FI82266B - Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein. - Google Patents

Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein. Download PDF

Info

Publication number
FI82266B
FI82266B FI833681A FI833681A FI82266B FI 82266 B FI82266 B FI 82266B FI 833681 A FI833681 A FI 833681A FI 833681 A FI833681 A FI 833681A FI 82266 B FI82266 B FI 82266B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
mutein
gene
protein
interleukin
cysteine residue
Prior art date
Application number
FI833681A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI833681A (fi
FI82266C (fi
FI833681A0 (fi
Inventor
David F Mark
Shi-Da Yu Lu
Leo S Lin
Original Assignee
Cetus Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27030446&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI82266(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Cetus Corp filed Critical Cetus Corp
Publication of FI833681A0 publication Critical patent/FI833681A0/fi
Publication of FI833681A publication Critical patent/FI833681A/fi
Priority to FI893037A priority Critical patent/FI87233C/fi
Priority to FI901503A priority patent/FI105203B/fi
Publication of FI82266B publication Critical patent/FI82266B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI82266C publication Critical patent/FI82266C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/141—Interleukin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

1 82266
Menetelmä IL-2 -muteiinin valmistamiseksi Tämä keksintö kuuluu yhdistelmä-DNA -tekniikan alaan. Erityisesti se koskee mutationaalisesti muutettuja interleu- · kiini-2-proteiineja, jotka eroavat kanta-analogeistaan kys-5 teiinitähteen korvautumisella/deletoitumisella.
Biologisesti aktiiviset proteiinit, joita tuotetaan mikrobiaalisesti yhdistelmä-DNA (rDNA) -tekniikalla, saattavat sisältää kysteiinitähteitä, jotka eivät ole välttämättömiä niiden aktiivisuudelle, mutta ovat vapaita muodos-10 tamaan ei toivottuja intermolekulaarisia tai intramoleku-laarisia sidoksia. Eräs sellainen proteiini on mikrobiaalisesti tuotettu ihmisen beeta-interferoni (IFN-0). Valmistettaessa IFN-0:a rDNA-tekniikalla on havaittu, että kor-kelta IPN-6 -pitoisuuksia sisältävissä E.coli -uutteissa 15 muodostuu mikrobiaalisesti tuotetun IFN-6:n dimeerejä ja oligomeerejä. Tämä multimeerien muodostuminen tekee IFN-0:n puhdistamisen ja eristämisen hyvin työlääksi ja aikaavieväksi ja tekee välttämättömäksi puhdistus- ja eristysme-netelmien useat lisävaiheet kuten proteiinin pelkistämisen 20 puhdistuksen aikana ja uudelleenhapetuksen palauttamaan sen alkuperäisen rakenteen siten lisäten virheellisen di-sulfisidoksen muodostumismahdoilisuutta. Edelleen mikrobiaalisesti tuotetulla IFN-6:lla on myös huomattu olevan johdonmukaisesti alhainen spesifinen aktiivisuus johtuen 25 ehkä multimeerien tai umpimähkäisten intramolekulaaristen disulfidisiltojen muodostumisesta. Sen vuoksi olisi toivottavaa kyetä muuttamaan mikrobiaalisesti tuotettuja biologisesti aktiivisia proteiineja kuten INF-$:a tavalla, mi-3Q kä ei vaikuta haitallisesti niiden aktiivisuuteen, mutta vähentää tai eliminoi niiden kyvyn muodostaa intermolekulaarisia ristisidoksia tai intramolekulaarisia sidoksia, jotka aiheuttavat sen, että proteiini saa ei-toivotun ter-tiäärisen rakenteen (esim. rakenteen, joka vähentää pro-35 teiinin aktiivisuutta).
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tuottaa kohdennetulla mutageneesitekniikalla mutationaalisesti muutettuja biologisesti aktiivisia lL-2-proteiineja (sellaisia pro- 2 82266 teiineja kutsutaan "muteiineiksi", Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4th Ed, s. 381, Springer-Verlag (1976)), jotka säilyttävät kanta-analogiensa aktiivisuuden, mutta joilta puuttuu kyky muodostaa intermolekulaarisia sidoksia 5 tai ei~toivottuja intramolekulaarisia disulfidisidoksia. Tässä suhteessa Shepard, H.M., et ai., Nature (1981) 294: 563-565» kuvaavat IFN-6:n muteiinin, jossa sen aminohappojärjestyksen asemassa 141 kysteiini on korvattu tyrosiinil-la (alkuperäisessä ihmisen IFN-f5:ssa on kolme kysteiinil 10 asemissa 17, 31 ja 141, Gene (1980) 1Ό:11-15 ja Nature (1980) 285:542-547). Tämä muteiini valmistettiin hybridi-geenin bakteeriekspressiolla, hybridigeeni rakennettiin osittaisesta IFN-8-cDNA -kloonista, jossa oli G+A siirtymä IFN-6-geenin nukleotidissä 485. Muteiinilta puuttui alku— 15 peräisen IFN-8:n biologinen aktiivisuus, mikä johti tekijät päätelmään, että korvattu kysteiini oli välttämätön aktiivisuudelle.
Kohdennettu mutageneesitekniikka on hyvin tunnettua ja sitä ovat tarkastelleet Lather, R.F. ja Lecoq, J.P. teok- 20 sessa. Genetic Engineering Academic Press (1983) s. 31-50.
Smith, M. ja Gillam, S. teoksessa Genetic Engineering:
Principles and Methods, Plenum Press (1981) 3:1-32 ovat erityisesti tarkastelleet oligonukleotidi-kohdennettua muta- qeneesia.
25
Keksinnön tarkoitus saavutetaan patenttivaatimuksissa esitetyin keinoin.
Kuva 1 on diagrammi plasmidista pLWl, joka sisältää ihmisen interleukiini-2(IL-2) -geenin E^coli-trp-promoottorin kontrollissa.
30
Kuva 2 on faagikloonin M13-IL2 restriktiokartta.
Kuva 3 on plasmidin pLW46 restriktiokartta.
Kuvat 4 ja 5 esittävät vastaavasti kloonin pLW46 koo- daavan säikeen nukleotidijärjestyksen ja IL-2serl25:ksi nimitetyn IL-2-muteiinin vastaavan aminohappojärjestyksen.
35
Esillä oleva keksintö antaa biologisesti aktiivisten ;\ IL-2-proteiinien muteiineja, joissa sellaiset kysteiinitäh- teet, jotka eivät ole välttämättömiä biologiselle aktiivi- 3 82266 suudelle, on tarkoituksellisesti deletoitu tai korvattu muilla aminohapoilla eliminoimaan intermolekulaaristen ristisi-dosten ja virheellisen intramolekulaarisen disulfidisidoksen muodostumiskohdat; muteiineja koodaavia mutanttigeenejä ja 5 menetelmää muteiinien valmistamiseksi.
Ihmisen IL-2:ssä ilmoitetaan olevan kolme kysteiinitäh-aetta sijaiten proteiinin asemissa 53, 105 ja 125. Kuten IFN-$:n tapauksessa bakteerisoluista eristettäessä IL-2 on aggregatoituneessa oligomeerisessa muodossa ja on pelkis-tettävä pelkistimillä, jotta saadaan hyvä saanto bakteeri-uutteista. Lisäksi puhdistettu pelkistetty IL-2-proteiini on epästabiili ja on mielellään varastoinnin ajaksi uudelleen hapetettava oligomeeriseen epäaktiiviseen muotoon.
Kolmen kysteiinin läsnäolo merkitsee, että uudelleenhape-1 tuksen aikana proteiini voi umpiraähkäisesti muodostaa yhden kolmesta mahdollisesta intramolekulaarisesta disulfidi-siliasta vain yhden niistä ollessa oikea, alkuperäisestä molekyylistä löydettävä silta. Koska alkuperäisen IL-2-proteiinin disulfidirakennetta ei tunneta, on mahdollista käyttää esillä olevaa keksintöä aiheuttamaan mutaatioita IL-2-geenin kodoneissa 58, 105 ja 125 ja tunnistaa, mitkä kysteiinitähteet ovat välttämättömiä aktiivisuudelle ja sen vuoksi luultavimmin sisältyvät alkuperäisen disulfidi-25 sillan muodostumiseen. Samalla kertaa voidaan muuttaa sellainen kysteiinitähde, joka ei ole välttämätön aktiivisuudelle, jotta estetään virheellisten intramolekulaaristen disuifidisiltojen muodostuminen ja minimoidaan intermolekulaaristen disulfidisiltojen mahdollisuus deietoimalla tai 30 korvaamalla vapaa kysteiinitähde.
Oligonukleotidialukkeen koon määrää alukkeen stabiilin hybridisaation tarve sen geenin alueelle, jossa mutaatio aiheutetaan ja tällä hetkellä saatavissa olevien oligonuk-leotidien syntetisoimismenetelmien rajoitukset. Smith, M.
35 ja Giiiam, S., edellä, ovat kuvanneet oligonuk.leotidi-kob-dennetussa mutageneesissa käytettävien oligonukleotidien muotoilussa huomioonotettavia seikkoja (esim. kokonaiskoko, mutaatiokohdan sivulla olevien osien koko). Yleensä oligo- 4 82266 nukleotidin kokonaispituus on sellainen, millä optimoidaan stabiili, ainutlaatuinen hybridisaatio mutaatiokohdassa 5' ja 3' pidentymien mutaatiokohdasta ollessa riittävän kokoisia estämään DNA-polymeraasin eksonukleaasiaktiivisuudella 5 kerjäämässä mutaatiota. Esillä olevan keksinnön mukaisesti mutageneesissa käytetyt oiigcnukiect-dit sisältävät tavallisesti noin 12 - noin 24 emästä, mieluummin noin 14 -noin 20 emästä ja vielä mieluummin noin 15 - noin 18 emästä. Ne sisältävät tavallisesti ainakin noin kolme ^ muutetun tai puuttuvan kodonin 3'-emästä.
Oligonukleotidi-kohdennettua mutageneesia voidaan käyttää valmistettaessa mutantti-IL-2-geeni, joka koodaa muteiinin, jolla on IL-2-aktiivisuus, mutta kysteiini 125 on vaihdettu seriiniin 125. Suositeltavin oligonukleotidi-^ aluke, jota käytetään tämän mutantti-IL-2-geenin valmistuksessa, kun faagissa on geenin tuntosäie, on GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATC. Tässä oligonukleotidissä on C-*G muutos lL-2-geenin kodonin 125 kanssa parin muodostavan kolmikkokoodin keskimmäisessä emäksessä.
20
Saatu mutationaalinen heterodupleksi siirretään sitten sopivaan isäntäorganismiin tai soluun. Heterodupleksin kohdentuminen isännässä tuottaa jälkeläisiä kummastakin säi-keestä. Kohdentumisen jälkeen mutanttigeeni voidaan eristää mutanttisäikeen jälkeläisistä, liittää sopivaan eks-25 pressiovektoriin ja vektori on tapana transformoida sopivaan isäntäorganismiin tai soluun, joka on E.coli. Sopivimpia vektoreita ovat plasmidit pBR322, pCRl ja niiden muunnokset, synteettiset vektorit yms. On huomattava, että kun valittu isäntä transformoidaan vektorilla, sopivat pro-30 moottori-operaattori-jaksot siirretään myös, jotta saadaan aikaan muteiinin ekspressio. Esillä olevan keksinnön mukaisesti saatavat muteiinit voivat olla glykosyloituja tai glykosyloimattomia riippuen glykosylaation tapahtumisesta alkuperäisessä kantaproteiinissa tai muteiinin. tuottamiseen 35 käytettävässä isäntäorganismissa. Haluttaessa saatu glyko-syloimaton muteiini voidaan haluttaessa glykosyloida in vitro kemiallisilla, entsymaattisilla tai muilla sinänsä tunnetuilla menetelmillä.
5 82266
Seuraavat esimerkit on esitetty helpottamaan esillä olevan keksinnön ymmärtämistä . Esimerkit 1-6 kuvaavat IL-2 muteiinin valmistusta.
5 Esimerkki 1 1
Taniguchi, T., et ai., Nature (1983) voi 2fr, s. 305 et seq. kuvaavat ihmisen IL-2:ta koodaavan cDNA-kloonin nuk-leotidijärjestyksen, IL-2-cDNA -pankkien valmistusmenetelmiä ja IL-2:n seulontamenetelmiä.
10 cDNA-pankkeja, jotka oli rikastettu potentiaalisilla IL-2-cDNA -klooneilla, valmistettiin IL-2-rikastetuista mRNA-fraktioista, joita saatiin indusoiduista perifeerisistä verilymfosyyteistä (PBL) ja Jurkat-soluista tavanomaisin menetelmin. mRNA:n rikastuttaminen IL-2-viestillä teh-15 tiin fraktioimalla mRNA ja identifioimalla IL-2-mRNA -ak· tiivisuutta sisältävä fraktio injektoimalla fraktiot Xenopus laevis -varbaismunasoluihin ja tutkimalla varhais-munasolulysaatit IL-2-aktiivisuuden suhteen HT-2-soluissa (J. Watson, J EXP Med (1979) 150:1570-1519 ja S. Gillis 20 - - et ai., J Immun (1978) 120:2027-2032).
Esimerkki 2 IL-2-cDNA -kloonien seulonta ja identifiointi IL-2-cDNA -pankit seulottiin käyttäen pesäkehybridisaa-25 Zl o-menetelmää. Kukin mikrotiitterilevy kopioitiin kak- soisnitroselluloosasuodatinpapereille (S ( S tyyppi BA-85) ja pesäkkeiden annettiin kasvaa 37°C:ssa H*-l6 h L-agaril-la, joka sisälsi 50 ug/ml ampisilliiniä. Pesäkkeet hajotettiin ja DNA kiinnitettiin suodattimeen käsittelemällä 30 järjestyksessä 5 min 500 mM NaOHrlla, 1,5 M NaClrlla, pesemällä kahdesti 5 min kummallakin kerralla 5 x standardi sitraattiliuoksella (SSC). Suodattimet kuivattiin ilmassa ja pidettiin 80°C:ssa 2 h. Kaksoissuodattimet esihybridi-soitiin ^2°C:ssa 6-8 h 10 ml:lla_per suodatin DNA-hybridi-35 saatiopuskuria (50 % formamidi, 5 x SSC, pH 7,0, 5 x Den- hardtin liuos, (polyvinyylipyrrolidiini, plus fikoli ja härän seerumin albumiini; 1 x = 0,2 % kutakin), 50 mM nat-riumfosfaattipuskuri pH:ssa 7,0, 0,2 I SPS, 20 μΐ/αΐ Poly 6 82266 U:ta ja 50 ug/ml denaturoitua lohen siemennesteen DNA:ta).
3 2 P:llä leimattu 20 nukleotidin jakson omaava oligonuk-leotidikoetin valmistettiin perustuen Toniguchi, T:n, et ai:in, edellä, selvittämään lL-2-geenin järjestyksen. Koet-5 timen nukleotidijärjestys oli GTGGCCTTCTTGGGCATGTA.
Näytteet hybridisoitiin 42°C:ssa 2H-36 h 5 ml:lla/suo- , . . . 3? datm DNA-hybridisaatiopuskuna, joka sisälsi P-cDNA-koettimen. Suodattimet pestiin kahdesti 30 min kummallakin kerralla 50°C:ssa 2 x SSC:llä, 0,1 % SDS, sen jälkeen ^ pestiin kahdesti 1 x SSC:llä ja 0,1 % SDSrllä 50°C:ssa 90 min, kuivattiin ilmassa ja autoradiografioitiin -70°C:ssa 2-3 päivää. Positiiviset pesäkkeet identifioitiin ja seulottiin uudestaan koettimella. Täyspitkät kloonit identifioitiin ja varmistettiin kartoittamalla restriktioentsyy-15 meillä ja vertaamalla Toniguchi, T:n, et al:in, edellä, selvittämään IL-2-cDNA -kloonin jaksoon.
Esimerkki 3 IL-2-geenin kloonaus M13 vektoriin 2Q IL-2-geeni kloonattiin M13 mp 9 .'ään kuten on kuvattu esimerkissä 1 käyttäen plasmidia pLWl (kuva 12), joka sisälsi IL-2-geenin E.coli-trp-promoottorin kontrollissa. pLWi-näyte tallennettiin laitokseen American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 25 20852, USA, *1. päivänä elokuuta 1983 ja sille on annettu ATCC numero 39,^05. Erään kloonin (nimetty M13 - IL2:ksi) sisältämän IL-2-insertin restriktiokartta esitetään kuvassa 13. Kloonista M13 - IL2 valmistettiin yksisäikeinen faagi-DNA toimimaan templaattina oligonukleotidi-kohdenne-30 tussa mutageneesissa.
Esimerkki 4 ,
Oligonukleotidi-kohdennettu mutageneesi
Kuten on osoitettu aikaisemmin IL-2 sisältää kysteiini- tähteet aminohappoasemissa 58, 105 ja 125. Perustuen näi-* 35 den kolmen kysteiinitähteen kodonit sisältävän IL-2-geenin • osien nukleotidijärjestyksiin muotoiltiin ja syntetisoitiin kolme oligonukleotidialuketta *mutatoimaan näiden tähteiden kodonit seriinin kodoneiksi. Näillä nukleotideillä 7 82266 oli seuraäva järjestys.
CTTCTAGAGACTGCAGATOTTTC (DM 27) muuttamaan kys-58, CATCAGCATACTCAGACATGAATG (DM 28) muuttamaan kys-105 ja GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC (DM 29) muuttamaan kys-125.
5 Neljäkymmentä pikomoolia kutakin oligonukleotidiä kina- soitiin erikseen seoksessa, jossa oli 0,1 mM ATP, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT ja 9 yksikköä T^ kinaasia, 50 ylrssa 37°C:ssa 1 h. Kukin kinasoiduista alukkeista (10 pmoolia) hybridisoitiin 2,6 pgraan SS MI3-10 IL-2-DNA:ta 15 ylrssa seosta, joka sisälsi 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9, 20 mM MgCl2 ja 20 mM 8-merkapto-
etanolia, kuumentamalla 67°C:ssa 5 min ja i42°C:ssa 25 min. Lämpökäsitellyt seokset jäähdytettiin jäillä ja pantiin sen jälkeen viimeiseen kolonniin, jossa oli 25 pl reaktio-^ seosta, joka sisälsi 0,5 mMrsena kutakin dNTPrtä, 17 mM
Tris-Hcl, pH 7,9, 17 mM MgCl2, 83 mM NaCl, 17 mM Anerkap-toetanolia, 5 yksikköä DNA-polymeraasi I Klenow-fragmenttia, 0,5 mM ATP ja 2 yksikköä T^-DNA-ligaasia, inkuboitiin 37°G;ssa 5 h. Reaktiot lopetettiin kuumentamalla 80°C:seen 20 ja reaktioseokset transformoitiin sopiviin JM 103 -soluihin, levitettiin agarmaljoille ja inkuboitiin yön yli, jotta saatiin faagiplakkeja.
Esimerkki 5 25 Mutagenoitujen faagiplakkien seulonta ja identifiointi
Sekä mutagenoituja M13 - IL 2 -plakkeja sisältävät maljat että mutagenoimattomia M13 - IL 2 -faagiplakkeja sisältävät 2 maljaa jäähdytettiin lJ°C:seen ja faagiplakit -kultakin maljalta siirrettiin kahdelle ympyränmuotoiselle nitro-30 selluloosasuodattimelle asettamalla kuiva suodatin agarmal-jalle, ensimmäinen suodatin 5 min:ksi ja toinen suodatin 15 minrksi. Suodattimet asetettiin sen jälkeen 5 min:ksi paksuille suodatinpapereille, joihin oli imeytetty 0,2 N NaOH;ta, 1,5- M NaCl:a ja 0,2 % Tritonia ja neutraloitiin 35 asettamalla toiseksi 5 minrksi suodatinpapereille, joihin oli imeytetty 0,5 M'Tris-HCl:a, pH 7,5 ja 1,5 M NaClra/ Suodattimet pestiin kahdesti samalla tavalla suodattimien päällä, joihin suodattamiin oli imeytetty 2 x SSCrtä, kui- 8 82266 vattiin ja pidettiin sen jälkeen vakuumiuunissa 80°C:ssa 2 h. Kaksoissuodattimet esihybridisoitiin i42°-C:ssa ^ h 10 ml:11a per suodatin DNA-hybridisaatiopuskuria (5 x SSC, pH 7,0, x Denhardtin liuos (polyvinyylipyrrolidiini, 5 fikoli ja härän seerumin albumiini, 1 x 5 0,2 % kutakin), 0,1 % SDS, 50 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7,0 ja 100 τρ pg/ml denaturoitua lohen siemennesteen DNA:ta). P:liä, leimatut koettimet valmistettiin kinasoimalla oligonukleo- tidialukkeet leimatulla ATP:llä. Suodattimet hybridisoi-10 τρ ς tiin ^ P:llä leimattuihin alukkeisiin, 0,1 x 10 tuiketta per min/ml, 5 ml:ssa per suodatin DNA-hybridisaatiopuskuria 42°C:ssa 8 h. Suodattimet pestiin kahdesti 50°C:ssa 30 min kukin pesupuskureissa, jotka sisälsivät 0,1 % SDS:ää ja 2 x SSCrtä ja kahdesti 50°C:ssa 30 min kukin 0,1 % SDSrllä ja 0,2 x SSC:lla. Suodattimet kuivattiin ilmassa ja autoradiografioitiin -70°C:ssa 2-3 päivää.
Koska oligonukleotidialukkeet DM 28 ja DM 29 suunniteltiin luomaan uusi Dde I -restriktiokohta mutagenoituun 2o klooniin (kuva 1*0, monesta kunkin tällaisen kinasoidun alukkeen kanssa hybridisoidusta kloonista saatu RF-DNA pilkottiin restriktioentsyymillä Dde I. Yksi mutagenoiduista M13 - IL 2 -plakeista,. joka hybridisoitiin alukkeen DM 28 kanssa ja jolla oli uusi Dde I -restriktiokohta (M13 -25 LW*J*0 poimittiin ja siirrostettiin JM 103 -viljelmään, ssDNA valmistettiin viljelmän supernatantista ja dsPR-DNA valmistettiin solupallosista. Samalla tavalla plakki, joka hybridisoitiin alukkeen DM 29 kanssa,- poimittiin (M13 ~ LW*l6) ja siitä valmistettiin ssDNA ja RF-DNA. Oligonuk-30 leotidialuke DM 27 muotoiltiin luomaan uusi Pst I -restriktiokohta Dde I -kohdan sijasta. Sen vuoksi plakit, jotka oli hybridisoitu tähän alukkeeseen, seulottiin uuden Pet I-kohdan läsnäollessa. Eräs sellainen faagiplakki identifioitiin (M13 - LW42) ja siitä valmistettiin ssDNA ja 35 RF-DNA. DNA kaikista kolmesta tällaisesta kloonista se4- venssoitiin^ jotta varmistettiin, että kysteiinin TGT-kodo-ni oli muuttunut seriinin TCT-kodoniksi.
9 82266
Esimerkki s
Mutagenoidun IL-2 «geenin uudelleen kloonaus ekspressiota varten E.colissa M13 - LW*l2:n, M13 - LVkk:n ja M13 - LW*l6:n RF-DNA pii- e , kottiin kukin restnktioentsyymeillä Hm d III ja Ban II ja inserttifragmentit puhdistettiin 1 t agaroosigeelillä. Samalla tavalla plasmidi pTrp3 (kuva 7) pilkottiin Hin d III:11a ja Ban II:11a, suuri plasmidifragmentti, joka sisälsi trp-promoottorin, puhdistettiin agaroosigeelillä ja 1 n sen jälkeen ligatbitiin kunkin M13 - LW*<2:sta, M13 - LWM:stä ja M13 - LWH6:sta eristetyn inserttifragmentin kanssa. Ligatoidut plasmidit transformoitiin sopivaan E.coli K 12 kantaan MM 29¾. Plasmidi -DNA:t näistä trans - formanteista analysoitiin kartoittamalla restriktioentsyy-15 meillä, jotta varmistettiin plasmidien pLW42, pLW44 ja pLWU6 läsnäolo. Kuva 1¾ on pLW46:n restriktiokartta. Kun kutakin näistä yksittäisistä klooneista kasvatettiin tryp-tofaanin puuttuessa, jotta saatiin aikaan trp-promoottori ja vapaat solu-uutteet analysoitiin SDS-polyakryyliaroidi-geeleillä, kaikki kolme kloonia, pLW*!2, pLW4*l ja pLW46, osoittautuivat syntetisoivan 1*1,5 kd:n proteiinin, joka v oli samanlainen kuin positiivisesta kontrollista, pLW21:stä löydetty proteiini. pLW21:n oli osoitettu syntetisoivan 25 l1*,1» kd:n IL-2-proteiinin. Kun näitä samoja uutteita tut kittiin IL-2-aktiivisuuden suhteen hiiren HT-2-soluissa, vain klooneilla pLW21 (positiivinen kontrolli) ja pLWA6 oli merkittäviä määriä IL-2-aktiivisuutta (taulukko II alla), osoittaen että kys-58 ja kys-105 ovat välttämättömiä 30 biologiselle aktiivisuudelle ja niiden muuttaminen serii-neiksi (pLW42 ja pLM*J vastaavasti) aiheuttaa biologisen aktiivisuuden menetyksen. Kys-125 ei toisaalta ole välttämätön biologiselle aktiivisuudelle, koska sen muutos ser 125:ksi (pLW46) ei vaikuttanut biologiseen aktiivisuuteen.
35 " ίο 8 2266 4
Taulukko II
Kloonit. IL-2 -aktiivisuus (n/ml) pIL 2-7 (negatiivinen kontrolli) 1 pLW21 (positiivinen kontrolli) 113,000 5 pLWH2 660 pLWH4 1,990 pLWH6 123,000
Kuva 15a esittää kloonin pLW^6 koodaavan säikeen nuk- 10 leotidijärjestyksen. Verrattuna ihmisen alkuperäisen IL7 2-geenin koodaavaan säikeeseen kloonilla pLW46 on yksittäinen emäsmuutos .G C nukleotidissä 37^· Kuva 15b esit-tää pLW46 koodaaman IL-2-routeiinin vastaavan aminohappo- järjestyksen. Tätä muteiinia nimitetään IL-2 ser 125:ksi.
15
Verrattuna alkuperäiseen IL-2:een muteiinilla on seriini kysteiinin sijasta asemassa 125· pLW46:lla transformoitu E.coli K 12 kannan MM294 näyte tallennettiin laitokseen American Type Culture Collection, 20 Rockville, Maryland 20852, USA, 26. päivänä syyskuuta 1983 ja sille on annettu AT CC numero 39, **52.
IL-2:n muteiinit, joissa kysteiini asemassa 125 on de-letoitu tai korvattu toisella aminohapolla, kuten muteiini IL-2 ser 125, säilyttävät IL-2 -aktiivisuuden. Sen vuoksi 25 niitä voidaan formuloida ja käyttää samalla tavalla kuin alkuperäistä IL-2:ta. Niin ollen sellaiset IL-2 -muteiinit ovat käyttökelpoisia bakteeri-, virus-, lois-, alku-eläin- ja sieni-infektioiden diagnoosissa ja käsittelyssä; lymfokiinin ja immunologisen vajavuuden osoittamisessa; 30 iäkkäiden ihmisten ja eläinten normaalin immunotekijän palauttamiseen alkuperäiseen muotoonsa; diagnostisten kokeiden kehittämisessä kuten kokeiden, joita käytetään entsyy-miamplifikaatiossa, radioleimauksessa, radiokuvauksessa ja · muissa sinänsä tunnetuissa menetelmissä, joilla tarkiste-35 taan IL-2 -pitoisuuksia sairauksissa; T solun kasvun in vitro edistämiseen terapeuttisiin ja diagnostisiin tarkoituksiin ealpaamaan lymfokiinien vastaanottokohdat ja eri-laisissa muissa terapeuttisissa, diagnostisissa ja tutki-* 11 82266 mussovellutuksissa. Ihmisen IL-2:n erilaisia terapeuttisia ja diagnostisia sovellutuksia on tutkittu ja selostettu julkaisuissa S.A. Rosenberg, E.A. Grimm, et ai., A. Mazumder, et ai. ja E.A. Grimm ja S.A. Rosenberg. IL-2-5 muteiineja voidaan käyttää yksinään tai yhdessä muiden immunologisesta relevanttien B tai T solujen ja muiden terapeuttisten aineiden kanssa. Terapeuttisia ja diagnostisia sovellutuksia varten ne voivat olla myrkyttömissä, aller-geenittömissä, fysiologisesti sopivissa kantajaväliaineis-1® sa kuten tislatussa vedessä, Ringerin liuoksessa, Hankin liuoksessa, fysiologisessa suolaliuoksessa yms. Ihmisille tai eläimille IL-2 -muteiinit voidaan antaa oraalisesti tai intraperitoneaalisesti tai lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti niin kuin lääkäri pitää sopivana. Esimerkkejä 15 relevanteista soluista ovat B ja T solut, luonnolliset tappajasolut yms. ja esimerkkejä terapeuttisista reagensseis-ta, joita voidaan käyttää yhdessä tämän keksinnön mukaisten polypeptidien kanssa, ovat erilaiset interferonit, erityisesti gamma-interferoni, B solun kasvutekijä, IL-1 yms.
• v

Claims (5)

12 82266
1. Menetelmä muteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (a) valmistetaan rakenteellinen geeni, joka koodaa biolo-5 gisesti aktiivisen proteiinin synteettisen muteiinin, jossa proteiinissa on ainakin yksi kysteiinitähde, joka on vapaa muodostamaan disulfidisidoksen ja joka ei ole välttämätön mainitulle biologiselle aktiivisuudelle, ja joka proteiini on ihmisen interleukiini-2, ja jolla muteiinilla on inter-10 leukiini-2:n asemassa 125 kysteiinitähde korvattu seriinil-lä, jolloin sen aminohapposekvenssi on 5 10 15 20 MetProThrSerSer SerThrLysLysThr GlnLeuGlnLeuGlu HisLeuLeuLeuAsp 15 25 30 35 40 LeuGlnMetlleLeu AsnGlylleAsnAsn TyrLysAsnProLys LeuThrArgMetLeu 45 50 55 60 ThrPheLysPheTyr MetProLysLysAla ThrGluLeuLysHis LeuGlnCysLeuGlu 65 70 75 80 GluGluLeuLysPro LeuGluGluValLeu AsnLeuAlaGlnSer LysAsnPheHisLeu 85 90 95 100 ArgProArgAspLeu IleSerAsnlleAsn VallleValLeuGlu LeuLysGlySerGlu 20 105 110 115 120 ThrThrPheMetCys GluTyrAlaAspGlu ThrAlaThrlleVal GluPheLeuAsnArg 125 130 135 140 TrpIleThrPheSer GlnSerIlelleSer ThrLeuThr--- 25 (b) viedään geeni replikoituvassa ja ekspressoituvassa muodossa ekspressiovektorin avulla isäntäorganismin isäntä-soluun, joka isäntäorganismi on bakteeri E.coli; ja 30 (c) ekspressoidaan geeni.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muteiini on glykosyloimaton.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekspressiovektori on plasmidi 13 82266 pLW46, jonka restriktiokartta on HIn dill Eco Rl^^—
10 I^Amp l-Ea/ϊ II K 82266
FI833681A 1982-10-19 1983-10-10 Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein. FI82266C (fi)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI893037A FI87233C (fi) 1982-10-19 1989-06-21 Gen vilken kodar en mutein
FI901503A FI105203B (fi) 1982-10-19 1990-03-26 Menetelmä rekombinantti-ihmisinterferoni-beta-muteiinin valmistamiseksi

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43515482A 1982-10-19 1982-10-19
US43515482 1982-10-19
US48616283A 1983-04-15 1983-04-15
US48616283 1983-04-15

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI833681A0 FI833681A0 (fi) 1983-10-10
FI833681A FI833681A (fi) 1984-04-20
FI82266B true FI82266B (fi) 1990-10-31
FI82266C FI82266C (fi) 1991-02-11

Family

ID=27030446

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI833681A FI82266C (fi) 1982-10-19 1983-10-10 Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.

Country Status (23)

Country Link
EP (4) EP0192811B1 (fi)
JP (2) JPS6128392A (fi)
KR (1) KR910009900B1 (fi)
AT (4) ATE33503T1 (fi)
AU (1) AU563962B2 (fi)
BE (1) BE898016A (fi)
CA (1) CA1340861C (fi)
CH (1) CH669395A5 (fi)
DE (4) DE3382528D1 (fi)
DK (2) DK168767B1 (fi)
ES (4) ES8505717A1 (fi)
FI (1) FI82266C (fi)
FR (1) FR2534594B1 (fi)
GB (1) GB2130219B (fi)
GR (1) GR79408B (fi)
IE (1) IE56026B1 (fi)
IL (1) IL69970A (fi)
LU (3) LU88761I2 (fi)
NL (2) NL930119I2 (fi)
NO (1) NO173740C (fi)
NZ (1) NZ205922A (fi)
PH (2) PH20343A (fi)
PT (1) PT77512B (fi)

Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI82266C (fi) * 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
IL71951A0 (en) * 1983-06-01 1984-09-30 Hoffmann La Roche Polypeptides having interferon activity,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
WO1985000817A1 (en) * 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
GB8334102D0 (en) * 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
US4530787A (en) * 1984-03-28 1985-07-23 Cetus Corporation Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins
DE3575072D1 (de) 1984-03-28 1990-02-08 Cetus Corp Pharmazeutische zusammensetzungen von mikrobenerzeugtem interleukin-2.
DE3574731D1 (de) * 1984-05-08 1990-01-18 Genetics Inst Ein menschlicher t-zellwachstumsfaktor.
GB8412564D0 (en) * 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
US5683688A (en) * 1984-05-31 1997-11-04 Genentech, Inc. Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions
NZ212207A (en) * 1984-05-31 1991-07-26 Genentech Inc Recombinant lymphotoxin
US5672347A (en) * 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
CA1275954C (en) 1984-08-31 1990-11-06 Hing Cheug Wong 3'-expression enhancing fragments and method
IL76360A0 (en) 1984-09-26 1986-01-31 Takeda Chemical Industries Ltd Mutual separation of proteins
WO1986002068A1 (en) * 1984-09-26 1986-04-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Mutual separation of proteins
US4857316A (en) * 1984-10-03 1989-08-15 Syntex (U.S.A.) Inc. Synergistic antiviral composition
US4606917A (en) * 1984-10-03 1986-08-19 Syntex (U.S.A) Inc. Synergistic antiviral composition
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US4572798A (en) * 1984-12-06 1986-02-25 Cetus Corporation Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins
DK172052B1 (da) * 1984-12-21 1997-09-29 Otsuka Pharma Co Ltd Antitumor-aktivt stof, fremgangsmåde til dets fremstilling, lægemiddel indeholdende stoffet, gen kodende for stoffet, vektor indeholdende genet samt rekombinant mikroorganisme transformet med en sådan vektor
US6107465A (en) * 1984-12-21 2000-08-22 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. IL-1β and derivatives thereof and drugs
US5342614A (en) * 1984-12-21 1994-08-30 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method of treating arthritus or inflammation with IL-1β or derivatives thereof
DE3500681A1 (de) * 1985-01-11 1986-07-17 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur isolierung und reinigung von lymphokinen
US4863849A (en) * 1985-07-18 1989-09-05 New York Medical College Automatable process for sequencing nucleotide
US6004548A (en) * 1985-08-23 1999-12-21 Amgen, Inc. Analogs of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
CA1297003C (en) * 1985-09-20 1992-03-10 Jack H. Nunberg Composition and method for treating animals
US5359035A (en) * 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
US5008374A (en) * 1986-03-14 1991-04-16 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. IL-1α derivatives and drugs
AU595864B2 (en) * 1986-03-14 1990-04-12 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Il-1 alpha derivatives and drugs
EP0260350B1 (en) * 1986-09-05 1992-02-12 Cetus Oncology Corporation Oxidation-resistant interferon-beta muteins and their production; formulations containing such muteins
JP2526965B2 (ja) * 1987-02-24 1996-08-21 武田薬品工業株式会社 ムテイン，ｄｎａおよびその用途
DK175535B1 (da) * 1987-03-04 2004-11-29 Daiichi Suntory Pharma Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt cysteinholdigt peptid
JP2879148B2 (ja) * 1987-07-07 1999-04-05 サイオス インコーポレイテッド 組換え繊維芽細胞成長因子
WO1989004326A1 (en) * 1987-11-04 1989-05-18 California Biotechnology Inc. Alveolar surfactant proteins
DE68929273T2 (de) * 1988-08-24 2001-07-05 American Cyanamid Co., Wayne Stabilisierung von Somatotropinen durch Modifikation von Cystein-Resten durch orts-spezifische Mutagenese oder chemische Derivatisierung
US5079230A (en) * 1988-09-12 1992-01-07 Pitman-Moore, Inc. Stable bioactive somatotropins
CA2003886A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-16 Anthony F. Purchio Cloning and expression of simian transforming growth factor-beta 1
WO1990008823A1 (en) * 1989-01-31 1990-08-09 The Upjohn Company Somatotropin analogs
ATE133993T1 (de) * 1989-02-17 1996-02-15 Merck & Co Inc Protein-antikrebsmittel
US5621078A (en) * 1989-03-22 1997-04-15 Merck & Co., Inc. Modified pseudomonas exotoxin PE40
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
US6207798B1 (en) 1989-08-03 2001-03-27 Merck & Co., Inc. Modified PE40 toxin fusion proteins
US5173297A (en) * 1991-07-01 1992-12-22 Quest International Flavors & Food Ingredients Company Division Of Indopco, Inc. Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis
IL98528A0 (en) * 1990-06-21 1992-07-15 Merck & Co Inc Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells
FR2671554A1 (fr) * 1991-01-11 1992-07-17 Clonatec Sa Peptides synthetiques derivant de l'antigene hbc du virus de l'hepatite b, leurs applications a la detection d'une infection par ce virus et a la vaccination contre l'hepatite b.
US5545723A (en) * 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US5814485A (en) * 1995-06-06 1998-09-29 Chiron Corporation Production of interferon-β (IFN-β) in E. coli
DE19544167A1 (de) * 1995-11-17 1997-05-22 Schering Ag Verwendung von Interferon-ß zur Behandlung von Bronchialkarzinom bei Bestrahlungstherapie
WO1997048808A1 (en) * 1996-06-19 1997-12-24 Chiron Corporation Bacterial production of interferon-beta using low levels of sodium and potassium ions
CN1100875C (zh) * 1998-03-06 2003-02-05 上海华晨生物技术研究所 新型重组人白细胞介素2的制备方法及其表达载体和工程菌
US6926898B2 (en) 2000-04-12 2005-08-09 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1935431A3 (en) 2000-05-15 2008-08-13 Health Research, Inc. Cancer treatments by using a combination of an antibody against her2 and interleukin-2
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
US6887462B2 (en) 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
WO2003025541A2 (en) * 2001-09-18 2003-03-27 Chiron Corporation Methods for treating multiple sclerosis
KR100511749B1 (ko) * 2001-11-06 2005-09-02 선바이오(주) 변형된 인터페론-베타, 및 이의 화학적으로 변형된 배합체
ES2500918T3 (es) 2001-12-21 2014-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
BR0314107A (pt) 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Método de produção de derivados de hidroxialquil amido
AU2003273413A1 (en) 2002-10-08 2004-05-04 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005044854A2 (en) 2003-11-04 2005-05-19 Chiron Corporation Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
AU2005227263A1 (en) * 2004-03-05 2005-10-06 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. In vitro test system for predicting patient tolerability of therapeutic agents
AR048035A1 (es) 2004-03-11 2006-03-22 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxialquilo y una proteina, preparados por aminacion reductora
JP2008507297A (ja) * 2004-07-26 2008-03-13 エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 最適化されたインターフェロンβ遺伝子
GB0523282D0 (en) 2005-11-15 2005-12-21 Isis Innovation Methods using pores
GB2453377A (en) 2007-10-05 2009-04-08 Isis Innovation Transmembrane protein pores and molecular adapters therefore.
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
ES2382058T3 (es) 2008-01-17 2012-06-04 Philogen S.P.A. Combinación de una proteína de fusión de un anticuerpo dirigido contra el EDB de la fibronectina-IL-2, y una molécula de unión a los linfocitos B, progenitores de los linfocitos B y/o sus homólogos cancerosos
CN102245760A (zh) 2008-07-07 2011-11-16 牛津纳米孔技术有限公司 酶-孔构建体
CA2730068A1 (en) 2008-07-07 2010-01-14 Oxford Nanopore Technologies Limited Base-detecting pore
US9077937B2 (en) * 2008-11-06 2015-07-07 Alcatel Lucent Method and apparatus for fast channel change
GB0820927D0 (en) 2008-11-14 2008-12-24 Isis Innovation Method
CA2750879C (en) 2009-01-30 2018-05-22 Oxford Nanopore Technologies Limited Adaptors for nucleic acid constructs in transmembrane sequencing
CN102482330A (zh) 2009-01-30 2012-05-30 牛津纳米孔技术有限公司 酶突变体
GB0905140D0 (en) 2009-03-25 2009-05-06 Isis Innovation Method
KR101939420B1 (ko) 2011-02-11 2019-01-16 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 돌연변이체 세공
EP3766513A1 (en) 2011-03-11 2021-01-20 Assistance Publique Hôpitaux de Paris Use of low dosage il-2 for treating vasculitis
KR20140050067A (ko) 2011-07-25 2014-04-28 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 막횡단 포어를 사용한 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열분석을 위한 헤어핀 루프 방법
GB201119244D0 (en) 2011-11-08 2011-12-21 British American Tobacco Co Smoking article
JP6271505B2 (ja) 2012-04-10 2018-01-31 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド 変異体ライセニンポア
WO2014013259A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Oxford Nanopore Technologies Limited Ssb method
CN105209634B (zh) 2013-03-08 2020-05-12 牛津纳米孔技术公司 酶停滞方法
GB201314695D0 (en) 2013-08-16 2013-10-02 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201313477D0 (en) 2013-07-29 2013-09-11 Univ Leuven Kath Nanopore biosensors for detection of proteins and nucleic acids
US10183061B2 (en) 2013-06-25 2019-01-22 Icm (Institut Du Cerveau Et De La Moelle Epiniere) Boosting Treg cells for treating Alzheimer disease and related disorders
GB201403096D0 (en) 2014-02-21 2014-04-09 Oxford Nanopore Tech Ltd Sample preparation method
EP2918285A1 (en) 2014-03-11 2015-09-16 Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) Interleukin-2 for treating food allergy
CN106459159B (zh) 2014-05-02 2021-11-30 牛津纳米孔技术公司 突变孔
CN114605507A (zh) 2014-09-01 2022-06-10 弗拉芒区生物技术研究所 突变csgg孔
US10266885B2 (en) 2014-10-07 2019-04-23 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Mutant pores
GB201418159D0 (en) 2014-10-14 2014-11-26 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2016172445A2 (en) * 2015-04-24 2016-10-27 The University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of identifying biologically active random peptides in plants and libraries of plants expressing candidate biologically active random peptides
US10876109B2 (en) 2015-04-24 2020-12-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of identifying biologically active random peptides in prokaryotic cells and libraries of prokaryotic cells expressing candidate biologically active random peptides
US10801023B2 (en) * 2015-04-24 2020-10-13 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of identifying biologically active random peptides in plants and libraries of plants expressing candidate biologically active random peptides
CA3001429C (en) 2015-10-22 2023-07-11 Iltoo Pharma Pharmaceutical compositions of il-2
GB201609220D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
US11648271B2 (en) 2016-06-22 2023-05-16 David Klatzmann Genetically modified T lymphocytes
EP3596108A4 (en) 2017-03-15 2020-12-23 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNOTOLERANCE
BR112019024127A2 (pt) 2017-05-24 2020-06-23 Pandion Therapeutics, Inc. Imunotolerância alvejada
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US11534479B2 (en) 2018-02-16 2022-12-27 Iltoo Pharma Use of interleukin 2 for treating Sjögren's syndrome
GB201807793D0 (en) 2018-05-14 2018-06-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
WO2020007937A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Iltoo Pharma Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis
US20210236599A1 (en) 2018-08-13 2021-08-05 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
WO2020102556A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods of prognosis and classification for preeclampsia
EP3972992A4 (en) 2019-05-20 2023-07-19 Pandion Operations, Inc. ANTI-MADCAM IMMUNE TOLERANCE
AU2020401357A1 (en) 2019-12-12 2022-07-21 Assistance Publique - Hôpitaux De Paris Interleukin 2 chimeric constructs
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
US20230090069A1 (en) 2020-03-06 2023-03-23 Centre Hospitalier Universitaire De Nimes Low dose human interleukin-2 for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
CN116075523A (zh) * 2020-04-29 2023-05-05 基因制药株式会社 具有融合的干扰素-β突变蛋白和抗体的重组蛋白以及包含其的药物组合物
JP2023524248A (ja) * 2020-04-29 2023-06-09 アビオン インク． 二重突然変異を有するヒトインターフェロン－ベータ変異体及びヒトインターフェロン－ベータ変異体の安全性を向上させる方法
MX2024004291A (es) 2021-10-06 2024-06-28 Iltoo Pharma Construcciones quiméricas de interleucina 2 con especificidad de direccionamiento a tejidos inflamados.
WO2024056154A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin-2 for use in treating autism spectrum disorder
WO2024121173A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Centre Hospitalier Universitaire De Nimes Low dose human interleukin-2 for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis in a subgroup of patients

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5359688A (en) * 1976-11-11 1978-05-29 Tanpakushitsu Kenkiyuu Shiyour Production of novel polypeptide
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
FI88175C (fi) * 1980-04-03 1993-04-13 Biogen Inc Rekombinant-dna-molekyler och foerfaranden foer framstaellning av polypeptider liknande humant -interferon
JPS58110548A (ja) * 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
FI82266C (fi) * 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
IL71951A0 (en) * 1983-06-01 1984-09-30 Hoffmann La Roche Polypeptides having interferon activity,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
WO1985000817A1 (en) * 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
US4959314A (en) * 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins

Also Published As

Publication number Publication date
FI833681A (fi) 1984-04-20
FR2534594A1 (fr) 1984-04-20
AU563962B2 (en) 1987-07-30
IE56026B1 (en) 1991-03-27
PH20343A (en) 1986-12-04
JPH0568480B2 (fi) 1993-09-29
ATE33503T1 (de) 1988-04-15
IL69970A0 (en) 1984-01-31
NL930119I1 (nl) 1993-11-01
DK105892A (da) 1992-08-26
GR79408B (fi) 1984-10-22
EP0234599A1 (en) 1987-09-02
EP0192811A1 (en) 1986-09-03
CA1340861C (en) 1999-12-28
GB2130219A (en) 1984-05-31
ES8506089A1 (es) 1985-06-16
DK481383D0 (da) 1983-10-19
DE3376271D1 (en) 1988-05-19
CH669395A5 (fi) 1989-03-15
NO173740C (no) 1994-01-26
LU90413I2 (fr) 1999-09-07
FI82266C (fi) 1991-02-11
PT77512B (en) 1987-11-24
PT77512A (en) 1983-11-01
EP0234599B1 (en) 1992-03-11
NL960013I2 (nl) 1997-03-03
DE3380598D1 (en) 1989-10-26
BE898016A (fr) 1984-02-15
NO173740B (no) 1993-10-18
LU88761I2 (fr) 1996-11-05
PH23702A (en) 1989-09-27
EP0218825A1 (en) 1987-04-22
ES526541A0 (es) 1985-04-01
ATE61407T1 (de) 1991-03-15
LU88357I2 (fr) 1994-05-04
EP0218825B1 (en) 1989-09-20
AU2008683A (en) 1984-05-03
ATE73493T1 (de) 1992-03-15
ES533054A0 (es) 1985-08-01
NL930119I2 (nl) 1995-01-16
DK105892D0 (da) 1992-08-26
DE3382197D1 (de) 1991-04-11
JPS6420096A (en) 1989-01-24
KR910009900B1 (ko) 1991-12-03
NZ205922A (en) 1987-11-27
IL69970A (en) 1991-05-12
DK168767B1 (da) 1994-06-06
ES8506801A1 (es) 1985-08-01
GB2130219B (en) 1986-01-29
FR2534594B1 (fr) 1987-06-19
ES542829A0 (es) 1986-06-01
ES533053A0 (es) 1985-06-16
FI833681A0 (fi) 1983-10-10
JPS6128392A (ja) 1986-02-08
GB8327490D0 (en) 1983-11-16
DK481383A (da) 1984-04-20
EP0109748A1 (en) 1984-05-30
NO833793L (no) 1984-04-24
DK171681B1 (da) 1997-03-10
EP0109748B1 (en) 1988-04-13
IE832380L (en) 1984-04-19
EP0192811B1 (en) 1991-03-06
ES8608043A1 (es) 1986-06-01
DE3382528D1 (de) 1992-04-16
ES8505717A1 (es) 1985-04-01
ATE46539T1 (de) 1989-10-15
KR840006369A (ko) 1984-11-29
NL960013I1 (nl) 1996-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI82266B (fi) Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
US4853332A (en) Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
US4588585A (en) Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4518584A (en) Human recombinant interleukin-2 muteins
US4959455A (en) Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
DE3789859T2 (de) Formen des Koloniestimulierungsfaktors 1.
JP2553829B2 (ja) 組換えコロニー刺激因子−１
JP2642942B2 (ja) 霊長動物造血成長因子の新規種族
JPH05500211A (ja) 造巨核球因子
JPH057996B2 (fi)
EP0299782B1 (en) Expression vectors for the production of human granulocyte-macrophage colony stimulation factor in a mammalian cell host(18.05.92)
US5104650A (en) Uses of recombinant colony stimulating factor-1
AU2131688A (en) Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor and muteins thereof
KR970004941B1 (ko) 신규 영장류 조혈 성장 인자족(family) 발현용 벡터 및 형질전환체
BG60510B2 (bg) Структурни гени,плазмиди и трансформирани клетки за получаване на бедни на цистеин мутеини на биологично активни протеини
IE871727L (en) Novel family of primate il3-like hematopoietic growth¹factors.

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired

Owner name: CHIRON CORPORATION