BR9917760B1 - Método para isolar uma forma tetramérica de uricase a partir de uma solução de uricase purificada - Google Patents

Description

“MÉTODO PARA ISOLAR UMA FORMA TETRAMÉRICA DE URICASE A PARTIR DE UMA SOLUÇÃO DE URICASE PURIFICADA” Dividido do pedido PI 9912974-4, depositado em 02/08/1999 Declaração dos Direitos do Governo Uma parte da pesquisa descrita no presente pedido de patente foi feita com suporte de Grant DK48529 dos Institutos Nacionais da Saúde. Conseqüentemente, o governo dos Estados Unidos pode ter certos direitos sobre a presente invenção.

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à modificação química das proteínas para prolongar as suas vidas médias em circulação e para reduzir a sua capacidade imunogênica. Mais especificamente, a invenção refere-se à conjugação de poli(etileno glicóis) ou de poli(óxidos de etileno) em urate oxidases, que elimina substancialmente a capacidade imunogênica da urate oxidase sem comprometer a sua atividade uricolítica.

Fundamentos da Invenção As indicações contidas nesta seção de fundamentos não constituem uma admissão da técnica anterior, mas ao invés disso refletem os próprios comentários subjetivos dos autores da invenção e as interpretações do estado da técnica no momento em que a invenção foi feita. Essas interpretações podem incluir deduções dos inventores pessoais até o momento não divulgadas, deduções essas que não faziam parte da técnica anterior.

As urate oxidases (uricases; E.C. 1.7.1.3) são enzimas que catalisam a oxidação do ácido úrico a um produto mais solúvel, a alantoina, um metabólito da purina que é excretado mais rapidamente. Os seres humanos não produzem a uricase enzimaticamente ativa, em conseqüência de diversas mutações no gene para as uricases adquiridas durante a evolução de primatas superiores. Wu, X, et al., (1992) J. Mol. Evol. 34:78-84. Conseqüentemente, em indivíduos suscetíveis, as concentrações excessivas do ácido úrico no sangue (hiperuricemia) e na urina (hiperuricossuria) podem conduzir à artrite dolorosa (gota), desfigurando depósitos de urate (cálculos artríticos), e à falha renal. Em alguns indivíduos afetados, as drogas disponíveis tais como o alopurinol (um inibidor da síntese de ácido úrico) produz efeitos adversos limitadores do tratamento ou não aliviam essas condições adequadamente. Hande, KR, et al., (1984) Am. J. Med. 76:47-56; Fam, AG, (1990) Baillière's Clin. Rheumatol. 4:177-192. As injeções de uricase podem diminuir a hiperuricemia e o hiperuricossuria, pelo menos temporariamente. Uma vez que a uricase é uma proteína estranha nos seres humanos, entretanto, até mesmo a primeira injeção da proteína não modificada de Aspergillus flavus induz reações anafiláticas em várias porcentagens de pacientes tratados (Pui, C-H, et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816), e as respostas imunológicas limitam a sua utilidade para o tratamento crônico ou intermitente. Donadio, D, et ah, (1981) Nouv Presse Méd 10:711-712; Leaustic, M, et ah, (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-5:54. O desempenho sub-ótimo de tratamentos disponíveis para a hiperuricemia tem sido reconhecido por diversas décadas. Kissel, P, et ah, (1968) Nature 217:72-74. Analogamente, a possibilidade de que determinados grupos de pacientes com gota grave possam se beneficiar de uma forma segura e eficaz da uricase injetável tem sido reconhecida por muitos anos. Davis, FF, et ah, (1978) em GB Broun, et al., (Eds.) Enzyme Engineering, Vol. 4 (páginas 169-173) New York, Plenum Press; Nishimura, H, et ah, (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, et ah, (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, et ah, (1981) Lancet 2(8241):281-283; Abuchowski, A, et ah, (1981) J. Pharmacol. Exp. Ther. 219:352-354; Chen, RH-L, et ah, (1981) Biochim. Biophys. Acta 660:293-298; Chua, CC, et ah, (1988) Ann. Int. Med. 109:114-117; Greenberg, ML, et ah, (1989) Biochem. Anal. 176:290-293. As uricases derivadas dos órgãos de animais é quase insolúvel nos solventes que são compatíveis com a administração segura por meio de injeção. Patente Norte-americana 3.616.231. Determinadas uricases derivadas de plantas ou de microorganismos são mais solúveis em solventes medicamente aceitáveis. Entretanto, a injeção das enzimas microbianas induz rapidamente as respostas imunológicas que podem conduzir a reações alérgicas que ameaçam a vida ou à inativação e/ou ao afastamento acelerado da uricase de circulação. Donadio, et ah, (1981); Leaustic, et ah, (1983). As enzimas baseadas nas seqüências de aminoácidos deduzidas de uricases de mamíferos, incluindo o porco e o babuíno, ou de insetos, tais como, por exemplo, Drosophila melanogaster ou Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, et ah, (1990) Mol. Cell. Biol. 10:5114-5127), não têm sido candidatos apropriados para o uso clínico, devido aos problemas da capacidade imunogênica e da insolubilidade em pH fisiológico. A modificação covalente das proteínas com poli(etileno glicol) ou óxido de poli(etileno) (ambos indicados como PEG), tem sido empregada para aumentar a vida útil da proteína e reduzir a capacidade imunogênica. Patentes Norte-americanas 4.179.337, 4.766.106. e 4.847.325; Saifer, MGP, et al., (1994) Adv. Exp. Med. Biol. 366:377-387. O acoplamento de PEG de peso molecular elevado para produzir conjugados com vidas médias em circulação prolongadas e/ou capacidade imunogênica diminuída, enquanto é conservada a atividade funcional, foi demonstrado anteriormente para uma outra enzima, a dismutase de superóxido (Somack, R, et al, (1991) Free Rad. Res. Commun. 12-13: 553-562; Patentes Norte-americanas 5.283.317 e 5.468.478) e para outros tipos de proteínas, por exemplo, citocinas (Saifer, MGP, et al., (1997) Polym. Preprints 38:576-577; Sherman, MR., et al., (1997) em JM Harris, et al., (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (páginas 155-169) Washington, D.C.: American Chemical Society). Os conjugados de uricase com polímeros com exceção de PEG também foram descritos. Patente Norte-americana 4.460.683.

Em quase todas as tentativas relatadas para PEGilar a uricase (isto é, para acoplar covalentemente a PEG à uricase), o PEG foi ligado primeiramente aos grupos amino, incluindo o resíduo do terminal amino e os resíduos de lisina disponíveis. Nas uricases normalmente utilizadas, o número total de lisinas em cada uma das quatro subunidades idênticas fica entre 25 (Aspergillus flavus (patente norte-americana 5.382.518)) e 29 (porco (Wu, X, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:9412-9416)). Algumas das lisinas são estão disponíveis para a PEGilação na conformação nativa da enzima. A abordagem mais comum para reduzir a capacidade imunogênica da uricase tem sido o acoplamento de grandes números de filamentos de PEG de baixo peso molecular. Isto resulta invariavelmente em grandes diminuições na atividade enzimática dos conjugados resultantes.

Os pesquisadores anteriores utilizaram a uricase injetada para catalisar a conversão do ácido úrico em alantoina in vivo. Veja Pui, et al., (1997). Esta é a base para o uso na França e na Itália da uricase do fungo Aspergillus flavus (Uricozyme®) para impedir ou corrigir temporariamente a hiperuricemia associada com a terapia citotóxica para malignidades hematológicas e reduzir temporariamente a hiperuricemia grave nos pacientes com gota. Potaux, L, et al., (1975) Nouv Presse Méd 4:1109-1112, Legoux, R, et al, (1992) J. Biol. Chem. 267:8565-8570; Patentes Norte-americanas 5.382.518 e 5.541.098. Por causa de sua vida em circulação curta, a Uricozyme® requer injeções diárias. Além disso, não é bem adequada para a terapia a longo prazo por causa de sua capacidade imunogênica.

Uma única injeção intravenosa de um preparado de uricase de Candida utilis acoplada a PEG de 5 kDa reduziu a urate do soro a níveis não detectáveis em cinco indivíduos humanos cuja concentração média da urate do soro da pre-injeção era de 6,2 mg/dl, que fica dentro da faixa normal. Davis, et al., (1981). Aos indivíduos foi aplicada uma injeção adicional quatro semanas mais tarde, mas suas respostas não foram relatadas. Nenhum anticorpo para a uricase foi detectado depois da segunda (e última) injeção, ao se empregar um ensaio de difusão de gel relativamente insensível. Esta referência não relatou nenhum resultado dos tratamentos crônicos ou subcrônicos de pacientes humanos ou de animais experimentais.

Um preparado da uricase de Arthrobacter protomorfiae acoplada a PEG de 5 kDa, foi empregado para controlar temporariamente a hiperuricemia em um único paciente com linfoma cuja concentração da urate do soro da pre-injeção era de 15 mg/dl. Chua, et al., (1988). Por causa da condição crítica do paciente e da curta duração do tratamento (quatro injeções durante catorze dias), não foi possível avaliar a eficácia ou a segurança do conjugado a longo prazo.

No presente pedido, a expressão "capacidade imunogênica" refere-se à indução de uma resposta imunológica por um preparado injetado de uricase modificada por PEG ou não modificada (o antígeno), enquanto que "capacidade antigênica" refere-se à reação de um antígeno com anticorpos preexistentes. Coletivamente, a capacidade antigênica e a capacidade imunogênica são indicadas como "imunoreatividade". Em estudos precedentes da PEG-uricase, a imunoreatividade foi avaliada através de uma variedade de métodos, incluindo: 1) a reação in vitro de PEG-uricase com anticorpos pré-formados; 2) medições da síntese de anticorpo induzida; e 3) taxas de afastamento aceleradas depois de injeções repetidas.

As tentativas precedentes de eliminar a capacidade imunogênica das uricases de diversas fontes mediante o acoplamento de vários números de filamentos de PEG com vários ligantes atingiram um sucesso limitado. As PEG-uricases foram apresentadas primeiramente por FF Davis e por Y Inada e seus colegas. Davis, et al., (1978); Patente Norte-americana 4.179.337; Nishimura et al., (1979); Patentes Japonesas 55-99189 e 62-55079. O conjugado apresentado na patente '337 foi sintetizado ao se reagir a uricase de origem não especificada com um excesso molar de 2.000 vezes de PEG de 750 daltons, indicando que um grande número de moléculas de polímero foi provavelmente ligado a cada subunidade de uri case. A patente '337 apresenta o acoplamento de PEG ou de poli(propileno glicol) com pesos moleculares de 500 a 20.000 daltons, preferivelmente de aproximadamente 500 a 5.000 daltons, para se obter conjugados ativos solúveis em água não imunogênicos de vários hormônios de polipeptídeos e enzimas incluindo as oxidareductases, das quais a uricase é um de três exemplos. Além disso, a patente '337 enfatiza o acoplamento de 10 a 100 filamentos de polímero por molécula de enzima, e a retenção de pelo menos 40% da atividade enzimática. Nenhum resultado de teste foi relatado para a extensão do acoplamento de PEG aos grupos amino disponíveis de uricase, a atividade uricolítica específica residual, ou a imunoreatividade do conjugado.

Os dados de 13 citações que se referem à PFGilação da uricase são resumidos na Tabela 1. Alguns destes resultados são apresentados também graficamente nas figuras 1A-2B. Sete dessas publicações descrevem diminuições significativas na atividade uricolítica medida in vitro causadas pelo acoplamento de vários números de filamentos de PEG à uricase de Candida utilis. O acoplamento de um grande número de filamentos de PEG de 5 kDa à uricase do fígado de suíno acarretou resultados similares, tal como descrito na publicação de Chen e em um relatório de simpósio pelo mesmo grupo. Chen, et al., (1981); Davis, et al., (1978).

Entre os estudos resumidos na Tabela 1, a imunoreatividade da uricase foi relatada como sendo diminuída pela PEGilação em sete deles e eliminada em cinco deles. Em três dos últimos cinco estudos, a eliminação da imunoreatividade foi associada com as diminuições profundas na atividade uricolítica - até no máximo 15%, 28%, ou 45% da atividade inicial. Nishimura, et al, (1979) (atividade de 15%); Chen, et al., (1981) (atividade de 28%); Nishimura, et al., (1981) (atividade de 45%). No quarto relatório, o PEG foi relatado como sendo acoplado a 61% dos resíduos de lisina disponíveis, mas a atividade específica residual não foi indicada. Abuchowski, et al., (1981). Entretanto, uma equipe de pesquisa que incluía dois dos mesmos cientistas e utilizou os mesmos métodos relatou em outra parte que essa extensão do acoplamento deixou uma atividade residual de somente 23% a 28%. Chen, et al, (1981). As publicações de 1981 de Abuchowski et de al. e de Chen et al., indicam que, para reduzir substancialmente a capacidade imunogênica da uricase, o PEG deve ser acoplado a aproximadamente 60% dos resíduos de lisina disponíveis (Tabela 1). A quinta publicação em que o imunoreatividade da uri case foi relatada como tendo sido eliminado não divulga a extensão do acoplamento do PEG, a atividade uricolítica residual, ou a natureza da ligação de PEG-proteína. Veronese, FM, et al., (1997) em JM Harris, et al., (Eds.), Poli(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (páginas 182-192) Washington, D.C.: American Chemical Society. A conjugação de PEG a uma fração menor dos resíduos de lisina em uricase reduziu mas não eliminou a sua imunoreatividade em animais experimentais. Tsuji, J, et al, (1985) Int. J. Imunopharmacol. 7:725-730 (28% a 45% dos grupos amino acoplados); Yasuda, Y, et al, (1990) Chem. Pharm. Bull. 38-2053-2056 (38% dos grupos amino acoplados). As atividades uricolíticas residuais dos adutos correspondentes variaram de <33% (Tsuji, et al.) a 60% (Yasuda, et al) de seus valores iniciais. Tsuji, et al. sintetizaram conjugados de PEG-uricase com PEGs de 7,5 kDa e 10 kDa, além de PEG de 5 kDa. Todos os conjugados resultantes eram um pouco imunogênicos e antigênicos, enquanto que apresentavam atividades enzimáticas bastante reduzidas (Tabela 1; Figuras la-lb).

Um preparado de uricase PEGilada de Candida utilis que foi administrado com segurança duas vezes a cada um de cinco seres humanos foi relatado como tendo retido somente 11% de sua atividade inicial. Davis, et al., (1981). Diversos anos mais tarde, a uricase modificada com PEG de Arthrobacter protomorfiae foi administrada quatro vezes a um paciente com linfoma avançado e hiperuricemia grave. Chua, et al., (1988). Embora a atividade residual desse preparado de enzima não foi medida, Chua, et al., demonstraram a ausência de anticorpos antiuricase no soro do paciente 26 dias depois da primeira injeção de PEG-uricase, ao se empregar um ensaio de imunosorvente ligado por enzima (ELISA).

Conforme resumido na Tabela 1, os estudos precedentes da uricase PEGilada mostram que a atividade catalítica é bastante reduzida mediante o acoplamento de um número suficiente de filamentos de PEG para diminuir substancialmente a sua imunoreatividade. Além disso, a maioria dos preparados precedentes de PEG-uricase era sintetizada ao se utilizar PEG ativado com cloreto cianúrico, um derivado de triazina (2,4,6-tricloro-l,3,5-triazina) que demonstrou introduzir novas determinantes antigênicas e induzir a formação de anticorpos em coelhos. Tsuji, et al., (1985). TABELA 1: Características de PEG-uricases dos Estudos Precedentes A patente japonesa 3-148298, concedida a A. Sano, et al., apresenta proteínas modificadas, incluindo a uricase, derivatizadas com PEG que tem um peso molecular de 1-12 kDa que mostram uma capacidade antigênica reduzida e uma ação "prolongada melhorada", e métodos de produção de tais peptídeos derivatizados. Entretanto, não há nenhuma descrição a respeito das contagens de filamentos, ensaios de enzima, testes biológicos ou o significado de “prolongada melhorada”. As patentes japonêsas 55-99189 e 62-55079, ambas concedidas a Y Inada, apresentam conjugados de uricase preparados com PEG-triazina ou bis-PEG-triazina (indicado como PEG2 na Tabela 1), respectivamente. Veja Nishimura, et al., (1979 e 1981). No primeiro tipo de conjugado, os pesos moleculares dos PEGS eram de 2 kDa e 5 kDa, enquanto que no segundo apenas o PEG de 5 kDa foi utilizado. Nishimura, et al., (1979) relataram a recuperação de 15% da atividade uricolítica após a modificação de 43% das lisinas disponíveis com o PEG linear de 5 kDa, enquanto que Nishimura, et al. (1981) relataram a recuperação de 31% ou 45% da atividade uricolítica após a modificação de 46% ou de 36% das lisinas, respectivamente, com PEG2.

Sumário da Invenção Os estudos precedentes ensinam que, quando uma redução significativa na capacidade imunogênica e/ou na capacidade antigênica da uricase é obtida por meio da PEGilação, ela é associada invariavelmente com uma perda substancial da atividade uricolítica. A segurança, a conveniência e a economia dos produtos biofarmacêuticos são todas impactadas adversamente por diminuições em suas potências e pela necessidade resultante de aumentar o dose administrada. Desse modo, há uma necessidade quanto a um meio seguro e eficaz alternativo para baixar os níveis elevados de ácido úrico nos fluidos corpóreos, incluindo 0 sangue e a urina. A presente invenção apresenta uma PEG-uricase substancialmente não imunogênica que retém toda ou quase toda a atividade uricolítica da enzima não modificada.

Uma realização da presente invenção é um conjugado de urate oxidase (uricase) que retém pelo menos aproximadamente 75% da atividade uricolítica de uricase não conjugada e tem uma capacidade imunogênica substancialmente reduzida. Essa realização inclui uma uricase purificada na qual cada subunidade pode ser covalentemente ligada a uma média de dois a dez filamentos de PEG, que podem ser lineares ou ramificados, sendo que cada molécula de PEG pode ter um peso molecular entre aproximadamente 5 kDa e 100 kDa. A uricase deste aspecto da invenção pode ser recombinante. Quer seja recombinante ou não, a uricase pode ser de origem de mamíferos. Em um aspecto desta realização, a uricase pode ser uricase de fígado de suínos, bovinos ou ovinos. Em um outro aspecto desta realização, a uricase pode ser quimérica. A uricase quimérica pode conter partes da uricase de fígado de suíno e/ou de fígado de babuíno. Por exemplo, a uricase quimérica pode ser uricase quimérica de porco-babuíno (uricase de PBC) ou uricase de suíno que contém as mutações R291K e T301S (uricase de PKS) (veja as seqüências na figura 6 e os resultados dos estudos fisiológicos e imunológicos nas figuras 7-12). Altemativamente, o uricase pode ser uricase de fígado de babuíno onde a tirosina 97 foi substituída pela histidina, por meio do que a atividade específica da uricase pode ser aumentada em pelo menos aproximadamente 60%. A uricase da invenção, qualquer que seja a origem, também pode estar em uma forma que seja truncada, no terminal amino ou no terminal carboxila, ou em ambos os terminais. Analogamente, a uricase pode ser uricase fungica ou microbiana. Em um aspecto desta realização, a uricase fungica ou microbiana pode ser uma forma natural ou recombinante da uricase de Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis ou Candida utilis. Altemativamente, a uricase pode ser uma uricase de invertebrado tal como, por exemplo, uma forma natural ou recombinante da uricase de Drosophila melanogaster ou Drosophila pseudobscura. A uricase da invenção também pode ser uma uricase de planta, por exemplo, uma forma natural ou recombinante da uricase do nódulo da raiz de soja (Glycine max). O PEG pode ter um peso molecular médio entre aproximadamente 5 kDa e 100 kDa; preferivelmente, o PEG pode ter um peso molecular médio entre aproximadamente 10 kDa e 60 kDa; mais preferivelmente, o PEG pode ter um peso molecular médio entre aproximadamente 20 kDa e aproximadamente 40 kDa tal como, por exemplo, 30 kDa. O número médio de filamentos covalentemente ligados do PEG pode ser de dois a dez filamentos por subunidade de uricase; preferivelmente, o número médio de filamentos covalentemente ligados pode ser de três a oito por subunidade; mais preferivelmente, o número médio dos filamentos do PEG pode ser de quatro a seis por subunidade. Em um aspecto desta realização, a uricase pode ser tetramérica. Os filamentos de PEG podem ser covalentemente ligados à uricase através das ligações uretano (carbamato), ligações amina secundária, e/ou ligações amida. Quando a uricase é uma forma recombinante de qualquer das uricases aqui mencionadas, a forma recombinante pode ter substancialmente a sequência da forma de ocorrência natural.

Uma outra realização da presente invenção é uma composição farmacêutica para baixar os níveis de ácido úrico nos fluidos corpóreos, contendo qualquer um dos conjugados de PEG-uricase descritos acima e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição pode ser estabilizada através de liofilização, e também pode dissolver imediatamente com a reconstituição para que se obtenha soluções apropriadas para a administração parenteral. A presente invenção também apresenta um método para baixar os níveis de ácido úrico nos fluidos corpóreos e tecidos de um mamífero. O método inclui a administração, a um mamífero, de uma quantidade redutora de ácido úrico eficaz de PEG-uricase. A PEG-uricase pode ser uma uricase purificada de duas ou mais subunidades na qual cada subunidade pode ser covalentemente ligada a uma média de dois a dez filamentos de PEG linear ou ramificado, sendo que cada molécula de PEG pode ter um peso molecular entre aproximadamente 5 kDa e 100 kDa, em um veículo farmaceuticamente aceitável. O mamífero pode ser um ser humano. A etapa da administração pode ser, por exemplo, injeção por via intravenosa, intradermal, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal, ou pela inalação de um preparado aerossolizado. Os níveis de ácido úrico elevados podem estar no sangue, na urine e/ou em outros fluidos corpóreos e tecidos, e podem ser associados com a gota, cálculos artríticos, a insuficiência renal, o transplante de órgãos ou uma doença maligna.

Outras realizações da presente invenção incluem um método para isolar uma forma tetramérica da uricase de uma solução que contém formas múltiplas da uricase, e o produto desse método. Inicialmente, a solução pode conter uricase tetramérica e agregados de uricase. O método pode incluir as etapas de: aplicação da solução a pelo menos uma coluna de separação a um pH entre aproximadamente 9 e 10,5 tal como, por exemplo, 10,2; a recuperação das frações do eluato e a identificação daqueles que podem conter uricase tetramérica isolada, sendo que as frações são substancialmente livres de agregados de uricase; e o agrupamento das frações da uricase tetramérica isolada. A coluna de separação pode ser baseada na troca de íons, na exclusão de tamanho, ou em qualquer outra propriedade de separação eficaz. O método também pode incluir a análise das frações para determinar a presença de uricase tetramérica e/ou da ausência de agregados de uricase. Por exemplo, essa análise pode incluir a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), outros métodos cromatográficos, dispersão luminosa, centrifugação e/ou eletroforese. Em um aspecto desta realização, a uricase tetramérica purificada pode conter menos de aproximadamente 10% de agregados de uricase.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1A mostra a retenção da atividade pela uricase PEGilada de Candida utilis em função do número de filamentos de PEG acoplados por subunidade. A figura 1B mostra a retenção da atividade pela uricase PEGilada de Candida utilis em função da massa total de PEG acoplada por subunidade. A figura 2A mostra a retenção da atividade pela uricase PEGilada do fígado de suíno em função do número de filamentos de PEG acoplados por subunidade. A figura 2B mostra a retenção da atividade pela uricase PEGilada do fígado de suíno em função da massa total de PEG acoplada por subunidade. A figura 3A mostra a retenção da atividade pela uricase quimérica de porco-babuíno (PBC) PEGilada em função do número de filamentos acoplados por subunidade. A figura 3B mostra a retenção da atividade pela uricase de PBC PEGilada em função da massa total de PEG acoplada por subunidade. A figura 4A mostra a retenção da telha da atividade pela uricase PEGilada de Aspergillus flavus em função do número de filamentos de PEG acoplados por subunidade. A figura 4B mostra a retenção da atividade pela uricase PEGilada de Aspergillus flavus em função da massa total de PEG acoplada por subunidade. A figura 5A mostra a retenção da atividade pela uricase de nódulo de raiz de soja recombinante PEGilada em função do número de filamentos de PEG acoplados por subunidade. A figura 5B mostra a retenção da atividade pela uricase de nódulo de raiz de soja recombinante PEGilada em função da massa total de PEG acoplada por subunidade. A Figura 6 mostra as seqüências de aminoácidos deduzidas da uricase quimérica de porco-babuíno (uricase de PBC), da uricase de PBC que é truncada nos terminais amino e carboxila (PBC-NT-CT) e da uricase de suíno que contém as mutações R291K e T301S (uricase de PKS), comparadas com as seqüências de suíno e babuíno. A Figura 7 mostra a atividade da uricase no soro de camundongo 24 horas depois de cada uma entre quatro ou cinco injeções intraperitoneais de uricase de PBC modificada com PEG, em relação ao valor 24 horas depois da primeira injeção. A Figura 8 mostra a relação inversa entre a atividade da uricase de PBC modificada com PEG injetada no soro de um camundongo com deficiência de uricase e as concentrações de ácido úrico no soro e na urina. A Figura 9 mostra a gravidade decrescente de um defeito de concentração na urina em camundongos com deficiência em uricase (uox -/-) que foram tratados com uricase de PBC modificada com PEG. A Figura 10 mostra a gravidade decrescente de diabetes insipidus nefrogênica em camundongos deficiência de uricase (uox -/-) que foram tratados com uricase de PBC modificada com PEG. A Figura 11 mostra a gravidade decrescente da nefropatia induzida por ácido úrico, tal como visualizada pela microscopia de ressonância magnética, em camundongos com deficiência em uricase (uox -/-) que foram tratados com uricase de PBC modificada com PEG. A Figura 12 mostra o afastamento acelerado da circulação de camundongos BALB/c do octâmero de uricase de PBC injetado, comparado com o tetrâmero, quando ambos foram acoplados a cinco a seis filamentos de PEG de 10 kDa por subunidade.

Descrição Detalhada das Realizações Preferidas Os preparados purificados de uricases naturais e recombinantes contêm geralmente uma mistura de agregados de enzima, além da forma (140 kDa) tetramérica. A porcentagem de cada preparado de uricase que está na forma tetramérica varia geralmente de aproximadamente 20% a 90%. Apesar da evidência que os agregados não PEGilados de diversas outras proteínas são altamente imunogênicos (veja, por exemplo, Moore, WV, et al., (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab. 51:691-697), os estudos precedentes de PEG-uricase não descrevem nenhum esforço para limitar o teor dos agregados, sugerindo que a capacidade imunogênica potencial dos agregados modificados com PEG não foi levada em consideração. Com base nas observações dos autores da presente invenção, parece provável que esses agregados estavam presentes nos preparados de enzima utilizados para as sínteses precedentes de PEG-uricase. A sua presença pode ter dificultado a tarefa de preparar conjugados não imunogênicos. Também parece que as grandes perdas da atividade uricolítica observadas em esforços precedentes para PEGilar a uricase estavam relacionadas ao grande número de filamentos de PEG de baixo peso molecular que foram acoplados. Por outro lado, os métodos de purificação e PEGilação da uricase aqui descritos permitem a ligação covalente do até dez filamentos de PEG por subunidade enquanto que retém mais de 75% da atividade uricolítica, pelo menos para determinadas uricases, por exemplo, a uricase quimérica de porco-babuíno e o enzima de A. flavus (veja as figuras 3A e 4A).

Em uma outra realização preferida, substancialmente todos os agregados da forma tetramérica da enzima podem ser removidos através de cromatografia de troca de íons ou de exclusão de tamanho a um pH entre aproximadamente 9 e 10,5, preferivelmente de 10,2, antes da conjugação do preparado de uricase substancialmente tetramérico resultante. O peso molecular da uricase em cada fração da coluna preparativa pode ser monitorado por qualquer técnica analítica dependente de tamanho, incluindo, por exemplo, a HPLC, a cromatografia de exclusão de tamanho convencional, a centrifugação, a dispersão luminosa, a eletroforese capilar ou a eletroforese com gel em um tampão não desnaturante. Para a uricase tetramérica isolada ao se empregar a cromatografia de exclusão de tamanho, as frações que contêm somente a forma de 140 kDa da enzima podem ser agrupadas e utilizadas para a conjugação em PEG. Para a uricase tetramérica isolada ao se empregar a cromatografia de troca de íons, as frações da coluna de troca de íons podem ser analisadas com respeito ao tamanho para se determinar quais frações contêm quantidades substanciais da forma tetramérica sem agregados detectáveis. Da uricase agrupada dessa maneira, pelo menos 90% podem estar na forma tetramérica; os agregados indesejáveis podem desse modo constituir tão pouco quanto aproximadamente 10%, 5%, 2%, ou menos, da uricase isolada total.

Os resultados aqui apresentados indicam que, mesmo quando extensivamente PEGiladas, as formas da uricase de PBC maiores do que o tetrâmero são altamente imunogênicas nos camundongos (figura 12). Além disso, nos camundongos de tinham sido injetados uma vez com os conjugados de PEG de agregados de uricase, a atividade uricolítica nas injeções subseqüentes tanto de tetrâmeros PEGilados quanto de agregados PEGilados foi retirada rapidamente de circulação. Por outro lado, os conjugados preparados a partir de uricase contendo menos de 5% de agregados poderíam ser reinjetados muitas vezes sem nenhuma aceleração de suas taxas de afastamento (figura 7) e sem a formação detectável de anticorpos, conforme medido por um imunoensaio ligado por enzima sensível. O emprego de uricase tetramérica altamente purificada distingue ainda mais os conjugados aperfeiçoados da presente invenção dos preparados de PEG-uricase descritos anteriormente. Por outro lado, a presença de uma proporção significativa (por exemplo, > 10%) dos agregados nos preparados de uricase utilizados por alguns pesquisadores precedentes pode ter conduzido ao acoplamento de um grande número de filamentos de PEG nos esforços para suprimir a capacidade imunogênica. Conseqüentemente, a atividade enzimática dos conjugados resultantes foi diminuída substancialmente.

Em uma incorporação da invenção, a uricase pode ser conjugada por meio de uma ligação covalente biologicamente estável, não tóxica, para um numero relativamente pequeno de cordões de PEG. Tais ligações podem incluir ligações de uretano (carbamato), ligações amino secundárias e ligações amida. Várias PEGs ativadas satisfatórias para tal conjugação estão comercialmente disponíveis de Shearwater Polymers, Huntsville, AL.

Por exemplo, ligações de uretano para uricase podem ser formados incubando uricase na presença do carbonato de succinimidil (CS) ou 4 nitrofenil carbonato (NFC) derivado de PEG. PEG CS pode ser sintetizada usando-se o procedimento descrito na Patente US 5 612 460 que está aqui incorporada para referência. PEG NFC pode ser sintetizada reagindo PEG com 4 nitrofenil cloroformato de acordo com os métodos descritos em Veronese, FM, al de et., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11:141-152, e na Patente US 5 286 637 que está aqui incorporada para referência. Os métodos descritos na patente '637 são adaptados a PEGs de peso molecular mais alto ajustando-se as concentrações dos reagentes para manter estequiometria semelhante. Um método alternativo de síntese de PEG NFC é descrito por Buettner, W, e outros., Relatório Descritivo da patente leste germânica DD 479 486 Al.

Ligações de amido a uricase podem ser obtidas usando-se um éster de N-hidroxisuccinimida de um ácido carboxílico derivado ácido de PEG (Shearwater Polymers). Ligações amina secundárias podem ser formadas usando-se 2,2,2-trifluoroetanosulfonil PEG (tresil PEG; Shearwater Polymers) ou por alquilação redutiva que usa PEG aldeído (Shearwater Polymers) e cianoborohidreto de sódio. Há vários fatores que podem afetar a escolha do peso ótimo molecular e número de cordões de PEG para acoplar uma determinada forma de uricase. Em geral, a redução ou eliminação de imunogenicidade, sem perda significativa de atividade uricolítica, pode requerer o acoplamento relativo de mais cordões de PEG de baixo peso molecular, comparados com menos cordões relativos de PEG, de peso molecular mais alto. Por exemplo, tanto PEG com 6 cordões de 20 kDa por subunidade ou PEG com 4 cordões de 30 kDa por subunidade, poderíam ser otimamente efetivas. Igualmente, cada forma diferente de uricase, pode ter um ótimo diferente, com respeito ao tamanho e número de cordões. Ver Figuras 1A-5B.

Quando conjugados de PEG de PBC uricase foram preparados a partir da forma tetramérica purificada da enzima (quatro subunidades de 35 kDa), eles exibiram imunogenicidade profundamente reduzidas em camundongos (Figura 7), em contraste com a imunogenicidade moderada de conjugados de PEG de formas maiores da enzima (por exemplo octâmeros de subunidades de 35 kDa; ver Figura 12), e a imunogenicidade muito alta da enzima inalterada. Injeções repetidas em camundongos deficientes de uricase, com a PEG-uricase da presente invenção, eliminaram a hiperuricemia deles por mais de 2 meses e protegeram a estrutura e função dos seus rins contra danos relacionados ao ácido úrico (Figura 8-11).

Os seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como limitadores da invenção de nenhuma maneira, ilustram os vários aspectos apresentados acima. Estes exemplos descrevem PEG-uricases preparadas através do acoplamento de derivados de PEG (ou seja, eletrofílicos) de diversos tamanhos e composições com as uri cases de suíno, fungicas ou bacterianas de ocorrência natural, ou com as uricases quiméricas de soja, suíno ou porco-babuíno recombinantes. Os resultados dos estudos da atividade, da solubilidade, da estabilidade, farmacocinéticos, farmacodinâmicos e imunológicos são incluídos. Os dados nas figuras 8-11 fornecem a evidência da capacidade da uricase de PBC modificada com PEG da presente invenção corrigir a hiperuricemia e a hiperuricosuria e preservar a estrutura e a função renal em um modelo animal em que a hiperuricemia e a hiperuricosuria ocorrem e causam graves danos renais. Wu, X, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:742-746. Estes exemplos fornecem a orientação a um elemento versado na técnica para a produção dos conjugados substancialmente não imunogênicos de uricase que retêm pelo menos aproximadamente 75% da atividade uricolítica da enzima não modificada. EXEMPLO 1 Purificação da forma tetramérica de uricase A forma tetramérica de uricase (peso molecular de aproximadamente 140 kDa) foi purificada a partir de uma solução de uricase de fígado de suíno, através de cromatografia preparatória de exclusão de tamanho ou de troca iônica, seguida por cromatografia analítica de exclusão de tamanho. A uricase de fígado de suíno foi obtida junto à Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, catálogo número U2350 ou U3377; ou junto à Boebringer Mancheim, Indianopolis, IN.

As cromatografias preparatória e analítica de exclusão de tamanho foram realizadas a um pH de 10-10,5, de preferência de 10,2, em 10 mM de tampão de carbonato de sódio contendo NaCl 0,1M em colunas Superdex 200, as quais foram calibradas previamente com proteínas de peso molecular conhecido. As Superdex foram obtidas junto à Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ. Qualquer tampão pode ser utilizado, desde que seja capaz de manter o pH desejado e seja compatível com a química a ser utilizada para o acoplamento subseqüente de PEG. Tais tampões são bem conhecidos no estado da técnica. A absorbância ultravioleta do eluato proveniente da coluna preparatória foi monitorada a 280 nm, e porções contendo uricase do eluato correspondente ao peso molecular da forma tetramérica desejada, mas sem uma espécie de peso molecular mais elevado, foram coletadas para o uso na síntese de PEG-uricase substancialmente não imunogênica, conforme descrição no Exemplo 2. Altemativamente, as formas tetraméricas de uricase podem ser isoladas através do uso de outros meios de exclusão de tamanho tais como, por exemplo, Superose 12 (Amersham Pharmacia) ou algum outro meio que seja compatível com soluções moderadamente alcalinas e que tenha uma capacidade apropriada de fracionamento de tamanho. Tais meios são de disponibilidade imediata e são bem conhecidos no estado da técnica. A cromatografia de troca iônica foi executada a um pH de 10-10,5, de preferência de 10,2, em colunas Mono Q (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ), as quais foram equilibradas com tampão de carbonato de sódio 0,1 M. Qualquer tampão que seja compatível com a química do acoplamento de PEG e que seja capaz de manter o pH desejado pode ser utilizado a uma intensidade iônica suficientemente baixa para permitir o adsorção de uricase à coluna. Tais tampões são bem conhecidos no estado da técnica. A absorbância ultravioleta do eluato foi monitorada a 280 nm, durante a eluição de uricase da resina de troca iônica, pelo aumento da força iônica da solução de tampão aplicada, como por exemplo, por um gradiente linear de 0 a 0,5 M NaCl no tampão de carbonato de sódio. A HPLC por exclusão de tamanho foi então utilizada para identificar as frações do eluato que contêm a forma tetramérica desejada de uricase, sem agregados detectáveis, para a síntese de uricase-PEG substancialmente não imunogênica. Altemativamente, a forma tetramérica de uricase pode ser isolada através do uso de outros meios de troca iônica, tal como Q-Sepharose (Amersham Pharmacia) ou qualquer outro meio que seja compatível com soluções moderadamente alcalinas. Tais meios são de disponibilidade imediata e são bem conhecidos no estado da técnica. A atividade de uricase foi analisada através do uso de uma modificação de métodos-padrão. Vide, por exemplo, Fridovich (1965); Nishimura, et al., (1979). As soluções de ácido úrico foram preparadas na hora, diariamente, em tampão de borato de sódio 50 mM, a um pH de 92, para se obter concentrações finais na análise de 6-150 μΜ. Os preparados de uricase foram diluídos neste tampão de borato, o qual contém albumina de soro bovino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, catálogo No. A-7030), de modo que a concentração final de albumina na análise ficou sendo de 0,1 mg/ml. Após a mistura de várias diluições da enzima com o substrato nas cavidades de uma placa de microtitulação em um leitor de microplacas, a taxa de desaparecimento do ácido úrico a 25°C foi monitorada a 292 nm, a cada quatro segundos, durante três minutos. Das amostras, entre as quais 10% e 40% do substrato foram consumidos dentro de três minutos, pelo menos 20 pontos de dados foram utilizados para calcular a taxa máxima de diminuição na absorbância por minuto. Uma unidade internacional (IU) da atividade da uricase é definida como a quantidade de enzima que consome um micromole de ácido úrico por minuto; as atividades específicas são expressadas como IU/mg de proteína. Alguns dos dados para as atividades relativas de uricase das Figuras 1A-5B foram obtidos através do uso de 100 μΜ de ácido úrico na análise. Outros resultados para a velocidade em 100 μΜ de ácido úrico (Vioo) foram calculados a partir dos valores da constante de Michaelis (Km) e da velocidade máxima (Vmax) para as respectivas preparações da enzima, através do uso da fórmula: Vl00= 100X Vmax/ (KM+ 100) onde Km é expressado em unidades micromolares. EXEMPLO 2 Acoplamento de PEG à uricase tetramérica de suíno A uma solução de uricase tetramérica em tampão de carbonato de sódio 0,1 M, a um pH de 10,2, de 10 a 200 moles de um derivado ativo de monometóxi PEG, como por exemplo, o carbonato 4-nitrofenil (NPC-PEG), de vários tamanhos (de 5 kDa a 30 kDa), foi adicionado para cada mole de subunidade de uricase (peso molecular de 35 kDa). Estes e outros PEGs ativos apropriados estão disponíveis junto à Shearwater Polymers. As instruções para acoplar estes PEGs às proteínas são fornecidas no catálogo da Searwater Polymers, no endereço da Internet www.swpolymers.com, e por JM Harris, et al., (Eds.) (1997), em Poly(ethylene) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680, Washington, DC: American Chemical Society. A reação do acoplamento foi continuada a 0-8°C, até a extensão do acoplamento de PEG que não mudou mais de forma significativa com o tempo. O PEG que não reagiu foi então removido do produto da reação por meio de cromatografia e/ou de ultrafiltração. O número de filamentos de PEG acoplado por subunidade de uricase foi determinado através de uma adaptação dos métodos descritos por Kunitani, M, et al., (1991) J. Chromatogr. 588:125-137; Saifer, et al., (1997) e Sherman et al., (1997). Em suma, as alíquotas das misturas da reação de PEGilação ou frações das colunas preparatórias de troca iônica ou por exclusão de tamanho foram caracterizadas por meio de HPLC analítica por exclusão de tamanho em uma coluna de TSK 5.000 PWxl à temperatura ambiente, em tampão de carbonato de sódio 10 mM, a um pH de 10,2, contendo NaCl 0,1M. A coluna da HPLC foi obtida junto à TosoHaas, Montgomeryville, PA. As proteínas e os PEGs foram monitorados por detectores de índice de refração e de absorbância de radiação ultravioleta. A quantidade de proteína no conjugado foi calculada a partir da absorbância de radiação ultravioleta em relação àquela da uricase padrão não modificada apropriada. A quantidade de PEG no conjugado foi então calculada, a partir da área do pico do índice de refração, corrigida para a contribuição da proteína no índice de refração, em relação à área do pico do índice de refração padrão apropriado de PEG. A figura 2A mostra a retenção de atividade pela uricase de fígado de suíno PEGilada, como uma função do número de filamentos de PEG acoplado por subunidade. Os dados dos autores da presente invenção (A, □) são comparados com aqueles de Chen, et al., (1981). O ponto de dados dentro de um círculo grande denota um conjugado relatado para ser não imunorreativo, por Chen, et al., (1981). Conforme mostrado na Figura A, os conjugados de uricase tetramérica de suíno com até seis filamentos de PEG de 30 kDa por subunidade ou até sete filamentos de PEG de 5 kDa por subunidade retiveram pelo menos 75% da atividade da enzima não modificada. O aumento aparente na atividade específica, com um número crescente de filamentos de PEG de 5 kDa ou de 30 kDa (até aproximadamente quatro filamentos por subunidade) pode refletir a insolubilidade ou a instabilidade relativa da enzima não modificada, em comparação com os conjugados. Conforme mostrado na Figura 2B, os conjugados de uricase de suíno com uma média de mais de três filamentos de PEG de 30 kDa por subunidade contêm uma massa maior de PEG do que foi considerado suficiente para impossibilitar a capacidade reativa, por Chen, etal. (1981). EXEMPLO 3 Propriedades dos conjugados de PEG de uricase de PBC tetramérica recombinante O DNA da uricase quimérica de porco babuíno (PBC) foi subclonado no vetor de expressão pET3d (Novagen, Madison, WI) e a construção resultante de plasmídeo foi transformada e expressada em um filamento de Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Novagen). Estes procedimentos foram realizados através do uso de métodos bem conhecidos no estado da técnica da biologia molecular. Vide Erlich (1989); Sambrook, etal., (1989); AuSubel, F. etal., (Eds.), (1997) Short Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons. A Figura 6 mostra a seqüência de aminoácidos deduzida de uricase de PBC (aminoácidos 1-225 da SEQ. ID. No.: 1 e aminoácidos 226-304 da SEQ. ID. No.: 2), em comparação com as seqüências de suíno (SEQ. ID. No.: 1) e de babuíno (SEQ. ID. No.: 2). Os resíduos na seqüência de babuíno que diferem daqueles na seqüência de suíno são mostrados em negrito. As seqüências de suíno e de babuíno foram primeiramente determinadas por Wu, et al., (1989) e confirmadas pelos autores da presente invenção. A SEQ. ID. No. 1 é idêntica ao Número de Acesso pl6164 do GenBank, com exceção da ausência do resíduo inicial de metionila na seqüência do GenBank. A SEQ. ID. No. 2 é idêntica ao Número de Acesso p25689 do GenBank, com exceção da ausência do resíduo inicial de metionila e de uma substituição de histidina por treonina, no resíduo 153 na seqüência do GenBank (resíduo 154, na Figura 6). A forma tetramérica de uricase de PBC foi isolada e acoplada aos PEGs de vários pesos moleculares, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Os conjugados preparados com o PEG de 5 kDa, de 10 kDA, de 19 kDa ou de 30 kDa continham até dez filamentos de PEG, por subunidade. Aqueles preparados com os PEGs de pelo menos 10 kDa retiveram mais do que 95% da atividade específica inicial da uricase recombinante (Figuras 3A-3B).

As seguintes propriedades de um conjugado de uricase tetramérica de PBC com aproximadamente seis filamentos de PEG de 10 kDa por subunidade são ilustradas nas figuras indicadas: a falta do capacidade imunogênica (Figura 7) e a eficácia em camundongos com deficiência de uricase em: 1) correção de hiperuricemia e hiperuricosúria (Figura 8); 2) diminuição da gravidade de um defeito de concentração de urina (Figura 9), e 3) diminuição da gravidade de diabetes insipidus nefrogênico (Figura 10). Adicionalmente, essa PEG-uricase diminuiu a gravidade dos danos renais relacionados com o ácido úrico, conforme visualização por microscopia por ressonância magnética (Figura 11). A Figura 7 mostra a atividade de uricase de PBC no soro de camundongo, 24 horas após cada uma das quatro ou cinco injeções intraperitoneais de PEG-uricase, em relação ao valor de 24 horas após a primeira injeção. Os conjugados de PEG foram preparados a partir de três preparados diferentes de uricase de PBC, através do uso de duas técnicas diferentes para a ativação de PEG. Um preparado (·) foi testado em camundongos com deficiência de uricase (uox -/-); os outros dois (Δ, ■) foram testados em camundongos normais BALB/c. O preparado mais imunorreativo (Δ) foi preparado a partir de uricase purificada de PBC, que contém uma quantidade desconhecida de agregados de uricase, acoplada a uma média de sete filamentos de PEG de 5 kDa por subunidade, através do uso do derivado do carbonato de succinimidila de PEG (SC-PEG). Zalipsky, patente norte-americana 5.612.460, aqui incorporada a título de referência. O preparado moderadamente imunorreativo (■) foi preparado por meio do acoplamento de um preparado de uricase de PBC que contém 11% dos agregados em uma média de dois filamentos de PEG de 19 kDa por subunidade, através do uso de um derivado de carbonato de 4-nitrofenila de PEG (NPC-PEG). Sherman et al., (1997). O conjugado menos imunorreativo (·) foi preparado por meio do acoplamento de uma média de seis filamentos NPC-PEG de 10 kDa por subunidade, em uma preparação de uricase de PBC, que contém a uricase agregada inferior a 5%. A Figura 8 mostra a relação inversa entre as concentrações do ácido úrico no soro e na urina e a atividade de PEG-uricase injetada no soro (uox -/-) de um camundongo com deficiência de uricase. Injeções no tempo zero e depois de 72 horas continham 0,43 IU de uricase de PBC conjugado a uma média de seis filamentos de PEG de 10 kDa por subunidade da enzima. A Figura 9 mostra que o tratamento de camundongos com deficiência de uricase com a uricase de PBC modificado por PEG diminuiu a gravidade de um defeito de concentração de urina. O desvio médio e padrão dos dados para a osmolalidade da urina é mostrado para dois camundongos, que contêm uma cópia do gene de uricase de murino normal (uox +/-), seis camundongos com deficiência de uricase homozigóticos não tratados (uox -/-) e seis camundongos com deficiência de uricase homozigóticos que foram injetados dez vezes, entre o terceiro e o septuagésimo segundo (72a) dia de vida, ou com 95 ou 190 mIU de PEG-uricase. Os camundongos de cada base genética ou receberam água ad libitum (barras sólidas) ou foram privados de água durante doze horas (barras hachuriadas) antes da coleta de sua urina. A Figura 10 mostra que o tratamento de camundongos com deficiência de uricase com a uricase de PBC modificada por PEG diminuiu a gravidade de diabetes insipidus nefrogênico, caracterizada pelo consumo anormalmente elevado de água e pela saída anormalmente elevada de urina. Os conteúdos genéticos dos camundongos e o protocolo de tratamento foram os mesmos que aqueles da Figura 9. O desvio médio e padrão de consumo diário de água (barras sólidas) e a saída de urina (barras hachuriadas) são mostrados para três grupos de seis camundongos. A Figura 11 mostra que o tratamento de camundongos com deficiência de uricase de PBC modificada por PEG diminuiu a gravidade da nefropatia induzida por ácido úrico, conforme visualização por microscopia por ressonância magnética. Os conteúdos genéticos dos três grupos de camundongos e o protocolo de tratamento foram os mesmos que aqueles da Figuras 9 e 10. A microscopia por ressonância magnética foi executada no Centro para Microscopia in vivo, Duke University Medicai Center, Durtham, Carolina do Norte.

Além dos resultados sumarizados nas Figuras de 8 a 11, foi demonstrado que os níveis de ácido úrico na urina de todos os camundongos com deficiência de uricase diminuíram drasticamente, após o tratamento com a uricase de PBC modificada por PEG.

Finalmente, a Figura 12 mostra que, ao contrário da forma tetramérica de uricase de PBC modificada por PEG, a forma octamérica (peso molecular = 280 kDa), mesmo quando extensivamente PEGilada, é imunogênica em camundongos. Esta propriedade é refletida no afastamento acelerado do octâmero modificado por PEG, dentro de cinco dias após uma única injeção intraperitoneal. Os mesmos camundongos foram novamente injetados com a mesma dose dos mesmos preparados de PEG-uricase, no oitavo e no décimo quinto dia. Vinte e quatro horas após a segunda e a terceira injeções, a atividade uricolítica não foi detectável nos soros dos camundongos injetados com o octâmero PEGilado, mas foi detectada prontamente nos soros daqueles injetados com o tetrâmero PEGilados. Estes resultados, em combinação com o afastamento acelerado do octâmero PEGilado, observado após a primeira injeção (Figura 12), confirmam a utilidade da remoção de todas as formas de uricase maiores do que o tetrâmero, antes da PEGilação da enzima. EXEMPLO 4 Conjugação de PEG da uricase de Candida utilis A uricase de Candida utilis foi obtida junto à Sigma-Aldrich (St. Louis MO; catálogo No. UI878) ou junto à Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ; catálogo No. URYW). Através do mesmo procedimento, conforme descrição nos Exemplos 1 e 2, a forma tetramérica foi isolada e os conjugados de PEG foram sintetizados com o PEG de 5 kDa, de 10 kDa ou de 30 kDa (Figuras 1A-1B). A Figura IA mostra a retenção da atividade pela uricase PEGilada de Candida utilis em função do número de filamentos de PEG acoplados por subunidade. Os dados dos autores da presente invenção (A, ·, □) são comparados com aqueles de Nishimura, et al., (1979); Nishimura, et al., (1981); Chen, et al., (1981); Davis, et al,. (1981); Tsuji, et al., (1985); Yasuda, et al., (1990), e Fujita, et al., (1991). Os pontos de dados dentro dos círculos grandes denotam os conjugados relatados como sendo não antigênicos, por Nishimura, et al., (1979 ou 1981) ou não imunorreativos, por Chen, et al., (1981). A figura 1B mostra a retenção da atividade pela uricase PEGilada de Candida utilis em função da massa total de PEG acoplado por subunidade. Os dados dos autores da presente invenção (A, ·, □) são comparados com aqueles dos mesmos relatórios, conforme a Figura IA. Os pontos de dados dentro dos círculos grandes têm o mesmo significado que na Figura 1 A.

Conforme mostrado nas figuras 1A e 1B, os conjugados com uma média de até seis filamentos de PEG de 5 kDa ou de 30 kDa ou de nove filamentos de PEG de 10 kDa por subunidade retiveram pelo menos 75% da atividade da enzima não modificada. O aumento aparente na atividade específica quando um número crescente de filamentos de PEG de 30 kDa é ligado (até cinco ou seis filamentos por subunidade) pode refletir a insolubilidade ou a instabilidade relativa da enzima não modificada, em comparação com os conjugados. EXEMPLO 5 Conjugação de PEG de uricase de Aspergillus flavus A uricase de Aspergillus flavus foi obtida junto à Sanofi Winthrop (Gentilly Cédex, França). Através do mesmo procedimento, conforme descrição no Exemplo 2, os conjugados com os PEGs de vários pesos moleculares foram sintetizados (Figuras 4A-4B). Os conjugados preparados pelo acoplamento da enzima de A. flavus, com uma média de até doze filamentos de PEG de 5 kDa ou de até sete filamentos de PEG de 30 kDa por subunidade, retiveram pelo menos 75% da atividade específica inicial dessa uricase fungica. EXEMPLO 6 Conjugação de PEG de uricase de soia A uricase recombinante do nódulo da raiz da soja (chamado também de nodulin 35) foi preparada e purificada, conforme descrição por Kahn e Tipton (Kahn, K, et al., (1997) Biochemistry 36:4731-4738), e foi apresentada pelo Dr. Tipton (University of Missouri, Columbia, MO). Através do mesmo procedimento, conforme descrição nos Exemplos 1 e 2, a forma tetramérica foi isolada e os conjugados foram preparados com os PEGs de vários pesos moleculares (Figuras 5A-5B). Ao contrário da uricase de Candida utilis (Figura IA), da uricase de suíno (Figura 2A), da uricase quimérica de porco-babuíno (Figura 3 A) e da uricase de Aspergillus flavus (Figura 4A), a enzima de soja tolerou o acoplamento de somente cerca de dois filamentos de PEG de 5 kDa ou de 30 kDa por subunidade, com retenção pelo menos de 75% da atividade uricolítica inicial. EXEMPLO 7 Conjugação de PEG de uricase de Arthrobacter slobiformis A uricase de Arthrobacter globiformis foi obtida junto à Sigma-Aldrich (catálogo No. U7128). Vide a Patente Japonesa 9-154581. Através do mesmo procedimento, conforme descrição nos Exemplos 1 e 2, a forma tetramérica foi isolada e os conjugados com 5 kDa e o PEG de 30 kDa foram preparados. Enquanto que os conjugados com uma média de mais de três filamentos de PEG de 5 kDa por subunidade retiveram menos do que 60% da atividade específica inicial, os conjugados com uma média de aproximadamente dois filamentos de PEG de 30 kDa por subunidade retiveram pelo menos 85% da atividade específica inicial. EXEMPLO 8 Conjugação de PEG de uri cases de PBC e de suíno truncadas por amino As uricases recombinantes de suíno e de PBC, a partir das quais os primeiros seis aminoácidos no terminal de carboxila são suprimidos, são expressas e purificadas de E. coli, por técnicas padrão, conforme descrição no Exemplo 3. Através do mesmo procedimento, conforme descrição nos Exemplos 1 e 2, conjugados de PEG de uricases de PBC truncadas por amino foram sintetizados para produzir os conjugados substancialmente não imunogênicos, os quais retêm pelo menos 75% da atividade específica inicial. EXEMPLO 9 Conjugação de PEG de uricases de PBC e de suíno truncadas no terminal carboxila ou em ambos os terminais carboxila e amino As uricases recombinantes de suíno e de PBC, a partir das quais os últimos três aminoácidos no terminal carboxila são eliminados, são expressadas e purificadas de E. coli por técnicas padrão, conforme descrição no Exemplo 3. Esta remoção do terminal carboxila pode aumentar a solubilidade das enzimas não modificadas, uma vez que remove o sinal alvo peroxisomàl. Vide Miura, et al., (1994). Através do mesmo procedimento, conforme descrição nos Exemplos 1 e 2, os conjugados de PEG de uricases truncadas de carboxila são sintetizados para produzir os conjugados substancialmente não imunogênicos, os quais retêm pelo menos 75% da atividade específica inicial. A seqüência de uricase recombinante de PBC truncada por seis resíduos no terminal amino e por três resíduos no terminal carboxila (PBC-NT-CT) é mostrada na Figura 6. Esta uricase é expressada, purificada e PEGilizada, conforme descrição nos Exemplos 1, 2 e 3, para produzir os conjugados substancialmente não imunogênicos, os quais retêm pelo menos 75% da atividade específica inicial. EXEMPLO 10 Conjugação de PEG de mutantes de uricase de suíno que contém um número elevado de pontos de ligação de PEG

As uricases de suíno recombinantes são preparadas conforme descrito no exemplo 3, no qual o número potencial de pontos de ligação de PEG é aumentado pela substituição de um ou mais resíduos de arginina por lisina. Vide Hershfield, MS, et al., (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88:7185-7189. A seqüência de aminoácidos de um exemplo da tal mutante (uricase de PKS), em que a arginina no resíduo 291 é substituída por lisina e a treonina no resíduo 301 é substituída por serina, é mostrada na Figura 6. Através do mesmo procedimento, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2, o PEG é conjugado a esta uricase para produzir os conjugados substancialmente não imunogênicos, os quais retêm pelo menos 75% da atividade específica inicial de uricase recombinante. EXEMPLOll Conjugação de PEG de um mutante de uricase de babuíno recombinante Através do uso de métodos padrão da biologia molecular, tal como no Exemplo 3, a uricase de babuíno recombinante é construída por intermédio de uma substituição de aminoácidos (histidina em lugar de tirosina) na posição 97 (vide a seqüência de babuíno na Figura 6). Através do mesmo procedimento, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2, os conjugados de PEG da forma tetramérica do mutante de uricase de babuíno recombinante foram sintetizados para produzir os conjugados de capacidade imunogênica substancialmente reduzida, os quais retêm pelo menos 75% da atividade específica inicial de uricase recombinante. EXEMPLO 12 Capacidade imunogênica dos conjugados de PEG provenientes de Candida utilis, Aspergilllus flavus e Arthrobacter globiformis A uricase de Candida utilis, Aspergillus flavus e Arthrobacter globiformis é obtida conforme descrito nos Exemplos 4, 5 e 7, respectivamente. Através do mesmo procedimento, de acordo com a descrição nos exemplos 1 e 2, os conjugados de PEG foram sintetizados com o PEG de 5 kDa, de 10 kDa, de 20 kDa ou de 30 kDa. A capacidade imunogênica destes conjugados é substancialmente reduzida ou eliminada.

SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: WILLIAMS, L. DAVTD HERSHFIELD, MICHAEL S. KELLY, SUSANJ. SAIFER, MARK G.P. SHERMAN, MERRY R.

(ii) TULE OFINVENTION: PEG-URATE OXEDASE CONJUGATES

Claims (5)

1. Método para isolar uma forma tetramérica de uricase a partir de uma solução de uricase purificada, onde a dita uricase purificada compreende uricase tetramérica e agregados de uricase, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: - separação da solução em frações a pelo menos uma coluna de separação a um pH entre 9 e 10,5, onde a coluna é selecionada a partir do grupo consistindo de uma coluna de troca de íons e uma coluna de exclusão de tamanho; e - recuperação da dita coluna de uma ou mais frações que contêm a uricase tetramérica isolada, sendo que uma ou mais das ditas frações contém menos do que 10% de agregados de uricase maiores que tetrâmeros.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita solução da dita uricase é aplicada à dita coluna a um pH de 10,2.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de análise das ditas frações para determinar pelo menos uma propriedade selecionada do grupo que consiste da presença da dita uricase tetramérica e da ausência de agregados de uricase que são maiores que uricase tetramérica.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de análise compreende pelo menos uma análise selecionada do grupo que consiste em cromatografia, centrifugação, dispersão luminosa e eletroforese.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita cromatografia é cromatografia líquida de alto desempenho.