KR20170012257A - 단일-쇄 trail-수용체 작용제 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특이적 TRAIL 수용체 작용제 단백질, 이를 암호화하는 핵산, 및 TRAIL-관련 질환 또는 장애를 갖는 대상자의 치료 방법을 제공한다. 본원에 제공된 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 3개의 가용성 TRAIL 도메인 및 Fc 단편을 포함한다. TRAIL 수용체 작용제 단백질은 실질적으로 비-응집성이고, 치료학적, 진단적 및/또는 연구 적용을 위해 적합하다.

Description

단일-쇄 TRAIL-수용체 작용제 단백질{SINGLE-CHAIN TRAIL-RECEPTOR AGONIST PROTEINS}

관련 출원

본 출원은 2014년 4월 23일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/983,152호에 대한 우선권의 이권을 주장하고, 이의 전문이 본원에 참조로서 포함한다.

발명의 분야

본 발명은 3개의 가용성 TRAIL 도메인 및 Fc 단편을 포함하는 특이적 TRAIL 수용체 작용제 단백질, TRAIL 수용체 작용제 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 및 이의 용도를 제공한다. TRAIL 수용체 작용제 단백질은 실질적으로 비-응집성이고, 치료학적, 진단적 및/또는 연구 적용에 적합하다.

TNF 상과(TNFSF) 사이토카인의 삼량체화는 효율적인 수용체 결합 및 활성을 필요로 하는 것으로 공지된다. 그러나, TNF 상과 사이토카인의 삼량체 복합물은 재조합 단량체 단위로부터 제조하기 어렵다.

WO 01/49866 및 WO 02/09055는 TNF 사이토카인 및 다량체화 성분을 포함하는 재조합 융합 단백질, 특히 C1q 단백질 부류 또는 수집으로부터의 단백질을 개시한다. 그러나, 이들 융합 단백질의 단점은, 삼량체화 도메인이 대개 큰 분자량을 갖고/갖거나 삼량체화가 다소 비효율적이라는 것이다.

슈나이더(Schneider) 등(참조: J Exp Med 187 (1989), 1205-1213)은 TNF 사이토카인의 삼량체가 N-말단에서 위치된 안정화 모티프에 의해 안정화된다고 기술한다. CD95L에서, 수용체 결합 도메인 삼량체의 안정화는 아마도 세포질 막 근처에 위치한 N-말단 아미노산 도메인에 의해 야기된다.

시라이시(Shiraishi) 등(참조: Biochem Biophys Res Commun 322 (2004), 197-202)은 CD95L의 수용체 결합 도메인이 N-말단에 위치된 합성 α-나선 코일형-코일(류신 지퍼) 모티프에 의해 안정화될 수 있다고 기술한다. 그러나, 폴리펩타이드 쇄의 서로에 대한 배향, 예를 들면, 평행 또는 역평행 배향은, 거의 예상할 수 없음이 밝혀졌다. 추가로, 코일형-코일 지퍼 모티프에서 7(heptad)-반복의 최적의 수는 측정하기 어렵다. 추가로, 코일형-코일 구조는 pH 및/또는 이온 강도의 변경 후 거대 분자 응집물을 형성하는 경향이 있다.

WO 01/25277은 세포 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인에 결합한 단일-쇄 올리고머 폴리펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 폴리펩타이드는 적어도 3개의 수용체 결합 위치를 포함하고, 이들 중 적어도 하나는 세포 수용체의 리간드 결합 도메인에 결합할 수 있고, 적어도 하나는 세포 수용체의 리간드 결합 도메인에 효과적으로 결합할 수 없어서, 단일-쇄 올리고머 폴리펩타이드는 수용체에 결합할 수 있지만, 수용체를 활성화시킬 수 없다. 예를 들면, 단량체는 TNF 과의 사이토카인 리간드로부터, 특히 TNF-α로부터 유도된다.

WO 2005/103077은 TNF 부류 리간드 구성원의 적어도 3개의 단량체 및 TNF 리간드 부류 구성원의 단량체를 또다른 것에 링크하는 적어도 2개의 펩타이드 링커를 포함하는 단일-쇄 융합 폴리펩타이드를 개시한다. 최근 실험은, 그러나, 이들 단일-쇄 융합 폴리펩타이드가 목적하지 않는 응집을 나타내는 것으로 나타났다.

WO 2010/010051은 3개의 가용성 TNF 부류 사이토카인 도메인 및 적어도 2개의 펩타이드 링커를 포함하는 단일-쇄 융합 폴리펩타이드를 개시한다. 기술된 융합 폴리펩타이드는 실질적으로 비-응집성이다.

또한, 파파도풀로스(Papadopoulos) 등(참조: Cancer Chemother Pharmacol, 2015, DOI 10.1007/s00280-015-2712-0)의 연구를 포함하는 이전 연구는 TRAIL 수용체 수퍼클러스터링(superclustering)이 독성을 야기할 수 있다는 것을 입증하였다.

따라서, 당해 기술 분야에서 높은 생물학적 활성, 높은 안정성, 낮은 독성을 나타내고 효율적인 재조합 제조를 가능하게 하는 신규한 TRAIL 수용체 작용제가 필요하다.

발명의 요지

본 발명은 낮은 단백질분해, 긴 반감기, 및 낮은 TRAIL 수용체 생체내 수퍼클러스터링(수반되는 독성에 따라)을 나타내는 특이적 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 제공한다.

본 발명의 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 일반적으로 다음을 포함한다: (i) 첫번째 가용성 TRAIL 사이토카인 도메인; (ii) 첫번째 펩타이드 링커; (iii) 두번째 가용성 TRAIL 도메인; (iv) 두번째 펩타이드 링커; (v) 세번째 가용성 TRAIL 도메인; 및 (vi) 항체 Fc 단편.

하나의 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 단일-쇄 융합 폴리펩타이드를 제공한다: (i) 첫번째 가용성 TRAIL 도메인, (ii) 첫번째 펩타이드 링커, (iii) 두번째 가용성 TRAIL 도메인, (iv) 두번째 펩타이드 링커, (v) 세번째 가용성 TRAIL 도메인, 및 (vi) 항체 Fc 단편. 하나의 양태에서, 항체 Fc 단편 (vi)은 첫번째 TRAIL 도메인 (i)에 대해 N 말단에 위치하고 및/또는 세번째 TRAIL 도메인 (v)에 대해 C-말단에 위치한다. 또다른 양태에서 항체 Fc 단편은 세번째 TRAIL 도메인 (v)에 대해 C-말단에 위치한다. 하나의 양태에서, 폴리펩타이드는 실질적으로 비 응집성이다. 또다른 양태에서, 두번째 및/또는 세번째 가용성 TRAIL 도메인은 N-말단 단축된 도메인이고, 이는 임의로 아미노산 서열 돌연변이를 포함한다.

하나의 양태에서, 가용성 TRAIL 도메인 중 적어도 하나, 특히 가용성 TRAIL 도메인 (iii) 및 (v) 중 적어도 하나는, N-말단 서열을 갖는 가용성 TRAIL 도메인이고, 이는 사람 TRAIL의 아미노산 Gln120 및 Val122 사이에서 시작하고, 여기서, Arg121은 천연 아미노산, 예를 들면, Ser 또는 GIy에 의해 대체될 수 있다. 또다른 양태에서, 가용성 TRAIL 도메인 중 적어도 하나, 특히 가용성 TRAIL 도메인 (iii) 및 (v) 중 적어도 하나는, (a) Arg121 - Val122 - Ala123 및 (b) (Gly/Ser)121 - Val122 - Ala123으로부터 선택된 N-말단 서열을 갖는 가용성 TRAIL 도메인이다. 하나의 양태에서, 가용성 TRAIL 도메인은 사람 TRAIL의 아미노산 Gly281으로 말단화되고, 및/또는 돌연변이를 위치 R130, G160, H168, R170, H177, Y189, R191 , Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, I266, D267 또는 D269에서 또는 상기 위치 중 2개 이상에서 임의로 포함한다. 하나의 양태에서, 가용성 TRAIL 도메인 (i)은 서열 번호 1에 따른 사람 TRAIL의 아미노산 Gln120 - Gly281로 이루어지고, 가용성 TRAIL 도메인 (iii) 및 (v)는 서열 번호 1에 따른 사람 TRAIL의 아미노산 Arg121 - Gly281로 이루어진다.

하나의 양태에서, 첫번째 및 두번째 펩타이드 링커 (ii) 및 (iv)는 독립적으로 3-8개의 아미노산 길이, 특히 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 길이를 갖고, 바람직하게는 당화될 수 있는 아스파라긴 잔기를 임의로 포함하는 글리신/세린 링커이다. 하나의 양태에서, 첫번째 및 두번째 펩타이드 링커 (ii) 및 (iv)은 서열 번호 2에 따른 아미노산 서열로 이루어진다. 또다른 양태에서, 폴리펩타이드는 추가로 예를 들면, 서열 번호 12의 N-말단 시그널 펩타이드 도메인을 포함하고, 이는 프로테아제 절단 위치를 포함할 수 있고, 및/또는 추가로 인식/정제 도메인, 예를 들면, 서열 번호 13에 따른 스트렙-태그를 포함하고/하거나 이에 연결될 수 있는 C-말단 요소(element)를 포함한다.

하나의 양태에서, 항체 Fc 단편 (vi)은 가용성 TRAIL 도메인 (i) 및/또는 (v)에 바람직하게는 서열 번호 11의 힌지(hinge)-링커를 통해 융합된다. 또다른 양태에서, 항체 Fc 단편 (vi)은 서열 번호 10 또는 17로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다. 하나의 양태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 14, 15 또는 18의 아미노산 서열을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 19, 20 또는 21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 26, 27, 28, 29, 또는 30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 제공한다. 하나의 양태에서, 2개의 폴리펩타이드는 각 폴리펩타이드의 시스테인 잔기 513, 519, 및 522 사이에 형성된 3개의 쇄간 디설파이드 결합을 통해 공유결합으로 링크된다.

하나의 양태에서, 폴리펩타이드(들)의 위치 168 및 337에서 아스파라긴 잔기 중 하나 이상은 N-당화된다. 또다른 양태에서, 폴리펩타이드(들)의 위치 168 및 337에서 아스파라긴 잔기는 둘 다 N-당화된다.

또다른 양태에서, 폴리펩타이드(들)는 추가로 번역-후 변형된다. 또다른 양태에서, 번역-후 변형은 피로글루타메이트로 변형된 N-말단 글루타민을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 TRAIL 수용체 작용제 단백질 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 및/또는 보조제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 추가의 양태에서, 세포는 진핵 세포이다. 또다른 양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 또다른 양태에서, 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 다른 양태에서, 세포는 CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, 및 CHO-K1 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 세포는 Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4, 및 하이브리도마 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 TRAIL-관련 질환 또는 장애를 갖는 대상자의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상자에게 유효량의 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 투여함을 포함한다. 하나의 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질은 단독으로 투여된다. 또다른 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질은 두번째 제제의 투여 이전, 동시에 또는 이후에 투여된다. 또다른 양태에서, 상기 질환 또는 장애는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 종양, 감염성 질환, 염증성 질환, 대사 질환, 자가면역 장애, 퇴행성 질환, 아폽토시스-관련 질환, 및 이식 거부. 하나의 양태에서, 종양은 고형 종양이다. 하나의 양태에서, 종양은 육종, 식도 암, 및 위 암으로 이루어진 암의 그룹으로부터 발생한다. 또다른 양태에서, 종양은 유잉 육종 또는 섬유육종으로부터 발생한다. 또다른 양태에서, 종양은 비-소 세포 폐 암종(NSCLC), 췌장 암, 결장직장 암, 유방 암, 난소 암, 두경부 암, 및 소세포 폐암(SCLC)으로 이루어진 암의 그룹으로부터 발생한다. 또다른 양태에서, 종양은 림프 종양이다. 하나의 양태에서, 종양은 혈액 종양이다. 또다른 양태에서, 종양은 비-호지킨 림프종, 백혈병, 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), B 세포 림프종, 버킷 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구 백혈병(CLL), 또는 털 세포 백혈병으로부터 발생한다. 또다른 양태에서, 자가면역 장애는 류마티스 질환, 관절염 질환, 또는 류마티스 및 관절염 질환이다. 추가의 양태에서, 상기 질환 또는 장애는 류마티스 관절염이다. 또다른 양태에서, 퇴행성 질환은 신경퇴행성 질환이다. 추가의 양태에서, 신경퇴행성 질환은 다발성 경화증이다.

하나의 양태에서, 두번째 제제는 화학요법, 방사선요법, 또는 생물학적 제제이다. 하나의 양태에서, 두번째 제제는 두벨리시브, 이브루티닙, 나비토클락스, 및 베네토클락스로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 또다른 양태에서, 두번째 제제는 아폽토시스 제제이다. 하나의 양태에서, 아폽토시스 두번째 제제는 보르테조밉, 아자시티딘, 다사티닙, 및 게피티닙로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정한 양태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 환자에게 정맥내 또는 피하 투여된다. 다른 양태에서, 기재된 약제학적 조성물은 환자에게 경구, 비경구, 근육내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 체강내(intracavitary), 복내(intracelial), 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 뼈내, 골반내, 심장주위내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스(bolus), 질, 직장, 구강, 설하, 비내, 또는 경피 투여로 투여된다.

하나의 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질은 단일 볼루스로서 투여된다. 또다른 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질은 수개의 분할된 용량을 통해 투여될 수 있다. TRAIL 수용체 작용제 단백질은 약 0.1-100 mg/kg로 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용량으로 투여될 수 있다: 약 0.1-0.5, 0.1-1, 0.1-10, 0.1-20, 0.1-50, 0.1-75, 1-10, 1-15, 1-7.5, 1.25-15, 1.25-7.5, 2.5-7.5, 2.5-15, 5-15, 5-7.5,1-20, 1-50, 7-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, 및 10-100 mg/kg. 다른 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질은 약제학적 조성물에 약 0.1-100 mg/ml로 존재한다. 하나의 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질은 약제학적 조성물에 약 0.1-0.5, 0.1-1, 0.1-10, 0.1-20, 0.1-50, 0.1-75, 1-10, 1-20, 1-50, 1-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, 또는 10-100 mg/ml로 이루어진 그룹으로부터 선택된 양으로 존재한다. 다른 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질의 치료학적으로 유효량은 대상자에게 투여된다. 또다른 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질의 예방적으로 유효량은 대상자에게 투여된다.

도 1 3개의 TRAIL 도메인을 포함하는 단일-쇄 융합 폴리펩타이드의 도메인 구조. I., II., III. 가용성 TRAIL 도메인.
도 2 TRAIL의 일반 구조를 나타내는 도식.
■ ■ ■ 세포 막, 세포 내에 위치하는 N-말단,
1. 수용체-결합 도메인(RBD)의 역평행(anti-parallel) β-폴드(fold),
2. RBD 및 세포 막의 계면,
3. 프로테아제 절단 위치.
도 3 미처리(native) TRAIL 삼량체의 구조를 나타내는 도식. 실린더형 구조는 RBD를 나타낸다. N-말단은 RBD을 세포 막으로 연결한다.
도 4 TRAIL의 수용체-결합 도메인을 포함하는 3개의 가용성 도메인의 구조를 나타내는 도식. I., II., III. 가용성 TRAIL 도메인.
도 5 TRAIL의 RBD를 포함하는 가용성 도메인의 삼량체화, 3개의 가용성 도메인의 N- 및 C-말단은 표면을 형성함을 특징으로 함.
도 6 다음 가용성 도메인의 N-말단까지의 거리를 보상하기 위해 더 긴 링커의 필요성을 나타내는 줄기-영역의 전부 또는 일부를 포함하는 단일-쇄 TRAIL의 구조를 나타내는 도식.
도 7 당해 기술 분야에 공지된 scFv-TRAIL 융합 단백질.
도 8 당해 기술 분야에 공지된 Fc-TRAIL 융합 단백질.
도 9A 추가 Fab 항체 단편을 포함하는 단일-쇄 융합 폴리펩타이드.
도 9B 추가 scFv 항체 단편을 포함하는 단일-쇄 융합 폴리펩타이드.
도 10 디설파이드 브릿지(bridge)를 통해 2개의 N-말단 융합된 scFc 융합 폴리펩타이드의 이량체화.
도 11 디설파이드 브릿지를 통한 2개의 C-말단 융합된 scFc 융합 폴리펩타이드의 이량체화.
도 12 링커를 통한 단일-쇄 융합 폴리펩타이드의 이량체화.
도 13 추가로 두번째 융합 폴리펩타이드에 또는 scFv 융합 폴리펩타이드에 융합된 추가 Fab 항체 단편을 포함하는 단일-쇄 융합 폴리펩타이드.
도 14 디설파이드 브릿지를 통한 2개의 scFab 융합 폴리펩타이드의 이량체화.
도 15 Fv 및/또는 Fab 항체 단편을 추가로 포함하는 N-말단 융합된 scFc 융합 폴리펩타이드.
도 16 Fv 및/또는 Fab 항체 단편을 추가로 포함하는 C-말단 융합된 scFc 융합 폴리펩타이드.
도 17a N-말단 시그널 펩타이드 도메인을 갖는 것으로 나타낸 예시적인 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 서열 번호 14에 기재된다. 성숙 단백질(이는 N-말단 시그널 펩타이드 도메인을 포함하지 않는다)은 서열 번호 19에 기재된다.
도 17b 전체 구조 및 예시적인 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 주석이 달린(annotated) 서열을 나타내는 도식.
도 18 FC-도메인을 포함하는 TRAIL-수용체 작용제의 정량화를 위한 ELISA의 검정 셋업
도 19 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 사람 종양 세포주에서 시험관내 세포 사멸을 유도한다. SKM-1, Colo205 또는 저캇(Jurkat) 세포는 증가되는 농도 TRAIL 수용체 작용제 단백질로 24시간 동안 처리되고, 세포 생존력을 검정하였다.
도 20(A-C) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 항-종양형성 제제를 사용하여 시험관내 상승작용한다. SU-DHL-4 세포를 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 증가하는 농도로 베네토클락스(도 20A) 또는 나비토클락스(도 20B)의 지시된 농도의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 대안적으로, (도 20C) NCI-H596 세포는 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 증가하는 농도로 도세탁셀(DTX)의 지시된 농도의 존재 또는 부재하에 72시간 동안 처리하였다. 세포 생존력을 검정하고, 상승효과를 블리스(Bliss) 합으로 측정하였다.
도 21 Colo205 결장직장 암종 이종이식 모델에서 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 종양 성장에 미치는 효과.
도 22 SKM-1 급성 골수성 백혈병 이종이식 모델에서 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 종양 성장에 미치는 효과.
도 23 H460LM 비-소 세포 폐 이종이식 모델에서 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 종양 성장에 미치는 효과.
도 24 및 24a(A-G) PDX 모델에서 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 종양 성장에 미치는 효과. 다이아몬드, TRAIL 수용체 작용제 단백질-처리됨; 정사각형, 미처리됨. 종양 용적은 (A) CTG-0069, (B) CTG-0167, (C) CTG-0293, (D) CTG-0785, (E) CTG-0714, (F) CTG-0136, 및 (G) CTG-0485에 대해 나타낸다.

본 발명에 따라서, 단일-쇄 TRAIL 수용체-결합 도메인의 Fc 도메인으로의 융합은 우수한 안정성을 겸비한 높은 생물학적 활성을 제공하는 6가 TRAIL 수용체 작용제를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 2개의 펩타이드 링커에 의해 및 N-말단에 및/또는 C-말단에 항체 Fc 단편에 의해 연결된 적어도 3개의 가용성 TRAIL 도메인을 포함하는 단일-쇄 융합 폴리펩타이드가 제공된다.

바람직하게는, 단일-쇄 융합 폴리펩타이드는 비-응집성이다. 용어 "비-응집성(non-aggregating)"은 ≥ 50%, 바람직하게는 ≥ 70% 및 보다 바람직하게는 ≥ 90%의 제조물의 단량체 함량을 언급한다. 단량체 함량 대 응집물 함량의 비는 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 응집물 형성의 양을 조사하여 측정할 수 있다. 응집 관련 안정성은 정의된 시간 기간, 예를 들면, 몇일 내지 수일, 수주 및 수개월 후에 상이한 저장 조건하에, 예를 들면, 4℃ 또는 25℃에서 SEC에 의해 측정할 수 있다. 융합 단백질에 대해, 실질적으로 비-응집으로서 분류되기 위해, 단량체 함량은 4℃, 또는 25℃에서 저장한지 수일의 시간 기간, 예를 들면, 10일 후, 보다 바람직하게는 수주, 예를 들면, 2, 3 또는 4주 후, 및 가장 바람직하게는 수개월, 예를 들면, 2 또는 3개월 후 상기 정의된 바와 같은 것이 바람직하다.

단일-쇄 융합 폴리펩타이드는 추가 도메인을 포함할 수 있고, 이는 이의 N- 및/또는 C-말단에 위치할 수 있다. 추가 융합 도메인의 예는, 예를 들면, N-말단 시그널 펩타이드 도메인이고, 이는 프로테아제 절단 위치 또는 인식/정제 도메인을 포함하고/하거나 이에 연결될 수 있는 C-말단 요소를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에 따라서, 융합 폴리펩타이드는 스트렙-태그를 링커를 통해 융합된 이의 C-말단에서 포함한다. 짧은 세린 링커를 포함하는 예시적인 스트렙-태그는 서열 번호 13에 나타낸다.

본 발명의 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 TRAIL로부터 유래된 3개의 가용성 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 이들 가용성 도메인은 포유동물, 특히 대립유전자 변이체 및/또는 이의 유도체를 포함하는 사람 TRAIL로부터 유래된다. 가용성 도메인은 막 위치된 도메인이 없는 수용체 결합 도메인을 포함하는 TRAIL의 세포외 부분을 포함한다. TNF 상과의 다른 단백질과 유사하게, TRAIL은 15-30개의 아미노산의 N -말단 부분(소위 줄기-영역이라 언급됨)을 통해 막에 부착된다(anchored). 줄기 영역은 삼량체화를 야기하고, 세포 막에 일정한 거리를 제공한다. 그러나, 줄기 영역은 수용체 결합 도메인(RBD)의 부분이 아니다.

중요하게는, RBD는 N- 및 C-말단 아미노산의 특정한 위치선정(localization)에 의해 특정화된다. 상기 아미노산은 즉시 인접되고, 삼량체 축을 중심으로 위치한다. RBD의 첫번째 N-말단 아미노산은 RBD의 C-말단 아미노산을 갖는 역평행 베타-가닥을 형성한다(도 2 및 3).

따라서, RBD의 역평행 베타-가닥은 세포 막과 경계면을 형성하고, 이는 줄기 영역의 아미노산을 통해 세포 막에 연결되거나 세포 막 내에 부착된다. TRAIL 수용체 작용제 단백질의 가용성 TRAIL 도메인은 줄기 영역으로부터 임의의 아미노산이 결핍된 TRAIL의 수용체 결합 도메인을 포함하는 것이 매우 바람직하다(도 4 및 5). 그렇지 않으면, 가용성 도메인 중 하나의 C-말단을 다음 가용성 도메인의 N-말단과 연결하는 긴 링커는 다음 가용성 도메인의 N-말단 줄기-영역을 보상하기 위해 요구될 수 있고(도 6), 이는 불안정성 및/또는 응집물의 형성을 야기할 수 있다.

이러한 가용성 도메인의 추가 이점은 RBD의 N- 및 C-말단 아미노산이 임의의 항-약물 항체에 대해 접근가능하지 않다는 것이다. 바람직하게는, 단일-쇄 융합 폴리펩타이드는 각 TRAIL 수용체에 대한 적어도 하나의 기능적 결합 위치를 포함하는 규칙화된(ordered) 삼량체 구조를 형성할 수 있다.

TRAIL 수용체 작용제 단백질은 3개의 기능적 TRAIL 수용체 결합 위치, 즉 TRAIL 수용체와 복합물을 형성할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 가용성 도메인은 상응하는 TRAIL 수용체에 결합할 수 있다. 하나의 양태에서, 가용성 도메인 중 적어도 하나는 수용체 활성일 수 있고, 이에 의해, 아폽토시스 및/또는 증식성 활성은 영향을 받을 수 있다. 추가의 양태에서, 가용성 도메인 중 하나 이상은 수용체 활성이 불가능한 것으로 선택된다.

가용성 TRAIL 도메인은 서열 번호 1에 기재된 사람 TRAIL로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 가용성 TRAIL 도메인은 특히 아미노산 120-122로부터 시작하고 특히 서열 번호 1의 아미노산 120-281, 121-281 또는 122-281을 포함하는 사람 TRAIL로부터 유래된다. 임의로, 서열 번호 1의 아미노산 Arg121은 비-하전된 아미노산, 예를 들면, Ser 또는 Gly로 대체될 수 있다.

표 1: 사람 TRAIL 단백질의 서열

상기 나타낸 바와 같이, 가용성 TRAIL 도메인은 서열 번호 1에 나타낸 야생형 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 이들 가용성 도메인 중 하나 이상에서 돌연변이, 예를 들면, 가용성 도메인의 결합 특성을 변경시키는(예를 들면, 증가 또는 감소시키는) 돌연변이를 도입할 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 하나의 양태에서, 가용성 도메인은 상응하는 사이토카인 수용체에 결합할 수 없는 것을 선택할 수 있다.

본 발명의 추가로 바람직한 양태에서, 가용성 TRAIL 도메인 (i)은 TRAIL-수용체 1(TRAILR1) 및/또는 TRAIL-수용체 2(TRAILR2)을 결합하고/하거나 활성화시키는 TRAIL 또는 이의 수용체 결합 도메인의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이의 결합 및/또는 활성은, 예를 들면, 반 데르 슬로트(van der Sloot) 등(참조: PNAS, 2006, 103:8634-8639), 켈리(Kelley) 등(참조: J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215), 또는 맥파레인(MacFarlane) 등(참조: Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270)에 의해 기술된 검정으로 결정될 수 있다.

돌연변이는 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 기술, 예를 들면, 반 데르 슬로트 등(참조: PNAS, 2006, 103:8634-8639), 켈리 등(참조: J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215), 또는 맥파레인 등(참조: Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270)에 의해 기재된 기술에 의해 생성될 수 있고, 임의의 타입의 구조적 돌연변이, 예를 들면, 아미노산의 치환, 결실, 중복 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 바람직한 양태는 치환의 생성이다. 치환은 본원에 기재된 TRAIL의 적어도 하나의 아미노산 또는 이의 수용체 결합 도메인에 영향을 줄 수 있다. 바람직한 양태에서, 치환은 TRAIL, 예를 들면, 사람 TRAIL의 아미노산 중 적어도 하나에 영향을 줄 수 있다(예를 들면, 서열 번호 1). 이와 관련하여 바람직한 치환은 서열 번호 1의 사람 TRAIL의 하기 아미노산 중 적어도 하나에 영향을 준다: R130, G160, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, 1266, D267, D269. 서열 번호 1의 사람 TRAIL의 바람직한 아미노산 치환은 하기 치환 중 적어도 하나이다: R130E, G160M, Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R, 또는 D269K.

아미노산 치환(들)은 TRAILR1 또는 TRAILR2에 또는 이들에 대한, TRAIL, 예를 들면, 사람 TRAIL의 결합 및/또는 활성에 영향을 줄 수 있다. 대안적으로, 아미노산 치환(들)은 TRAIL, 예를 들면, TRAILR1 및 TRAILR2 둘 다에 또는 이들 둘 다에 대한 사람 TRAIL의 결합 및/또는 활성에 영향을 줄 수 있다. TRAILR1 및/또는 TRAILR2의 결합 및/또는 활성은 수용체에 대해 긍정적으로, 즉, 더 강한, 더 선택적 또는 더 특이적 결합 및/또는 보다 더 큰 활성으로 영향을 줄 수 있다. 대안적으로, TRAILR1 및/또는 TRAILR2의 결합 및/또는 활성은 수용체에 대해 부정적으로, 즉, 더 약한, 덜 선택적 또는 덜 특이적 결합 및/또는 더 적은 활성 또는 활성 없음으로 영향을 줄 수 있다.

TRAILR1 및 TRAILR2 둘 다의 결합 및/또는 활성에 영향을 주는 본 발명의 아미노산 치환(들)을 갖는 TRAIL의 돌연변이의 예는, 예를 들면, 맥파레인 등(상기 참조)의 표 1에서 발견될 수 있고, 하기 2개의 아미노산 치환: 서열 번호 1 Y213W 및 S215D 또는 하기 단일 아미노산 치환: Y189A을 갖는 사람 TRAIL 돌연변이를 포함할 수 있다.

TRAILR1의 결합 및/또는 활성에 영향을 주는 본 발명의 아미노산 치환(들)을 갖는 TRAIL의 돌연변이의 예는, 예를 들면, 맥파레인 등(상기 참조)의 표 1에서 발견될 수 있고, 하기 4개의 아미노산 치환: 서열 번호 1 N 199V, K201R, Y213W 및 S215D 또는 하기 5개의 아미노산 치환: Q193S, N199V, K201R, Y213W 및 S215D을 갖는 사람 TRAIL 돌연변이를 포함할 수 있거나, 켈리 등(상기 참조)의 표 2에서 발견될 수 있고, 하기 6개의 아미노산 치환을 갖는 사람 TRAIL 돌연변이를 포함할 수 있다: Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199V, 및 K201R, 또는 Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199R, 및 K201R.

TRAILR2의 결합 및/또는 활성에 영향을 주는 본 발명의 아미노산 치환(들)을 갖는 TRAIL의 돌연변이의 예는, 예를 들면, 맥파레인 등(상기 참조)의 표 1에서 또는 켈리 등(상기 참조)의 표 2에서 발견될 수 있고, 서열 번호 1의 하기 6개의 아미노산 치환을 갖는 사람 TRAIL 돌연변이를 포함할 수 있거나: Y189Q, R191 K, Q193R, H264R, I266L, 및 D267Q, 반 데르 슬로트 등(상기 참조)의 표 2에서 발견될 수 있고, 하기 단일 아미노산 치환: D269H, 또는 하기 2개의 아미노산 치환: D269H 및 E195R 또는 D269H 및 T214R을 갖는 사람 TRAIL 돌연변이를 포함할 수 있다.

따라서, 하나의 바람직한 양태는 본원에 기재된 TRAIL 수용체 작용제 단백질이고, 여기서, 가용성 도메인 중 적어도 하나는 TRAIL의 또는 이의 수용체 결합 도메인의 돌연변이를 포함하고, 이는 TRAILR1 및/또는 TRAILR2를 결합 및/또는 활성화시킨다.

감소된 TRAIL 유도된 수용체 응집을 나타내는 TRAIL의 돌연변이의 추가의 예는, H168(S, T, Q), R170(E, S, T, Q) 및 H177(S, T)이다.

본원에 기재된 TRAIL의 또는 수용체 결합 도메인의 돌연변이를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 하나의 바람직한 양태는 TRAIL 수용체 작용제 단백질이고, 여기서, 성분 (i)은 특히 하기 나타낸 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.

이러한 아미노산 치환은 사람 TRAIL(서열 번호 1)의 하기 아미노산 위치 중 적어도 하나에 영향을 준다: R130, G160, H168, R170, H177, Y189, R191 , Q193, E195, N199, K201 , Y213, T214, S215, H264, 1266, D267, D269.

이러한 아미노산 치환은 다음 중 적어도 하나이다: R13OE, G16OM, H168 (S, T, Q), R170 (E, S, T, Q), H177 (SJ)1 Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R, 또는 D269K.

바람직한 TRAIL-R2 선택적 도메인은 아미노산 치환 Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L 및 D267Q를 포함한다.

바람직한 TRAIL-R1 선택적 도메인은 아미노산 치환 Y189A, Q193S, N199V, K201R, Y213W 및 S215D를 포함한다.

본 발명의 단일-쇄 융합 분자는 3개의 가용성 TRAIL 도메인, 즉 성분 (i), (iii) 및 (v)를 포함한다. 응집에 대항하는 단일-쇄 TRAIL 융합 폴리펩타이드의 안정성은, 두번째 및/또는 세번째 가용성 TRAIL 도메인이 아미노산 서열 돌연변이를 임의로 포함하는 N-말단 단축된 도메인인 경우, 개선된다. 따라서, 바람직하게는, 두번째 및 세번째 가용성 TRAIL 도메인 둘 다는 N-말단 단축된 도메인이고, 이는 아미노산 서열 돌연변이를 N-말단 영역에, 바람직하게는 가용성 TRAIL 도메인의 N-말단의 첫번째 5개의 아미노산 내에 임의로 포함한다. 이들 돌연변이는 하전된, 예를 들면, 산성 또는 염기성 아미노산의, 천연 아미노산, 특히 세린 또는 글리신에 의한 대체를 포함할 수 있다.

그에 반해서, 첫번째 가용성 TRAIL 도메인의 선택은 중요하지 않다. 여기서, 전장 N-말단 서열을 갖는 가용성 도메인이 사용될 수 있다. 그러나, 또한 첫번째 가용성 TRAIL 도메인은 N-말단 단축되고 임의로 돌연변이화된 서열을 가질 수 있는 것을 주지하여야 한다.

본 발명의 추가로 바람직한 양태에서, 가용성 TRAIL 도메인 (i), (iii) 및 (v)는 가용성 사람 TRAIL 도메인이다. 첫번째 가용성 TRAIL 도메인 (i)은 미처리, 단축 및/또는 돌연변이화 서열로부터 선택될 수 있다. 따라서, 첫번째 가용성 TRAIL 도메인 (i)은 N-말단 서열을 갖고, 이는 사람 TRAIL의 아미노산 GIu116 및 Val122 사이에서 시작할 수 있고, 여기서, Arg121은 천연 아미노산으로, 예를 들면, Ser 또는 GIy로 대체될 수 있다. 두번째 및 세번째 가용성 TRAIL 도메인 (iii) 및 (v)는 단축 N-말단 서열을 갖고, 이는 바람직하게는 사람 TRAIL의 아미노산 Gln120 및 Val122 사이에서 출발하고, 여기서, Arg121은 또다른 아미노산으로, 예를 들면, Ser 또는 Gly로 대체될 수 있다.

바람직하게는, 가용성 TRAIL 도메인 (iii) 및 (v)의 N-말단 서열은 다음으로부터 선택된다:

(a) Arg121 - Val122 - Ala123 및

(b) (Gly/Ser) 121.

가용성 TRAIL 도메인은 바람직하게는 사람 TRAIL의 아미노산 Gly281으로 말단화된다. 특정 양태에서, TRAIL 도메인은 상기한 내부 돌연변이를 포함할 수 있다.

TRAIL 수용체 작용제 단백질의 성분 (ii) 및 (iv)는 각각 성분 (i) 및 (iii) 또는 (iii) 및 (v) 사이에 위치하는 펩타이드 링커 요소이다. 유연한(flexible) 링커 요소는 3-8개의 아미노산 길이, 특히 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8의 아미노산 길이를 갖는다. 링커 요소는 바람직하게는 글리신/세린 링커, 즉, 아미노산 글리신 및 세린으로 실질적으로 이루어진 펩타이드 링커이다. 가용성 사이토카인 도메인은 S 또는 G(C-말단)로 말단화되는 경우, 예를 들면, 사람 TRAIL, 링커는 S 또는 G 뒤에 시작한다. 가용성 사이토카인 도메인이 S 또는 G (N-말단)로 시작하는 경우, 링커는 이러한 S 또는 G 앞에서 말단화된다.

링커 (ii) 및 링커 (iv)가 동일한 길이로 존재할 필요는 없다는 것을 주지하여야 한다. 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해, 보다 짧은 링커를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한 보다 짧은 링커가 응집물을 형성하는 경향이 감소된 단일 쇄 분자를 야기한다는 것이 판명되었다. 반면 여기에 개시된 것보다 실질적으로 더 긴 링커는 불리한 응집 특성을 나타낼 수 있다.

목적하는 경우, 링커는 당화 위치 Asn-Xaa-Ser를 형성할 수 있는 아스파라긴 잔기를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 링커 중 하나, 예를 들면, 링커 (ii) 또는 링커 (iv)는 당화 위치를 포함한다. 다른 양태에서, 둘 다의 링커 (iv)은 당화 위치를 포함한다. sc TRAIL 단백질의 가용성을 증가시키기 위해 및/또는 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해, 링커 (ii) 또는 링커 (iv) 또는 이들 둘 다가 당화 위치를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.

바람직한 링커 서열은 GSGSGSGS (서열 번호 3), GSGSGNGS (서열 번호 2), GGSGSGSG (서열 번호 4), GGSGSG (서열 번호 5), GGSG (서열 번호 6), GGSGNGSG (서열 번호 7), GGNGSGSG (서열 번호 8), GGNGSG (서열 번호 9), 및 GSGS (서열 번호 23)로부터 선택된다.

가장 바람직한 양태에 따라서, 링커 서열은 서열 번호 2에 따른 각각의 GSGSGNGS이다. 예시 링커 서열을 표 2에 나타낸다.

표 2: 예시 링커 서열

TRAIL 수용체 작용제 단백질은 추가로 항체 Fc 단편 도메인을 포함하고, 이는 첫번째 TRAIL 도메인 (i)에 대해 N-말단에 및/또는 세번째 TRAIL 도메인 (v)에 대해 C-말단에 위치할 수 있다. 바람직하게는, 항체 Fc 단편 도메인은 서열 번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로서 이루어진다. 대안적으로, Fc 단편 도메인은 서열 번호 17에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로서 이루어진다. 예시 Fc 단편 도메인을 표 3에 나타낸다.

표 3: 예시 Fc 단편 도메인

글리코사이트의 총수 및 3차원에서 탄수화물의 개별적인 위치는 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 생체내 안정성에 영향을 미친다. 추가로, 탄수화물 인식은 말단 당류의 국소 밀도, 탄수화물 트리(tree)의 브랜칭(branching) 및 탄수화물 매터(matter)의 상대적 위치에 좌우된다.

CH2-도메인 탄수화물의 고갈은 생체내 Fc-수용체 기반 가교결합 및 잠재적 TRAIL-수용체 수퍼클러스터링-기반 독성을 피하기 위해 필수적이다. 추가로, 부분 분해된 탄수화물은 생체내 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 반감기를 렉틴-구동 기전을 통해 감소시킨다. 분자 상 당화 위치의 총수를 감소시켜, 수득된 화합물은 이들 기전에 덜 접근가능하고, 반감기를 증가시킨다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 TRAIL 수용체 작용제 단백질 상 글리코사이트의 전체 수는 CH2 글리코사이트의 고갈을 통해 감소되고, 아글리코실(aglycosl)-CH2 도메인을 생성하는 N297S 동등한 돌연변이를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 야기한다(EU 넘버링 시스템에 따름).

내부 표면 영역에 존재하는 CH2-글리코사이트는 일반적으로 프로테아제로부터 하위도메인을 "개방 Fc-입체형태(conformation) 전이(transits)" 동안 보호하고, 여기서, 힌지-쇄간 디설파이드 결합은 환원되고(reduced), 공유결합 쇄간 결합이 파괴된다. 이는 CH2-해리 및 프로테아제로의 내부 표면 영역의 노출을 가능하게 한다.

아글리코실-CH2를 생성하는 N297S 동등한 돌연변이(EU 넘버링 시스템에 따름)를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 이에 따라 야생형 CH2 당화를 갖는 동등한 구조 보다 단백질분해에 덜 안정한 경향이 있다. 이는 USP/DSP/저장 동안 화합물의 안정성에 영향을 줄 것이고, 여기서, 숙주 세포 프로테아제가 존재하고 구조에 장기간 접근을 갖는다. 따라서, 특정 양태에서, TRAIL 수용체 작용제는 CH2 글리코사이트가 결핍되지만, 각 폴리펩타이드 쇄의 링커 서열에 글리코사이트를 포함한다(예를 들면, 서열 번호 2에 따른 GSGSGNGS). 특정 예시적인 양태에서, TRAIL 수용체 작용제는 총 4개의 글리코사이트에 대해 폴리펩타이드 쇄당 2개의 글리코사이트를 포함한다.

본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 항체 Fc 단편 도메인은 힌지-링커 요소를 통해 융합된다. 힌지-링커 요소는 10-30 아미노산의 길이, 특히 15-25 아미노산의 길이, 예를 들면, 22 아미노산을 갖는다. 힌지-링커 요소는 바람직하게는 본원에 "Ig 힌지-영역"로 언급된 면역글로불린의 힌지-영역 서열을 포함한다. 용어 "Ig 힌지-영역"은 디설파이드 결합이 면역글로불린의 2개의 중쇄를 링크하는 시스테인 잔기를 포함하는 천연 발생 Ig 힌지-영역 서열의 부분과 서열 동일성 또는 유사성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다.

힌지-영역의 유도체 및 유사체는 돌연변이에 의해 수득될 수 있다. 본원에 언급된 유도체 또는 유사체는 야생형(또는 천연 발생 단백질)의 전장 서열과 서열 동일성 또는 유사성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이고, 단 결실, 삽입 및/또는 치환을 야기하는 하나 이상의 아미노산 서열 차이를 갖는다. 본 발명에 따라서, 그러나, 용어 "힌지-링커"는 힌지-영역 또는 이의 유도체를 포함하는 이들 링커에 제한되지 않지만, 임의의 링커는 힌지-링커 요소에 의해 부착된 도메인이 생물학적으로 활성 확인을 획득할 수 정도로 충분히 길다.

개별적인 TRAIL 수용체 작용제 단백질에서 개방 Fc-입체형태를 갖는 분자의 수는 힌지 영역에 존재하는 쇄간-디설파이드 결합의 수에 좌우된다. 따라서, 하나의 양태에서 세번째 시스테인은 본 발명의 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 힌지 영역 내로 도입되어 CH2-글리코사이트의 고갈 효과를 개선시켰다.

추가로, 본 발명의 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 추가로 이러한 위치에서 단백질분해 처리를 감소시키는 상부-힌지 리신의 글리신으로의 돌연변이를 포함한다.

특히 바람직한 힌지-링커 요소는 서열 번호 11로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(표 4).

TRAIL 수용체 작용제 단백질은 추가로 N-말단 시그널 펩타이드 도메인을 포함할 수 있고, 적합한 숙주 세포에서 처리, 예를 들면, 세포외 분비될 수 있다. 바람직하게는, N-말단 시그널 펩타이드 도메인은 프로테아제 절단 위치, 예를 들면, 시그널 펩티다제 절단 위치를 포함하고, 따라서, 발현 이후 또는 그 동안 제거되어 성숙 단백질을 수득할 수 있다. 특히 바람직한 N-말단 시그널 펩타이드 도메인은 서열 번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다(표 4).

추가로, TRAIL 수용체 작용제 단백질은 인식/정제 도메인, 예를 들면, FLAG 도메인, 스트렙-태그 또는 스트렙-태그 Il 도메인 및/또는 폴리-His 도메인을 포함되거나 이에 연결된 예를 들면, 1-50, 바람직하게는 10-30 아미노산의 길이를 갖는 C-말단 요소를 추가로 포함할 수 있다. 특히 바람직한 양태에 따라서, 융합 폴리펩타이드는 서열 번호 13에 나타낸 짧은 세린 링커를 통해 C-말단에 융합된 스트렙-태그를 포함한다(표 4).

예시적인 힌지-링커 요소, N-말단 시그널 펩타이드 도메인, 및 짧은 세린 링커를 표 4에 나타낸다.

표 4: 예시적인 도메인 및 링커

본 발명의 특히 바람직한 양태에 따라서, 융합 폴리펩타이드는 서열 번호 2의 펩타이드 링커 요소에 의해 융합된 3개의 가용성 TRAIL 도메인을 포함한다. 첫번째 가용성 TRAIL 도메인 (i)은 서열 번호 1에 따른 사람 TRAIL의 아미노산 120-281로 이루어지고, 가용성 TRAIL 도메인 (iii) 및 (v)는 서열 번호 1에 따른 사람 TRAIL의 아미노산 121-281로 이루어진다. 추가로, 융합 폴리펩타이드는 서열 번호 11에 따른 힌지-링커를 통해 가용성 TRAIL 도메인 (v)에 대해 C-말단에 융합된 서열 번호 10에 따른 항체 Fc 단편 도메인을 포함한다. 발명자들은 놀랍게도 이러한 특정한 융합 폴리펩타이드가 개선된 생물학적 활성을 제공하고, 특히 안정하다는 것을 발견하였다. 본 발명의 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 예시적인 양태의 아미노산 서열은 서열 번호 19에 기재된다.

추가로, 융합 폴리펩타이드는, 예를 들면, 서열 번호 12에 따른 N-말단 시그널 펩타이드 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 특이적 예는 서열 번호 14에 나타낸다.

또다른 바람직한 양태에 따라서, 융합 폴리펩타이드는 추가로 서열 번호 13에 나타낸 바와 같이 본 발명의 폴리펩타이드에 짧은 세린 링커를 통해 융합된 C-말단 스트렙-태그를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라서, Fc 단편은 바람직하게는 서열 번호 10 또는 17에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다. 추가로, Fc 단편은 더 짧은 Fc 단편으로 이루어질 수 있고, 예를 들면 서열 번호 10의 아미노산 1-217을 포함한다. C-말단 스트렙-태그를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 특히 바람직한 예는 서열 번호 15 및 18에 나타낸다.

서열 번호 14, 15 및 18에 나타낸 예시적인 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 각각 N-말단 시그널 펩타이드 도메인을 포함한다. 시그널 펩타이드 도메인은 아미노산 1-20을 포함한다. 각각의 경우, 성숙 단백질은 아미노산 21로 시작한다. 본 발명의 성숙 예시적인 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 서열 번호 19, 20, 21, 26, 27, 28, 29, 및 30에 기재된다. 상기한 예시적인 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 표 5에 나타낸다.

서열 번호 19에 기재된 TRAIL 수용체 작용제는 당화 위치(CH2 영역에서 N297S 돌연변이는 무당화된 CH2 도메인을 제공함)의 감소된 총수, 힌지 영역에서 쇄간 디설파이드 결합의 증가된 수, 및 상부-힌지 리신의 글리신으로의 돌연변이를 갖는다. 이러한 변경은 잠재적 분해 및 TRAIL 수용체 수퍼클러스터링(수반되는 독성과 함께)의 감소를 제공하는 반면 분자의 반감기는 증가된다. 몇몇 양태에서, N-말단 글루타민은 피로글루타메이트로 변형된다(참조: Liu et al. 2011, J. Biol. Chem. 286:11211-11217).

표 5: 예시적인 TRAIL 수용체 작용제 단백질

본 발명의 추가의 측면은 본원에 기재된 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산 분자는 DNA 분자, 예를 들면, 이중-가닥 또는 단일-가닥 DNA 분자, 또는 RNA 분자일 수 있다. 핵산 분자는 TRAIL 수용체 작용제 단백질 또는 이의 전구체, 예를 들면, TRAIL 수용체 작용제 단백질의 프로(pro)- 또는 프리-프로폼(pre-proform)을 암호화할 수 있고, 이는 시그널 서열 또는 바람직하게는 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 N- 및/또는 C-말단에 위치하는 분비 또는 정제를 위한 다른 이종 아미노산 부분을 포함할 수 있다. 이종 아미노산 부분은 첫번째 및/또는 두번째 도메인에 프로테아제 절단 위치를 통해, 예를 들면, 인자 X3, 트롬빈 또는 IgA 프로테아제 절단 위치를 통해 링크될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열의 특이적 예를 표 6에 서열 번호 16으로 나타낸다. 이러한 핵산 분자는 서열 번호 14의 융합 폴리펩타이드를 암호화한다.

표 6: 예시적인 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 핵산 서열

핵산 분자는 발현 대조군 서열, 예를 들면, 목적하는 숙주 세포에서 핵산 분자의 발현을 가능하게 하는 발현 대조군 서열에 작동적으로(operatively) 링크될 수 있다. 핵산 분자는 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 박테리오파지, 바이러스 벡터, 염색체 통합 벡터 등에 위치할 수 있다. 적합한 발현 대조군 서열 및 벡터의 예는 예를 들면 문헌[참조: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, and Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 또는 이의 보다 최신 에디션]에 기재되어 있다.

다양한 발현 벡터/숙주 세포 시스템은 본 발명의 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 적합한 숙주 세포는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 박테리아와 같은 원핵 세포, 예를 들면, 이.콜리(E.coli), 진핵 숙주 세포, 예를 들면, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 및, 보다 바람직하게는, 사람 세포를 포함한다. 추가로, 본 발명은 상기한 핵산 분자로 변형 또는 형질변환된 비-사람 유기체에 관한 것이다. 이러한 형질전환 유기체는 상동성 재조합을 포함하는 유전적 전달의 공지된 방법으로 생성될 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 활성 제제로서 적어도 하나의 TRAIL 수용체 작용제 단백질, 이에 따라 암호화하는 각 핵산, 또는 변형된 또는 형질감염된 세포, 본원에 기재된 것 모두를 포함하는 약제학적 또는 진단적 조성물에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "TRAIL-관련 질환 또는 장애"는 TRAIL 수용체 작용제의 첨가에 의해 개선될 수 있는 임의의 질환 또는 장애이다. 적어도 하나의 TRAIL 수용체 작용제 단백질, 이에 따라 암호화하는 각 핵산, 또는 변형된 또는 형질감염된 세포, 본원에 개시된 것 모두는 TRAIL의 기능장애에 의해 야기되고, 이와 관련되고/되거나 이에 의해 수반되는 장애, 특히 종양과 같은 증식성 장애, 예를 들면, 고형 또는 림프 종양; 감염성 질환; 염증성 질환; 대사 질환; 자가면역 장애, 예를 들면, 류마티스 및/또는 관절염 질환; 퇴행성 질환, 예를 들면, 다발성 경화증과 같은 신경퇴행성 질환; 아폽토시스-관련 질환 또는 이식 거부의 치료, 예를 들면, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "TRAIL의 기능장애"는 TRAIL의 정상 기능 또는 발현으로부터 벗어난 TRAIL의 임의의 기능 또는 발현, 예를 들면, TRAIL의 정상 생리학적 발현 수준과 비교하여, TRAIL 유전자 또는 단백질의 과발현, TRAIL 유전자 또는 단백질의 감소되거나 폐지된(abolished) 발현, TRAIL의 정상 생리학적 활성 또는 결합과 비교하여, TRAIL의 증가된 활성, TRAIL의 감소되거나 폐지된 활성, 임의의 결합 파트너, 예를 들면, 수용체, 특히 TRAIL 수용체 또는 또다른 사이토카인 분자로의 TRAIL의 증가된 결합, 임의의 결합 파트너, 예를 들면, 수용체, 특히 TRAIL 수용체 또는 또다른 사이토카인 분자로의 감소되거나 폐지된 결합으로서 이해하여야 한다.

다양한 양태에서, 방법은 장애에 걸린 사람 대상자를 진단 및/또는 치료하는 것을 제공하는데, 이는 사람 대상자에게 본원에 개시된 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 투여함을 포함하여 TRAIL 수용체를 표적화하여 진단 및/또는 치료될 수 있는데, 이로서 사람 대상자에서 표적, 또는 표적들의 활성에 미치는 효과가 작용성이고, 하나 이상의 증상이 완화되고/되거나, 치료가 성취된다. 본원에 제공된 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 원발성 및 전이성 암에 걸린 사람을 진단 및/또는 치료에 사용될 수 있고, 상기 암은 유방, 결장, 직장, 폐(예를 들면, 소세포 폐암 "SCLC" 및 비-소세포 폐암 "NSCLC"), 구인두, 하인두, 식도, 위, 췌장, 간, 담낭 및 담관, 소장, 요로(신장, 방광 및 요로상피를 포함함), 암컷 생식관(경부, 자궁, 및 난소 뿐만 아니라 융모막암종 및 임신융모질환을 포함함), 남성 생식관(전립선, 정낭, 고환 및 생식 세포 종양을 포함함), 내분비샘(갑상샘, 부신, 및 뇌하수체를 포함함), 및 피부의 암종, 뿐만 아니라 혈관종, 흑색종, 육종(이들은 뼈 및 연조직으로부터 발생하는 것 뿐만 아니라 카포시 육종을 포함함), 뇌, 신경, 눈, 및 수막의 종양(별아교세포종, 신경아교종, 아교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경모세포종, 슈반세포종, 및 수막종을 포함함), 조혈 악성종양으로부터 발생한 종양, 급성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), B 세포 림프종, 버킷 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구 백혈병(CLL), 털 세포 백혈병, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, DLBCL, 소포 림프종, 조혈 악성종양, 카포시 육종, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 다발성 골수종, 악성종양의 신생물딸림증후군(paraneoplastic syndrome)/고칼슘혈증, 또는 고형 종양을 포함한다.

본원에 개시된 TRAIL 수용체 작용제 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 몇몇 양태에서, 약제학적 조성물은 장애를 치료하기 위한 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다. 예를 들면, 추가 제제는 치료제, 화학요법제; 영상화제, 세포독성제, 혈관형성 억제제, 키나제 억제제(이에 제한되는 것을 아니지만 KDR 및 TIE-2 억제제를 포함한다), 공-자극 분자 조절자 또는 면역 체크포인트 억제제(이에 제한되는 것을 아니지만 항-B7.1, 항-B7.2, 항-B7.3, 항-B7.4, 항-CD28, 항-B7RP1, CTLA4-Ig, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-PD-L2, 항-ICOS, 항-LAG-3, 항-Tim3, 항-VISTA, 항-HVEM, 항-BTLA, 광 융합 단백질, 항-CD137, 항-CD137L, 항-OX40, 항-OX40L, 항-CD70, 항-CD27, 항-GAL9, 항-A2AR, 항-KIR, 항-IDO-1, 항-CD20을 포함함), 수지상 세포/항원-제시 세포 조절자(이에 제한되는 것을 아니지만 항-CD40 항체, 항-CD40 L, 항-DC-SIGN, 항-Dectin-1, 항-CD301, 항-CD303, 항-CD123, 항-CD207, 항-DNGR1, 항-CD205, 항-DCIR, 항-CD206, 항-ILT7을 포함함), 톨-유사 수용체를 위한 조절자(이에 제한되는 것을 아니지만 항-TLR-1, 항-TLR-2, 항-TLR-3, 항-TLR-4, 항-TLR-4, 항-TLR-5, 항-TLR-6, 항-TLR-7, 항-TLR-8, 항-TLR-9를 포함함), 접착(adhesion) 분자 차단제(이에 제한되는 것을 아니지만 항-LFA-1 항체, 항-E/L 셀렉틴 항체, 소분자 억제제를 포함함), 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능적 단편(이에 제한되는 것을 아니지만 항-IL-18, 항-TNF, 또는 항-IL-6/사이토카인 수용체 항체를 포함함), 이특이적 재지시된 T 세포 또는 NK 세포 세포독성(이에 제한되는 것을 아니지만 BiTE®를 포함함), 키메라 T 세포 수용체 (CAR-T) 기반 요법, T 세포 수용체 (TCR)-기반 요법, 치료학적 암 백신, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출가능한 레벨 또는 리포터, TNF 길항제, 항-류머티스약, 근육 이완제, 마약(narcotic), 비-스테로이드 항-염증성 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 아나볼릭 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역법, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사선제제, 항우울제, 항정신병약, 자극제, 천식 의약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제일 수 있다.

본원에 기재된 암의 치료 방법 또는 종양으로부터 전이의 예방 또는 억제의 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질(들)은 단독으로 또는 하나 이상의 추가 제제, 예를 들면, 화학요법제, 방사선요법제, 또는 생물학적 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 몇몇 양태에서, 제제는 하기를 포함할 수 있다: 13-시스-레티노산; 2-CdA; 2-클로로데옥시아데노신; 5-아자시티딘; 5-플루오로우라실; 5-FU; 6-머캅토푸린; 6-MP; 6-TG; 6-티오구아닌; 아브락산; Accutane®; 악티노마이신-D; Adriamycin®; Adrucil®; Afinitor®; Agrylin®; Ala-Cort®; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알림타; 알리트레티노인; Alkaban-AQ®; Alkeran®; 알-트랜스레티노산; 알파 인터페론; 알트레타민; 아메토프테린; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 아나그렐라이드; Anandron®; 아나스트로졸; 아라비노실사이토신; Ara-C Aranesp®; Aredia®; Arimidex®; Aromasin®; Arranon®; 삼산화비소; Arzerra™; 아스파라기나제; ATRA; Avastin®; 아자시티딘; BCG; BCNU; 벤다무스틴; 베바시주맙; 벡사로텐; BEXXAR®; 비칼루타미드; BiCNU; Blenoxane®; 블레오마이신; 보르테조밉; 부설판; Busulfex®; C225; 칼슘 류코보린; Campath®; Camptosar®; 캄프토테신-11; Capecitabine Carac™; 카보플라틴; 카르무스틴; 카르무스틴 웨이퍼; Casodex®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; Cerubidine®; 세툭시마브; 클로람부실; 시스플라틴; 시트로보룸 인자; 클라드리빈; 코르티손; Cosmegen®; CPT-11; 사이클로포스파미드; Cytadren®; 시타라빈; 시타라빈 리포솜; Cytosar-U®; Cytoxan®; 다카르바진; 다코겐; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 다사티닙; 다우노마이신; 다우노루비신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 다우노루비신 리포좀; DaunoXome®; 데카드론; 데시타빈; Delta-Cortef®; Deltasone®; 데니류킨; 디프티톡스; DepoCyt™; 덱사메타손; 덱사메타손 아세테이트; 덱사메타손 나트륨 포스페이트; 덱사손; 덱스라족산; DHAD; DIC; 디오덱스; 도세탁셀; Doxil®; 독소루비신; 독소루비신 리포좀; Droxia™; DTIC; DTIC-Dome®; Duralone®; 두벨리시브; Efudex®; Eligard™; Ellence™; Eloxatin™; Elspar®; Emcyt®; 에피루비신; 에포에틴 알파; 에르비툭스; 에를로티닙; 에르위니아 L-아스파라기나제; 에스트라무스틴; Ethyol Etopophos®; 에토포사이드; 에토포사이드 포스페이트; Eulexin®; 에베롤리무스; Evista®; 엑세메스탄; Fareston®; Faslodex®; Femara®; 필그라스팀; 플록수리딘; Fludara®; 플루다라빈; Fluoroplex®; 플루오로우라실; 플루오로우라실(크림); 플루옥시메스테론; 플루타미드; 폴린산; FUDR®; 풀베스트란트; 게피티닙; 겜시타빈; 겜투주맙 오조가마이신; 겜자르; Gleevec™; Gliadel® Wafer; GM-CSF; 고세렐린; 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF); 과립구 마이크로파지 콜로니 자극 인자(G-MCSF); Halotestin®; Herceptin®; 헥사드롤; Hexalen®; 헥사메틸멜라민; HMM; Hycamtin®; Hydrea®; Hydrocort Acetate®; 하이드로코르티손; 하이드로코르티손 나트륨 포스페이트; 하이드로코르티손 나트륨 석시네이트; 하이드로코르톤 포스페이트; 하이드록시우레아; 이브루티닙; 이브리투모맙; 이브리투모맙 티욱세탄; Idamycin®; Idarubicin Ifex®; 인터페론-알파; 인터페론-알파-2b(PEG 콘쥬게이트); 이포스파미드; 인터류킨-11(IL-11); 인터류킨-2(IL-2); 이마티닙 메실레이트; 이미다졸 카복스아미드; Intron A®; 이필리무맙, Iressa®; 이리노테칸; 이소트레티노인; 익사베필론; Ixempra™; KADCYCLA®; Kidrolase (t) Lanacort®; 라파티닙; L-아스파라기나제; LCR; 레날리도마이드; 레트로졸; 류코보린; 류케란; Leukine™; 류프롤라이드; 류로크리스틴; Leustatin™; 리릴루맙; 리포좀 Ara-C; Liquid Pred®; 로무스틴; L-PAM; L-사르콜리신; Lupron®; Lupron Depot®; Matulane®; 막시덱스; 메클로레타민; 메클로레타민 하이드로클로라이드; Medralone®; Medrol®; Megace®; 메게스트롤; 메게스트롤 아세테이트; MEK 억제제; 멜팔란; 머캅토푸린; 메스나; Mesnex™; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메틸프레드니솔론; Meticorten®; 미토마이신; 미토마이신-C; Mitoxantrone M-Prednisol®; MTC; MTX; Mustargen®; 무스틴; Mutamycin®; Myleran®; Mylocel™; Mylotarg®; 나비토클락스; Navelbine®; 넬라라빈; Neosar®; Neulasta™; Neumega®; Neupogen®; Nexavar®; Nilandron®; 닐로티닙; 닐루타미드; Nipent®; Nitrogen Mustard Novaldex®; 니볼루맙; Novantrone®; 엔플레이트; 옥트레오타이드; 옥트레오타이드 아세테이트; 오파투무맙; Oncospar®; Oncovin®; Ontak®; Onxal™; 오프렐베킨; Orapred®; Orasone®; 옥살리플라틴; 파클리탁셀; 파클리탁셀 단백질-결합된; 파미드로네이트; 파니투무맙; Panretin®; Paraplatin®; 파조파닙; Pediapred®; PEG 인터페론; 페가스파르가세; 페그필그라스팀; PEG-INTRON™; PEG-L-아스파라기나제; PEMETREXED; 펨브롤리주맙; 펜토스타틴; 페르투주맙; 페닐알라닌 머스타드; 필딜리주맙; Platinol®; Platinol-AQ®; 프레드니솔론; 프레드니손; Prelone®; 프로카바진; PROCRIT®; Proleukin®; 카르부스틴 임플란트를 갖는 프로리페프로스판 20; Purinethol®; BRAF 억제제; 랄록시펜; Revlimid®; Rheumatrex®; Rituxan®; 리툭시마브; Roferon-A®; 로미플로스팀; Rubex®; 루비도마이신 하이드로클로라이드; Sandostatin®; Sandostatin LAR®; 사르그라모스팀; Solu-Cortef®; Solu-Medrol®; 소라페닙; SPRYCEL™; STI-571; STIVAGRA™, 스트렙토조신; SU11248; 수니티닙; Sutent®; Tamoxifen Tarceva®; Targretin®; Tasigna®; Taxol®; Taxotere®; Temodar®; 테모졸로마이드 템시롤리무스; 테니포사이드; TESPA; 탈리도마이드; Thalomid®; TheraCys®; 티오구아닌; Thioguanine Tabloid®; 티오프로포아미드; Thioplex®; 티오테파; TICE®; Toposar®; 토포테칸; 토레미펜; Torisel®; 토시투모맙; 트라스투주맙; Treanda®; 트레멜리무맙; 트레티노인; Trexall™; Trisenox®; TSPA; TYKERB®; 우렐루맙; VCR; Vectibix™; Velban®; Velcade®; 베네토클락스; VePesid®; Vesanoid®; Viadur™; Vidaza®; 빈블라스틴; 빈블라스틴 설페이트; Vincasar Pfs®; 빈크리스틴; 비노렐빈; 비노렐빈 타트트레이트; VLB; VM-26; 보리노스타트; 보트리엔트; VP-16; Vumon®; Xeloda®; Zanosar®; Zevalin™; Zinecard®; Zoladex®; 졸레드론산; 졸린자; 또는 Zometa®, 및/또는 특히 본원에 열거되지 않은 유사한 경로를 표적화하는 임의의 다른 제제.

2개 이상의 물질 또는 원리가 조합된 치료 용법의 일부로서 사용되는 경우, 이들은 동일한 투여 경로를 통해 또는 다른 투여 경로를 통해, 본질적으로 동일한 시간에 또는 상이한 시간에(예를 들면, 본질적으로 동시에, 연속적으로, 또는 대안적인 용법에 따라서) 투여될 수 있다. 물질 또는 원리가 동시에 동일한 투여 경로를 통해 투여되는 경우, 이들은 당해 기술 분야의 숙련가에게 명백한 것과 같이 상이한 약제학적 제형 또는 조성물 또는 조합된 약제학적 제형 또는 조성물의 부분으로 투여될 수 있다.

또한, 2개 이상의 활성 물질 또는 원리가 조합된 치료 용법의 일부로서 사용되는 경우, 물질 또는 원리 각각은 동일한 양으로 화합물 또는 원리가 자체로 사용되는 경우에 사용되는 동일한 용법에 따라서 투여될 수 있고, 이러한 조합된 사용은 상승적 효과를 야기할 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 그러나, 2개 이상의 활성 물질 또는 원리의 조합된 사용이 상승적 효과를 야기하는 경우, 이는 또한 투여되는 물질 또는 원리 중 하나, 또는 하나 초과, 또는 모두의 양을 감소시킬 수 있는 동시에, 여전히 목적하는 치료학적 활성은 성취된다. 이는, 예를 들면, 물질 또는 원리가 이의 통상의 양으로 사용되는 경우에, 물질 또는 원리 중 하나 이상의 사용과 관련된 임의의 원치않는 부작용을 피하고 제한하고 감소시키는데 유용할 수 있는 동시에, 여전히 목적하는 약제학적 또는 치료학적 효과는 성취된다.

본 발명에 따라 사용되는 치료 용법의 효과는 임상의에게 명백한 상기 질환 또는 관련 장애에 대해 자체 공지된 임의의 방법으로 측정 및/또는 준수될 수 있다. 임상의는 또한, 적합한 경우 경우에 따른 기준으로(on a case-by-case basis), 특정한 치료 용법을 변경 또는 변형하여 목적하는 치료학적 효과를 성취하고, 원치않은 부작용을 피하고 제한하고 감소시키고, 및/또는 한편으로 목적하는 치료학적 효과를 성취하는 것과 다른 한편으로 목적하지 않는 부작용을 피하고, 제한하고, 또는 감소시키는 것 사이의 적합한 균형을 성취할 수 있다.

일반적으로, 치료 용법은 목적하는 치료학적 효과가 성취될 때까지 및/또는 목적하는 치료학적 효과가 유지되는 한 준수될 것이다. 다시, 이는 임상의에 의해 결정될 수 있다.

다양한 양태에서, 하나 이상의 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 단독으로 또는 예방적 제제, 치료제, 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공한다. 다양한 양태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물의 용도의 비제한적 예는 장애의 진단, 검출, 및/또는 모니터링, 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 처리, 및/또는 개선을 및/또는 연구를 포함한다. 약제학적 조성물의 제형은, 단독으로 또는 예방적 제제, 치료제, 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지되어 있다(US 특허 공보 번호 20090311253 A1).

다양한 양태에서, 약제학적 제형은 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 다당류 및/또는 폴리소르베이트, 및 TRAIL 수용체 작용제 단백질(약 0.1 및 100 mg/ml 사이의 농도로 존재하고 종점을 포함한다(예를 들면, 0.1-10, 1-10, .01-50, 1-50, 1-100, 10-100, 25-100, 25-50, 또는 50-100 mg/ml))를 포함할 수 있고, 여기서, 제형은 pH 약 5.0 및 7.0 사이로 존재하고, 종점을 포함한다(예를 들면, pH 약 5.0-6.0, 5.5-6.0, 5.0-6.5, 5.5-6.5, 또는 6.0-7.0). 양태에서, 제형 중 적어도 하나의 아미노산은 히스티딘이고, 약 10-20 mM, 10-15mM, 15-20mM, 또는 약 15mM의 농도로 존재한다. 양태에서, 제형에서 적어도 하나의 다당류는 수크로스이고, 약 0-8.0% 중량/용적(w/v)의 농도로 존재한다. 양태에서, 제형 중 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80이고, 약 0-0.06% w/v의 농도로 존재한다. 양태에서, 제형 중 적어도 하나의 아미노산은 아르기닌이고, 약 0-1.5% w/v(예를 들면, 0.5-1.5, 1.0-1.5, 또는 0.5-1.0 w/v)의 농도로 존재한다. 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질은 제형에서 약 0.1-100 mg/ml의 농도로 존재한다(예를 들면, 약 1-100 mg/ml, 또는 약 1-15 mg/ml, 또는 약 1-7.5 mg/ml, 또는 약 2.5-7.5 mg/ml, 또는 약 5-7.5 mg/ml, 또는 약 25-100 mg/ml, 또는 약 20-60 mg/ml, 또는 약 25-50 mg/ml, 또는 약 25 mg/ml, 또는 약 50 mg/ml, 또는 약 0.1-60 mg/ml, 또는 약 0.1-25 mg/ml, 또는 약 1.0-60 mg/ml, 또는 약 0.5-60 mg/ml, 또는 약 0.1-2.0 mg/ml, 또는 약 0.5-2.0 mg/ml, 또는 약 1-5 mg/ml, 또는 약 1-7.5 mg/ml, 또는 약 1-15 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml, 또는 약 1.0 mg/m).

본원에 사용된 어구 "유효량"은 TRAIL 작용제 단백질의 양을 의미하고, TRAIL의 기능장애 또는 TRAIL-관련 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 파라미터에서 검출가능한 개선(예를 들면, 기준선으로부터 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 그 이상)을 야기한다.

다양한 양태에서, 약제학적 제형은 수성 제형, 동결건조 제형, 또는 동결건조 및 재수화 제형이다. 양태에서, 수화 용액은 덱스트로스 및/또는 염수이다(예를 들면, 약 5% w/v의 농도의 덱스트로스 및/또는 약 0.9% w/v의 농도의 염수). 양태에서, 약제학적 제형은 약 15 mM 히스티딘, 약 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 80, 약 4% (w/v) 수크로스, 및 약 0.1-25 mg/ml의 TRAIL 수용체 작용제 단백질, 또는 약 1-15 mg/ml의 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 포함하고, pH 약 6에서 존재한다. 양태에서, 제형은 추가로 적어도 하나의 추가 제제를 포함한다.

다양한 양태에서, 제형은 약 25 mg/ml TRAIL 수용체 작용제 단백질, 약 15 mM 히스티딘, 0.03% 폴리소르베이트 80(중량/용적, w/v), 4.0% 수크로스 (w/v), 및 pH 약 6.0를 포함하여 사용된다. 몇몇 양태에서, 제형은 아르기닌을 포함하지 않는다. 몇몇 양태에서, 제형은, 다른 성분 또는 농도를 포함하는 다른 제형과 비교하여, 예상치못하게 개선된 냉동-해동 안정성, 액체 제형 안정성, 및/또는 동결건조 제형 안정성을 나타낸다.

본원에 제공된 치료제의 투여 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 경구 투여, 비경구 투여(예를 들면, 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외 투여, 종양내 투여, 점막 투여(예를 들면, 비내 및 경구 경로) 및 폐 투여(예를 들면, 인할러 또는 네불라이저로 투여되는 에어로졸화된 화합물)를 포함한다. 투여의 특이적 경로를 위한 약제학적 조성물의 제형, 및 투여의 다양한 방법에 필요한 물질 및 기술은 이용가능하고, 당해 기술 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다(US 특허 공보 번호 20090311253 A1).

다양한 양태에서, 용량 용법은 최적의 목적하는 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방적 반응)을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스(bolus)는 투여될 수 있고, 분할된 용량이 경시적으로 투여될 수 있거나 용량은 치료학적 상황의 긴급에 따라서 지시된 바와 같이 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 몇몇 양태에서, 비경구 조성물은 투여 용이성 및 용량 균일성을 위해 용량 단위 형태로 제형화된다. 용어 "용량 단위 형태(dosage unit form)"는 치료될 포유동물 대상자를 위한 단일 용량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 언급하고; 각각의 단위는 목적하는 치료학적 효과를 제공하도록 계산된 필요한 약제학적 담체와 회합된 활성 화합물의 미리결정된 양을 포함한다.

본원에 제공된 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 치료학적 또는 예방적으로 유효량의 예시적인 비제한적 범위는 약 0.1-100 mg/kg이다(예를 들면, 약 0.1-0.5, 0.1-1, 0.1-10, 0.1-20, 0.1-50, 0.1-75, 1-10, 1-15, 1-7.5, 1.25-15, 1.25-7.5, 2.5-7.5, 2.5-15, 5-15, 5-7.5,1-20, 1-50, 7-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, 또는 10-100 mg/kg, 또는 그 사이의 임의의 농도). 몇몇 양태에서, TRAIL 수용체 작용제 단백질은 약제학적 조성물에 치료학적으로 효과적인 농도, 예를 들면, 약 0.1-100 mg/ml의 농도(예를 들면, 약 0.1-0.5, 0.1-1, 0.1-10, 0.1-20, 0.1-50, 0.1-75, 1-10, 1-20, 1-50, 1-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, 또는 10-100 mg/ml, 또는 그 사이의 임의의 농도)로 존재한다. 용량 값이 완화될 상태의 타입 및/또는 중증도에 따라 가변적임을 주지한다. 임의의 특정한 대상자에 대해, 특이적 용량 용법은 개별적인 필요 및/또는 투여하거나 조성물의 투여를 감리하는 사람의 전문적인 판단에 따라서 경시적으로 조절될 수 있고, 본원에 기재된 용량 범위는 단지 예시적이고 청구된 조성물의 범위 및 실행을 제한하려는 의도는 아님을 추가로 이해하여야 한다.

실시예

1. TRAIL 수용체 작용제 단백질(sc TRAIL wt)의 제조

1.1 폴리펩타이드 구조

A) 아미노산 Met1 - Gly20

Ig-카파-시그널 펩타이드, 추정된 아미노산 GIy 20 뒤의 시그널 펩티다제 절단 위치.

B) 아미노산 Gln21 - Gly182

사람 TRAIL 리간드의 첫번째 가용성 사이토카인 도메인(TRAIL, 서열 번호 1의 아미노산 120 - 281).

C) 아미노산 GIy 183 - Ser 190

서열 번호 2의 첫번째 펩타이드 링커 요소.

D) 아미노산 Arg191 - Gly351

사람 TRAIL 리간드의 두번째 가용성 사이토카인 도메인(TRAIL, 서열 번호 1의 아미노산 121 - 281).

E) 아미노산 GIy352 - Ser359.

서열 번호 2의 두번째 펩타이드 링커 요소.

F) 아미노산 Arg360 - Gly520

사람 TRAIL 리간드의 세번째 가용성 사이토카인 도메인(TRAIL, 서열 번호 1의 아미노산 121-281).

G) 아미노산 Gly521 - Cys542

서열 번호 11의 힌지-링커 요소.

H) 아미노산 Pro543 - Lys760

서열 번호 10의 항체 Fc 단편 도메인.

상기 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 서열 번호 14에 나타낸다.

지시된 링커는 다른 바람직한 링커에 의해, 예를 들면, 서열 번호 3-9로 나타낸 것에 의해 대체될 수 있다.

첫번째 및 두번째 펩타이드 링커가 동일할 필요가 없음을 주지하여야 한다.

시그널 펩타이드 서열 (A)은 임의의 다른 적합한, 예를 들면, 포유동물 시그널 펩타이드 서열로 대체될 수 있다.

1.2 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 카세트

합성 유전자는 적합한 숙주 세포, 예를 들면, 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서 발현을 위한 이의 코돈 사용을 고려하여 최적화될 수 있다. 바람직한 핵산 서열은 서열 번호 16에 나타낸다.

2. 발현 및 정제

융합 폴리펩타이드의 클로닝, 발현 및 정제

상기 언급된 융합 단백질은 2개의 상이한 진핵 숙주 세포에서 재조합 발현되었다:

상기한 TRAIL 수용체 작용제 융합 단백질의 초기 분석을 위해, 10% FBS, 100 유닛/ml 페니실린 및 100 [mu]g/ml 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM + GlutaMAX (GibCo)에서 성장한 Hek293T 세포를 융합 폴리펩타이드를 위한 발현 카세트 및 적합한 선택 마커를 포함하는 플라스미드(예를 들면, 블라스티시딘, 푸로마이신 또는 하이그로마이신 내성 유전자를 포함하는 기능적 발현 카세트)로 일시적으로 형질감염시켰다. 다수의 폴리펩타이드 쇄가 최종 생성물을 수득하기 위해 필수적인 이들 경우에, 발현 카세트는 형질감염 동안 하나의 플라스미드 상에서 결합되거나 상이한 플라스미드 상에 위치하였다. 재조합 융합 폴리펩타이드를 포함하는 세포 배양 상청액을 형질감염 후 3일에 수거하고, 300 x g에서 원심분리하여 정화하고, 이어서, 0.22 μm 멸균 필터를 통과시켜 여과하였다.

생체내 사용되는 TRAIL 수용체 작용제 융합 단백질의 보다 큰 규모 발현을 위해, 상기 언급된 단백질을 암호화하는 합성 DNA 카세트를 적합한 선택 마커(예를 들면, 블라스티시딘, 푸로마이신 또는 하이그로마이신 내성 유전자를 포함하는 기능적 발현 카세트) 및 숙주 세포 유전체 내에 전사 활성 삽입 위치의 수를 개선시키는데 적합한 유전 요소를 포함하는 진핵 발현 벡터 내로 삽입하였다. 서열 확인된 발현 벡터를 전기천공에 의해 현탁액 내로 개조된 중국 햄스터 난소 세포(CHO-S, Invitrogen)를 도입하였다. 적합한 선택 압력을 형질감염 후 3일에 형질감염된 세포에 적용하였다. 벡터 유도된 내성 유전자(들)를 포함하는 생존 세포를 후속적인 배양에 의해 선택 압력하에 회수하였다. 화학적으로 정의된 배지(PowerCHO2-CD, Lonza)에서 37℃ 및 7% CO₂ 분위기에서 오비탈 진탕기 인큐베이터(100 rpm, 50mm 진탕 쓰로우(shaking throw))에서 선택된 세포 풀의 안정한 성장후, 개별적인 상청액을 상기 언급된 단백질을 검출하는 ELISA-검정으로 분석하고, 가장 높은 특이적 생산성을 갖는 세포 풀을 단백질 생산 전에 진탕 플라스크에서 확장시켰다(expanded)(오비탈 진탕기, 100 rpm, 진탕 쓰로우 50mm).

실험실 규모 단백질 생산을 위해, 개별적인 세포 풀을 7-12일 동안 화학적으로 정의된 배지(PowerCHO2-CD, Lonza)에서 37℃ 및 7% CO₂ 분위기에서 웨이브(Wave) 바이오리액터 20/50 EHT(GE-Healthcare)에서 배양하였다. 기저 배지는 4mM 글루타맥스 보충된 PowerCHO2-CD이었다. 웨이브 배양을 생존가능한 세포 농도 0.3 내지 0.4 x 10e6 세포/ml 및 하기 설정을 사용하여 시작하였다(5- 또는 10 리터 백에 대해): 진탕 빈도 18rpm, 진탕 각 7°, 기체 흐름 0.2-0.3 L/min, 7% CO₂, 36.5℃. 웨이브 작동 동안, 세포 배양물을 PowerFeed A(Lonza)로, 보통 2일(20% 공급)에 및 5일(30% 공급)에 2회 공급하였다. 두번째 공급 후, 진탕 빈도를 22rpm으로 증가시키고, 뿐만 아니라 진탕 각을 8°로 증가시켰다.

바이오액터를 대개 세포 생존력이 80% 아래로 떨어지는 경우 7일 내지 12일 사이에 수거하였다. 첫번째, 배양 상청액을 수동 심청 여과 시스템(Millipore Millistak Pod, MC0HC 0.054m²)을 사용하여 정화하였다. 스트렙-태그된 단백질에 대해, 아비딘을 최종 농도 0.5mg/L로 첨가하였다. 최종적으로, TRAIL 수용체 작용제 융합 단백질을 포함하는 배양 상청액을 보틀 탑 필터(bottle top filter)(0.22μm, PES, Corning)를 사용하여 멸균 여과하고, 추가 처리까지 2 내지 8℃에서 저장하였다.

친화성 정제(affinity purification)를 위해, 스트렙타신 세파로스를 컬럼(겔 층 1ml)에 충전하고, 15ml 완충액 W(100 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 8.0) 또는 PBS pH 7.4로 평형화시키고, 세포 배양 상청액을 컬럼에 4ml/min의 유속으로 적용하였다. 후속적으로, 컬럼을 15ml 완충액 W로 세척하고, 결합된 폴리펩타이드를 7 x 1ml 완충액 E (100 mM Tris HCI, 150 mM NaCI, 2.5 mM 데스티오비오틴, pH 8.0)를 첨가하여 단계적으로 용리하였다. 대안적으로, 2.5 mM 데스티오비오틴를 포함하는 PBS pH 7.4를 이러한 단계를 위해 사용할 수 있다.

스트렙타신 세파로스 기반 방법에 대안적으로, 친화성 정제를 고정된 단백질-A를 친화도 리간드로서 사용하는 컬럼 및 Akta 크로마토그래피 시스템(GE-Healthcare)을 사용하여 수행하였다. 융합 단백질의 FC-도메인에 대해 높은 친화도를 갖는 고형 상 물질을 선택하였다: MABSelect Sure^TM (GE Healthcare). 간단하게, 정화된 세포 배양 상청액을 컬럼-층 1ml당 10mg 융합 단백질 적재량을 넘지 않는 세척-완충액-1(20 mM Pi, 95 mM NaCl, pH7.2)로 평형화된 HiTrap MabSelectSure 컬럼(CV=5ml) 상에 적재하였다. 컬럼을 상기한 평형화 완충액의 10 컬럼-용적(10CV), 이어서, 세척-완충액-2(20mM Pi, 95mM NaCl, pH 8.0)의 4 컬럼-용적(4CV)으로 세척하여 숙주-세포 단백질 및 숙주-세포 DNA를 고갈시켰다. 이어서, 컬럼을 용리 완충액(20mM Pi, 95mM NaCl, pH 3.5)으로 용리하고, 용리액을 10 이하의 분획으로 수거하였고, 각 분획은 컬럼-층 용적(5ml)과 동일한 용적을 갖는다. 각 분획을 동일한 용적의 상기 언급한 세척-완충액-2로 중화시켰다. 선속도는 150cm/h로 설정되고, 상기 언급된 친화도 크로마토그래피 방법 동안 일정하게 유지하였다.

용리액 분획의 단백질 양을 정량화하고, 피크 분획을 한외여과로 농축하고, 추가로 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 정제하였다.

SEC를 Superdex 200 10/300 GL 또는 HiLoad 26/60 컬럼 상에서 Akta 크로마토그래피 시스템(GE-Healthcare)을 사용하여 수행하였다. 컬럼을 포스페이트 완충된 염수를 사용하여 평형화하고, 농축된, 친화성-정제된 폴리펩타이드를 SEC 컬럼 상에 2% (v/v)의 컬럼-용적을 넘지 않는 샘플 용적으로 적재하였다. Superdex200 10/300 GL 컬럼(GE Healthcare)의 경우에, 1분당 0.5ml의 유속을 적용하였다. HiLoad 26/60 Superdex200 컬럼의 경우에, 1분당 2.5ml의 유속을 적용하였다. 폴리펩타이드의 용리 프로파일을 280nm에서 흡광도에 의해 모니터링하였다.

미처리 상태하에 정제된 융합 폴리펩타이드의 겉보기(apparent) 분자량의 측정을 위해, Superdex 200 컬럼을 공지된 분자량의 표준 단백질로 적재하였다. 표준 단백질의 용리 용적을 기준으로 하여, 캘리브레이션 곡선을 플롯팅하고, 정제된 융합 폴리펩타이드의 겉보기 분자량을 측정하였다. TRAIL 수용체 작용제 융합 단백질을 포함하는 FC-도메인은 전형적으로 대략적으로 160-180 kDa의 동종이합체에 대해 겉보기 분자량을 갖는 Supoerdex200 컬럼으로부터 용리되었다.

3. 아폽토시스 검정

저캇 A3 영구 T-세포주를 갖는 세포 검정을 사용하여 TRAIL-수용체 작용제 융합 단백질의 아폽토시스 유도 활성을 측정하였다. 저캇 세포는 10% FBS, 100 유닛/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지 + GlutaMAX (GibCo)를 갖는 플라스크에서 성장시켰다. 검정 이전, 100,000 세포를 웰당 96-웰 마이크로티터플레이트 내로 시딩하였다. 상이한 농도의 융합 펩타이드의 웰로의 첨가하고, 이어서, 37℃에서 3시간 배양하였다. 세포를 용해 완충액(250 mM HEPES, 50 mM MgCI2, 10 mM EGTA, 5% Triton-X-100, 100 mM DTT, 10 mM AEBSF, pH 7.5)을 첨가하여 용해시키고, 플레이트를 30분 내지 2시간 동안 얼음에 놓았다. 아폽토시스를 증가된 활성의 카스파제, 예를 들면, 카스파제-3에 필적한다. 따라서, 특이적 카스파제 기질 Ac DEVD-AFC (Biomol)의 절단을 사용하여 아폽토시스의 범위를 측정하였다. 사실상, 카스파제 활성은 세포를 프로피듐 요오다이드 및 Hoechst-33342로 염색한 후 형태학적으로 측정한 아폽토시스 세포의 퍼센트와 상관관계가 있다. 카스파제 활성 검정을 위해, 20μl 세포 용해물을 블랙 96-웰 마이크로티터플레이트로 이동하였다. 50 mM HEPES, 1% 수크로스, 0.1% CHAPS, 50 μM Ac-DEVD-AFC, 및 25 mM DTT, pH 7.5를 포함하는 80μl 완충액을 첨가한 후, 플레이트를 Tecan Infinite 500 마이크로티터플레이트 판독기로 옮기고, 형광 강도 증가를 모니터링하였다(여기 파장 400nm, 방출 파장 505nm).

3.1 세포 사멸 검정

HT1080 섬유육종 세포에서 세포 사멸을 측정하기 위해, 15,000개 세포를 96-웰 플레이트에 밤새 10% FBS(Biochrom)로 보충된 RPM1 1640-배지 + GlutaMAX(GibCo)에서 플레이팅하였다. 세포를 사이클로헥스이미드(Sigma)와 최종 농도 2.5g/ml에서 인큐베이팅(coincubating)하였다. 세포 사멸을 완충액 KV(0.5% 결정 자색, 20% 메탄올)으로 염색하여 정량화하였다. 염색 후, 웰을 물로 세척하고, 공기-건조하였다. 염료를 메탄올로 용리하고, 595nm에서 광학 밀도를 ELISA 판독기로 측정하였다.

4. 안정성/응집 시험

4.1 응집 분석의 원리(가용성 단백질에 대한 정의)

단량체(TRAIL 수용체 결합 모듈의 정의된 삼량체 어셈블리) 및 응집물의 함량을 실시예 2에 기재된 분석적 SEC에 의해 측정한다. 이러한 특정한 목적을 위해 분석을 생리학적 염 농도를 생리학적 pH(예를 들면, 0.9% NaCI, pH 7.4; PBS pH 7.4)에서 포함하는 완충액 중에서 수행한다. 전형적인 응집 분석을 Superdex200 컬럼(GE Healthcare) 상에서 수행한다. 이러한 컬럼은 단백질을 10 내지 800 kDa의 범위로 분리하다.

미처리 조건하에 정제된 융합 폴리펩타이드의 겉보기 분자량의 측정을 위해, Superdex 200 컬럼을 공지된 분자량의 표준 단백질로 적재한다. 표준 단백질의 용리 용적을 기준으로 하여, 캘리브레이션 곡선을 플롯팅하고, 정제된 융합 폴리펩타이드의 겉보기 분자량을 용리 용적을 기초로 하여 계산한다.

가용성, 비-응집된 단백질, 예를 들면, 삼량체 TRAIL의 SEC 분석은, 전형적으로 별개의 단일 단백질 피크를 정의된 용리 용적에서 나타낸다. 이러한 용리 용적은 특정한 단백질의 겉보기 미처리 분자량에 상응하고, 대략적으로 1차 아미노산 서열을 기준으로 하여 계산된 이론적 분자량에 따른다.

단백질 응집이 일어나는 경우, SEC 분석은 더 낮은 체류(retention) 용적을 갖는 추가 단백질 피크를 나타낸다. TRAIL에 대해, 가용성 단백질의 응집은 특징적인 방식으로 일어난다. 단백질은 "삼량체"의 올리고머를 형성하여 9량체(nonamers)(3 x 3) 및 27량체(3 x 9)를 형성하는 경향이 있다. 이들 올리고머는 응집 시드로서 역할을 하고, 높은 함량의 올리고머는 잠재적으로 단백질의 응집을 야기한다. 큰 분자량의 올리고머 및 응집물은 Superdex200 컬럼의 빈(void) 용적으로 용리되고, 이들의 미처리 분자량에 대해 SEC에 의해 분석할 수 없다.

(완전한) 응집의 유도 때문에, TRAIL-SF 융합 단백질의 정제된 제조물은 바람직하게는 단지 정제된 삼량체 단백질 및 단지 매우 적은 양의 올리고머화 단백질을 포함하여야 한다. 특정한 TRAIL-SF 단백질 제조물의 응집/올리고머화 정도를 SEC 분석을 기초로 하여 정의된 삼량체 및 올리고머/응집물 분획 각각에 대해 OD280 다이아그램의 피크 면적을 계산하여 측정한다. 총 피크 면적을 기초로 하여, 정의된 삼량체 단백질의 퍼센트는 다음과 같이 계산한다:

(% 삼량체 함량 = [피크 면적 삼량체] / [총 피크 면적] x 100)

이러한 텍스트에서 사용되는 가용성 단백질에 대한 정의는, 생리학적 염 농도의 완충액에서 생리학적 pH에서 정의된 가용성 단백질(TRAIL 도메인의 삼량체 어셈블리) 함량 > 90%를 0.2 내지 10.0 mg/ml의 전형적인 단백질 농도 범위 내에서 포함하는 정제된 TRAIL 단백질의 단백질 제조물을 기술한다.

5. 반감기 측정

분자 A-D는 각각 쇄간 디설파이드 결합에 의해 공유결합으로 링크된 2개의 폴리펩타이드로 구성된다. 글리코사이트 및 힌지 시스테인(쇄간 디설파이드 결합을 단백질 사이에 야기함)의 수를 시험하여 이들 특성 변경이 이들 화합물의 반감기에 미치는 효과를 측정하였다.

암컷 NMRI 마우스를 1.2 mg/kg bw 및/또는 4 mg/kg bw의 명시된 화합물을 사용하여 단일 정맥내 볼루스 주사로 처리하였다. 전혈을 적용 전(투약전(predose)), 및 시험 항목 투여 후 168시간까지 수집하였다. 혈청을 제조하고, 샘플을 -80℃에서 혈청 농도의 측정까지 저장하였다. 약동학적 파라미터를 평균 혈청 농도 및 비-구획 약동학적 데이터 분석을 위한 약동학적 평가 프로그램 PK Solutions 버젼 2.0(Summit Research Services, Montrose, CO)를 사용하여 계산하였다. PK Solutions은 자동화된, 엑셀-기반 어플리케이션이고, 이는 예를 들면, 정맥내 또는 혈관외 투여 경로 후 생물학적 샘플의 분석으로부터 수득된 농도-시간 데이터로부터 약동학적 파라미터를 산출한다. PK Solutions는 임의의 특이적 구획 모델을 추정하지 않고 결과를 계산한다.

혈청에서 시험 항목의 정량화는 표 7에 나타낸 개별적인 TRAIL-수용체 작용제를 검출하는 ELISA-검정을 사용하여 수행하였고, 분자의 부분인 스트렙-태그와는 독립적이다. 일반적 레이아웃(layout)을 도 18에 나타낸다. 결과를 표 7에 요약한다.

분자 A(서열 번호 26의 2개의 폴리펩타이드로 구성됨)는 2개의 힌지 시스테인(2개의 쇄간 디설파이드 결합을 형성함) 및 Fc 영역의 위치 297에서 N 잔기(EU 인덱스에 따라서)를 갖고, 야생형 CH2 당화를 야기한다. 분자 A는 또한 글리코사이트를 위치 168 및 337에서 갖는다. 분자 B(서열 번호 19의 2개의 폴리펩타이드로 구성됨)는 3개의 힌지 시스테인(3개의 쇄간 디설파이드 결합을 형성함)(위치 513, 519, 및 522에서) 및 N297S 돌연변이를 Fc 영역의 위치 297에서 갖고(EU 인덱스에 따라서), CH2 도메인의 무당화를 야기한다. 분자 B는 또한 글리코사이트를 위치 168 및 337에서 갖는다. 분자 C(서열 번호 27의 2개의 폴리펩타이드로 구성됨)는 3개의 힌지 시스테인(3개의 쇄간 디설파이드 결합을 형성함) 및 N297S 돌연변이를 Fc 영역의 위치 297에서 갖고(EU 인덱스에 따라서), CH2 도메인의 무당화를 야기한다. 추가로, 위치 168에서 글리코사이트가 존재하지만(링커 1), 위치 337(링커 2)에서는 존재하지 않는다. 분자 D(서열 번호 28의 2개의 폴리펩타이드로 구성됨)는 3개의 힌지 시스테인(3개의 쇄간 디설파이드 결합을 형성함) 및 N297S 돌연변이를 Fc 영역의 위치 297에서 갖고(EU 인덱스에 따라서), CH2 도메인의 무당화를 야기한다. 추가로, 둘 다의 링커 1 및 링커 2 상 글리코사이트(각각 위치 168 및 337)는 분자 D에서 고갈되었다.

분자 B(둘 다 당화된 링커, 고갈된 CH2 글리코사이트, 및 세번째 힌지 시스테인의 첨가)의 생체내 안정성(화합물 반감기에 의해 판단됨)은 분자 A와 비교하여 개선되었다. 추가로, 화합물(분자 D)에서부터의 모든 글리코사이트의 고갈은 일시적 발현 동안 감소된 생체내 안정성 및 낮은 생산성을 야기하였다. 분자 C(당화된 첫번째 링커, 무당화된 두번째 링커, 고갈된 CH2 글리코사이트)는 분자 B 및 D와 비교하여 중간의(intermediate) 생체내 안정성을 나타내었다(표 7에 결과를 참조).

표 7: NMRI-마우스에서 화합물 반감기 시험 결과

이들 실험 결과는 세번째 쇄간 디설파이드 결합(힌지 시스테인의 첨가를 통해)과 링커 당화(링커 1 및 2 둘 다에서)의 조합 및 Fc 영역에서 CH2 도메인의 탈당화가 본 발명의 분자에서 보다 큰 생체내 안정성을 야기한다는 것을 입증한다.

6. 효능의 시험관내 입증

6.1 서열 번호 19의 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 사람 혈액 종양 및 고형 종양 세포 생존을 시험관내 억제한다.

종양 세포를 10,000 세포/웰에서 96-웰 플레이트에 10% FBS를 포함하는 권고된 배지에서 시딩하고, 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질로 24시간 동안 37℃에서 습윤된 5% CO₂ 분위기에서 처리하였다. 세포 생존력을 후속적으로 제조자(Promega; Madison, WI)의 지시에 의해 기재된 바와 같이 CellTiter-Glo® 시약을 사용하여 평가하였다. IC₅₀ 값을 비-처리된 대조군 세포로 정규화된 농도 반응 데이터의 비-선형 회귀 분석으로 측정하였다. 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질 처리에 대한 반응에서 세포 생존력 손실을 나타내는 Colo205, 저캇 및 SKM-1 세포에 대한 수득한 농도 반응 곡선의 예를 도 19에 나타낸다. 표 8은 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질로 24시간 동안 처리된 혈액 종양(A; (n=40; 비-호지킨 림프종, NHL; 급성 골수성 림프종, AML; 급성 림프모구 백혈병, ALL) 및 고형 종양(B; (n=44; 비-소 세포 폐 암종, NSCLC; 췌장; 결장직장 암, CRC; 유방 암, BrCa; 난소, 섬유육종; 두경부, H&N; 소세포 폐암, SCLC) 세포주의 결과를 나타내고, 생존력을 CellTiter-Glo®로 평가하였다. 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질에 대해 수득한 IC₅₀-종양 세포 생존력에 미치는 매개된 효과가 제시된다.

표 8

시험관내 사람 종양 암 세포주에서 서열 번호 19의 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 효능(Potency)

6.2 서열 번호 19의 TRAIL 수용체 작용제 단백질은 항-종양형성 제제와 함께 상승작용하여 종양 세포 사멸을 유도한다.

종양 세포를 10,000 세포/웰에서 96-웰 플레이트에 10% FBS를 포함하는 권고된 배지에서 시딩하고, 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질 및 베네토클락스 (ABT-199), 나비토클락스 (ABT-263) 또는 도세탁셀 (DTX)로 24시간 동안 37℃에서 습윤된 5% CO₂ 분위기에서 공-처리하였다. 세포 생존력을 후속적으로 제조자의 지시에 의해 기재된 바와 같이 CellTiter-Glo® 시약을 사용하여 평가하였다. 블리스 독립 모델(Bliss independence model)(참조: Wong et al., 2012; Mol. Cancer Ther. 11:1026-1035; Bernebaum, 1981 Adv. Cancer Res. 35:269-335; Borisy et al., 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7977-7982)을 병용 활성을 평가하기 위해 사용하고, 음의 정수는 길항작용(antagonism)를 나타내고, 제로 값은 부가(additive) 활성을 나타내고, 양의 정수는 상승효과를 나타낸다. 블리스 스코어를 각 병용에 대해 용량 매트릭스(dose matrix)로 계산하고, 합계하여 "블리스 합" 값을 제공하였다. 상승적 종양 세포 사멸의 예를 사람 종양 세포를 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질 및 베네토클락스, 나비토클락스 또는 DTX로 공-처리하여 유도하였고, 관련된 블리스 합을 도 20(A-C)에 나타낸다. 다수의 종양 세포주에서 이들 병용에 대해 측정된 블리스 합을 표 9에 도시한다.

표 9

시험관내 NSCLC 세포주 (A)에서 DTX 및 NHL & AML 세포주 (B)에서 베네토클락스 또는 나비토클락스와 병용된 서열 번호 19의 TRAIL 수용체 작용제 단백질에 의한 세포 사멸의 블리스 상승효과 평가

7. 서열 번호 19의 TRAIL 수용체 작용제 단백질 치료는 생체내 종양 성장을 억제한다.

서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 종양 성장에 미치는 효과를 SCID 암컷 마우스(Charles Rivers Laboratories; Wilmington, MA)에 이식된 피하 Colo205 (결장직장), SKM-1 (급성 골수성 백혈병), 및 H460LM (비-소 세포 폐) 이종이식 종양에서 평가하였다. 간단히, 사람 암 세포를 암컷 SCID 마우스의 우측 뒷 옆구리 내로 연구일 0일에 피하 접종하였다. 서열 번호 19의 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 투여(0.3, 1, 또는 3 mkd 투약 IV, QDx5 또는 IP, Q2Dx5 지시된 바와 같음)를 사이즈 매치(size match) 시간에 개시하였다. 각 그룹에서 평균 종양 용적이 Colo205 및 SKM-1에 대해 >2000 mm³ 또는 H460LM에 대해 또는 >2500 mm³의 종점에 도달할 때까지 종양 용적을 실험 동안 측정하였다. 결과를 도 21 내지 23에 나타낸다. 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 투여는 유의한 종양 성장 억제를 Colo205, SKM-1, 및 H460LM 이종이식 종양 모델에서 유도하였다.

서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 종양 성장에 미치는 효과를 또한 NSG 암컷 마우스(Champions Oncology; Hackensack, NJ)에 이식된 환자-유래된 이종이식 모델 CTG-0069 (결장직장), CTG-0167 (NSCLC), CTG-0293 (췌장), CTG-0714 (육종), CTG-0136 (식도), CTG-485 (위), 및 CTG-0785 (유잉 육종)에서 평가하였다. 간단하게, 종양 단편을 암컷 NSG 마우스의 우측 뒷 옆구리 내로 피하로 연구일 0일에 전파하였다. 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 투여(3 mkd 투약 IP, Q2Dx5)를 사이즈 매치 시간에 개시하였다. 각 그룹에서 평균 종양 용적이 >2000 mm³의 종점 또는 60일에 도달할 때까지 종양 용적을 실험 동안 측정하였다. 결과를 도 24(A-G)에 나타낸다. 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드로 구성된 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 투여는 CTG-0069 (결장직장), CTG-0167 (NSCLC), CTG-0293 (췌장), CTG-0714 (육종), CTG-0136 (식도), CTG-485 (위), 및 CTG-0785 (유잉 육종) PDX 모델에서 유의한 종양 성장 억제를 유도하였다.

SEQUENCE LISTING <110> ABBVIE INC. APOGENIX AG <120> SINGLE-CHAIN TRAIL-RECEPTOR AGONIST PROTEINS <130> 566215: BBI-999PC <140> PCT/US2015/027270 <141> 2015-04-23 <150> US 61/983,152 <151> 2014-04-23 <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> source <223> /note="human TRAIL" <400> 1 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140 Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 18 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro 1 5 10 15 Ala Gly Asn Gly Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly 20 25 30 Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu 35 40 45 Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe 50 55 60 Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys 65 70 75 80 Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu 85 90 95 Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr 100 105 110 Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg 115 120 125 Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr 130 135 140 Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser 145 150 155 160 Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe 165 170 175 Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Arg Val 180 185 190 Ala Ala His Ile Thr Gly 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Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 290 295 300 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala 305 310 315 320 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Arg 325 330 335 Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser 340 345 350 Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser 355 360 365 Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu 370 375 380 Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr 385 390 395 400 Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys 405 410 415 Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro 420 425 430 Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys 435 440 445 Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu 450 455 460 Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu 465 470 475 480 Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 485 490 495 Gly Pro Gly Ser Ser 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Claims (22)

1. 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질.
2. 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 TRAIL 수용체 작용제 단백질.
3. 제2항에 있어서, 상기 2개의 폴리펩타이드가 각 폴리펩타이드의 시스테인 잔기 513, 519, 및 522 사이에 형성된 3개의 쇄간 디설파이드 결합을 통해 공유결합되는, TRAIL 수용체 작용제 단백질.
4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 폴리펩타이드(들)의 위치 168 및 337에서 상기 아스파라긴 잔기 중 하나 이상이 N-당화되는, TRAIL 수용체 작용제 단백질.
5. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 폴리펩타이드(들)의 위치 168 및 337에서 상기 아스파라긴 잔기가 둘 다 N-당화되는, TRAIL 수용체 작용제 단백질.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드(들)가 추가로 번역-후 변형되는, TRAIL 수용체 작용제 단백질.
7. 제6항에 있어서, 상기 번역-후 변형이 상기 N-말단 글루타민의 피로글루타메이트로의 변형을 포함하는, TRAIL 수용체 작용제 단백질.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 TRAIL 수용체 작용제 단백질 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 및/또는 보조제를 포함하는 약제학적 조성물.
9. 제1항의 TRAIL 수용체 작용제 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
10. 제9항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
11. 제9항의 핵산 분자를 포함하는 세포.
12. 제11항에 있어서, 진핵 세포인 세포.
13. 제11항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포인, 세포.
14. 제11항에 있어서, 상기 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 세포.
15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 TRAIL 수용체 작용제 단백질의 유효량을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, TRAIL-관련 질환 또는 장애를 갖는 대상자를 치료하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 종양, 감염성 질환, 염증성 질환, 대사 질환, 자가면역 장애, 퇴행성 질환, 아폽토시스-관련 질환, 및 이식 거부로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 종양이 고형 종양인, 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 종양이 림프 종양인, 방법.
19. 제16항에 있어서, 상기 자가면역 장애가 류마티스 질환, 관절염 질환, 또는 류마티스 및 관절염 질환인, 방법.
20. 제16항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 류마티스 관절염인, 방법.
21. 제16항에 있어서, 상기 퇴행성 질환이 신경퇴행성 질환인, 방법.
22. 제16항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이 다발성 경화증인, 방법.
    
    

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