CZ2001317A3 - Konjugát urikasy, farmaceutický prostředek, použití a způsob izolace tetramerní urikasy - Google Patents

Konjugát urikasy, farmaceutický prostředek, použití a způsob izolace tetramerní urikasy Download PDF

Info

Publication number
CZ2001317A3
CZ2001317A3 CZ2001317A CZ2001317A CZ2001317A3 CZ 2001317 A3 CZ2001317 A3 CZ 2001317A3 CZ 2001317 A CZ2001317 A CZ 2001317A CZ 2001317 A CZ2001317 A CZ 2001317A CZ 2001317 A3 CZ2001317 A3 CZ 2001317A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
uricase
peg
conjugate
kda
tetrameric
Prior art date
Application number
CZ2001317A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303751B6 (cs
Inventor
L. David Williams
Michael S. Hershfield
Susan J. Kelly
Mark G. P. Saifer
Merry R. Sherman
Original Assignee
Mountain View Pharmaceuticals, Inc.
Duke University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mountain View Pharmaceuticals, Inc., Duke University filed Critical Mountain View Pharmaceuticals, Inc.
Publication of CZ2001317A3 publication Critical patent/CZ2001317A3/cs
Publication of CZ303751B6 publication Critical patent/CZ303751B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Část výzkumu popisovaného v této přihlášce byla provedena za podpory Grantu DK 48 529 od Národních Institutů Zdraví. Proto má vláda U S v tomto vynálezu určitá práva.
OBLAST TECHNIKY
Předložený vynález se týká chemické modifikace proteinů za účelem prodloužení jejich oběhových poločasů a zredukování jejich imunogennosti. Přesněji, vynález se týká konjugace polyethylenglykolů nebo polyethylenoxidů s urátoxidasami, která v podstatě eliminuje imunogennost urátoxidasy bez toho, aby ohrozila její urikolytickou aktivitu.
DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY
Tvrzení obsažená v této části netvoří podstatu přijetí předešlé techniky, ale spíše odrážejí vynálezcovy vlastní subjektivní poznámky a výklady stavu techniky v době, kdy byl vynález vytvořen. Tyto výklady mohou obsahovat osobní, doposud neuveřejněné, pohledy vynálezce, které samy nebyly součástí předešlé techniky.
Urátoxidasy (urikasy; E.C. 1.7.3.3.) jsou enzymy katalyzující oxidaci kyseliny močové na více rozpustný produkt allantoin, purinový metabolit, který je snadněji exkretován. Lidé neprodukují enzymaticky aktivní urikasu, což je výsledkem několika mutací v genu pro urikasu získaných v průběhu evoluce vyšších primátů. Wu, X, et. al., (1992) J. Mol. Evol. 34:78-84. Jako důsledek může u citlivých jedinců nadměrná koncentrace močové kyseliny v krvi (hyperurikemie) a v moči (hyperurikosurie) vést k bolestivé artritidě (dna), ošklivým sedimentům urátu (tofy) a k selhání ledvin. U některých postižených jedinců mají dosažitelné léky, jako je allopurinol (inhibitor syntézy kyseliny močové), léčbu limitující nepříznivé účinky nebo nezmírňují stav adekvátně. KR, et al., (1984) Am. J. Med. 76:47-56; Fam, AG, (1990) Bailliěre's Clin. Rheumatol. 4:177-192. Injekce urikasy může hyperurikemii a hyperurikosurii snížit alespoň dočasně. Protože je urikasa pro člověka cizí protein, dokonce již první injekce nemodifikovaného proteinu zAspergillus flavus způsobila anafylaktické reakce u několika procent léčených pacientů (Pui, C-H, et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816), a imunitní reakce limitují její funkčnost pro trvalé nebo občasné léčení. Donadio, D., et al., (1981) Nov. Presse Méd. 10:711-712; Leaustic, M, etal., (1983)Rev. Rhum. Mal. Osteoartic. 50:553-554.
Optimální provedení dosažitelné léčby hyperurikemie bylo zkoumáno po několik desetiletí. Kissel, P, et al., (1968) Nátuře 217:72-74. Podobně možnost, že by určitá skupina pacientů
e · • · • · • · · · • • · • · • ·
•
• · · · · • · • • ·
• · • • • ·
• · ♦ • · • · • »
s těžkou dnou mohla mít užitek z bezpečné a efektivní formy urikasy vhodné pro injekce, byla zkoumána po mnoho let. Davis, FF, et al., (1978) in GB Broun, et al., (Eds.) Enzyme Engineering, Vol. 4 (pp. 169-173) New York, Plenům Press; Nishimura, H, et al., (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, et al., (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, et al., (1981) Lancet 2(8241):281-283; Abuchovski, A, et al., (1981) J. Pharmacol. Exp. Ther. 219:352-354; Chen, RH-L, et al., (1981) Biochim. Biophys. Acta 660:293-298; Chua, CC, et al., (1988) Ann. Int. Med. 109:114-117; Greenberg, ML, et al., (1989) Anal. Biochem. 176:290-293. Urikasy pocházející ze zvířecích orgánů jsou téměř nerozpustné v rozpouštědlech, která jsou kompatibilní sbezpečným podáváním léku injekcí. US patent 3 616 231. Některé urikasy pocházející z rostlin nebo mikroorganismů jsou v lékařsky přijatelnějších rozpouštědlech rozpustnější. Nicméně, injekce s mikrobiálními enzymy rychle indukuje imunitní odpověď, která může vést k život ohrožující alergické reakci nebo k inaktivaci a/nebo ke zrychlenému odstranění urikasy z oběhu. Donadio, et al., (1981); Leaustic, et al., (1983). Enzymy založené na aminokyselinových sekvencích odvozených ze savčích urikas, včetně prasat a paviánů, nebo z hmyzu, jako např. Drosophila melanogaster nebo Drosophila pseudoobscura (Wallrath,LL, etal., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:5114-5127), nebyly vhodnými kandidáty pro klinické využití, vzhledem k problémům imunogennosti a nerozpustnosti při fyziologickém pH.
Kovalentní modifikace proteinů pomocí polyethylenglykolu nebo polyethylenoxidu (oba dále jen PEG) byly použity ke zvýšení poločasu proteinu a redukci imunogennosti. U S patenty
179 337, 4 766 106 a 4 847 325; Saifer, MGP, et al., (1994) Adv. Exp. Med Biol. 366:377-387. Vazba PEG o vysoké molekulové hmotnosti za produkce konjugátů s prodlouženým oběhovým poločasem a/nebo se sníženou imunogennosti, zatímco funkční aktivita zůstává zachována, bylo dříve prokázáno u jiného enzymu, a to superoxiddismutasy (Somack, R, et al., (1991) Free Rad. Res. Commun. 12-13:553-562; U S patenty 5 283 317 a
468 478) a pro další typy proteinů, např. cytokiny (Saifer, MGP, et al., (1997) Polym. Preprints 38:576-577;Sherman, MR, et al., (1997) in JM Harris, et al., (Eds.), Polyethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 155-169) Washington, DC: Američan Chemical Society). Konjugáty urikasy s jinými polymery než PEG byly také popsány. U S patent 4 460 683.
Téměř ve všech ohlášených pokusech PEGylovat urikasu (tj. PEG kovalentně navázat naurikasu), byl PEG připojen primárně na aminoskupiny, včetně aminokoncových zbytků a dostupných lysinových zbytků. V obvykle užívaných urikasach se celkový počet lysinů v každé ze čtyř identických podjednotek pohybuje mezi 25 (Aspergillus flavus (U S patent 5 382 518)) a 29 (prase (Wu, X, et al., (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:9412-9416)). Některé z lysinů jsou pro PEGylaci nativní formy enzymu nedostupné. Nejběžnější přístup ke snižování * · • · · · · · · · · · ··« · 9 · ··· ······· · · · · · · • · ···· ··· ··· · · 9 9 9 9 9 99 9 imunogennosti urikasy byl vázat ji na velký počet vláken PEG o nízké molekulové hmotnosti. To mělo vždy za následek vysoký pokles enzymatické aktivity výsledných konjugátů.
Předchozí výzkumníci užívali injekční urikasu ke katalýze konverze močové kyseliny naallantoin in vivo. Pui, et al., (1997). Toto je základ pro použití urikasy z plísní Aspergillus flavus (Uricozyme®) ve Francii a Itálii k zabránění nebo dočasnému odstranění hyperurikemie spojené s cytotoxickou terapií léčby hematologických zhoubných nádorů a k přechodnému snížení několika hyperurikemií u pacientů trpících dnou. Potaux, L, et al., (1975) Noův. Presse Méd. 4:1109-1112; Legoux, R, et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:8565-8570; US patenty 53 82 518 a 5 541 098. Vzhledem ke svému krátkému oběhovému poločasu, Uricozyme® vyžaduje denní injekční dávkování. Kromě toho není příliš vhodný pro dlouhodobé terapie vzhledem k jeho imunogennosti.
Jednotlivé vnitrožilní dávkování přípravku obsahujícího urikasu z Candida utilis vázanou s PEG o molekulové hmotnosti 5 kDa snížila urát v séru na nedetekovatelnou úroveň u pěti lidských jedinců, jejichž průměrná koncentrace urátu v séru před injekcí byla 6,2 mg/dl, což je v běžném rozmezí. Davis, et al., (1981). Jedincům byla o čtyři týdny později podána doplňková injekce, ale zpráva o jejich reakci nebyla publikována. Nebyly detekovány žádné protilátky proti urikase, což bylo sledováno u druhé (poslední) injekce pomocí relativně necitlivé gelové difusní zkoušky. Tento odkaz nehovoří o žádných výsledcích trvalé nebo krátce trvalé léčby lidských pacientů či pokusných zvířat.
Přípravek urikasy z Arthrobacter protoformiae vázané s 5 kDa PEG byl použit k dočasné regulaci hyperurikemie u jednoho pacienta s lymfomem, jehož koncentrace urátu v séru před injekcí byla 15 mg/dl. Chua, et al., (1988).Vzhledem ke kritickému stavu pacienta a krátkému trvání léčby (čtyři injekce během čtrnácti dnů) nebylo možné provést hodnocení dlouhodobé účinnosti nebo bezpečnosti konjugátu.
V této přihlášce se termín „imunogennost“ týká indukce imunitní odpovědi na injektovaný přípravek PEG-modifikované nebo nemodifikované urikasy (antigen), zatímco „antigennost“ se týká reakce antigenu sjiž existující protilátkou. Souhrnně, antigennost a imunogennost jsou nazývány jako „imunoreaktivita“. V předchozích studiích PEG-urikasy byla imunoreaktivita určována různými způsoby zahrnujícími: 1) reakci PEG-urikasy s předformovanou protilátkou in vítr o·, 2) měření indukované syntézy protilátek; a 3) zrychlené odstranění podílů po opakované injekci.
Předchozí pokusy eliminovat imunogennost urikas z různých zdrojů vázáním různých počtů vláken PEG prostřednictvím různých spojek měly omezený úspěch. PEG-urikasy poprvé objevili FF Davis a Y Inada a jejich kolegové. Davis, et al., (1978); U S patent 4 179 337; Nishimura, et al., (1979); japonské patenty 55-99189 a 62-55079. Konjugáty uveřejněné ······· · Φ φ 9 Φ Φ • Φ ΦΦΦΦ ···
ΦΦΦ Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦΦ v patentu ‘337 byly syntetizovány reakcí urikasy neurčeného původu s 2 000-násobným molekulovým přebytkem 750 Da PEG, indikujícím, že ke každé podjednotce urikasy byl pravděpodobně připojen velký počet molekul polymeru. V patentu ’337 je uvedeno vázání bud’ PEG nebo polypropylenglykolu o molekulové hmotnosti 500 až 20 000 Da, nejlépe asi 500 až 5 000 Da, pro poskytnutí aktivních, ve vodě rozpustných, neimunogenních konjugátů různých polypeptidových hormonů a enzymů zahrnujících oxidoreduktasy, ze kterých je urikasa jedním ze tří příkladů. Kromě toho patent ’337 zdůrazňuje vázání 10 až 100 polymerních vláken na molekulu enzymu za zachování alespoň 40 % enzymatické aktivity. Žádné výsledky testů nebyly uvedeny pro stupeň vazby PEG na dostupné aminoskupiny urikasy, pro zbytkové specifické urikolytické aktivity nebo imunoreaktivitu konjugátu.
Údaje ze 13-ti citací vztahujících se kPEGylaci urikasy jsou shrnuty v tabulce 1. Některé z těchto výsledků jsou také prezentovány graficky na obrázcích 1A až 2B. Sedm z těchto publikací popisuje podstatný úbytek urikolytické aktivity měřený in vitro způsobený navázáním různých počtů vláken PEG na urikasu z Candida utilis. Vázání velkého počtu vláken PEG o molekulové hmotnosti 5 kDa na urikasu z vepřových jater dávalo stejné výsledky jaké byly popsány jak v publikaci (Chen), tak i ve zprávě té samé skupiny ze sympózia. Chen, et al., (1981; Davis, et al., (1978).
Mezi studiemi shrnutými v tabulce 1 bylo v sedmi studiích uvedeno, že imunoreaktivita urikasy byla PEGylací snížena a v pěti studiích bylo uvedeno, že byla odstraněna. Ve třech z posledně zmíněných pěti studií bylo odstranění imunoreaktivity spojeno s velkým snížením urikolytické aktivity - na maximálně 15 %, 28 % nebo 45 % počáteční aktivity. Nishimura, etal., (1979) (15 % aktivity); Chen, et al., (1981) (28 % aktivity); Nishimura, et al., (1981) (45 % aktivity).Ve čtvrté studii byla uvedena vazba PEG na 61 % dostupných lysinových zbytků, ale zbytková specifická aktivita nebyla zjištěna. Abuchovski, et al., (1981). Nicméně výzkumný tým, jehož členy byly ti sami dva vědci a používali ty samé metody, uvedl jinde, že tento stupeň vazby zanechával reziduální aktivitu jen 23 až 28 %. Chen, et al., (1981). Publikace z roku 1981 (Abuchovski, et al. a Chen, et al.) uvádějí, že k podstatnému snížení imunogennosti urikasy musí být PEG vázán na přibližně 60 % dostupných lysinových zbytků (tab. 1). Pátá publikace, která uvádí eliminaci imunoreaktivity urikasy, neuveřejňuje stupeň vazby PEG, zbytkovou urikolytickou aktivitu nebo přirozenou vazbu PEG-protein. Veronese, FM, et al., (1997) in JM Harris, et al., (Eds.), Polyethylene glycol) Chemistry andBiologicalÁpplications, ACS Symposium Series 680 (pp. 182-192) Washington, DC: Američan Chemical Society.
Konjugace PEG s malými frakcemi lysinových zbytků v urikase snižuje ale neeliminuje její imunoreaktivitu u pokusných zvířat. Tsuji, J, et al., (1985) Int. J. Immunopharmacol. 7:725-730 (28 až 45 % vázaných aminoskupin); Yasuda, Y, et al., (1990) Chem. Pharm. Bull.
·; ι , :: .·: :
······» · «·» · · • · ····· A · ·«· · ·« ·· ···φ·
38:2053-2056 (38 % vázaných aminoskupin). Zbytkové urikolytické aktivity se u odpovídajících adičních sloučenin pohybovaly od <33 % (Tsuji, et al.) do 60 % (Yasuda et al.) jejich počátečních hodnot. Tsuji, et al., syntetizoval konjugáty PEG-urikasy sPEG o molekulové hmotnosti 5 kDa, 7,5 kDa a 10 kDa . Všechny výsledné konjugáty byly trochu imunogenní a antigenní, avšak projevující zřetelně snížené enzymatické aktivity (tab. 1; obr. 1A až 1B).
PEGylovaný přípravek urikasy z Candida utilis, který byl dvakrát bezpečně podán každému z pěti lidí, si udržel jen 11 % své počáteční aktivity. Davis, etal., (1981). O několik let později byla PEG-modifíkovaná urikasa z Arthrobacter protoformiae podána čtyřikrát jednomu pacientovi s pokročilým lymfomem a těžkou hyperurikemií. Chua, et al., (1988). Ačkoli nebyla měřena zbytková aktivita tohoto enzymového přípravku, Chua, et al. prokázal absenci antiurikasových protilátek v pacientově séru 26 dní po první injekci PEG-urikasy pomocí enzymové saturační analýzy (ELISA).
Jak je shrnuto v tabulce 1, dřívější studie PEGylované urikasy ukazují, že je katalytická aktivita zjevně zeslabena vázáním dostatku vláken PEG kvůli podstatnému snížení své imunoreaktivity. Kromě toho byly nej starší preparáty PEG-urikasy syntetizovány použitím PEG aktivovaného chloridem kyseliny kyanurové, derivátem triazinu (2,4,6-trichloro-l,3,5-triazin), pomocí kterého byly představeny nové antigenní determinanty a indukována tvorba protilátek u králíků. Tsuji, etal., (1985).
• · ··«··· ··9
9 9 9 9 9 · 99 9
9 9 9 9 9 9 99
9999999 · 9 · * 99 · · 9 9 ·t99
9 9 9 9 9 9 9 999 9
Tabulka 1: Charakteristiky PEG-urikas z předešlých studií
zdroj urikasy spojovací vazba molekulová hmotnost PEG (kDa) procento lysinů vázaných na PEG zbytková urikolytická aktivita (%) antigennost nebo imunogennost - - poznámky odkazy
neuvedeno azid 0,7 neuvedeno neuvedeno neuvedeno U S patent
(diol) 4 179 337
Candida triazin 5 Antigennost Nishimura a
utilis (chlorid v králičím séru kol., 1979
kyseliny (% z toho
kyanurové) % z„98“: z nemodifikova ného enzymu)
20 31 70%
26 21 6%
43 15 0
48 5 0
Candida peg2 2x5 22 87 86% Nishimura a
utilis triazin 25 70 49% kol., 1981
36 45 0
46 31 0
50 27 0
Candida triazin 5 71 11 Pět mužů sneslo Davis a
utilis dvě injekce během 30-ti kol., 1981
dnů
Candida triazin 5 49 neuvedeno Podobná Abuchovski
utilis podle imunogennost a kol.,1981
Chen, a k nativní
kol., 1981 51 neuvedeno urikase u ptáků. Imunogennost
negativní
vepřová játra triazin 5 37 60 Zrychlené Chen a
odstranění u kol., 1981
myší
47 45 Cí
58 28 Konstantní odstranění (poločas asi
8h)
Candida triazin 5 57 23 Konstantní
utilis odstranění (poločas asi
8h)
Candida triazin 5 35 neuvedeno PEG snižoval Savoca, KV,
utilis podle Chen imunogennost u βία/.,(1984)
a kol. ,1981 králíků Int. Arch.
70 neuvedeno Allergy. Appl. Immunol.
75:58-67
• 0 ······ ·· · ··· · · · · · · 0 0 0 0 0 0 4 4 94
0440440 · ♦ · · 00
0 4 · 0 · · '·0 • 00 0 · · «0 ·» · · ·
zdroj urikasy spojovací vazba molekulová hmotnost PEG (kDa) procento lysinu vázaných na PEG zbytková urikolytická aktivita (%) antigennost nebo imunogennost - - poznámky odkazy
Candida utilis triazin 5 neuvedeno neuvedeno PEG/urikasa byla podávána orálně kuřatům v liposomech (jednou) Nishida,Y, et al.,(\9M)J. Pharm. Pharmacol 36:354-355
Candida utilis triazin 5 7,5 10 44 45 28 37 41 45 9,4 7,8 32 11 3 7,3 Imunogennost snížena, ale pozitivní u králíků. (Protilát ky proti urikase nejsou; reagují sPEGsuperoxiddismu tasou.) Antigennost testovaná u morčecích protilátek byla snížena. Tsui a kol., 1985
Arthrobacter protoformiae neuvedeno 5 neuvedeno neuvedeno Žádné protilátky nebyly detekovány stanovením ELISA 26 dní po první ze čtyř injekcí PEGurikasy Chua a kol., 1988
Candida utilis peg2 triazin 2x5 10 12 15 21 38 90 89 80 70 60 neuvedeno neuvedeno neuvedeno neuvedeno Antigennost testovaná v králičím séru byla snížena o 75 %. Yasuda a kol., 1990
zdroj urikasy spojovací vazba molekulová hmotnost PEG (kDa) procento lysinů vázaných na PEG zbytková urikolytická aktivita (%) Antigennost nebo imunogennost - - poznámky odkazy
Candida utilis peg2 triazin 2x5 22 68 Jednotlivé injekce. PEG zvýšil poločas z asi lh na asi8h u myší. PEG blokoval odstranění u jater, sleziny a ledvin (24 hodinová studie) Fujita a kol., 1991
neuvedeno PEG PEG2 vazba neuvedena neuvedeno neuvedeno neuvedeno Imunogennost u myší byla snížena o 98 % (PEG) nebo 100 % (PEG2) Veronase a kol., 1997
uvedeno to samé jako pro PEG neuvedeno
V japonském patentu 3-148 298 (A. Sáno, et al.) jsou popsány modifikované proteiny, včetně urikasy, derivatizované PEG o molekulové hmotnosti 1 až 12 kDa, které prokazují sníženou antigennost a „vylepšené prodloužené“ působení a způsoby tvorby takových derivatizovaných peptidů. Nicméně zde nejsou žádné popisy vztahující se k počtům vláken, enzymovým stanovením, biologickým testům nebo významu „vylepšené prodloužené“. V japonském patentu 55-99 189 a 62-55 079 (oba Y. Inada) jsou popsány urikasové konjugáty připravené s PEG-triazinem nebo ózYPEG-triazinem (uvedeno jako PEG2 v tab. 1). Nishimura, et «/.,(1979 a 1981). U prvního typu konjugátu byla molekulová hmotnost PEG 2 kDa a 5 kDa, zatímco u druhého byl použit jen ten s hmotností 5 kDa. Nishimura, et «/.,(1979) uvedl zisk 15 % urikolytické aktivity po modifikaci 43 % dostupných lysinů lineárním PEG o molekulové hmotnosti 5 kDa, zatímco Nishimura, et al.,(1981) uvedl zisk 31 % nebo 45 % urikolytické aktivity po modifikaci 46 % nebo 36 % lysinů,resp., s PEG2.
• · ·*··*· ·· • · · · · · · · · ·····« tt · · φ « · · • · ·♦····« '9 · · ♦ · · · · * · ···
PODSTATA VYNÁLEZU
V předchozí studii je popsáno, že je-li dosaženo PEGylací významného snížení imunogennosti a/nebo antigennosti urikasy, je to vždy spojeno s podstatnou ztrátou urikolytické aktivity. Bezpečnost, výhoda a efektivnost biofarmak jsou nepříznivě ovlivňovány poklesy jejich účinnosti a výslednou potřebou zvyšovat podávanou dávku. Je zde tedy třeba bezpečné a efektivní alternativy určené pro snižování zvýšené hladiny močové kyseliny v tělních tekutinách, jako je krev a moč. Předkládaný vynález poskytuje v podstatě neimunogenní PEG-urikasu, u které je zachována všechna, nebo téměř všechna, urikolytická aktivita nemodifikovaného enzymu.
Jedním ztvárněním předloženého vynálezu je konjugát urátoxidasy (urikasy), která si zachovává asi 75 % urikolytické aktivity nekonjugované urikasy a má v podstatě sníženou imunogennost. Toto ztvárnění obsahuje purifíkovanou urikasu, v níž každá podjednotka může být kovalentně vázána v průměru na 2 až 10 vláken PEG, která mohou být lineární nebo rozvětvená a každá molekula PEG zde může mít molekulovou hmotnost mezi 5 až 100 kDa. Urikasa může být z tohoto hlediska vynálezu rekombinantní. Urikasa může být savčího původu a to je-li rekombinantní či nikoliv. Z jednoho hlediska tohoto ztvárnění může být urikasa z vepřových, hovězích nebo ovčích jater. Z jiného hlediska tohoto ztvárnění může být urikasa chimérická. Chimérická urikasa může obsahovat podíly urikasy z vepřových a/nebo paviáních jater. Například chimérická urikasa může být prase-pavián-chimérická urikasa (PBC urikasa) nebo vepřová urikasa obsahující mutace R291K a T301S (PKS urikasa) (viz sekvence na obr. 6 a výsledky fyziologických a imunologických studií na obr. 7 až 12). Alternativně může být urikasa z paviáních jater, kde je v urikase tyrosin 97 nahrazen histidinem, čímž může být specifická aktivita urikasy zvýšena alespoň o 60 %. Urikasa vynálezu, jakéhokoliv původu může též být ve formě, která je zkrácená, buď na N-konci nebo C-konci nebo na obou koncích. Rovněž může být urikasa plísňového či mikrobiálního původu. Z jednoho hlediska ztvárnění může být plísňová nebo mikrobiální urikasa přirozeně se vyskytující nebo ve formě rekombinantní urikasy zAspergillus flavus, Arthrobacter globiformis nebo Candida utilis. Alternativně může být urikasa z bezobratlých, jako je např. přirozeně se vyskytující nebo rekombinantní forma urikasy zDrosophila melanogaster nebo Drosophila pseudoobscura. Urikasa vynálezu může být též rostlinná, např. přirozeně se vyskytující nebo rekombinantní forma urikasy ze sojových kořenových hlíz (Glycine max). PEG může mít průměrnou molekulovou hmotnost mezi 5 kDa a 100 kDa; výhodnější je průměrná molekulová hmotnost mezilO kDa a 60 kDa; nejvýhodnější je pak průměrná molekulová hmotnost mezi 20 kDa a 40 kDa, jako je např. 30 kDa. Průměrný počet kovalentně vázaných vláken PEG smí být 2 až 10 vláken na urikasovou podjednotku;
•4 444444 4· « · 4 44 4 «44
4444444 « 4 4 · 4 « • · 4444 · · 4 ·«· · 4 * · » 4 · 444 výhodnější je průměrný počet kovalentně vázaných vláken 3 až 8 na podjednotku; nejvýhodnější je průměrný počet vláken PEG na podjednotku 4 až 6. Z jednoho hlediska tohoto ztvárnění může být urikasa tetramerní. Vlákna PEG smí být kovalentně vázána na urikasu přes vazby uretanu (esteru kyseliny uhličité), vazby sekundárních aminů a/nebo amidové vazby. Jestliže je urikasa v rekombinantní formě některé ze zde zmíněných urikas, může mít rekombinantní forma v podstatě sekvenci přirozeně se vyskytující formy.
Jiné ztvárnění předloženého vynálezu je farmaceutický prostředek pro snížení hladiny močové kyseliny v tělesných tekutinách, obsahující některé z PEG-urikasa konjugátů popsaných výše a farmaceuticky přijatelných nosičů. Prostředek může být stabilizován lyofilizací a též se může okamžitě po rekonstituci rozpustit, aby poskytl roztoky vhodné pro parenterální podávání.
Předložený vynález též poskytuje způsob snížení hladiny močové kyseliny v tělesných tekutinách a tkáních savce. Způsob zahrnuje podávání efektivního močovou kyselinu snižujícího množství PEG-urikasy. PEG-urikasa může být purifikovaná urikasa o dvou nebo více podjednotkách, v níž každá její podjednotka může být kovalentně vázána na průměrně 2 až 10 vláken lineárního nebo větveného PEG, kde každá molekula PEG může mít molekulovou hmotnost mezi 5 až 100 kDa u farmaceuticky přijatelných nosičů. Savec může být člověk. Postup podávání může být např. injekcí intravenózně, intradermálně, subkutánně, intramuskulárně nebo intraperitoneálními cestami nebo inhalací aerosolu přípravku. Zvýšená hladina kyseliny močové může být v krvi, moči a/nebo jiných tělních tekutinách a tkáních a může být spojena se dnou, tofy, selháním ledvin, transplantací orgánů nebo maligním onemocněním.
Jiná ztvárnění předloženého vynálezu jsou způsoby izolace tetramerní formy urikasy z roztoku obsahujícího četné formy urikasy a výsledek tohoto způsobu. Nejprve může roztok obsahovat tetramerní urikasu a urikasové agregáty. Způsob může obsahovat kroky: aplikování roztoku na alespoň jednu separační kolonu při pH mezi 9 až 10,5, jako je např. 10,2; odebrání frakcí eluátu a identifikování těch frakcí, které možná obsahují izolovanou tetramerní urikasu a vyznačují se tím, že jsou v podstatě prosté urikasových agregátů; a sloučení frakcí s izolovanou tetramerní urikasou. Separační kolona může být též založena na iontové výměně, dělení podle velikosti, nebo jiných efektivních vlastnostech. Způsob může též obsahovat analýzu frakcí ke stanovení přítomnosti tetramerní urikasy a/nebo absence urikasových agregátů. Taková analýza může např. zahrnovat kapalinovou chromatografii (HPLC), další chromatografícké metody, rozptyl světla, odstřeďování a/nebo elektroforézu. Z jednoho hlediska tohoto ztvárnění může purifikovaná tetramerní urikasa obsahovat méně než 10 % urikasových agregátů.
Předložený vynález poskytuje vylepšené konjugáty ve vodě rozpustných polymerů, pokud možno polyethylenglykolů nebo polyethylenoxidů, s urikasami. Vynález též poskytuje
4 ·*···· 4 4 ·
4 4 · ♦ · · 4 · 4
4·· 4 4 4 · · 4
44444Φ4 4 « 4 4 4 4 · 4 4»· · 4 4 •·4 4 4 4 44 4» 444 farmaceutické prostředky vylepšených konjugátů. Tyto konjugáty jsou v podstatě neimunogenní a uchovávají si alespoň 75 %, lépe 85 % a nejlépe 95 % nebo více urikolytické aktivity nemodifikovaného enzymu. Urikasy vhodné pro konjugaci s ve vodě rozpustnými polymery zahrnují přirozeně se vyskytující urátoxidasy izolované z bakterií, plísní a tkání rostlin a zvířat, obratlovců i bezobratlých, tak jako rekombinantní formy urikasy, včetně zmutovaných, hybridních a/nebo zkrácených enzymatických variant urikasy. Ve vodě rozpustné polymery vhodné pro použití v předloženém vynálezu obsahují lineární a rozvětvené polyethylenglykoly a polyethylenoxidy, všechny souhrnně nazývané PEG. Příklady rozvětvených PEG jsou předmětem U S patentu 5 643 575. Jeden upřednostňovaný příklad lineárního PEG je monomethoxyPEG o obecné struktuře CH3O-(CH2CH2O)nH, kde n je proměnlivé od 100 do 2300.
Jedna upřednostňovaná savčí urikasa je rekombinantní prase-pavián-chimérická urikasa, složená z částí sekvencí urikas z vepřových a paviáních jater, které byly poprvé určeny Wu, et al.,(\9%9}. Jeden příklad takové chimérické urikasy obsahuje prvních 225 aminokyselin sekvence vepřové urikasy (SEQ ID NO.l) a konečných 79 aminokyselin sekvence z paviání urikasy (SEQ ID NO.2) (prase-pavián urikasa nebo PBC urikasa, viz obr. 6). Jiný příklad takové chimérické urikasy obsahuje zbytky 7 až 225 sekvence vepřové urikasy (SEQ ID NO.l) a zbytky 226 až 301 sekvence z paviání urikasy (SEQ ID NO.2); to je ekvivalent k PBC urikase, která je zkrácená na N-konci i C-konci (PBC-NT-CT; viz obr. 6). Jiný příklad takové chimérické urikasy obsahuje prvních 228 aminokyselin sekvence vepřové urikasy (SEQ ID NO.l) a konečných 16 aminokyselin sekvence z paviání urikasy (SEQ ID NO.2). Pokud se poslední sekvence liší od sekvence vepřové urikasy jen ve dvou posicích, mající lysin (K) na místě argininu ve zbytku 291 a serin (S) na místě threoninu ve zbytku 301, je tento mutant uváděn jako prase-K-S nebo PKS urikasa. PKS, PBC a PBC-NT-CT urikasy mají každá jeden lysinový zbytek navíc a tudíž o jedno potenciální místo PEGylace navíc, než mají ostatní vepřové nebo paviání sekvence.
cDNA pro různé savčí urikasy, včetně PBC urikasy, PKS urikasy a rekombinantní prase-pavián urikasy byly klonovány a optimální podmínky byly stanoveny pro expresi v E. coli použitím standardních způsobů. P/zErlich, HA,(Ed.) (1989) PCR Technology. Principles and Application. New York: Stockton Press; Sambrook, J, et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Rekombinantní urikasy byly získány, purifikovány a jejich stabilita a aktivita byla stanovena použitím modifikace standardních stanovení. Viz Fridovich, 1,(1965) J. Biol. Chem. 240:2491-2494; Nishimura, etal., (1979) a příklad 1.
V jednom ztvárnění vynálezu může být urikasa konjugována prostřednictvím biologicky stabilní, netoxické, kovalentní vazby s relativně malým počtem vláken PEG. Takové vazby mohou zahrnovat uretanové vazby (esteru kyseliny uhličité), vazby sekundárních aminů a amidové vazby. Různé aktivované PEG vhodné pro takové konjugace jsou komerčně dostupné od Shearvater Polymers, Hunstville, AL.
Například uretanové vazby na urikasu mohou být tvořeny inkubováním urikasy v přítomnosti derivátů PEG a sukcinimidylesteru kyseliny uhličité (SC) nebo 4-nitrofenylesteru kyseliny uhličité (NPC). SC-PEG může být syntetizován použitím postupu popsaného v U S patentu 5 612 460, který je začleněný v příloze odkazů. NPC-PEG může být syntetizován reakcí PEG se 4-nitrofenylchloromravenčanem podle způsobů popsaných ve Veronese, FM, et al., (1985) Appl. Biochem. Biotechnol. 11:141-152, a v U S patentu 5 286 637, který je začleněný v příloze odkazů. Způsoby popsané v patentu ‘637 jsou přizpůsobeny PEG o vyšší molekulové hmotnosti, a to regulováním koncentrací reaktantů k udržení stejné stechiometrie. Alternativní způsob syntézy NPC-PEG je popsán v Bíittner, W, et al., East German Patent Specification DD 279 486 Al.
Amidové vazby na urikasu mohou být dosaženy užitím derivátu PEG s A-hydroxysukcinimidylesterem karboxylové kyseliny (Shearvater Polymers). Vazby sekundárních aminů mohou být tvořeny užitím 2,2,2-trifluoroethansulfonylPEG (tresylPEG, Shearvater Polymers) nebo reduktivní alkylací užitím PEG-aldehydu (Shearvater Polymers) a kyanoborohydridu sodného.
V konjugátech obsahujících PEG s molekulovými hmotnostmi mezi 5 kDa a 30 kDa se pohybuje maximální počet vláken PEG vázaných na podjednotku, zatímco si uchovávají alespoň 75 % urikolytické aktivity nemodifikovaného enzymu, průměrně od 2 vláken u sojové urikasy do více než 10-ti vláken u PBC urikasy (viz podmínky stanovení v příkladu 1 a výsledky na obr. 1A až 5B). Poslední stupeň PEGylace odpovídá přibližně jedné třetině veškerých aminoskupin. V jednom ztvárnění vynálezu je průměrný počet vláken PEG vázaných na podjednotku urikasy mezi 2 a 10. V upřednostňovaném ztvárnění je průměrný počet vláken PEG vázaných na podjednotku urikasy mezi 3 a 8. V upřednostňovanějším ztvárnění je průměrný počet vláken PEG kovalentně vázaných na podjednotku urikasy mezi 4 a 6. V jiném ztvárnění je molekulová hmotnost PEG užitého pro vazebnou reakci mezi 5 kDa a 100 kDa, lépe mezi 10 kDa a 60 kDa a nejlépe mezi 20 kDa a 40 kDa, jako je např. 30 kDa.
Vyskytuje se zde několik faktorů, které mohou ovlivňovat volbu molekulové hmotnosti a počtu vláken PEG pro vazbu na danou formu urikasy. Obecně může snížení nebo eliminace imunogennosti bez vážné ztráty urikolytické aktivity vyžadovat vazbu relativně více vláken PEG o nižší molekulové hmotnosti v porovnání s vazbou relativně méně vláken PEG o vyšší molekulové hmotnosti. Např. buď 6 vláken PEG o molekulové hmotnosti 20 kDa na podjednotku nebo 4 vlákna PEG o molekulové hmotnosti 30 kDa na podjednotku mohou být • ΦΦΦ • ♦ φ · φ · «« · · optimálně efektivní. Podobně každá odlišná forma urikasy může mít různé optimum s ohledem na obě velikosti vláken a jejich počet. Viz obr.lA až 5B.
PEG konjugace poskytovaly všechny testované urikasy, rozpustné a stabilní v pufrech při fyziologickém pH, bez přídavku analogického substrátu nebo inhibitoru, jako je 8-azaxanthin, který se používá jako stabilizátor plísňové urikasy (Uricozyme®), prodávané Sanofi Winthrop ve Francii a Itálii. Dva odlišné konjugáty PBC urikasy, jeden obsahující přibližně 6 vláken PEG o molekulové hmotnosti 10 kDa na podjednotku a jiný obsahující přibližně 2 vlákna PEG o molekulové hmotnosti 19 kDa, si uchovaly významnou aktivitu po inkubaci v myším séru po dobu více než jednoho měsíce při 37°C. Kromě toho mělo několik konjugátů z tohoto vynálezu oběhový poločas v myších větší než dva dny, na rozdíl od přibližně 8-hodinového nebo 24-hodinového poločasu dříve uvedených PEG-modifíkovaných savčích a mikrobiálních urikas. Chen, et al., (1981); Fuertges, F, et al., (1990) J. Contr. Release 11:139-148; Fujita, T, et al., (1991) J. Phamacobiodyn. 14:623-629. Díky delšímu poločasu jsou injektované proteinové léky efektivnější, což vede ke zlepšení pacientových komplikací. Prodloužený poločas též svědčí o produktu, který je tělem lépe tolerovaný.
Když byly PEG konjugáty PBC urikasy připraveny ztetramerní formy enzymu (čtyři podjednotky o molekulové hmotnosti 35 kDa), projevovaly skutečně sníženou imunogennost u myší (obr. 7), na rozdíl od mírné imunogennosti PEG konjugátů větších forem enzymu (např. oktamery podjednotek o molekulové hmotnosti 35 kDa; vzzobr. 12) a velmi vysoké imunogennosti nemodifikovaného enzymu. Opakované injekce s PEG-urikasou z předloženého vynálezu urikasa-defícientím myším eliminovaly jejich hyperurikemii na více než dva měsíce a chránily strukturu a funkci jejich ledvin proti poškození močovou kyselinou (obr. 8 až 11).
Injekce plně aktivních konjugátů PBC urikasy s PEG o molekulové hmotnosti 10 kDa (obr. 3A až 3B) snížily dramaticky hyperurikemii homozygotních, urikasa-deficientních myší (obr. 8). Hladiny močové kyseliny v moči byly též dramaticky sníženy u všech urikasa-deficientních myší léčených PEG-modifíkovanou PBC urikasou. Urikasa-deficientní myši dostaly sérii injekcí s přípravkem PEG-urikasy, který byl stejný s tím, jež byl použit k získání údajů v obr. 8. Tato léčba snížila vážnost moč-zahušťovacího defektu, jak bylo prokázáno měřeními močové osmolarity za normálních podmínek a po 12-ti hodinovém období nedostatku vody (obr. 9) a při jejich spotřebě vody a výstupu moči (obr. 10), porovnaný s odpovídajícími měřeními u neléčených, geneticky stejných myší. Bylo též prokázáno, že deset týdnů léčby homozygotní, urikasa-deficientní (uox -/-) „odepsané“ myši PEG-urikasou z tohoto vynálezu, počínající prvními deseti dny života, snížilo vážnost urátem indukovaného rozpadu struktury ledvin, jak je zviditelněno pomocí magnetické rezonanční mikroskopie (obr. 11). Mikroskopiální metody vzz Hedlund, LW, et al., (1991) Fund. Appl. Toxicol. 16:787-797;
···«·«· · ·«· · · • · * · · · « « « ·· · · · · ·· 9 9 · · 9
Johnson, GA, et al., (1992) in JC Gore, (Ed.), Reviews ofMagnetic Resonance in Medicine, Vol. 4 (pp. 187-219) New York: Pergamon Press.
Purifikované přípravky přirozeně se vyskytujících a rekombinantních urikas obvykle obsahují kromě tetramerní (140 kDa) formy ještě směs agregátů enzymu. Procento tetramerní formy v každém urikasovém přípravku se různě průměrně pohybuje od 20 % do 90 %. Navzdory důkazu, že PEGylované agregáty několika dalších proteinů jsou vysoce imunogenní (např. vzzMoore, Wv, et al., (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab. 51:691-697), předešlé studie PEG-urikasy nepopisují žádnou snahu limitovat obsah agregátů, naznačující, že potenciální imunogennost PEG-modifíkovaných agregátů nebyla uvažována. Na základě pozorování v tomto vynálezu se spíše zdá, že takovéto agregáty byly přítomny v enzymových preparátech používaných pro předchozí syntézy PEG-urikasy. Jejich přítomnost možná činí úlohu přípravy neimunogenních konjugátů mnohem složitější. Také se zdá, že se velké ztráty urikolytické aktivity u PEGylované urikasy, pozorované v předchozí práci, týkaly velkého počtu vláken o nízké molekulové hmotnosti PEG, které bylo vázáno. Na druhé straně, způsob purifikace a PEGylace urikasy popsaný na tomto místě připouští kovalentní připojení až 10-ti vláken PEG na podjednotku, zatímco si uchová více než 75 % urikolytické aktivity, alespoň pro určité urikasy, např. prase-pavián-chimérické urikasy a enzym zA. flavus (viz obr. 3 A a 4A).
V jiném upřednostňovaném ztvárnění mohou být všechny agregáty tetramerní formy enzymu v podstatě odděleny iontovýměnnou chromatografií nebo molekulovou vylučovací chromatografíí při pH mezi 9 a 10,5, spíše 10,2, před PEG konjugací výsledného v podstatě tetramerního přípravku urikasy. Molekulová hmotnost urikasy v každé frakci z preparativní kolony může být monitorována pomocí jakékoliv analytické techniky založené na rozdílech ve velikosti molekul, včetně např. HPLC, běžné molekulové vylučovací chromatografíe, odstřeďování, rozptylu světla, kapilární elektroforézy nebo gelové elektroforéze v nedenaturačním pufru. Pro tetramerní urikasu izolovanou použitím molekulové vylučovací chromatografíe mohou být frakce obsahující pouze formy enzymu (140 kDa) sbírány a použity pro konjugaci s PEG. Pro tetramerní urikasu izolovanou použitím iontovýměnné chromatografíe mohou být frakce z iontovýměnné kolony analyzovány s ohledem na velikost pro určení, která frakce obsahuje značné množství tetramerní formy bez detekovatelných agregátů. Z takto odebrané urikasy může být alespoň 90 % tetramerní formy; nežádoucí agregáty mohou představovat asi 10 %, 5 %, 2 % nebo méně z celkové izolované urikasy.
Výsledky předložené na tomto místě vyjadřují, že ač jsou rozsáhle PEGylované, jsou formy PBC urikasy větší než tetramer v myších vysoce imunogenní (obr. 12). Kromě toho u myší, které byly injektovány PEG konjugáty agregátů urikasy jednou, byla urikolytická aktivita u následujících injekcí buď s PEGylovaným tetramerem nebo PEGylovanými agregáty ·♦·· rychle odstraněna z oběhu. Narozdíl od toho mohly být konjugáty připravené z urikasy obsahující méně než 5 % agregátů reinjektovány mnohokrát bez jakéhokoliv urychlení míry jejich odstranění (obr. 7) a bez zjistitelné tvorby protilátek, což bylo měřeno citlivým enzym vážícím imunostanovením. Použití vysoce purifikované tetramerní urikasy dále odlišuje vylepšené konjugáty předloženého vynálezu od přípravků PEG-urikasy popsaných dříve. Na rozdíl přítomnost významného poměru agregátů (např. >10 %) v preparátech urikasy, užitých předchozími vynálezci, je mohla vést, ve snaze potlačit imunogennost, k vazbě velkého počtu vláken PEG. V důsledku toho byla enzymatická aktivita výsledných konjugátů v podstatě snížena. V jiném ztvárnění předložený vynález úmyslně sleduje PEGylovanou urikasu v netetramerní formě, jako jsou např. dimery urikasy, pokud si přípravky takové konjugované urikasy uchovávají alespoň asi 75 % urikolytické aktivity a jsou v podstatě neimunogenní.
V jiném ztvárnění předloženého vynálezu je stanovena mutovaná urikasa z paviáních jater, která má ve vztahu k nezmutovanému enzymu neočekávaně vyšší účinnost. Tato vylepšená urikasa z primátů byla připravena běžnými technikami přípravy rekombinantní DNA. Zvláště bylo neočekávané, že by substituce jednoho aminokyselinového zbytku (histidin místo tyrosinu na posici 97) v paviání urikase mohla mít za následek v podstatě vzrůst specifické enzymatické aktivity. Když byl tento zmutovaný protein exprimován v E. coli, bylo shledáno, že má alespoň o 60 % vyšší specifickou aktivitu než rekombinantní paviání enzym, ze kterého byl odvozen.
V jiném ztvárnění je specifická aktivita zvyšována a/nebo rozpustnost nePEGylovaného enzymu je zlepšena expresí zkrácených variant vepřových nebo prase-pavián-chimérických urikas, ze kterých alespoň prvních šest aminokyselin na N-konci a/nebo alespoň poslední tři aminokyseliny na C-konci jsou z exprimováných proteinů vyřazeny (viz obr. 6). Rekombinantní urikasy zkrácené na C-konci mohou mít zlepšenou rozpustnost před PEGylací zapříčiněnou vyjmutím peroxizomální cílové sekvence. FzzMiura, S, et al., (1994) Eur. J. Biochem.
223:141-146.
Konjugáty PEG-urikasy z předloženého vynálezu jsou užitečné pro snižování hladin močové kyseliny v tělních tekutinách a tkáních savců, hlavně lidí, a mohou tak být užitečné pro léčbu zvýšených hladin močové kyseliny spojených se stavy dny, s tofy, selháním ledvin, transplantací orgánů nebo maligním onemocněním. Konjugáty PEG-urikasy mohou být injektovány savcům, majícím nadměrné hladiny močové kyseliny, kteroukoli z mnoha cest, které zahrnují intravenózní, subkutánní, intradermální, intramuskulámí nebo intraperitoneální cesty. Alternativně mohou být aerosolovány a inhalovány. FzzPatton, JS, (1996) Adv. Drug Delivery Rev. 19:3-36 a US patent 5 458 135. Efektivní dávka PEG-urikasy z předloženého vynálezu bude záviset na hladině močové kyseliny a velikosti jedince. V jednom ztvárnění tohoto hlediska vynálezu je PEG-urikasa podávána ve farmaceuticky přijatelné pomocné látce nebo rozpouštědle • #
v množství pohybujícím se asi od 10 pg do l g. V předchozím ztvárnění je podávané množství mezi asi 100 pg a 500 mg. Raději je konjugovaná urikasa podávána v množství mezi asi 1 mg a 100 mg, jako je např. 5 mg, 20 mg nebo 50 mg. Hmotnosti udávané v těchto ztvárněních pro dávkování množství se týkají množství proteinu v konjugátu.
Farmaceutické přípravky obsahující PEG-urikasu mohou být připraveny běžnými technikami, jako je např. popsáno v Gennaro, AR (Ed.) (1990) Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18111 Edition Easton, PA: Mack Publishing Co. Vhodné pomocné látky pro přípravu injekčních roztoků zahrnují např. solný roztok pufirovaný fosfátovým pufrem, laktátový Ringerův roztok, vodu, polyoly a glycerol. Farmaceutické prostředky pro parenterální injekce obsahují farmaceuticky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné kapaliny, disperse, suspense nebo emulse právě tak, jako sterilní prášky pro rekonstituci do sterilních injekčních roztoků nebo dispersí právě před použitím. Tyto farmaceutické přípravky mohou obsahovat přídavné komponenty, jako jsou např. konzervační prostředky, solubilizátory, stabilizátory, zvlhčující činidla, emulgátory, pufry, antioxidanty a rozpouštědla.
PEG-urikasa může být též poskytována jako regulovaně se uvolňující prostředek pro implantaci do jedince ke kontinuální kontrole zvýšených hladin kyseliny močové v tělních tekutinách. Např. kyselina polymléčná, polyglykolová, regenerovaný kolagen, poly-L-lysin, alginát sodný, gelanová pryskyřice, chitosan, agarosa, multilamelární liposomy a mnoho dalších běžně uskladnitelných přípravků obsahujících biologicky rozložitelné a biodegradovatelné materiály, které mohou být přetvářeny do biologicky aktivních prostředků. Tyto materiály, jsou-li implantovány nebo injektovány, se postupně rozkládají a uvolňují aktivní materiál do okolní tkáně. Např. jeden způsob zapouzdřené PEG-urikasy tvoří způsob uvedený v U S patentu 5 653 974, který je začleněný v příloze odkazů. Použití biologicky rozložitelných, biodegradovatelných a ostatních uskladnitelných přípravků je v předloženém vynálezu úmyslně sledováno. Použití infusních pump a matrix-entrapment systémů pro podávání PEG-urikasy spadá též do rámce předloženého vynálezu. PEG-urikasa může být též výhodně obklopena micelami nebo liposomy. Liposomální zapouzdřující technologie jsou v technice velice dobře známy. Viz např. Lasic, D, et al., (Eds.) (1995) StealthLiposomes, Boča Raton, FL: CRC Press.
PEG-urikasa farmaceutických prostředků vynálezu bude snižovat potřebu hemodialýzy u pacientů s vysokým rizikem urátem indukovaného selhání ledvin, např. příjemců transplantovaných orgánů (viz Venkataseshan, VS, et al., (1990) Nephron 56:317-321) a pacientů s maligním onemocněním. U pacientů s rozsáhlou akumulací krystalického urátu (tofy) budou takovéto farmaceutické prostředky zlepšovat kvalitu života daleko rychleji než běžně dostupné léčby.
·<· · · • ·
Následující příklady, které nejsou v žádném případě sestrojeny, aby limitovaly vynález, ilustrují různá hlediska uvedená výše. Tyto příklady popisují PEG-urikasy připravené spojením aktivovaných (např. elektrofilních) derivátů PEG o různých velikostech a složení s přirozeně se vyskytujícími vepřovými, plísňovými nebo bakteriálními urikasami, nebo s rekombinantními sojovými, vepřovými nebo prase-pavián-chimérickými urikasami. Jsou zahrnuty výsledky aktivity, rozpustnosti, stability, farmakokinetiky, farmakodynamiky a imunologických studií. Údaje na obr. 8 až 11 zajišťují důkazy schopnosti PEG-modifikované PBC urikasy tohoto vynálezu odstraňovat hyperurikemii a hyperurikosurii a chránit ledvinovou strukturu a funkci u zvířecích modelů, u kterých se hyperurikemie a hyperurikosurie vyskytuje a způsobuje vážné poškození ledvin. Wu, X, et al., (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:742-746. Tyto příklady zajišťují návod ke každému běžnému úkonu v technice výroby v podstatě neimunogenních konjugátů urikasy, které si uchovávají alespoň 75 % urikolytické aktivity nemodifikovaného enzymu.
PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH
Obrázek 1A ukazuje retenci aktivity PEGylované urikasy zCandida utilis jako funkci počtu vláken PEG vázaných na podjednotku.
Obrázek 1B ukazuje retenci aktivity PEGylované urikasy z Candida utilis jako funkci celkové hmotnosti PEG vázaného na podjednotku.
Obrázek 2A ukazuje retenci aktivity PEGylované urikasy z vepřových jater jako funkci počtu vláken PEG vázaných na podjednotku.
Obrázek 2B ukazuje retenci aktivity PEGylované urikasy z vepřových jater jako funkci celkové hmotnosti PEG vázaného na podjednotku.
Obrázek 3 A ukazuje retenci aktivity PEGylované prase-pavián-chimérické urikasy (PBC) jako funkci počtu vláken PEG vázaných na podjednotku.
Obrázek 3B ukazuje retenci aktivity PEGylované urikasy PBC jako funkci celkové hmotnosti PEG vázaného na podjednotku.
Obrázek 4A ukazuje retenci aktivity PEGylované urikasy z Aspergillus flavus jako funkci počtu vláken PEG vázaných na podjednotku.
Obrázek 4B ukazuje retenci aktivity PEGylované urikasy z Aspergillus flavus jako funkci celkové hmotnosti PEG vázaného na podjednotku.
Obrázek 5 A ukazuje retenci aktivity PEGylované rekombinantní urikasy ze sojových kořenových hlíz jako funkci počtu vláken PEG vázaných na podjednotku.
• · • · • · · · · · · · · ··· · ♦ · ·« ·· ···
Obrázek 5B ukazuje retenci aktivity PEGylované rekombinantní urikasy ze sojových kořenových hlíz jako funkci celkové hmotnosti PEG vázaného na podjednotku.
Obrázek 6 ukazuje odvozené aminokyselinové sekvence prase-pavián-chimérické urikasy (PBC urikasy), PBC urikasy, která je zkrácená z N-konce i C-konce (PBC-NT-CT) a vepřové urikasy obsahující mutace R291K a T301S (PKS urikasy), porovnané s vepřovými a paviáními sekvencemi.
Obrázek 7 ukazuje aktivitu urikasy v myším séru 24 hodin po každé ze čtyř nebo pěti intraperitoneálních injekcí PEG-modifikované PBC urikasy, vztažené na hodnotu 24 hodin po první injekci.
Obrázek 8 ukazuje inverzní vztah mezi aktivitou injektované PEG-modifikované PBC urikasy v séru urikasa-deficientní myši a koncentrací močové kyseliny v séru a moči.
Obrázek 9 ukazuje snižující se vážnost moč-zahušťovacího defektu u urikasa-deficientní (uox -/-) myši, která byla léčena PEG-modifíkovanou PBC urikasou.
Obrázek 10 ukazuje snižující se vážnost nefrogenní diabetes insipidus u urikasa-deficientní {uox -/-) myši, která byla léčena PEG-modifíkovanou PBC urikasou.
Obrázek 11 ukazuje snižující se vážnost močovou kyselinou indukované nefropatie u urikasa-deficientní {uox -/-) myši, která byla léčena PEG-modifíkovanou PBC urikasou, jak je zviditelněno pomocí magnetické rezonanční mikroskopie.
Obrázek 12 ukazuje zrychlené odbourávání injektovaného oktameru PBC urikasy z oběhu BALB/c myši porovnané s tetramerem, když oba enzymy byly vázány s 5-ti až 6-ti vlákny PEG o molekulové hmotnosti 10 kDa na podjednotku.
PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU
Příklad 1: Purifikace tetramerní formy urikasy
Tetramemí forma urikasy (molekulová hmotnost asi 140 kDa) byla purifikována z roztoku urikasy z vepřových jater preparativní molekulovou vylučovací nebo iontovýměnnou chromatografií, následovanou analytickou molekulovou vylučovací chromatografií. Urikasa z vepřových jater byla získána od Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, katalogové č. U 2350 nebo U 3377; nebo Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.
Preparativní a analytická molekulová vylučovací chromatografíe byla provedena při pH 10 až 10,5, raději 10,2, v 10 mM pufru uhličitanu sodného obsahujícím 0,1 M NaCl na kolonách Superdex 200, které byly předtím kalibrovány pomocí proteinů o známé molekulové hmotnosti. Superdex byl získán od Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ. Může být použit jakýkoliv pufr, • · • ••9 • 9 ·· · · ♦ 9 · 99 9
9 9 999999
9999999 9 999 99
9 9 9 9 9 9 99
999 9 99 99 99999 který je schopný udržet požadované pH, a který je kompatibilní s chemickým složením, které je použito pro následné navázání PEG. Takové pufry jsou v technice dobře známy. Absorbance eluátu z preparativní kolony v ultrafialové oblasti byla monitorována při 280 nm a podíly eluátu obsahující urikasu, která odpovídá molekulové hmotnosti tetramerní formy, ale je prostá druhů o vyšší molekulové hmotnosti, byly sbírány a použity k syntéze v podstatě neimunogenní PEG-urikasy jak je popsáno v příkladu 2. Alternativně mohou být tetramerní formy urikasy izolovány použitím jiných molekulově-vylučovacích médií, jako je např. Superose 12 (Amersham Pharmacia) nebo jakékoliv jiné médium, které je kompatibilní se slabě alkalickými roztoky, a které má vhodnou velikost frakcionačního rozsahu. Taková média jsou lehce dostupná a jsou v technice dobře známá.
Iontovýměnná chromatografie byla provedena při pH 10 až 10,5, raději 10,2, na kolonách Mono Q (Amersham Pharmacia , Piscataway, NJ), které byly uvedeny v rovnováhu 0,1 M pufrem uhličitanu sodného. Může být použit jakýkoliv pufr, který je kompatibilní s chemickým složením, které je použito pro následnou vazbu PEG a je schopný udržet požadované pH při dostatečně nízké iontové síle, aby byla umožněna adsorpce urikasy na kolonu. Takové pufry jsou v technice dobře známy. Absorbance eluátu v ultrafialové oblasti byla monitorována při 280 nm během eluce urikasy z iontovýměnné pryskyřice při zvyšování se iontové síly aplikovaného roztoku pufru, např. při lineárním gradientu z 0 na 0,5 M NaCl v pufru uhličitanu sodného. Molekulová vylučovací HPLC byla pak užita k identifikaci frakcí eluátu obsahujících žádanou tetramerní formu urikasy bez detekovaných agregátů,která je určena k syntéze v podstatě neimunogenní PEG-urikasy. Alternativně může být tetramerní forma urikasy izolována použitím jiného iontovýměnného média jako je např.Q-Sepharose (Amersham Pharmacia) nebo jakéhokoliv jiného média, které je kompatibilní se slabě alkalickými roztoky. Taková média jsou lehce dostupná a jsou v technice dobře známá.
Urikasová aktivita byla stanovena použitím modifikace standardních způsobů. Viz např. Fridovich (1965); Nishimura, et al., (1979). Roztoky močové kyseliny byly denně čerstvě připravovány v 50 mM pufru boritanu sodného, pH 9,2, tak, aby finální koncentrace pro stanovení byly 6 až 150 μΜ. Urikasové přípravky byly ředěny v tomto boritanovém pufru obsahujícím albumin z hovězího séra (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, katalogové č. A-7030) tak, že finální koncentrace albuminu ve stanovení byla 0,1 mg/ml. Po smíchání různých roztoků enzymu se substrátem v komůrkách mikrotitračních destiček v mikrodestičkovém snímači byla rychlost úbytku močové kyseliny při 25 °C monitorována při 292 nm každé čtyři sekundy po dobu tří minut. Ze vzorků, ve kterých bylo spotřebováno mezi 10 % až 40 % substrátu během tří minut, bylo použito alespoň 20 hodnot pro výpočet maximální rychlosti úbytku absorbance za minutu. Jedna mezinárodní jednotka (IU) urikasové aktivity je definována jako množství • · ·· « * • · 9 ··· · · · «••••41 · ··« · · • · · · · · · · « •·· · ·· ·· ·· ··· enzymu, které spotřebuje jeden mikromol močové kyseliny za minutu; specifické aktivity jsou vyjádřeny jako IU/mg proteinu. Některé z údajů pro relativní urikasové aktivity na obr. 1A až 5B byly získány užitím 100 μΜ močové kyseliny při stanovení. Jiné výsledky reakční rychlosti při 100 μΜ močové kyseliny (Vioo) byly vypočteny z hodnot Michaelisovy konstanty (Km) a maximální reakční rychlosti (Vmax) pro odpovídající enzymové přípravky použitím vzorce:
V100 = 100 X Vmax / (Km + 100) kde Kmje vyjádřena v mikromolárních jednotkách.
Příklad 2: Vazba PEG na tetramerní vepřovou urikasu
K roztoku tetramerní urikasy v 0,1 M pufru uhličitanu sodného, pH 10,2; na každý mol urikasové podjednotky (molekulová hmotnost 35 kDa) bylo přidáno 10 až 200 molů aktivovaného derivátu monomethoxyPEG, např. 4-nitrofenylesterem kyseliny uhličité (NPC-PEG), o různých velikostech (5 kDa až 30 kDa). Tyto a ostatní vhodné aktivované PEG jsou dosažitelné u Shearwater Polymers. Instrukce pro navázání těchto PEG na proteiny jsou poskytnuty v katalogu Shearwater Polymers, na stránkách internetu www.swpolymers.com a v JM Harris, et al., (Eds.) (1997) Polyethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series 680, Washington, DC: Američan Chemical Society. Vazebná reakce probíhala při 0 až 8°C do té doby, než se stupeň vazby PEG přestal významně měnit s časem. Nezreagovaný PEG byl pak oddělen od reakčního produktu chromatograficky a/nebo ultrafiltrací.
Počet vláken vázaných na podjednotku urikasy byl stanoven přizpůsobením způsobů popsaných vKunitani, M, et al., (1991) J. Chromatogr. 588:125-137; Saifer, et al., (1997) a Sherman, et al., (1997). Ve stručnosti, alikvóty PEGylovaných reakčních směsí nebo frakcí z preparativních iontovýměnných nebo molekulově-vylučovacích kolon byly charakterizovány analytickou molekulovou vylučovací HPLC na TSK 5 000 PWxl koloně při pokojové teplotě v 10 mM pufru uhličitanu sodného, pH 10,2; obsahujícím 0,1 M NaCl. HPLC kolona byla získána od Toso Haas, Montgomeryville, PA. Proteiny a PEG byly monitorovány absorbancí v ultrafialové oblasti refraktometrickým detektorem. Množství proteinu vkonjugátu bylo vypočteno z absorbance v ultrafialové oblasti vztažené k absorbanci příslušného standardu nemodifikované urikasy. Množství PEG v konjugátu bylo pak vypočteno z plochy píku z refraktometrického detektoru, korigovaného na příspěvek proteinu detekovaný refraktometrickým detektorem, vztažené k ploše píku z refraktometrického detektoru odpovídajícího PEG standardu.
•9 9999
9 9 9 9 9 9 99
9999 9 9 9 9 9 9 99 · ··«····
9 9 99 9 9 9 999 9
Obrázek 2 ukazuje retenci aktivity PEGylované urikasy z vepřových jater jako funkci počtu vláken PEG vázaných na podjednotku. Údaje současných vynálezců (A,n)jsou srovnány stěmi z Chen, et al., (1981). Datové body s velkým kruhem označují neimunogenní konjugáty uvedené v Chen, et al., (1981). Jak je ukázáno na obrázku 2A, si konjugáty tetramerní vepřové urikasy, obsahující do 6 vláken 30 kDa PEG na podjednotku nebo do 7 vláken 5 kDa PEG na podjednotku, zachovaly alespoň 75 % aktivity nemodifikovaného enzymu. Patrný vzrůst specifické aktivity s narůstajícím počtem vláken PEG o molekulové hmotnosti 5 kDa nebo 30 kDa (do asi 4 vláken na podjednotku) může odrážet relativní nerozpustnost nebo nestabilitu nemodifikovaného enzymu v porovnání s konjugáty. Jak je ukázáno na obrázku 2B, obsahují konjugáty vepřové urikasy s průměrně více než 3 vlákny 30 kDa PEG na podjednotku větší hmotnost PEG, než bylo shledáno vhodným pro zamezení imunoreaktivity v Chen, et al., (1981).
Příklad 3: Vlastnosti PEG konjugátů tetramerní rekombinantní urikasy cDNA rekombinantní prase-pavián- chimérické (PBC) urikasy byla nakloňována do pET3d expresního vektoru (Novagen, Madison, WI) a sestrojený výsledný plasmid byl transformován do kmene Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Novagen) a vněm exprimován. Tyto postupy byly provedeny užitím postupů v technice molekulární biologie dobře známých. EzzErlich (1989); Sambrook, et al., (1989); Ausubel, F, et al., (Eds.), (1997) Short Protocols in Molecular Biology, New Short Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley& Sons.
Obrázek 6 ukazuje odvozenou aminokyselinovou sekvenci PBC urikasy (aminokyseliny 1 až 225 z SEQ ID NO:1 a aminokyseliny 226 až 304 z SEQ ID NO:2) porovnanou s vepřovými (SEQ ID NO:1) a paviáními (SEQ ED NO:2) sekvencemi. Rezidua v paviání sekvenci, která se liší od těch z vepřové sekvence jsou zobrazena tučným tiskem. Vepřové a paviánní sekvence byly poprvé stanoveny Wu, et al., (1989) a byly potvrzeny současnými vynálezci. SEQ ID NO:1 je identická s přírůstkovým číslem p 16 164 GenBanky, opomineme-li absenci počátečního methionylu v sekvenci GenBanky. SEQ ID NO:2 je identická s přírůstkovým číslem p 25 689 GenBanky, opomineme-li absenci počátečního methionylu a výměny threoninu za histidin u zbytku 153 v sekvenci GenBanky (zbytek 154 na obr. 6).
Tetramerní forma urikasy byla izolována a vázána sPEG o různých molekulových hmotnostech jak je popsáno v příkladech 1 a 2. Konjugáty připravené sPEG o molekulové hmotnosti 5 kDa, 10 kDa, 19 kDa nebo 30 kDa obsahovaly do 10-ti vláken na podjednotku. Ty konjugáty, které byly přiraveny s PEG o alespoň 10 kDa, si uchovaly více než 95 % počáteční specifické aktivity rekombinantní urikasy (obr. 3 A až 3B).
Μ *··· ·
r··· • · · · ·· · • · · · 9· • 9 · · · · ·· • » · · · · · ··
99· · ·· · Λ 9 9 9 99
Následující vlastnosti konjugátu tetramerní PBC urikasy s přibližně 6-ti vlákny 10 kDa PEG na podjednotku jsou ilustrovány na uvedených obrázcích: nedostatek imunogennosti (obr. 7) a účinnost u urikasa-deficientních myší při 1) odstraňování hyperurikemie a hyperurikosurie (obr. 8); 2) snižování vážnosti moč-zahušťovacího defektu (obr. 9), a
3) snižování vážnosti nefrogenní diabetes insipidus (obr. 10). Kromě toho snižuje tato PEG-urikasa vážnost poškození ledvin močovou kyselinou, jak je zviditelněno pomocí magnetické rezonanční mikroskopie (obr. 11).
Obrázek 7 ukazuje aktivitu PBC urikasy v myším séru 24 hodin po každé ze čtyř nebo pěti intraperitoneálních injekcí PEG-urikasy vztažené k hodnotě 24 hodin po první injekci. PEG konjugáty byly připraveny ze třech odlišných přípravků PBC urikasy použitím dvou odlišných technik pro aktivaci PEG. Jeden přípravek (·) byl testován u urikasa-deficientní (uox -/-) myši; další dva (Δ,·) byly testovány u normálních BALB/c myší. Nejimunoreaktivnější přípravek (Δ) byl připraven z purifikované PBC urikasy, obsahující neznámé množství urikasových agregátů vázaných průměrně na 7 vláken 5 kDa PEG na podjednotku, použitím derivátu PEG se sukcinimidylesterem kyseliny uhličité (SC-PEG). Zalipsky, U S patent 5 612 460, který je začleněný v příloze odkazů. Mírný imunoreaktivní přípravek () byl připraven navázáním přípravku PBC urikasy, obsahujícího 11 % agregátů, na průměrně 2 vlákna 19 kDa PEG na podjednotku, použitím derivátu PEG se 4-nitrofenylesterem kyseliny uhličité (NPC-PEG). Sherman, et al., (1997). Alespoň imunoreaktivní konjugát (·) byl připraven navázáním průměrně
6-ti vláken 10 kDa NPC-PEG na podjednotku, pro přípravu PBC urikasy obsahující <5 % agregované urikasy.
Obrázek 8 ukazuje inverzní vztah mezi koncentrací močové kyseliny v séru a moči a aktivitou injektované PEG-modifikované PBC urikasy v séru urikasa-deficientní (uox -/-) myši. Injekce v nulovém čase a po 72 hodinách obsahovaly 0,43 IU PBC urikasy konjugované s průměrně 6-ti vlákny PEG o 10 kDa na enzymovou podjednotku.
Obrázek 9 ukazuje, že léčba urikasa-deficientních myší PEG-modifíkovanou PBC urikasou snižovala vážnost moč-zahušťovacího defektu. Průměrné a standardní odchylky údajů pro osmolaritu moči jsou ukázány pro dvě myši, obsahující jednu kopii normálního myšího urikasového genu (uox -/-) a šest neléčených, homozygotních, urikasa-defícientních myší, které byly injektovány desetkrát mezi třetím a sedmdesátým druhým dnem života bud’ 95 nebo 190 mlU PEG-urikasy. Myši každého genetického profilu buď přijímaly vodu ad libitum (prostorné napáječky) nebo jim byla voda odepřena po 12 hodin (uzavřené napáječky), což předcházelo sbírání jejich moči.
Obrázek 10 ukazuje, že léčba urikasa-defícientních myší PEG-modifíkovanou PBC urikasou snižovala vážnost nefrogenní diabetes insipidus, charakterizované abnormálně vysokou »· ···· *♦ · ·· · 9 9····· ··· · · · 9 99
9999 9 9 9 99999
9 9 9 9 9 9 99
999 9 99 99 99999 spotřebou vody a abnormálně vysokým výstupem moči. Genetické profily myší a léčebný protokol byly stejné jako na obrázku 9. Průměrné a standardní odchylky údajů pro denní spotřebu moči (prostorné napáječky) a výstup moči (uzavřené napáječky) jsou ukázány pro tři skupiny šesti myší.
Obrázek 11 ukazuje, že léčba urikasa-defícientních myší PEG-modifikovanou PBC urikasou snižovala vážnost močovou kyselinou indukované nefropatie, jak je zviditelněno pomocí magnetické rezonanční mikroskopie. Genetické profily tří skupin myší a léčebný protokol byly stejné jako na obrázcích 9 a 10. Magnetická rezonanční mikroskopie byla provedena v Centru pro in vivo mikroskopii, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina.
Kromě výsledků shrnutých na obrázcích 8 až 11 bylo prokázáno, že se hladiny močové kyseliny v moči všech urikasa-defícientních myší dramaticky snižovaly po léčbě PEG-modifikovanou PBC urikasou. Konečně, obrázek 12 ukazuje, že na rozdíl od PEG-modifikované tetramerní formy PBC urikasy je oktamemí forma (molekulová hmotnost je 280 kDa), dokonce i když je rozsáhle PEGylovaná, u myší imunogenní. Tato vlastnost se odráží ve zrychleném odstraňování PEG-modifíkovaného oktameru během pěti dnů po jediné intraperitoneální injekci. Ty samé myši byly reinjektovány tou samou dávkou toho samého přípravku PEG-urikasy ve dnech 8 a 15. Dvacet čtyři hodin po druhé a třetí injekci byla v séru myší injektovaných PEGylovaným oktamerem urikolytická aktivita nedetekovatelná, ale byla lehce detekovatelná v séru myší injektovaných PEGylovaným tetramerem. Tyto závěry v kombinaci se zrychleným odstraňováním PEGylovaného oktameru, pozorovaným po první injekci, podporují prospěšnost odstranění všech forem urikasy,které jsou větší než tetramer, před PEGylací enzymu.
Příklad 4: PEG konjugace urikasy z Candida utilis
Urikasa z Candida utilis byla získána buď od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO; katalogové č. U 1878) nebo od Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ; katalogové č. URYW). Postup je popsán v příkladech 1 a 2, tetramerní forma byla izolována a PEG konjugáty byly syntetizovány s 5 kDa, 10 kDa nebo 30 kDa PEG (obr. 1A až IB). Obrázek 1A ukazuje retenci aktivity PEGylované urikasy z Candida utilis jako funkci počtu vláken PEG vázaných na podjednotku. Údaje současných vynálezců (Α,·,π) jsou srovnány stěmi zNishimura, et al., (1979); Nishimura, et al., (1981); Chen, et al., (1981); Davis, et al., (1981); Tsuji, et al., (1988); Yasuda, et al., (1990); Fujita, et al., (1991). Datové body s velkým kruhem označují konjugáty • · · · · ·
• · φ · φ φ φ • · φ · ·φ • ΦΦ φφφφφ • φ · φ φ φ· φφ φφ φφ ·ΦΦ uvedené jako neantigenní v Nishimura, et al., (1979 nebo 1981) nebo neimunoreaktivní v Chen, etal., (1981).
Obrázek 1B ukazuje retenci aktivity PEGylované urikasy z Candida utilis jako funkci celkové hmotnosti PEG vázaného na podjednotku. Údaje současných vynálezců (Α,·,π) jsou srovnány s těmi samými, které jsou odkazovány na obrázku 1.
Jak je ukázáno na obrázcích 1A a 1B si konjugáty s průměrně do 6-ti vláken 5 kDa nebo 30 kDa PEG nebo 9-ti vláken do 10 kDa PEG na podjednotku uchovaly alespoň 75 % aktivity nemodifikovaného enzymu. Zřejmý nárůst ve specifické aktivitě jako i rostoucího počtu připojených vláken 30 kDa PEG (do 5-ti nebo 6-ti vláken na podjednotku) může odrážet relativní nerozpustnost nebo nestabilitu nemodifikovaného enzymu srovnanou s konjugáty.
Příklad 5: PEG konjugace urikasy z Aspergillus flavus
Urikasa z Aspergillus flavus byla získána od Sanofi Winthrop (Gentilly Cédex, France). Postup, podle kterého byly konjugáty s PEG o různých molekulových hmotnostech syntetizovány (obr. 4A až 4B), je popsán v příkladu 2. Konjugáty připravované navázáním enzymu z A. flavus s průměrně do 12-ti vláken 5 kDa PEG nebo do 7 vláken 30 kDa na podjednotku si uchovaly alespoň 75 % počáteční specifické aktivity této plísňové urikasy.
Příklad 6: PEG konjugace sojové urikasy
Rekombinantní urikasa ze sojových kořenových hlíz (také zvaná nodulin 35) byla připravena a purifikována jak je popsáno vKahn, et al., (1997) Biochemistry 36:4731-4738) a jak bylo poskytnuto Dr.Tiptonem (University of Missouri, Columbia, MO). Postup je popsán v příkladech 1 a 2, tetramemí forma byla izolována a PEG konjugáty byly připraveny s PEG o různých molekulových hmotnostech (obr. 5A-5B). Na rozdíl od urikasy z Candida utilis (obr. 1A), vepřové urikasy (obr. 2A), prase-pavián chimérické urikasy (obr. 3A) a urikasy z Aspergillus flavus (obr. 4A) dovoloval sojový enzym navázání jen průměrně dvou vláken 5 kDa PEG nebo 30 kDa PEG na podjednotku a uchoval si alespoň 75 % počáteční urikolytické aktivity.
Příklad 7: PEG konjugace urikasy z Arthrobacter globiformis
Urikasa z Arthrobacter globiformis byla získána od Sigma-Aldrich (katalogové č. U 7128). Viz japonský patent 9-154581. Postup je popsán v příkladech 1 a 2, tetramerní forma byla φ · φ · • · φ ·· · φφ·· • ΦΦ »·· φφφ
ΦΦΦΦΦΦ· · ··· · · φ φ ΦΦΦ· φφφ φφφ φ ·φ · · · · ··· izolována a konjugáty s 5 kDa PEG a 30 kDa PEG byly připraveny. Zatímco si konjugáty s průměrně více než 3-mi vlákny 5 kDa PEG na podjednotku uchovaly méně než 60 % počáteční specifické aktivity, konjugáty s průměrně přibližně 2-mi vlákny 30 kDa PEG si uchovaly alespoň 85 % počáteční specifické aktivity.
Příklad 8: PEG konjugace amino-zkrácených vepřových a PBC urikas
Rekombinantní vepřová a PBC urikasa, ze kterých je prvních šest aminokyselin naN-konci vyřazeno, jsou exprimovány v E. coli a purifikovány zE. coli standardními technikami, jak je popsáno v příkladu 3. Postup je popsán v příkladech 1 a 2, PEG konjugáty amino-zkrácených urikas byly syntetizovány pro produkci v podstatě neimunogenních konjugátů, které si uchovaly alespoň 75 % počáteční specifické aktivity.
Příklad 9: PEG konjugace z vepřových a PBC urikas krácených na C-konci nebo na obou koncích (N-konci i C-konci)
Rekombinantní vepřová a PBC urikasa, ze kterých jsou poslední tři aminokyseliny na C-konci vyřazeny, jsou exprimovány vE. coli a purifikovány zE. coli standardními technikami, jak je popsáno v příkladu 3. Tato C-koncová delece může zvýšit rozpustnost nemodifikovaných enzymů, protože odstraňuje peroxisomální cílový signál. E/zMiura, et al., (1994). Postup je popsán v příkladech 1 a 2, PEG konjugáty karboxyl-zkrácených urikas jsou syntetizovány pro produkci v podstatě neimunogenních konjugátů, které si uchovaly alespoň 75 % počáteční specifické aktivity. Sekvence rekombinantní PBC urikasy zkrácené o šest zbytků na N-konci a tři zbytky na C-konci (PBC-NT-CT) je ukázána na obrázku 6. Tato urikasa je exprimována, purifikována a PEGylována jak je popsáno v příkladech 1, 2 a 3 pro produkci v podstatě neimunogenních konjugátů, které si uchovaly alespoň 75 % počáteční specifické aktivity.
Příklad 10: PEG konjugace mutantů vepřové urikasy obsahujících zvýšený počet vazebných míst pro PEG
Rekombinantní vepřové urikasy jsou připravovány jak je popsáno v příkladu 3, ve kterých je potenciální počet vazebných míst PEG zvýšen nahrazením jednoho nebo více argininových zbytků lysinem. Viz Hershfield, MS, et al., (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:7185-7189. Aminokyselinová sekvence jednoho příkladu takového mutantu (PKS-urikasa), ve kterém je
444 44 ·4444 i 4 444<44
4444444 4 Φ » Φ 4 · • · 4 · Φ ·· · · «44 Φ Φ· ·· «*·♦· argininový zbytek 291 nahrazen lysinem a threoninový zbytek 301 je nahrazen serinem, je ukázán na obrázku 6. Postup je popsán v příkladech 1 a 2, PEG je konjugován s touto urikasou pro produkci v podstatě neimunogenních konjugátů, které si uchovaly alespoň 75 % počáteční specifické aktivity rekombinantní urikasy.
Příklad 11: PEG konjugace rekombinantního mutantu paviání urikasy
Užitím standardních způsobů molekulární biologie, jako v příkladu 3, je rekombinantní paviání urikasa vytvořena aminokyselinovou substitucí (tyrosin nahrazen histidinem) na pozici 97 (viz paviání sekvence na obr. 6). Postup je popsán v příkladech 1 a 2, PEG konjugáty tetramerní formy mutantu rekombinantní paviání urikasy jsou syntetizovány pro produkci konjugátů se v podstatě sníženou imunogenností, které si uchovaly alespoň 75 % počáteční specifické aktivity rekombinantní urikasy.
Příklad 12: Imunogennost PEG konjugátů z Candida utilis, Aspergillus flavus a Arthrobacter globiformis
Urikasa z Candida utilis, Aspergillus flavus a Arthrobacter globiformis je získána jak je popsáno v příkladech 4, 5, resp. 7. Postup je popsán v příkladech 1 a 2, PEG konjugáty jsou syntetizovány s 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa nebo 30 kDa PEG. Imunogennost těchto konjugátů je v podstatě snížena nebo eliminována.
·* ····
SEZNAM SEKVENCÍ <110> Williams, L. David
Hershfield, Michael s. Kelly, Susan 3. Saifer, Mark G.P. Sherman, Merry R.
<120> KONJUGÁT URIKASY, FARMACEUTICKÝ PROSTŘEDEK, POUŽITÍ A ZPŮSOB IZOLACE TETRAMERNÍ URIKASY <130> MVIEW.001VPC <140>
<141>
<150> 09/130,392 <151> 1998 08-06 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 304 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 1
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu ser ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 2
a.
• • ·· ·· •
• · • • • • • • • ·
• • · • to • • • •
• • •toto • · • • · • • •
• • • · • · • • •
··· · 9 9 ·· • · ·
<211> 304 <212> PRT <213> Papio hamadryas <400> 2
Met Ala Asp Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile cys Glu
85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110 His Val
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys
115 120 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Leu Arg ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Lys Pro Glu val Lys Asp Arg cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr Hi s Gin cys Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
S:\DOCS\DCH\DCH-3008.DOC 072799

Claims (41)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Konjugát urikasy, obsahující purifíkovanou urikasu, vyznačující se tím, že obsahuje podjednotky, ze kterých je každá podjednotka urikasy kovalentně vázána na průměrně 2 až 10 vláken PEG, kde má každá molekula PEG molekulovou hmotnost mezi asi 5 kDa a 100 kDa, a kde si konjugát uchovává alespoň asi 75 % urikolytické aktivity nekonjugované urikasy a je v podstatě neimunogenní.
  2. 2. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že urikasa je savčí urikasa.
  3. 3. Konjugát podle nároku 2, vyznačující se tím, že urikasa je urikasa z vepřových jater, hovězích jater nebo ovčích jater.
  4. 4. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že urikasa je rekombinantní.
  5. 5. Konjugát podle nároku 4, vyznačující se tím, že urikasa má v podstatě sekvenci urikasy z vepřových, hovězích , ovčích nebo paviáních jater.
  6. 6. Konjugát podle nároku 4, vyznačující se tím, že urikasa je chimérická.
  7. 7. Konjugát podle nároku 6, vyznačující se tím, že chimérická urikasa obsahuje podíly urikasy z vepřových nebo paviáních jater.
  8. 8. Konjugát podle nároku 7, vyznačující se tím, že chimérická urikasa je PBC urikasa.
  9. 9. Konjugát podle nároku 7, vyznačující se tím, že chimérická urikasa je PKS urikasa.
  10. 10. Konjugát podle nároku 4, vyznačující se tím, že urikasa má v podstatě sekvenci urikasy z paviáních jater, ve které byl tyrosin 97 nahrazen histidinem.
  11. 11. Konjugát podle nároku 4, vyznačující se tím, že urikasa obsahuje N-konec a C-konec, a vyznačující se tím, že urikasa je zkrácená na jednom konci nebo na obou koncích.
  12. 12. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že urikasa je plísňová nebo mikrobiální urikasa.
  13. 13. Konjugát podle nároku 12, vyznačující se tím, že plísňová nebo mikrobiální urikasa je izolovaná z Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis nebo Candida utilis, nebo je to rekombinantní enzym mající v podstatě sekvenci jedné z těchto urikas.
  14. 14. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že urikasa je urikasa bezobratlých.
  15. 15. Konjugát podle nároku 14, vyznačující se tím, že urikasa bezobratlých je izolovaná z Drosophila melanogaster nebo Drosophila pseudoobscura, nebo je to rekombinantní enzym mající v podstatě sekvenci jedné z těchto urikas.
  16. 16. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že urikasa je rostlinná urikasa.
  17. 17. Konjugát podle nároku 16, vyznačující se tím, že rostlinná urikasa je izolovaná ze sojových kořenových hlíz (Glycine mctx) nebo je to rekombinantní enzym mající v podstatě sekvenci této urikasy.
    • 9 • · · · • · · • 9 ♦ 9· 9 • · · · · * · ·?
    ·····*· · · · · ·· • 9 9 · ♦ · · ··
    999 · 9 9 ·· ♦··
  18. 18. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že PEG má průměrnou molekulovou hmotnost mezi asi 10 kDa a 60 kDa.
  19. 19. Konjugát podle nároku 18, vyznačující se tím, že PEG má průměrnou molekulovou hmotnost mezi asi 20 kDa a 40 kDa.
  20. 20. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že průměrný počet kovalentně vázaných vláken PEG je 3 až 8 vláken na urikasovou podjednotku.
  21. 21. Konjugát podle nároku 20, vyznačující se tím, že průměrný počet kovalentně vázaných vláken PEG je 4 až 6 vláken na urikasovou podjednotku.
  22. 22. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že urikasa je tetramerní.
  23. 23. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že vlákna PEG jsou kovalentně vázána na urikasu přes vazby vybrané ze skupiny obsahující uretanové vazby, vazby sekundárních aminů a amidovéh vazby.
  24. 24. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že PEG je lineární.
  25. 25. Konjugát podle nároku 1, vyznačující se tím, že PEG je větvené.
  26. 26. Farmaceutický prostředek pro snížení hladin močové kyseliny v tělních tekutinách nebo tkáních, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
  27. 27. Farmaceutický prostředek podle nároku 26, vyznačující se tím, že je prostředek stabilizován lyofilizací a rozpouští se okamžitě po rozředění, aby poskytl roztoky vhodné pro parenterálni podávání.
  28. 28. Použití konjugátu urikasy, obsahujícího purifikovanou urikasu obsahující podjednotky, ze kterých je každá podjednotka urikasy kovalentně vázána v průměru na 2 až 10 vláken PEG, kde každá molekula PEG má molekulovou hmotnost mezi asi 5 kDa a 100 kDa, a kde si konjugát uchovává alespoň asi 75 % urikolytické aktivity nekonjugované urikasy a je v podstatě neimunogenní, k přípravě léčiva pro snížení zvýšených hladin močové kyseliny v tělních tekutinách nebo tkáních savců.
  29. 29. Použití konjugátu urikasy podle nároku 28, kde savec je člověk.
  30. 30. Použití konjugátu urikasy podle nároku 28, kde léčivo je podáváno savci intravenózně, intradermálně, subkutánně, intramuskulárně nebo intraperitoneálními injekcemi nebo inhalací aerosolu přípravku.
  31. 31. Použití konjugátu urikasy podle nároku 28, kde zvýšené hladiny močové kyseliny jsou spojeny se stavy vybranými ze skupiny, která zahrnuje dnu, tofy, selhání ledvin, transplantace orgánů nebo maligní onemocnění.
  32. 32. Použití konjugátu urikasy podle nároku 28, kde PEG je lineární.
  33. 33. Použití konjugátu urikasy podle nároku 28, kde PEG je větvené.
    ···««· · · ♦ · · · • · · · · · * · • «4 9 9 · · ···
  34. 34. Způsob izolace tetramerní formy urikasy z roztoku urikasy, vyznačujícího se tím, že obsahuje tetramerní urikasu a urikasové agregáty, obsahující kroky :
    aplikace roztoku na alespoň jednu separační kolonu při pH mezi asi 9 a 10,5; a odebrání z kolony jedné nebo více frakcí, které obsahují izolovanou tetramerní urikasu, kde jedna nebo více frakcí jsou v podstatě prosté od urikasových agregátů.
  35. 35. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že roztok urikasy je aplikován na kolonu při pH 10,2.
  36. 36. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že separace je založena na vlastnosti vybrané ze skupiny obsahující iontovou výměnu a molekulové vylučování.
  37. 37. Způsob podle nároku 34, dále se vyznačující tím, že obsahuje krok analýzy frakcí ke stanovení alespoň jedné vlastnosti vybrané ze skupiny obsahující přítomnost tetramerní urikasy a absenci urikasových agregátů.
  38. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že krok analýzy zahrnuje alespoň jednu analýzu vybranou ze skupiny, obsahující chromatografií, odstřeďování, rozptyl světla a elektroforézu.
  39. 39. Způsob podle nároku 38, vyznačující se tím, že chromatografie je vysoce účinná kapalinová chromatografie.
  40. 40. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že izolovaná tetramerní urikasa obsahuje méně než asi 10 % urikasových agregátů.
  41. 41. Izolovaná tetramerní urikasa vyrobená způsobem podle nároku 34.
CZ20010317A 1998-08-06 1999-08-02 Farmaceutický prostredek urikasy, lécivo, pouzití a zpusob prípravy CZ303751B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13039298A 1998-08-06 1998-08-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2001317A3 true CZ2001317A3 (cs) 2001-07-11
CZ303751B6 CZ303751B6 (cs) 2013-04-24

Family

ID=22444494

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20010317A CZ303751B6 (cs) 1998-08-06 1999-08-02 Farmaceutický prostredek urikasy, lécivo, pouzití a zpusob prípravy

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP1100542B1 (cs)
JP (3) JP5183836B2 (cs)
KR (2) KR100488848B1 (cs)
AU (1) AU770014B2 (cs)
BR (2) BRPI9912974B8 (cs)
CZ (1) CZ303751B6 (cs)
HU (2) HU226294B1 (cs)
IL (3) IL141220A0 (cs)
NZ (1) NZ509595A (cs)
PL (2) PL202799B1 (cs)
RU (3) RU2246318C2 (cs)
TW (1) TW570981B (cs)
WO (1) WO2000007629A2 (cs)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI9912974B8 (pt) * 1998-08-06 2021-05-25 Univ Duke conjugados de peg-urato oxidase e seu uso
CN1896231B (zh) 1998-08-06 2012-09-05 山景药品公司 分离四聚体尿酸氧化酶的方法
US6783965B1 (en) * 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
NZ509633A (en) 1998-08-06 2003-04-29 Univ Duke A recombinant chimeric PEG-uricase with a long circulatory life and reduced immunogenicity
AU2006203252B8 (en) * 2000-02-10 2009-06-18 Duke University Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
WO2001074400A1 (fr) 2000-04-03 2001-10-11 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Transporteurs et systeme de distribution de medicament les utilisant
DE60137635D1 (de) * 2000-06-28 2009-03-26 Merck & Co Inc Verwendung von allopurinol zur behandlung von bluthochdruck
DK1421175T3 (da) 2001-06-28 2009-03-23 Mountain View Pharmaceuticals Polymerstabiliserede proteinaser
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
EA010015B1 (ru) 2003-05-12 2008-06-30 Афимакс, Инк. Новый разделительный фрагмент (спейсер) для модифицированных полиэтиленгликолем соединений на основе пептидов
ES2395413T3 (es) 2003-05-12 2013-02-12 Affymax, Inc. Péptidos que se unen al receptor de eritropoyetina
ES2390082T5 (es) * 2004-06-30 2018-01-19 Nektar Therapeutics Conjugados de resto de Factor IX y polímeros
CA2604399A1 (en) * 2005-04-11 2006-10-19 Savient Pharmaceuticals, Inc. Variant forms of urate oxidase and use thereof
BRPI0612942A2 (pt) * 2005-04-11 2012-10-09 Savient Pharmaceuticals Inc forma variante de oxidase de urato e uso do mesmo
US9534013B2 (en) * 2006-04-12 2017-01-03 Horizon Pharma Rheumatology Llc Purification of proteins with cationic surfactant
US8148123B2 (en) 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
JP2008545627A (ja) 2005-05-09 2008-12-18 タツプ・フアーマシユーテイカル・プロダクツ・インコーポレイテツド 腎結石症を治療する方法
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
JP4890132B2 (ja) * 2006-07-20 2012-03-07 東洋紡績株式会社 ウリカーゼの比活性を向上させる方法、および比活性の向上した改変型ウリカーゼ
EP3482768A1 (en) 2009-06-25 2019-05-15 Horizon Pharma Rheumatology LLC Methods and kits for predicting infusion reaction risk and antibody-mediated loss of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricase therapy
NZ623294A (en) * 2010-03-02 2015-10-30 Protalix Ltd Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
WO2012033941A1 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Takeda Pharmaceuticals North America, Inc. Methods for concomitant treatment of theophylline and febuxostat
CN102634492B (zh) 2011-02-14 2015-06-10 重庆富进生物医药有限公司 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用
CA2869557A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 Indus Pharmaceuticals, Inc. Novel compositions of combinations of non-covalent dna binding agents and anti-cancer and/or anti-inflammatory agents and their use in disease treatment
MY190411A (en) * 2015-05-15 2022-04-21 Medimmune Llc Improved uricase sequences and methods of treatment
CN105412942B (zh) * 2015-12-23 2019-02-26 沈阳三生制药有限责任公司 聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂
CN112980808A (zh) * 2019-12-12 2021-06-18 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 尿酸酶、及其制备方法和用途
JP2023548496A (ja) 2020-11-03 2023-11-17 プロタリクス リミテッド 修飾ウリカーゼ及びその使用
EP4293117A1 (en) 2021-02-10 2023-12-20 Oriental Yeast Co., Ltd. Uricase activator and uric acid measurement reagent
CN114181917B (zh) * 2022-02-14 2022-06-03 潍坊华卓生物科技有限公司 一种改造尿酸酶、基因序列、制备方法及应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55135590A (en) * 1979-04-05 1980-10-22 Mihama Hisaharu Modified asparaginase and uricase and their preparation
JPS57192435A (en) * 1981-05-20 1982-11-26 Toyobo Co Ltd Modified polypeptide
JPS6255079A (ja) * 1986-04-23 1987-03-10 Mihama Hisaharu 修飾ウリカ−ゼ
US6783965B1 (en) * 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
BRPI9912974B8 (pt) * 1998-08-06 2021-05-25 Univ Duke conjugados de peg-urato oxidase e seu uso
NZ509633A (en) * 1998-08-06 2003-04-29 Univ Duke A recombinant chimeric PEG-uricase with a long circulatory life and reduced immunogenicity

Also Published As

Publication number Publication date
PL202799B1 (pl) 2009-07-31
IL183948A0 (en) 2007-10-31
KR20010072287A (ko) 2001-07-31
PL383331A1 (cs) 2002-01-28
RU2246318C2 (ru) 2005-02-20
EP1100542B1 (en) 2005-06-22
PL346224A1 (en) 2002-01-28
BRPI9912974B1 (pt) 2015-08-25
CZ303751B6 (cs) 2013-04-24
IL183948A (en) 2010-11-30
IL141220A0 (en) 2002-03-10
RU2349341C2 (ru) 2009-03-20
HU228916B1 (en) 2013-06-28
KR100488848B1 (ko) 2005-05-11
BRPI9917760B8 (pt) 2021-05-25
BRPI9912974B8 (pt) 2021-05-25
BR9912974A (pt) 2001-05-08
HU226294B1 (en) 2008-08-28
EP1100542A2 (en) 2001-05-23
NZ509595A (en) 2004-02-27
JP2013039139A (ja) 2013-02-28
RU2278680C2 (ru) 2006-06-27
JP2009254376A (ja) 2009-11-05
JP2002522399A (ja) 2002-07-23
PL220873B1 (pl) 2016-01-29
HUP0103003A2 (hu) 2001-11-28
HUP0103003A3 (en) 2006-04-28
BR9917760B1 (pt) 2014-11-25
JP5183836B2 (ja) 2013-04-17
JP5291235B2 (ja) 2013-09-18
RU2006107111A (ru) 2007-09-20
JP5290901B2 (ja) 2013-09-18
KR100614212B1 (ko) 2006-08-21
TW570981B (en) 2004-01-11
AU5251599A (en) 2000-02-28
WO2000007629A2 (en) 2000-02-17
IL141220A (en) 2007-09-20
AU770014B2 (en) 2004-02-12
KR20040088585A (ko) 2004-10-16
RU2004104953A (ru) 2005-07-27
WO2000007629A3 (en) 2000-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9885024B2 (en) PEG-urate oxidase conjugates and use thereof
CZ2001317A3 (cs) Konjugát urikasy, farmaceutický prostředek, použití a způsob izolace tetramerní urikasy
RU2443426C2 (ru) Конъюгаты уратоксидазы, фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты и способ получения вышеупомянутых конъюгатов
MXPA01001272A (en) Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
PL203492B1 (pl) Koniugat urykazy i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna