JP2017513503A - 単鎖ｔｒａｉｌ受容体アゴニストタンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、特定ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、及びＴＲＡＩＬ関連疾患または障害を有する被験者の治療方法を提供する。本発明で提供される前記ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメイン及びＦｃフラグメントを含む。前記ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は実質的に非凝集性であり、治療、診断及び／または研究用途に適している。

Description

本発明は、３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメイン及びＦｃフラグメントを含む特定ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質、前記ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸分子、及びその使用を提供する。前記ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は実質的に非凝集性であり、治療、診断及び／または研究用途に適している。

ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）サイトカインのトリマー化が効率的な受容体結合及び活性化のために必要であることは公知である。しかしながら、組換えモノマー単位からＴＮＦスーパーファミリーサイトカインのトリマー複合体を作成することは難しい。

ＷＯ ０１／４９８６６及びＷＯ ０２／０９０５５は、ＴＮＦサイトカイン及びマルチマー化成分を含む組換え融合タンパク質、特にＣ１ｑタンパク質ファミリー由来のタンパク質またはコレクションを開示している。しかしながら、これらの融合タンパク質には、トリマー化ドメインが通常大きな分子量を有しており、及び／またはトリマー化がかなり非効率的であるという欠点がある。

Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１８７（１９８９），１２０５−１２１３）は、ＴＮＦサイトカインのトリマーがＮ末端に位置する安定化モチーフにより安定化されることを記載している。ＣＤ９５Ｌでは、受容体結合ドメイントリマーの安定化は多分細胞膜近くに位置しているＮ末端アミノ酸ドメインにより生ずる。

Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３２２（２００４），１９７−２０２）は、ＣＤ９５Ｌの受容体結合ドメインがＮ末端に位置する人工α−ヘリックスコイルドコイル（ロイシンジッパー）モチーフにより安定化され得ることを記載している。しかしながら、ポリペプチド鎖の相互配向、例えば平行または逆平行配向は予測しがたいことが知見された。更に、コイルドコイルジッパーモチーフ中の７アミノ酸繰り返しの最適数を決定することは難しい。加えて、コイルドコイル構造はｐＨ及び／またはイオン強度を変化させた後高分子凝集物を形成する傾向を有している。

ＷＯ ０１／２５２７７は、細胞受容体の細胞外リガンド結合ドメインに結合する単鎖オリゴマーポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは少なくとも３つの受容体結合部位を含み、前記結合部位の少なくとも１つは細胞受容体のリガンド結合ドメインに結合し得、前記結合部位の少なくとも１つは細胞受容体のリガンド結合ドメインに効果的に結合できず、これにより単鎖オリゴマーポリペプチドは受容体に結合し得るが、受容体を活性化し得ない。例えば、モノマーはＴＮＦファミリーのサイトカインリガンド、特にＴＮＦ−αから誘導される。

ＷＯ ２００５／１０３０７７は、ＴＮＦファミリーリガンドメンバーの少なくとも３つのモノマー、及びＴＮＦリガンドファミリーメンバーのモノマーを相互に連結する少なくとも２つのペプチドリンカーを含む単鎖融合ポリペプチドを開示している。しかしながら、最近の実験から、これらの単鎖融合ポリペプチドが望ましくない凝集を示すことが判明している。

ＷＯ ２０１０／０１００５１は、３つの可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメイン及び少なくとも２つのペプチドリンカーを含む単鎖融合ポリペプチドを開示している。記載されている融合ポリペプチドは実質的に非凝集性である。

更に、Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓら（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１５，ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２８０−０１５−２７１２−０）の研究を含めた以前の研究から、ＴＲＡＩＬ受容体のスーパークラスタリングにより毒性が生ずる恐れがあることが立証されている。

国際公開第０１／４９８６６号 国際公開第０２／０９０５５号 国際公開第０１／２５２７７号 国際公開第２００５／１０３０７７号 国際公開第２０１０／０１００５１号

Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１８７（１９８９），１２０５−１２１３ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３２２（２００４），１９７−２０２ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１５，ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２８０−０１５−２７１２−０

従って、当業界では、高い生物活性、高い安定性、低毒性を示し、効率的に組換え製造できる新規ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストが要望されている。

本発明は、低いタンパク質分解、長い半減期、及びインビボでの低いＴＲＡＩＬ受容体スーパークラスタリング（付随する毒性と共に）を示す特定のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を提供する。

本発明のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は通常、（ｉ）第１可溶性ＴＲＡＩＬサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１ペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２可溶性ＴＲＡＩＬドメイン、（ｉｖ）第２ペプチドリンカー、（ｖ）第３可溶性ＴＲＡＩＬドメイン、及び（ｖｉ）抗体Ｆｃフラグメントを含む。

１つの態様において、本発明は、（ｉ）第１可溶性ＴＲＡＩＬドメイン、（ｉｉ）第１ペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２可溶性ＴＲＡＩＬドメイン、（ｉｖ）第２ペプチドリンカー、（ｖ）第３可溶性ＴＲＡＩＬドメイン、及び（ｖｉ）抗体Ｆｃフラグメントを含む単鎖融合ポリペプチドを提供する。１つの実施形態では、抗体Ｆｃフラグメント（ｖｉ）は、第１ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）に対してＮ末端に、及び／または第３ＴＲＡＩＬドメイン（ｖ）に対してＣ末端に位置している。別の実施形態では、抗体Ｆｃフラグメントは第３ＴＲＡＩＬドメイン（ｖ）に対してＣ末端に位置している。１つの実施形態では、ポリペプチドは実質的に非凝集性である。別の実施形態では、第２及び／または第３可溶性ＴＲＡＩＬドメインは、場合によりアミノ酸配列変異を含むＮ末端短縮型ドメインである。

１つの実施形態では、可溶性ＴＲＡＩＬドメインの少なくとも１つ、特に可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉｉｉ）及び（ｖ）の少なくとも１つは、ヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｎ１２０とＶａｌ１２２の間で始まるＮ末端配列を有し、Ａｒｇ１２１が中性アミノ酸、例えばＳｅｒまたはＧｌｙで置換されていてもよい可溶性ＴＲＡＩＬドメインである。別の実施形態では、可溶性ＴＲＡＩＬドメインの少なくとも１つ、特に可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉｉｉ）及び（ｖ）の少なくとも１つは、（ａ）Ａｒｇ１２１−Ｖａｌ１２２−Ａｌａ１２３、及び（ｂ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１２１−Ｖａｌ１２２−Ａｌａ１２３から選択されるＮ末端配列を有する可溶性ＴＲＡＩＬドメインである。１つの実施形態では、可溶性ＴＲＡＩＬドメインはヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｙ２８１で終わり、及び／または場合によりＲ１３０、Ｇ１６０、Ｈ１６８、Ｒ１７０、Ｈ１７７、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７またはＤ２６９位、または前記位置の２つ以上に変異を含む。１つの実施形態では、可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）は配列番号１に従うヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｎ１２０−Ｇｌｙ２８１からなり、可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉｉｉ）及び（ｖ）は配列番号１に従うヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ａｒｇ１２１−Ｇｌｙ２８１からなる。

１つの実施形態では、第１及び第２ペプチドリンカー（ｉｉ）及び（ｉｖ）は独立して３−８アミノ酸の長さ、特に３、４、５、６、７または８アミノ酸の長さを有し、場合によりグリコシル化され得るアスパラギン残基を含むグリシン／セリンリンカーであることが好ましい。１つの実施形態では、第１及び第２ペプチドリンカー（ｉｉ）及び（ｉｖ）は配列番号２に従うアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、ポリペプチドは更に、例えば配列番号１２のＮ末端シグナルペプチドドメインを含み、該ドメインはプロテアーゼ開裂部位を含み得、及び／または更に配列番号１３に従うＳｔｒｅｐタグのような認識／精製ドメインを含むか、及び／または該ドメインに結合し得るＣ末端エレメントを含む。

１つの実施形態では、抗体Ｆｃフラグメント（ｖｉ）は可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）及び／または（ｖ）に、好ましくは配列番号１１のヒンジ−リンカーを介して融合される。別の実施形態では、抗体Ｆｃフラグメント（ｖｉ）は配列番号１０または１７に示すアミノ酸配列からなる。１つの実施形態では、ポリペプチドは配列番号１４、１５または１８のアミノ酸配列を含む。

別の態様において、本発明は、配列番号１９、２０または２１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を提供する。

別の態様において、本発明は、配列番号２６、２７、２８、２９または３０に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を提供する。

別の態様において、本発明は、配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を提供する。１つの実施形態では、２つのポリペプチドは各ポリペプチドのシステイン残基５１３、５１９及び５２２間に形成された３つの鎖間ジスルフィド結合を介して共有結合している。

１つの実施形態では、ポリペプチドの１６８位及び３３７位のアスパラギン残基の１つ以上がＮ−グリコシル化されている。別の実施形態では、ポリペプチドの１６８位及び３３７位のアスパラギン残基が共にＮ−グリコシル化されている。

別の実施形態では、ポリペプチドは更に翻訳後修飾されている。別の実施形態では、翻訳後修飾はピログルタメートに修飾されたＮ末端グルタミンを含む。

別の態様において、本発明は、本明細書中に開示されているＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質及び１つ以上の医薬的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤及び／または佐剤を含む医薬組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸分子を提供する。別の実施形態では、本発明は、核酸分子を含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は核酸分子を含む細胞を提供する。更なる実施形態では、細胞は真核細胞である。別の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。他の実施形態では、細胞はＣＨＯ−ＤＢＸ１１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｓ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞からなる群から選択される。他の実施形態では、細胞はＶｅｒｏ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ−２９３、ＮＩＨ−３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、Ｔ４７Ｄ、ＮＳ０、ＣＲＬ７０３０、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４及びハイブリドーマ細胞からなる群から選択される。

別の態様において、本発明は、ＴＲＡＩＬ関連疾患または障害を有する被験者に対して有効量のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を投与することを含む前記被験者の治療方法を提供する。１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を単独で投与する。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を第２物質の投与前、投与と同時に、または投与後に投与する。別の実施形態では、疾患または障害は、腫瘍、感染性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される。１つの実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。１つの実施形態では、腫瘍は肉腫、食道癌及び胃癌からなる癌の群から生ずる。別の実施形態では、腫瘍はユーイング肉腫または線維肉腫から生ずる。別の実施形態では、腫瘍は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）からなる癌の群から生ずる。別の実施形態では、腫瘍はリンパ系腫瘍である。１つの実施形態では、腫瘍は血液腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、バ−キットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または有毛細胞白血病から生ずる。別の実施形態では、自己免疫疾患はリウマチ様疾患、関節炎疾患、またはリウマチ様関節炎疾患である。更なる実施形態では、疾患または障害は関節リウマチである。別の実施形態では、変性疾患は神経変性疾患である。更なる実施形態では、神経変性疾患は多発性硬化症である。

１つの実施形態では、第２物質は化学療法剤、放射線療法剤または生物学的物質である。１つの実施形態では、第２物質はデュベリシブ、イブルチニブ、ナビトクラックス及びベネトクラックスからなる群から選択される。別の実施形態では、第２物質はアポトーシス性物質である。１つの実施形態では、アポトーシス性第２物質はボルテゾミブ、アザシチジンン、ダサチニブ及びゲフィチニブからなる群から選択される。特定実施形態では、本明細書中に開示されている医薬組成物を患者に対して静脈内また皮下投与により投与する。他の実施形態では、開示されている医薬組成物を患者に対して経口、非経口、筋肉内、関節内、気管支内、腹部内、関節包内、軟骨内、心腔内、腔内、小脳内、脳・脳室内、結腸内、子宮頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内または経皮投与により投与する。

１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を単回ボーラスとして投与する。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を数回の分割用量で投与してもよい。ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与され得る。１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は約０．１〜０．５、０．１〜１、０．１〜１０、０．１〜２０、０．１〜５０、０．１〜７５、１〜１０、１〜１５、１〜７．５、１．２５〜１５、１．２５〜７．５、２．５〜７．５、２．５〜１５、５〜１５、５〜７．５、１〜２０、１〜５０、７〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、１０〜２０、１０〜５０、１０〜７５、及び１０〜１００ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与され得る。他の実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を医薬組成物中に約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌで存在させる。１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を医薬組成物中に約０．１〜０．５、０．１〜１、０．１〜１０、０．１〜２０、０．１〜５０、０．１〜７５、１〜１０、１〜２０、１〜５０、１〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、１０〜２０、１０〜５０、１０〜７５、または１０〜１００ｍｇ／ｍｌからなる群から選択される量で存在させる。他の実施形態では、治療有効量のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を被験者に投与する。別の実施形態では、予防有効量のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を被験者に投与する。

３つのＴＲＡＩＬドメインＩ．、ＩＩ．、ＩＩＩ．可溶性ＴＲＡＩＬドメインを含む単鎖融合ポリペプチドのドメイン構造。 ＴＲＡＩＬの一般構造を表す概略図。黒四角は細胞膜、細胞内に位置するＮ末端。１．受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の逆平行βフォールド。２．ＲＢＤと細胞膜の界面。３．プロテアーゼ開裂部位． 天然ＴＲＡＩＬトリマーの構造を表す概略図。円筒構造はＲＢＤを表す。Ｎ末端はＲＢＤを細胞膜と結合させる。 ＴＲＡＩＬの受容体結合ドメインを含む３つの可溶性ドメイン、すなわちＩ．、ＩＩ．、ＩＩＩ．可溶性ＴＲＡＩＬドメインの構造を表す概略図。 ３つの可溶性ドメインのＮ及びＣ末端が表面を形成していることを特徴とするＴＲＡＩＬのＲＢＤを含む可溶性ドメインのトリマー化。 隣の可溶性ドメインのＮ末端に対する距離を補償するための長リンカーの要件を示すストーク領域のすべてまたは一部を含む単鎖ＴＲＡＩＬの構造を表す概略図。 当業界から公知のｓｃＦｖ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質。 当業界から公知のＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質。 （Ａ）追加のＦａｂ抗体フラグメントを含む単鎖融合ポリペプチド。（Ｂ）追加のｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む単鎖融合ポリペプチド。 ２つのＮ末端融合ｓｃＦｃ融合ポリペプチドのジスルフィド架橋を介するダイマー化。 ２つのＣ末端融合ｓｃＦｃ融合ポリペプチドのジスルフィド架橋を介するダイマー化。 単鎖融合ポリペプチドのリンカーを介するダイマー化。 第２融合ポリペプチドまたはｓｃＦｖ融合ポリペプチドに更に融合された追加Ｆａｂ抗体フラグメントを含む単鎖融合ポリペプチド。 ２つのｓｃＦａｂ融合ポリペプチドのジスルフィド架橋を介するダイマー化。 更にＦｖ及び／またはＦａｂ抗体フラグメントを含むＮ末端融合ｓｃＦｃ融合ポリペプチド。 更にＦｖ及び／またはＦａｂ抗体フラグメントを含むＣ末端融合ｓｃＦｃ融合ポリペプチド。 Ｎ末端シグナルペプチドドメインを有する代表的なＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を配列番号１４に示す。（Ｎ末端シグナルペプチドドメインを含まない）成熟タンパク質を配列番号１９に示す。 代表的ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質の全体構造及び注釈付き配列を表す概略図。 Ｆcドメインを含有するＴＲＡＩＬ受容体アゴニストを定量するためのＥＬＩＳＡのアッセイセットアップ 配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質はインビトロでヒト腫瘍細胞株において細胞死を誘発させる。ＳＫＭ−１、Ｃｏｌｏ２０５またはＪｕｒｋａｔ細胞を漸増濃度のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を用いて２４時間処理し、細胞生存性を評価した。 配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質はインビトロで抗腫瘍剤と相乗効果を示す。ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞を漸増濃度のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質と指定濃度のベネトクラックス（図２０Ａ）またはナビトクラックス（図２０Ｂ）の存在下または不在下で２４時間インキュベートした。或いは、（図２０Ｃ）ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞を漸増濃度のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質と指定濃度のドセタキセル（ＤＴＸ）の存在下または不在下で７２時間処理した。細胞生存性を評価し、相乗効果をＢｌｉｓｓ合計により調べた。 配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質のＣｏｌｏ２０５結腸直腸癌異種移植片モデルにおける腫瘍増殖に対する影響。 配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質のＳＫＭ−１急性骨髄性白血病異種移植片モデルにおける腫瘍増殖に対する影響。 配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質のＨ４６０ＬＭ非小細胞肺癌異種移植片モデルにおける腫瘍増殖に対する影響。 配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質のＰＤＸモデルにおける腫瘍増殖に対する影響。菱形：ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質で処理した。四角：未処理。（Ａ）ＣＴＧ−００６９、（Ｂ）ＣＴＧ−０１６７、（Ｃ）ＣＴＧ−０２９３、（Ｄ）ＣＴＧ−０７８５、（Ｅ）ＣＴＧ−０７１４、（Ｆ）ＣＴＧ−０１３６及び（Ｇ）ＣＴＧ−０４８５についての腫瘍容積を示す。 配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質のＰＤＸモデルにおける腫瘍増殖に対する影響。菱形：ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質で処理した。四角：未処理。（Ａ）ＣＴＧ−００６９、（Ｂ）ＣＴＧ−０１６７、（Ｃ）ＣＴＧ−０２９３、（Ｄ）ＣＴＧ−０７８５、（Ｅ）ＣＴＧ−０７１４、（Ｆ）ＣＴＧ−０１３６及び（Ｇ）ＣＴＧ−０４８５についての腫瘍容積を示す。

本発明によれば、単鎖ＴＲＡＩＬ受容体結合ドメインをＦｃドメインに融合させると、高い生物活性と良好な安定性を併せ持つ六価ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストが得られることが知見された。従って、２つのペプチドリンカーにより連結されている少なくとも３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメイン、及びＮ末端及び／またはＣ末端に抗体Ｆｃフラグメントを含む単鎖融合ポリペプチドが提供される。

好ましくは、単鎖融合ポリペプチドは非凝集性である。用語「非凝集性」は、製剤のモノマー含量が≧５０％、好ましくは≧７０％、より好ましくは≧９０％であることを指す。凝集物含量に対するモノマー含量の比はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて凝集物形成の量を測定することにより調べられ得る。凝集に関する安定性は、異なる保存条件下で、例えば４℃または２５℃で規定期間後、例えば数日間乃至数週間から数ヶ月間後ＳＥＣにより調べられ得る。融合タンパク質の場合、実質的に非凝集性と分類されるためには、４℃または２５℃で数日間、例えば１０日間、より好ましくは数週間、例えば２、３または４週間、最も好ましくは数ヶ月間、例えば２または３ヶ月間保存後のモノマー含量が上に規定されている通りであることが好ましい。

単鎖融合ポリペプチドがそのＮ及び／またはＣ末端に位置し得る追加ドメインを含んでいてもよい。追加融合ドメインの例は、例えばプロテアーゼ開裂部位を含み得るＮ末端シグナルペプチドドメイン、または認識／精製ドメインを含むかまたは該ドメインに連結し得るＣ末端エレメントである。好ましい実施形態によれば、融合ポリペプチドはそのＣ末端にリンカーを介して融合しているＳｔｒｅｐタグを含む。短セリンリンカーを含む代表的Ｓｔｒｅｐタグを配列番号１３に示す。

本発明のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質はＴＲＡＩＬに由来する３つの可溶性ドメインを含む。これらの可溶性ドメインがその対立遺伝子変異体及び／または誘導体を含めて哺乳動物、特にヒトＴＲＡＩＬに由来することが好ましい。可溶性ドメインは膜に位置するドメインなしで受容体結合ドメインを含むＴＲＡＩＬの細胞外部分を含む。ＴＮＦスーパーファミリーの他のタンパク質のように、ＴＲＡＩＬは１５−３０アミノ酸のＮ末端部分、所謂ストーク領域を介して膜に固定されている。ストーク領域はトリマー化に寄与し、細胞膜に対して一定の距離を与える。しかしながら、ストーク領域は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の一部ではない。

重要なことには、ＲＢＤがそのＮ−及びＣ末端アミノ酸の特定局在化により特徴づけられる。前記アミノ酸は直接隣接しており、トリマーの軸に対して中心に位置している。ＲＢＤの第１Ｎ末端アミノ酸はＲＢＤのＣ末端アミノ酸と逆平行βストランドを形成する（図２及び３）。

よって、ＲＢＤの逆平行βストランドは細胞膜と界面を形成し、ストーク領域のアミノ酸を介して細胞膜に連結され、細胞膜内に固定される。ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質の可溶性ＴＲＡＩＬドメインがストーク領域からアミノ酸を欠くＴＲＡＩＬの受容体結合ドメインを含む（図４及び５）ことが非常に好ましい。さもなければ、隣接可溶性ドメインのＮ末端ストーク領域を補償するためには可溶性ドメインの１つのＣ末端を隣接可溶性ドメインのＮ末端と連結させる長リンカーが必要であり（図６）、これにより不安定性が生じ、及び／または凝集物が形成されるであろう。

可溶性ドメインの更なる利点は、ＲＢＤのＮ及びＣ末端アミノ酸が抗薬物抗体に接近可能でないことである。単鎖融合ポリペプチドがそれぞれのＴＲＡＩＬ受容体に対して少なくとも１つの機能性結合部位を含む秩序トリマー構造を形成し得ることが好ましい。

ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は３つの機能性ＴＲＡＩＬ受容体結合部位、すなわちＴＲＡＩＬ受容体と複合体を形成し得るアミノ酸配列を含む。よって、可溶性ドメインは対応するＴＲＡＩＬ受容体に結合し得る。１つの実施形態では、可溶性ドメインの少なくとも１つは受容体活性化でき、これによりアポトーシス及び／または増殖活性が影響され得る。更なる実施形態では、可溶性ドメインの１つ以上は受容体活性化できないように選択される。

可溶性ＴＲＡＩＬドメインは配列番号１に示すヒトＴＲＡＩＬに由来し得る。好ましくは、可溶性ＴＲＡＩＬドメインはヒトＴＲＡＩＬ、特にアミノ酸１２０−１２２から出発するヒトＴＲＡＩＬに由来し、特に配列番号１のアミノ酸１２０−２８１、１２１−２８１、または１２２−２８１を含む。場合により、配列番号１のアミノ酸Ａｒｇ１２１は非荷電アミノ酸、例えばＳｅｒまたはＧｌｙにより置換され得る。

上に示したように、可溶性ＴＲＡＩＬドメインは配列番号１に示す野生型配列を含み得る。しかしながら、これら可溶性ドメインの１つ以上に変異、例えば可溶性ドメインの結合性を変化させる（例えば、増加または減少させる）変異を導入することができることに注目すべきである。１つの実施形態では、対応するサイトカイン受容体に結合できない可溶性ドメインを選択し得る。

本発明の更に好ましい実施形態では、可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）は、ＴＲＡＩＬ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１）及び／またはＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ２）に結合する及び／または活性化するＴＲＡＩＬまたはその受容体結合ドメインの変異体を含む。変異体の結合及び／または活性は、例えばｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｏｏｔら（ＰＮＡＳ，２００６，１０３：８６３４−８６３９）、Ｋｅｌｌｅｙら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０：２２０５−２２１５）、またはＭａｃＦａｒｌａｎｅら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００５，６５：１１２６５−１１２７０）に記載されているアッセイにより調べられ得る。

変異体は当業者に公知の技術、例えばｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｏｏｔら（ＰＮＡＳ，２００６，１０３：８６３４−８６３９）、Ｋｅｌｌｅｙら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０：２２０５−２２１５）、またはＭａｃＦａｒｌａｎｅら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００５，６５：１１２６５−１１２７０）に記載されている技術により作成され得、任意のタイプの構造変異、例えばアミノ酸の置換、欠失、複製及び／または挿入を含み得る。好ましい実施形態は置換の発生である。置換は本明細書中に記載されているＴＲＡＩＬまたは受容体結合ドメインの少なくとも１つのアミノ酸に影響を及ぼし得る。好ましい実施形態では、置換はＴＲＡＩＬ、例えばヒトＴＲＡＩＬ（例えば、配列番号１）のアミノ酸の少なくとも１つに影響を及ぼし得る。この点での好ましい置換は配列番号１のヒトＴＲＡＩＬの以下のアミノ酸の少なくとも１つに影響を及ぼす：Ｒ１３０、Ｇ１６０、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７、Ｄ２６９。配列番号１のヒトＴＲＡＩＬの好ましいアミノ置換は以下の置換の少なくとも１つである：Ｒ１３０Ｅ、Ｇ１６０Ｍ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ｈ、Ｄ２６９Ｒ、またはＤ２６９Ｋ。

アミノ酸置換は、ＴＲＡＩＬ、例えばヒトＴＲＡＩＬのＴＲＡＩＬＲ１またはＴＲＡＩＬＲ２のいずれかへの結合及び／または活性に影響を及ぼし得る。或いは、アミノ酸置換はＴＲＡＩＬ、例えばヒトＴＲＡＩＬのＴＲＡＩＬＲ１及びＴＲＡＩＬＲ２の両方に対する結合及び／または活性に影響を及ぼし得る。ＴＲＡＩＬＲ１及び／またはＴＲＡＩＬＲ２の結合及び／または活性はプラスの影響、すなわち受容体のより強い、より選択的、より特異的な結合、及び／またはより多い活性化を受け得る。或いは、ＴＲＡＩＬＲ１及び／またはＴＲＡＩＬＲ２の結合及び／または活性はマイナスの影響、すなわちより弱い、より低選択性、またはより低特異性の結合、及び／または受容体の全くまたは殆どない活性化を受け得る。

ＴＲＡＩＬＲ１及びＴＲＡＩＬＲ２の両方の結合及び／または活性化に影響を及ぼす本発明のアミノ酸置換を有するＴＲＡＩＬの変異体の例は、例えばＭａｃＦａｒｌａｎｅら（上を参照されたい）の表１中に見られ得、配列番号１の２つのアミノ酸Ｙ２１３Ｗ及びＳ２１５Ｄ、または単一アミノ酸置換Ｙ１８９Ａを有するヒトＴＲＡＩＬ変異体からなり得る。

ＴＲＡＩＬＲ１の結合及び／または活性化に影響を及ぼす本発明のアミノ酸置換を有するＴＲＡＩＬの変異体の例は、例えばＭａｃＦａｒｌａｎｅら（上を参照されたい）の表１中に見られ得、以下の配列番号１の４つのアミノ酸置換：Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ及びＳ２１５Ｄ、または以下の５つのアミノ酸置換：Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ及びＳ２１５Ｄを有するヒトＴＲＡＩＬ変異体からなり得、或いはＫｅｌｌｅｙら（上を参照されたい）の表２中に見られ得、以下の６つのアミノ酸置換：Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ及びＫ２０１Ｒ、またはＹ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｒ及びＫ２０１Ｒを有するヒトＴＲＡＩＬ変異体からなり得る。

ＴＲＡＩＬＲ２の結合及び／または活性化に影響を及ぼす本発明のアミノ酸置換を有するＴＲＡＩＬの変異体の例は、例えばＭａｃＦａｒｌａｎｅら（上を参照されたい）の表１またはＫｅｌｌｅｙら（上を参照されたい）の表２中に見られ得、配列番号１の以下の６つのアミノ酸置換：Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｒ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ及びＤ２６７Ｑを有するヒトＴＲＡＩＬ変異体からなり得、或いはｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｏｏｔら（上を参照されたい）の表２中に見られ得、以下の単一アミノ酸置換：Ｄ２６９Ｈ、または以下の２つのアミノ酸置換：Ｄ２６９Ｈ及びＥ１９５Ｒ、またはＤ２６９Ｈ及びＴ２１４Ｒを有するヒトＴＲＡＩＬ変異体からなり得る。

よって、１つの好ましい実施形態は、可溶性ドメインの少なくとも１つがＴＲＡＩＬＲ１１及び／またはＴＲＡＩＬＲ２に結合する及び／または活性化するＴＲＡＩＬまたはその受容体結合ドメインの変異体を含む本明細書中に記載されているＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質である。

ＴＲＡＩＬ誘発性受容体凝集が少ないＴＲＡＩＬの変異体の更なる例はＨ１６８（Ｓ，Ｔ，Ｑ）、Ｒ１７０（Ｅ，Ｓ，Ｔ，Ｑ）、及びＨ１７７（Ｓ，Ｔ）である。

本明細書中に記載されているＴＲＡＩＬまたはその受容体結合ドメインの変異体を含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質の１つの好ましい実施形態は、成分（ｉ）が少なくとも１つのアミノ酸置換、特に以下に示すアミノ酸置換を含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質である。

前記アミノ酸置換は、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１）の以下のアミノ酸位置：Ｒ１３０、Ｇ１６０、Ｈ１６８、Ｒ１７０、Ｈ１７７、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７、Ｄ２６９の少なくとも１つに影響を及ぼす。

前記アミノ酸置換は、以下：Ｒ１３０Ｅ、Ｇ１６０Ｍ、Ｈ１６８（Ｓ，Ｔ，Ｑ）、Ｒ１７０（Ｅ，Ｓ，Ｔ，Ｑ）、Ｈ１７７（Ｓ，Ｔ）１ Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ｈ、Ｄ２６９ＲまたはＤ２６９Ｋの少なくとも１つである。

好ましいＴＲＡＩＬ−Ｒ２選択ドメインはアミノ酸置換Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｒ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ及びＤ２６７Ｑを含む。

好ましいＴＲＡＩＬ−Ｒ１選択ドメインはアミノ酸置換Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ及びＳ２１５Ｄを含む。

本発明の単鎖融合分子は３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメイン、すなわち成分（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖ）を含む。第２及び／または第３可溶性ＴＲＡＩＬドメインが場合によりアミノ酸配列変異を含むＮ末端短縮型ドメインならば、単鎖ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの凝集に対する安定性が強化される。よって、第２及び第３可溶性ＴＲＡＩＬドメインの両方が場合により可溶性ＴＲＡＩＬドメインのＮ末端領域に、好ましくはＮ末端の最初の５つのアミノ酸内にアミノ酸配列変異を含むＮ末端短縮型ドメインであることが好ましい。これらの変異は帯電した、例えば酸性または塩基性アミノ酸の中性アミノ酸、特にセリンまたはグリシンによる置換からなり得る。

これとは対照的に、第１可溶性ＴＲＡＩＬドメインの選択は重要でない。ここでは、完全長Ｎ末端配列を有する可溶性ドメインを使用してもよい。しかしながら、第１可溶性ＴＲＡＩＬドメインがＮ末端短縮型の、場合により変異されている配列を有し得ることにも注目すべきである。

本発明の更に好ましい実施形態では、可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖ）は可溶性ヒトＴＲＡＩＬドメインである。第１可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）は未変性、短縮型及び／または変異配列から選択され得る。よって、第１可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）は、ヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｕ１１６とＶａｌ１２２の間から始まり得、Ａｒｇ１２１が中性アミノ酸により、例えばＳｅｒまたはＧｌｙにより置換され得るＮ末端配列を有する。第２及び第３可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉｉｉ）及び（ｖ）は、好ましくはヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｎ１２０とＶａｌ１２２の間から始まり、Ａｒｇ１２１が別のアミノ酸、例えばＳｅｒまたはＧｌｙにより置換され得る短縮型Ｎ末端配列を有する。

好ましくは、可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉｉｉ）及び（ｖ）のＮ末端配列は、
（ａ）Ａｒｇ１２１−Ｖａｌ１２２−Ａｌａ１２３、及び
（ｂ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１２１
から選択される。

可溶性ＴＲＡＩＬドメインがヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｙ２８１で終わることが好ましい。特定実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは上記した内部変異を含み得る。

ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質の成分（ｉｉ）及び（ｉｖ）は、それぞれ成分（ｉ）と（ｉｉｉ）、または（ｉｉｉ）と（ｖ）の間に位置するペプチドリンカーエレメントである。可動性リンカーエレメントは３−８アミノ酸の長さ、特に３、４、５、６、７または８アミノ酸の長さを有する。リンカーエレメントは好ましくはグリシン／セリンリンカー、すなわち実質的にアミノ酸グリシン及びセリンからなるペプチドリンカーである。例えばヒトＴＲＡＩＬのように可溶性サイトカインドメインがＳまたはＧ（Ｃ末端）で終わる場合には、リンカーはＳまたはＧの後から始まる。可溶性サイトカインドメインがＳまたはＧ（Ｎ末端）で始まる場合には、リンカーはこのＳまたはＧの前で終わる。

リンカー（ｉｉ）及びリンカー（ｉｖ）が同一の長さを有している必要がないことに注目すべきである。潜在的な免疫原性を減らすために、より短いリンカーを使用することが好ましいことがある。加えて、より短かいリンカーにより凝集物を形成する傾向が低い単鎖が生ずることが判明した。一方、リンカーがここに開示されているものよりも実質的に長いリンカーは好ましくない凝集性を示すことがある。

必要に応じて、リンカーはグリコシル化部位Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒを形成し得るアスパラギン残基を含み得る。特定実施形態では、リンカーの１つ、例えばリンカー（ｉｉ）またはリンカー（ｉｖ）がグリコシル化部位を含む。他の実施形態では、両リンカー（ｉｖ）がグリコシル化部位を含む。ｓｃ ＴＲＡＩＬタンパク質の可溶性を高めるために及び／または潜在的な免疫原性を減らすために、リンカー（ｉｉ）及び／またはリンカー（ｉｖ）がグリコシル化部位を含むことが好ましいことがある。

好ましいリンカー配列は、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号２）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号４）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号５）、ＧＧＳＧ（配列番号６）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号７）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号８）、ＧＧＮＧＳＧ（配列番号９）、及びＧＳＧＳ（配列番号２３）から選択される。

最も好ましい実施形態によれば、リンカー配列は各々配列番号２に従うＧＳＧＳＧＮＧＳである。代表的なリンカー配列を表２に示す。

ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は更に、第１ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）に対してＮ末端に、及び／または第３ＴＲＡＩＬドメイン（ｖ）に対してＣ末端に位置し得る抗体Ｆｃフラグメントドメインを含む。好ましくは、抗体Ｆｃフラグメントドメインは配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列からなる。或いは、Ｆｃフラグメントドメインは配列番号１７に示すアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列からなる。代表的なＦｃフラグメントドメインを表３に示す。

グリコサイトの総数及び炭水化物の３次元の個々の位置がＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質のインビボ安定性に影響を及ぼす。更に、炭水化物認識は末端糖の局所密度、炭水化物樹の分岐度及び炭水化物材料の相対位置に依存する。

インビボでのＦｃ受容体をベースとする架橋及び潜在的なＴＲＡＩＬ受容体スーパークラスタリングをベースとする毒性を避けるためには、ＣＨ２−ドメイン炭水化物の欠失が必要である。更に、部分的に分解した炭水化物は、レクチン推進メカニズムによりＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質のインビボの半減期を短くする。分子上のグリコシル化部位の総数を減らすことにより、生じた化合物はこれらのメカニズムに接近しにくく、半減期が延びる。従って、１つの実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質上のグリコサイトの全数はＣＨ２グリコサイトの欠失により減少し、その結果脱グリコシル化ＣＨ２ドメインを生ずるＮ２９７Ｓ等価変異（ＥＵナンバリングシステムに従う）を含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質が得られる。

内表面エリア上に存在するＣＨ２グリコサイトは通常、ヒンジ鎖間ジスルフィド結合が減少し、共有鎖間結合が崩壊する「オープンＦｃコンフォメーショントトランジット」中にサブドメインをプロテアーゼから守る。これにより、ＣＨ２解離及び内表面エリアのプロテアーゼに対する露出が可能である。従って、脱グリコシル化ＣＨ２を生じさせるＮ２９７Ｓ等価変異（ＥＵナンバリングシステムに従う）を含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は、野生型ＣＨ２グリコシル化を有する等価構造よりもタンパク分解的にあまり安定でないであろう。これは、宿主細胞プロテアーゼが存在しており、構造物への長期間接近を有するＵＳＰ／ＤＳＰ／保存中の化合物の安定性に影響を及ぼす。従って、特定実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストはＣＨ２グリコサイトを欠くが、各ポリペプチド鎖のリンカー配列（例えば、配列番号２に従うＧＳＧＳＧＮＧＳ）中にグリコサイトを含む。特定の代表的実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストは１つのポリペプチド鎖あたり２つのグリコサイトを含み、全部で４つのグリコサイトを含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、抗体Ｆｃフラグメントドメインはヒンジ−リンカーエレメントを介して融合している。ヒンジ−リンカーエレメントは１０−３０アミノ酸の長さ、特に１５−２５アミノ酸、例えば２２アミノ酸の長さを有する。ヒンジ−リンカーエレメントが本明細書中で「Ｉｇヒンジ領域」と称される免疫グロブリンのヒンジ領域配列を含むことが好ましい。用語「Ｉｇヒンジ領域」は、ジスルフィド結合が免疫ブロブリンの２つの重鎖を連結しているシステイン残基を含む天然に存在するＩｇヒンジ領域配列の一部と配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。

ヒンジ領域の誘導体及びアナログは変異により得られ得る。本明細書中で称されている誘導体またはアナログは、欠失、挿入及び／または置換に起因し得る１つ以上のアミノ酸配列差異を有している以外、野生型（すなわち、天然に存在しているタンパク質）の完全長配列と配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。しかしながら、本発明によれば、用語「ヒンジ−リンカー」はＩｇヒンジ領域またはその誘導体を含むリンカーに限定されず、生物学的に活性な立体配座が生ずるようにヒンジ−リンカーエレメントによりドメインを付着させるのに十分なリンカー長を含む。

個々のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質中のオープンＦｃコンフォメーションを有する分子の数はヒンジ領域中に存在する鎖間ジスルフィド結合の数に依存する。従って、１つの実施形態では、ＣＨ２グリコサイトの欠失の影響を緩和するために本発明のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質のヒンジ領域に第３システインを導入した。

加えて、本発明のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は更に、この部位でのタンパク質分解プロセッシングを減らすために上ヒンジリシンのグリシンへの変異を含む。

特に好ましいヒンジ−リンカーエレメントは配列番号１１（表４）に示すアミノ酸配列を含むか、または該アミノ酸配列からなる。

ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は更に、適切な宿主細胞におけるプロセッシング、例えば細胞外分泌を可能にするＮ末端シグナルペプチドドメインを含み得る。好ましくは、Ｎ末端シグナルペプチドドメインはプロテアーゼ開裂部位、例えばシグナルペプチダーゼ開裂部位を含み、よって成熟タンパク質を得るための発現後またはその間に除去され得る。特に好ましいＮ末端シグナルペプチドドメインは配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む（表４）。

加えて、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は更に、認識／精製ドメイン、例えばＦＬＡＧドメイン、ＳｔｒｅｐタグまたはＳｔｒｅｐタグＩｌドメイン、及び／またはポリ−Ｈｉｓドメインを含むかまたは結合していてもよい例えば１−５０、好ましくは１０−３０アミノ酸長を有するＣ末端エレメントを有し得る。特に好ましい実施形態によれば、融合ポリペプチドは配列番号１３（表４）に示す短セリンリンカーを介してＣ末端に融合したＳｔｒｅｐタグを含む。

代表的なヒンジ−リンカーエレメント、Ｎ末端シグナルペプチドドメイン及び短セリンリンカーを表４に示す。

本発明の特に好ましい実施形態によれば、融合ポリペプチドは配列番号２のペプチドリンカーエレメントにより融合されている３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメインを含む。第１可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）は配列番号１に従うヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸１２０−２８１からなり、可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉｉｉ）及び（ｖ）は配列番号１に従うヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸１２１−２８１からなる。加えて、融合ポリペプチドは、配列番号１１に従うヒンジ−リンカーを介して可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｖ）に対してＣ末端で融合している配列番号１０に従う抗体Ｆｃフラグメントドメインを含む。驚くことに、本発明者らはこの特定融合ポリペプチドが改良された生物活性を与え、特に安定であることを知見した。本発明のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質の代表的実施形態のアミノ酸配列を配列番号１９に示す。

更に、融合ポリペプチドはＮ末端シグナルペプチドドメイン、例えば配列番号１２に従うドメインを含む。本発明のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質の具体例を配列番号１４に示す。

別の好ましい実施形態によれば、融合ポリペプチドは更に、配列番号１３に示す短セリンリンカーを介して本発明のポリペプチドに融合しているＣ末端Ｓｔｒｅｐタグを含み得る。本発明のこの態様によれば、Ｆｃフラグメントは好ましくは配列番号１０または１７に示すアミノ酸配列からなる。更に、Ｆｃフラグメントは、例えば配列番号１０のアミノ酸１−２１７を含むより短いＦｃフラグメントからなり得る。Ｃ末端Ｓｔｒｅｐタグを含む融合ポリペプチドの特に好ましい例を配列番号１５及び１８に示す。

配列番号１４、１５及び１８に示す代表的なＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質の各々はＮ末端シグナルペプチドドメインを含む。シグナルペプチドドメインはアミノ酸１−２０を含む。いずれの場合も、成熟タンパク質はアミノ酸２１から始まる。本発明の代表的な成熟ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は配列番号１９、２０、２１、２６、２７、２８、２９及び３０に示されている。代表的な上記ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を表５に示す。

配列番号１９に示すＴＲＡＩＬ受容体アゴニストは、少ないグリコシル化部位の総数（脱グリコシル化ＣＨ２ドメインを与えるＣＨ２領域中のＮ２９７Ｓ変異）、ヒンジ領域中のより多い鎖間ジスルフィド結合の数、及び上部ヒンジリシンのグリシンへの変異を有している。これらの改変により、分子の半減期を延長させながら、潜在的な分解及びＴＲＡＩＬ受容体スーパークラスタリング（付随する毒性と共に）が減少する。幾つかの実施形態では、Ｎ末端グルタミンはピログルタメートに修飾されている（Ｌｉｕら，２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６：１１２１１−１１２１７）。

本発明の更なる態様は、本明細書中に記載されているＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸分子に関する。核酸分子はＤＮＡ分子、例えば二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子であり得る。核酸分子はＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質またはその前駆体、例えば好ましくはＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質のＮ及び／またはＣ末端に位置する分泌または精製のためのシグナル配列または他の異種アミノ酸部分を含み得るＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質のプレまたはプロフォームをコードし得る。異種アミノ酸部分はプロテアーゼ開裂部位、例えば因子Ｘ３、トロンビン、またはＩｇＡプロテアーゼ開裂部位を介して第１及び／または第２ドメインに連結され得る。本発明の核酸配列の具体例を配列番号１６として表６に示す。この核酸分子は配列番号１４の融合ポリペプチドをコードする。

核酸分子は発現調節配列、例えば所望の宿主細胞において核酸分子を発現させることができる発現調節配列に機能し得る形で連結され得る。核酸分子はベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、ウイルスベクター、染色体組込みベクター等上に位置し得る。適切な発現調節配列及びベクターの例は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、またはそのより最新版に記載されている。

本発明のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸配列を発現させるために各種発現ベクター／宿主細胞系が使用され得る。適切な宿主細胞には、原核細胞、例えば大腸菌のような細菌、真核宿主細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない。更に、本発明は、上記した核酸分子を形質転換またはトランスフェクトした非ヒト生物に関する。このようなトランスジェニック生物は相同組換えを含めた遺伝子移入の公知方法により作成され得る。

本発明の更なる態様は、いずれも本明細書中に記載されている少なくとも１つのＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質、該タンパク質をコードするそれぞれの核酸、或いは形質転換またはトランスフェクト細胞を活性成分として含む医薬または診断組成物に関する。

本明細書中で使用されている用語「ＴＲＡＩＬ関連疾患または障害」は、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストの付加により改善され得る疾患または障害である。いずれも本明細書中に記載されている少なくとも１つのＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質、該タンパク質をコードするそれぞれの核酸、或いは形質転換またはトランスフェクト細胞が治療において、例えばＴＲＡＩＬの機能不全に起因する、関連する、及び／または伴う障害、特に増殖性障害、例えば固形またはリンパ系腫瘍のような腫瘍；感染性疾患；炎症性疾患；代謝性疾患；自己免疫障害、例えばリウマチ様及び／または関節炎疾患；変性疾患、例えば多発性硬化症のような神経変性疾患；アポトーシス性疾患または移植片拒絶の予防及び／または治療において使用され得る。

本明細書中で使用されている用語「ＴＲＡＩＬの機能不全」は、ＴＲＡＩＬの正常な機能または発現から外れるＴＲＡＩＬの機能または発現、例えばＴＲＡＩＬ遺伝子またはタンパク質の過剰発現；ＴＲＡＩＬの正常な生理学的発現レベルと比較してＴＲＡＩＬ遺伝子またはタンパク質の低下乃至消失した発現；ＴＲＡＩＬの高い活性；ＴＲＡＩＬの低下乃至消失した活性；任意の結合パートナー、例えば受容体、特にＴＲＡＩＬ受容体または別のサイトカイン分子に対するＴＲＡＩＬの高い結合；ＴＲＡＩＬの正常な生理学的活性または結合と比較して任意の結合パートナー、例えば受容体、特にＴＲＡＩＬ受容体または別のサイトカイン分子に対する低下乃至消失した結合と理解すべきである。

各種実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体を標的とすることにより診断及び／または治療され得る障害を患っているヒト被験者の診断及び／または治療方法が提供され、その方法は、ヒト被験者中の１つ以上の標的の活性に対する作用が作動性であり、１つ以上の症状が緩和され、及び／または治療が成功するようにヒト被験者に対して本明細書中に開示されているＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を投与することを含む。本発明で提供されるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は、原発性及び転移性癌、例えば乳房、結腸、直腸、肺（例えば、小細胞肺癌“ＳＣＬＣ”及び非細胞小細胞肺癌“ＮＳＣＬＣ”）、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝、胆嚢及び胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱及び尿路上皮を含む）、女性生殖路（子宮頸管、子宮及び卵巣、及び絨毛癌及び妊娠性絨毛性疾患を含む）、男性生殖路（前立腺、精嚢、精巣及び胚細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎及び下垂体を含む）及び皮膚の癌；血管腫、黒色腫及び肉腫（骨及び軟組織に起因するもの、及びカポジ肉腫を含む）；脳、神経、眼及び髄膜の腫瘍（星状膠細胞腫、神経膠腫、神経膠芽症、網膜芽腫、神経腫、神経芽腫、神経鞘腫及び髄膜腫を含む）；造血性悪性疾患、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、造血性悪性疾患、カポジ肉腫、悪性リンパ腫、悪性組織球症、悪性メラノーマ、多発性骨髄腫、悪性疾患の腫瘍随伴性症候群／高カルシウム血症、または固形腫瘍に起因する腫瘍を患っているヒトを診断及び／または治療するために使用され得る。

本明細書中に開示されているＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態では、医薬組成物は少なくとも１つの障害を治療するための追加治療薬を含む。例えば、追加治療薬は、治療薬、化学療法薬、造影剤、細胞傷害性物質、血管形成インヒビター、キナーゼインヒビター（ＫＤＲ及びＴＩＥ−２インヒビターが含まれるが、これらに限定されない）、共刺激分子モジュレーターまたは免疫チェックポイントインヒビター（抗Ｂ７．１、抗Ｂ７．２、抗Ｂ７．３、抗Ｂ７．４、抗ＣＤ２８、抗Ｂ７ＲＰ１、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ２、抗ＩＣＯＳ、抗ＬＡＧ−３、抗Ｔｉｍ３、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＢＴＬＡ、光融合タンパク質、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＯＸ４０、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ２７、抗ＧＡＬ９、抗Ａ２ＡＲ、抗ＫＩＲ、抗ＩＤＯ−１、抗ＣＤ２０が含まれるが、これらに限定されない）、樹状細胞／抗原提示細胞モジュレーター（抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ、抗デクチン−１、抗ＣＤ３０１、抗ＣＤ３０３、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ２０７、抗ＤＮＧＲ１、抗ＣＤ２０５、抗ＤＣＩＲ、抗ＣＤ２０６、抗ＩＬＴ７が含まれるが、これらに限定されない）、トル様受容体に対するモジュレーター（抗ＴＬＲ−１、抗ＴＬＲ−２、抗ＴＬＲ−３、抗ＴＬＲ−４、抗ＴＬＲ−４、抗ＴＬＲ−５、抗ＴＬＲ−６、抗ＴＬＲ−７、抗ＴＬＲ−８、抗ＴＬＲ−９が含まれるが、これらに限定されない）、接着分子ブロッカー（抗ＬＦＡ−１抗体、抗Ｅ／Ｌセレクチン抗体、小分子インヒビターが含まれるが、これらに限定されない）、抗サイトカイン抗体またはその機能性フラグメント（抗ＩＬ−１８、抗ＴＮＦまたは抗ＩＬ−６／サイトカイン受容体抗体が含まれるが、これらに限定されない）、二重特異性逆方向Ｔ細胞またはＮＫ細胞傷害剤（ＢｉＴＥ（Ｒ）が含まれるが、これらに限定されない）、キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ−Ｔ）を主成分とする治療薬、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を主成分とする治療薬、治療用癌ワクチン、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能標識またはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋ブロッカー、抗微生物薬、抗乾癬薬、コルチコステロイド、同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫治療薬、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性治療薬、抗鬱薬、抗精神薬、刺激薬、喘息治療薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたはアナログ、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストであり得る。

実施形態では、癌の治療方法において、または本明細書中に記載されている腫瘍からの転移の予防または抑制において、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は単独で、または１つ以上の追加物質、例えば化学療法剤、放射線療法剤または生物学的物質と組み合わせて使用され得る。幾つかの実施形態では、前記物質には、１３−シス−レチノイン酸、２−ＣｄＡ、２−クロロデオキアデノシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、５−ＦＵ、６−メルカプトプリン、６−ＭＰ、６−ＴＧ、６−チオグアニン、アブラキサン、アキュテイン（Ｒ）、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン（Ｒ）、アドルシル（Ｒ）、アフィニトール（Ｒ）、アグリリン（Ｒ）、アラ−コート（Ｒ）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ、アリトレチノイン、アルカバン−ＡＱ（Ｒ）、アルケラン（Ｒ）、全トランス型レチノイン酸、αインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン（Ｒ）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、Ａｒａ−Ｃアラネスプ（Ｒ）、アレディア（Ｒ）、アリミデックス（Ｒ）、アロマシン（Ｒ）、アラノン（Ｒ）、三酸化ヒ素、アーゼラ（ＴＭ）、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ、アバスチン（Ｒ）、アザシチジン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ＢＥＸＸＡＲ（Ｒ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ、ブレノキサン（Ｒ）、ブレオマシイン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス（Ｒ）、Ｃ２２５、ロイコボリンカルシウム、キャンパス（Ｒ）、カンプトサー（Ｒ）、カンプトテシン−１１、カペシタビン・カラック（ＴＭ）、カルボプラチン、カルスタチン、カルスタチン・ウェファー、カソデックス（Ｒ）、ＣＣ−５０１３、ＣＣＩ−７７９、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、セルビジン（Ｒ）、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボラム因子、クラドリビン、コルチゾン、コスメゲン（Ｒ）、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタドレン（Ｒ）、シタラピン、シタラビンリポソーム、シトサール−Ｕ（Ｒ）、シトキサン（Ｒ）、ダカルバジン、ダコゲン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシンリポソーム、ダウノキソーム（Ｒ）、デカドロン、デシタビン、デルタコーテフ（Ｒ）、デルタゾン（Ｒ）、ダニロイキン、ディフティトックス、デポサイト（ＴＭ）、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、デキソナ、デクスランゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、ジオデックス、ドセタキセル、ドキシル（Ｒ）、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、ドロキシア（ＴＭ）、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（Ｒ）、デュラロン（Ｒ）、デュベリシブ、エフデックス（Ｒ）、エリガード（ＴＭ）、エレンス（ＴＭ）、エロキサチン（ＴＭ）、エルスパー（Ｒ）、エムサイト（Ｒ）、エピルビシン、エポエチンアルファ、アービタックス、エルロチニブ、エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エチオールエトポホス（Ｒ）、エトポシド、リン酸エトポシド、ユーレキシン（Ｒ）、エベロリムス、エビスタ（Ｒ）、エキセメスタン、ファレストン（Ｒ）、ファスロデックス（Ｒ）、フェマーラ（Ｒ）、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラ（Ｒ）、フルダラビン、フルオロプレクス（Ｒ）、フルオロウラシル、フルオロウラシル（クリーム）、フルオキシメステロン、フルタミダ、フォリン酸、ＦＵＤＲ（Ｒ）、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ジェムザール、グリーベック（ＴＭ）、グリアデル（Ｒ）ウェファー、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＳＦ）、ハロテスチン（Ｒ）、ハーセプチン（Ｒ）、ヘキサドロール、ヘキサレン（Ｒ）、ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ハイカムチン（Ｒ）、ハイドレア（Ｒ）、ハイドロコート酢酸塩（Ｒ）、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸ハイドロコートン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イブリツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、イダマイシン（Ｒ）、イダルビシン・イフェックス（Ｒ）、インターフェロンα、インターフェロンα２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）、イホスファミド、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、メシル酸イマチニブ、イミダゾールカルボキシアミド、イントロンＡ（Ｒ）、イピリムマブ、イレッサ（Ｒ）、イリノテカン、イソトレチノイン、イキサベピロン、イグゼンプラ（ＴＭ）、カドサイクル（Ｒ）、キドロラーゼ（ｔ）ラナコート（Ｒ）、ラパチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＬＣＲ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、リューケラン、リューカイン（ＴＭ）、ロイプロリド、ロイコクリスチン、ロイスタチン（ＴＭ）、リリルマブ、リポソーマルＡｒａ−Ｃ、リキッドＰｒｅｄ（Ｒ）、ロムスチン、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、リュープロン（Ｒ）、リュープロン・デポ（Ｒ）、マチュラン（Ｒ）、マキシデックス、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メドラロン（Ｒ）、メドロール（Ｒ）、メゲース（Ｒ）、メゲストロール、酢酸メゲストロール、ＭＥＫインヒビター、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス（ＴＭ）、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、メチコルテン（Ｒ）、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロンＭ−プレドニゾール（Ｒ）、ＭＴＣ、ＭＴＸ、マスタージェン（Ｒ）、ムスチン、ムタマイシン（Ｒ）、マイレラン（Ｒ）、マイロセル（ＴＭ）、マイロターグ（Ｒ）、ナビトクラックス、ナベルビン（Ｒ）、ネララビン、ネオサール（Ｒ）、ニューラスタ（ＴＭ）、ニューメガ（Ｒ）、ニューポジェン（Ｒ）、ネクサバール（Ｒ）、ニランドロン（Ｒ）、ニロチニブ、ニルタミド、ニペント（Ｒ）、ナイトロジェンマスタード・ノバルデックス（Ｒ）、ニボルマブ、ノバントロン（Ｒ）、エヌプレート、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、オファツムマブ、オンカスパー（Ｒ）、オンコビン（Ｒ）、オンタック（Ｒ）、オンキサル（ＴＭ）、オプレルベキン、オラプレッド（Ｒ）、オラソン（Ｒ）、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルタンパク質結合、パミドロネート、パニツムマブ、パンレチン（Ｒ）、パラプラチン（Ｒ）、パゾパニブ、ペディアプレド（Ｒ）、ＰＥＧインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィラグラスチム、ＰＥＧ−イントロン（ＴＭ）、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ペメトレキセド、ペンブロリズマブ、ペントスタチン、ペルツズマブ、フェニルアラニンマスタード、ピジリズマブ、プラチノール（Ｒ）、プラチノール−ＡＱ（Ｒ）、プレドニゾロン、プレトニゾン、プレロン（Ｒ）、プロカルバジン、プロクリット（Ｒ）、プロロイキン（Ｒ）、プロリフェプロスパン２０とカムスチンインプラント、プリントール（Ｒ）、ＢＲＡＦインヒビター、ラロキシフェン、レブリミド（Ｒ）、リウマトレックス（Ｒ）、リツキサン（Ｒ）、リツキシマブ、ロフェロン−Ａ（Ｒ）、ロミプロスチム、ルベックス（Ｒ）、ルビドマイン塩酸塩、サンドスタチン（Ｒ）、サンドスタチンＬＡＲ（Ｒ）、サルグラモスチム、ソル・コーテフ（Ｒ）、ソル・メドロール（Ｒ）、ソラフェニブ、スプリセル（ＴＭ）、ＳＴＩ−５７１、スティバグラ（ＴＭ）、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、スーテント（Ｒ）、タモキシフェン・タルセバ（Ｒ）、タルグレチン（Ｒ）、タシグナ（Ｒ）、タキソール（Ｒ）、タキソテレ（Ｒ）、テモダール（Ｒ）、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、サロミド（Ｒ）、テラシス（Ｒ）、チオグアニン、チオグアニン・タブロイド（Ｒ）、チオホスファミド、チオプレックス（Ｒ）、チオテパ、ＴＩＣＥ（Ｒ）、トポサル（Ｒ）、トポテカン、テレミフェン、トーリセル（Ｒ）、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレアンダ（Ｒ）、トレメリムマブ、トレチノイン、トレキサル（ＴＭ）、トリセノックス（Ｒ）、ＴＳＰＡ、タイケルブ（Ｒ）、ウレルマブ、ＶＣＲ、ベクティビックス（ＴＭ）、ベルバン（Ｒ）、ベルケイド（Ｒ）、ベネトクラックス、ベプシド（Ｒ）、ベサノイド（Ｒ）、ビアデュール（ＴＭ）、ビダーザ（Ｒ）、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、ビンカサルＰｆｓ（Ｒ）、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＬＢ、ＶＭ−２６、ボリノスタット、ヴォトリエント、ＶＰ−１６、ブモン（Ｒ）、ゼローダ（Ｒ）、ザノサー（Ｒ）、ゼヴァリン（ＴＭ）、ザインカード（Ｒ）、ゾラデックス（Ｒ）、ゾレドロン酸、ゾリンザ、またはゾメタ（Ｒ）、及び／または類似の経路を標的とするここに具体的にリストされていない他の物質が含まれ得る。

２つ以上の物質または成分を配合治療レジメンの一部として使用しようとする場合、これらは同一投与ルートまたは異なる投与ルートを介して本質的に同時にまたは異なる時に（例えば、本質的に同時に、連続的に、または交互レジメに従って）投与され得る。物質または成分を同一投与ルートを介して同時に投与しようとする場合、これらは当業者に自明のように異なる医薬製剤または組成物、または配合医薬製剤または組成物の一部として投与され得る。

また、２つ以上の活性物質または成分を配合治療レジメンの一部として使用しようとする場合、該物質または成分の各々はその化合物または成分を独立して使用するときに使用されるのと同一の量で、同一のレジメンに従って投与され得、併用により相乗効果が得られることも得られないこともある。しかしながら、２つ以上の活性物質または成分の併用により相乗効果が得られる場合には、なお所望の治療効果を得ながら、投与しようとする物質または成分の１つ、２つ以上またはすべての量を減らすことも可能であり得る。これは、なお所望の医薬または治療効果を得ながらも、例えば１つ以上の物質または成分をその通常の使用量で使用したときに関連する望ましくない副作用を回避、制限または抑制するために有用であり得る。

本発明に従って使用される治療レジメンの有効性は、臨床医にとって明らかな関与する疾患または障害についてそれ自体公知の方法で調べ、及び／または追跡され得る。臨床医は、所望の治療効果を得るため、望ましくない副作用を回避、制限または抑制するために、及び／または所望の治療効果の達成と望ましくない副作用の回避、制限または抑制との適切なバランスを得るために、必要に応じて、ケースバイケースで特定の治療レジメンを変更または改変することもできる。

通常、治療レジメンは、所望の治療効果が得られるまで、及び／または所望の治療効果が維持される限り続けられる。これもまた臨床医により決定され得る。

各種実施形態では、単独、または予防薬、治療薬と組み合わせた１つ以上のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質、及び／または医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物が提供される。各種実施形態では、本明細書中に開示されている医薬組成物の使用の非限定例には、障害の診断、検出及び／またはモニタリング；障害または１つ以上のその症状の予防、治療、管理及び／または緩和；及び／または研究が含まれる。単独、または予防薬、治療薬、及び／または医薬的に許容され得る担体と組み合わせた医薬組成物の処方は当業者に公知である（米国特許出願公開Ｎｏ．２００９０３１１２５３ Ａ１）。

各種実施形態では、医薬製剤は、１つ以上のアミノ酸、１つ以上の多糖及び／またはポリソルベート、及び終点を含めて約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．１〜１０、１〜１０、．０１〜５０、１〜５０、１〜１００、１０〜１００、２５〜１００、２５〜５０、または５０〜１００ｍｇ／ｍｌ）の濃度で存在するＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を含み、該製剤は終点を含めて約５．０〜７．０のｐＨ（例えば、約５．０〜６．０、５．５〜６．０、５．０〜６．５、５．５〜６．５、または６．０〜７．０のｐＨ）を有する。実施形態では、製剤中の少なくとも１つのアミノ酸はヒスチジンであり、約１０〜２０ｍＭ、１０〜１５ｍＭ、１５〜２０ｍＭ、または約１５ｍＭの濃度で存在している。実施形態では、製剤中の少なくとも１つの多糖はスクロースであり、約０〜８．０％重量／容量（ｗ／ｖ）の濃度で存在している。実施形態では、製剤中のポリソルベートはポリソルベート８０であり、約０〜０．０６％ｗ／ｖの濃度で存在している。実施形態では、製剤中の少なくとも１つのアミノ酸はアルギニンであり、約０〜１．５％ｗ／ｖ（例えば、０．５〜１．５、１．０〜１．５、または０．５〜１．０ｗ／ｖ）の濃度で存在している。実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は製剤中に約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１〜１００ｍｇ／ｍｌ、約１〜１５ｍｇ／ｍｌ、約１〜７．５ｍｇ／ｍｌ、約２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、約５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、約２５〜１００ｍｇ／ｍｌ、約２０〜６０ｍｇ／ｍｌ、約２５〜５０ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜６０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０〜６０ｍｇ／ｍｌ、約０．５〜６０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５−２．０ｍｇ／ｍｌ、約１〜５ｍｇ／ｍｌ、約１〜７．５ｍｇ／ｍｌ、約１〜１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍ）の濃度で存在している。

本明細書中で使用されているフレーズ「有効量」は、ＴＲＡＩＬの機能不全、またはＴＲＡＩＬ関連疾患または障害に関連する１つ以上のパラメーターの検出可能な改善（例えば、ベースラインから少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、またはそれ以上）をもたらすＴＲＡＩＬアゴニストタンパク質の量を意味する。

各種実施形態では、医薬製剤は水性製剤、凍結乾燥製剤、または凍結乾燥・再水和製剤である。実施形態では、水和溶液はデキストロース及び／または食塩水（例えば、約５％ｗ／ｖの濃度のデキストロース、及び／または約０．９％ｗ／ｖの濃度の食塩水）である。実施形態では、医薬製剤は約１５ｍＭ ヒスチジン、約０．０３％（ｗ／ｖ） ポリソルベト８０、約４％（ｗ／ｖ） スクロース、及び約０．１〜２５ｍｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質または約１〜１５ｍｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を含み、約６のｐＨを有する。実施形態では、製剤は更に少なくとも１つの追加物質を含む。

各種実施形態では、約２５ｍｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質、約１５ｍＭ ヒスチジン、０．０３％ ポリソルベート８０（重量／容量，ｗ／ｖ）、４．０％ スクロース（ｗ／ｖ）を含有し、約６．０のｐＨを有する製剤を使用する。幾つかの実施形態では、製剤はアルギニンを含まない。幾つかの実施形態では、製剤は、他の成分または濃度を含む他の製剤と比較して予期せぬほど改良された凍結融解安定性、液体製剤安定性、及び／または凍結乾燥製剤安定性を示す。

本発明で提供される治療薬の投与方法には、経口投与、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与、粘膜投与（例えば、鼻腔内及び経口ルート）、及び肺内投与（例えば、吸入器またはネブライザーを用いて投与されるエアゾール化化合物）が含まれるが、これらに限定されない。特定の投与ルートのための医薬組成物の処方、及び各種投与方法に必要な材料及び技術は入手可能であり、当業者に公知である（米国特許出願公開Ｎｏ．２００９０３１１２５３ Ａ１）。

各種実施形態では、用量レジメンは最適の所望応答（例えば、治療または予防応答）を与えるように調節され得る。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、複数の分割量を経時的に投与してもよい。または、用量は治療状況の緊急性により示されるように比例的に減少または増加され得る。幾つかの実施形態では、非経口組成物は投与が容易であり、用量が均一であるために用量単位形態で処方される。用語「投与単位形態」は、治療対象の哺乳動物被験者に対する単位用量として適切な物理的にばらばらの単位を指す。各単位は所望の治療効果を生ずるように計算した活性化合物の所定量及び必要な医薬担体を含有している。

本発明で提供されるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質の治療または予防有効量の代表的な非限定的範囲は約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１〜０．５、０．１〜１、０．１〜１０、０．１〜２０、０．１〜５０、０．１〜７５、１〜１０、１〜１５、１〜７．５、１．２５〜１５、１．２５〜７．５、２．５〜７．５、２．５〜１５、５〜１５、５〜７．５、１〜２０、１〜５０、７〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、１０〜２０、１０〜５０、１０〜７５、または１０〜１００ｍｇ／ｋｇ、またはその範囲の濃度）である。幾つかの実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は医薬組成物中に治療有効濃度で、例えば約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．１〜０．５、０．１〜１、０．１〜１０、０．１〜２０、０．１〜５０、０．１〜７５、１〜１０、１〜２０、１〜５０、１〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、１０〜２０、１０〜５０、１０〜７５、または１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、またはその範囲の濃度）の濃度で存在している。用量値は緩和しようとする状態のタイプ及び／または重症度に応じて変更し得ることに注目されたい。特定被験者に対する具体的用量レジメンは個人の必要性、及び／または組成物を投与する人またはその投与を監視する人のプロの判断に従って経時的に調節され得、本明細書中に記載されている用量範囲は例示に過ぎず、特許請求されている組成物の範囲または実施を限定すると意図するものではないことをさらに理解されたい。

１．ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質（ｓｃ ＴＲＡＩＬ ｗｔ）の製造
１．１ ポリペプチド構造
Ａ）アミノ酸Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ２０
Ｉｇ−Ｋａｐｐａ−シグナルペプチド、アミノ酸Ｇｌｙ２０の後に想定シグナルペプチダーゼ開裂部位。
Ｂ）アミノ酸Ｇｌｎ２１−Ｇｌｙ１８２
ヒトＴＲＡＩＬリガンドの第１可溶性サイトカインドメイン（ＴＲＡＩＬ，配列番号１のアミノ酸１２０−２８１）。
Ｃ）アミノ酸Ｇｌｙ１８３−Ｓｅｒ１９０
配列番号２の第１ペプチドリンカーエレメント。
Ｄ）アミノ酸Ａｒｇ１９１−Ｇｌｙ３５１
ヒトＴＲＡＩＬリガンドの第２可溶性サイトカインドメイン（ＴＲＡＩＬ，配列番号１のアミノ酸１２１−２８１） 。
Ｅ）アミノ酸Ｇｌｙ３５２−Ｓｅｒ３５９
配列番号２の第２ペプチドリンカーエレメント。
Ｆ）アミノ酸Ａｒｇ３６０−Ｇｌｙ５２０
ヒトＴＲＡＩＬリガンドの第３可溶性サイトカインドメイン（ＴＲＡＩＬ，配列番号１のアミノ酸１２１−２８１）。
Ｇ）アミノ酸Ｇｌｙ５２１−Ｃｙｓ５４２
配列番号１１のヒンジ−リンカーエレメント。
Ｈ）アミノ酸Ｐｒｏ５４３−Ｌｙｓ７６０
配列番号１０の抗体Ｆｃフラグメントドメイン。

上記ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を配列番号１４に示す。

指定のリンカーを他の好ましいリンカー、例えば配列番号３〜９に示すリンカーに代えてもよい。

第１及び第２ペプチドリンカーが同一である必要がないことに注目すべきである。

シグナルペプチド配列（Ａ）を他の適切なもの、例えば哺乳動物シグナルペプチド配列に代えてもよい。

１．２ ポリペプチドをコードする遺伝子カセット
合成遺伝子は適切な宿主細胞、例えば昆虫細胞または哺乳動物細胞中での発現のためのそのコドン使用の点で最適化され得る。好ましい核酸配列を配列番号１６に示す。

２．発現及び精製
融合ポリペプチドのクローニング、発現及び精製
上記した融合タンパク質を２つの異なる真核宿主細胞において組換え発現させた。

上記したＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト融合タンパク質の最初の分析のために、１０％ ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）中で増殖させたＨｅｋ２９３Ｔ細胞に融合ポリペプチド及び適切な選択マーカーのための発現カセット、例えばブラストサイジン、ピューロマイシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子を含む機能発現カセットを含むプラスミドを一過的にトランスフェクトした。最終産物を得るために複数のポリペプチド鎖を必要とする場合には、トランスフェクション中発現カセットを１つのプラスミド上で組み合わせるか、または異なるプラスミド上に配置した。トランスフェクションから３日後に組換え融合ポリペプチドを含有している細胞培養物上清を収集し、３００×ｇで遠心後０．２２μｍ滅菌フィルターを介する濾過により清澄化した。

インビボで使用しようとするＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト融合タンパク質の大規模発現のために、上記タンパク質をコードする合成ＤＮＡカセットを適切な選択マーカー（例えば、ブラストサイジン、ピューロマイシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子を含む機能発現カセット）及び宿主細胞ゲノム内の転写的に活性な挿入部位の数を高めるのに適切な遺伝エレメントを含む真核発現ベクターに挿入した。配列検証済み発現ベクターを懸濁培養に適応したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にエレクトロポレーションにより導入した。トランスフェクトしてから３日後に適切な選択圧をトランスフェクト細胞に加えた。その後の選択圧下での培養によりベクター由来耐性遺伝子を有している生存細胞を回収した。選択細胞プールをオービタルシェーカーインキュベーター（１００ｒｐｍ，５０ｍｍ振とう距離）を用いて合成培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２−ＣＤ，Ｌｏｎｚａ）中３７℃、７％ ＣＯ_２雰囲気下で安定増殖させ、個々の上清を上記タンパク質を検出するＥＬＩＳＡアッセイにより分析し、タンパク質産生前に最高の比生産性を有する細胞プールをシェークフラスコ（オービタルシェーカー，１００ｒｐｍ，振とう距離５０ｍｍ）で増大させた。

ラボスケールのタンパク質産生のために、個々の細胞プールをウェーブバイオリアクター２０／５０ ＥＨＴ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて合成培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２−ＣＤ，Ｌｏｎｚａ）中３７℃、７％ ＣＯ_２雰囲気で７〜１２日間培養した。基本培地は４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＰｏｗｅｒＣＨＯ２−ＣＤであった。０．３〜０．４×１０ｅ６細胞／ｍｌの生存細胞濃度及び以下の設定（５または１０リッターバッグの場合）：振とう回数１８ｒｐｍ、振とう角度７°、気流０．２〜０．３Ｌ／分、７％ ＣＯ_２、３６．５℃を用いてウェーブ培養を開始した。ウェーブラン中、細胞培養物にＰｏｗｅｒＦｅｅｄ Ａ（Ｌｏｎｚａ）を２回、通常２日目（２０％供給）及び５日目（３０％供給）に供給した。第２回の供給後、振とう回数を２２ｒｐｍに、振とう角度を８°に上げた。

通常細胞生存性が８０％以下に下がったときにバイオリアクターを７日目と１２日目の間に収集する。まず、培養上清を手動深濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ Ｐｏｄ，ＭＣ０ＨＣ ０．０５４ｍ^２）を用いて清澄化した。Ｓｔｒｅｐタグ付きタンパク質の場合、アビジンを０．５ｍｇ／Ｌの最終濃度まで加えた。最後に、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト融合タンパク質を含有している培養上清をボトルトップフィルター（０．２２μｍ，ＰＥＳ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて滅菌濾過し、更に処理するまで２〜８℃で保存した。

アフィニティー精製のために、ストレプタクチンセファロースを１５ｍｌのバッファーＷ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）またはＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化したカラム（ゲルベッド１ｍｌ）に充填し、細胞培養上清を４ｍｌ／分の流速でカラムに適用した。その後、カラムを１５ｍｌのバッファーＷで洗浄し、７×１ｍｌのバッファーＥ（１００ｍＭ トリスＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ デスチオビオチン，ｐＨ８．０）を添加することにより結合ポリペプチドを段階的に溶出させた。或いは、このステップのために２．５ｍＭ デスチオビオチンを含有しているＰＢＳ ｐＨ７．４を使用し得る。

ストレプタクチンセファロースをベースとする方法に代えて、アフィニティー精製をアフィニティーリガンドとして固定化タンパク質Ａを有するカラム及びＡｋｔａクロマトグラフィーシステム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。融合タンパク質のＦ_Ｃドメインに対して高いアフィニティーを有する固相材料ＭＡＢＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＴＭ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を選択した。簡単に説明すると、清澄化した細胞培養上清を洗浄バッファー１（２ｍＭ Ｐｉ，９５ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍｌ）にカラムベッド１ｍｌあたり１０ｍｇの融合タンパク質を超えない量で充填した。宿主細胞タンパク質及び宿主細胞ＤＮＡを欠失させるためにカラムを１０カラム容量（１０ＣＶ）の上記平衡バッファー、次いで４カラム容量（４ＣＶ）の洗浄バッファー２（２０ｍＭ Ｐｉ，９５ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で洗浄した。次いで、カラムを溶出バッファー（２０ｍＭ Ｐｉ，９５ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ３．５）を用いて溶出し、溶出液を各々がカラムベッド容量（５ｍｌ）に等しい容量を有する最高１０個の画分で集めた。各画分を等量の上記洗浄バッファー２を用いて中和した。線速度を１５０ｃｍ／ｈに設定し、上記アフィニティークロマトグラフィー方法中一定に維持した。溶出液画分のタンパク質量を定量し、ピーク画分を限外濾過により濃縮し、更にサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。

ＳＥＣをＡｋｔａクロマトグラフィーシステム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬまたはＨｉＬｏａｄ ２６／６０カラムで実施した。カラムをリン酸緩衝食塩液で平衡化し、濃縮し、アフィニティー精製したポリペプチドを２％（ｖ／ｖ）のカラム容量を超えないサンプル容量でＳＥＣカラムに充填した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の場合、０．５ｍｌｍｌ／分の流速を適用した。ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの場合、２．５ｍｌ／分の流速を適用した。ポリペプチドの溶出プロフィールを２８０ｎｍの吸光度によりモニターした。

精製融合ポリペプチドの見かけ分子量を天然条件下で測定するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムに既知分子量を有する標準タンパク質を充填した。標準タンパク質の溶出容量に基づいて検量線をプロットし、精製融合ポリペプチドの見かけ分子量を調べた。ＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト融合タンパク質を含むＦ_Ｃドメインは典型的には約１６０〜１８０ｋＤａのホモダイマーの見かけ分子量でＳｕｐｏｅｒｄｅｘ２００カラムから溶出した。

３．アポトーシスアッセイ
Ｊｕｒｋａｔ Ａ３永久Ｔ細胞株を用いる細胞アッセイを使用して、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト融合タンパク質のアポトーシス誘発活性を調べた。Ｊｕｒｋａｔ細胞をフラスコで１０％ ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）を用いて増殖させた。アッセイ前に、９６ウェルのマイクロタイタープレートに１００，０００細胞／ウェルを接種した。ウェルに対して異なる濃度の融合ペプチドを添加した後、３７℃で３時間インキュベートした。溶解バッファー（２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１０ｍＭ ＥＧＴＡ，５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，１００ｍＭ ＤＴＴ，１０ｍＭ ＡＥＢＳＦ，ｐＨ７．５）を添加することにより細胞を溶解し、プレートを氷上に３０分間〜２時間置いた。アポトーシスはカスパーゼ、例えばカスパーゼ３の上昇した活性に対応する。よって、アポトーシスの程度を調べるために特定カスパーゼ基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（Ｂｉｏｍｏｌ）の開裂を使用した。実際、カスパーゼ活性は、細胞をヨウ化プロピジウム及びＨｏｅｃｈｓｔ−３３３４２で染色した後形態学的に調べたアポトーシス細胞のパーセンテージに相関している。カスパーゼ活性アッセイのために、２０μｌの細胞ライゼートを黒色９６ウェルのマイクロタイタープレートに移した。８０μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ スクロース、０．１％ ＣＨＡＰＳ、５０μＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ及び２５ｍＭ ＤＴＴを含有するｐＨ７．５のバッファーを添加した後、プレートをＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ５００マイクロタイタープレートリーダーに移し、蛍光強度（励起波長４００ｎｍ、発光波長５０５ｎｍ）の増加をモニターした。

３．１ 細胞死アッセイ
ＨＴ１０８０線維細胞肉腫細胞での細胞死を調べるために、１５，０００細胞を９６ウェルプレートで１０％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を補充したＲＰＭ１ １６４０培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）を用いて一晩平板培養した。細胞を２．５ｇ／ｍｌの最終濃度でシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）と共インキュベートした。バッファーＫＶ（０．５％ クリスタルバイオレット，２０％ メタノール）を用いて染色することにより細胞死を定量した。染色後、ウェルを水で洗浄し、風乾した。染料をメタノールで溶出させ、５９５ｎｍでの光学密度をＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定した。

４．安定性／凝集試験
４．１ 凝集分析の原則（可溶性タンパク質の定義）
モノマー（ＴＲＡＩＬ受容体結合モジュールの定義されているトリマーアセンブリ）及び凝集物の含量を実施例２に記載されている分析用ＳＥＣにより測定した。この特別の目的のために、分析を生理学的ｐＨの生理学的塩濃度を含有するバッファー（例えば、０．９％ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４；ＰＢＳ ｐＨ７．４）中で実施する。典型的な凝集分析はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行う。このカラムにより、１０〜８００ｋＤａの範囲のタンパク質が分離する。

天然条件下での精製融合ポリペプチドの見かけ分子量を測定するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムに公知の分子量を有する標準タンパク質を充填する。標準タンパク質の溶出容量に基づいて、検量線をプロットし、精製融合ポリペプチドの見かけ分子量を溶出容量に基づいて計算する。

可溶性非凝集性タンパク質、例えばトリマーＴＲＡＩＬのＳＥＣ分析は、典型的には規定の溶出容量ではっきりした１つのタンパク質ピークを示す。この溶出容量は特定タンパク質の見かけ天然分子量に相当し、一次アミノ酸配列に基づいて計算した理論分子量におおよそ従う。

タンパク質凝集が生じているならば、ＳＥＣ分析はより低い保持容量で追加のタンパク質ピークを示す。ＴＲＡＩＬの場合、可溶性タンパク質の凝集は特徴的な方法で生ずる。タンパク質は「トリマー」のオリゴマーを形成する傾向にあり、ノナマー（３×３）及び２７マー（３×９）を形成する。これらのオリゴマーは凝集種として機能し、高含量のオリゴマーが潜在的にタンパク質の凝集をもたらす。高分子量のオリゴマー及び凝集物はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの空隙容量で溶出し、その天然分子量に関してＳＥＣにより分析され得ない。

（完全）凝集の誘発のために、ＴＲＡＩＬ−ＳＦ融合タンパク質の精製標本は、好ましくは規定されているトリマータンパク質のみ、非常に少量のオリゴマー化タンパク質のみを含有していなければならない。特定ＴＲＡＩＬ−ＳＦタンパク質標本の凝集／オリゴマー化の程度は、それぞれ規定トリマー及びオリゴマー／凝集物フラクションについてのＯＤ２８０ダイアグラムのピーク面積を計算することによりＳＥＣ分析に基づいて調べられる。全ピーク面積に基づいて、規定トリマータンパク質のパーセントを次のように計算する：
（トリマー含量の％＝［トリマーのピーク面積］／［全ピーク面積］×１００）
本明細書で使用されている可溶性タンパク質についての定義は、０．２〜１０．０ｍｇ／ｍｌの典型的なタンパク質濃度範囲内で＞９０％の規定可溶性タンパク質（ＴＲＡＩＬドメインのトリマーアセンブリ）含量を含有している生理学的ｐＨで生理学的塩濃度のバッファー中の精製ＴＲＡＩＬタンパク質のタンパク質標本を指す。

５．半減期測定
分子Ａ〜Ｄの各々は鎖間ジスルフィド結合により共有結合している２つのポリペプチドからなる。これらの特性に影響を及ぼす効果がこれらの化合物の半減期に対して有しているかを調べるために、グリコサイト及び（タンパク質間に鎖間ジスルフィド結合を生じさせる）ヒンジシステインの数を調べた。

雌ＮＭＲＩマウスを単回静脈内ボーラス注射として１．２ｍｇ／ｋｇ体重及び／または４ｍｇ／ｋｇ体重の特定化合物で処置した。施用前に（投与前に）、供試品投与後最長１６８時間まで全血液を集めた。血清を作成し、血清濃度を測定するまでサンプルを−８０℃で保存した。薬物動態濃度を平均血清濃度及びノンコンパートメント薬物動態データ分析（Ｓｕｍｍｉｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，コロラド州モントローズ）の薬物動態評価プログラムＰＫソリューションズバージョン２．０を用いて計算した。ＰＫソリューションズは、例えば静脈内または血管外ルートで投与後の生物学的サンプルの分析から得た濃度−時間データから薬物動態パラメーターを算定する自動化Ｅｘｃｅｌベースのアプリケーションである。ＰＫソリューションズは特定のコンパートメントモデルを仮定することなく結果を計算する。

血清中の供試品の定量は、Ｓｔｒｅｐタグが分子の一部であるかに関係なく、表７に示す個々のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストを検出するＥＬＩＳＡアッセイを用いて実施した。一般的レイアウトを図１８に示す。結果を表７に要約する。

分子Ａ（２つの配列番号２６のポリペプチドからなる）は２つのヒンジシステイン（２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する）及びＦｃ領域の２９７位（ＥＵインデックスに従う）にＮ残基を有しており、野生型ＣＨ２グリコシル化が生ずる。分子Ａは１６８位及び３３７位にグリコサイトをも有する。分子Ｂ（２つの配列番号１９のポリペプチドからなる）は（５１３位、５１９位及び５２２位に）３つのヒンジシステイン（３つの鎖間ジスルフィド結合を形成する）及びＦｃ領域の２９７位（ＥＵインデックスに従う）にＮ２９７Ｓ変異を有しており、ＣＨ２ドメインの脱グリコシル化が生ずる。分子Ｂは１６８位及び３３７位にグリコサイトをも有する。分子Ｃ（２つの配列番号２７のポリペプチドからなる）は３つのヒンジシステイン（３つの鎖間ジスルフィド結合を形成する）及びＦｃ領域の２９７位（ＥＵインデックスに従う）にＮ２９７Ｓ変異を有しており、ＣＨ２ドメインの脱グリコシル化が生ずる。更に、グリコサイトは１６８位（リンカー１）にあるが、３３７位（リンカー２）にはない。分子Ｄ（２つの配列番号２８のポリペプチドからなる）は３つのヒンジシステイン（３つの鎖間ジスルフィド結合を形成する）及びＦｃ領域の２９７位（ＥＵインデックスに従う）にＮ２９７Ｓ変異を有しており、ＣＨ２ドメインの脱グリコシル化が生ずる。更に、分子Ｄ中ではリンカー１及びリンカー２（それぞれ、１６８位及び３３７位置）上のグリコサイトが欠失している。

分子Ｂ（両リンカーのグリコシル化、ＣＨ２グリコサイトの欠失、第３ヒンジシステインの付加）の（化合物の半減期により判断される）インビボ安定性は分子Ａと比較して強化された。更に、化合物（分子Ｄ）からすべてのグリコサイトが欠失すると、インビボ安定性が低下し、一過性発現中の生産性は低い。分子Ｃ（第１リンカーのグリコシル化、第２リンカーの脱グリコシル化、ＣＨ２グリコサイトの欠失）は、分子Ｂ及びＤと比較して中間のインビボ安定性を示した（表７中の結果を参照されたい）。

これらの実験結果から、（リンカー１及び２の両方における）リンカーグリコシル化に第３鎖間ジスルフィド結合（ヒンジシステインの付加による）及びＦｃ領域中のＣＨ２ドメインの脱グリコシル化を組み合わせると、本発明の分子のインビボ安定性が向上することが証明される。

６．有効性のインビトロ証明
６．１ 配列番号１９のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質はインビトロでヒト血液系及び固形腫瘍細胞の生存を抑制する
腫瘍細胞を９６ウェルプレートで１０％ ＦＢＳを含有している推奨培地中に１０，０００細胞／ウェルで接種し、配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を用いて湿気のある５％ ＣＯ_２雰囲気中３７℃で２４時間処理した。その後、細胞生存性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｒ）試薬を製造業者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ；ウィスコンシン州マディソン）に記載されているように用いて評価した。ＩＣ_５０値は非処理対照細胞に対して正規化した濃度応答データの非線形回帰分析により調べた。配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質治療に応答して細胞生存性が低下することを示す得られたＣｏｌｏ２０５、Ｊｕｒｋａｔ及びＳＫＭ−１細胞についての濃度応答曲線の例を図１９に示す。表８は、配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質で２４時間処理した血液系（Ａ；（ｎ＝４０；非ホジキンリンパ腫，ＮＨＬ；急性骨髄性リンパ腫，ＡＭＬ；急性リンパ芽球性白血病，ＡＬＬ）及び固形腫瘍（Ｂ；（ｎ＝４４；非小細胞肺癌，ＮＳＣＬＣ；膵臓；結腸直腸癌，ＣＲＣ；乳癌，ＢｒＣａ；卵巣；線維肉腫；頭頸部，Ｈ＆Ｎ；小細胞肺癌，ＳＣＬＣ）細胞株のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｒ）により評価した生存性の結果を示す。配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質媒介の腫瘍細胞生存性に対するＩＣ_５０の結果を示す。

６．２ 配列番号１９のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質は抗腫瘍剤と相乗的に作用して腫瘍細胞死を誘発する
腫瘍細胞を９６ウエルプレートで１０％ ＦＢＳを含有している推奨培地中に１０，０００細胞／ウェルで接種し、配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質をベネトクラックス（ＡＢＴ−１９９）、ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）またはドセタキセル（ＤＴＸ）と一緒に用いて湿気のある５％ ＣＯ_２雰囲気中３７℃で２４時間処理した。その後、細胞生存性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｒ）試薬を製造業者の説明書に記載されているように用いて評価した。Ｂｌｉｓｓ独立性モデル（Ｗｏｎｇら，２０１２；Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，１１：１０２６−１０３５；Ｂｅｒｎｅｂａｕｍ，１９８１，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３５：２６９−３３５；Ｂｏｒｉｓｙら，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：７９７７−７９８２）を用いて併用活性を評価し、負の整数は拮抗作用を示し、０の値は相加活性を示し、正の整数は相乗効果を示す。Ｂｌｉｓｓスコアを各配合剤についての用量マトリックスで計算し、総計して、「Ｂｌｉｓｓ合計」を得る。ヒト腫瘍細胞を配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質とベネトクラックス、ナビトクラックスまたはＤＴＸと一緒に用いて処理することにより誘発される相乗的腫瘍細胞死の例を関連するＢｌｉｓｓ合計と共に図２０（Ａ〜Ｃ）に示す。多数の腫瘍細胞株においてこれらの配合剤について調べたＢｌｉｓｓ合計を表９に示す。

７．配列番号１９のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質治療はインビボで腫瘍増殖を抑制する
配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質の腫瘍増殖に対する効果をＳＣＩＤ雌マイス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；マサチューセッツ州ウィルミントン）に皮下移植したＣｏｌｏ２０５（結腸直腸癌）、ＳＫＭ−１（急性骨髄性白血病）及びＨ４６０ＬＭ（非小細胞肺癌）異種移植片腫瘍で評価した。簡単に説明すると、研究０日目にヒト癌細胞を雌ＳＣＩＤマウスの右後方脇腹に皮下接種した。サイズマッチ時に、配列番号１９のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質（指示されているように、０．３、１または３ｍｋｄ用量でＩＶ，ＱＤ×５、またはＩＰ，Ｑ２Ｄ×５）の投与を開始した。各群の平均腫瘍容積がＣｏｌｏ２０５及びＳＫＭ−１の場合＞２０００ｍｍ^３、またはＨ４６０ＬＭの場合＞２５００ｍｍ^３のエンドポイントに達するまで実験期間中腫瘍容積を測定した。結果を図２１〜２３に示す。配列番号１９に示されているアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を投与すると、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＫＭ−１及びＨ４６０ＬＭ異種移植片腫瘍モデルにおいて著しい腫瘍増殖抑制が誘発された。

配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質の腫瘍増殖に対する効果をＮＳＧ雌マウス（Ｃｈａｍｐｉｏｎｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；ニュージャージー州ハンケンサック）に移植した患者由来の異種移植片モデルＣＴＧ−００６９（結腸直腸）、ＣＴＧ−０１６７（ＮＳＣＬＣ）、ＣＴＧ−０２９３（膵臓）、ＣＴＧ−０７１４（肉腫）、ＣＴＧ−０１３６（食道）、ＣＴＧ−４８５（胃）及びＣＴＧ−０７８５（ユーイング肉腫）においても評価した。簡単に説明すると、研究０日目に、腫瘍断片を雌ＮＳＧマウスの右後方脇腹に皮下増殖させた。サイズマッチ時に、配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質（３ｍｋｄ用量でＩＰ，Ｑ２Ｄ×５）の投与を開始した。各群の平均腫瘍容積が＞２０００ｍｍ^３のエンドポイントに達するまで実験期間中または６０日間腫瘍容積を測定した。結果を図２４（Ａ〜Ｇ）に示す。配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を投与すると、ＣＴＧ−００６９（結腸直腸）、ＣＴＧ−０１６７（ＮＳＣＬＣ）、ＣＴＧ−０２９３（膵臓）、ＣＴＧ−０７１４（肉腫）、ＣＴＧ−０１３６（食道）、ＣＴＧ−４８５（胃）及びＣＴＧ−０７８５（ユーイング肉腫）ＰＤＸモデルにおいて著しい腫瘍増殖抑制が誘発された。

Claims (22)

1. 配列番号１９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質。
2. 配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質。
3. 前記２つのポリペプチドが、各ポリペプチドのシステイン残基５１３、５１９及び５２２間に形成された３つの鎖間ジスルフィド結合を介して共有結合している、請求項２に記載のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質。
4. 前記ポリペプチドの１６８位及び３３７位のアスパラギン残基の１個以上がＮ−グリコシル化されている、請求項１、２または３に記載のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質。
5. 前記ポリペプチドの１６８位及び３３７位のアスパラギン残基の両方がＮ−グリコシル化されている、請求項１、２または３に記載のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質。
6. 前記ポリペプチドが更に翻訳後修飾されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質。
7. 前記翻訳後修飾がＮ末端グルタミンのピログルタメートへの修飾を含む、請求項６に記載のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質及び１つ以上の医薬的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤及び／または佐剤を含む医薬組成物。
9. 請求項１に記載のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸分子。
10. 請求項９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
11. 請求項９に記載の核酸分子を含む細胞。
12. 真核細胞である、請求項１１に記載の細胞。
13. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１１に記載の細胞。
14. 前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１１に記載の細胞。
15. ＴＲＡＩＬ関連疾患または障害を有する被験者に対して有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストタンパク質を投与することを含む前記被験者の治療方法。
16. 前記疾患または障害が腫瘍、感染性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記腫瘍がリンパ系腫瘍である、請求項１６に記載の方法。
19. 前記自己免疫障害がリウマチ様疾患、関節炎疾患、またはリウマチ様関節炎疾患である、請求項１６に記載の方法。
20. 前記疾患または障害が関節リウマチである、請求項１６に記載の方法。
21. 前記変性疾患が神経変性疾患である、請求項１６に記載の方法。
22. 前記神経変性疾患が多発性硬化症である、請求項１６に記載の方法。

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