G -修飾之P B C尿酸酶治療尿酸酶一缺乏（U〇X — / 一）老鼠，經由磁力共振顯微鏡觀察其減少尿酸所引起之腎病的嚴重性。圖1 2顯示注射每次單位已結合5 - 6股1 0仟道耳頓P E G的P B C尿酸酶八聚物及四聚物時，比較其在 B A L B / C老鼠血液循環的加速淸除情形。鮫佳實施例之詳細說曰I (請先閱讀背面之注意事項Μ 裝--- 臂寫本頁) . Ϊ線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -18 - 570981 A7 B7 五、發明說明（6 ) 本發明提供改良的尿酸酶水溶性共聚物之共轭物’以聚（乙二醇）或聚（環氧乙烷）爲佳。此發明也提供改良共軛物的藥學組成分。這些共軛物大致爲無一免疫原性且保留至少7 5 %之未修飾酵素的分解尿酸活性’而以8 5 %爲佳和更佳是9 5 %或更多。適用與水溶性共聚物結合的尿酸酶包括天然發生的尿酸氧化酶’可分離自細菌、真菌和植物及動物組織，包括脊椎動物及無脊椎動’以及包括突變、雜化和/或切頂端酵素活性之不同重組形式的尿酸酶。使用於本發明中適合的水溶性共聚物包括直線及分支的聚（乙二醇）或聚（環氧乙院），爲常知的PEGs 。分支P E G的範例是美國專利5 ’ 6 4 3 ’ 5 7 5的主題。直線P E G的較佳範例是單甲氧基P E G，常見結構爲 C Η 3〇一（C Η 2 C Η 2〇）η Η，此處η可約從1 0 0到 2，3 〇 0。一較佳的哺乳物尿酸酶是重組豬-狒狒嵌合體尿酸酶，是由部分豬肝及狒狒肝臟尿酸酶序列所組成’此二者皆第一次由Wu等人（1 9 8 9 )決定。此類嵌合體尿酸酶的範例是包含來自豬尿酸酶序列（S E Q ID NO: 1 )的前2 2 5個胺基酸，以及來自狒狒尿酸酶序列（ S E Q I D N〇：2 )的後7 9個胺基酸（豬一狒狒尿酸酶，或P B C尿酸酶；參閱圖6 )。此類嵌合體尿酸酶的另一範例是包含豬序列7 - 2 2 5殘基（S E Q ID N〇：1)及狒狒序列226 — 301殘基（ S E Q ID N 0 ： 2 );此相當於胺基及羧基兩端皆本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-19 - I---------- -裝--- t * I (請先閱讀背面之注音？事項本頁) -線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570981 Α7 __ Β7 五、發明說明Γ ) 切掉的PBC尿酸酶（PBC — NT— CT ;參閱圖6) ◦此類嵌合體尿酸酶的另一範例是包含來自豬序列（ SEQ ID NO: 1)前288個胺基酸，以及來自狒狒序列（S E Q ID N〇：2 )的後1 6個胺基酸。由於後面的序列與豬序列只有兩個位置不同，在第 2 9 1殘基離胺酸（κ )取代精胺酸以及第3 0 1殘基絲胺酸（S )取代酥胺酸，所以此突變株又稱爲豬一 κ S或 PKS 尿酸酶。PKS，PBC，及 PBC — NT — CT 尿酸酶每個至少有一個或更多個離胺酸殘基，因此比豬或狒狒序列更具有P E G化位之潛力。各種哺乳動物尿酸酶的c D N A，包括P B C尿酸酶，P K S尿酸酶及重組狒狒-類似尿酸酶，皆使用標準方法次選殖並在最適合條件於大腸桿菌中表現。參閱 Erlich,HA,(Ed.)( 1 989)PCR Technolongy.Principles and Applications for DNA Amplification.New York: Stockton Press;Sambrook,J. et al.，（ 1 9 89)Molecular Cloning, A L a b o r a t ο n y D r e s s萃取重組的尿酸酶，純化並使用修飾的標準分析法評估並穩定性及活性。參閱Frid〇v1Ch，I，（ 1 965)J， Biol Chem 240:249 1 -2494;Nishimura，et al.，（ 1 979)，及範例 1 ο 在本發明的一實施例中，尿酸酶可經由一生物性穩定、無毒性的物質而結合，如共價結合到一相當少股數的 P E G。此類結合包括胺基甲酸乙酯（胺基甲酸鹽）結合，二級胺結合，及醯胺結合。各種已活化適用於此類結合本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-20 - --------------裝--- *·I (請先閱讀背面之注意事項本頁) --線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570981 A7 B7 五、發明說明（18 ) 的 P E G s 都可從 Shearwater P〇lymers，Huntsville，AL 的商品取得。舉例而言，胺基甲酸乙酯結合到尿酸酶可經由將尿酸 •酶與琥拍醯亞胺基碳酸鹽（S C )存在下或4 -硝基苯基碳酸鹽（NPC)衍生之PEG存在下作用而形成。SC - P E G的合成可使用描述於美國專利 5，6 1 2 · 4 6 0中的程序達到，此內容也倂入本文參考資料中。NPC — PEG的合成可經由PEG與4 —硝基本基氯仿作用而達到’依據描述於Veronese，FM，et al.， ( 1 9 8 5 )Appl Biochem Biotechnol 11:141-152 中和美國專利 5，286，637中的方法，這些倂入本文參考資料中。‘ 6 3 7專利所敍述的方法可適用於較高分子量的 P E G，只要經由調整反應物濃度維持類似的化學計量即可。另一合成N P C - P E G的變化方法敍述於B u 11 n e r， W，et al.，東德專利說明書D D 2 7 9 4 8 6 A 1中。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製醯胺結合到尿酸酶可使用N -羥基琥珀醯亞胺酯的 P E G的殘酸衍生物（Shearwater Polymers)而取得。二胺結合可使用2，2，2 -三氟乙烷硫醯P E G ( tresy PEG;Shearwater polymers)形成，或使用 P E G 醛（Shearwater Polymers)及氰硼烷鈉還原性烷基化而成。在包含PEGS的共軛物內，PEGs的分子量介於 5仟道耳頓及3 0仟道耳頓之間，且每次單位所結合之最大股數的P E G仍保留至少7 5 %之未修飾酵素的分解尿酸活性’對於黃豆尿酸酶的平均股數是2而P B C尿酸酶 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 570981 A7 _________ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（!9 ) 則超過1 0股。（參閱範例1中的評估條件及圖1 A - 5 B中的結果）。較後範圍的p e G化相對於近1 / 3的全部胺基。在本發明的一實施例中，每次單位尿酸酶結合的 •P E G平均股數介於2和1 〇之間。在一較佳實施例中，每次單位尿酸酶結合的P E G平均股數介於3和8之間。在一更佳實施例中，每次單位尿酸酶與P E G共價結合的平均股數介於4和6之間。在另一實施例中，使用於結合反應的P E G分子量介於5仟道耳頓和1 〇〇仟道耳頓之間’以介於1 0仟道耳頓及6 0仟道耳頓爲佳，且更佳是介於2 0仟道耳頓和4 0仟道耳頓之間，譬如3 0仟道耳頓。有數個因子可影響選擇用於結合到一已知形式之尿酸酶的P E G最適合分子量及股數。通常要降低或去除免疫原性而不失去分解尿酸活性是需要與較低分子量但相對較多股數的P E G結合，或較高分子量但較少股數的p E G 結合。譬如，每次單位結合6股2 0仟道耳頓的P E G或每次單位結合4股3 0仟道耳頓P E G爲最大效用。同樣的，每一種不同形式的尿酸酶可相對於有不同的合適大小及股數的P E G結合。參閱圖1 A — 5 B。 P E G結合是在生理p Η値之緩衝液中，受試尿酸酶可溶於其中且穩定，不需要加入那些售自法國及意大利 Sanofi Winthrop的真菌尿酸酶（Ur cozyme ® )穩定劑8 —咪唑黃嘌呤的受質類似物或抑制劑。兩個不同的P B C尿酸酶共軛物，一個包含每次單位有近6股1 0仟道耳頓的 (請先閱讀背面之注意事項本頁) 裝 i線- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）_ 2之_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570981 A7 B7 五、發明說明π ) P E G，以及另一包含每次單位有近2股1 9仟道耳頓的 P E G，而置3 7 °C的老鼠血淸內超過一個月之後仍保留顯著之活性。此外，本發明的數個共軛物與先前所公布之 • 8小時或2 4小時半衰期的P E G -修飾的哺乳動物及微生物尿酸酶相比較時，在老鼠體內血液循環的半衰期大於 2 天。Chen，et al.，（1981);Fuertges，F，et al.，（ 1 990)J Cont Release 1 1:1 39- 1 48 ;Fujita,T.et al.,(1991)J Pharmacobiodyn 14:623-629。較長半衰期的注射蛋白質藥劑可使其更具成本效益及改進病人的合倂症。延長半衰期也意指此產物較被身體耐受。當P E G與製備自純化四聚物形式之酵素（4個3 5 仟道耳頓次單位）的P B C尿酸酶結合時，它們表現出在老鼠體內大大的降低免疫原性（圖7 )，相較之下P E G 結合較大形式之酵素（譬如3 5仟道耳頓次單位的八聚物，參閱圖1 2 )結合時爲適中之免疫原性，以及與未修飾之酵素結合時則具非常高的免疫原性。以本發明之P E G -尿酸酶重複注射尿酸酶缺乏老鼠可消除它們的高尿酸血症超過2個月，以及保護它們腎臟的構造和功能以對抗尿酸相關傷害（圖8 — 1 1 )。注射完全活化之P B C尿酸酶與1 〇仟道耳頓P E G 的共軛物（圖3 A - 3 B )可顯著大大降低純種尿酸酶一缺乏老鼠的高尿酸血症（圖8 )。以P E G -修飾之 P B C尿酸酶治療全部之尿酸酶缺乏老鼠亦能大# @彳氐@ 液中的尿酸濃度。尿酸酶-缺乏老鼠接受連續的P E G 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -23 - ---------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項本頁) 訂· 570981 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明θ ) 尿酸酶注所得結果類似過去之數據（圖8 )。此治療降低尿液-濃縮缺乏的嚴重性’這是與相對應之未治療、基因類似之老鼠測量比較正常情況下的尿液滲透性，和1 2小 •時之後的水分耗盡量（圖9 )及水分消耗和尿液排出量（圖1 0 )的結果證明之。此處也證明十週的治療中，在第一次開始的1 0天內，以本發明之P E G —尿酸酶治療純種尿酸酶一缺乏（u 〇 X - / 一） ''去除〃老鼠可減少尿酸鹽所引發之腎結構破壞的嚴重性，此可經由磁力共振顯微鏡觀察到（圖1 1 )。顯微鏡方法參閱Hedlund，LW，et al., (1 99 1 )Fund Appl Toxicol 1 6 : 7 87-797 ; Johnsοn,G A,et al.,(1992)in JC Gore，（Ed.),Reviws of Magnetic Resonance in Medicine，Vol.4(pp.l87-219)new York:Pergamon Press。純化製備天然發生及重組性尿酸酶時，除了四聚物（ 1 4 0仟道耳頓）形式之外，也包含此酵素凝集體的混合物◦每一尿酸酶製備時所含的四聚物形式百分比通常約 2 0 %到9 0 %。儘管已證實數種其它未P E G化的蛋白質凝集體是高免疫原性的（參閱Moore，WV，et al.，（1 9 80)J Clin Endocrinol Metab 51:691-697)，而先前硏究的 P E G -43/ 並未描述任何工作來限制凝集體的含量，因此假設此P E G -修飾過的凝集體潛在的免疫原性不序考慮。以本發明的觀察基礎，此類凝聚物出現在酵素的製備內類似先前的 P E G -尿酸酶合成時。它們的存在使得製備無-免疫原性共軛物的工作更困難，也使先前努力將大量低分子量 (請先閱讀背面之注意事項

本頁) -線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -24 - 570981 Α7 ---Β7 五、發明說明辟） P E G結合以p E G化的尿酸酶大大失去其分解尿酸的活性。另一方面，文中所描述的尿酸酶純化及P E G化方法 ’可使每次單位尿酸酶與多達1 〇股的p E G共價附著， •且仍保留超過7 5 %的分解尿酸活性，譬如豬-狒狒嵌合體尿酸酶及來自黃麴菌的酵素（參閱圖3A及4A)。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在另一較佳實施例中，此酵素的大部分四聚物形式的凝集體可經由離子-交換或大小-排除色層分析法於p Η 9到1 〇 · 5之間移除，以1 〇 · 2爲佳，因此在P E G 結合之前進行。來自製備管柱中的每一分層部分的尿酸酶分子量，可使用任何大小-依賴型分析技術偵測之，包括 Η P L C，傳統的大小排除色層分析法，離心，光線散射法，毛細管電泳法或凝膠電泳法於非-變性緩衝液中。使用大小排除色層分析法分離的四聚物尿酸酶，只包含 1 4 0仟道耳頓形式之酵素可集中使用於與P E G結合。使用離子-交換色層分析法所分離的四聚物尿酸酶，來自離子-交換管柱的分層部可經由分析決定其大小使其分層部分是含有四聚物形式但無凝集物的尿酸酶。然後將此尿酸酶集合一起，則至少9 0 %是四聚物形式，因此不想要的凝集物組成可少於1 〇 %，5 %，2 %或更少。文中所呈現的結果指出，即使大部分範圍P E G化，只要是大於四聚物的P B C尿酸酶在老鼠體內就具高免疫原性（圖1 2 )。再者，曾以P E G結合之尿酸酶凝集物注射過的老鼠，接下去再注射P E G化的四聚物或p E G 化凝集物皆在血液循環中被快速淸除其分解尿酸的活性。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-25 - 570981 A7 _ B7 五、發明說明θ ) 相較之下’製備自只含少於5 %凝集物的尿酸酶共轭物，可重複注射很多次而不會加速它們的淸除速率（圖7 )，且以敏感度高的酵素聯結免疫分析法測量不到抗體的形成 •。使用高度純化的四聚物尿酸酶或使用前述本發明之 P E G -尿酸酶改良形共軛物可做進一步區分。相較之下 ’使用先前硏究者所製備的尿酸酶明顯存在一部分（譬如 ’> 1 0 % )的凝集物，而導致需與多數股的p E G結合以抑制免疫原性。結果所得共軛物的酵素活性也大致減少。在其它實施例中，本發明欲表現非-四聚物形式的 P E G化尿酸酶，譬如尿酸酶二聚物，且此製備的尿酸酶共軛物保留至少7 5 %的分解尿酸活性及無-免疫原性。在本發明的另一實施例中，提供一相對於未突變酵素的突變型狒狒肝臟尿酸酶具有未預期般的增加酵素活性之潛力。此改良的靈長類尿酸酶是以傳統的D N A重組技術製備而來。特別不被預期的是只有單一胺基酸殘基（組胺酸取代- 9 7位置的酪胺酸）的取代，就可使拂狒尿酸酶增加專一的酵素活性。當表現於大腸桿菌中時，此突變蛋白質被發現比其被衍生的來源重組狒狒酵素至少高6 0 % 的專一活性。在另一實施例中，專一性活性的增加和/或未P E G 化酵素的溶解度可經由表現豬或豬-狒狒嵌合體尿酸酶的切頂端變異體來加以改良，亦即被表現蛋白質的胺基端至少刪除前六個胺基酸而羧基端至少刪除後三個胺基酸（參閱圖6 )。在P E G化之前，已切除竣基端的重組尿酸酶本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _ 26 - „---_| I---- --- (請先閱讀背面之注意事項本頁) 訂· —線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570981 Α7 Β7 五、發明說明θ ) 可改良溶解度是因爲移除過氧化體的標的序列的緣故。參閱 Miura，S，et al.，（ 1 994)Eur J Biochem 223:1 4 1 - 1 46。本發明的P E G -尿酸酶共軛物有用於使體液及哺乳 •動物組織內的尿酸濃度降低，尤以人類爲佳，且能使用於治療高尿酸濃度的相關病症，包括痛風，痛風石，腎功能不全，器官移植及惡性疾病。p E G -尿酸酶共軛物可注射到具有過高尿酸濃度的哺乳動物。經由任何一種路徑，包括靜脈內，皮下，皮內，肌肉內及腹膜內路徑。另外，也可使用氣溶膠化及呼入之方式。參閱PattonJS，（ 1 996)Adv Drug Delivery Rev 19:3-36 及美國專利 5，458,1 35 ^ 本發明之 P E G -尿酸酶的有效劑量將視個體之尿酸濃度及大小而定。在本發明此觀點的一實施例中，P E G -尿酸酶是在藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑中給與，劑量約在1 〇微克到1克的範圍。在一較佳實施例中，給與的劑量介於 1 0 0微克到5 0 0毫克之間。更佳是此尿酸酶共軛物給與的劑量介於1毫克及1 0 0毫克之間，譬如5毫克， 2 0毫克或5 0毫克。實施例中的給與劑量質量是指在共軛物中的蛋白質量。包含P E G -尿酸酶的藥學組合物可經由傳統技術來製備，譬如描述於 Gennar〇，AR(Ed.)( 1 990)Remington’s Pharmaceatical Sciences ,18th Edition Easton,PA:Mack Publishing Co·適合於製備可注射溶液的賦形劑包括磷酸鹽緩衝鹽液，乳酸鹽的杯格氏溶液（R i n g e r ’ s S ο 1 u t i ◦ η)，水，聚醇類及甘油◦用於膜膜內注射的藥學組成分包含藥學上本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _ 27 _ ---·------裝--- (請先閱讀背面之注意事項本頁) 訂：線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570981 A7 __ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明p ) 可接受的無菌水溶液或非水溶液之液體，分散液，懸浮液 ’或乳劑及用於重組到無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。這些組成物可包額外的組成分，如防腐劑、助溶劑、 •穩定劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝液、抗氧化劑及稀釋劑。 p E G -尿酸酶也能提供作爲調控釋放的組成分，用於植入個體內持續控制體液內的尿酸濃度。譬如，聚乳酸，聚羥基乙酸，再生膠原，聚一 L 一離胺酸，藻酸鈉，膠凝樹膠，去乙醯殼多醣（chhosan)，瓊脂糖、多薄層微脂粒及許多其它傳統積存組合物包含生物可腐蝕生或生物可分解性物質，當其被植入或注射後可漸漸分離並釋放活性物質到四週組織內。譬如，以美國專利5,65 3,974所揭示之方法將P E G -尿酸酶裝入膠囊內的方法就倂入本文的參考資料中。本發明也欲表現生物可腐蝕性或生物可分解性或其它積存組合物的使用。融合幫浦及基質陷捕系統的使用以遞送P E G -尿酸酶也在本發明的範圍內。P E G -尿酸酶也可包於微脂小粒或微脂粒內。微脂粒塡裝膠囊技術已熟知於技藝中。參閱 Lasic，D，et al.(Eds)( 1 995)Stealth Liposomes,Boca Raton,FL:CRC Press o 本發明的P E G -尿酸酶藥學組成分可在高危險性尿酸引發腎衰竭的病人中減少血液透析的需要，譬如器官移植接受者（參閱 Venkataseshan，VS，et al(1990)Nephron 56:317-321)和具有一些惡疾的病人。而擁有大量疊積之尿酸鹽結晶（痛風石）的病人，此類藥物組成分比目前可獲之治療更能快速改善生活品質。 (請先閱讀背面之注意事項

本頁) ;線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -28 - 570981 A7 ---B7 五、發明說明辟）下列範例不限制本發明的任一方面，是例證上述所揭示的各方面觀點◦這些範例所敍述的P E G -尿酸酶的製備是來自己活化（亦即親電子性）之結合p E G衍生物， •此衍生物是天然發生的豬、真菌或細菌的尿酸酶，或重組黃豆、豬或豬狒狒嵌合體尿酸酶，有不同大小及組成分。也包括活性、溶解度、穩定度、藥物動力學、藥效學及免疫學硏究的結果。圖8 - 1 1的數據提供證明。得知本發明的P E G -修飾P B L尿酸酶具有改正高尿酸血症高尿酸尿症的能力，且在動物實驗中可保存腎結構及功能於高尿酸血症及高尿酸尿症所引發的嚴重腎破壞發生時。 Wu，X，et al.，（ 1 994)Proc Natl Acad Sci USA 9 1:742-746。這些範例提供指引給熟知此技藝之人士能製造無一免疫原性的尿酸酶共軛物，且保留至少7 5 %未修飾酵素的分解尿酸活性。範例1 四聚物形式之尿酸酶的製備四聚物形式的尿酸酶（分子量約1 4 0仟道耳頓）是從製備用的大小排除或離子-交換色層分析法從豬肝尿酸酶溶液中純化出來，隨後再經分析用的大小-排除色層分析法。豬肝尿酸酶是得自Slgma-AldnCh，St. Lou1S，M〇， Catalog N〇.U2350 或 U3 377;或 Boehringer Mannheim， Indianapolis,IN o

製備用及分析用的大小-排除色層分析法皆在p H 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -29 - (請先閱讀背面之注意事項 —裝--- 本頁) 線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570981 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（28 ) 形式尿酸酶但不含凝集物的溶離液部分，以用於合成本質上無免疫原性之P E G -尿酸酶。另外，使用其它離子一交換介質亦可分離四聚物形式的尿酸酶，譬如Q-Sepharo.se (A m e 1· c h a m P h a 1· m a c i a)或任何其它容於微驗溶液的介質。此類介質可迅速取自已熟知之技藝。使用修飾的標準方法分析分解尿酸的活性。參閱 Fridovich (1965);Nishimura，et al(1979)。尿酸溶液需不斷製備於新鮮的P Η 9 · 2，5 0毫莫耳濃度硼酸鈉緩衝液內，以提供最終濃度爲6 - 1 5 0微莫耳濃度之分析液。將尿酸酶製備物以含有牛血淸自蛋白（Sigma-Aidrich，St. Loins，M〇，Catalog，No.A-7030 )之硼酸鹽緩衝液稀釋，以至分析液中的白蛋白最終濃度爲0 · 1毫克/毫升。將不同稀釋倍數的酵素與位於微定量板^凹孔內的受質作用，然後以微板讀數儀在2 5 °C，2 9 2 n m每.4秒鐘偵測一次尿酸消失的速率，持續3分鐘。在3分鐘內消耗受質的樣本有1 0 %到4 0 %，因此至少有2 0個數據可用於計算每分鐘減少吸收的最大速率。1國際單位（I V )的尿酸酶活性定義是每分鐘消耗1微莫耳尿酸的酵素量；專一活性是以I ϋ /毫克蛋白質來表示。在圖1 A — 5 B中的相關尿酸酶活性的一些數據可利用1 0 〇微莫耳濃度的尿酸於分析液中取得。其它在1 0 0微莫耳濃度尿酸的速度（ V 10。）結果可由米柯里斯（Michaelis)常數（Km)及最大速度（ν_λ)對個別酵素製備物計算而得，使用公式如下：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ' ：裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 570981 A7 B7 五、發明說明（29 )

1' 0 0 X V (Κ μ + 1 〇〇 ) 此處Κ Μ是以微莫耳濃度單位表示。範例2 結合到四聚物形式的豬尿酸酶將四聚物尿酸酶溶於ρ Η 1 Ο . 2，Ο . 1莫耳濃度 @酸鈉緩衝液中，每莫耳的尿酸酶次單位（分子量3 5仟道耳頓）加入1 0 - 2 0 0莫耳的已活化之各種大小（5 仟道耳頓到3 0仟道耳頓）單甲氧基P E G，譬如4 一硝基苯基碳酸鹽（NPC - PEG)。這些及其它合適的已活化 P E G s 可取自 Shearwater Polymers。將這些 P E G s結合到蛋白質的書明書已在Shearwater Polymer目錄中，可在網際網路上得知WWW.Swpolymers.com以及JM Harris et al.,(Ede.)( 1 997)Poly(ethlene glycol)Chemistry and Biological Applications.ACS Symposium Series 680, Washington，DC:Amercian Chemical Society.結合反應是在〇 -8 °C下進行，直到P E G結合範圍不再顯著改變爲止。然後以色層分析法和/或超過濾法將反應產物內未反應之 P E G移除。每次單位尿酸酶所結合的P E G股數由敍述於 Kunitani,M,et al.,(199)J Chromatogr 588:125-137;Saifer,et al.( 1 997)和Sherman，et al.，（ 1 997)中的改良方法來決定。簡而言之，分裝P E G的反應混合物或來自製備用離子一交換或大小排除管柱之分層部分，在含有0 · 1莫耳濃度氯 ^ ^--------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 i紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -32-~" 570981 A7 B7 五、發明說明（30 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 化鈉的1 0’毫莫耳濃度碳酸鈉緩衝液，ρ Η 1 〇 . 2的 T S Κ 5，0 0 0 P w X L管柱上，，於室溫下以分析用大小一排除Η P L C特性分析。此Η P L C管柱是得自， TosoHaas，Montgomeryville，PA。蛋白質和 P E G s 以紫外線吸收度及折射率偵測儀偵測之。共軛物中的蛋白質量是以相對於合適之未修飾尿酸酶爲標準的紫外線吸收度計算而言。共軛物中的P E G量是以相對於合適P E G標準的折射率高點區域之紫外線吸收度計算得知，用於校正折射率所指的蛋白質分布。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製圖2 A顯示每次單位結合不同股數之P E G的功能性 P E G化豬肝尿酸酶的活性保留。本發明者的數據（▲， □)是與（：1^11^&1.，（1981)相比較。數據一大圓圈是指 01^11以&1.，（1981)所報告的無一免疫原性共軛物。如圖2八中所顯示，每次單位結合多達6股3 0仟道耳頓P E G或每次單位結合多達7股5仟道耳頓P E G的四聚物豬尿酸酶共軛物，仍保留至少7 5 %未修飾酵素的活性。增加5 仟道耳頓或3 0仟道耳頓P E G (最多約每次單位4股）時會明顯增加專一性活性，這可以反應出未修飾酵素與共軛物比較時的相對不溶性或不穩定性。如圖2 B中所顯示，豬尿酸酶共軛物中，每次單位平均多3股3 0仟道耳頓 P E G之較大量P E G者能排除免疫原性，Chen，et al. ，（1981)。範例3 33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 570981 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

五、發明說明θ ) 四聚物重組P B C尿酸酶的P E G共軛物之特性將重組的豬一狒狒嵌合體（P B C )尿酸酶c D N A 次選殖到p E T 3 d表現載體內（No vagen,Madison,WI), •並將所得之質體構築轉形到大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) p L y s S內並表現之（Novagen)。這些程序的進行是使用分子生物學已熟知之技藝的方法。參閱Erllch( 1 989); Sambrook,et al., ( 1 9 8 9); A u s ub ο 1; F, e t al., (Eds),( 1 997)Short Protocols in Molecular Biology，New Yort:John Wiley & Sons 〇圖6顯示P B C尿酸酶所推論出的胺基酸序列（ SEQ ID N〇：l的1 — 225胺基酸和SEQ ID N〇：2的226 — 304胺基酸），與豬（ SEQ ID N〇：l)和狒狒（SEQ ID N〇 :2 )序列比較。狒狒序列與豬序列不同的殘基用粗體字表示◦豬和狒狒序列最旱是由Wu等人（1 9 8 9 )決定且由本發明者再次確認。SEQ ID N〇：l與 GenBank登記號碼pl6164相同，除了 GenBank序列缺少初始甲硫胺基殘基。SEQ ID NO : 2與GenBank登記號碼P 2 5 6 8 9相同，除了 G e η B a n k序列缺少初始甲硫胺基殘基及第1 5 3殘基從組胺酸改爲酥胺酸（圖6中的第1 5 4殘基）。如範例1及2所敍述之將分離出的四聚物形式的 P B C尿酸酶與不同分子量的p e G s結合。以5仟道耳頓一 1 0仟道耳頓、1 9仟道耳頓或3 0仟道耳頓p e G (請先閱讀背面之注意事項再本頁) --裝士 . 線_ 本紙張尺度適用中國國豕ί示準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -34- 570981 A7 _ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明02 ) 所製備的共軛物，每次單位最多包含1股P E G。以至少 1〇仟道耳頓p E G所製備的共軛物，保留9 5 %以上的重組尿酸酶最初專一性活性（圖3 A - 3 B )。 • 下列是四聚物P B C尿酸酶共軛物每次單位含約6股 1 0仟道耳頓P E G的特性，舉例如所指的圖式：缺乏免疫原性（圖7 )和在尿酸酶缺乏老鼠中的效能1 )改正高尿酸血症及高尿酸尿症（圖8 ); 2 )減少尿液-濃縮缺乏的嚴重性（圖9 );和3 )減少腎性糖尿病尿崩症的嚴重性（圖1 0 )。此外，此P E G -尿酸酶可減少尿酸所引起之相關腎傷害的嚴重性，可經由磁力共振顯微鏡觀察 (圖 1 1 )。圖7顯示相對於第一次注射P E G -尿酸酶2 4小時之後每四或五次腹膜內注射2 4小時後的老鼠血淸中， P B C尿酸酶的活性値。P E G共軛物是製備自使用兩種不同P E G活化技術所製備的三種不同P B C尿酸酶。一製備物（參）在尿酸酶一缺乏（u 0 X — / 一）老鼠內測試；其它兩種（△，)則在正常B A L B / C老鼠內測試。最見免疫反應活性的製備物（△)是製備自含有未知數量之尿酸酶凝集物的純化P B C尿酸酶，每次單位結合到平均7股的5仟道耳頓P E G琥珀醯亞胺基碳酸鹽衍生物（S C — P E G ) 。 Zalipsky。美國專利 5,6 1 2,460,此處也倂入本文參考資料中。中度免疫反應性的製備物（_ )的製備，是將含有1 1 %凝集物的P B C尿酸酶製備物每次單位結合到平均2股的1 9仟道耳頓P E G 4 -硝基苯基碳本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _ 35 -

570981 A7 B7 五、發明說明料) 酸鹽衍生物（N P C — P E G ) Sherman et al.，（1997)。最不具免疫反應活性的共軛物（# )的製備，是將平均6股的1 0仟道耳頓N P C - P E G結合到每次單位的P B C 尿酸酶，而此製備物含有< 5 %的尿酸酶凝集物。圖8顯示注射P E G -尿酸酶於尿酸酶-缺乏老鼠（ u 0 X - 後的血淸及尿液之尿酸濃度與尿酸酶活性的反比關係。時間零時注射且在7 2小時後含有〇 · 4 3 I 0的P B C尿酸酶共軛物，每個酵素次單位平均有6股 10仟道耳頓PEG。圖9顯示以P E G -修飾之P B C尿酸酶治療尿酸酶 -缺乏老鼠之減少尿液濃縮不足的嚴重性。尿液滲透性數據的平均和標準偏差是顯示兩隻含有一複本的正常老鼠尿酸酶基因（u ◦ X +/ -）的老鼠，六隻未治療的純種尿酸酶缺乏老鼠（U 0 X - / 一），和六隻純種尿酸酶一缺乏老鼠在第3和第7 2天之間注射1 0次的9 5或 1 9 0 m I U P E G尿酸酶。每一種遺傳背景的老鼠在數集它們的尿液之前先已無限制的吸收水分（實心條狀）或已除去水分2小時（影線條狀）。圖1 0顯示以P E G -修飾之P B C尿酸酶治療尿酸酶-缺乏老鼠之減少腎性糖尿病尿崩症的嚴重性，亦即減少不正常的高消耗水分及不正常的高尿液排出特性。老鼠的遺傳背景和治療程序方法與圖9中的相同。每天水分消耗（實心條狀）和尿液排出（影線條狀）的平均及標準偏差是顯示3組的6隻老鼠之數據。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）請先閱讀背面之注意事項頁經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 - 36- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570981 A7 B7 五、發明說明Μ ) 圖1 1顯示以P E G -修飾之P B C尿酸酶治療尿酸酶缺乏老鼠，經由磁力共振顯微鏡觀察其減少尿酸所引起之腎病的嚴重性。此三組老鼠的基因背景及治療程序與圖 •9和1 0相同。磁力共振顯微鏡技術是在杜克大學醫學中心(Duke University Medical Ceuter,Durham,North Carolira) 的活體內顯微鏡使用中心進行。除了圖8 — 1 1中的結果摘要，證明全部的尿酸酶缺乏老鼠在以P E G -修飾之P B C尿酸酶治療之後可顯著減少尿液中尿酸濃度。最後圖1 2顯示，即使是p E G化的八聚物形式的尿酸酶（尿酸酶分子量=2 8 0仟道耳頓 )也不同於P E G —修飾的四聚物形式之P B C尿酸酶，在老鼠內具免疫原性。此特性反應在單一腹膜內注射後五天內，P E G —修飾的八聚物會加速被淸除。相同老鼠再以相同劑量的相同P E G -尿酸酶製備物於第8和第1 5 天再注射。第二及第三次注射後的2 4小時之後，注射 P E G化之八聚物的老鼠血淸没有偵測到分解尿酸的活性，但注射P E G化四聚物的老鼠血淸可迅速偵測到分解酵素的活性。這些發現再結合第一次注射P E G化八聚物之後觀察到的加速淸除結果（圖1 2 )，支持有效移除全部尿酸酶的順序是大於四聚物的尿酸酶會優先於被P E G化的酵素。範例4 P E G結合來自產蛋白念珠菌的尿酸酶本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -37 -

570981 A7 B7 五、發明說明（35 ) 來自產蛋念珠菌的尿酸酶是得自Sigma-Aldnch ( St_L〇uis，M〇；目錄號碼 U 1 8 7 8 )或 Worthington (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

Biochemical Corporation(Freehold，NJ ;目錄號碼 U R Y W ) 1 •四聚物形式的分離及P E G共軛物是以5仟道耳頓、 1〇仟道耳頓或3 0仟道耳頓P E G合成，程序如範例1 和2中之描述（圖1A — 1B)。圖1A顯示來自產蛋白質念珠菌的尿酸酶每個次單位以不同股數之P E G結合的 P E G化之後所保留的活化功能。本發明者的數據（▲’ _ ’ □)是與 Nishimura，et al.，（ 1 979);Nishimura，et al.， (1 9 8 1) ;Chen,et al.,(1981); Davis,et al., (1 9 8 1); T s uj i, e t al. ，（ 1 9 85 );Yasuda，et al_，（ 1 990)，和 Fu」uta，et al.，（1991)的數據相比較。在大圓圈內所指的數據是Nishimura，et al.,(1 979或 1 981)所公布的無抗原性共軛物，或Chen,et al. ,(1981)所公布的無免疫反應活性共軛物。圖1 B顯示來自蛋白念珠菌的尿酸酶每個次單位以全部質量之P E G結合的P E G化之後所保留的活性功能。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明者的數據（▲ ’ Φ ’ □)是與圖1 A中的那些相同報告數據做比較。大圓圈內所指之數據的意義與圖1 A相同。如圖1 A和1 B所顯示，每次單位平均結合多達6股的5仟道耳頓或3 0仟道耳頓P E G或9股1 0仟道耳頓 P E G時，仍保留至少7 5 %的未修飾酵素活性。當增加附著之3 0仟道耳頓P E G的股數時（每次單位多達5或 6股）也明顯增加專一活性，可以反應出未修飾酵素與共本紙張尺度適用中國國冢標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -38 - 570981 A7 __ B7 五、發明說明06 ) 車尼物/比較的相對不溶性或不穩定性。範例5 結合來自黃麴菌的尿酸酶來自黃麴菌的尿酸酶是得自Sanofi Winthrop(Centilly C’edex,Feance)。與不同分子量的P E G s所合成的共軛物（圖4 A - 4 B )之程序方法敍述於範例2中。將來自黃麴菌之酵素每次單位平均與最多1 2股之5仟道耳頓P E G或最多7股之3 0仟道耳頓P E G結合所製備的共軛物，保留至少7 5 %的此真菌尿酸酶初始的專一活性。範例6 _P E G結合黃豆的尿酸酶來自黃豆根瘤的重組尿酸酶（也稱爲根瘤素3 5 )是以 Khan 和 Tipton(Kahn，K，et al.，（1997)Biochemistry 36:4731-4738)所敍述之方法製備及純化，並由Dr.Tipton(University ofMissoun，Columbia，M〇）所提供。四聚物形式的分離及 PEG共軛物是與各種質量的PEG s合成製備（圖5A -5 B )，程序如範例1和2中之描述。與來自產蛋白念珠菌的尿酸酶（圖1 A )，豬尿酸酶（圖2 A )，豬一狒狒嵌合物尿酸酶（圖3 A )和來自黃麴菌的尿酸酶（圖4 A )比較時，黃豆酵素每次單位只容許與近2股的5仟道耳頓P E G或3 0仟道耳頓P E G結合·而能保留至少 6 7 5 %的初始分解酵素活性。請先閱讀背面之注意事項

頁經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -39- 570981 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明07 範例7 吉'&MM. 來自球形節桿菌的尿酸酶是得自Slgma_Aldnch(目錄號碼U7 128)。參閱日本專利9_丨545 8 1。四聚物形式的分離及與5汗道耳頓和3 〇仟道耳頓p e G結合之製備程序描述於範例1和2中。然而共軛物每次單位與平均超過3股5 仔道耳頓P E G結合時，則保留少於6 〇 %的初始專一性 '活性’若每次單位結合平均約2股3 0仟道耳頓P E G時則保留至少8 5 %的初始專一活性。範例8 G結合胺基端切除的豬及p b C尿酸酶重組豬及P B C尿酸酶的胺基端前6個胺基酸被刪. 除，並經由標準技術表現在大腸桿菌內且純化之，如範例 3中所描述。合成此胺基端切除的尿酸酶P E G共軛物是要製造無免疫原性的共轭物，使其保留至少7 5 %的初始專一活性。範例9 P E G結合豬的尿酸酶及P B C已切除羧基端或胺基及羧 I端皆切除的尿酸酶_ 重組豬和P B C尿酸酶其羧基端最後3個胺基酸被刪 jrthrobacter globiformis )的 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 裝線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 570981 A7 __ B7 五、發明說明08 ) 除’以敍述於範例3中的標準技術將其表現於大腸桿菌中並從中純化。刪除羧基端可以增加未修飾酵素的溶解度，适是因爲移走過氧化體的標的訊號。參閱Miura，et al. ’ '(1 9 94)如範例i和2中的程序敍述，羧基端切除的尿酸酶 P E G共軛物的合成可製造無免疫原性的共軛物，且保留至少7 5 %的初始專一性活性。切除胺基端六個殘基及羧基端三個殘基的重組P B C尿酸酶（P B C - N T - C T )序列顯示在圖6中。此尿酸酶的表現、純化及P E G化如範例1，2和3中之敍述，可製造無-免疫原性的共軛物且保留至少7 5 %的初始專一性活性。範例1〇 I E G結合含有增加P E G附著位置的豬尿酸酶突變株重組的豬尿酸酶製備如範例3中所敍述，其中可藉由以離胺酸取代一個或更多個精胺酸殘基來增加P E G附者位置的可能數目。參閱 Hershfield，MS，etal.，（1991)Proc Natl Acad Sci USA 8 8:7 1 85 -7 1 89。此類突變的一範例的胺基酸序列（P K S尿酸酶）的第2 9 1殘基的精胺酸被離胺酸取代，以及第3 0 1殘基的酥胺酸被絲胺酸取代，如圖 6中所顯示。如範例1和2中的程序敍述，p E G結合到此尿酸酶以製造無-免疫原性的共軛物，且保留至少7 5 %的重組尿酸酶初始專一性活性。範例1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公羞） (請先閱讀背面之注意事項再Ϊ本頁) . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -41 - 570981 A7 ________B7_ 五、發明說明09 ) 結合重組的拂狒尿酴8每突變株使用標準的分生技術，如範例3中，重組的狒狒尿酸酶構成具有一胺基酸的取代（組胺酸取代酪胺酸）在第 • 9 7的位置（參閱圖6中的狒狒序列）◦如範例1和2中的程序敍述，P E G結合四聚物形式的重組狒狒尿酸酶突變株’以合成製造可降低免疫原性且保留至少7 5 %重組尿酸酶初始專一活性的共軛物。範例1 2 來直產蛋白念珠菌、黃麴菌及球形節捍菌的p E G共軻物的免疫原件來自產蛋白念珠菌、黃麴菌及球形節桿菌的尿酸酶是分別得自如範例4、5及7中之敍述。如範例1和2中的程序敍述’以5仟道耳頓、1 0仟道耳頓、2 0仟道耳頓或3 0仟道耳頓P E G合成p E G共軛物。這些共軛物的免疫原性大致已降低或去除。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-42 -

Claims

ABCD 570981——— I公告本六、申請專利範圍附件一（B ): 第88 1 1 3406號專利申請案中文申請專利範圍（無劃線替換本）民國92年8月25日修正 1 · 一種尿酸酶共軛物，其保留7 5 %至1 2 5 %的未共軛之尿酸酶的分解尿酸活性且本質上無免疫原性，並包含經純化的四聚物尿酸酶，其中每一個尿酸酶次單位係共價結合至平均2到1 0股的P E G，其中該P E G的分子量係介於5仟道耳頓至4 0仟道耳頓之間。 2 ·如申請專利範圍第1項之共軛物，其中的尿酸酶是哺乳動物的尿酸酶。 3 ·如申請專利範圍第2項之共轆物，其中的尿酸酶是豬肝，牛肝，或羊肝的尿酸酶。 4 ·如申請專利範圍第1項之共轭物，其中的尿酸酶是重組體。 5 ·如申請專利範圍第4項之共軛物，其中的尿酸酶實質上具有豬，牛，羊或狒狒肝臟的尿酸酶的序列。 6 ·如申請專利範圍第4項之共軛物，其中的尿酸酶是嵌合物。 7 ·如申請專利範圍第6項之共軛物，其中的嵌合物尿酸酶包含部分豬及狒狒肝的尿酸酶。 8 ·如申請專利範圍第7項之共軛物，其中的嵌合物尿酸酶是P B C尿酸酶。 9 ·如申請專利範圍第7項之共軛物，其中的嵌合物本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210 X297公釐） ~ - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 綉經濟部智慧財產局員工谓費合作社印製 570981 ABCD 六、申請專利範圍尿酸酶是P K S尿酸酶。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 〇 .如申請專利範圍第4項之共軛物，其中的尿酸酶實質上具有狒狒肝尿酸酶的序列，而其第9 7位置的酪胺酸已被組胺酸取代。 1 1 .如申請專利範圍第4項之共軛物，其中的尿酸酶含有一胺基末端及一羧基末端，且其中的尿酸酶在一末端或兩末端被截短。 1 2 ·如申請專利範圍第1項之共軛物，其中的尿酸酶是真菌或微生物的尿酸酶。 - 1 3 ·如申請專利範圍第1 2項之共軛物，其中的真菌或微生物的尿酸酶是分離自黃麹菌（Aspergillus flavus) ，球形節桿菌（Arthrobacter globiformis)或產蛋白念珠菌 (Candida util is)，或是實質上具有這些序列之一的重組酵素〇 1 4 ·如申請專利範圍第1項之共軛物，其中的尿酸酶是無脊椎動物的尿酸酶。 1 5 ·如申請專利範圍第1 4項之共輒物，其中的無脊椎動物的尿酸酶是分離自黃猩猩果蠅（Drc)sc)phlla 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 melanogaster)或假暗色果蠅（Drosophila pseudoobscura)，或是實質上具有這些序列之一的重組酵素。 1 6 ·如申請專利範圍第1項之共軛物，其中的尿酸酶是植物的尿酸酶。 1 7 ·如申請專利範圍第1 6項之共軛物，其中的植物尿酸酶是分離自黃豆（Glycine max)的根瘤或是實質上本紙張尺度適用巾國國家標準（CNS )八视^ ( 210X297公羡)二2 - ""

A、申請專利範圍具有此尿酸酶序列的重組酵素。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 8 ·如申請專利範圍第1項之共軛物，其中每一尿酸酶次單位平均共價結合至3至8股的P E G。 1 9 ·如申請專利範圍第1 8項之共軛物，其中每一尿酸酶次單位平均共價結合至4至6股的P E g。 2 ◦•如申請專利範圍第1項之共軛物，其中的尿酸酶是四聚物。 2 1 ·如申請專利範圍第1項之共軛物，其中的 P E G股共價結合到尿酸酶是經由胺基甲酸乙酯結合，二級胺結合和醯胺結合。 2 2 ·如申請專利範圍第1項之共軛物，其中的 P E G是直線的。 2 3 ·如申請專利範圍第1項之共軛物，其中的 P E G是分支的。 2 4 · —種用於降低體液或組織中升高的尿酸濃度之藥學組成物，其包含申請專利範圍第1項之共軛物及藥學上可接受之載體。 2 5 ·如申請專利範圍第2 4項之藥學組成物，其中該組成物係經由凍乾以穩定之，且在重新組合時迅速溶解以提供可適用於非經腸道投服之溶液。 2 6 .如申請專利範圍第2 4項之藥學組成物，其中該升高的尿酸濃度與痛風，痛風石，腎功能不足，器官移植及惡性疾病等有關。 2 7 · —種用於自尿酸酶溶液中分離出四聚物形式的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

570981 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍尿酸酶之方法，該溶液包含四聚物尿酸酶及尿酸酶凝集物，該方法包含步驟：將該溶液置入至少一個Ρ Η 9至 1 0 · 5之間的分離用管柱上；以及自該管柱回收含有經分離之四聚物尿酸酶部分的1或多個分級液，其中該1或多個分級液實質上不含有尿酸酶凝集物。 2 8 ·如申請專利範圍第2 7項之方法，其中該尿酸酶之溶液係置入Ρ Η 1 0 · 2之管柱中。 2 9 ·如申請專利範圍第2 7項之方法，其中該分離是以離子交換和大小排除之特性爲基礎。 3 0 ·如申請專利範圍第2 7項之方法，其進一步包含分析該分級液的步驟以決定至少一項存有該四聚物尿酸酶及不存有尿酸酶凝集物的特性。 3 1 ·如申請專利範圍第3 0項之方法，其中該分析步驟包括至少1種選自色層分析法，離心法，光線散射法及電泳之分析。 3 2 ·如申請專利範圍第3 1項之方法，其中該色層分析法是高效液相色層分析法。 3 3 ·如申請專利範圍第2 7項之方法，其中該經分離之四聚物尿酸酶含有少於1 〇 %的尿酸酶凝集物。 3 4 · —種經由申請專利範圍第2 7項之方法所製造的經分離之四聚物尿酸酶，其實質上不含有尿酸酶凝集物且包含次單位，其中該尿酸酶之每1個次單位係能夠共價結合至平均爲2至1 0股之PEG，其中每1個PEG分子之分子量係介於5 kD a至5 0 k D a之間。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· -訂· -絲本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~