JP2002522399A - Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用 - Google Patents
Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（両方ともＰＥＧと呼ばれる）に共有結合した天然に存在するか組換え尿酸酸化酵素（ウリカーゼ）であって、各ウリカーゼサブユニットに平均２〜１０鎖のＰＥＧが結合し、ＰＥＧは約５ｋＤａと１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する。得られたＰＥＧ−ウリカーゼ結合体は、実質的に非免疫原性であり、非修飾酵素の尿酸分解活性の少なくとも７５％を保持する。
Description
【０００１】 [政府権利の記載] 本出願中に記載された研究の一部は、国立衛生研究所の助成金ＤＫ４８５２９
の支援を用いて行われた。従って、合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得
る。
の支援を用いて行われた。従って、合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得
る。
【０００２】 [発明の分野] 本発明は、タンパク質の循環寿命を延長し、かつタンパク質の免疫原性を減少
させるタンパク質の化学修飾に関する。より詳細には、本発明は、尿酸分解活性
を失うことなく尿酸酸化酵素の免疫原性を実質的に排除する、ポリ（エチレング
リコール）またはポリ（エチレンオキシド）と尿酸酸化酵素との結合体に関する
。
させるタンパク質の化学修飾に関する。より詳細には、本発明は、尿酸分解活性
を失うことなく尿酸酸化酵素の免疫原性を実質的に排除する、ポリ（エチレング
リコール）またはポリ（エチレンオキシド）と尿酸酸化酵素との結合体に関する
。
【０００３】 [発明の背景] この背景の節に含まれる記載は、先行技術の承認から構成されていない代わり
に、本発明が行われた際の先行技術の記載に対する本発明者ら自身の主観的なコ
メントおよび解釈を反映する。これらの解釈は、個人的な以前に開示されていな
い本発明に関する洞察を含み得るが、洞察自体が先行技術の一部ではない。
に、本発明が行われた際の先行技術の記載に対する本発明者ら自身の主観的なコ
メントおよび解釈を反映する。これらの解釈は、個人的な以前に開示されていな
い本発明に関する洞察を含み得るが、洞察自体が先行技術の一部ではない。
【０００４】 尿酸酸化酵素（ウリカーゼ、Ｅ．Ｃ．１．７．３．３）は、尿酸のより可溶な
生成物で、より容易に排泄されるプリン代謝産物であるアラントインへの酸化を
触媒する酵素である。ヒトは、高等な霊長類の進化過程で必要なウリカーゼ遺伝
子のいくつかの変異の結果として酵素活性ウリカーゼを産生しない。Ｗｕ， Ｘ
． ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．、３４：７８〜８４
。結果として、感受性を示す個体では、血液（高尿酸血症）および尿（高尿酸尿
症）における過剰濃度の尿酸により、有痛性の関節炎（痛風）、外観を損なう尿
酸蓄積物（痛風結節）、および腎不全を発症し得る。何人かの罹患個体では、ア
ロプリノール（尿酸合成のインヒビター）などの利用可能な薬物は、治療を制限
する副作用を示すか、これらの病状を適切に軽減しない。Ｈａｎｄｅ, ＫＲ
． ｅｔ ａｌ．、１９８４、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．、７６：４７〜５６；
Ｆａｍ， ＡＧ．、１９９０、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ Ｃｌｉｎ． Ｒｈｅｕ
ｍａｔｏｌ．、４：１７７〜１９２。ウリカーゼ注射により、少なくとも一時的
に高尿酸血症および高尿酸尿症を軽減することができる。しかし、ウリカーゼは
ヒトにおいて外来タンパク質であるので、アスペルギルス フラバス由来の非修
飾タンパク質の最初の注射でさえ治療患者の数％でアナフィラキシー反応（Ｐｕ
ｉ， Ｃ−Ｈ．ｅｔ．ａｌ．、１９９７、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１１：１８１３〜
１８１６）および長期にわたる治療または断続的な治療の有用性を制限する免疫
原性反応を誘導している。Ｄｏｎａｄｉｏ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、
Ｎｏｕｖ． Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄ．、１０：７１１〜７１２； Ｌｅａｕｓｔ
ｉｃ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｒｅｖ． Ｒｈｕｍ． Ｍａｌ． Ｏ
ｓｔｅｏａｒｔｉｃ．、５０：５５３〜５５４。
生成物で、より容易に排泄されるプリン代謝産物であるアラントインへの酸化を
触媒する酵素である。ヒトは、高等な霊長類の進化過程で必要なウリカーゼ遺伝
子のいくつかの変異の結果として酵素活性ウリカーゼを産生しない。Ｗｕ， Ｘ
． ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．、３４：７８〜８４
。結果として、感受性を示す個体では、血液（高尿酸血症）および尿（高尿酸尿
症）における過剰濃度の尿酸により、有痛性の関節炎（痛風）、外観を損なう尿
酸蓄積物（痛風結節）、および腎不全を発症し得る。何人かの罹患個体では、ア
ロプリノール（尿酸合成のインヒビター）などの利用可能な薬物は、治療を制限
する副作用を示すか、これらの病状を適切に軽減しない。Ｈａｎｄｅ, ＫＲ
． ｅｔ ａｌ．、１９８４、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．、７６：４７〜５６；
Ｆａｍ， ＡＧ．、１９９０、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ Ｃｌｉｎ． Ｒｈｅｕ
ｍａｔｏｌ．、４：１７７〜１９２。ウリカーゼ注射により、少なくとも一時的
に高尿酸血症および高尿酸尿症を軽減することができる。しかし、ウリカーゼは
ヒトにおいて外来タンパク質であるので、アスペルギルス フラバス由来の非修
飾タンパク質の最初の注射でさえ治療患者の数％でアナフィラキシー反応（Ｐｕ
ｉ， Ｃ−Ｈ．ｅｔ．ａｌ．、１９９７、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１１：１８１３〜
１８１６）および長期にわたる治療または断続的な治療の有用性を制限する免疫
原性反応を誘導している。Ｄｏｎａｄｉｏ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、
Ｎｏｕｖ． Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄ．、１０：７１１〜７１２； Ｌｅａｕｓｔ
ｉｃ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｒｅｖ． Ｒｈｕｍ． Ｍａｌ． Ｏ
ｓｔｅｏａｒｔｉｃ．、５０：５５３〜５５４。
【０００５】 高尿酸血症に一部適切に利用可能な治療は、数十年間、認識されている。Ｋｉ
ｓｓｅｌ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．、１９６８、Ｎａｔｕｒｅ、２１７：７２〜７
４。同様に、重篤な痛風を罹患した患者の一定の群が注射可能なウリカーゼの安
全で有効な形態から利益を得ることができる可能性が長年認識されている。Ｄａ
ｖｉｓ，ＦＦ． ｅｔ ａｌ．、１９７８、ＧＢ Ｂｒｏｕｎ，ｅｔ ａｌ．編
、Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第４巻、１６９〜１７３、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｈ． ｅｔ
ａｌ．、１９７９、Ｅｎｚｙｍｅ、２４：２６１〜２６４； Ｎｉｓｈｉｍｕｒ
ａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｅｎｚｙｍｅ、２６：４９〜５３； Ｄ
ａｖｉｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｌａｎｃｅｔ、２（８２４１）：２８
１〜２８３； Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｊ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．、２１９、３５２〜３５４； Ｃ
ｈｅｎ， ＲＨ−Ｌ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ Ａｃｔａ．、６６０：２９３〜２９８； Ｃｈｕａ， ＣＣ． ｅｔ
ａｌ．、１９８８、Ａｎｎ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ．、１０９：１１４〜１１７；
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， ＭＬ． ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ａｎａｌ． Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．、１７６：２９０〜２９３。動物の器官由来のウリカーゼは、安全
な注射による投与に適合する溶媒にほぼ不溶である。米国特許第３，６１６，２
３１号。植物または微生物由来の一定のウリカーゼは、医学的に受容可能な溶媒
により可溶である。しかし、微生物酵素の注射によって、生命に危険を及ぼすよ
うなアレルギー反応またはウリカーゼの不活化および／または循環からのクリア
ランスの促進を引き起こし得る免疫学的応答を即座に誘導する。Ｄｏｎａｄｉｏ
， ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｌｅａｕｓｔｉｃ， ｅｔ ａｌ．、１９８３
。ブタおよびヒヒを含む哺乳動物または昆虫（例えば、ドロソフィラ メラノガ
スターまたはドロソフィラ シュードオブスキュラなど（Ｗａｌｌｒａｔｈ，
ＬＬ． ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０：５
１１４〜５１２７））由来のウリカーゼの推定アミノ酸配列に基づく酵素は、生
理学的ｐＨでの免疫原性および不溶性に問題があり臨床用の適切な候補ではなか
った。
ｓｓｅｌ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．、１９６８、Ｎａｔｕｒｅ、２１７：７２〜７
４。同様に、重篤な痛風を罹患した患者の一定の群が注射可能なウリカーゼの安
全で有効な形態から利益を得ることができる可能性が長年認識されている。Ｄａ
ｖｉｓ，ＦＦ． ｅｔ ａｌ．、１９７８、ＧＢ Ｂｒｏｕｎ，ｅｔ ａｌ．編
、Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第４巻、１６９〜１７３、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｈ． ｅｔ
ａｌ．、１９７９、Ｅｎｚｙｍｅ、２４：２６１〜２６４； Ｎｉｓｈｉｍｕｒ
ａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｅｎｚｙｍｅ、２６：４９〜５３； Ｄ
ａｖｉｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｌａｎｃｅｔ、２（８２４１）：２８
１〜２８３； Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｊ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．、２１９、３５２〜３５４； Ｃ
ｈｅｎ， ＲＨ−Ｌ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ Ａｃｔａ．、６６０：２９３〜２９８； Ｃｈｕａ， ＣＣ． ｅｔ
ａｌ．、１９８８、Ａｎｎ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ．、１０９：１１４〜１１７；
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， ＭＬ． ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ａｎａｌ． Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．、１７６：２９０〜２９３。動物の器官由来のウリカーゼは、安全
な注射による投与に適合する溶媒にほぼ不溶である。米国特許第３，６１６，２
３１号。植物または微生物由来の一定のウリカーゼは、医学的に受容可能な溶媒
により可溶である。しかし、微生物酵素の注射によって、生命に危険を及ぼすよ
うなアレルギー反応またはウリカーゼの不活化および／または循環からのクリア
ランスの促進を引き起こし得る免疫学的応答を即座に誘導する。Ｄｏｎａｄｉｏ
， ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｌｅａｕｓｔｉｃ， ｅｔ ａｌ．、１９８３
。ブタおよびヒヒを含む哺乳動物または昆虫（例えば、ドロソフィラ メラノガ
スターまたはドロソフィラ シュードオブスキュラなど（Ｗａｌｌｒａｔｈ，
ＬＬ． ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０：５
１１４〜５１２７））由来のウリカーゼの推定アミノ酸配列に基づく酵素は、生
理学的ｐＨでの免疫原性および不溶性に問題があり臨床用の適切な候補ではなか
った。
【０００６】 ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（両方ともＰＥ
Ｇと呼ばれる）とタンパク質の共有結合による修飾を使用してタンパク質の半減
期を延長し、免疫原性を減少させている。米国特許第４，１７９，３３７号、同
第４，７６６，１０６号、および同第４，８４７，３２５号； Ｓａｉｆｅｒ，
ＭＧＰ． ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏ
ｌ．、３６６：３７７〜３８７。循環寿命が延長し、そして／または免疫原性が
増大する一方で機能的活性が保護されている結合体を作製するための高分子量の
ＰＥＧとのカップリングは、別の酵素であるスーパーオキシドジムスターゼ（Ｓ
ｏｍａｃｋ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍｕｎ．、１２〜１３：５３３〜５６２； 米国特許第５，２８３，３１７
号および同第５，４６８，４７８号）および他の型のタンパク質、例えば、サイ
トカイン（ＪＭ． Ｈａｒｒｉｓ， ｅｔ ａｌ編、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎ
ｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６８０
、１５５〜１６９、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ中のＳａｉｆｅｒ， ＭＧＰ． ｅｔ ａｌ．、１９
９７、Ｐｏｌｙｍ． Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ、３８：５７６〜５７７； Ｓｈｅｒ
ｍａｎ， ＭＲ． ｅｔ ａｌ．、１９９７）については以前に示されていた。
ウリカーゼのＰＥＧ以外のポリマーとの結合体も記載されている。米国特許第４
，４６０，６８３号。
Ｇと呼ばれる）とタンパク質の共有結合による修飾を使用してタンパク質の半減
期を延長し、免疫原性を減少させている。米国特許第４，１７９，３３７号、同
第４，７６６，１０６号、および同第４，８４７，３２５号； Ｓａｉｆｅｒ，
ＭＧＰ． ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏ
ｌ．、３６６：３７７〜３８７。循環寿命が延長し、そして／または免疫原性が
増大する一方で機能的活性が保護されている結合体を作製するための高分子量の
ＰＥＧとのカップリングは、別の酵素であるスーパーオキシドジムスターゼ（Ｓ
ｏｍａｃｋ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍｕｎ．、１２〜１３：５３３〜５６２； 米国特許第５，２８３，３１７
号および同第５，４６８，４７８号）および他の型のタンパク質、例えば、サイ
トカイン（ＪＭ． Ｈａｒｒｉｓ， ｅｔ ａｌ編、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎ
ｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６８０
、１５５〜１６９、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ中のＳａｉｆｅｒ， ＭＧＰ． ｅｔ ａｌ．、１９
９７、Ｐｏｌｙｍ． Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ、３８：５７６〜５７７； Ｓｈｅｒ
ｍａｎ， ＭＲ． ｅｔ ａｌ．、１９９７）については以前に示されていた。
ウリカーゼのＰＥＧ以外のポリマーとの結合体も記載されている。米国特許第４
，４６０，６８３号。
【０００７】 ほぼ全ての報告されたＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅ）ウリカーゼ（すなわち、
ＰＥＧとウリカーゼとの共有結合）は、最初にＰＥＧをアミノ末端残基および利
用可能なリシン残基を含むアミノ基に結合させることを意図した。一般的に使用
されるウリカーゼでは、それぞれの４つの同一のサブユニット中のリシンの総数
は、２５（アスペルギルス フラバス（米国特許第５，３８２，５１８号））と
２９（ブタ（Ｗｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６：９４１２〜９４１６））との間である
。リシンのいくつかは、酵素の天然の形態においてＰＥＧ化に利用できない。ウ
リカーゼの免疫原性の減少に最も一般的なアプローチは、低分子量のＰＥＧの多
数の鎖に結合させることであった。これにより、得られた結合体の酵素活性が常
に大きく減少している。
ＰＥＧとウリカーゼとの共有結合）は、最初にＰＥＧをアミノ末端残基および利
用可能なリシン残基を含むアミノ基に結合させることを意図した。一般的に使用
されるウリカーゼでは、それぞれの４つの同一のサブユニット中のリシンの総数
は、２５（アスペルギルス フラバス（米国特許第５，３８２，５１８号））と
２９（ブタ（Ｗｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６：９４１２〜９４１６））との間である
。リシンのいくつかは、酵素の天然の形態においてＰＥＧ化に利用できない。ウ
リカーゼの免疫原性の減少に最も一般的なアプローチは、低分子量のＰＥＧの多
数の鎖に結合させることであった。これにより、得られた結合体の酵素活性が常
に大きく減少している。
【０００８】 以前、研究者は、ウリカーゼ注射を用いてｉｎ ｖｉｖｏでの尿酸のアラント
インへの変換を触媒させていた。Ｐｕｉ， ｅｔ ａｌ．、１９９７を参照のこ
と。これは、フランスおよびイタリアでの、真菌アスペルギルス フラバス由来
のウリカーゼ（Ｕｎｉｃｏｚｙｍｅ（商品名））を使用して血液学的悪性腫瘍の
細胞傷害性治療に関連する高尿酸血症を予防または一時的に正常にし、痛風患者
の重篤な高尿酸血症を一時的に軽減することを基礎としている。Ｐｏｔａｕｘ，
Ｌ． ｅｔ ａｌ．、１９７５、Ｎｏｕｖ． Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄ．、４：
１１０９〜１１１２； Ｌｅｇｏｕｘ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６７：８５６５〜８５７０； 米国特許第５，３
８２，５１８号、および同第５，５４１，０９８号。その循環寿命が短いために
、Ｕｒｉｃｏｚｙｍｅ（商品名）は、毎日注射する必要がある。さらに、その免
疫原性のために長期治療にあまり適さない。
インへの変換を触媒させていた。Ｐｕｉ， ｅｔ ａｌ．、１９９７を参照のこ
と。これは、フランスおよびイタリアでの、真菌アスペルギルス フラバス由来
のウリカーゼ（Ｕｎｉｃｏｚｙｍｅ（商品名））を使用して血液学的悪性腫瘍の
細胞傷害性治療に関連する高尿酸血症を予防または一時的に正常にし、痛風患者
の重篤な高尿酸血症を一時的に軽減することを基礎としている。Ｐｏｔａｕｘ，
Ｌ． ｅｔ ａｌ．、１９７５、Ｎｏｕｖ． Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄ．、４：
１１０９〜１１１２； Ｌｅｇｏｕｘ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６７：８５６５〜８５７０； 米国特許第５，３
８２，５１８号、および同第５，５４１，０９８号。その循環寿命が短いために
、Ｕｒｉｃｏｚｙｍｅ（商品名）は、毎日注射する必要がある。さらに、その免
疫原性のために長期治療にあまり適さない。
【０００９】 ５ｋＤａ ＰＥＧにカップリングしたキャンディダ ユティリス ウリカーゼ
調製物の一回の静脈内注射により、５人のヒト被験体での血清尿酸塩（平均注射
前血清尿酸塩濃度は６．２ｍｇ／ｇＬであり、これは正常範囲内である）が検出
不可能なレベルまで減少した。Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ．１９８１。４週間後
、被験体にさらに注射を行ったが、その反応については報告されなかった。第２
の（および最後の）注射後、比較的感度の低いゲル内拡散アッセイではウリカー
ゼに対する抗体は検出されなかった。この引例は、ヒト患者または実験動物の慢
性または亜慢性治療の結果を報告していなかった。
調製物の一回の静脈内注射により、５人のヒト被験体での血清尿酸塩（平均注射
前血清尿酸塩濃度は６．２ｍｇ／ｇＬであり、これは正常範囲内である）が検出
不可能なレベルまで減少した。Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ．１９８１。４週間後
、被験体にさらに注射を行ったが、その反応については報告されなかった。第２
の（および最後の）注射後、比較的感度の低いゲル内拡散アッセイではウリカー
ゼに対する抗体は検出されなかった。この引例は、ヒト患者または実験動物の慢
性または亜慢性治療の結果を報告していなかった。
【００１０】 ５ｋＤａ ＰＥＧに結合させたアースロバクター プロトフォーミア（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｆｏｒｍｉａｅ）由来のウリカーゼ調製物を使
用して、注射前の血清尿酸塩濃度が１５ｍｇ／ｄＬである１人のリンパ腫患者で
高尿酸血症が一時的に調節された。Ｃｈｕａ， ｅｔ ａｌ．、１９８８。患者
が危篤状態でかつ治療の継続時間が短かった（１４日間に４回の注射）ので、結
合体の長期の効果または安全性を評価することができなかった。
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｆｏｒｍｉａｅ）由来のウリカーゼ調製物を使
用して、注射前の血清尿酸塩濃度が１５ｍｇ／ｄＬである１人のリンパ腫患者で
高尿酸血症が一時的に調節された。Ｃｈｕａ， ｅｔ ａｌ．、１９８８。患者
が危篤状態でかつ治療の継続時間が短かった（１４日間に４回の注射）ので、結
合体の長期の効果または安全性を評価することができなかった。
【００１１】 本出願では、用語「免疫原性」は、ＰＥＧ修飾または非修飾ウリカーゼの調製
物（抗原）の注射組成物による免疫応答の誘導をいい、「抗原性」は、抗原と前
から存在する抗体との反応をいう。集合的に、抗原性および免疫原性を、「免疫
反応性」という。ＰＥＧ−ウリカーゼの以前の研究では、免疫反応性を、１）Ｐ
ＥＧ−ウリカーゼと予め形成した抗体とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの反応、２）誘導
された抗体合成の測定、および３）反復注射後のクリアランスの促進速度を含む
種々の方法で評価した。
物（抗原）の注射組成物による免疫応答の誘導をいい、「抗原性」は、抗原と前
から存在する抗体との反応をいう。集合的に、抗原性および免疫原性を、「免疫
反応性」という。ＰＥＧ−ウリカーゼの以前の研究では、免疫反応性を、１）Ｐ
ＥＧ−ウリカーゼと予め形成した抗体とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの反応、２）誘導
された抗体合成の測定、および３）反復注射後のクリアランスの促進速度を含む
種々の方法で評価した。
【００１２】 種々のリンカーを介したＰＥＧの様々な数の鎖のカップリングによっていくつ
かの供給源由来のウリカーゼの免疫原性を排除するという以前の試みは、一部成
功している。ＰＥＧ−ウリカーゼは、最初、ＦＦ ＤａｖｉｓならびにＹ． Ｉ
ｎａｄａおよび同僚によって開示された。Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９７８；
米国特許第４，１７９，３３７号； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．１
９７９； 日本国特許第５５−９９１８９号および同第６２−５５０７９号。’
３３７特許で開示された結合体は、不特定の供給源のウリカーゼと２，０００倍
モル過剰の７５０ダルトンのＰＥＧとの反応によって合成され、これは、多数の
ポリマー分子が各ウリカーゼサブユニットに付着しているらしいということを示
した。’３３７特許は、種々のポリペプチドホルモンおよび酸化還元酵素を含む
酵素、ウリカーゼは、３つの例のうちの１つの活性で水溶性の、非免疫原性の結
合体を得るための５００〜２０，０００ダルトンの、好ましくは５００〜５，０
００ダルトンの分子量のＰＥＧまたはポリ（プロピレングリコール）のいずれか
とのカップリングを開示している。さらに、’３３７特許は、酵素分子あたり１
０〜１００のポリマー鎖のカップリングおよび酵素活性の少なくとも４０％の保
持を強調している。ウリカーゼの利用可能なアミノ基へのＰＥＧのカップリング
範囲、残基特異性尿酸分解活性、または結合体の免疫反応性の試験結果は報告し
ていなかった。
かの供給源由来のウリカーゼの免疫原性を排除するという以前の試みは、一部成
功している。ＰＥＧ−ウリカーゼは、最初、ＦＦ ＤａｖｉｓならびにＹ． Ｉ
ｎａｄａおよび同僚によって開示された。Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９７８；
米国特許第４，１７９，３３７号； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．１
９７９； 日本国特許第５５−９９１８９号および同第６２−５５０７９号。’
３３７特許で開示された結合体は、不特定の供給源のウリカーゼと２，０００倍
モル過剰の７５０ダルトンのＰＥＧとの反応によって合成され、これは、多数の
ポリマー分子が各ウリカーゼサブユニットに付着しているらしいということを示
した。’３３７特許は、種々のポリペプチドホルモンおよび酸化還元酵素を含む
酵素、ウリカーゼは、３つの例のうちの１つの活性で水溶性の、非免疫原性の結
合体を得るための５００〜２０，０００ダルトンの、好ましくは５００〜５，０
００ダルトンの分子量のＰＥＧまたはポリ（プロピレングリコール）のいずれか
とのカップリングを開示している。さらに、’３３７特許は、酵素分子あたり１
０〜１００のポリマー鎖のカップリングおよび酵素活性の少なくとも４０％の保
持を強調している。ウリカーゼの利用可能なアミノ基へのＰＥＧのカップリング
範囲、残基特異性尿酸分解活性、または結合体の免疫反応性の試験結果は報告し
ていなかった。
【００１３】 ウリカーゼのＰＥＧ化に関する１３報の引例からのデータを表１にまとめる。
これらの結果のうちのいくつかも、図１Ａ〜図２Ｂにグラフで示した。これらの
刊行物のうち７報は、キャンディダ ユティリス由来のウリカーゼへの種々の鎖
数のＰＥＧとのカップリングによってｉｎ ｖｉｔｒｏで測定された尿酸分解活
性の有意な減少が記載されている。ブタ肝臓ウリカーゼへの多数の鎖の５ｋＤａ
ＰＥＧのカップリングは、同一のグループによるＣｈｅｎの刊行物およびシン
ポジウムの報告の両方に記載の結果と類似であった。Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．
、１９８１； Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ．、１９７８。
これらの結果のうちのいくつかも、図１Ａ〜図２Ｂにグラフで示した。これらの
刊行物のうち７報は、キャンディダ ユティリス由来のウリカーゼへの種々の鎖
数のＰＥＧとのカップリングによってｉｎ ｖｉｔｒｏで測定された尿酸分解活
性の有意な減少が記載されている。ブタ肝臓ウリカーゼへの多数の鎖の５ｋＤａ
ＰＥＧのカップリングは、同一のグループによるＣｈｅｎの刊行物およびシン
ポジウムの報告の両方に記載の結果と類似であった。Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．
、１９８１； Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ．、１９７８。
【００１４】 表１にまとめた研究のうち７報でＰＥＧ化によるウリカーゼの免疫反応性の減
少および５報で消失が報告されていた。後者の５報の研究のうち３報では、免疫
反応性の消失（多くとも初期活性の１５％、２８％、または４５％）は、尿酸分
解活性の顕著な減少に関連していた。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１
９７９（１５％活性）； Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１（２８％活性）
； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９８１（４５％活性）。４番目の
報告では、ＰＥＧは、６１％の利用可能なリシン残基にカップリングされたと報
告されているが、残基の比活性は記載されていなかった。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ
， ｅｔ ａｌ．、１９８１。しかし、２人の同一の科学者を含み同一の方法を
使用した研究チームは、このカップリングの範囲が２３％〜２８％しか活性を残
していないことを他で報告していた。Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１。Ａ
ｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．の１９８１年
の刊行物は、ウリカーゼの免疫原性を実質的に減少させるために、ＰＥＧを利用
可能なリシン残基の約６０％にカップリングさせるべきであることを示す（表１
）。ウリカーゼの免疫原性が消失したと報告した５番目の刊行物は、ＰＥＧカッ
プリングの範囲、残存尿酸分解活性、またはＰＥＧ−タンパク質結合の性質を開
示していない。ＪＭ Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．編、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅ
ｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６
８０、１８２〜１９２、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ中のＶｅｒｏｎｅｓｅ， ＦＭ． ｅｔ ａｌ．
、１９９７。
少および５報で消失が報告されていた。後者の５報の研究のうち３報では、免疫
反応性の消失（多くとも初期活性の１５％、２８％、または４５％）は、尿酸分
解活性の顕著な減少に関連していた。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１
９７９（１５％活性）； Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１（２８％活性）
； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９８１（４５％活性）。４番目の
報告では、ＰＥＧは、６１％の利用可能なリシン残基にカップリングされたと報
告されているが、残基の比活性は記載されていなかった。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ
， ｅｔ ａｌ．、１９８１。しかし、２人の同一の科学者を含み同一の方法を
使用した研究チームは、このカップリングの範囲が２３％〜２８％しか活性を残
していないことを他で報告していた。Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１。Ａ
ｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．の１９８１年
の刊行物は、ウリカーゼの免疫原性を実質的に減少させるために、ＰＥＧを利用
可能なリシン残基の約６０％にカップリングさせるべきであることを示す（表１
）。ウリカーゼの免疫原性が消失したと報告した５番目の刊行物は、ＰＥＧカッ
プリングの範囲、残存尿酸分解活性、またはＰＥＧ−タンパク質結合の性質を開
示していない。ＪＭ Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．編、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅ
ｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６
８０、１８２〜１９２、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ中のＶｅｒｏｎｅｓｅ， ＦＭ． ｅｔ ａｌ．
、１９９７。
【００１５】 ＰＥＧとウリカーゼ中のリシン残基のより小さな画分との結合は減少したが、
実験動物における免疫反応性は消失しなかった。Ｔｓｕｊｉ， Ｊ． ｅｔ ａ
ｌ．、１９８５、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、７：７
２５〜７３０（カップリングしたアミノ基の２８％〜４５％）； Ｙａｓｕｄａ
， Ｙ． ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、
３８：２０５３〜２０５６（カップリングしたアミノ基の３８％）。対応する付
加物の残存尿酸活性は、最初の値の＜３３％（Ｔｓｕｊｉ， ｅｔ ａｌ．）〜
６０％（Ｙａｓｕｄａ， ｅｔ ａｌ．）の範囲であった。Ｔｓｕｊｉ， ｅｔ
ａｌ．は、５ｋＤａ ＰＥＧに加えて７．５ｋＤａおよび１０ｋＤａのＰＥＧ
を用いてＰＥＧ−ウリカーゼ結合体を合成した。得られた全ての結合体は、いく
らか免疫原性および抗原性を示し、酵素活性の顕著な減少が示された（表１、図
１Ａ〜図１Ｂ）。
実験動物における免疫反応性は消失しなかった。Ｔｓｕｊｉ， Ｊ． ｅｔ ａ
ｌ．、１９８５、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、７：７
２５〜７３０（カップリングしたアミノ基の２８％〜４５％）； Ｙａｓｕｄａ
， Ｙ． ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、
３８：２０５３〜２０５６（カップリングしたアミノ基の３８％）。対応する付
加物の残存尿酸活性は、最初の値の＜３３％（Ｔｓｕｊｉ， ｅｔ ａｌ．）〜
６０％（Ｙａｓｕｄａ， ｅｔ ａｌ．）の範囲であった。Ｔｓｕｊｉ， ｅｔ
ａｌ．は、５ｋＤａ ＰＥＧに加えて７．５ｋＤａおよび１０ｋＤａのＰＥＧ
を用いてＰＥＧ−ウリカーゼ結合体を合成した。得られた全ての結合体は、いく
らか免疫原性および抗原性を示し、酵素活性の顕著な減少が示された（表１、図
１Ａ〜図１Ｂ）。
【００１６】 ５人のヒトに各々安全に２回投与したキャンディダ ユティリス由来のウリカ
ーゼのＰＥＧ化調製物は、最初の活性の１１％しか保持されないと報告された。
Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ．、１９８１。数年後、アースロバクター プロトフ
ォーミア由来のＰＥＧ修飾ウリカーゼを、進行性リンパ腫および重篤な高尿酸血
症を罹患した１人の患者に４回投与した。Ｃｈｕａ， ｅｔ ａｌ．、１９８８
。その酵素調製物の残存活性が測定されていないが、Ｃｈｕａ，ｅｔ ａｌ．は
、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、最初のＰＥＧ−ウリカーゼ注射から
２６日後の患者の血清中に抗ウリカーゼ抗体か存在しないことを示した。
ーゼのＰＥＧ化調製物は、最初の活性の１１％しか保持されないと報告された。
Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ．、１９８１。数年後、アースロバクター プロトフ
ォーミア由来のＰＥＧ修飾ウリカーゼを、進行性リンパ腫および重篤な高尿酸血
症を罹患した１人の患者に４回投与した。Ｃｈｕａ， ｅｔ ａｌ．、１９８８
。その酵素調製物の残存活性が測定されていないが、Ｃｈｕａ，ｅｔ ａｌ．は
、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、最初のＰＥＧ−ウリカーゼ注射から
２６日後の患者の血清中に抗ウリカーゼ抗体か存在しないことを示した。
【００１７】 表１にまとめたように、ＰＥＧ化ウリカーゼの以前の研究は、触媒活性がその
免疫反応性を実質的に減少させるのに十分な数のＰＥＧ鎖のカップリングよって
顕著に減少することを示す。さらに、ＰＥＧ−ウリカーゼのほとんどの以前の調
製物は、新規の抗原決定基を誘導し、ウサギにおける抗体の形成を誘導すること
が示されている塩化シアヌールであるトリアジン誘導体（２，４，６−トリクロ
ロ−１，３，５−トリアジン）で活性化したＰＥＧを用いて合成されていた。Ｔ
ｓｕｊｉ， ｅｔ ａｌ．、１９８５。
免疫反応性を実質的に減少させるのに十分な数のＰＥＧ鎖のカップリングよって
顕著に減少することを示す。さらに、ＰＥＧ−ウリカーゼのほとんどの以前の調
製物は、新規の抗原決定基を誘導し、ウサギにおける抗体の形成を誘導すること
が示されている塩化シアヌールであるトリアジン誘導体（２，４，６−トリクロ
ロ−１，３，５−トリアジン）で活性化したＰＥＧを用いて合成されていた。Ｔ
ｓｕｊｉ， ｅｔ ａｌ．、１９８５。
【００１８】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【００１９】 Ｓａｎｏ， ｅｔ ａｌ．に付与された日本国特許第３−１４８２９８号は、
抗原性の減少および「改良された延長」作用を示す１〜１２ｋＤａの分子量のＰ
ＥＧで誘導体化されたウリカーゼを含む修飾タンパク質ならびにこのような誘導
体化ペプチドの作製法を開示している。しかし、鎖の数、酵素アッセイ、生物学
的試験、または「改良された延長」の意味についての開示はない。Ｙ． Ｉｎａ
ｄａに付与された日本国特許第５５−９９１８９および同第６２−５５０７９号
は、ＰＥＧ−トリアジンまたはｂｉｓ−ＰＥＧ−トリアジン（表１でＰＥＧ2と
示す）でそれぞれ調製したウリカーゼ結合体を開示している。Ｎｉｓｈｉｍｕｒ
ａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９および１９８１を参照。第１の型の結合体では、
ＰＥＧの分子量は２ｋＤａおよび５ｋＤａであり、第２の型では、５ｋＤａのＰ
ＥＧのみを使用した。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９は、４３
％の利用可能なリシンの直鎖５ｋＤａ ＰＥＧでの修飾後に１５％の尿酸分解活
性の回復を報告し、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９８１は、それぞ
れ４６％または３６％のリシンのＰＥＧ2での修飾後に３１％または４５％の尿
酸分解活性の回復を報告した。
抗原性の減少および「改良された延長」作用を示す１〜１２ｋＤａの分子量のＰ
ＥＧで誘導体化されたウリカーゼを含む修飾タンパク質ならびにこのような誘導
体化ペプチドの作製法を開示している。しかし、鎖の数、酵素アッセイ、生物学
的試験、または「改良された延長」の意味についての開示はない。Ｙ． Ｉｎａ
ｄａに付与された日本国特許第５５−９９１８９および同第６２−５５０７９号
は、ＰＥＧ−トリアジンまたはｂｉｓ−ＰＥＧ−トリアジン（表１でＰＥＧ2と
示す）でそれぞれ調製したウリカーゼ結合体を開示している。Ｎｉｓｈｉｍｕｒ
ａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９および１９８１を参照。第１の型の結合体では、
ＰＥＧの分子量は２ｋＤａおよび５ｋＤａであり、第２の型では、５ｋＤａのＰ
ＥＧのみを使用した。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９は、４３
％の利用可能なリシンの直鎖５ｋＤａ ＰＥＧでの修飾後に１５％の尿酸分解活
性の回復を報告し、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９８１は、それぞ
れ４６％または３６％のリシンのＰＥＧ2での修飾後に３１％または４５％の尿
酸分解活性の回復を報告した。
【００２０】 [発明の要旨] 以前の研究では、ウリカーゼの免疫原性および／または抗原性の顕著な減少が
ＰＥＧ化によって行われる場合、この減少は尿酸分解活性の実質的な欠失に常に
関連していることを教示している。生物医薬の安全性、便利さ、費用有効性全て
にとって、効能の減少、およびそれによる投薬量増加は悪影響である。従って、
血液および尿を含む体液中の尿酸レベルの上昇を低下させるための安全で有効な
代替手段が必要である。本発明によれば、非修飾酵素の尿酸分解活性の全てまた
はほぼ全てを保持する実質的に非免疫原性のＰＥＧ−ウリカーゼが得られる。
ＰＥＧ化によって行われる場合、この減少は尿酸分解活性の実質的な欠失に常に
関連していることを教示している。生物医薬の安全性、便利さ、費用有効性全て
にとって、効能の減少、およびそれによる投薬量増加は悪影響である。従って、
血液および尿を含む体液中の尿酸レベルの上昇を低下させるための安全で有効な
代替手段が必要である。本発明によれば、非修飾酵素の尿酸分解活性の全てまた
はほぼ全てを保持する実質的に非免疫原性のＰＥＧ−ウリカーゼが得られる。
【００２１】 本発明の１つの実施形態は、非結合体ウリカーゼの尿酸分解活性の少なくとも
約７５％を保持し、免疫原性を実質的に減少させた尿酸酸化酵素（ウリカーゼ）
の結合体である。この実施形態は、各サブユニットが、直鎖または分岐鎖であり
、各ＰＥＧ分子が約５ｋＤａと１００ｋＤａとの間の分子量であり得る平均２〜
１０鎖のＰＥＧが共有結合し得る精製ウリカーゼを含む。本発明のこの態様のウ
リカーゼは、組換え体であり得る。組換えの有無にかかわらず、ウリカーゼは哺
乳動物起源であり得る。この実施形態の１つの態様では、ウリカーゼは、ブタ、
ウシ、またはヒツジの肝臓のウリカーゼであり得る。この実施形態の別の態様で
は、ウリカーゼはキメラであり得る。キメラウリカーゼには、ブタ肝臓および／
またはヒヒ肝臓ウリカーゼを含み得る。例えば、キメラウリカーゼは、ブタ−ヒ
ヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣウリカーゼ）または変異Ｒ２９１ＫおよびＴ３０１
Ｓを含むブタウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）（図６の配列および図７〜図１２
の生理学的および免疫学的研究の結果を参照のこと）であり得る。あるいは、ウ
リカーゼは、チロシン９７がヒスチジンで置換されて、ウリカーゼの比活性が少
なくとも約６０％増加し得るヒヒ肝臓ウリカーゼであり得る。本発明のウリカー
ゼは、起源が何であろうと、アミノ末端もしくはカルボキシル末端のいずれかま
たは両末端が短縮された形態でもあり得る。同様に、ウリカーゼは、真菌または
細菌ウリカーゼであり得る。この実施形態の１つの態様では、真菌または細菌ウ
リカーゼは、アスペルギルス フラバス、アースロバクター グロビフォルミス
、またはキャンディダ ユティリス由来のウリカーゼの天然に存在する形態また
は組換え形態であり得る。あるいは、ウリカーゼは、無脊椎動物ウリカーゼ、例
えば、ドロソフィラ メラノガスターまたはドロソフィラ シュードオブスキュ
ラ由来のウリカーゼの天然に存在する形態または組換え形態であり得る。本発明
のウリカーゼはまた、植物ウリカーゼ、例えば、ダイズ根粒グリシン マックス
由来のウリカーゼの天然に存在する形態または組換え形態であり得る。ＰＥＧは
、約５ｋＤａと１００ｋＤａとの間の平均分子量であり、好ましくは、ＰＥＧは
、約１０ｋＤａと６０ｋＤａとの間の平均分子量であり、より好ましくは、ＰＥ
Ｇは、約２０ｋＤａと４０ｋＤａとの間の平均分子量、例えば、３０ｋＤａであ
り得る。共有結合するＰＥＧ鎖の平均数は、ウリカーゼサブユニットあたり２〜
１０鎖であり、好ましくは、共有結合するＰＥＧ鎖の平均数は、ウリカーゼサブ
ユニットあたり３〜８鎖であり、より好ましくは、共有結合するＰＥＧ鎖の平均
数は、ウリカーゼサブユニットあたり４〜６鎖であり得る。この実施形態の１つ
の態様では、ウリカーゼは、四量体であり得る。ＰＥＧ鎖を、ウレタン（カルバ
メート）結合、第２級アミン結合、および／またはアミド結合を介して共有結合
し得る。ウリカーゼが本明細書中に記載の任意のウリカーゼの組換え形態である
場合、組換え形態は、天然に存在する形態の配列を実質的に有し得る。
約７５％を保持し、免疫原性を実質的に減少させた尿酸酸化酵素（ウリカーゼ）
の結合体である。この実施形態は、各サブユニットが、直鎖または分岐鎖であり
、各ＰＥＧ分子が約５ｋＤａと１００ｋＤａとの間の分子量であり得る平均２〜
１０鎖のＰＥＧが共有結合し得る精製ウリカーゼを含む。本発明のこの態様のウ
リカーゼは、組換え体であり得る。組換えの有無にかかわらず、ウリカーゼは哺
乳動物起源であり得る。この実施形態の１つの態様では、ウリカーゼは、ブタ、
ウシ、またはヒツジの肝臓のウリカーゼであり得る。この実施形態の別の態様で
は、ウリカーゼはキメラであり得る。キメラウリカーゼには、ブタ肝臓および／
またはヒヒ肝臓ウリカーゼを含み得る。例えば、キメラウリカーゼは、ブタ−ヒ
ヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣウリカーゼ）または変異Ｒ２９１ＫおよびＴ３０１
Ｓを含むブタウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）（図６の配列および図７〜図１２
の生理学的および免疫学的研究の結果を参照のこと）であり得る。あるいは、ウ
リカーゼは、チロシン９７がヒスチジンで置換されて、ウリカーゼの比活性が少
なくとも約６０％増加し得るヒヒ肝臓ウリカーゼであり得る。本発明のウリカー
ゼは、起源が何であろうと、アミノ末端もしくはカルボキシル末端のいずれかま
たは両末端が短縮された形態でもあり得る。同様に、ウリカーゼは、真菌または
細菌ウリカーゼであり得る。この実施形態の１つの態様では、真菌または細菌ウ
リカーゼは、アスペルギルス フラバス、アースロバクター グロビフォルミス
、またはキャンディダ ユティリス由来のウリカーゼの天然に存在する形態また
は組換え形態であり得る。あるいは、ウリカーゼは、無脊椎動物ウリカーゼ、例
えば、ドロソフィラ メラノガスターまたはドロソフィラ シュードオブスキュ
ラ由来のウリカーゼの天然に存在する形態または組換え形態であり得る。本発明
のウリカーゼはまた、植物ウリカーゼ、例えば、ダイズ根粒グリシン マックス
由来のウリカーゼの天然に存在する形態または組換え形態であり得る。ＰＥＧは
、約５ｋＤａと１００ｋＤａとの間の平均分子量であり、好ましくは、ＰＥＧは
、約１０ｋＤａと６０ｋＤａとの間の平均分子量であり、より好ましくは、ＰＥ
Ｇは、約２０ｋＤａと４０ｋＤａとの間の平均分子量、例えば、３０ｋＤａであ
り得る。共有結合するＰＥＧ鎖の平均数は、ウリカーゼサブユニットあたり２〜
１０鎖であり、好ましくは、共有結合するＰＥＧ鎖の平均数は、ウリカーゼサブ
ユニットあたり３〜８鎖であり、より好ましくは、共有結合するＰＥＧ鎖の平均
数は、ウリカーゼサブユニットあたり４〜６鎖であり得る。この実施形態の１つ
の態様では、ウリカーゼは、四量体であり得る。ＰＥＧ鎖を、ウレタン（カルバ
メート）結合、第２級アミン結合、および／またはアミド結合を介して共有結合
し得る。ウリカーゼが本明細書中に記載の任意のウリカーゼの組換え形態である
場合、組換え形態は、天然に存在する形態の配列を実質的に有し得る。
【００２２】 本発明の別の実施形態は、上記のＰＥＧ−ウリカーゼ結合体および薬学的に受
容可能なキャリアの任意を含む、体液中の尿酸レベルの低下用の薬学的組成物で
ある。組成物を、凍結乾燥によって安定化し、再構成の際、迅速に溶解して非経
口投与に適切な溶液を得ることができる。
容可能なキャリアの任意を含む、体液中の尿酸レベルの低下用の薬学的組成物で
ある。組成物を、凍結乾燥によって安定化し、再構成の際、迅速に溶解して非経
口投与に適切な溶液を得ることができる。
【００２３】 本発明はまた、哺乳動物の体液および組織中の尿酸レベルの低下法を提供する
。この方法は、尿酸減少有効量のＰＥＧ−ウリカーゼを哺乳動物に投与する工程
を含む。前記ＰＥＧ−ウリカーゼは、薬学的に受容可能なキャリア中に各サブユ
ニットが直鎖または分岐鎖ＰＥＧの平均２〜１０鎖に共有結合している２つまた
はそれ以上のサブユニットを含む精製ウリカーゼを含み、各ＰＥＧ分子は約５ｋ
Ｄａと１００ｋＤａとの間の分子量を有する。前記哺乳動物はヒトであり得る。
投与工程は、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内、または腹腔内経路での注射ま
たはエアゾール化処方であり得る。尿酸レベルの上昇は、血液、尿、および／ま
たは他の体液および組織で起こり、痛風、痛風結節、腎不全、臓器移植、および
悪性疾患に関連し得る。
。この方法は、尿酸減少有効量のＰＥＧ−ウリカーゼを哺乳動物に投与する工程
を含む。前記ＰＥＧ−ウリカーゼは、薬学的に受容可能なキャリア中に各サブユ
ニットが直鎖または分岐鎖ＰＥＧの平均２〜１０鎖に共有結合している２つまた
はそれ以上のサブユニットを含む精製ウリカーゼを含み、各ＰＥＧ分子は約５ｋ
Ｄａと１００ｋＤａとの間の分子量を有する。前記哺乳動物はヒトであり得る。
投与工程は、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内、または腹腔内経路での注射ま
たはエアゾール化処方であり得る。尿酸レベルの上昇は、血液、尿、および／ま
たは他の体液および組織で起こり、痛風、痛風結節、腎不全、臓器移植、および
悪性疾患に関連し得る。
【００２４】 本発明の他の実施形態は、複数の形態のウリカーゼを含む溶液からの四量体の
単離法およびその方法による生成物である。最初、溶液は、四量体ウリカーゼお
よびウリカーゼ凝集体を含み得る。本方法は、約９と１０．５との間のｐＨ（例
えば、１０．２）で少なくとも１つの分離カラムに溶液を添加する工程と、ウリ
カーゼ凝集体を実質的に含まない溶出液の画分を回収し、単離した四量体ウリカ
ーゼを含み得る画分を同定する工程と、単離した四量体ウリカーゼ画分をプール
する工程とを含み得る。分離カラムは、イオン交換、サイズ排除、または任意の
他の有効な分離の性質に基づき得る。本方法はまた、四量体ウリカーゼの存在お
よび／またはウリカーゼ凝集体の非存在を同定するための画分の分析を含み得る
。例えば、このような分析には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、他
のクロマトグラフィー法、光散乱、遠心分離、および／または電気泳動が含まれ
得る。この実施形態の１つの態様では、精製四量体ウリカーゼは、約１０％未満
のウリカーゼ凝集体を含み得る。
単離法およびその方法による生成物である。最初、溶液は、四量体ウリカーゼお
よびウリカーゼ凝集体を含み得る。本方法は、約９と１０．５との間のｐＨ（例
えば、１０．２）で少なくとも１つの分離カラムに溶液を添加する工程と、ウリ
カーゼ凝集体を実質的に含まない溶出液の画分を回収し、単離した四量体ウリカ
ーゼを含み得る画分を同定する工程と、単離した四量体ウリカーゼ画分をプール
する工程とを含み得る。分離カラムは、イオン交換、サイズ排除、または任意の
他の有効な分離の性質に基づき得る。本方法はまた、四量体ウリカーゼの存在お
よび／またはウリカーゼ凝集体の非存在を同定するための画分の分析を含み得る
。例えば、このような分析には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、他
のクロマトグラフィー法、光散乱、遠心分離、および／または電気泳動が含まれ
得る。この実施形態の１つの態様では、精製四量体ウリカーゼは、約１０％未満
のウリカーゼ凝集体を含み得る。
【００２５】 [好ましい実施形態の詳細な説明] 本発明は、水溶性ポリマー（好ましくは、ポリ（エチレングリコール）または
ポリ（エチレンオキシド））とウリカーゼとの改良された結合体を提供する。本
発明はまた、改良結合体の薬学的組成物を提供する。これらの結合体は、実質的
に非免疫原性であり、非修飾酵素の尿酸分解活性の少なくとも７５％、好ましく
は８５％、より好ましくは９５％またはそれ以上を保持する。水溶性ポリマーに
適切なウリカーゼには、細菌、真菌、および植物および動物、脊椎動物および無
脊椎動物の組織から単離された天然に存在する尿酸酸化酵素ならびにウリカーゼ
の組換え体、変異、雑種および／またはウリカーゼの短縮した酵素活性変異体が
含まれる。本発明での使用に適切な水溶性ポリマーには、直鎖および分岐鎖ポリ
（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）、全てＰＥＧとして公
知が含まれる。分岐ＰＥＧの例は、米国特許第５，６４３，５７５号の主題であ
る。直鎖ＰＥＧの好ましい例は、一般式ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ｎは、
約１００〜約２，３００で変化する、モノメトキシＰＥＧである。
ポリ（エチレンオキシド））とウリカーゼとの改良された結合体を提供する。本
発明はまた、改良結合体の薬学的組成物を提供する。これらの結合体は、実質的
に非免疫原性であり、非修飾酵素の尿酸分解活性の少なくとも７５％、好ましく
は８５％、より好ましくは９５％またはそれ以上を保持する。水溶性ポリマーに
適切なウリカーゼには、細菌、真菌、および植物および動物、脊椎動物および無
脊椎動物の組織から単離された天然に存在する尿酸酸化酵素ならびにウリカーゼ
の組換え体、変異、雑種および／またはウリカーゼの短縮した酵素活性変異体が
含まれる。本発明での使用に適切な水溶性ポリマーには、直鎖および分岐鎖ポリ
（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）、全てＰＥＧとして公
知が含まれる。分岐ＰＥＧの例は、米国特許第５，６４３，５７５号の主題であ
る。直鎖ＰＥＧの好ましい例は、一般式ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ｎは、
約１００〜約２，３００で変化する、モノメトキシＰＥＧである。
【００２６】 １つの好ましい哺乳動物ウリカーゼは、組換えブタ−ヒヒキメラウリカーゼで
あり、これは、ブタ肝臓およびヒヒ肝臓ウリカーゼの部分配列からなり、この両
配列はＷｕ， ｅｔ ａｌ．、１９８９で最初に決定された。このようなキメラ
ウリカーゼの１つの例は、最初にブタウリカーゼ配列（配列番号１）由来の２２
５アミノ酸および最後にヒヒウリカーゼ配列（配列番号２）由来の７９アミノ酸
を含む（ブタ−ヒヒウリカーゼ（すなわちＰＢＣウリカーゼ）、図６を参照のこ
と）。このようなウリカーゼの別の例は、ブタ配列（配列番号１）の残基７〜２
２５およびヒヒ配列（配列番号２）の残基２２６〜３０１を含む。これは、アミ
ノ末端およびカルボキシル末端の両方が短縮されたＰＢＣウリカーゼの等価物で
ある（ＰＢＣ−ＮＴ−ＣＴ、図６を参照のこと）。このようなキメラウリカーゼ
の別の例は、最初にブタ配列（配列番号１）由来の２８８アミノ酸および最後に
ヒヒ配列（配列番号２）由来の１６アミノ酸を含む。後者の配列は、残基２９１
のアルギニンのリシン（Ｋ）への置換および残基３０１のトレオニンのセリン（
Ｓ）への置換を有する２つの位置のみでブタ配列と異なるので、この変異をブタ
−Ｋ−ＳまたはＰＫＳウリカーゼという。ＰＫＳ、ＰＢＣ、およびＰＢＣ−ＮＴ
−ＣＴウリカーゼはそれぞれ、リシン残基を一つ多く有するので、ブタまたはヒ
ヒの配列より潜在的なＰＥＧ化部位を一つ多く含む。
あり、これは、ブタ肝臓およびヒヒ肝臓ウリカーゼの部分配列からなり、この両
配列はＷｕ， ｅｔ ａｌ．、１９８９で最初に決定された。このようなキメラ
ウリカーゼの１つの例は、最初にブタウリカーゼ配列（配列番号１）由来の２２
５アミノ酸および最後にヒヒウリカーゼ配列（配列番号２）由来の７９アミノ酸
を含む（ブタ−ヒヒウリカーゼ（すなわちＰＢＣウリカーゼ）、図６を参照のこ
と）。このようなウリカーゼの別の例は、ブタ配列（配列番号１）の残基７〜２
２５およびヒヒ配列（配列番号２）の残基２２６〜３０１を含む。これは、アミ
ノ末端およびカルボキシル末端の両方が短縮されたＰＢＣウリカーゼの等価物で
ある（ＰＢＣ−ＮＴ−ＣＴ、図６を参照のこと）。このようなキメラウリカーゼ
の別の例は、最初にブタ配列（配列番号１）由来の２８８アミノ酸および最後に
ヒヒ配列（配列番号２）由来の１６アミノ酸を含む。後者の配列は、残基２９１
のアルギニンのリシン（Ｋ）への置換および残基３０１のトレオニンのセリン（
Ｓ）への置換を有する２つの位置のみでブタ配列と異なるので、この変異をブタ
−Ｋ−ＳまたはＰＫＳウリカーゼという。ＰＫＳ、ＰＢＣ、およびＰＢＣ−ＮＴ
−ＣＴウリカーゼはそれぞれ、リシン残基を一つ多く有するので、ブタまたはヒ
ヒの配列より潜在的なＰＥＧ化部位を一つ多く含む。
【００２７】 ＰＢＣウリカーゼ、ＰＫＳウリカーゼ、および組換えヒヒ様ウリカーゼを含む
種々の哺乳動物ウリカーゼのｃＤＮＡをサブクローン化し、標準的な方法を用い
てエシェリヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現用の最適条件を同定した。
Ｅｒｌｉｃｈ， ＨＡ．編、１９８９、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。組換えウリカーゼを、抽出し
、精製し、それらの安定性および活性を標準的なアッセイの改変を用いてアッセ
イした。Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ， Ｉ．、１９６５、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ
．、２４０：２４９１〜２４９４、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９
７９、および実施例１を参照のこと。
種々の哺乳動物ウリカーゼのｃＤＮＡをサブクローン化し、標準的な方法を用い
てエシェリヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現用の最適条件を同定した。
Ｅｒｌｉｃｈ， ＨＡ．編、１９８９、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。組換えウリカーゼを、抽出し
、精製し、それらの安定性および活性を標準的なアッセイの改変を用いてアッセ
イした。Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ， Ｉ．、１９６５、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ
．、２４０：２４９１〜２４９４、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９
７９、および実施例１を参照のこと。
【００２８】 本発明の１つの実施形態では、ウリカーゼを、生物学的に安定で、無毒性の共
有結合を介して、比較的少数のＰＥＧ鎖に結合させることができる。このような
結合には、ウレタン（カルバメート）結合、第２級アミン結合、およびアミド結
合が含まれ得る。このような結合体に適切な種々の活性化ＰＥＧは、Ｓｈｅａｒ
ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬから市販されてい
る。
有結合を介して、比較的少数のＰＥＧ鎖に結合させることができる。このような
結合には、ウレタン（カルバメート）結合、第２級アミン結合、およびアミド結
合が含まれ得る。このような結合体に適切な種々の活性化ＰＥＧは、Ｓｈｅａｒ
ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬから市販されてい
る。
【００２９】 例えば、ウリカーゼへのウレタン結合を、ＰＥＧのスクシニミジルカーボネー
ト（ＳＣ）または４−ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）誘導体の存在下で
のウリカーゼのインキュベーションによって形成させることができる。ＳＣ−Ｐ
ＥＧを、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，６１２，４６０号に
記載の手順を用いて合成することができる。ＮＰＣ−ＰＥＧを、Ｖｅｒｏｎｅｓ
ｅ， ＦＭ．ｅｔ ａｌ．、１９８５、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．、１１：１４１〜１５２および本明細書中で参考として援用される
米国特許第５，２８６，６３７号に記載の方法に従って、ＰＥＧと４−ニトロフ
ェニルクロロホルメートとの反応によって合成することができる。’６３７の特
許に記載の方法を、類似の化学量論的性質を維持するために反応物質の濃度を調
節することによってより高分子量のＰＥＧに適用する。ＮＰＣ−ＰＥＧの別の合
成法は、Ｂｕｔｔｎｅｒ， Ｗ，ｅｔ ａｌ．に付与された、東ドイツ特許明細
書第ＤＤ２７９ ４８６Ａ１号に記載されている。
ト（ＳＣ）または４−ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）誘導体の存在下で
のウリカーゼのインキュベーションによって形成させることができる。ＳＣ−Ｐ
ＥＧを、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，６１２，４６０号に
記載の手順を用いて合成することができる。ＮＰＣ−ＰＥＧを、Ｖｅｒｏｎｅｓ
ｅ， ＦＭ．ｅｔ ａｌ．、１９８５、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．、１１：１４１〜１５２および本明細書中で参考として援用される
米国特許第５，２８６，６３７号に記載の方法に従って、ＰＥＧと４−ニトロフ
ェニルクロロホルメートとの反応によって合成することができる。’６３７の特
許に記載の方法を、類似の化学量論的性質を維持するために反応物質の濃度を調
節することによってより高分子量のＰＥＧに適用する。ＮＰＣ−ＰＥＧの別の合
成法は、Ｂｕｔｔｎｅｒ， Ｗ，ｅｔ ａｌ．に付与された、東ドイツ特許明細
書第ＤＤ２７９ ４８６Ａ１号に記載されている。
【００３０】 ウリカーゼに対するアミド結合を、ＰＥＧのカルボン酸誘導体のＮ−ヒドロキ
シスクシニミドエステル（Ｓｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を用いて得
ることができる。第２級アミン結合を、２，２，２−トリフルオロエタンスルホ
ニルＰＥＧ（トレシルＰＥＧ； Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を
用いるか、ＰＥＧアルデヒド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）およ
びシアノホウ酸水素ナトリウムを用いた還元アルキル化によって形成することが
できる。
シスクシニミドエステル（Ｓｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を用いて得
ることができる。第２級アミン結合を、２，２，２−トリフルオロエタンスルホ
ニルＰＥＧ（トレシルＰＥＧ； Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を
用いるか、ＰＥＧアルデヒド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）およ
びシアノホウ酸水素ナトリウムを用いた還元アルキル化によって形成することが
できる。
【００３１】 ５ｋＤａと３０ｋＤａとの間の分子量のＰＥＧを含む結合体では、非修飾酵素
の尿酸分解活性を少なくとも７５％保持しながらサブユニットあたりカップリン
グするＰＥＧ鎖の最大数は、ダイズウリカーゼで２鎖からＰＢＣウリカーゼで１
０鎖以上の範囲であった。（実施例１のアッセイ条件および図１Ａ〜図５Ｂの結
果を参照のこと）。後者のＰＥＧ化の範囲は、全アミノ基の約１／３に相当する
。本発明の１つの実施形態では、ウリカーゼサブユニットあたりにカップリング
するＰＥＧ鎖の平均数は、２と１０との間である。好ましい実施形態では、ウリ
カーゼサブユニットあたりに共有結合するＰＥＧ鎖の平均数は、３と８との間で
ある。より好ましい実施形態では、ウリカーゼサブユニットあたりに共有結合す
るＰＥＧの平均の鎖数は、４と６との間である。別の実施形態では、カップリン
グ反応に使用するＰＥＧの分子量は、５ｋＤａと１００ｋＤａとの間、好ましく
は１０ｋＤａと６０ｋＤａとの間、より好ましくは２０ｋＤａと４０ｋＤａとの
間、例えば、３０ｋＤａである。
の尿酸分解活性を少なくとも７５％保持しながらサブユニットあたりカップリン
グするＰＥＧ鎖の最大数は、ダイズウリカーゼで２鎖からＰＢＣウリカーゼで１
０鎖以上の範囲であった。（実施例１のアッセイ条件および図１Ａ〜図５Ｂの結
果を参照のこと）。後者のＰＥＧ化の範囲は、全アミノ基の約１／３に相当する
。本発明の１つの実施形態では、ウリカーゼサブユニットあたりにカップリング
するＰＥＧ鎖の平均数は、２と１０との間である。好ましい実施形態では、ウリ
カーゼサブユニットあたりに共有結合するＰＥＧ鎖の平均数は、３と８との間で
ある。より好ましい実施形態では、ウリカーゼサブユニットあたりに共有結合す
るＰＥＧの平均の鎖数は、４と６との間である。別の実施形態では、カップリン
グ反応に使用するＰＥＧの分子量は、５ｋＤａと１００ｋＤａとの間、好ましく
は１０ｋＤａと６０ｋＤａとの間、より好ましくは２０ｋＤａと４０ｋＤａとの
間、例えば、３０ｋＤａである。
【００３２】 ウリカーゼの所与の形態へのカップリング用のＰＥＧの最適な分子量および鎖
の数の選択に影響を与え得るいくつかの因子が存在する。一般に、尿酸分解活性
の実質的な損失を伴わない免疫原性の減少または除去には、高分子量のＰＥＧの
比較的少ない鎖と比較してより低分子量のＰＥＧの比較的多い鎖のカップリング
が必要であり得る。例えば、サブユニットあたり６鎖の２０ｋＤａ ＰＥＧまた
はサブユニットあたり４鎖の３０ｋＤａ ＰＥＧのいずれかが最も有効であり得
る。同様に、ウリカーゼのそれぞれ異なる形態は、サイズおよび鎖の数の両方に
よって異なる至適性を有し得る。図１Ａ〜図５Ｂを参照のこと。
の数の選択に影響を与え得るいくつかの因子が存在する。一般に、尿酸分解活性
の実質的な損失を伴わない免疫原性の減少または除去には、高分子量のＰＥＧの
比較的少ない鎖と比較してより低分子量のＰＥＧの比較的多い鎖のカップリング
が必要であり得る。例えば、サブユニットあたり６鎖の２０ｋＤａ ＰＥＧまた
はサブユニットあたり４鎖の３０ｋＤａ ＰＥＧのいずれかが最も有効であり得
る。同様に、ウリカーゼのそれぞれ異なる形態は、サイズおよび鎖の数の両方に
よって異なる至適性を有し得る。図１Ａ〜図５Ｂを参照のこと。
【００３３】 ＰＥＧ結合によって、フランスおよびイタリアのＳａｎｏｆｉ Ｗｉｎｔｈｒ
ｏｐで販売されている真菌ウリカーゼ（Ｕｒｉｃｏｚｙｍｅ（商品名））におけ
る安定剤として使用される８−アザキサンチンなどの基質アナログまたはインヒ
ビターを添加することなく、生理学的ｐＨの緩衝液中で全ての試験ウリカーゼを
可溶で安定にする。ＰＢＣウリカーゼの２つの異なる結合体、一方は、サブユニ
ットあたり約６鎖の１０ｋＤａ ＰＥＧを含み、他方は、サブユニットあたり約
２鎖の１９ｋＤａ ＰＥＧを含むは、マウス血清中での３７℃で１ヶ月を超える
インキュベーション後、有意な活性を保持した。さらに、本発明のいくつかの結
合体は、マウスでの循環半減期が２日間を超えるのに対して、ＰＥＧ修飾哺乳動
物および細菌ウリカーゼについての以前の報告では約８時間または２４時間の半
減期であった。Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｆｕｅｒｔｇｅｓ，
Ｆ．ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｊ． Ｃｏｎｔｒ． Ｒｅｌｅａｓｅ、１１：１
３９〜１４８； Ｆｕｊｉｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ． Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．、１４：６２３〜６２９。注射したタンパク質薬物
の半減期が長いほど費用効果も高く、患者の服薬遵守も改善され得る。半減期の
延長はまた、身体内でより耐性を示す生成物の指標である。
ｏｐで販売されている真菌ウリカーゼ（Ｕｒｉｃｏｚｙｍｅ（商品名））におけ
る安定剤として使用される８−アザキサンチンなどの基質アナログまたはインヒ
ビターを添加することなく、生理学的ｐＨの緩衝液中で全ての試験ウリカーゼを
可溶で安定にする。ＰＢＣウリカーゼの２つの異なる結合体、一方は、サブユニ
ットあたり約６鎖の１０ｋＤａ ＰＥＧを含み、他方は、サブユニットあたり約
２鎖の１９ｋＤａ ＰＥＧを含むは、マウス血清中での３７℃で１ヶ月を超える
インキュベーション後、有意な活性を保持した。さらに、本発明のいくつかの結
合体は、マウスでの循環半減期が２日間を超えるのに対して、ＰＥＧ修飾哺乳動
物および細菌ウリカーゼについての以前の報告では約８時間または２４時間の半
減期であった。Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｆｕｅｒｔｇｅｓ，
Ｆ．ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｊ． Ｃｏｎｔｒ． Ｒｅｌｅａｓｅ、１１：１
３９〜１４８； Ｆｕｊｉｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ． Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．、１４：６２３〜６２９。注射したタンパク質薬物
の半減期が長いほど費用効果も高く、患者の服薬遵守も改善され得る。半減期の
延長はまた、身体内でより耐性を示す生成物の指標である。
【００３４】 ＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ結合体を酵素の精製四量体（３５ｋＤａの４つのサ
ブユニット）から調製する場合、結合体は、マウスで顕著に減少した免疫原性を
示し（図７）、それに対して、より大きな形態の酵素（例えば、３５ｋＤａサブ
ユニットの八量体、図１２を参照のこと）のＰＥＧ結合体では中程度の免疫原性
を示し、非修飾酵素では非常に高い免疫原性を示した。ウリカーゼ欠損マウスへ
の本発明のＰＥＧ−ウリカーゼの反復注射により、２ヶ月以上にわたって高尿酸
血症が消失し、尿酸関連損傷に対する腎臓の構造および機能を保護した（図８〜
図１１）。
ブユニット）から調製する場合、結合体は、マウスで顕著に減少した免疫原性を
示し（図７）、それに対して、より大きな形態の酵素（例えば、３５ｋＤａサブ
ユニットの八量体、図１２を参照のこと）のＰＥＧ結合体では中程度の免疫原性
を示し、非修飾酵素では非常に高い免疫原性を示した。ウリカーゼ欠損マウスへ
の本発明のＰＥＧ−ウリカーゼの反復注射により、２ヶ月以上にわたって高尿酸
血症が消失し、尿酸関連損傷に対する腎臓の構造および機能を保護した（図８〜
図１１）。
【００３５】 ＰＢＣウリカーゼと１０ｋＤａ ＰＥＧとの完全に活性な結合体（図３Ａ〜図
３Ｂ）の注射により、ホモ接合性のウリカーゼ欠損マウスの高尿酸血症が劇的に
減少した（図８）。尿中の尿酸レベルもまた、ＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼで治
療した全てのウリカーゼ欠損マウスにおいて劇的に減少した。ウリカーゼ欠損マ
ウスに、図８でのデータを得るために使用したものと類似のＰＥＧ−ウリカーゼ
調製物を用いた一連の注射を投与した。正常な条件下で１２時間の水分枯渇させ
た尿の重量オスモル濃度の測定（図９）および水分消費および尿の排出（図１０
）によって示されるように、この治療により、未治療の遺伝的に類似したマウス
での対応する測定と比較して、尿濃縮欠損の重篤度が減少した。磁気共鳴顕微鏡
で視覚化したところ、本発明のＰＥＧ−ウリカーゼを用いたホモ接合性ウリカー
ゼ欠損（ｕｏｘ−／−）「ノックアウト」マウスの生後１０日目から開始した１
０週間の治療により、腎臓構造の尿酸塩誘導破壊の重篤度が減少したこともまた
示された（図１１）。顕微鏡法については、Ｈｅｄｌｕｎｄ， ＬＷ． ｅｔ
ａｌ．、１９９１、Ｆｕｎｄ. Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、１６：７８７〜
７９７； ＪＣ Ｇｏｒｅ編、Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅ
ｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第４巻、１８７〜２１９、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ：Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ中のＪｏｈｎｓｏｎ， ＧＡ． ｅｔ
ａｌ．、１９９２を参照のこと。
３Ｂ）の注射により、ホモ接合性のウリカーゼ欠損マウスの高尿酸血症が劇的に
減少した（図８）。尿中の尿酸レベルもまた、ＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼで治
療した全てのウリカーゼ欠損マウスにおいて劇的に減少した。ウリカーゼ欠損マ
ウスに、図８でのデータを得るために使用したものと類似のＰＥＧ−ウリカーゼ
調製物を用いた一連の注射を投与した。正常な条件下で１２時間の水分枯渇させ
た尿の重量オスモル濃度の測定（図９）および水分消費および尿の排出（図１０
）によって示されるように、この治療により、未治療の遺伝的に類似したマウス
での対応する測定と比較して、尿濃縮欠損の重篤度が減少した。磁気共鳴顕微鏡
で視覚化したところ、本発明のＰＥＧ−ウリカーゼを用いたホモ接合性ウリカー
ゼ欠損（ｕｏｘ−／−）「ノックアウト」マウスの生後１０日目から開始した１
０週間の治療により、腎臓構造の尿酸塩誘導破壊の重篤度が減少したこともまた
示された（図１１）。顕微鏡法については、Ｈｅｄｌｕｎｄ， ＬＷ． ｅｔ
ａｌ．、１９９１、Ｆｕｎｄ. Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、１６：７８７〜
７９７； ＪＣ Ｇｏｒｅ編、Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅ
ｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第４巻、１８７〜２１９、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ：Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ中のＪｏｈｎｓｏｎ， ＧＡ． ｅｔ
ａｌ．、１９９２を参照のこと。
【００３６】 天然に存在するウリカーゼまたは組換えウリカーゼの精製調製物は、通常、四
量体（１４０ｋＤａ）に加えて酵素の凝集体の混合物を含む。四量体形態である
各ウリカーゼ調製物の割合は、一般に、約２０％〜９０％で変化する。いくつか
の他のタンパク質の非ＰＥＧ化凝集体の免疫原性が高いにもかかわらず（例えば
、Ｍｏｏｒｅ， ＷＶ，ｅｔ ａｌ．、１９８０、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．、５１：６９１〜６９７を参照のこと）、ＰＥＧ
−ウリカーゼの以前の研究は、凝集体の含有率を制限するいかなる作業も記載さ
れていないことから、これは、ＰＥＧ修飾凝集体の潜在的な免疫原性が考慮され
ていないことが示唆される。本発明者らの観察に基づいて、このような凝集体は
その前のＰＥＧ−ウリカーゼ合成に使用された酵素調製物に存在していたようで
ある。凝集体の存在により、非免疫原性結合体の調製作業をより困難にしていた
のかもしれない。ＰＥＧ化ウリカーゼに対する以前の試みで認められた尿酸分解
活性の大部分の損失は、カップリングした多数の低分子のＰＥＧ鎖に関連するよ
うでもある。それに対して、本明細書中に記載のウリカーゼ精製法およびＰＥＧ
化法により、サブユニットあたり１０鎖ものＰＥＧの共有結合が可能となる一方
で、少なくとも一定のウリカーゼ、例えば、ブタ−ヒヒキメラウリカーゼおよび
アスペルギルス フラバス由来の酵素の７５％を超える尿酸分解活性が保持され
る（図３Ａおよび図４Ａを参照のこと）。
量体（１４０ｋＤａ）に加えて酵素の凝集体の混合物を含む。四量体形態である
各ウリカーゼ調製物の割合は、一般に、約２０％〜９０％で変化する。いくつか
の他のタンパク質の非ＰＥＧ化凝集体の免疫原性が高いにもかかわらず（例えば
、Ｍｏｏｒｅ， ＷＶ，ｅｔ ａｌ．、１９８０、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．、５１：６９１〜６９７を参照のこと）、ＰＥＧ
−ウリカーゼの以前の研究は、凝集体の含有率を制限するいかなる作業も記載さ
れていないことから、これは、ＰＥＧ修飾凝集体の潜在的な免疫原性が考慮され
ていないことが示唆される。本発明者らの観察に基づいて、このような凝集体は
その前のＰＥＧ−ウリカーゼ合成に使用された酵素調製物に存在していたようで
ある。凝集体の存在により、非免疫原性結合体の調製作業をより困難にしていた
のかもしれない。ＰＥＧ化ウリカーゼに対する以前の試みで認められた尿酸分解
活性の大部分の損失は、カップリングした多数の低分子のＰＥＧ鎖に関連するよ
うでもある。それに対して、本明細書中に記載のウリカーゼ精製法およびＰＥＧ
化法により、サブユニットあたり１０鎖ものＰＥＧの共有結合が可能となる一方
で、少なくとも一定のウリカーゼ、例えば、ブタ−ヒヒキメラウリカーゼおよび
アスペルギルス フラバス由来の酵素の７５％を超える尿酸分解活性が保持され
る（図３Ａおよび図４Ａを参照のこと）。
【００３７】 別の好ましい実施形態では、酵素の実質的に全ての四量体形態の凝集体形態を
、９と１０．５との間のｐＨ（好ましくは１０．２）でのイオン交換またはサイ
ズ排除クロマトグラフィーによって、実質的にウリカーゼの四量体調製物を生じ
るＰＥＧ結合の前に、取り除くことができる。分離用カラムからの各画分中のウ
リカーゼの分子量を、任意のサイズ依存分析、例えば、ＨＰＬＣ、従来のサイズ
排除クロマトグラフィー、遠心分離、光散乱、キャピラリー電気泳動、または非
変性緩衝液でのゲル電気泳動を含む、によってモニターすることができる。サイ
ズ排除クロマトグラフィーを用いて単離した四量体ウリカーゼについて、１４０
ｋＤａの形態の酵素のみを含む画分をプールしてＰＥＧへの結合に使用した。イ
オン交換クロマトグラフィーを用いて単離した四量体ウリカーゼについて、検出
可能な凝集体を含まない実質的な四量体の量を含むイオン交換カラム由来の画分
を、サイズについて分析して決定することができる。従って、プールしたウリカ
ーゼの少なくとも９０％が四量体形態であり得る。従って、所望でない凝集体は
、全単離ウリカーゼの約１０％、５％、２％、またはそれ以下の少なさであり得
る。
、９と１０．５との間のｐＨ（好ましくは１０．２）でのイオン交換またはサイ
ズ排除クロマトグラフィーによって、実質的にウリカーゼの四量体調製物を生じ
るＰＥＧ結合の前に、取り除くことができる。分離用カラムからの各画分中のウ
リカーゼの分子量を、任意のサイズ依存分析、例えば、ＨＰＬＣ、従来のサイズ
排除クロマトグラフィー、遠心分離、光散乱、キャピラリー電気泳動、または非
変性緩衝液でのゲル電気泳動を含む、によってモニターすることができる。サイ
ズ排除クロマトグラフィーを用いて単離した四量体ウリカーゼについて、１４０
ｋＤａの形態の酵素のみを含む画分をプールしてＰＥＧへの結合に使用した。イ
オン交換クロマトグラフィーを用いて単離した四量体ウリカーゼについて、検出
可能な凝集体を含まない実質的な四量体の量を含むイオン交換カラム由来の画分
を、サイズについて分析して決定することができる。従って、プールしたウリカ
ーゼの少なくとも９０％が四量体形態であり得る。従って、所望でない凝集体は
、全単離ウリカーゼの約１０％、５％、２％、またはそれ以下の少なさであり得
る。
【００３８】 本明細書中で示した結果は、広範囲にＰＥＧ化された場合でさえ、四量体を超
えるＰＢＣウリカーゼの形態は、マウスにおいて免疫原性が高いことを示す（図
１２）。さらに、ウリカーゼ凝集体のＰＥＧで１回注射されたマウスでは、ＰＥ
Ｇ化四量体またはＰＥＧ化凝集体のいずれかのその後の注射における尿酸分解活
性は、循環から迅速に取り除かれた。それに対して、感度の高い酵素免疫抗体法
で測定したところ、５％未満の凝集体を含むウリカーゼから調製した結合体を、
そのクリアランス速度の促進（図７）および検出可能な抗体形成を起こさず再度
多くの回数を再注射することができた。高度に精製した四量体ウリカーゼの使用
により、本発明の改良結合体と以前に記載されたＰＥＧ−ウリカーゼ調製物とを
さらに区別する。それに対して、以前の何人かの研究者によって使用されたウリ
カーゼ調製物中の凝集体の有意な比率（例えば、＞１０％）の存在により、免疫
原性を抑制するための試みで多数のＰＥＧ鎖をカップリングすることができた。
従って、得られた結合体の酵素活性は、実質的に減少した。他の実施形態では、
本発明は、このような結合体ウリカーゼの調製物がその尿酸分解活性の少なくと
も７５％を保持し、実質的に非免疫原性である限り、非四量体形態、例えば、ウ
リカーゼ二量体、におけるＰＥＧ化ウリカーゼが明白に意図される。
えるＰＢＣウリカーゼの形態は、マウスにおいて免疫原性が高いことを示す（図
１２）。さらに、ウリカーゼ凝集体のＰＥＧで１回注射されたマウスでは、ＰＥ
Ｇ化四量体またはＰＥＧ化凝集体のいずれかのその後の注射における尿酸分解活
性は、循環から迅速に取り除かれた。それに対して、感度の高い酵素免疫抗体法
で測定したところ、５％未満の凝集体を含むウリカーゼから調製した結合体を、
そのクリアランス速度の促進（図７）および検出可能な抗体形成を起こさず再度
多くの回数を再注射することができた。高度に精製した四量体ウリカーゼの使用
により、本発明の改良結合体と以前に記載されたＰＥＧ−ウリカーゼ調製物とを
さらに区別する。それに対して、以前の何人かの研究者によって使用されたウリ
カーゼ調製物中の凝集体の有意な比率（例えば、＞１０％）の存在により、免疫
原性を抑制するための試みで多数のＰＥＧ鎖をカップリングすることができた。
従って、得られた結合体の酵素活性は、実質的に減少した。他の実施形態では、
本発明は、このような結合体ウリカーゼの調製物がその尿酸分解活性の少なくと
も７５％を保持し、実質的に非免疫原性である限り、非四量体形態、例えば、ウ
リカーゼ二量体、におけるＰＥＧ化ウリカーゼが明白に意図される。
【００３９】 本発明の別の実施形態によれば、非変異酵素のものと比較して予想外に潜在性
が増加した変異ヒヒ肝臓ウリカーゼが得られる。この改良霊長類ウリカーゼを、
従来の組換えＤＮＡ技術によって調製した。ヒヒウリカーゼにおける１つのアミ
ノ酸残基の置換（９７位のトリプシンからヒスチジンへの置換）によって比活性
が実質的に増加したことが特に予想外であった。エシェリヒア コリで発現させ
た場合、変異タンパク質は誘導した組換えヒヒ酵素より少なくとも６０％高い比
活性を有することが見出された。
が増加した変異ヒヒ肝臓ウリカーゼが得られる。この改良霊長類ウリカーゼを、
従来の組換えＤＮＡ技術によって調製した。ヒヒウリカーゼにおける１つのアミ
ノ酸残基の置換（９７位のトリプシンからヒスチジンへの置換）によって比活性
が実質的に増加したことが特に予想外であった。エシェリヒア コリで発現させ
た場合、変異タンパク質は誘導した組換えヒヒ酵素より少なくとも６０％高い比
活性を有することが見出された。
【００４０】 別の実施形態では、アミノ末端での最初の少なくとも６アミノ酸および／また
はカルボキシル末端の最後の少なくとも３アミノ酸が発現タンパク質から欠失し
ている短縮変異体ブタまたはブタ−ヒヒキメラウリカーゼの発現によって、比活
性が増加し、そして／または非ＰＥＧ化酵素の溶解性が改良される（図６を参照
のこと）。カルボキシル末端短縮した組換えウリカーゼは、ペルオキシソーム標
的配列の除去により、ＰＥＧ化の前に溶解性を改良し得る。Ｍｉｕｒａ， Ｓ．
ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２３：１４
１〜１４６を参照のこと。
はカルボキシル末端の最後の少なくとも３アミノ酸が発現タンパク質から欠失し
ている短縮変異体ブタまたはブタ−ヒヒキメラウリカーゼの発現によって、比活
性が増加し、そして／または非ＰＥＧ化酵素の溶解性が改良される（図６を参照
のこと）。カルボキシル末端短縮した組換えウリカーゼは、ペルオキシソーム標
的配列の除去により、ＰＥＧ化の前に溶解性を改良し得る。Ｍｉｕｒａ， Ｓ．
ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２３：１４
１〜１４６を参照のこと。
【００４１】 本発明のＰＥＧ−ウリカーゼ結合体は、哺乳動物、好ましくはヒトの体液およ
び組織中の尿酸レベルの低下に有用であるので、痛風、痛風結節、腎不全、臓器
移植、および悪性疾患を含む病状に関連する尿酸レベルの上昇の治療に有用であ
り得る。ＰＥＧ−ウリカーゼ結合体を、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、および腹
腔内経路の多数の経路のいずれかによって過剰な尿酸レベルの哺乳動物に注射す
ることができる。あるいは、結合体を、エアゾール化および吸入させることがで
きる。Ｐａｔｔｏｎ， ＪＳ．、１９９６、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ Ｒｅｖ．、１９：３〜３６および米国特許第５，４５８，１３５号を参照
のこと。本発明のＰＥＧ−ウリカーゼの有効用量は、尿酸レベルおよび個体のサ
イズに依存する。本発明のこの態様の１つの実施形態では、ＰＥＧ−ウリカーゼ
を、約１０μｇ〜約１ｇの範囲の量で薬学的に受容可能な補形薬または希釈剤と
共に投与する。好ましい実施形態では、投薬量は、約１００μｇと５００ｍｇと
の間である。より好ましくは、結合体ウリカーゼを、約１ｍｇと１００ｍｇとの
間の量、例えば、５ｍｇ、２０ｍｇ、または５０ｍｇで投与する。実施形態の投
薬量を投与した質量を、結合体中のタンパク質量という。
び組織中の尿酸レベルの低下に有用であるので、痛風、痛風結節、腎不全、臓器
移植、および悪性疾患を含む病状に関連する尿酸レベルの上昇の治療に有用であ
り得る。ＰＥＧ−ウリカーゼ結合体を、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、および腹
腔内経路の多数の経路のいずれかによって過剰な尿酸レベルの哺乳動物に注射す
ることができる。あるいは、結合体を、エアゾール化および吸入させることがで
きる。Ｐａｔｔｏｎ， ＪＳ．、１９９６、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ Ｒｅｖ．、１９：３〜３６および米国特許第５，４５８，１３５号を参照
のこと。本発明のＰＥＧ−ウリカーゼの有効用量は、尿酸レベルおよび個体のサ
イズに依存する。本発明のこの態様の１つの実施形態では、ＰＥＧ−ウリカーゼ
を、約１０μｇ〜約１ｇの範囲の量で薬学的に受容可能な補形薬または希釈剤と
共に投与する。好ましい実施形態では、投薬量は、約１００μｇと５００ｍｇと
の間である。より好ましくは、結合体ウリカーゼを、約１ｍｇと１００ｍｇとの
間の量、例えば、５ｍｇ、２０ｍｇ、または５０ｍｇで投与する。実施形態の投
薬量を投与した質量を、結合体中のタンパク質量という。
【００４２】 ＰＥＧ−ウリカーゼを含む薬学的処方物を、Ｇｅｎｎａｒｏ， ＡＲ，編、１
９９０、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ、第１８版、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏ．などに記載の従来技術によって調製することができる。注射可能な溶液の調
製物用の適切な補形薬には、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、乳酸化リンガー
溶液、水、ポリオール、およびグリセロールが含まれる。非経口注射用の薬学的
組成物は、薬学的に受容可能な滅菌水溶性または非水溶性液体、分散剤、懸濁剤
、または乳化剤、ならびに使用直前の滅菌注射溶液または分散剤への再構成用の
滅菌粉末を含む。これらの処方物は、更なる成分（例えば、防腐剤、可溶化剤、
安定剤、潤滑剤、乳化剤、緩衝液、抗酸化剤、および希釈剤など）を含み得る。
９９０、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ、第１８版、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏ．などに記載の従来技術によって調製することができる。注射可能な溶液の調
製物用の適切な補形薬には、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、乳酸化リンガー
溶液、水、ポリオール、およびグリセロールが含まれる。非経口注射用の薬学的
組成物は、薬学的に受容可能な滅菌水溶性または非水溶性液体、分散剤、懸濁剤
、または乳化剤、ならびに使用直前の滅菌注射溶液または分散剤への再構成用の
滅菌粉末を含む。これらの処方物は、更なる成分（例えば、防腐剤、可溶化剤、
安定剤、潤滑剤、乳化剤、緩衝液、抗酸化剤、および希釈剤など）を含み得る。
【００４３】 ＰＥＧ−ウリカーゼを、体液中の尿酸レベルの上昇を継続的に調節するための
個体への移植用の放出調節組成物として供給することもできる。例えば、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、再生コラーゲン、ポリ−Ｌ−リシン、アルギン酸ナトリ
ウム、ゲル化ガム、キトサン、アガロース、多重層リポソーム、および他の多数
の従来の蓄積処方物は、生物活性組成物とともに処方することができる生侵食性
および生分解性物質を含む。これらの物質は、移植または注射された場合、段階
的に崩壊し、周辺組織に活性物質を放出する。例えば、ＰＥＧ−ウリカーゼのカ
プセル化の方法の１つは、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，６
５３，９７４号に開示の方法を含む。生侵食性で生分解性の他の蓄積処方物の使
用が本発明で明白に意図される。ＰＥＧ−ウリカーゼの送達用の注入ポンプおよ
び基質包括システムもまた、本発明の範囲内である。ＰＥＧ−ウリカーゼはまた
、ミセルまたはリポソームに有利に封入され得る。リポソームカプセル化技術は
、当該分野で周知である。例えば、Ｌａｓｉｃ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．編、１９
９５、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ． Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
個体への移植用の放出調節組成物として供給することもできる。例えば、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、再生コラーゲン、ポリ−Ｌ−リシン、アルギン酸ナトリ
ウム、ゲル化ガム、キトサン、アガロース、多重層リポソーム、および他の多数
の従来の蓄積処方物は、生物活性組成物とともに処方することができる生侵食性
および生分解性物質を含む。これらの物質は、移植または注射された場合、段階
的に崩壊し、周辺組織に活性物質を放出する。例えば、ＰＥＧ−ウリカーゼのカ
プセル化の方法の１つは、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，６
５３，９７４号に開示の方法を含む。生侵食性で生分解性の他の蓄積処方物の使
用が本発明で明白に意図される。ＰＥＧ−ウリカーゼの送達用の注入ポンプおよ
び基質包括システムもまた、本発明の範囲内である。ＰＥＧ−ウリカーゼはまた
、ミセルまたはリポソームに有利に封入され得る。リポソームカプセル化技術は
、当該分野で周知である。例えば、Ｌａｓｉｃ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．編、１９
９５、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ． Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００４４】 本発明のＰＥＧ−ウリカーゼ薬学的組成物により、例えば、臓器移植レシピエ
ントの尿酸塩誘導性腎不全の危険性の高い患者（Ｖｅｎｋａｔａｓｅｓｈａｎ，
ＶＳ． ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｎｅｐｈｒｏｎ．、５６：３１７〜３２１
を参照のこと）およびいくつかの悪性疾患患者における血液透析の必要性が減少
する。結晶尿酸塩を大量に蓄積した患者（痛風結節）では、このような組成物は
、現在利用可能な治療より、迅速に生活の質を改善する。
ントの尿酸塩誘導性腎不全の危険性の高い患者（Ｖｅｎｋａｔａｓｅｓｈａｎ，
ＶＳ． ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｎｅｐｈｒｏｎ．、５６：３１７〜３２１
を参照のこと）およびいくつかの悪性疾患患者における血液透析の必要性が減少
する。結晶尿酸塩を大量に蓄積した患者（痛風結節）では、このような組成物は
、現在利用可能な治療より、迅速に生活の質を改善する。
【００４５】 以下の実施例は、上記で開示の種々の態様を例示するものであって、本発明を
決して限定するものではない。これらの実施例は、いくつかのサイズおよび組成
の活性化（すなわち、電気親和性）ＰＥＧ誘導体と、天然に存在するブタ、真菌
、もしくは細菌のウリカーゼまたは組換えのダイズ、ブタ、またはブタ−ヒヒキ
メラウリカーゼとのカップリングによって調製されるＰＥＧ−ウリカーゼを記載
する。活性、溶解性、安定性、薬学的動力学、薬物動態学、および免疫学的研究
の結果を含む。図８〜図１１のデータにより、高尿酸血症および高尿酸尿症を治
療し抗尿酸血症および抗尿酸尿症が発症して重篤な腎損傷を引き起こす動物モデ
ルにおける腎臓の構造および機能を保護する本発明のＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカー
ゼの能力が証明される。Ｗｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：７４２〜７４６。これらの実施例は
、非修飾酵素の尿酸分解活性を少なくとも約７５％保持するウリカーゼの実質的
に非免疫原性な結合体の作製のための当業者へのガイダンスを提供する。
決して限定するものではない。これらの実施例は、いくつかのサイズおよび組成
の活性化（すなわち、電気親和性）ＰＥＧ誘導体と、天然に存在するブタ、真菌
、もしくは細菌のウリカーゼまたは組換えのダイズ、ブタ、またはブタ−ヒヒキ
メラウリカーゼとのカップリングによって調製されるＰＥＧ−ウリカーゼを記載
する。活性、溶解性、安定性、薬学的動力学、薬物動態学、および免疫学的研究
の結果を含む。図８〜図１１のデータにより、高尿酸血症および高尿酸尿症を治
療し抗尿酸血症および抗尿酸尿症が発症して重篤な腎損傷を引き起こす動物モデ
ルにおける腎臓の構造および機能を保護する本発明のＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカー
ゼの能力が証明される。Ｗｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：７４２〜７４６。これらの実施例は
、非修飾酵素の尿酸分解活性を少なくとも約７５％保持するウリカーゼの実質的
に非免疫原性な結合体の作製のための当業者へのガイダンスを提供する。
【００４６】 [実施例１] ウリカーゼの四量体形態の精製 ウリカーゼの四量体形態（分子量約１４０ｋＤａ）を、分離用のサイズ排除ま
たはイオン交換クロマトグラフィー、その後の分析用サイズ排除クロマトグラフ
ィーでブタ肝臓ウリカーゼ溶液から精製した。ブタ肝臓ウリカーゼは、Ｓｉｇｍ
ａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ｕ２３５０もしく
はＵ３３７７またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａ
ｐｏｌｉｓ、ＩＮから得た。
たはイオン交換クロマトグラフィー、その後の分析用サイズ排除クロマトグラフ
ィーでブタ肝臓ウリカーゼ溶液から精製した。ブタ肝臓ウリカーゼは、Ｓｉｇｍ
ａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ｕ２３５０もしく
はＵ３３７７またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａ
ｐｏｌｉｓ、ＩＮから得た。
【００４７】 分離用および分析用サイズ排除クロマトグラフィーを、ｐＨ１０〜１０．５（
好ましくは１０．２）で、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩
衝液中で、公知の分子量のタンパク質で予め較正しているＳｕｐｅｒｄｅｘ ２
００カラムで行った。Ｓｕｐｅｒｄｅｘを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから得た。所望のｐＨを維持し、後のＰＥＧ
カップリングに使用される化学的性質に適合可能な任意の緩衝液を使用すること
ができる。このような緩衝液は、当該分野で周知である。分離カラム由来の溶出
液のＵＶ吸収を、２８０ｎｍでモニターし、所望の四量体の分子量に対応するが
より高い分子量種を含まない溶出液のウリカーゼ含有部分を、実施例２に記載の
実質的に非免疫原性ＰＥＧ−ウリカーゼの合成に使用するために回収した。ある
いは、ウリカーゼの四量体形態を、他のサイズ排除媒体、例えば、Ｓｕｐｅｒｏ
ｓｅ １２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など、または弱アルカリ
性溶液に適合し、適切なサイズ分画範囲を有する任意の他の媒体を使用して単離
することができる。このような媒体は、容易に利用可能であり、当該分野で周知
である。
好ましくは１０．２）で、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩
衝液中で、公知の分子量のタンパク質で予め較正しているＳｕｐｅｒｄｅｘ ２
００カラムで行った。Ｓｕｐｅｒｄｅｘを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから得た。所望のｐＨを維持し、後のＰＥＧ
カップリングに使用される化学的性質に適合可能な任意の緩衝液を使用すること
ができる。このような緩衝液は、当該分野で周知である。分離カラム由来の溶出
液のＵＶ吸収を、２８０ｎｍでモニターし、所望の四量体の分子量に対応するが
より高い分子量種を含まない溶出液のウリカーゼ含有部分を、実施例２に記載の
実質的に非免疫原性ＰＥＧ−ウリカーゼの合成に使用するために回収した。ある
いは、ウリカーゼの四量体形態を、他のサイズ排除媒体、例えば、Ｓｕｐｅｒｏ
ｓｅ １２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など、または弱アルカリ
性溶液に適合し、適切なサイズ分画範囲を有する任意の他の媒体を使用して単離
することができる。このような媒体は、容易に利用可能であり、当該分野で周知
である。
【００４８】 イオン交換クロマトグラフィーを、ｐＨ１０〜１０．５、好ましくは１０．２
で、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ Ｑカラム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で行った。ＰＥ
Ｇカップリングの化学的性質に適合し、所望のｐＨを維持することができる任意
の緩衝液を十分に低いイオン強度で使用して、ウリカーゼをカラムに吸着させる
ことができる。このような緩衝液は、当該分野で周知である。溶出液のＵＶ吸収
を、注いだ緩衝液のイオン強度の増加、例えば、炭酸ナトリウム緩衝液中の０〜
０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的勾配によってイオン交換樹脂からウリカーゼが溶出
している間、２８０ｎｍでモニターした。次いで、サイズ排除ＨＰＬＣを使用し
て、実質的に非免疫原性のＰＥＧ−ウリカーゼの合成用の、検出可能な凝集体を
含まない、所望のウリカーゼの四量体を含む溶出液の画分を同定した。あるいは
、ウリカーゼの四量体形態を、他のイオン交換体、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など、または弱アルカリ性溶液に適合す
る任意の他の媒体を使用して単離することができる。このような媒体は容易に利
用可能であり、当該分野で周知である。
で、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ Ｑカラム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で行った。ＰＥ
Ｇカップリングの化学的性質に適合し、所望のｐＨを維持することができる任意
の緩衝液を十分に低いイオン強度で使用して、ウリカーゼをカラムに吸着させる
ことができる。このような緩衝液は、当該分野で周知である。溶出液のＵＶ吸収
を、注いだ緩衝液のイオン強度の増加、例えば、炭酸ナトリウム緩衝液中の０〜
０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的勾配によってイオン交換樹脂からウリカーゼが溶出
している間、２８０ｎｍでモニターした。次いで、サイズ排除ＨＰＬＣを使用し
て、実質的に非免疫原性のＰＥＧ−ウリカーゼの合成用の、検出可能な凝集体を
含まない、所望のウリカーゼの四量体を含む溶出液の画分を同定した。あるいは
、ウリカーゼの四量体形態を、他のイオン交換体、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など、または弱アルカリ性溶液に適合す
る任意の他の媒体を使用して単離することができる。このような媒体は容易に利
用可能であり、当該分野で周知である。
【００４９】 ウリカーゼ活性を、標準的な方法の改変を用いてアッセイした。例えば、Ｆｒ
ｉｄｏｖｉｃｈ、 １９６５； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７
９を参照のこと。尿酸溶液を、毎日新たに調製した５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ９．２中に調製して６〜１５０μＭの最終アッセイ濃度にした。ウリ
カーゼ調製物を、アッセイにおけるアルブミンの最終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬと
なるようにウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ、ＭＯ、カタログ番号Ａ−７０３０）を含むこのホウ酸緩衝液中で希釈した。
酵素の種々の希釈物とマイクロプレートリーダー中のマイクロタイタープレート
のウェル中の基質との混合後、２５℃での尿酸の消失速度を、３分間に４秒毎を
２９２ｎｍで監視した。１０％と４０％との間の基質が３分以内に消費されるサ
ンプルから、少なくとも２０データポイントを使用して、１分間あたりの吸光度
の最大減少速度を計算した。ウリカーゼ活性の１国際単位（ＩＵ）を、１分間に
１μモルの尿酸を消費した酵素量と定義する。比活性を、ＩＵ／ｍｇタンパク質
と示す。図１Ａ〜図５Ｂの相対的なウリカーゼ活性のデータのいくつかを、アッ
セイにおいて１００μＭの尿酸を使用して得た。１００μＭの尿酸での速度（Ｖ100 ）についての他の結果を、各酵素調製物についてのミカエリス定数（ＫM）お
よび最大速度（Ｖmax）から、以下の式を用いて計算した。
ｉｄｏｖｉｃｈ、 １９６５； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７
９を参照のこと。尿酸溶液を、毎日新たに調製した５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ９．２中に調製して６〜１５０μＭの最終アッセイ濃度にした。ウリ
カーゼ調製物を、アッセイにおけるアルブミンの最終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬと
なるようにウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ、ＭＯ、カタログ番号Ａ−７０３０）を含むこのホウ酸緩衝液中で希釈した。
酵素の種々の希釈物とマイクロプレートリーダー中のマイクロタイタープレート
のウェル中の基質との混合後、２５℃での尿酸の消失速度を、３分間に４秒毎を
２９２ｎｍで監視した。１０％と４０％との間の基質が３分以内に消費されるサ
ンプルから、少なくとも２０データポイントを使用して、１分間あたりの吸光度
の最大減少速度を計算した。ウリカーゼ活性の１国際単位（ＩＵ）を、１分間に
１μモルの尿酸を消費した酵素量と定義する。比活性を、ＩＵ／ｍｇタンパク質
と示す。図１Ａ〜図５Ｂの相対的なウリカーゼ活性のデータのいくつかを、アッ
セイにおいて１００μＭの尿酸を使用して得た。１００μＭの尿酸での速度（Ｖ100 ）についての他の結果を、各酵素調製物についてのミカエリス定数（ＫM）お
よび最大速度（Ｖmax）から、以下の式を用いて計算した。
【００５０】
【数１】 Ｖ100＝１００×Ｖmax／（ＫM＋１００） （ＫMは、μモル単位で示す）
【００５１】 [実施例２] 四量体ブタウリカーゼへのＰＥＧカップリング ０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．２中の四量体ウリカーゼ溶液に、
１０〜２００モルの種々のサイズ（５ｋＤａ〜３０ｋＤａ）の活性化モノメトキ
シＰＥＧ誘導体、例えば、４−ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ−ＰＥＧ）
を、各モルのウリカーゼサブユニット（分子量３５ｋＤａ）に添加した。これら
または他の適切な活性化ＰＥＧは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒから
購入可能である。これらのＰＥＧのタンパク質へのカップリングの指示は、Ｓｈ
ｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｕｍｅｒｓのカタログ、インターネットｗｗｗ．ｓｗ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ．ｃｏｍ、およびＪＭ Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．編、１９
９７、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎ
ｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６８０、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙで得られる。カップリング反応を、ＰＥ
Ｇカップリングの範囲を経時的に顕著に変化するまで０〜８℃で進行させても差
し支えなかった。次いで、未処理ＰＥＧを、クロマトグラフィーおよび／または
限外濾過によって反応生成物から取り除いた。
１０〜２００モルの種々のサイズ（５ｋＤａ〜３０ｋＤａ）の活性化モノメトキ
シＰＥＧ誘導体、例えば、４−ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ−ＰＥＧ）
を、各モルのウリカーゼサブユニット（分子量３５ｋＤａ）に添加した。これら
または他の適切な活性化ＰＥＧは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒから
購入可能である。これらのＰＥＧのタンパク質へのカップリングの指示は、Ｓｈ
ｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｕｍｅｒｓのカタログ、インターネットｗｗｗ．ｓｗ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ．ｃｏｍ、およびＪＭ Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．編、１９
９７、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎ
ｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６８０、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙで得られる。カップリング反応を、ＰＥ
Ｇカップリングの範囲を経時的に顕著に変化するまで０〜８℃で進行させても差
し支えなかった。次いで、未処理ＰＥＧを、クロマトグラフィーおよび／または
限外濾過によって反応生成物から取り除いた。
【００５２】 ウリカーゼのサブユニットあたりにカップリングしたＰＥＧ鎖の数を、Ｋｕｎ
ｉｔａｎｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、
５８８：１２５〜１３７；Ｓａｉｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．、１９９７、およびＳｈ
ｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ．、１９９７に記載の方法の適用によって同定した。
簡単に述べれば、分離用イオン交換またはサイズ排除カラムからのＰＥＧ化反応
混合物または画分の部分を、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ炭酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ１０．２中、室温でＴＳＫ ５，０００ｐＷXLカラムによる分析用
サイズ排除ＨＰＬＣによって特徴づけた。ＨＰＬＣカラムを、ＴｏｓｏＨａａｓ
、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡから得た。タンパク質およびＰＥＧを
、紫外線吸収および屈折率検出器によって監視した。結合体中のタンパク質量を
、適切な非修飾ウリカーゼ標準と比較した紫外線吸光度から計算した。次いで、
結合体中のＰＥＧの量を、屈折率に対するタンパク質の寄与として回収した屈折
率の領域から、適切なＰＥＧ標準の屈折率ピークの領域と比較して計算した。
ｉｔａｎｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、
５８８：１２５〜１３７；Ｓａｉｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．、１９９７、およびＳｈ
ｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ．、１９９７に記載の方法の適用によって同定した。
簡単に述べれば、分離用イオン交換またはサイズ排除カラムからのＰＥＧ化反応
混合物または画分の部分を、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ炭酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ１０．２中、室温でＴＳＫ ５，０００ｐＷXLカラムによる分析用
サイズ排除ＨＰＬＣによって特徴づけた。ＨＰＬＣカラムを、ＴｏｓｏＨａａｓ
、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡから得た。タンパク質およびＰＥＧを
、紫外線吸収および屈折率検出器によって監視した。結合体中のタンパク質量を
、適切な非修飾ウリカーゼ標準と比較した紫外線吸光度から計算した。次いで、
結合体中のＰＥＧの量を、屈折率に対するタンパク質の寄与として回収した屈折
率の領域から、適切なＰＥＧ標準の屈折率ピークの領域と比較して計算した。
【００５３】 図２Ａは、サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのブタ肝
臓由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す。本発明者等のデータ（
黒三角、□）をＣｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１のデータと比較する。大き
な円内のデータポイントは、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１による非免疫
反応性であると報告されている結合体を示す。図２Ａに示すように、サブユニッ
トあたり６鎖までの３０ｋＤａ ＰＥＧまたはサブユニットあたり７鎖までの５
ｋＤａ ＰＥＧを有する四量体ブタウリカーゼ結合体は、非修飾酵素活性の少な
くとも７５％を保持した。５ｋＤａまたは３０ｋＤａ ＰＥＧの鎖数（サブユニ
ットあたり約４鎖まで）の増大に伴う非活性の明白な増加により、結合体と比較
して非修飾酵素の相対的不溶性または不安定性に影響を与え得る。図２Ｂに示す
ように、サブユニットあたり平均３鎖を超える３０ｋDaＰＥＧとブタウリカーゼ
結合体は、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１によって免疫反応性を阻害する
のに十分であると見出されている量よりも多いＰＥＧを含む。
臓由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す。本発明者等のデータ（
黒三角、□）をＣｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１のデータと比較する。大き
な円内のデータポイントは、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１による非免疫
反応性であると報告されている結合体を示す。図２Ａに示すように、サブユニッ
トあたり６鎖までの３０ｋＤａ ＰＥＧまたはサブユニットあたり７鎖までの５
ｋＤａ ＰＥＧを有する四量体ブタウリカーゼ結合体は、非修飾酵素活性の少な
くとも７５％を保持した。５ｋＤａまたは３０ｋＤａ ＰＥＧの鎖数（サブユニ
ットあたり約４鎖まで）の増大に伴う非活性の明白な増加により、結合体と比較
して非修飾酵素の相対的不溶性または不安定性に影響を与え得る。図２Ｂに示す
ように、サブユニットあたり平均３鎖を超える３０ｋDaＰＥＧとブタウリカーゼ
結合体は、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１によって免疫反応性を阻害する
のに十分であると見出されている量よりも多いＰＥＧを含む。
【００５４】 [実施例３] 四量体組換えＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ結合体の性質 組換えブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼｃＤＮＡを、ｐＥＴ３ｄ発現ベ
クター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にサブクローン化し、得られ
たプラスミド構築物を、エシェリヒア コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株
（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、発現させた。これらの手順を、分子生物学分
野で周知の方法を用いて行った。Ｅｒｌｉｃｈ、１９８９； Ｓａｍｂｒｏｏｋ
， ｅｔ ａｌ．、１９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．編、１
９９７、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照のこ
と。
クター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にサブクローン化し、得られ
たプラスミド構築物を、エシェリヒア コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株
（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、発現させた。これらの手順を、分子生物学分
野で周知の方法を用いて行った。Ｅｒｌｉｃｈ、１９８９； Ｓａｍｂｒｏｏｋ
， ｅｔ ａｌ．、１９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．編、１
９９７、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照のこ
と。
【００５５】 図６は、ブタ（配列番号１）およびヒヒ（配列番号２）配列と比較した、ＰＢ
Ｃウリカーゼ（配列番号１のアミノ酸１〜２２５および配列番号２のアミノ酸２
２６〜３０４）の推定アミノ酸配列を示す。ブタ配列の残基と異なるヒヒ配列の
残基を太字で示す。ブタおよびヒヒの配列は、Ｗｕ， ｅｔ ａｌ．、１９８９
によって最初に同定され、本発明で確認した。配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋ配
列において最初のメチオニン残基が存在しない以外は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセ
ッション番号ｐ１６１６４と同一である。配列番号２は、ＧｅｎＢａｎｋ配列の
最初のメチオニン残基が存在せず、残基１５３でヒスチジンがトレオニンに変更
されている（図６の残基１５４）以外は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号
ｐ２５６８９と同一である。
Ｃウリカーゼ（配列番号１のアミノ酸１〜２２５および配列番号２のアミノ酸２
２６〜３０４）の推定アミノ酸配列を示す。ブタ配列の残基と異なるヒヒ配列の
残基を太字で示す。ブタおよびヒヒの配列は、Ｗｕ， ｅｔ ａｌ．、１９８９
によって最初に同定され、本発明で確認した。配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋ配
列において最初のメチオニン残基が存在しない以外は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセ
ッション番号ｐ１６１６４と同一である。配列番号２は、ＧｅｎＢａｎｋ配列の
最初のメチオニン残基が存在せず、残基１５３でヒスチジンがトレオニンに変更
されている（図６の残基１５４）以外は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号
ｐ２５６８９と同一である。
【００５６】 ＰＢＣウリカーゼの四量体形態を、実施例１および実施例２に記載のように単
離して種々の分子量のＰＥＧにカップリングした。５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１９
ｋＤａ、３０ｋＤａ ＰＥＧで調製した結合体は、サブユニットあたり１０鎖ま
でのＰＥＧを含んでいた。少なくとも１０ｋＤａのＰＥＧで調製した結合体は、
組換えウリカーゼの最初の比活性の９５％以上を保持した（図３Ａ〜図３Ｂ）。
離して種々の分子量のＰＥＧにカップリングした。５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１９
ｋＤａ、３０ｋＤａ ＰＥＧで調製した結合体は、サブユニットあたり１０鎖ま
でのＰＥＧを含んでいた。少なくとも１０ｋＤａのＰＥＧで調製した結合体は、
組換えウリカーゼの最初の比活性の９５％以上を保持した（図３Ａ〜図３Ｂ）。
【００５７】 サブユニットあたり約６鎖の１０ｋＤａ ＰＥＧを有する四量体ＰＢＣウリカ
ーゼの結合体の以下の性質を図に示す：免疫原性の欠如（図７）および１）高尿
酸血症および高尿酸尿症の治療（図８）、。２）尿濃縮欠損（図９）の重篤度の
減少、および３）腎性尿崩症（図１０）の重篤度の減少におけるウリカーゼ欠損
マウスの効率。さらに、このＰＥＧ−ウリカーゼにより、磁気共鳴顕微鏡（図１
１）で視覚化したところ、尿酸関連腎障害の重篤度が減少した。
ーゼの結合体の以下の性質を図に示す：免疫原性の欠如（図７）および１）高尿
酸血症および高尿酸尿症の治療（図８）、。２）尿濃縮欠損（図９）の重篤度の
減少、および３）腎性尿崩症（図１０）の重篤度の減少におけるウリカーゼ欠損
マウスの効率。さらに、このＰＥＧ−ウリカーゼにより、磁気共鳴顕微鏡（図１
１）で視覚化したところ、尿酸関連腎障害の重篤度が減少した。
【００５８】 図７は、最初の注射から２４時間後の値と比較した、ＰＥＧ−ウリカーゼの４
〜５回の腹腔内注射から各２４時間後のマウス血清におけるＰＢＣウリカーゼ活
性を示す。ＰＥＧ結合体を、ＰＥＧ活性化の２つの異なる技術を用いてＰＢＣウ
リカーゼの３つの異なる調製物から調製した。１つの調製物（●）を、ウリカー
ゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウスで試験し、他の２つ（△、■）を正常なＢＡＬＢ
／ｃマウスで試験した。最も免疫反応性のある調製物（△）は、ＰＥＧのスクシ
ニミジルカーボネート誘導体（ＳＣ−ＰＥＧ）を用いて、サブユニットあたり平
均７鎖の５ｋＤａ ＰＥＧにカップリングした未知量のウリカーゼ凝集体を含む
精製ＰＢＣウリカーゼから調製した。本明細書中で参考として援用されるＺａｌ
ｉｐｓｋｙに付与された米国特許第５，６１２，４６０号。中程度の免疫反応性
のある調製物（■）は、ＰＥＧの４−ニトロフェニルカーボネート誘導体（ＮＰ
Ｃ−ＰＥＧ）を用いて、サブユニットあたり平均２鎖の１９ｋＤａ ＰＥＧに対
して１１％の凝集体を含むＰＢＣウリカーゼ調製物のカップリングによって調製
した。Ｓｈｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．、１９９７。最も低い免疫反応結合体（●
）を、５％未満の凝集ウリカーゼを含むｐＢＣウリカーゼ調製物へのサブユニッ
トあたり平均６鎖の１０ｋＤａ ＮＰＣ−ＰＥＧのカップリングによって調製し
た。
〜５回の腹腔内注射から各２４時間後のマウス血清におけるＰＢＣウリカーゼ活
性を示す。ＰＥＧ結合体を、ＰＥＧ活性化の２つの異なる技術を用いてＰＢＣウ
リカーゼの３つの異なる調製物から調製した。１つの調製物（●）を、ウリカー
ゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウスで試験し、他の２つ（△、■）を正常なＢＡＬＢ
／ｃマウスで試験した。最も免疫反応性のある調製物（△）は、ＰＥＧのスクシ
ニミジルカーボネート誘導体（ＳＣ−ＰＥＧ）を用いて、サブユニットあたり平
均７鎖の５ｋＤａ ＰＥＧにカップリングした未知量のウリカーゼ凝集体を含む
精製ＰＢＣウリカーゼから調製した。本明細書中で参考として援用されるＺａｌ
ｉｐｓｋｙに付与された米国特許第５，６１２，４６０号。中程度の免疫反応性
のある調製物（■）は、ＰＥＧの４−ニトロフェニルカーボネート誘導体（ＮＰ
Ｃ−ＰＥＧ）を用いて、サブユニットあたり平均２鎖の１９ｋＤａ ＰＥＧに対
して１１％の凝集体を含むＰＢＣウリカーゼ調製物のカップリングによって調製
した。Ｓｈｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．、１９９７。最も低い免疫反応結合体（●
）を、５％未満の凝集ウリカーゼを含むｐＢＣウリカーゼ調製物へのサブユニッ
トあたり平均６鎖の１０ｋＤａ ＮＰＣ−ＰＥＧのカップリングによって調製し
た。
【００５９】 図８は、血清および尿中の尿酸濃度とウリカーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウス
の血清中の注射されたＰＥＧ−ウリカーゼの活性との間の反比例関係を示す。注
射から０時間および７２時間で、酵素サブユニットあたり平均６鎖の１０ｋＤａ
ＰＥＧに結合したＰＢＣウリカーゼが０．４３ＩＵ含まれていた。
の血清中の注射されたＰＥＧ−ウリカーゼの活性との間の反比例関係を示す。注
射から０時間および７２時間で、酵素サブユニットあたり平均６鎖の１０ｋＤａ
ＰＥＧに結合したＰＢＣウリカーゼが０．４３ＩＵ含まれていた。
【００６０】 図９は、ウリカーゼ欠損マウスのＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼでの治療により
、尿濃縮欠損の重篤度が減少したことを示す。正常なマウスウリカーゼ遺伝子（
ｕｏｘ＋／−）の１コピーを含む２匹のマウス、６匹の未処理ホモ接合性ウリカ
ーゼ欠損マウス（ｕｏｘ−／−）、および３日目と７２日目との間に９５ｍＩＵ
または１９０ｍＩＵのＰＥＧ−ウリカーゼを１０回注射した６匹のホモ接合性ウ
リカーゼ欠損マウスについて尿重量オスモル濃度データの平均および標準偏差を
示す。各遺伝的背景のマウスの尿の回収前に、水を任意に摂取する（黒塗りのバ
ー）か、１２時間水を枯渇させた。
、尿濃縮欠損の重篤度が減少したことを示す。正常なマウスウリカーゼ遺伝子（
ｕｏｘ＋／−）の１コピーを含む２匹のマウス、６匹の未処理ホモ接合性ウリカ
ーゼ欠損マウス（ｕｏｘ−／−）、および３日目と７２日目との間に９５ｍＩＵ
または１９０ｍＩＵのＰＥＧ−ウリカーゼを１０回注射した６匹のホモ接合性ウ
リカーゼ欠損マウスについて尿重量オスモル濃度データの平均および標準偏差を
示す。各遺伝的背景のマウスの尿の回収前に、水を任意に摂取する（黒塗りのバ
ー）か、１２時間水を枯渇させた。
【００６１】 図１０は、ウリカーゼ欠損マウスのＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼでの治療によ
り、異常に高い水の消費および異常に高い尿の排出によって特徴づけられる腎性
尿崩症の重篤度が減少したことを示す。マウスの遺伝的背景および処理プロトコ
ールは図９と同一である。毎日の水の消費（黒塗りのバー）および尿排出（斜線
のバー）の平均および標準偏差を、６匹のマウスの３群として示す。
り、異常に高い水の消費および異常に高い尿の排出によって特徴づけられる腎性
尿崩症の重篤度が減少したことを示す。マウスの遺伝的背景および処理プロトコ
ールは図９と同一である。毎日の水の消費（黒塗りのバー）および尿排出（斜線
のバー）の平均および標準偏差を、６匹のマウスの３群として示す。
【００６２】 図１１は、磁気共鳴顕微鏡で視覚化したところ、ウリカーゼ欠損マウスのＰＥ
Ｇ修飾ＰＢＣウリカーゼでの治療により、尿酸誘導性腎症の重篤度が減少したこ
とを示す。３群のマウスの遺伝的背景および処理プロトコールは図９および図１
０と同一であった。磁気共鳴顕微鏡法を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖ
ｏ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｕｒｈａｍ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａで行った。
Ｇ修飾ＰＢＣウリカーゼでの治療により、尿酸誘導性腎症の重篤度が減少したこ
とを示す。３群のマウスの遺伝的背景および処理プロトコールは図９および図１
０と同一であった。磁気共鳴顕微鏡法を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖ
ｏ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｕｒｈａｍ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａで行った。
【００６３】 図８〜図１１にまとめた結果に加えて、全てのウリカーゼ欠損マウスの尿中の
尿酸レベルがＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼ治療後に劇的に減少したことを示した
。最後に、図１２は、ＰＢＣウリカーゼの異なるＰＥＧ修飾形態である、八量体
形態（分子量＝２８０ｋＤａ）では、広範にＰＥＧ化した場合でさえマウスで免
疫原性を示すことを示す。この特性は、一回の腹膜内注射から５日以内にＰＥＧ
修飾八量体のクリアランスの促進に反映されている。同一のマウスに、同用量の
同一のＰＥＧ−ウリカーゼ調製物を８日目及び１５日目に再注射した。第２およ
び第３の注射から２４時間後、尿酸分解活性はＰＥＧ化八量体を注射したマウス
の血清において検出不可能であったが、ＰＥＧ化四量体注射のマウスの血清では
容易に検出された。第１の注射後に認められたＰＥＧ化八量体のクリアランス促
進（図１２）と組み合わせたこれらの所見から、酵素のＰＥＧ化前に四量体より
大きなウリカーゼ形態の全てを取り除くことの有用性が支持される。
尿酸レベルがＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼ治療後に劇的に減少したことを示した
。最後に、図１２は、ＰＢＣウリカーゼの異なるＰＥＧ修飾形態である、八量体
形態（分子量＝２８０ｋＤａ）では、広範にＰＥＧ化した場合でさえマウスで免
疫原性を示すことを示す。この特性は、一回の腹膜内注射から５日以内にＰＥＧ
修飾八量体のクリアランスの促進に反映されている。同一のマウスに、同用量の
同一のＰＥＧ−ウリカーゼ調製物を８日目及び１５日目に再注射した。第２およ
び第３の注射から２４時間後、尿酸分解活性はＰＥＧ化八量体を注射したマウス
の血清において検出不可能であったが、ＰＥＧ化四量体注射のマウスの血清では
容易に検出された。第１の注射後に認められたＰＥＧ化八量体のクリアランス促
進（図１２）と組み合わせたこれらの所見から、酵素のＰＥＧ化前に四量体より
大きなウリカーゼ形態の全てを取り除くことの有用性が支持される。
【００６４】 [実施例４] キャンディダ ユティリス由来のウリカーゼのＰＥＧ結合体 キャンディダ ユティリス由来のウリカーゼを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ｕ１８７８）またはＷｏｒｔｈｉｎｇ
ｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｒｅｅｈｏｌｄ
、ＮＪ、カタログ番号ＵＲＹＷ）のいずれかから得た。実施例１および実施例２
に記載のように、四量体形態を単離し、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、または３０ｋＤ
ａのＰＥＧを用いてＰＥＧ結合体を合成した（図１Ａ〜図１Ｂ）。図１Ａは、サ
ブユニットあたりのカップリングしたＰＥＧ鎖数の関数としてのキャンディダ
ユティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す。本発明者等の
データ（黒三角、●、□）を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９
； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ
．、１９８１； Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｔｓｕｊｉ， ｅ
ｔ ａｌ．、１９８５； Ｙａｓｕｄａ， ｅｔ ａｌ．、１９９０、およびＦ
ｕｊｉｔａ， ｅｔ ａｌ．、１９９１と比較する。大きな円内のデータポイン
トは、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９もしくは１９８１によっ
て非抗原性であり、またはＣｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１によって非免疫
反応性であると報告された結合体を示す。
（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ｕ１８７８）またはＷｏｒｔｈｉｎｇ
ｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｒｅｅｈｏｌｄ
、ＮＪ、カタログ番号ＵＲＹＷ）のいずれかから得た。実施例１および実施例２
に記載のように、四量体形態を単離し、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、または３０ｋＤ
ａのＰＥＧを用いてＰＥＧ結合体を合成した（図１Ａ〜図１Ｂ）。図１Ａは、サ
ブユニットあたりのカップリングしたＰＥＧ鎖数の関数としてのキャンディダ
ユティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す。本発明者等の
データ（黒三角、●、□）を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９
； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ
．、１９８１； Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｔｓｕｊｉ， ｅ
ｔ ａｌ．、１９８５； Ｙａｓｕｄａ， ｅｔ ａｌ．、１９９０、およびＦ
ｕｊｉｔａ， ｅｔ ａｌ．、１９９１と比較する。大きな円内のデータポイン
トは、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９もしくは１９８１によっ
て非抗原性であり、またはＣｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１によって非免疫
反応性であると報告された結合体を示す。
【００６５】 図１Ｂは、サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのキャン
ディダ ユティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す。本発
明者等のデータ（黒三角、●、□）を、図１Ａと同一の報告データと比較する。
大きな円内のデータポイントは、図１Ａと同一の意味である。
ディダ ユティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す。本発
明者等のデータ（黒三角、●、□）を、図１Ａと同一の報告データと比較する。
大きな円内のデータポイントは、図１Ａと同一の意味である。
【００６６】 図１Ａおよび図１Ｂに示すように、サブユニットあたり平均６鎖の５ｋＤａも
しくは３０ｋＤａのＰＥＧまたは平均９鎖の１０ｋＤａ ＰＥＧを有する結合体
は、非修飾酵素活性の少なくとも７５％を保持した。付着した３０ｋＤａ ＰＥ
Ｇの鎖数（サブユニットあたり５または６鎖まで）の増加に伴う比活性の明らか
な増加は、結合体と比較して非修飾酵素の相対的な不溶性または不安定性に影響
を与え得る。
しくは３０ｋＤａのＰＥＧまたは平均９鎖の１０ｋＤａ ＰＥＧを有する結合体
は、非修飾酵素活性の少なくとも７５％を保持した。付着した３０ｋＤａ ＰＥ
Ｇの鎖数（サブユニットあたり５または６鎖まで）の増加に伴う比活性の明らか
な増加は、結合体と比較して非修飾酵素の相対的な不溶性または不安定性に影響
を与え得る。
【００６７】 [実施例５] アスペルギルス フラバス由来のウリカーゼのＰＥＧ結合体 アスペルギルス フラバス由来のウリカーゼを、Ｓａｎｏｆｉ Ｗｉｎｔｈｒ
ｏｐ（Ｇｅｎｔｉｌｌｙ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。実施例２に記
載のように、種々の分子量のＰＥＧとの結合体を合成した（図４Ａ〜図４Ｂ）。
アスペルギルス フラバス由来の酵素とサブユニットあたり平均１２鎖までの５
ｋＤａ ＰＥＧまたは平均７鎖までの３０ｋＤａ ＰＥＧとのカップリングによ
って調製した結合体は、この真菌ウリカーゼの最初の比活性の少なくとも７５％
を保持した。
ｏｐ（Ｇｅｎｔｉｌｌｙ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。実施例２に記
載のように、種々の分子量のＰＥＧとの結合体を合成した（図４Ａ〜図４Ｂ）。
アスペルギルス フラバス由来の酵素とサブユニットあたり平均１２鎖までの５
ｋＤａ ＰＥＧまたは平均７鎖までの３０ｋＤａ ＰＥＧとのカップリングによ
って調製した結合体は、この真菌ウリカーゼの最初の比活性の少なくとも７５％
を保持した。
【００６８】 [実施例６] ダイズウリカーゼのＰＥＧ結合体 ダイズ根粒由来の組換えウリカーゼ（ノジュリン３５とも呼ばれる）を調製し
、Ｋａｈｎ ａｎｄ Ｔｉｐｔｏｎ（Ｋａｈｎ， Ｋ．、ｅｔ ａｌ．、１９９
７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：４７３１〜４７３８）に記載のように精
製し、Ｄｒ．Ｔｉｐｔｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、
Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＯ）から得た。実施例１および実施例２に記載のように、
四量体を単離し、種々の分子量のＰＥＧで結合体を調製した（図５Ａ〜図５Ｂ）
。キャンディダ ユティリス（図１Ａ）、ブタウリカーゼ（図２Ａ）、ブタ−ヒ
ヒキメラウリカーゼ（図３Ａ）、およびアスペルギルス フラバスからのウリカ
ーゼ（図４Ａ）に対して、ダイズ酵素は、最初の尿酸分解活性の少なくとも７５
％を保持する、サブユニットあたり約２鎖の５ｋＤａまたは３０ｋＤａ ＰＥＧ
とのカップリングを許容した。
、Ｋａｈｎ ａｎｄ Ｔｉｐｔｏｎ（Ｋａｈｎ， Ｋ．、ｅｔ ａｌ．、１９９
７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：４７３１〜４７３８）に記載のように精
製し、Ｄｒ．Ｔｉｐｔｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、
Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＯ）から得た。実施例１および実施例２に記載のように、
四量体を単離し、種々の分子量のＰＥＧで結合体を調製した（図５Ａ〜図５Ｂ）
。キャンディダ ユティリス（図１Ａ）、ブタウリカーゼ（図２Ａ）、ブタ−ヒ
ヒキメラウリカーゼ（図３Ａ）、およびアスペルギルス フラバスからのウリカ
ーゼ（図４Ａ）に対して、ダイズ酵素は、最初の尿酸分解活性の少なくとも７５
％を保持する、サブユニットあたり約２鎖の５ｋＤａまたは３０ｋＤａ ＰＥＧ
とのカップリングを許容した。
【００６９】 [実施例７] アースロバクター グロビフォルミス由来のウリカーゼのＰＥＧ結合体 アースロバクター グロビフォルミス由来のウリカーゼを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌ
ｄｒｉｃｈ（カタログ番号Ｕ７１２８）から得た。日本国特許第９−１５４５８
１を参照のこと。実施例１および実施例２に記載のように、四量体を単離し、５
ｋＤａおよび３０ｋＤａ ＰＥＧとの結合体を調製した。サブユニットあたり平
均３を超える鎖の５ｋＤａ ＰＥＧを有する結合体は、最初の比活性の６０％未
満を維持した一方、サブユニットあたり平均２鎖の３０ｋＤａ ＰＥＧを有する
結合体は、最初の比活性の少なくとも８５％を維持した。
ｄｒｉｃｈ（カタログ番号Ｕ７１２８）から得た。日本国特許第９−１５４５８
１を参照のこと。実施例１および実施例２に記載のように、四量体を単離し、５
ｋＤａおよび３０ｋＤａ ＰＥＧとの結合体を調製した。サブユニットあたり平
均３を超える鎖の５ｋＤａ ＰＥＧを有する結合体は、最初の比活性の６０％未
満を維持した一方、サブユニットあたり平均２鎖の３０ｋＤａ ＰＥＧを有する
結合体は、最初の比活性の少なくとも８５％を維持した。
【００７０】 [実施例８] アミノ短縮ブタおよびＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ結合体 実施例３に記載のように、アミノ末端の最初の６つのアミノ酸を欠失させた組
換えブタおよびＰＢＣウリカーゼを、標準的技術によってエシェリヒア コリに
発現させ、精製する。実施例１および実施例２に記載のように、アミノ短縮ウリ
カーゼのＰＥＧ結合体を合成して最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実
質的に非免疫原性結合体を作製する。
換えブタおよびＰＢＣウリカーゼを、標準的技術によってエシェリヒア コリに
発現させ、精製する。実施例１および実施例２に記載のように、アミノ短縮ウリ
カーゼのＰＥＧ結合体を合成して最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実
質的に非免疫原性結合体を作製する。
【００７１】 [実施例９] カルボキシル末端またはアミノ末端とカルボキシル末端の両末端が短縮したブ
タおよびＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ結合体 実施例３に記載のように、カルボキシル末端の最後の３つのアミノ酸を欠失さ
せた組換えブタおよびＰＢＣウリカーゼを、標準的技術によってエシェリヒア
コリに発現させ、精製する。このカルボキシ末端の欠失は、ペルオキシソーム標
的シグナルが取り除かれるので、非修飾酵素の溶解性が促進し得る。Ｍｉｕｒａ
， ｅｔ ａｌ．、１９９４を参照のこと。実施例１および実施例２に記載のよ
うに、カルボキシ短縮ウリカーゼのＰＥＧ結合体を合成して最初の比活性の少な
くとも７５％を保持する実質的に非免疫原性結合体を作製する。アミノ末端での
６つの残基およびカルボキシ末端での３つの残基が短縮された組換えＰＢＣウリ
カーゼ（ＰＢＣ−ＮＴ−ＣＴ）の配列を、図６に示す。実施例１、実施例２、お
よび実施例３に記載のように、このウリカーゼを発現させ、精製してＰＥＧ化し
て、最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実質的に非免疫原性の結合体を
作製する。
タおよびＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ結合体 実施例３に記載のように、カルボキシル末端の最後の３つのアミノ酸を欠失さ
せた組換えブタおよびＰＢＣウリカーゼを、標準的技術によってエシェリヒア
コリに発現させ、精製する。このカルボキシ末端の欠失は、ペルオキシソーム標
的シグナルが取り除かれるので、非修飾酵素の溶解性が促進し得る。Ｍｉｕｒａ
， ｅｔ ａｌ．、１９９４を参照のこと。実施例１および実施例２に記載のよ
うに、カルボキシ短縮ウリカーゼのＰＥＧ結合体を合成して最初の比活性の少な
くとも７５％を保持する実質的に非免疫原性結合体を作製する。アミノ末端での
６つの残基およびカルボキシ末端での３つの残基が短縮された組換えＰＢＣウリ
カーゼ（ＰＢＣ−ＮＴ−ＣＴ）の配列を、図６に示す。実施例１、実施例２、お
よび実施例３に記載のように、このウリカーゼを発現させ、精製してＰＥＧ化し
て、最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実質的に非免疫原性の結合体を
作製する。
【００７２】 [実施例１０] ＰＥＧ付着部位数を増加させたブタウリカーゼ変異体のＰＥＧ結合体 実施例３に記載のように、ＰＥＧ付着部位の潜在的な数を１つまたは複数のア
ルギニン残基のリシンとの置換によって増加させた組換えブタウリカーゼを調製
する。Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ， ＭＳ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７１８５〜７１８９を参照のこと
。残基２９１のアルギニンをリシンと置換し、残基３０１のトレオニンをセリン
と置換したこのような変異（ＰＫＳウリカーゼ）の１つのアミノ酸配列の例を、
図６に示す。実施例１および実施例２に記載のように、ＰＥＧを、このウリカー
ゼに結合して、組換えウリカーゼの最初の比活性の少なくとも７５％を保持する
実質的に非免疫原性の結合体を作成する。
ルギニン残基のリシンとの置換によって増加させた組換えブタウリカーゼを調製
する。Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ， ＭＳ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７１８５〜７１８９を参照のこと
。残基２９１のアルギニンをリシンと置換し、残基３０１のトレオニンをセリン
と置換したこのような変異（ＰＫＳウリカーゼ）の１つのアミノ酸配列の例を、
図６に示す。実施例１および実施例２に記載のように、ＰＥＧを、このウリカー
ゼに結合して、組換えウリカーゼの最初の比活性の少なくとも７５％を保持する
実質的に非免疫原性の結合体を作成する。
【００７３】 [実施例１１] 組換えヒヒウリカーゼ変異のＰＥＧ結合体 実施例３に記載のように、分子生物学の標準的方法を使用して、第９７位にア
ミノ酸置換（チロシンのヒスチジンへの置換）を有する組換えヒヒウリカーゼを
構築する（図６のヒヒ配列を参照のこと）。実施例１および実施例２に記載のよ
うに、組換えヒヒウリカーゼ変異体の四量体のＰＥＧ結合体を合成して、組換え
ウリカーゼの最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実質的に免疫原性が減
少した結合体を作製する。
ミノ酸置換（チロシンのヒスチジンへの置換）を有する組換えヒヒウリカーゼを
構築する（図６のヒヒ配列を参照のこと）。実施例１および実施例２に記載のよ
うに、組換えヒヒウリカーゼ変異体の四量体のＰＥＧ結合体を合成して、組換え
ウリカーゼの最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実質的に免疫原性が減
少した結合体を作製する。
【００７４】 [実施例１２] キャンディダ ユティリス、アスペルギルス フラバス、およびアースロバク
ター グロビフォルミス由来のＰＥＧ結合体の免疫原性 キャンディダ ユティリス、アスペルギルス フラバス、およびアースロバク
ター グロビフォルミス由来のウリカーゼを、それぞれ、実施例４、実施例５、
および実施例７に記載のように得る。実施例１および実施例２に記載のように、
５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または３０ｋＤａのＰＥＧを用いて、ＰＥ
Ｇ結合体を合成する。これらの結合体の免疫原性は、実質的に減少または消失す
る。
ター グロビフォルミス由来のＰＥＧ結合体の免疫原性 キャンディダ ユティリス、アスペルギルス フラバス、およびアースロバク
ター グロビフォルミス由来のウリカーゼを、それぞれ、実施例４、実施例５、
および実施例７に記載のように得る。実施例１および実施例２に記載のように、
５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または３０ｋＤａのＰＥＧを用いて、ＰＥ
Ｇ結合体を合成する。これらの結合体の免疫原性は、実質的に減少または消失す
る。
【図１Ａ】 サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのキャンディダ ユ
ティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
ティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図１Ｂ】 サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのキャンディダ ユ
ティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
ティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図２Ａ】 サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのブタ肝臓由来のＰ
ＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
ＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図２Ｂ】 サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのブタ肝臓由来のＰ
ＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
ＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図３Ａ】 サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのＰＥＧ化ブタ−ヒ
ヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
ヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図３Ｂ】 サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのＰＥＧ化ＰＢＣウ
リカーゼによる活性の保持率を示す図である。
リカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図４Ａ】 サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのアスペルギルス
フラバス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
フラバス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図４Ｂ】 サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのアスペルギルス
フラバス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
フラバス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図５Ａ】 サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのＰＥＧ化組換えダ
イズ根粒ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
イズ根粒ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図５Ｂ】 サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのＰＥＧ化組換えダ
イズ根粒ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
イズ根粒ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図６】 ブタおよびヒヒの配列を比較した、ブタ−ヒヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣウリ
カーゼ）、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方を短縮したＰＢＣウリカー
ゼ（ＰＢＣ−ＮＴ−ＣＴ）、および変異Ｒ２９１ＫおよびＴ３０１Ｓを含むブタ
ウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）の推定アミノ酸配列を示す図である。
カーゼ）、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方を短縮したＰＢＣウリカー
ゼ（ＰＢＣ−ＮＴ−ＣＴ）、および変異Ｒ２９１ＫおよびＴ３０１Ｓを含むブタ
ウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）の推定アミノ酸配列を示す図である。
【図７】 各々４回または５回のＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼの腹腔内注射から２４時間
後の、最初の注射から２４時間後と比較したマウス血清中のウリカーゼ活性を示
す図である。
後の、最初の注射から２４時間後と比較したマウス血清中のウリカーゼ活性を示
す図である。
【図８】 ウリカーゼ欠損マウスの血清中に注射されたＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼ活性
と血清および尿中の尿酸濃度との間の反比例関係を示す図である。
と血清および尿中の尿酸濃度との間の反比例関係を示す図である。
【図９】 ＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼで処理したウリカーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウ
スにおける尿濃縮欠損の重篤度の減少を示す図である。
スにおける尿濃縮欠損の重篤度の減少を示す図である。
【図１０】 ＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼで処理したウリカーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウ
スにおける腎性尿崩症の重篤度の減少を示す図である。
スにおける腎性尿崩症の重篤度の減少を示す図である。
【図１１】 ＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼで処理したウリカーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウ
スにおける、磁気共鳴顕微鏡で視覚化された、尿酸誘導性腎症の重篤度の減少を
示す図である。
スにおける、磁気共鳴顕微鏡で視覚化された、尿酸誘導性腎症の重篤度の減少を
示す図である。
【図１２】 四量体および八量体が共にサブユニットあたり１０ｋＤａの５〜６つのＰＥＧ
鎖に結合した場合、四量体と比較した、ＰＢＣウリカーゼ八量体を注射したＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの循環からのクリアランスの促進を示す図である。
鎖に結合した場合、四量体と比較した、ＰＢＣウリカーゼ八量体を注射したＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの循環からのクリアランスの促進を示す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月１０日（２０００．８．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 9/06 Ａ Ｃ１２Ｎ 9/06 11/08 Ａ 11/08 (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:67） //(Ｃ１２Ｎ 9/06 (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:67） Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 9/06 (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ａ６１Ｋ 37/50 Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ウィリアムズ，エル．，デビッド アメリカ合衆国 カリフォルニア 94536 フレモント アーレン コート 37709 (72)発明者 ハーシュフィールド，マイケル，エス． アメリカ合衆国 ノース カロライナ 27707 ダーハム ブリストル ロード 4019 (72)発明者 ケリー，スーザン，ジェイ． アメリカ合衆国 ノース カロライナ 27516 チャペル ヒル レアー コート 8104 (72)発明者 サイファー，マーク，ジー．，ピー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94070 サン カルロス ローヤル レーン 1114 (72)発明者 シャーマン，メリー，アール． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94070 サン カルロス ローヤル レーン 1114 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B033 NA01 NA23 NB34 NC02 ND06 NF04 NG09 NH10 4B050 CC03 CC05 DD04 DD07 GG03 KK14 LL01 4C076 AA24 BB11 BB13 BB15 BB16 BB21 CC17 CC41 EE23 EE59 4C084 AA07 BA42 BA44 CA04 CA05 CA19 CA20 CA21 CA33 CA59 DC23 MA13 MA56 MA66 NA06 NA14 ZA811 ZC192 ZC311
Claims (41)
- 【請求項１】 非結合体ウリカーゼの尿酸分解活性の少なくとも約７５％を
保持し、実質的に非免疫原性であるウリカーゼの結合体であって、前記ウリカー
ゼの各サブユニットが平均２〜１０鎖のＰＥＧに共有結合しているサブユニット
を含む精製ウリカーゼを含み、ＰＥＧの各分子が約５ｋＤａと１００ｋＤａとの
間の分子量である、結合体。 - 【請求項２】 前記ウリカーゼは哺乳動物ウリカーゼである、請求項１記載
の結合体。 - 【請求項３】 前記ウリカーゼはブタ肝臓ウリカーゼ、ウシ肝臓ウリカーゼ
、またはヒツジ肝臓ウリカーゼである、請求項２記載の結合体。 - 【請求項４】 前記ウリカーゼは組換え体である、請求項１記載の結合体。
- 【請求項５】 前記ウリカーゼはブタ肝臓ウリカーゼ、ウシ肝臓ウリカーゼ
、ヒツジ肝臓ウリカーゼ、またはヒヒ肝臓ウリカーゼの配列を実質的に有する、
請求項４記載の結合体。 - 【請求項６】 前記ウリカーゼはキメラである、請求項４記載の結合体。
- 【請求項７】 前記キメラウリカーゼは、ブタ肝臓ウリカーゼおよびヒヒ肝
臓ウリカーゼの一部を含む、請求項６記載の結合体。 - 【請求項８】 前記キメラウリカーゼはＰＢＣウリカーゼである、請求項７
記載の結合体。 - 【請求項９】 前記キメラウリカーゼはＰＫＳウリカーゼである、請求項７
記載の結合体。 - 【請求項１０】 前記ウリカーゼは、チロシン９７がヒスチジンで置換され
ているヒヒ肝臓ウリカーゼの配列を有する、請求項４記載の結合体。 - 【請求項１１】 前記ウリカーゼはアミノ末端およびカルボキシル末端を含
み、前記ウリカーゼは一方の末端または両方の末端が短縮されている、請求項４
記載の結合体。 - 【請求項１２】 前記ウリカーゼは真菌ウリカーゼまたは細菌ウリカーゼで
ある、請求項１記載の結合体。 - 【請求項１３】 前記真菌ウリカーゼまたは細菌ウリカーゼは、アスペルギ
ルス フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アースロバクター
グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）、
またはキャンディダ ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）から単離さ
れるか、前記ウリカーゼの１つの配列を実質的に有する組換え酵素である、請求
項１２記載の結合体。 - 【請求項１４】 前記ウリカーゼは無脊椎動物ウリカーゼである、請求項１
記載の結合体。 - 【請求項１５】 前記無脊椎動物ウリカーゼは、ドロソフィラ メラノガス
ター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）またはドロソフィラ
シュードオブスキュラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ
）から単離されるか、前記ウリカーゼの１つの配列を実質的に有する組換え酵素
である、請求項１４記載の結合体。 - 【請求項１６】 前記ウリカーゼは植物ウリカーゼである、請求項１記載の
結合体。 - 【請求項１７】 前記植物ウリカーゼはグリシン マックス（Ｇｌｙｃｉｎ
ｅ ｍａｘ）の根粒から単離されるか、前記ウリカーゼの配列を実質的に有する
組換え酵素である、請求項１６記載の結合体。 - 【請求項１８】 前記ＰＥＧは約１０ｋＤａと６０ｋＤａとの間の平均分子
量を有する、請求項１記載の結合体。 - 【請求項１９】 前記ＰＥＧは約２０ｋＤａと４０ｋＤａとの間の平均分子
量を有する、請求項１８記載の結合体。 - 【請求項２０】 前記ＰＥＧの平均共有結合鎖数は、ウリカーゼサブユニッ
トあたり３〜８鎖である、請求項１記載の結合体。 - 【請求項２１】 前記ＰＥＧの平均共有結合鎖数は、ウリカーゼサブユニッ
トあたり４〜６鎖である、請求項２０記載の結合体。 - 【請求項２２】 前記ウリカーゼは四量体である、請求項１記載の結合体。
- 【請求項２３】 前記ＰＥＧの鎖は、ウレタン結合、第二級アミン結合、お
よびアミド結合からなる群から選択される結合を介してウリカーゼと共有結合し
ている、請求項１記載の結合体。 - 【請求項２４】 前記ＰＥＧは直鎖である、請求項１記載の結合体。
- 【請求項２５】 前記ＰＥＧは分岐している、請求項１記載の結合体。
- 【請求項２６】 請求項１記載の結合体および薬学的に受容可能なキャリア
を含む、体液または組織中の尿酸レベル低下用の薬学的組成物。 - 【請求項２７】 前記組成物は凍結乾燥によって安定化され、再構成の際、
迅速に溶解して非経口投与に適切な溶液が得られる、請求項２６記載の薬学的組
成物。 - 【請求項２８】 哺乳動物の体液または組織中で上昇した尿酸レベルの低下
法であって、前記哺乳動物に有効な尿酸低下量のＰＥＧ−ウリカーゼを投与する
工程を含み、薬学的に受容可能なキャリア中に前記ＰＥＧ−ウリカーゼが各サブ
ユニットがＰＥＧの平均２〜１０鎖に共有結合している少なくとも２つのサブユ
ニットを含む精製ウリカーゼを含み、各ＰＥＧ分子は約５ｋＤａと１００ｋＤａ
との間の分子量を有する、方法。 - 【請求項２９】 前記哺乳動物はヒトである、請求項２８記載の方法。
- 【請求項３０】 前記投与工程は、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、および腹
腔内経路での注射またはエアゾール化処方物の吸入からなる群から選択される、
請求項２８の方法。 - 【請求項３１】 前記尿酸レベルの上昇は、痛風、痛風結節、腎不全、臓器
移植、および悪性疾患からなる群から選択される病状に関連する、請求項２８記
載の方法。 - 【請求項３２】 前記ＰＥＧは直鎖である、請求項２８記載の方法。
- 【請求項３３】 前記ＰＥＧは分岐している、請求項２８記載の方法。
- 【請求項３４】 ウリカーゼ溶液からのウリカーゼの四量体の単離法であっ
て、前記溶液は四量体ウリカーゼおよびウリカーゼ凝集体を含み、 約９と１０．５との間のｐＨで少なくとも１つの分離カラムに前記溶液を添加
する工程と、 前記カラムから単離された四量体ウリカーゼを含む１つまたは複数の画分を回
収し、前記１つまたは複数の画分はウリカーゼ凝集体を実質的に含まない工程を
含む、方法。 - 【請求項３５】 前記ウリカーゼの前記溶液をｐＨ１０．２の前記カラムに
添加する、請求項３４記載の方法。 - 【請求項３６】 前記分離は、イオン交換およびサイズ排除からなる群から
選択される性質に基づく、請求項３４記載の方法。 - 【請求項３７】 前記四量体の存在およびウリカーゼ凝集体の非存在からな
る群から選択される少なくとも１つの性質を同定するために前記画分を分析する
工程をさらに含む、請求項３４記載の方法。 - 【請求項３８】 前記分析工程は、クロマトグラフィー、遠心分離、光散乱
、および電気泳動からなる群から選択される少なくとも１つの分析を含む、請求
項３７記載の方法。 - 【請求項３９】 前記クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー
である、請求項３８記載の方法。 - 【請求項４０】 前記単離四量体ウリカーゼは、約１０％未満のウリカーゼ
凝集体を含む、請求項３４記載の方法。 - 【請求項４１】 請求項３４記載の方法によって作製された、単離四量体ウ
リカーゼ。
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