PT77512B

PT77512B - Process for preparing cystein-depleted muteins of biologically active proteins

Info

Publication number: PT77512B
Application number: PT77512A
Authority: PT
Inventors: David F Mark; Leo S Lin; Shi-Da Yu Lu
Original assignee: Cetus Corp
Priority date: 1982-10-19
Filing date: 1983-10-17
Publication date: 1987-11-24
Also published as: FI833681A; FR2534594A1; AU563962B2; IE56026B1; FI82266B; PH20343A; JPH0568480B2; ATE33503T1; IL69970A0; NL930119I1; DK105892A; GR79408B; EP0234599A1; EP0192811A1; CA1340861C; GB2130219A; ES8506089A1; DK481383D0; DE3376271D1; CH669395A5

Description

Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é um diagrama da sequência

de aminoácidos do IFN- |b.

A Figura 2 é uma ilustração esquema, tica mostrando a preparação de um gene mutante do IFR- por mutagenése dirigida, por oligonucleotídeos.

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A Figura $ mostra um diagrama do plasmídeo pBl trp incluindo o gene do IFR- .

A Figura 4 é um diagrama do vector

de clonagem fágico M13mp8.

. k Figura 5 mostra o mapa de restrição do clone H13-V 1.

A Figura 6 mostra o padrão do gel

de sequenciação do gene mutante IFN-_ser^r, mostrando uma alteração numa única base na região codificadora.

A Figura 7 é um diagrama do plasmí

deo de expressão pTrp?.

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A Figura 8a 'mostra o padrão de res. trição Hinfl do clone pSY25Ol e a Figura 8b mostra os seus dois fragmentos resultantes de 169 pb © 28pb.

A Figura 9 θ nm mapa de restrição do

clone pSY25Ol.

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DRA codificadora da muteina quência de aminoácidos.

Figura

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10 mostra a sequência de serl7 ^{com a re}sp®ctiva s.e

A Figura 11 mostra a banda proteica única de 18 000 daltons correspondente ao presente

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nos extractos dos clones pSY2501 e p ltrp.

A Figura 12 é um diagrama do pias, mídeo pLWl que contam o gene da interleuquina-2-humana (IL-2) sob o controle do promotor trp de E. coli.

A Figura 13 é um mapa de restrição

do clone de fago M13-IL2.

A Figura 14 é um mapa de restrição

do plasmídeo pLW46.

As Figuras 15a e 15b mostram, res. pectivamente, a sequência de nucleotídeos da aadeia codifica dora do clone pLW46 e a correspondente sequência de aminoáci dos da muteína IL-2 designada

Modos para efectuação do invento

0 presente invento fornece: muteí. nas de proteínas biologicamente activas nas quais os resíduos de cisteína que não são essenciais para a actividade biológica foram deliberadamente eliminados ou substituído^ por outros aminoácidos para eliminar locais de ligação cruzada intermole cular ou de formação de ligações di-sulfureto intramoleculares incorrectas; genes mutantes codificando tais muteínas; e meios para fazer tais muteínas.

Proteínas que possam ser mutacional. mente alteradas de acordo com este invento podem ser identifi. cadas a partir de informação disponível tendo em conta o conteú do cisteína das proteínas biologicamente activas e as funções desempenhadas pelos resíduos de cisteína em relação à activida de e estrutura terciária. Para as proteínas para as quais não há tal informação disponível na literatura esta informação po de ser determinada através da alteração sistemática de cada um dos resíduos de cisteína da proteína por processos aqui descri

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tos e testando a actividade biológica das muteinas resultantes e a sua predisposição para formar ligações di-sulfureto intermoleculares ou intramoleculares indesejáveis. Assim,enquanto o invento ê especificamente descrito e exemplificado abaixo relativamente às muteinas dos IFN-J3 e IL-2 seria apreciado que os ensinamentos seguintes se aplicassem a qualquer outra proteína biologicamente activa que contenha um residuo de cisteina funcionalemnte não essencia1 que torno a proteína susceptlvel ã formação de ligações di-sulfureto indesejáveis. Exemplos de outras proteínas que não o IFNJ3 e a IL-2 que são candidatas a alteração mutacional de acordo com o invento são o factor de necrose tumoral, o factor-1 estimulador de colónias e o IFN-°( 1- As proteinas candidatas terão geralmente um número impar de resíduos de cisteína.

No caso do IFN-p foi referido

na literatura de que ambos os IFNs glicosilados e não glicosil^ do apresentam actividades especificas qualitativamente semelhar^ tes e que portanto, a porções glicosilo não estão envolvidas e não contribuem para a actividade biológica do IFN-j5. No entanto, o IFN-p produzido por microrganismos que não é glicosilado apresenta consistentemente uma actividade especifica quantitativamente inferinr à do IFN-J3 nativo que.é glicosilado. Sabe-se que o IFN-p tem três resíduos de cisteína nas posições 17, 31 e 141. Foi demonstrado por Shopard, et al., supra que a cis teina 141 é essencial, para a actividade biológica. No IFN-^, que contem quatro resíduos de cisteína, há duas ligações -S-S-intramoleculares, uma entre cis 29 e cis 138 e uma outra entre cis 1 e cis 98. Baseado na homologia entre o IFN-B e os IFN-f(s, cis 141 do IFN-p poderia estar envolvido na ligação -S-Sintramolecular com cis 31, deixando cis 17 livre para formar ligações cruzadas intermoleculares. Quer por eliminação decis 17 quer por substituição por um aminoacido diferente, pode-se determinar se cis 17 ê essencial à actividade biológica e o seu papel na formação de ligações -SS-. Se cis 17 não for essencial para a actividade biológica da proteína, a proteína resultante com cis 17 eliminado ou com cis 17 substituido deverá apresentar uma actividade especifica semelhante à do IFN-B nativo e

possibilitaria também uma maior facilidade de isolamento e pu

rificação da proteína.

Através da utilização do processo de mutagénese dirigida de oligonucleotídeos com um oligonucleotí deos iniciador sintético que é complemertar da região do gene de IFN-Ç)onde se situa o codão para cis 17 mas que contém a_l terações de uma ou mais bases nesse codão, pode-se produzir um gene desenhado que resulte na substituição de cis 17 por um outro aminoácido escolhido. Quando a eliminação é desejada o iniciador oligonucleotídico não possui o codão para cis 17·

A conversão de cis 17 em aminoácidos neutros como sejam a glicina, valina, alanina, leucina, isoleucina, tirosina, fenil. alanina, histidina, triptofano, serina, treonina e metionina e a abordagem preferida. Serina e treonina são as substituições mais preferidas devido à sua analogia química com a cisteína. Quando a cisteína é eliminada, a muteína madura tem menos um aminoácido do que a proteína parenteral nativa ou o IEN-^ pro duzido por microorganismos.

IL-2 humana sabe-se ter três resíduos de cisteína localizados nas posições 58, 105 e 125 da proteína. Como no caso do IFN-(^ , IL-2 e está numa forma agregada oligomé rica quando isolada das células bacterianas e tem de ser reduzi da com agentes redutores para se obter um bom rendimento a par tir dos extractos bacteriascs. Em adição, a proteína IL-2 reduzi da purificada é instável e rapidamente reoxidada para uma for ma inactiva oligomérica quando armazenada. A presença de três cisteínas significa que quando há reoxidação a proteína pode formar ao acaso uma de três possíveis pontes di-sulfureto in tramoleculares, sendo apenas uma destas a ponte correcta como a encontrada na molécula nativa. Uma vez que, a estrutura di-sulfureto da proteína IL-2 nativa não é conhecida, é possível usar o presente invento para criar mutações nos codões 58,105 e 125 do gene da IL-2 e identificar quais os resíduos de cis teína necessários para a actividade e que portanto deverão es. tar envolvidos na formação da ponte di-sulfureto nativa. Na mesma linha, o resíduo de cisteína que não é necessário para

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a actividade pode ser modificado de modo a evitar a formação de pontes di-sulfureto intramoleculares incorrectas e minimizar a possibilidade de formação de pontes di-sulfureto intermoleculares por remoção ou substituição do resíduo de cisteina livre.

0 tamanho do iniciador oligonu cleotídeo ê determinado pela necessidade de uma hibridação estável do iniciador com a região do gene em que a mutação vai ser induzida e pelas limitações com métodos correntes para sin_ tese de oligonucleotídeos. Os fãctores a serem considerados ao projectarem-se oligonucleotídeos para utilização na mutagénese dirigida por oligonucleotídeo (eg, tamanho global, tamanho das porções que ladeiam o local de mutação), são descritos por Smith, H,eGillam S., Supra. Em geral o tamanho global do oligonucleotídeo será de modo a optimizar uma hibridação única e estável no local de mutação tendo as extensões 5' e 3' a partir do local de mutação o tamanho suficiente para evitar destruir a mutação pela actividade de exonuclease da DNA polimerase. De acordo com o presente invento os-oligonucleotí_ deos usados para mutagénese contêm geralmente cerca de 12 a cerca de 24 bases, de preferência de 14 a 20 bas^s e ainda mais preferível-de 15 a 18 bases. Terão yeralmente pelo menos cerca de três bases 3' a partir do codão alterado ou eliminaio.

0 método para preparação do gene IFN-B modificado de um modo geral envolve a indução uma mutagenase de local especifico no gene do IFN-B no codão 17 (TGT) usando um iniciador nucleotídico sintético que omite o codão ou altera-o de modo a codificar um outro aminoãcido. Quando a treonina substitui z cisteina e o iniciador é hibridado com a cadeia de sentido contrário do gene do IFN-B, o iniciador nucleotídico preferido ê GCAATTTTCACTCAG (o sublinhado incica o codão alterado. Quando ê desejável eliminar a cisteina, o iniciador preferido ê AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG, que omite o codão TGT para cis. Quando a cisteina ê substituída por serina um iniciador de 17 nucleotídicos,GCAATTTTCAGACTCAG, que inclui um codão AGT para serina ê iniciador preferido. A transição

-10-

Τ Ή da primeira base no codão cis 17 resulta na mudança de

cisteína para serina. Deve-se reconhecer que quando as elimi

nações são introduzidas, deve-se manter a fase de leitura cor

recta da sequência de DNA para expressão da proteína desejada.

0 iniciador é hibridado com um fago de cadeia simples como sejam M13, fd ou 0X174 nos quais foi clonada uma cadeia do gene de IEN-|^. Considerar-se-à que o fago pode ter quer a cadeia de sentido directo quer a cadeia de sentido contrário do gene. Quando o fago tem a cadeia de sentido contrário o iniciador é idêntico à região da cadeia codificadora que contém o codão a ser mutado com excepção para uma zona de não complementaridade com aquele codão que define a eliminação do codão ou um tripleto que codifica um outro aminoácido. Quando o fago tem a cadeia codificadora o inicia dor é complementar da região da cadeia codificadora que contem o codão a ser mutado excepto numa zona de não complementarida. de apropriada no tripleto que é emparelhado com o codão a ser eliminado. As condições que devem ser usadas na hibridação e_s tão descritas por Smith, M. e Gillam, S., supra. Á temperatura será geralmente entre cerca de O^c e cerca de 70²0, normalmen te entre 102C e 50²C. Após hibridação o iniciador é prolongado no DNA do fago por reacção com a DNA polimerase I, DNA poli merase, transcriptase reversa ou outra DNA polimerase adequada

0 dsDNA é convertido em dsDNA circular por tratamento com uma DNA ligase como"seja a DNA ligase. As moléculas de DNA con tendo regiões de cadeia simples podem ser destruídas por trata mento com a endonuclease Sl.

A mutagénese dirigida por oligonu cleotídeos pode ser idênticamente empregue para fazer um gene IL-2 mutante que codifique uma muteína tendo actividade de IL-2 mas tendo cis 125 trocado por serina 125. 0 iniciador oli gonucleotídico preferido usado para fazer este gene 11-2 mutan te quando o fago transporta a cadeia codificadora do gene é GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATC. Este oligonucleotídeo tem uma al. teração C -?G na base central do tripleto que é emparelhado com o codão 125 lo gene IL-2.

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-11Ο heteroduplex mutacional resultante é então usada para transformar um organismo ou ceiula hospedeira competentes. A replicação de heteroduplex pelo hospedeiro ori gina progénie de ambas as cadeias. Apés replicação o gene mutan te pode ser isolado a partir da progénie da estirpe mutante, inserido num vector de expressão apropriado e o vector usado para transformar um organismo ou célula hospedeira adequado.

Os vectores preferidos são os plasmídeos pBB322, pGSl e seus variantes, vectores sintéticos e similares. Organismos hospe deiros adequados são E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, varias estirpes de levedura, Baoillus thermophilus, células animais como sejam as de ratinho, rato ou células de ovário de hamster Chinês (CHO), células de plan tas, hospedeiros animais e vegetais e similares. Deve-se re conhecer que quando um hospedeiro escolhido é transformado oom o vector, são também introduzidas sequências promotor-operador adequadas de modo a ser expresso a muteína. Os hospedeiros p£ dem ser procariotas ou eucariotas (processos para inserção de DITA em células eucariotas estão descritos nos pedidos PGT nos US81/00239 e US81/00240 publicados em 3 de Setembro de 1981).

E. coli e células GHO são os hospedeiros preferidos. As muteí. nas obtidas de acordo com o presente invento podem ser glico siladas e não glicosiladas dependendo se a glicosilação ocorre na proteína parenteral nativa e do organismo hospedeiro usado para produzir a muteína. Se desejável, a muteí|Qa não glicosila da obtida quando E. coli ou um Bacillus constituem o organismo hospedeiro, se se quiser pode ser glicosilada in vitro por mo dificações químicas, enzimáticas ou de outros tipos conhecidos na especialidade.

Na execução preferida deste invento no que se respeita a IEN-^ , o resíduo de cistéina na posição 17 na sequência de aminoácidos do IFN-f’ , como se mostra na Fig. 1, é substituído por serina através de uma transição T 4 A da primeira base do codão 17 da cadeia codificadora da sequência de DNA que codifica 0 IEN-{^ maduro. A mutagenese e.s pecifica de sítio ê induzida usando um iniciador de 17 núcleo tídeos GQAATTTtPOAGAGTCAG que é idêntico a uma sequência de 17 nucleotídeos de cadeia codificadora do IFN- P na região do co

dão 17 excepto para uma única base não complementar na primei, ra base do codão 17. A não complementaridade é no nucleotídeo 12 do iniciador. Gomo se sabe 0 código genético é degenerado e muitos dos aminoácidos podem ser codificados por mais de um codão. 0 código de bases para a serina, por exemplo, é degene rado de seis modos de forma que os codões TCT, TCG, TCC, TCA, AGT e ACG todos codificam a serina. O codão AGT foi escolhido por conveniência para a execução preferida deste invento. Idên ticamente, a treonins é codificada por qualquer um dos codões ACT, ACA, ACC e ACG. Pretende-se que quando um codão é especi, ficado para um aminoácido particular ele inclui todos os codões degenerados que codificam aquele aminoácido. 0 iniciador de 17 nucleotídeos é hibridado com 0 DNA de cadeia simples do fago Ml 3 que transporta a cadeia de sentido contrário do gene IPN0 iniciador oligonucleotídeo é então prolongado no DNA usando 0 fragmento Klenow da DNA polimerase I e o dsDNA resultante é convertido em DNA circular fechado com a ligase de T4. A repli cação do heteroduplex mutacional resultante produz clones da cadeia de DNA contendo a zona não complementar. Os clones mu tantes podem ser identificados e detectados pelo aparecimento ou desaparecimento de locais de restrição específicos, resis tência ou sensibilidade a antibióticos ou ainda por outros métodos conhecidos na especialidade. Quando a cisteina é súbs tituida por serina, a transição T A, mostrada na Pigura 2, resulta na criação de um novo local de restriçãf Hinfl no gene estrutural. 0 clone mutante é identificado usando 0 iniciador oligonucleotídico como sonda num rastreio por hibridação das placas de fagos mutantes. 0 iniciador terá apenas 1 base não complementar quando hibridado com 0 parental mas terá um emp.a

relhamento perfeito quando hibridado com o DNA de fago mutado como se indica na Pigura 2. As condições de hibridação podem então ser escolhidos de modo a que 0 iniciador oligonucleotídic híbrido preferencialmente com o DNA mutado e não com o DNA parenteral. 0 local Hinfl agora gerado também serve como meio de confirmação da mutação numa única base no gene IPN- .

0 DNA do fago M13 transportamos 0 gene mutado é isolado e transposto para um vectox¹ de expressão

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apropriado, como seja o plasmídeo pTrp3 ® a estirpe MM294 de

E. ooli é transformada com o vector. Os meios de crescimento

adequados à cultura dos transformantes e da sua progénie são

conhecidos dos entendidos na matéria. A muteína expressa do

IFN-^é isolada, purificada e caracterizada.

Os exemplos seguintes são apresen tados para ajudar a uma melhor compreensão do invento e para fins ilustrativos apenas. Não devem ser pensados como limi tantes do objectivo do invento seja de que modo for. Os exem pios 1-9 descrevem a preparação de uma muteína do IFN-Os exemplos 10-15 descrevem a preparação de uma muteína da IL-2.

EXEMPLO 1

Glonagem do gene do IFN-fono vector MI3:

A utilização do vector fágico M13 como fonte de DNA molde de cadeia simples foi demonstrada por G.F. Temple et al, Nature (1982) 296:557-540. 0 plasmídeo pl^ltrp (Figura 3) contendo o gene do IFN-psob controle do pro motor trp de E. ooli, foi digerido com as enzifias de restrição Hind III e XhoTI. 0 DNA da forma replicativa (PP) do M13mp8 (J. Messing, "Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Re combinant DNA," Ed. A Walton, Elsevier Press, 145-153 (1981) (Figura 4) foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI e misturado com o DNA de ργ ltrp o qual tinha sido prévia mente digerido com HindIII e XhoII. A mistura foi então ligada com a DNA ligase de T4 e o DNA ligado usado para transformar células competentes da estirpe JM 103 de E. ooli as quais foram semeadas em placas indicadoras Xgal (J. Messing, et al, Nucleic Acids Res (1981) j): 309-321). As placas contendo fagos recombi. nantes (placas brancas) foram repicdas, inoculadas em meio de cultura fresco para JM 103 ® minipreparativos de moléculas FR preparados a partir de células infectadas (H.D. Birnboim and

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J. Doly, Nucleic Acid Res (1979) JZ, 1513-1523). As moléculas RE foram digeridas com várias enzimas de restrição para iden tificar os clon.es contendo a inserção IEN-^. 0 mapa de restrji ção de um desses clones (M13 -?Ί) está apresentado na Eigura 5. 0 DITA fágico de cadeia simples (ss) foi preparado a partir do clone M13-^ 1 para servir como molde à mutagénese "específi. ca de sítio" usando um oligonucleotídeo sintético.

EXEMPLO 2

Mutagénese específico de sítio

Quarenta picomoles do oligonucleotí deo sintético GGAATTTTGAGAGTCAG (iniciador) foram tratadas com cinase de T4 na presença de trifosfato de adenosina (ATP) 0,1 mM, hidrocloreto de hidroximetilaminometano (Tris-HCl) 50 mM pH 8,0, MgCl2 10 mM, ditotreitol (DTT) 5 mM e 9 unidades de cinase de T4, em 50 pl a 37°c durante 1 hora. 0 iniciador tratado com cinase (12 pmoles) foi hibridado com 5 hg de ss DNA de M13-^ 1 em 50 p-1 de uma mistura contendo NaCl 50 mil, Tris-HCl 10 mil, pH 8,0, IlgOlg 10 mil βψ -mercaptoetanol 10 mil, aquecendo a 67^{* 2 * * * * * *}G durante 5 minutos e a 42^C durante 25 min.

A mistura hibridada foi então arrefecida em gelp e depois adi cionada a 50 μΓ de uma mistura de reacção contendo 0,5 mli de cada um dos trifosfatos de deoxinucleosido (dNTP), Tris-HCl 80 mM, pH 7,4, HgClg 8 mM, NaCl 100 mM, 9 unidades do fragento Klenow da DITA polilerase I, ÁTP 0,5 mM e 2 unidades de DITA ligase de T4, incubada a 37²C durante 3 horas e a 25⁹C durante

2 horas. A reacção foi então terminada por extracção com fenol

e precipitação com etanol. 0 DxTA foi dissolvida em Tris-HCl

10 mH pH 8,0, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 50% de

sucrose e 0,05% he azul de bromofenilo e sujeito a electrofo

rese num gel de 0,8% de agarose na presença de 2 |ig/ml de

brometo de etídio. As bandas de DITA correspondentes às formas

RE do 1113-í²1 foram eluídas de fatias de gel pelo método do

perclorato (R. W. Davis, et al, "Advanced Bacterial Genetics",

-15Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. p. 178-179 (1980))* 0 LNA eluido fòi usado para transformar células JM103 competentes, as quais foram crescidas durante a noite e o ss ΠΝΑ isolado do sobrenadante da cultura. Este ss DNA foi usado como molde num segundo ciclo de extensão do iniciador, as formas EP do LUA purificadas através do gel foram usadas para transformar células JM 103 competentes, que foram semeadas em placas de agar e incubadas durante a noite para obter placas de fagos.

EXEMPLO 3

Mutagénese especifica de sitio

Eepete-se a experiência do Exemplo 2 acima excepto no que respeita ao iniciador oligonucleotídico sintético usado que é neste caso GCAATTTTCAGACTCAG para substi tuir o codão 17 do gene IPN-^que codifica a cisteína por um que codifique a treonina.

EXEMPLO 4

Deleção específica de sítio

II

A experiência do Exemplo 2 ê rep_e tida com excepção do iniciador oligonucleotídico sintético usa. do que ê neste caso com AGOAATTTTCAGOAGAAGOTOOTG para eliminar o codão 17 do gene IEN-y .

EXEMPLO 5

Rastreio e Identificação de Placas Mutagenizadas

Caixas contendo placas de M13-^1 mutado (Exemplo 1) assim como duas caixas contendo placas de fago M13-^l não mutado, foram arrefecidas até 4^0 e as placas de cada uma das caixas transferidas para dois círculos de fil

-16-

tro de nitrocelulose colocando um filtro seco sobre a placa de

agar durante 5 min para o primeiro filtro e 15 min para o segun

do filtro. Os filtros foram então colocados sobre papéis de fil

tro espessos embebidos em NaON 0,2 N, NaCl 1,5 M e 0,2% de Tri.

ton X-100 durante 5 min θ neutralizados colocando-os sobre pa

péis de filtro embebidos em Tris-HCl 0,5 M pH 7,5 e NaCl 1,5 M

durante mais 5 min. Os filtros foram lavados de um modo idênticc

em filtros embebidos em SSC 2 x (citrato salino "Standard"), se.

cos e depois metidos num forno de vácuo a 80^0 durante 2 hr.

Os filtros em duplicado foram pré-hibridados a 55^SG durante 4

hr com 10 ml por filtro de tampão de hibridação de DNA (SSO 5

x) pH 7,0, solução de Denhardt 4 x (polivinilpirrolidina, ficol

e albumina de soro bovino, 1 x = 0,02% de cada), 0,1% de dode.

citeulfato de sódio (SD3), tampão fosfato de sódio 50 mH pH 7,θ

e 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. A sonda 32

marcada com P foi preparada por fosforilaçao do iniciador oligonucleotídico com ATP marcado com Os filtros foram hi

bridados com 3,5 x 10 cpm/ml do iniciador marcado com ^y P em 5 ml por filtro de tampão de hibridação de DNA a 55²G durante 24 horas. Os filtros foram lavados a 55-0 durante 30 min cada em tampões de lavagem contendo 0,1% de SDS e quantidades decres. centes de SSC. Os filtros foram lavados inicialmente com tampão contendo SSC 2 x e os filtros testemunha contendo placas de fago 1113-^1 não mutado foram testadas relativamente à presença de qualquer radioactividade usando um contador Geiger. A con centração de SSO. foi baixada passo a passo e os filtros lavados até não permanecer qualquer radiocatividade detectável nos fil tros testemunha com as placas de M13-f^?1 não mutado. A concen tração mais baixa de SSC foi de SSC 0,1 x. Os filtros foram secos ao ar e autoradiografados a -70^0 durante 2-3 dias. Poi feito rastreio a 480 placas de IÍ13-pl mutado e a 100 placas testemunha não mutadas usando a sonda oligonucleotídica fosfo. rilada. Nenhuma das placas testemunha hibridou com a sonda en quanto que 5 placas de Ml3-VI mutado hibridaram com a sonda.

Uma das cinco placas de M13-p 1

mutado (M13-SY25O1) foi colhida e inoculada numa cultura de JM 103- 0 ss DNA foi preparado a partir do sobrenadante e o DNA de cadeia dupla (ds) foi preparado a partir do sedimento

de células. 0 ss DNA foi usado com o molde para a dideoxi-se.

quenciação do clone usando o iniciador universal de M1J. 0 ra

sultado da análise da sequência ê mostrado na Figura 6, confir

mando quo o codão TGT para a eis foi convertido no codão AGT

para ser.

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EXEMPLO 6

-17-

Expressão de IFN-vmntado em E. coli

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0 DNA ER de M13-SY2501 foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e YhoII e o fragmento de inserção de 520 pb purificado num gel de 1% de agarose. 0 pias, mídeo pTrp3 contendo o promotor trp de E. coli (Figura 7) foi digerido com as enzimas HindIII e BamHI , misturado com o frag mento de DNA de M13-SY25O1 purificado e ligado na presença de DNA ligase de T4. 0 DNA ligado foi usado para transformar a esi tirpe MM294 de E. coli. Os transformantes resistentes à ampici lina foram testados relativamente à sensibilidade à droga tetra ciclina. 0 DNA dos plasmídeos de cinco clones resistentes à am picilina e sensíveis à tetraciclina foi digerido com Hinfl para detecção da presença da inserção de M13-SY2501. A Figura 84 mostra o padrão de restrição de um dos clones (pSY2501), cornpa rando-o com o padrão Hinfl do clone de IFN-^ opiginal, ppltrp. Como se esperaVa, há um local Hinfl adicional no pSY2501, cor tando o fragmento interno do IFN-^de 197 pb num fragmento de 169 pb e noutro de 28 pb (Figura 8b). Na Figura 9 θ apresenta do um mapa de restrição do clone pSY2501. A sequência completa do DNA do gene IFN-^) mutante é mostrada na Figura 10 juntamente com a sequência de aminoacidos prevista.

0 plasmídeo designado por clone

pSY2501 está depositado na Agricultural Research Culture Oolle^ tion (NRRL), Fermentation Laboratory, Northern Regional Research Oenter, Science and Education Administration, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Feoria, Illinois 60604 e está regstado com os números de acesso GMOO NS 1533

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e NRRL N2 B-15356.

As culturas de pSY2501 e p^ltrp, que incluem as respectivas progénies, foram cultivadas até uma densidade óptica (ΒΟθ^θ) de 1,0. Os extractos sem células foram preparados e quantidade de actividade anti-viral do ΙΕΊΊ- ^tes^ tada em células GM2767 num teste de microtitulação.

Os extractos do clone pSY2501 apre. sentaram três a dez vezes maior actividade do que os do ppltrp (Tabela 1), indicando assim que 0 clone pSY2501 ou estava a sintetizar mais proteína com actividade de IFN- ou que a pro. teína sintetizada tinha uma actividade específica mais elevada.

TABELA I

Extracto Actividade antiviral (U/ml)

pSY2501 6 x 10⁵

p ltrp 1 x 10^

ptrpj (testemunha) 30

»

Para determinar se 0 clone pSY2501 estaria a sintetizar várias vezes mais proteína activa, os ex tractos de ambos os clones foram submetidos a electroforese num gel de SDS-poliacrilamida juntamente com um extracto testemunha e 0 gel foi corado com azul Coomasie para se visualizar as pro. teínas. Como se mostra na Figura 11, havia apenas uma banda proteica correspondendo a uma proteína com um peso molecular aparente de 18 000 daltons que estava presente nos extractos dos clones pSY2501 e p ltrp mas não no extracto testemunha do ptrp3. Esta proteína, que tem um peso molecular de cerca de 20 000 daltons mas que apresenta um padrão de migração em gel de uma proteína de 18 000 daltons mostrou-se préviamente ser 0 IFN-U? por purificação desta proteína a partir de extractos de

pyltrp. Uma vez que há menos desta proteína nos extractos de

pSY25Ol do que nos extractos de p^ltrp, a aetividade específi

ca da proteína nos extractos do clone pSY25Ol era mais elevada

do que a do clone pfoltrp.

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EXEMPLO 7

Purificação de IPN-^¹ _serjr?í

0 _serq? foi recuperado a par

tir de E. coli que tinha sido transformada para produzir IENserl7* A E. coli cresceu no meio de crescimento seguinte até UOggQ = 10-11 (peso seco 8,4 g/1).

Ingrediente	Concentraçí
Ntí^Ol	20 mM
k₂so₄	16,1 mlí
kh₂p°₄	7,8 mM
Na^HPO^	12,2 mM
MgSO₄ ,7H₂0	3 mM
Citrato de Na₂.2H_n0	1,5 mM
MnS0₄.4H₂0	30 pM
ZnS0₄.7H₂0	30 pM
CuS0₄.5H₂0	3 pM
L-triptofauo	70 mg/1
PeS0₄.7H₂0	72 pM
tiamina Ή01	20 mg/1
glucose	40 g/1

controle do pH com NH^OH

-20-

Uma colheita de 9,9 1 (9,9 kg) de E. coli transformada foi arrefecido para 2020 e concentrado fazendo passar a colheita por um filtro de fluxo transversal a um gotejar de pressão média de !%110 Kpa e velocidade de flu xo do filtrado com o valor constante de 260 ml/min até o peso do filtrado ser de 8,8 kg. 0 concentrado (aproximadamente um litro) foi decantado para um recipiente e arrefecido até 15²0. As células no concentrado foram então rompidas por passagem do concentrado através de um homogenizador Manton-Gaulin a 5²C, ^69,000 Kpa. 0 homogenizador foi lavado com um litro de tampão fosfato salino, pH 7,4 (PBS) e o líquido de lavagem foi adicionado ao material homogeneizador para dar um volume final de dois litros. Este volume foi centrifugado continuamen te a 12000 x g a uma velocidade de fluxo de 5θ ml/ml. 0 sólido foi separado do sohrenadante e ressuspenso em quatro litros de PBS contendo 2% por peso de SDS. Esta suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante 15 min após o que não havia material visível em suspensão. A solução foi então extraída com 2-butanol numa razão de volumes de 1:1 de 2-butanol: volu me de solução. A extracção foi efectuada num separador de fases líquida-líquida usando uma velocidade de fluxo de 200 ml/min. A fase orgânica foi então separada e evaporada até secagem para dar 21,3 g de proteína. Esta foi ressuspensa em água destilada numa razão de volumes de 1:10.

I»

0 produto recuperado foi testado relativamente à actividade de IFN-^ humano usando um teste baseado na protecção contra efeito citopático virai (CPE). 0 teste foi feito em placas de microtitulação. Cinquenta pl de de meio minimo essencial foi distribuído por cada poço e 25 p.1 da amostra foi colocado no primeiro poço e feitas dilui, ções seriadas de 1:3 volumes nos poços seguintes. Vírus (estomatite vesicular), células (fibroblastos humanos linha GM-2767) e testemunhas IPK-^de referência foram incluídos em cada placa. 0 IFN-Í^de referência usado foi de 100 unidades por ml. As placas foram então irradiadas com luz UV durante 10 min. Após irradiação adicionou-se a cada poço 100 ul da suspensão celular (1,2 x 10^y células/ml) e incubou-se durante 18-24 hr.

-21A cada poço excepto à testemunha

células adicionou-se uma solução de vírus a uma unidade forma

dora de placas por célula. Incubou-se de novo até a testemunha

vírus apresentar 100% de CPE. Isto aconteceu normalmente 18-24

hr após a adição da solução de vírus. Os resultados do teste

foram interpretados em relação à localização do poço de 5θ% de

OPE da testemunha IER-V de referência. A partir deste ponto

determinou-se o título de interferão para todas as amostras

da placa. A actividade especifica do produto recuperado deter n

minou-se ser 5 x 10' U/mg.

EXEMPLO 8

Precipitação ácida e purificação cromatográfica

0 processo do Exemplo 7 foi repeti, do excepto que após extracção e separação das fases aquosa e orgânica e mistura da fase orgânica com PBS numa razão de volu mes de 5:1 o pH da mistura foi baixado para cerca de 5 através da adição de ácido acético glacial. 0 precipitado resultante foi separado por centrifugação a 10000-17000 x g durante 15 min e o sedimento foi redissolvido em 10% p/v de SDS, DTT 10 mM tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5 e aquecido a 802G durante 5 min. I

A solução foi então aplicada a uma coluna "Aquapore" de 10 pM, Brownlee EP-300, usando um sistema de gradiente Beckman. 0 tampão A era 0,1% de ácido trifluoro acético (ΤΪΆ) em HgO; o tampão B era 0,1% de TE A em acetonitri lo. A detecção foi feita por absorvância de ultravioletas a 280 na . 0 programa do solvente era gradiente linear de 0% do tampão B a 100% do tampão B em três horas. As fracções contendo actividades de interferão mais elevadas foram reunidas e deter minada a actividade específica da preparação de interferão reu

rg o

nido que se verificou ser de 9,0 x 10' a 3,8 x 10 unidades in

Q

ternacionais por mg de proteína, comparado com cerca de 2 x 10 U/mg de IFN-pnativo.

-22EXBHPLO 9

Caracterização bioquímica do IEN- (% serl7

Determinou-se as composições em aminoácidos após 24-72 hr de hidrólise de amostras de 40 de IEN em 200 μΐ de HG1 5,7 N, 0,1% de fenol, a 108^0. A pro lina e a cisteína foram determinadas do mesmo modo após oxida ção com o ácido perfórmico; neste caso, o fenol foi omitido da hidrólise. 0 triptofano foi analisado após 24 hr de hidrólise de amostras de 400 pl em HG1 5,7 N, 10% de ácido mercaptoacétic (sem fenol). A análise foi efectuada num analisador de amino ácidos Beckman 121MB usando uma única coluna de resina AA10.

A composição em aminoácidos calcu lada a partir de hidrólises ácidas representativas de 24, 48 e 72 hr do IEN-jp _ser]_7 purificado está de acordo com a prevista através da sequência do DRA dos clones do gene IEN, menos a metionina N-terminal ausente.

A sequência de aminoácidos dos 58 primeiros resíduos da terminação amino do IEN purificado foi determinada numa amostra de 0,7 mg num sequenciador Beckman 8900 com tampão Quadrol 0,1 M. Os aminoácidos PT11 foram deter minados por HPLG de fase reversa numa coluna ODS ultraesfera Altex (4,6 x 250 mm) a 45-0 eluída a 1,3 min a 40% de tampão B e 8,4 min de 40-70% de tampão B, onde o tampão A era aceta to de sódio 0,0115 M, 5% do tetra-hidrofurano (THE), pH 5,11 e tampão B era 10% de THE em acetonitrilo.

A sequência de aminoácidos da ter minação N do IEN- P_serp2 determinada corresponde à sequência esperada predicta a partir da sequência do DNA, excepto para a ausência da metionina N-terminal.

Gomo se indicou acima, a prepara, ção de apresenta níveis de actividade específica muito próximos ou melhores do que cs do IEN-^nativo.

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Ο IFN- (?_serl7 não tem grupos sul fidrilo livres, mas parece tem uma ligação -S-S- entre as úni cas cisteínas restantes nas posições 31 e 141, À proteína não forma facilmente oligómeros e parece estar substancialmente na forma monomérica. 0 IFN- (^_serQ_y obtido de acordo com este invento pode ser formulado quer como um produto único ou como mistura de várias formas para preparações farmacêuticamente aceitáveis em veículos fisiologicamente compatíveis inertes não tóxicos, não alergênicos para uso clinico e terapêutico na terapia do cancro ou em condições onde a terapia com inter ferão seja indicada e para infecções virais, '4ais veículos in cluem mas não estão limitados a água destilada, salino fisio lógico, solução de Ringer, solução de Hank e similares. Rodem também ser incluídos estabilizadores não tóxicos e aditivos solubilizantes tais como dextrose, HSA (albumina de soro huma. no) e similares. Às formulações terapêuticas podem ser adminis tradas oralmente ou parenteralmente como seja em administraçõe^ intravenosas, intramusculares, intraperitoneais e subcutâneas. As preparações de modificado do presente invento podem

também ser usadas para aplicação tópica nos meios apropriados normalmente utilisados para esse fim.

As principais vantagens da muteína do IFll-acima descrita reside na eliminação de um grupo sulfi drilo na posição 17 do IPN-p, forçando destepmodo a proteína a formar ligações di-sulfureto correctas entre cis 31 e eis 141 e a assumir a conformação estensivamente necessária a uma completa actividade biológica. A actividade especifica aumenta da do IFN- ^_serqrj permite a utilização de pequenas dosagens para fins terapêuticos. Através da eliminação da cisteína na posição 17 e eliminação do grupo -SH livre, a proteína IETT- ^η^° ^íorma dímeros e oligomeros tão facilmente como o

IRH- fi produzido por microorganismos. Isto facilita a purifica ção da proteína e aumenta a sua estabilidade.

-24ΕΧΕΗΡ10 10

A sequência de nucleotídeos de um clone de cDNA codificando a 11-2 humana, processos para a pre. paração de livrarias de cDNA de IL-2 e rastreio dos mesmos relativamente à IL-2 estão descritos por Taniguchi 1., et al, Nature (1985) Vol 24, p 305 e seguintes.

As livrarias de cDNA enriquecidas em clones potenciais de cDNA de 11-2 foram feitas a partir de fracções de mRNA enriquecidas em 11-2 ohtidas a partir de lin fócitos do sangue periférico (PBL) e células Jurkat induzidas por métodos convencionais. 0 enriquecimento do mRNA em mensagei ro para 11-2 foi feito por fraccionamento do mRNA e identifica ção da fracção tendo actividade de mRNA de 11-2 através da in jecção das fracções em oócitos de Xenopus laevis e testando os lisados de oócitos relativamente à actividade de 11-2 em célu las HT-2 (J. Watson, J. Exp. lled (1979) 150: 1570-1519 e S. Gillis et al, J. Imomun (1978) 120: 2027-2032).

EXEMPLO 11

Rastreio e identificação dos clones de cDNA de 11-2

í

As livrarias de cDNA de IL-2 foram testadas usando o processo de hibridação de colónias. Cada pia ca de microtitulação foi transferida para duplicado de papéis de filtro de nitrocelulose (S &, S tipo BA-85) e as colónias foi deixadas crescer a 39-G durante 14-16 horas em agar 1 contendo 50 p.g/ml de ampicilina. As colónias foram lisadas e o DNA fixa do ao filtro por tratamento sequencial durante 5 min com NaOn 500 mM, NaGL 1,5 M, lavadas duas vezes durante 5 min de cada vez com citrato salino "Standard" (CSC) 5 x. Os filtros foram secos ao ar e incubados a SO^C durante 2 horas. Os filtros em duplica do foram prê-hibridados a 4220 durante 6-8 hr com 10 ml por filtro de tampão de hibridação de DNA (50% de formamida, SSC 5 x pH 7,0, solução de Denhardt (polivinilpirrolidina, mais

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ficol e albumina de soro bovino; 1 x = 0,2% de cada), Tampão

fosfato de sódio 50 Λ a pH 7,0, 0,2% de SLS, 20 |ig/ml de Poli

U e 50 jig/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado.

Preparou-se uma sonda de 20 oli.

32

gonucleotideo marcada com ' P baseado na sequência do gene 11-2 divulgada por Tanigucbi, T., et al, supra. A sequência de nu cleotídeos da sonda era GTGGGGTTGTTGGGOATGTA.

As amostras foram hibridadas a

4220 durante 24-36 hr com 5 ml/filtro de tampão de hibridação 32

de DNA contendo a sonda de cDNA marcada com P. Os filtros foram lavados duas vezes durante 30 min de cada vez a 50²0 com SSC 2 x, 0,1% de SDS, depois lavados duas vezes com SSO 1 x e 0,1% de SDS a 5020 durante 90° min, secos ao ar e autoradiogra fados a -7020 durante 2 a 3 dias. Os clones positivos foram identificados e testadas novamente com a sonda. Olones de ta manho completo foram identificados e confirmados por mapas de enzimas de restrição e comparação com a sequência do clone de cDNA de IL-2 divulgado por Taniguchi, T., et al, supra.

EXEMPLO 12

Olonagem do gene IL-2 no vector M13 >

0 gene IL-2 foi clonado no M13mp9 como descrito no Exemplo 1 usando o plasmídeo pLWl (Eigura 12) contendo o gene IL-2 sob o controle do promotor trp de E. coli Uma amostra de pLWl foi depositada na American Type Oulture Oollection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, em 4 de Agosto de 1983 e foi-lhe atribuido o número ATCG 39405. Na Eigura 13 ê apresentado o mapa de restrição de um cio ne (designado M13-IL-2) contendo a inserção IL-2. Preparou-se DNA fáfico de cadeia simples a partir do clone M13-IL2 para servir como molde para a mutagénese dirigida por oligonucleotí deos.

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-26EXEMPEO 15

Mutagénese dirigida por oligonucleotideos

Gomo se indicou préviamente, 11-2 contem resíduos de cisteína nas posições de aminoácidos 58, 105 e 125. Baseado nas sequências de oligonucleotideos das porções de gene IL-2 que contém os codões para estes três resíduos de cisteína foram planeados e sintetizados três iniciadores oligo nucleotídicos para mutação dos codões destes três resíduos subjs tituindo-os por codões para serina. Estes oligonucleotideos têm as sequências seguintes:

OTTCTAGAGACTGCAGATGTTTC (DM27) para mudar para cis 58,

CATCAGGATACTCAGAGATGAATG (DM28) para mudar para cis 105 e GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC (DM29) para mudar para cis 125.

Quarenta picomoles de cada oligo. nucleotideo foram tratadas oom cinase separadamente na presença de ATP 0,1 mM, Tris-HGl 50 mM, pH 8,0, MgClg 10 mil, DTT 5 mM e 9 unidades de cinase de T^ em 50 jul a 37²G durante 1 hr. Cada um dos iniciadores tratados com cinase (10 pmoles) foi hibrida do com 2,6 pg de ss DNA de M13-IL2 em 15 pl de uma mistura con tendo NaGl 100 mM, Tris-HGl 20 mM, pH 7,9, MgCl^ 20 mM e |^-mer captoetanol 20 mM, por aquecimento a 67-G durante 5 min e a 422 G durante 25 min. As misturas ligadas foram arrefecidas em gelo e depois ajustadas para um voluàe final de 25 μΐ de uma mistura de reacção contendo 0,5 mM de cada dNTP, Tris-HGl 17 mH, pH 7,9 MgClg 17 mM, NaCl 83 mM, -mercaptoetanol 17 mM, 5 unidades do fragmento Klenow da DNA polimerase I, ATP 0,5 mH e 2 unidades de DNA ligase de T^, incubado a 37²C durante 5 hr. as reacções foram paradas por aquecimento para 802C e as misturas de reaç, ção foram usadas para transformar células JM103 competentes, semeadas em placas de agar e incubadas durante a noite para se obter placas de fagos.

-27-

EXEMPLO 14

Rastreio e identificação das placas de fago mutagenizado

Caixas contendo placas de M1J-IL2 mutagenizado assim como 2 caixas contendo placas de M13-IL2 não mutagenizado foram arrefecidas para 420 e as placas de fa gos de cada caixa foram transferidas para dois círculos de fil tro de nitrocelulose pondo um filtro seco sobre a placa de agar durante 5 min para o primeiro filtro e 15 min para o segundo filtro. Os filtros foram então colocados sobre papéis de filtro espessos embebidos em NaOH 0,2 N, NaCl 1,5 M e 0,2% de Triton durante 5 min e neutralizados através da sua colocação sobre papéis de filtro embebidos em Tris-HCl 0,5 H, pH ?,5 e NaCl

1,5 M durante outros 5 min. Os filtros foram lavados de um modo idêntico duas vezes em filtros embabidos em SSO 2 x, secos e incubados num forno de vácuo a 3020 durante 2 hr. Os filtros em duplicado foram pré-hibridados a 4220 durante 4 hr com 10 ml por filtro de tampão de hibridação de DNA (j.uC 5 x, pH 7,0, solução de Denhardt (polivinilpirrolidina, ficol e albumina do soro bovino, 1 x = 0,02% de cada), 0,1% de 8DS, tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0 e 100 jug/ml de DNa de esperma de salmão desnaturado. As sondas marcadas com ^P foram preparadas por tratamento com cinase dos iniciadores oligonucleotídicos com

ATP marcado. Os filtros foram hibridados com O,jL x 10^ cpm/ml

3?

de iniciadores marcados com “P em 5 ml por filtro de tampão de hibridação de DNA a 422C durante 8 horas. Os filtros foram lavados duas vezes a 5020 durante 30 min cada em tampões de lavagem contendo 0,1% de SDS e ,330 2 x e duas vezes a 50^eC du rante 30 minutos cada com 0,1% de SDS e 830 0,2 x. Os filtros foram secos ao ar e autoradiografados a -7020 durante 2-3 dias,

Uma vez que os iniciadores oligo nucleotídicos DM28 e DM29 foram planeados de modo a criarem um novo local de restrição Ddel nos clones mutagenizados (Figura 14), DNA-FR de uma série de clones que hibridacam com cada um dos iniciadores tratados com cinase digeridos com a enzima de restrição Ddel. Uma das placas de M13-IL2 mucagenizada que hi

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bridava com o iniciador DM28 e que tinha um novo local de res. trição Ddel (M13LW44) foi recolhida e inoculada numa cultura de JM1O3) ss DNA foi preparado a partir do sobrenadante de cul tura e dsDNA-RP foi preparado a partir do sedimento de células. De um modo idêntico, uma placa que hibridava com o iniciador DM29 foi colhida (M15-LVÍ46) e ss DNA e DNA-FR preparados a par tir dela. 0 iniciador oligonucleotídico DM2? foi planeado de modo a criar um novo local de restrição Pstl em lugar de um lo cal Ddel . Portanto, as placas que hibridaram com este inicia dor foram testadas relativamente à presença de um novo local Pstl. Uma dessas placas de fagos foi identificada (M13-LW42) e preparados ss DNA e DNA PR a partir dela. O DNA de todos os três destes clones foram se queixei ado s para confirmar que os co dões TGT da cisteína tinham sido convertidos num codão TOT para a serina.

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EXEMPLO 15

Reclonagem do gene IL-2 mutagenizado para expressão em E. coli

0 DNA PS de M13-LW42, M13-LW44 e M13-LW46 foi cada um digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamII e os fragemntos de inserção purificados a par tir de um gel de 1% de agarose. De um modo semelhante, o pias, mídeo pTrpã (Figura 7) foi digerido com HindIII e BamIIo frag. mento maior do plasmídeo contendo o promotor trp foi purificado num gel de agarose e depois ligado a cada um dos fragmentos de inserção isolados a partir de M13-LU42, H13-LW44 e M13-LW46.

Os plasmídeos ligados foram usados para transformar a estirpe competente MM294 de E. coli K12. Os DNAs dos plasmídeos destes transformantes foram analisados através de mapas de enzimas de restrição para confirmar a presença dos plasmídeos pLW42,pLV44 e pLV46. A Figura 14 ê um mapa de restrição do pLW46. Quando cada um destes clones individuais foi crescido na ausência de triptofano para induzir o promotor trp e os extractos sem célu las analisados em geis de SDS-poliácrilamida, todos os três cio. nes, pLW42, pLW44 e pLW46 verificou-se sintetizar uma proteína

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-29de 14,5 kd semelhante è encontrada na testemunha positiva, pLW21, que se demonstrou sintetizar uma proteína IL-2 de 14,4 kd. Quando estes mesmos extractos foram submetidos a um teste para detectar a presença de aetividade IL-2 em células de ra tinho HT-2, apenas os clones pLV2l (testemunha positiva) e pLW46 tinham quantidades significantes de aetividade IL-2 (Ta bela II abaixo), indicando que cis 58 e cis 105 são necessários para a aetividade biológica e a sua troca por serinas (pLVJ42 e pLU44 respectivamente) resultou na perda de aetividade bioló gica. Por outro lado cis 125 não deve ser necessário para a aetividade biológica porque a sua substituição por ser 125 (pLW46) não afectou a aetividade biológica.

Tabela II

Clones

Aetividade IL-2 (p/ml)

pIL2-7 (testemunha negativa) 1

pLW21 (testemunha positiva) 113,000

pLW42 G60

pLV/44 1,990

pLV/46 123,000

Ά. Pigura 15a mostra a sequência de nucleotídeos da cadeia codificadora do clone pL;/46. quando comparado com a cadeia codificadora do gene da IL-2 humana na tiva, 0 clone pLV/46 tem uma única base alterada G -> C 110 núcleo tídeo 374. A Pigura 15b mostra a correspondente sequência de aminoácidos da muteína IL-2 codificada pelo pL'a/46. Esta muteína é designada por À^ua-ⁿAo comparada com a IL-2 nativa

a muteína tem uma serina em vez de uma cisteina na posição 125.

Uma amostra da estirpe Ϊ11254 de E. coli K12 transformada com pLU46 foi depositada na American Type Culture Gollection, 12301 Parklav/n Drive, Rockville, Ilar^r

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'Λ ·land 20852, USA em 26 de Setembro de 1983 e foi registada com o Número ATCC 39,452.As muteínas de IL-2 em que a cisteína na posição 125 foi eliminada ou substituída por um outro aminoácido, como ê o caso da muteína ^IL"²serl25’ ^retêm actividade IL-2.Elas podem, por esse facto ser formuladas e usadas do mesmo modo que IL-2 nativa.Assim, tais muteínas de IL-2 são úteis no diagnóstico e tratamento de infecções por bactérias vírus, protosoãrios e fungos parasitas;nas manifestações de linfoquina ou imuno-deficiência; para reconstituição das funções imunes normais em humanos idosos e animais; no desenvolvimento de testes de diagnóstico tais como os que empregam a amplificação de enzimas, marcação radioactiva, imagem radiológica e outros métodos conhecidos na especialidade para controle de níveis de IL-2 no estado de doença; para a promoção do crescimento de células I in vitro para fins terapêuticos e de diagnóstico para bloqueamento dos locais receptores das limfoquina; e em várias outras aplicações terapêuticas de diagnóstico e de pesquisa.As várias aplicações terapêuticas e de diagnóstico da IL-2 humana foram investigadas e divulgadas por

S.A.Rosenberg,E.A.Grimm, et al, A. Mazumder, et al e E.A.Grimm e S.A. Rosenberg.As muteínas de IL-2 podemser usadas por si só ou em combinação com outras células B ou T imunológicamente relevantes ou com outros agentes terapêuticos.Para aplicações terapêuticas ou de diagnóstico podem ser formuladas em meios transportadores fisiológicamente compatíveis não tóxicos e não alergêniços, tais como água destilada, solução de Ringer, solução de Hank, salino fisiológico e similares.As administrações das muteínas de IL-2 a humanos ou animais podem ser orais, intrapeitoneais, intramusculares ou subcutâneos como parecem apropriado pelo médico.Exemplos de células relevantes são as células B ou T, células naturalmente assassinas e similares e como exemplo de reagentes terapêuticos que podem ser usados em combinação com os polipeptideos deste invento podem ser os vários interferões, especialmente o interferão gama, o factor de crescimento de células B,IL-1 e similares.As gamas de dosagem de muteína sintética são de atê 2 milhões de unidades por M2(sobrescrito 2) do corpo humano quando administrada como uma infusão contínua ou até 1 milhão de unida des por M2 (sobrescrito 2) quando administrada como um bolus intravenoso ou intramuscular.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1-, - Processo de preparação de muteina sintética de uma proteína biologicamente activa tendo pelo menos um residuo de cisteina que se encontra livre para formar uma ligação de di-sulfureto e que não ê essencial para a referida actividade biológica, muteina essa que tem pelo menos um dos referidos resíduos de cisteina substituído por um outro aminoácido caracterizado por compreender a cultu ra de uma célula hospedeira ou organismo recombinantes que foi transformada com um vector de expressão incluindo um gene estrutural que codifica a muteina sintética, ou a progênio da referida célula ou organismo e a recolha da muteina sintética da cultura.

2⁵ . - Processo de acordo com

a reivindicação 1, caracterizado por existir apenas um dos referidos resíduos de cisteina.

3^S. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os referidos» resíduos de cisteina serem substituidos por serina, treonina, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, histidina, tirosina, fenilalanina, triptofano ou metionina.

4^â. - Processo de acordo com

a reivindicação 1, caracterizado por os referidos resíduos de cisteina serem substituidos por serina ou treonina.

5^â. - Processo de acordo com

a reivindicação 1, caracterizado por a proteína ser IFN-p, IL-2, factor de necrose tumoral, factor, factor-1 estimulador de colónias, ou IFN- / 1.

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A65. - Célula ou organismo recombinantes caracterizada por a célula recombinante ou organismo ser transformada com um vector de expressão que se inclui um gene estrutural que codifica uma muteina sintética de uma proteína biologicamente activa tendo, pelo menos um residuo de cisteína que se encontra livre para formar uma ligação de di-sulfureto e que não ê essencial à referida actividade biológica, tendo a muteina pelo menos um dos referidos resíduos de cisteína substituido por um outro aminoâcido, e a progénie da referida célula recombinante ou organismo.

75. - Célula ou organismo recombinantes de acordo com a reivindicação 6, caracterizada ainda por existir apenas um dos referidos resíduos de cisteína.

8-. - Célula ou organismo recombinantes de acordo com a reivindicação 6, caracterizada ainda por os referidos resíduos de cisteína serem substituídos por serina, treonina, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, histidina, tirosina, fenilalanina, tniptofano ou metionina. "

95. - Célula ou organismo recombinantes de acordo com a reivindicação 6, caracterizada ainda por os referidos resíduos de cisteína serem substituídos por serina ou treonina.

10®. - Célula ou organismo recom binantes de acordo com a reivindicação 6, caracterizada ainda por a proteína ser IFN-^3, IL-2, linfotoxina, factor-1 estimulador de colónias ou IFN-«( 1.

11-. - Célula ou organismo recombinantes de acordo com a reivindicação 6, caracterizada ainda por a proteína ser 0 IFN-p, 0 residuo de cisteína estar na posição 17 do IFN-B e 0 residuo de cisteína ser subs_

tituido por um resíduo de serina.

12^a. - Célula ou organismo

recombinantes de acordo com a reivindicação 11, caracteriza^ da ainda por a muteína ser não-g 1 icosi 1 ada .

recombinantes de acordo da ainda por a proteína estar na posição 125 da tituido por serina.

13^a. - Célula ou organismo com a reivindicação 6, caracterizaser a IL-2, o resíduo de cisteina IL-2 e o resíduo de cisteina ser subs

14^a. - Célula ou organismo recombinantes de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por a muteina ser não-g1icosi1ada.

15^a. - Método para evitar que uma proteína tendo pelo menos um resíduo de cisteina que se encontra livre para formar uma ligação de di-sulfureto forme a referida ligação caracterizado por se alterar a proteína mutacionaImente substituindo o resíduo de cisteina por um outro aminoácido.-"

16^a. - Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado ainda por a proteína ser biologicamente activa e a cisteina não ser essencial para a referida actividade biológica.

17^a. - Método de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado por o resíduo de cisteina ser substituído por serina ou treonina.

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18^â. - Método de acordo com a

reivindicação 15, caracterizado ainda por a proteína ser o IFN-JJ IL-2, linfotoxina, factor-1 estimulador de colonias ou IFN-<1.

195. _ Método de acordo com a

reivindicação 15, caracterizado ainda por a proteína ser o IFN-p o residuo de cisteina estar na posição 17 do IFN-j3 e o residuo de cisteina ser substituido por um residuo de serj^ na.

202. _ Processo para a preparação de muteina sintética, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a proteína ser o IFN-p, o residuo de cisteina estar na posição 17 do IFN-p e o residuo de cisteina estar substituido por um residuo de serina.

212. _ Método para produzir um gene que codifica uma muteina sintética de uma proteína biologicamente activa tendo pelo menos um residuo de cisteina que estã livre para formar uma ligação de di-sulfureto e

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que não ê essencial â referida aetividade biologica, tendo a referida muteina pelo menos um dos referidos resíduos substi. tuido por um outro aminoácido, caracterizado por:

a) se hibridar o DNA de cadeia simples compreendendo uma cadeia de um gene estrutural que codifica a referida proteína com um iniciador oligonucleotídico mutante que ê complementar de uma região da referida cadeia que inclui o codão para o referido residuo de cisteina ou o tripleto de sentido contrário emparelhado com o referido codão, conforme o caso, excepto no que diz respeito a uma zona de não complementaridade com o referido codão ou o referido tripleto de sentido contrário queque define a eliminação do codão ou um tripleto que codifica outro referido aminoácido.

b) se prolongar o indicador com DNA polimerase a fim de formar um heteroduplex mutacional; e

c) se replicar o referido heteroduplex mutacional.

22^â. - Método de acordo com

a reivindicação 21, caracterizado ainda por a zona de não complementaridade definir um tripleto que codifica a serina ou a treonina.

23². - Método de acordo com a

reivindicação 21, caracterizado por o DNA de cadeia simples ser de um fago de cadeia simples que inclui a referida cadeia e por o heteroduplex mutacional do passo (b) ser convertido num heteroduplex circular fechado.

24⁵. - Método de acordo com

a reivindicação 21, caracterizado ainda por a referida replicação ser efectuada mediante a transformação de um horpedeiro bacteriano competente com o heteroduplex circular fechado e se fazer cultura dos transformantes resultantes. »

25^â. - Método de acordo com

a reivindicação 21, caracterizado ainda por passos adicionais englobando e isolar da progénie de cadeia mutante do heterodu plex, o isolar do DNA da referida progénie e o isolar do refe rido gene a partir do DNA da referida progénie.

26-, - Método de acordo com as reivindicações 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado ainda por a proteína ser o IFN-Jí humano o residuo de cisteina estar na posição 17 e a zona de não complementaridade definir um co dão para a serina.

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27^a. - Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado ainda por a cadeia ser a cadeia de sentido contrário do IFN-^ e o iniciador olígonucleot£ dico mutante ser o GCAATTTTACAGTCAG.

28^a. - Método de acordo com as reivindicações 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado ainda por a proteína ser a IL-2 humana, o residuo de cisteína estar na posição 125 e a zona de não complementaridade definir um codão que codifica a serina.

29^a. - Um gene estrutural caracterizado por conter uma sequência DNA que codifica a mutej_ na sintética preparada de acordo com uma das reivindicações 1 a 5.

30^a. - Um vector de expressão, caracterizado por incluir o gene estrutural de acordo com a reivindicação 29, numa posição que permita a sua expressão.

31^a. - Uma célula hospedeira ou organismo caracterizado por ser transformada com o vector de expressão de acordo com a reivindicação 30 e a sua progénie .

32^a. - E'. coli caracterizado por ser transformada com o vector de expressão de acordo com a reivindicação 30, e sua progénie.

33^a. - Processo para a preparação de um oligonucleotídeo, para a preparação de um gene estrutural de acordo com a reivindicação 29, por mutagenese dirigida por oligonucleotídeo, caracterizado por se incluir no referido oligonucleotídeo uma sequência nucleotídica que ê complementar para uma região da cadeia do gene estrutural que incluir o codão para o residuo de cisteína ou o tripleto de sentido contrário emparelhado com o referido codão, conforme o caso excepto para uma zona de não complementaridade

com o referido codão que define uma eliminação do codão ou um tripleto que codifica para outro referido amino ácido.

34^a. - Plasmídeo pSY2501.

35^a. - Bactéria caracterizada por ser transformada com o plasmídeo pSY25Ol e sua progénie

36^a. - Bactéria de acordo com

a reivindicação 35, caracterizada também por a bactéria ser E. col i.

37^a. - Plasmídeo pLW46.

38^a. - Bactéria, caracterizada por ser transformada com o plasmídeo pLW46 e sua progénie.

39^a. - Bactéria de acordo com

a reivindicação 38, caracterizada também por a bactéria ser E. Coli.

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40^a. - Processo para a prepa.

ração de muteina interleucina-2 recombinante humana , caracterizado por a cisteina na posição 125, numerada de acordo com interleucina-2 nativa humana, ser substituído por um aminoáci_ do neutro e a referida muteina apresnetar a actividade biológica da interleucina-2 nativa humana.

41^a. - Processo para preparação da muteina sintética de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por o residuo da referida cisteina ter sido substi tuida por um maino ácido seleccionado a partir do grupo consti tuido por serina, treonina, glicina, alanina, vaiina, leucina, isoleucina, histidina, tirosina, fenilalanina, triptofano ou meti on i na .

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42⁵. - Processo para preparação da muteina, de acordo com a reivindicação 40, caracteriza_ do por o referido aminoácido neutro ser serina.

43^. - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por se muteina alanii-interleucina-2 serina 125 recombinante humana.

445. _ Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por se preparar muteina des-analil-interleucina-2 serina 125 recombinante humana.

453. - Processo de acordo com

a reivindicação 40, caracterizado por se preparar muteina, interleucina-2 serina 125, que exibe a actividade biológica da interleucina-2 nativa humana e que contém a sequência de amino ácidos deduzida conforme representado na Figura 15b

HetPcoThrSerSer

25

LeuGlnMetlleLeu

45

ThrPheLysPheTyr

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GluGluLeuLysPro

85

ÀrgProArgAspLeu

105

íhrThrPheMetCys

125

TrpIleThrPheSer

10

SerThrLysLysThr

30

AsnGlylleAsnAsn

50

MetProLysLysAla

70

LeuGluGluValLeu

90

IleSerAsnlleAsn

110

GluTyrAlaAspGlu

130

GlnSerIlelleSer

15

GlnLeuGlnLeuGlu

35

TyrLysAsnProLys

55

ThrGluLeuLysHis

75

AsnLeuAlaGlnSer

95

ValIleValLeuGlu

115

ThrAlaThrlleVal

135

ThrLeuThr--²⁰

HisL.euLeuLeuAsp u 40

LeuTnrArgMetLeu

60

LeuGlnCysLeuGlu

80

LysAsnPheHisLeu

100

LeuLysGlySerGlu

120

GluPheLeuAsnArg

140

FIG. 15b

com e sem metionina de terminação N

46^ã. - Método de acordo com

as reivindicações 40, 41, 42, 43, 44 e 45, caracterizado por a muteína ser não glicosilada.

47«. - Processo para a preparação de uma formulação para diagnóstico de tratamento terapêutico (local ou sistémico) de infecções provocadas por bactérias, virus, par asitas, protozoários e fungos; para aumentar a citoxicidade mediada por células; para estimular a acti^ vidade celular assassina de linfoquina activada; para servir de intermediário no restabelecimento da função imune de linfó eitos; para aumentar a reacção a 1o-antigénica ; para facilitar o restabelecimento da função imune em estados deficientes de imunidade adquirida; para reconstituição da função imune normal em adultos e em animais; no desenvolvimento de testes de testes diagnósticos, tais como os que utilizam amplificação de enzimas, marcação radioactiva, imagem radiológica; para controle de níveis de interleucina-2 no estado de doença; e para a promoção do crescimento de células T» i n vitro para fins terapêuticos e de diagnóstico para bloquear os locais receptores para linfoquinas; caracterizado por se incluir nas referidas formulações:

(a) uma quantidade eficaz de muteína interleucina-2 recombinante humana, em que o residuo de cisteína na posição 125, numerada de acordo com interleucina-2 nativa humana, ser substituído por amino ácido neutro e em que a muteína atrás referida apresenta a actividade biológica da interleucina -2 nativa humana; e

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(b) um meio transportador inerte, não alergênicos farmaceuticamente compatíveis.

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48³. - Processo para a preparação de uma formulação, de acordo oom a reivindicação 47, caracterizado por a muteina ser alanil-interleucina-2 serina125 ou des-alanil-interleucina-2 serina 125 transportador atrãs referido ser seleccionado a partir do grupo constituído por ãgua destilada, solução de Ringer, solução de Hank e soro fisiológico.

49^. - Processo para a preparação de uma formulação, caracterizado por se incluir na referida formulação:

(a) uma muteina interleucina-2 recombinante humanr , em que o residuo de cisteina na posição 125, numerado de acordo com interleucina-2 nativa humana ser substituído por um amino ácido neutro e a referida muteina apresenta a actividade biológica da interleucina-2, nativa, humana; e

(b) um poli-peptídeo seleccionado a partir.do grupo constituído por interferão gama, factor de crescimento celular B e IL-.1.

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50^â. - Processo para a prepara ção de uma formulação de acordo com a reivindicação 49, carac terizado por a muteina representar alanil-interleucina-2 seri na 125 ou des-alanil-interleucina-2 serina 125.

51⁵. - Processo para a preparação de muteina interferão p, sintética, humana, recombinante, caracterizado por a cisteina na posição 17, numerada de acordo com interferão p nativo ser substituída por um aminoácido neutro, e por a muteina referida apresentar aetividade de interferão B, nativo, humano.

52³. - Processo para preparação da muteína sintética de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por o resíduo de cisteína referido ser substitu_i_ do por um aminoácido seleccionado a partir do grupo constituído serina, treonina, glicina, alanina, valína, leucina, isolei[ cina, histidina, tirosina, fenilalanina, triptofano ou metionina.

53⁵. - Processo para preparação de muteína sintética, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por o referido resíduo de cisteína ser substituido por um aminoácido seleccionado a partir do grupo constituído por serina ou treonina.

54®. - Processo para preparação de muteína sintética de caordo com a reivindicação 51, caracterizado por a muteína ser não glicosilada.

55^s. - Processo de acordo com

a reivindicação 51, caracterizado por IFN-^-ser 17 recombinante humano, biologicamente activo. y

56³. - Processo de acordo com

a reivindicação 49, caracterizado por se preparar a muteína IFB-^ser 17, recombinante humano, representada pela sequência de aminoacidos representada pela sequência de aminoácidos representada na Figura 10.

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FIG. 10

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-4357^a. - Processo para a preparação de uma composição terapêutica tendo actividade de IFN-/3 humano, caracterizado por se incluir na referida composição terapêutica uma quantidade terapeuticamente eficaz de muteina sintética, preparado de acordo com as reivindicações 51, 52 ou 53, misturada com um meio transportador, farmaceuticamente aceitável.

58^a. - Método para regularização do crescimento celular num doente caracterizado por compreender a administração ao doente referido de uma quantidade eficaz, reguladora de crescimento celular da muteina sintética, preparado de acordo com as reivindicações 51, 52 ou 55, numa gama de dosagem de atê 2 milhões de unidades por M2 (sobrescrito 2) do corpo humano quando administrada como uma infusão contínua ou atê 1 milhão de unidades por M2(sobrescrito 2) quando administrada com um bolus intravenoso ou intramuscular.

59^a. - Método de tratamento de um doente com uma doença provocada por um virus caracterizado por compreender a administração ao referido doente, de uma quantidade eficaz, inibidora de doença provocada por virus, da muteina sintética preparada de acordo com as reivindicações 51, 52 ou 55,numa gama de dosagem de até 2 milhões de unidades por M2 (sobrescrito 2) do corpo humano quando administrada como uma infusão contínua ou até 1 milhão de unidades por M2(sobre£ crito 2) quando administrada com um bolus intravenoso ou intramuscular.

60^a. - Método para estimular a actividade de células assassinas naturais num doente, caracterizado por compreender a administração ao referido doente de uma quantidade eficaz estimulante da célula assassina natural da muteína sintética preparada de acordo com as reivindicações 51, 52 ou 55, numa gama de dosagem de até 2 milhões de unida-

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