CN111718424A - 单链trail受体激动剂蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单链TRAIL受体激动剂蛋白。本文提供了特定的TRAIL受体激动剂蛋白、其编码核酸、以及治疗患有TRAIL相关疾病或障碍的个体的方法。本文提供的TRAIL受体激动剂蛋白包含三个可溶性TRAIL域和一个Fc片段。所述TRAIL受体激动剂蛋白基本上是非聚集的并且适合治疗、诊断和/或研究应用。

Description

单链TRAIL受体激动剂蛋白

相关专利申请

本申请是国际申请日为2015年4月23日的国际申请PCT/US2015/027270进入中国、申请号为201580031858.7的题为“单链TRAIL受体激动剂蛋白”的发明专利申请的分案申请。本申请要求于2014年4月23日提交的美国临时专利申请号61/983,152的优先权权益，其以引用方式全文并入本文。

技术领域

本发明提供了包含三个可溶性TRAIL域和一个Fc片段的特定的TRAIL受体激动剂蛋白、编码所述TRAIL受体激动剂蛋白的核酸分子及其用途。所述TRAIL受体激动剂蛋白基本上是非聚集的并且适合治疗、诊断和/或研究应用。

背景技术

众所周知，TNF超家族(TNFSF)细胞因子的三聚化是有效的受体结合和活化所必需的。然而，难以从重组单体单元制备TNF超家族细胞因子的三聚体复合物。

WO 01/49866和WO 02/09055公开了重组融合蛋白，其包含TNF细胞因子和多聚化组分，特别是C1q蛋白质家族的蛋白质或胶原凝集素。然而，这些融合蛋白的缺点在于：三聚化域通常具有大的分子量并且/或者三聚化的效率很低。

Schneider 等人(J Exp Med 187 (1989), 1205-1213)描述了通过位于N-末端的稳定基序来稳定TNF细胞因子的三聚体。在CD95L中，受体结合域三聚体的稳定据推测是由位于细胞质膜附近的N-末端氨基酸域造成的。

Shiraishi 等人(Biochem Biophys Res Commun 322 (2004), 197-202)描述了CD95L的受体结合域可由位于N-末端的人工α-螺旋卷曲螺旋(亮氨酸拉链)基序稳定。然而，据发现，几乎无法预测多肽链彼此间的取向，例如平行或反平行取向。另外，难以确定卷曲螺旋拉链基序中七残基重复序列的最佳数量。另外，卷曲螺旋结构倾向于在pH和/或离子强度改变后形成大分子聚集体。

WO 01/25277涉及单链低聚多肽，其结合细胞受体的细胞外配体结合域，其中所述多肽包含至少三个受体结合位点，其中至少一个能够结合所述细胞受体的配体结合域并且至少一个不能有效结合所述细胞受体的配体结合域，从而所述单链低聚多肽能够结合所述受体但不能活化所述受体。例如，所述单体来源于TNF家族的细胞因子配体，特别是来自TNF-α。

WO 2005/103077公开了单链融合多肽，其包含TNF家族配体成员的至少三个单体和将所述TNF配体家族成员的单体彼此连接的至少两个肽接头。然而，最近的实验表明，这些单链融合多肽显示出不期望的聚集。

WO 2010/010051公开了单链融合多肽，其包含三个可溶性TNF家族细胞因子域和至少两个肽接头。所述融合多肽基本上是非聚集的。

此外，此前的研究，包括Papadopoulos 等人(Cancer Chemother Pharmacol,2015, DOI 10.1007/s00280-015-2712-0)在内，已经证实，TRAIL受体的超集群可以导致毒性。

因此，本领域需要新型的TRAIL受体激动剂，其具有高生物活性、高稳定性、低毒性并且允许有效的重组生产。

发明内容

本发明提供了特定的TRAIL受体激动剂蛋白，其在体内具有低蛋白水解降解、长半衰期和低TRAIL受体超集群（连同随之而来的毒性）。

本发明的TRAIL受体激动剂蛋白通常包含：(i) 第一可溶性TRAIL细胞因子域；(ii) 第一肽接头；(iii) 第二可溶性TRAIL域；(iv) 第二肽接头；(v) 第三可溶性TRAIL域；和 (vi) 抗体Fc片段。

在一个方面，本发明提供了单链融合多肽，其包含：(i) 第一可溶性TRAIL域，(ii)第一肽接头，(iii) 第二可溶性TRAIL域，(iv) 第二肽接头，(v) 第三可溶性TRAIL域，和(vi) 抗体Fc片段。在一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vi)位于所述第一TRAIL域(i)的N-末端以及/或者所述第三TRAIL域(v)的C-末端。在另一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vi)位于所述第三TRAIL域(v)的C-末端。在一个实施方案中，所述多肽基本上是非聚集的。在另一个实施方案中，所述第二和/或第三可溶性TRAIL域是任选地包含氨基酸序列突变的N-末端缩短的域。

在一个实施方案中，所述可溶性TRAIL域中的至少一个，特别是所述可溶性TRAIL域(iii)和(v)中的至少一个，是具有N-末端序列的可溶性TRAIL域，所述序列起始于人类TRAIL的氨基酸Gln120至Val122之间，并且其中Arg121可被中性氨基酸（例如，Ser或GIy）替换。在另一个实施方案中，所述可溶性TRAIL域中的至少一个，特别是所述可溶性TRAIL域(iii)和(v)中的至少一个，是具有N-末端序列的可溶性TRAIL域，所述序列选自(a) Arg121– Val122 – Ala123 和 (b) (Gly/Ser)121 – Val122 – Ala123。在一个实施方案中，所述可溶性TRAIL域终止于人类TRAIL的氨基酸Gly281，并且/或者任选地在以下位置包含突变：R130、G160、H168、R170、H177、Y189、R191 、Q193、E195、N199、K201、Y213、T214、S215、H264、I266、D267或D269或所述位置中的两处或更多处。在一个实施方案中，所述可溶性TRAIL域(i)由根据SEQ ID NO: 1的人类TRAIL的氨基酸Gln120 – Gly281组成，而所述可溶性TRAIL域(iii)和(v)由根据SEQ ID NO: 1的人类TRAIL的氨基酸Arg121 – Gly281组成。

在一个实施方案中，所述第一和第二肽接头(ii)和(iv)独立地具有3-8个氨基酸的长度，特别是3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度，并且优选地为甘氨酸/丝氨酸接头，任选地包含可被糖基化的天冬酰胺残基。在一个实施方案中，所述第一和第二肽接头(ii)和(iv)由根据SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，所述多肽另外包含例如SEQID NO: 12的N-末端信号肽域（其可包含蛋白酶裂解位点），并且/或者其另外包含C-末端元件（其可包含识别/纯化域（例如，根据SEQ ID NO: 13的Strep-标签）并且/或者与之相连）。

在一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vi)通过优选地SEQ ID NO: 11的铰链接头被融合至所述可溶性TRAIL域(i)和/或(v)。在另一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vi)由如SEQ ID NO: 10或17中所示的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述多肽包含SEQ IDNO: 14、15或18的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了包含多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述多肽含有SEQID NO: 19、20或21中所示的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了包含多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述多肽含有SEQID NO: 26、27、28、29或30中所示的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了包含两条多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述两条多肽含有SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两条多肽通过形成于各自多肽的半胱氨酸残基513、519和522之间的三个链间二硫键共价连接。

在一个实施方案中，所述多肽的位置168和337处的天冬酰胺残基中的一个或多个是N-糖基化的。在另一个实施方案中，所述多肽的位置168和337处的天冬酰胺残基均是N-糖基化的。

在另一个实施方案中，所述多肽还经过了翻译后修饰。在另一个实施方案中，所述翻译后修饰包括将N-末端谷氨酰胺修饰成焦谷氨酸。

在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文公开的TRAIL受体激动剂蛋白和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。

在另一方面，本发明提供了编码所述TRAIL受体激动剂蛋白的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供了包含所述核酸分子的表达载体。在另一个实施方案中，本发明提供了包含所述核酸分子的细胞。在另外的实施方案中，所述细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。在其它实施方案中，所述细胞选自：CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S和CHO-K1细胞。在其它实施方案中，所述细胞选自：Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0、CRL7030、HsS78Bst、PER.C6、SP2/0-Agl4和杂交瘤细胞。

在另一方面，本发明提供了治疗患有TRAIL相关疾病或障碍的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述TRAIL受体激动剂蛋白。在一个实施方案中，所述TRAIL受体激动剂蛋白单独施用。在另一个实施方案中，所述TRAIL受体激动剂蛋白在施用第二试剂之前、同时或之后施用。在另一个实施方案中，所述疾病或障碍选自：肿瘤、感染性疾病、炎症性疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病、退行性疾病、细胞凋亡相关疾病和移植排斥。在一个实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在一个实施方案中，所述肿瘤产生自以下癌症类别：肉瘤、食道癌和胃癌。在另一个实施方案中，所述肿瘤产生自尤因氏肉瘤或纤维肉瘤。在另一个实施方案中，所述肿瘤产生自以下癌症类别：非小细胞肺癌（NSCLC）、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部癌和小细胞肺癌（SCLC）。在另一个实施方案中，所述肿瘤是淋巴瘤。在一个实施方案中，所述肿瘤是血液肿瘤。在另一个实施方案中，所述肿瘤产生自：非霍奇金淋巴瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓系白血病（AML）、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性粒细胞白血病（CML）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）或毛细胞白血病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是类风湿疾病、关节炎疾病或类风湿和关节炎疾病。在另外的实施方案中，所述疾病或障碍是类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，所述退行性疾病是神经退行性疾病。在另外的实施方案中，所述神经退行性疾病是多发性硬化症。

在一个实施方案中，所述第二试剂是化学治疗剂、放射治疗剂或生物试剂。在一个实施方案中，所述第二试剂选自：Duvelisib、伊伯拉铁尼伯（Ibrutinib）、Navitoclax和Venetoclax。在另一个实施方案中，所述第二试剂是细胞凋亡剂。在一个实施方案中，所述细胞凋亡第二试剂选自：硼替佐米、阿扎胞苷、达沙替尼和吉非替尼。在具体的实施方案中，本文公开的药物组合物通过静脉内或皮下施用向患者施用。在其它实施方案中，所公开的药物组合物通过以下方式向患者施用：口服、肠胃外、肌内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、侧脑室内、结肠内、子宫颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜腔内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱、团注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或透皮施用。

在一个实施方案中，所述TRAIL受体激动剂蛋白以单次团注的方式施用。在另一个实施方案中，TRAIL受体激动剂蛋白可以若干个分剂量施用。所述TRAIL受体激动剂蛋白可以约0.1-100 mg/kg施用。在一个实施方案中，所述TRAIL受体激动剂蛋白可以下列剂量施用：约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-15、1-7.5、1.25-15、1.25-7.5、2.5-7.5、2.5-15、5-15、5-7.5,1-20、1-50、7-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75和10-100 mg/kg。在其它实施方案中，所述TRAIL受体激动剂蛋白以约0.1-100 mg/ml存在于药物组合物中。在一个实施方案中，所述TRAIL受体激动剂蛋白可以下列量存在于药物组合物中：约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-20、1-50、1-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100 mg/ml。在其它实施方案中，向个体施用治疗有效量的TRAIL受体激动剂蛋白。在另一个实施方案中，向个体施用预防有效量的TRAIL受体激动剂蛋白。

附图说明

图1 包含三个TRAIL域的单链融合多肽的域结构。I.、II.、III.可溶性TRAIL域。

图2 表示TRAIL的一般结构的示意图。

■ ■ ■ 细胞膜、位于细胞内的N-末端、

1. 受体结合域(RBD)的反平行β-折叠，

2. RBD与细胞膜的交界，

3. 蛋白酶裂解位点。

图3 表示天然TRAIL三聚体的结构的示意图。圆柱体结构表示RBD。N-末端连接RBD与细胞膜。

图4 表示包括TRAIL的受体结合域在内的三个可溶性域的结构的示意图。I.、II.、III.可溶性TRAIL域。

图5 包括TRAIL的RBD的可溶性域的三聚化，其特征在于所述三个可溶性域的N-末端和C-末端形成表面。

图6 表示包含全部或部分茎区的单链TRAIL的结构的示意图，其说明了需要更长的接头以补偿至下一个可溶性域的N-末端的距离。

图7 本领域已知的scFv-TRAIL融合蛋白。

图8 本领域已知的Fc-TRAIL融合蛋白。

图9A 包含额外的Fab抗体片段的单链融合多肽。

图9B 包含额外的scFv抗体片段的单链融合多肽。

图10 两条N-末端融合的scFc融合多肽通过二硫桥键二聚化。

图11 两条C-末端融合的scFc融合多肽通过二硫桥键二聚化。

图12 单链融合多肽通过接头二聚化。

图13 包含额外的Fab抗体片段的单链融合多肽进一步融合至第二融合多肽或scFv融合多肽。

图14 两条scFab融合多肽通过二硫桥键二聚化。

图15 还包含Fv和/或Fab抗体片段的N-末端融合的scFc融合多肽。

图16 还包含Fv和/或Fab抗体片段的C-末端融合的scFc融合多肽。

图17A 如所示具有N-末端信号肽域的示例性TRAIL受体激动剂蛋白示于SEQ IDNO: 14中。成熟的蛋白质（其不包含N-末端信号肽域）示于SEQ ID NO: 19中。

图17B 表示示例性TRAIL受体激动剂蛋白的整体结构和注释序列的示意图。

图18 用于对含有FC域的TRAIL受体激动剂进行定量的ELISA的测定设置。

图19 包含两条多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述两条多肽含有SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列，所述TRAIL受体激动剂蛋白体外诱导人类肿瘤细胞系的细胞死亡。将SKM-1、Colo205或Jurkat细胞用浓度渐增的TRAIL受体激动剂蛋白处理24小时并评估细胞活力。

图20(A-C) 包含两条多肽的TRAIL受体激动剂蛋白，所述两条多肽含有SEQ IDNO: 19所示的氨基酸序列，所述TRAIL受体激动剂蛋白与抗肿瘤发生剂具有体外协同作用。将SU-DHL-4细胞与浓度渐增的TRAIL受体激动剂蛋白在存在或不存在指示浓度的venetoclax（图20A）或navitoclax（图20B）的情况下温育24小时。或者，（图20C）将NCI-H596细胞用浓度渐增的TRAIL受体激动剂蛋白在存在或不存在指示浓度的多西紫杉醇(DTX)的情况下处理72小时。评估细胞活力并通过布里斯总和（Bliss sum）测定协同作用。

图21 包含两条多肽的TRAIL受体激动剂蛋白对Colo205直肠结肠癌移植瘤模型中肿瘤生长的影响，所述两条多肽含有SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列。

图22 包含两条多肽的TRAIL受体激动剂蛋白对SKM-1急性髓系白血病移植瘤模型中肿瘤生长的影响，所述两条多肽含有SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列。

图23 包含两条多肽的TRAIL受体激动剂蛋白对H460LM非小细胞肺癌移植瘤模型中肿瘤生长的影响，所述两条多肽含有SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列。

图24(A-G) 包含两条多肽的TRAIL受体激动剂蛋白对PDX模型中肿瘤生长的影响，所述两条多肽含有SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列。菱形，经TRAIL受体激动剂蛋白处理的；方形，未经处理的。示出了以下的肿瘤体积：(A) CTG-0069、(B) CTG-0167、(C) CTG-0293、(D) CTG-0785、(E) CTG-0714、(F) CTG-0136 和 (G) CTG-0485。

具体实施方式

根据本发明，据发现，将单链TRAIL受体结合域融合至Fc域得到六价的TRAIL受体激动剂，其具有高生物活性以及良好的稳定性。因此，提供了包含由两个肽接头连接的至少三个可溶性TRAIL域以及N-末端和/或C-末端的抗体Fc片段的单链融合多肽。

优选地，所述单链融合多肽是非聚集的。术语“非聚集的”指代制备物的单体含量≥ 50%，优选地≥ 70%并且更优选地≥ 90%。单体含量与聚集体含量的比率可以使用尺寸排阻层析法(SEC)通过检查聚集体形成的量来测定。涉及稳定性的聚集可在不同的保存条件下（例如，在4℃或25℃）在限定的时间（例如，从几天到若干天、若干周以及若干月）后通过SEC测定。对于所述融合蛋白，为了被归类为基本上非聚集的，优选在4℃或25℃保存若干天（例如，10天），更优选地若干周（例如，2、3或4周），并且最优选地若干月（例如，2或3个月）的时间后具有如上所定义的单体含量。

所述单链融合多肽可包含可位于其N-末端和/或C-末端的额外的域。额外的融合域的实例是例如N-末端信号肽域（其可包含蛋白酶裂解位点）或C-末端元件（其可包含和/或连接至识别/纯化域）。根据优选的实施方案，所述融合多肽在其C-末端包含经由接头融合的Strep-标签。示例性的包含短的丝氨酸接头的Strep-标签示于SEQ ID NO: 13中。

本发明的TRAIL受体激动剂蛋白包含来源于TRAIL的三个可溶性域。优选地，这些可溶性域来源于哺乳动物，特别是人类TRAIL，包括其等位变体和/或衍生物。所述可溶性域包含TRAIL的细胞外部分，包括受体结合域（不含位于膜上的域）。与TNF超家族的其它蛋白质一样，TRAIL经由15-30个氨基酸的N-末端部分（所谓的茎区）而被锚定在膜上。所述茎区有助于三聚化并在与细胞膜之间提供一定的距离。然而，所述茎区并非受体结合域（RBD）的一部分。

重要地是，RBD的特征在于其N-末端和C-末端氨基酸的具体定位。所述氨基酸紧邻并且位于三聚体的轴线的中心。RBD的第一N-末端氨基酸与RBD的C-末端氨基酸形成反平行β束（图2和3）。

因此，该RBD的反平行β束与细胞膜形成交界面，其经由茎区的氨基酸连接至并锚定于细胞膜内。高度优选的是，所述TRAIL受体激动剂蛋白的可溶性TRAIL域包含TRAIL的受体结合域（其不含来自茎区的任何氨基酸）（图4和5）。否则，将需要连接所述可溶性域之一的C-末端与下一个可溶性域的N-末端的长接头以补偿所述下一个可溶性域的N-末端茎区（图6），其可能导致不稳定性和/或形成聚集体。

此类可溶性域的另外的优点在于，RBD的N-末端和C-末端氨基酸对于任何抗-药物抗体而言都是不可及的。优选地，所述单链融合多肽能够形成有序的三聚体结构，其针对相应的TRAIL受体包含至少一个功能性结合位点。

所述TRAIL受体激动剂蛋白包含三个功能性TRAIL受体结合位点，即能够与TRAIL受体形成复合物的氨基酸序列。因此，所述可溶性域能够结合对应的TRAIL受体。在一个实施方案中，所述可溶性域中的至少一个能够活化受体，从而可能影响细胞凋亡和/或增殖活性。在另外的实施方案中，所述可溶性域中的一个或多个被选为不能够活化受体。

所述可溶性TRAIL域可来源于人类TRAIL，如SEQ ID NO: 1中所示。优选地，所述可溶性TRAIL域来源于人类TRAIL（具体地讲，起始于氨基酸120-122）并包含特别是SEQ IDNO: 1的氨基酸120-281、121-281或122-281。任选地，SEQ ID NO: 1的氨基酸Arg121可被不带电的氨基酸（例如Ser或Gly）替换。

表1：人类TRAIL蛋白的序列

如上所指出的，可溶性TRAIL域可包含如SEQ ID NO: 1中所指示的野生型序列。然而，应当注意的是，有可能在这些可溶性域中的一个或多个中引入突变，例如，改变（例如，增强或减弱）所述可溶性域的结合特性的突变。在一个实施方案中，可溶性域可被选为无法结合对应的细胞因子受体。

在本发明的另外的优选实施方案中，所述可溶性TRAIL域(i)包含TRAIL或其受体结合域的突变体，其结合并且/或者活化TRAIL受体1(TRAILR1)和/或TRAIL受体2(TRAILR2)。所述突变体的结合和/或活性可例如通过如van der Sloot 等人(PNAS, 2006,103:8634-8639)、Kelley 等人(J. Biol.Chem., 2005, 280:2205-2215) 或 MacFarlane等人(Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270)中所述的测定法进行测定。

所述突变体可通过技术人员已知的任何技术生成，例如，在van der Sloot 等人(PNAS, 2006, 103:8634-8639)、Kelley 等人(J. Biol.Chem., 2005, 280:2205-2215)或 MacFarlane 等人(Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270)中所述的技术，并且可包括任何类型的结构性突变，例如，氨基酸的置换、缺失、重复和/或插入。优选的实施方案是生成置换。所述置换可影响如本文所述的TRAIL或其受体结合域的至少一个氨基酸。在优选的实施方案中，所述置换可影响TRAIL例如人类TRAIL（例如，SEQ ID NO: 1)的至少一个氨基酸。在这一点上，优选的置换影响SEQ ID NO: 1的人类TRAIL的下列氨基酸中的至少一个：R130、G160、Y189、R191、Q193、E195、N199、K201、Y213、T214、S215、H264、1266、D267、D269。SEQ ID NO:1的人类TRAIL的优选的氨基酸置换是下列置换中的至少一者：R130E、G160M、Y189A、Y189Q、R191K、Q193S、Q193R、E195R、N199V、N199R、K201R、Y213W、T214R、S215D、H264R、I266L、D267Q、D269H、D269R或D269K。

所述氨基酸置换可影响TRAIL（例如，人类TRAIL）与TRAILR1或TRAILR2的结合和/或对其的活性。作为另外一种选择，所述氨基酸置换可影响TRAIL（例如，人类TRAIL）与TRAILR1和TRAILR2二者的结合和/或对其的活性。可正面影响TRAILR1和/或TRAILR2的结合和/或活性，即，更强、更有选择性或更特异性结合和/或使受体更加活化。作为另外一种选择，可负面影响TRAILR1和/或TRAILR2的结合和/或活性，即，更弱、不太有选择性或不太特异性结合和/或不太活化或不活化受体。

本发明的具有氨基酸置换的TRAIL的突变体（其影响TRAILR1和TRAILR2二者的结合和/或活化）的实例可见于例如MacFarlane 等人的表1中（参见上文）并且可包括这样的人类TRAIL突变体，其具有SEQ ID NO: 1的以下两个氨基酸置换：Y213W和S215D，或具有以下单个氨基酸置换：Y189A。

本发明的具有氨基酸置换的TRAIL的突变体（其影响TRAILR1的结合和/或活化）的实例可见于例如MacFarlane 等人的表1中（参见上文）并且可包括这样的人类TRAIL突变体，其具有SEQ ID NO: 1的以下四个氨基酸置换：N199V、K201R、Y213W和S215D，或具有以下五个氨基酸置换：Q193S、N199V、K201R、Y213W和S215D，或可见于Kelley 等人的表2中（参见上文）并且可包括这样的人类TRAIL突变体，其具有以下六个氨基酸置换：Y213W、S215D、Y189A、Q193S、N199V和K201R，或具有Y213W、S215D、Y189A、Q193S、N199R和K201R。

本发明的具有氨基酸置换的TRAIL的突变体（其影响TRAILR2的结合和/或活化）的实例可见于例如MacFarlane 等人的表1中（参见上文）或 Kelley 等人的表2中（参见上文）并且可包括这样的人类TRAIL突变体，其具有SEQ ID NO: 1的以下六个氨基酸置换：Y189Q、R191K、Q193R、H264R、I266L和D267Q，或可见于van der Sloot 等人的表2中（参见上文）并且可包括这样的人类TRAIL突变体，其具有以下单个氨基酸置换：D269H，或具有以下两个氨基酸置换：D269H和E195R，或D269H和T214R。

因此，一个优选的实施方案是如本文所述的TRAIL受体激动剂蛋白，其中至少一个可溶性域包含TRAIL或其受体结合域的突变体，其结合并且/或者活化TRAILR1和/或TRAILR2。

TRAIL的突变体（其显示出减少的TRAIL诱导的受体聚集）的另外的实例是H168(S、T、Q)、R170(E、S、T、Q)和H177(S、T)。

包含如本文所述的TRAIL或其受体结合域的突变体的TRAIL受体激动剂蛋白的一个优选的实施方案是这样的TRAIL受体激动剂蛋白，其中组分(i)包含至少一个氨基酸置换，特别是如下文所指出的。

此类氨基酸置换影响人类TRAIL（SEQ ID NO: 1）的下列氨基酸位置中的至少一个：R130、G160、H168、R170、H177、Y189、R191、Q193、E195、N199、K201、Y213、T214、S215、H264、1266、D267、D269。

此类氨基酸置换是下列中的至少一者：R13OE、G16OM、H168(S、T、Q)、R170(E、S、T、Q)、H177(SJ)1 Y189A、Y189Q、R191K、Q193S、Q193R、E195R、N199V、N199R、K201R、Y213W、T214R、S215D、H264R、I266L、D267Q、D269H、D269R或D269K。

优选的TRAIL-R2选择域包含氨基酸置换Y189Q、R191K、Q193R、H264R、I266L和D267Q。

优选的TRAIL-R1选择域包含氨基酸置换Y189A、Q193S、N199V、K201R、Y213W和S215D。

本发明的单链融合分子包含三个可溶性TRAIL域，即组分(i)、(iii)和(v)。如果所述第二和/或第三可溶性TRAIL域是任选地包含氨基酸序列突变的N-末端缩短的域，则单链TRAIL融合多肽抗聚集的稳定性得以增强。因此，优选地，所述第二和第三可溶性TRAIL域均为任选地在N-末端区（优选地在所述可溶性TRAIL域的N-末端的头五个氨基酸内）包含氨基酸序列突变的N-末端缩短的域。这些突变可包括用中性氨基酸（特别是丝氨酸或甘氨酸）替换带电的（例如酸性或碱性）氨基酸。

与之相比，对第一可溶性TRAIL域的选择则不那么关键。在此，可使用具有全长N-末端序列的可溶性域。然而，应当注意的是，所述第一可溶性TRAIL域也可具有N-末端缩短并任选地突变的序列。

在本发明的另外的优选实施方案中，所述可溶性TRAIL域(i)、(iii)和(v)是可溶性人类TRAIL域。所述第一可溶性TRAIL域(i)可选自天然的、缩短的和/或突变的序列。因此，所述第一可溶性TRAIL域(i)具有N-末端序列，其可起始于人类TRAIL的氨基酸GIu116和Val122之间，并且其中Arg121可被中性氨基酸例如被Ser或GIy替换。所述第二和第三可溶性TRAIL域(iii)和(v)具有缩短的N-末端序列，其优选地起始于人类TRAIL的氨基酸Gln120和Val122之间，并且其中Arg121可被另一个氨基酸例如Ser或GIy替换。

优选地，所述可溶性TRAIL域(iii)和(v)的N-末端序列选自：

(a) Arg121 - Val122 - Ala123 和

(b) (Gly/Ser) 121。

所述可溶性TRAIL域优选地以人类TRAIL的氨基酸Gly281结束。在某些实施方案中，所述TRAIL域可包含如上所述的内部突变。

所述TRAIL受体激动剂蛋白的组分(ii)和(iv)是分别位于组分(i)和(iii)或(iii)和(v)之间的肽接头元件。所述柔性接头元件长3-8个氨基酸，具体地讲长3、4、5、6、7或8个氨基酸。所述接头元件优选为甘氨酸/丝氨酸接头，即基本上由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成的肽接头。在其中可溶性细胞因子域终止于S或G（C-末端），例如人类TRAIL的情况下，所述接头在S或G之后起始。在其中可溶性细胞因子域起始于S或G（N-末端）的情况下，所述接头在该S或G之前结束。

应当注意的是，接头(ii)和接头(iv)不需要具有相同的长度。为了降低可能的免疫原性，可优选地使用更短的接头。另外，结果表明，更短的接头导致具有减弱的形成聚集体的趋势的单链分子。而大大长于本文公开的那些的接头可具有不利的聚集特性。

如果需要，接头可包含天冬酰胺残基，其可形成糖基化位点Asn-Xaa-Ser。在某些实施方案中，所述接头之一例如接头(ii)或接头(iv)包含糖基化位点。在其它实施方案中，两个接头(iv)均包含糖基化位点。为了提高所述sc TRAIL蛋白的可溶性和/或为了降低可能的免疫原性，可优选地接头(ii)或接头(iv)或二者均包含糖基化位点。

优选的接头序列选自：GSGSGSGS (SEQ ID NO: 3)、GSGSGNGS (SEQ ID NO: 2)、GGSGSGSG (SEQ ID N0: 4)、GGSGSG (SEQ ID NO: 5)、GGSG (SEQ ID NO: 6)、GGSGNGSG(SEQ ID NO: 7)、GGNGSGSG (SEQ ID NO: 8)、GGNGSG (SEQ ID NO: 9) 和 GSGS (SEQ IDNO: 23)。

根据最优选的实施方案，所述接头序列的每一者均为根据SEQ ID NO: 2的GSGSGNGS。示例性接头序列示于表2中。

表2：示例性接头序列

所述TRAIL受体激动剂蛋白另外包含抗体Fc片段域，其可位于所述第一TRAIL域(i)的N-末端以及/或者所述第三TRAIL域(v)的C-末端。优选地，所述抗体Fc片段域包含如SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列或由其组成。作为另外一种选择，所述Fc片段域包含如SEQ ID NO: 17中所示的氨基酸序列或由其组成。示例性Fc片段域示于表3中。

表3：示例性Fc片段域

糖基化位点的总数和糖类各自的三维位置影响TRAIL受体激动剂蛋白的体内稳定性。另外，糖类识别取决于末端糖类的局部密度、糖树的支化和糖类物质的相对位置。

有必要耗尽CH2-域糖类以避免基于Fc受体的体内交联和可能的基于TRAIL受体超集群的毒性。另外，部分降解的糖类通过凝集素驱动的机制缩短TRAIL受体激动剂蛋白的体内半衰期。通过减少分子上糖基化位点的总数，所得化合物对于这些机制而言是不太可及的，延长了半衰期。因此，在一个实施方案中，本发明的TRAIL受体激动剂蛋白上的糖基化位点的总数通过耗尽CH2糖基化位点而减少，得到包含N297S等效突变（根据EU编号系统）而产生无糖基化-CH2域的TRAIL受体激动剂蛋白。

存在于内表面区域上的CH2-糖基化位点在“开放式Fc构象过渡”期间（其中铰链-链间二硫键被还原而共价链间键合被破坏）通常保护亚域免受蛋白酶损害。这允许CH2解离并将内表面区域暴露于蛋白酶。

因此，相比具有野生型CH2糖基化的等同结构，包含N297S等效突变（根据EU编号系统）而产生无糖基化-CH2的TRAIL受体激动剂蛋白很可能不够蛋白水解稳定。这将影响化合物在USP/DSP/保存期间的稳定性，其中存在宿主细胞蛋白酶并对结构具有长期接触。因此，在某些实施方案中，所述TRAIL受体激动剂缺少CH2糖基化位点，但在每条多肽链的接头序列中包含糖基化位点(例如，根据SEQ ID NO: 2的GSGSGNGS)。在某些示例性实施方案中，对于总共四个糖基化位点，所述TRAIL受体激动剂包含两个糖基化位点/多肽链。

根据本发明的优选的实施方案，所述抗体Fc片段域经由铰链-接头元件融合。所述铰链-接头元件长10-30个氨基酸，具体地讲长15-25个氨基酸，例如22个氨基酸。所述铰链-接头元件优选地包含免疫球蛋白的铰链区序列，本文中被称为“Ig铰链区”。术语“Ig铰链区”意指包含与天然存在的Ig铰链区序列（其包含半胱氨酸残基，在该处二硫键连接所述免疫球蛋白的两条重链）具有序列同一性或相似性的氨基酸序列的任何多肽。

所述铰链区的衍生物和类似物可以通过突变获得。本文中所述的衍生物或类似物是包含与野生型（或天然存在的蛋白质）的全长序列具有序列同一性或相似性的氨基酸序列的多肽，不同的是，其具有可归属于缺失、插入和/或置换的一个或多个氨基酸序列差异。然而，根据本发明，术语“铰链-接头”不限于那些包含Ig铰链区或其衍生物的接头，还包括任何这样的接头，其足够长以允许通过铰链-接头元件附接域以得到具有生物活性的构象。

在单个TRAIL受体激动剂蛋白中具有开放式Fc构象的分子的数量取决于铰链区中存在的链间二硫键的数量。因此，在一个实施方案中，向本发明的TRAIL受体激动剂蛋白的铰链区中引入第三个半胱氨酸，以改善耗尽CH2糖基化位点的效果。

另外，本发明的TRAIL受体激动剂蛋白另外包含将上铰链赖氨酸突变为甘氨酸以减少在该位点的蛋白水解加工。

特别优选的铰链-接头元件包含如SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列或由其组成（表4）。

所述TRAIL受体激动剂蛋白可另外包含N-末端信号肽域，其允许在合适的宿主细胞中加工，例如细胞外分泌。优选地，所述N-末端信号肽域包含蛋白酶裂解位点，例如信号肽酶裂解位点，并因而可在表达后或表达期间被移除以获得成熟的蛋白质。特别优选的N-末端信号肽域包含如SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列（表4）。

另外，所述TRAIL受体激动剂蛋白可另外包含长例如1-50，优选10-30个氨基酸的C-末端元件，其可包含或连接至识别/纯化域，例如FLAG域、Strep-标签或Strep-标签II域和/或多His域。根据特别优选的实施方案，所述融合多肽包含经由如SEQ ID NO: 13中所示的短的丝氨酸接头融合至C-末端的Strep-标签（表4）。

示例性铰链-接头元件、N-末端信号肽域和短的丝氨酸接头示于表4中。

表4：示例性域和接头

根据本发明的特别优选的实施方案，所述融合多肽包含通过SEQ ID NO: 2的肽接头元件融合的三个可溶性TRAIL域。所述第一可溶性TRAIL域(i)由根据SEQ ID NO: 1的人类TRAIL的氨基酸120-281组成，而所述可溶性TRAIL域(iii)和(v)由根据SEQ ID NO: 1的人类TRAIL的氨基酸121-281组成。另外，所述融合多肽包含根据SEQ ID NO: 10的抗体Fc片段域，其经由根据SEQ ID NO: 11的铰链-接头融合至所述可溶性TRAIL域(v)的C-末端。本发明人惊讶地发现，此特定的融合多肽提供了改善的生物活性并且特别稳定。本发明的TRAIL受体激动剂蛋白的示例性实施方案的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 19中。

另外，所述融合多肽可包含例如根据SEQ ID NO: 12的N-末端信号肽域。本发明的TRAIL受体激动剂蛋白的特定实例示于SEQ ID NO: 14中。

根据另一个优选的实施方案，所述融合多肽可另外包含C-末端Strep-标签，其经由如SEQ ID NO: 13中所示的短的丝氨酸接头融合至本发明的多肽。根据本发明的这个方面，所述Fc片段优选地由如SEQ ID NO: 10或17中所示的氨基酸序列组成。另外，所述Fc片段可由更短的Fc片段组成，例如包含SEQ ID NO: 10的氨基酸1-217。包含C-末端Strep-标签的融合多肽的特别优选的实例示于SEQ ID NO: 15和18中。

如SEQ ID NO: 14、15和18中所示的示例性TRAIL受体激动剂蛋白各自包含N-末端信号肽域。所述信号肽域包含氨基酸1-20。在每种情况下，成熟的蛋白质起始于氨基酸21。本发明的成熟的示例性TRAIL受体激动剂蛋白示于SEQ ID NO: 19、20、21、26、27、28、29和30中。上述示例性TRAIL受体激动剂蛋白示于表5中。

如SEQ ID NO: 19中所示的TRAIL受体激动剂具有减少的糖基化位点总数（CH2区中的N297S突变提供了无糖基化的CH2域）、增加的铰链区中的链间二硫键数量以及上铰链赖氨酸被突变为甘氨酸。这些改变在延长分子的半衰期的同时，减少了可能的降解和TRAIL受体超集群（连同随之而来的毒性）。在一些实施方案中，N-末端谷氨酰胺被修饰成焦谷氨酸（Liu 等人2011, J. Biol.Chem.286:11211-11217）。

表5：示例性TRAIL受体激动剂蛋白

本发明的另外的方面涉及编码如本文所述的TRAIL受体激动剂蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA分子（例如双链或单链DNA分子）或RNA分子。所述核酸分子可编码TRAIL受体激动剂蛋白或其前体，例如所述TRAIL受体激动剂蛋白的原形式或前原形式，其可包含用于分泌或纯化的信号序列或其它异源氨基酸部分，所述信号序列或其它异源氨基酸部分优选地位于所述TRAIL受体激动剂蛋白的N-末端和/或C-末端。所述异源氨基酸部分可经由蛋白酶裂解位点（例如X3因子、凝血酶或IgA蛋白酶裂解位点）而被连接至第一和/或第二域。本发明的核酸序列的特定实例以SEQ ID NO: 16示于表6中。此核酸分子编码SEQID NO: 14的融合多肽。

表6：示例性TRAIL受体激动剂蛋白的核酸序列

所述核酸分子可被操作性地连接至表达控制序列，例如允许在期望的宿主细胞中表达所述核酸分子的表达控制序列。所述核酸分子可位于载体（例如质粒、细菌噬菌体、病毒载体、染色体整合载体等）上。合适的表达控制序列和载体的实例在例如Sambrook 等人(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 以及Ausubel 等人(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons或其更新的版本中有述。

各种表达载体/宿主细胞系统可被用于表达编码本发明的TRAIL受体激动剂蛋白的核酸序列。合适的宿主细胞包括但不限于：原核细胞如细菌，例如大肠杆菌；真核宿主细胞如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞，优选哺乳动物细胞并且更优选人类细胞。另外，本发明涉及用如上所述的核酸分子转化或转染的非人生物体。此类转基因生物体可通过已知的基因转移方法（包括同源重组）生成。

本发明的另外的方面涉及包含以下物质作为活性剂的药物或诊断组合物：所有如本文所述的至少一种TRAIL受体激动剂蛋白、其相应的编码核酸、或经转化或转染的细胞。

如本文中所用的术语“TRAIL相关疾病或障碍”是可通过添加TRAIL受体激动剂而改善的任何疾病或障碍。所有如本文所述的至少一种TRAIL受体激动剂蛋白、其相应的编码核酸、或经转化或转染的细胞可被用在疗法中，例如，用于预防和/或治疗由TRAIL功能障碍引起的、与之相关和/或与之相伴的疾病，特别是增生性疾病，如肿瘤，例如实体瘤或淋巴瘤；感染性疾病；炎症性疾病；代谢性疾病；自身免疫性疾病，例如类风湿疾病和/或关节炎疾病；退行性疾病，例如神经退行性疾病如多发性硬化症；细胞凋亡相关疾病或移植排斥。

如本文中所用的术语“TRAIL功能障碍”应当理解为偏离正常的TRAIL功能或表达的任何TRAIL功能或表达，例如，相比正常的TRAIL生理表达水平，TRAIL基因或蛋白质的过表达、TRAIL基因或蛋白质的表达降低或消除；相比正常的TRAIL生理活性或结合，TRAIL活性升高、TRAIL活性降低或消除、TRAIL与任何结合伴侣（例如，与受体，特别是TRAIL受体或另一种细胞因子分子）的结合增加、与任何结合伴侣（例如，与受体，特别是TRAIL受体或另一种细胞因子分子）的结合减少或消除。

在各种实施方案中，提供了用于诊断和/或治疗患有可以通过靶向TRAIL受体来诊断和/或治疗的疾病的人类个体的方法，包括向所述人类个体施用本文公开的TRAIL受体激动剂蛋白，使得对所述人类个体中的靶标或多个靶标的活性的效果是激动性的、一种或多种症状得到缓解和/或实现了治疗目的。本文提供的TRAIL受体激动剂蛋白可以被用于诊断和/或治疗患有原发性或转移性癌症的人类，包括乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌（例如，小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”）、口咽癌、喉咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌和胆管癌、小肠癌、泌尿道癌（包括肾、膀胱和尿道上皮）、女性生殖道癌（包括宫颈、子宫、卵巢以及绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病）、男性生殖道癌（包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤）、内分泌腺癌（包括甲状腺、肾上腺和脑垂体）和皮肤癌以及血管瘤、黑色素瘤、肉瘤（包括来自于骨与软组织的那些以及卡波西肉瘤）、脑肿瘤、神经肿瘤、眼肿瘤和脑膜肿瘤（包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、神经鞘瘤和脑膜瘤）、来自于以下的肿瘤：造血系统恶性肿瘤、急性白血病、急性淋巴细胞白血病（ALL）和急性髓系白血病（AML）、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性粒细胞白血病（CML）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、毛细胞白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、DLBCL、滤泡性淋巴瘤、造血系统恶性肿瘤、卡波西肉瘤、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增生症、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤、副肿瘤综合征/恶性高钙血症或实体肿瘤。

提供了包含本文公开的TRAIL受体激动剂蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含用于治疗疾病的至少一种额外的治疗剂。例如，所述额外的试剂可以是治疗剂、化学治疗剂；显像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂（包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂）、共刺激分子调节剂或免疫检查点抑制剂（包括但不限于抗-B7.1、抗-B7.2、抗-B7.3、抗-B7.4、抗-CD28、抗-B7RP1、CTLA4-Ig、抗-CTLA-4、抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-PD-L2、抗-ICOS、抗-LAG-3、抗-Tim3、抗-VISTA、抗-HVEM、抗-BTLA、LIGHT融合蛋白、抗-CD137、抗-CD137L、抗-OX40、抗-OX40L、抗-CD70、抗-CD27、抗-GAL9、抗-A2AR、抗-KIR、抗-IDO-1、抗-CD20）、树突细胞/抗原呈递细胞调节剂（包括但不限于抗-CD40抗体、抗-CD40 L、抗-DC-SIGN、抗-Dectin-1、抗-CD301、抗-CD303、抗-CD123、抗-CD207、抗-DNGR1、抗-CD205、抗-DCIR、抗-CD206、抗-ILT7)、Toll样受体调节剂（包括但不限于抗-TLR-1、抗-TLR-2、抗-TLR-3、抗-TLR-4、抗-TLR-4、抗-TLR-5、抗-TLR-6、抗-TLR-7、抗-TLR-8、抗-TLR-9)、粘附分子阻断剂（包括但不限于抗-LFA-1抗体、抗-E/L选择素抗体、小分子抑制剂）、抗-细胞因子抗体或其功能性片段（包括但不限于抗-IL-18、抗-TNF或抗-IL-6/细胞因子受体抗体）、双特异性重定向T细胞或NK细胞细胞毒性剂（包括但不限于BiTE®）、基于嵌合T细胞受体(CAR-T)的疗法、基于T细胞受体(TCR)的疗法、治疗性癌症疫苗、甲氨蝶呤、环孢素、雷帕霉素、FK506、可检测标记物或报道分子、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、镇定剂、非甾体类抗炎药（NSAID）、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗银屑病剂、糖皮质激素、合成代谢类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁剂、精神抑制剂、兴奋剂、平喘药、β激动剂、吸入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。

在本文所述的实施方案、治疗癌症的方法或肿瘤转移的预防或抑制中，所述TRAIL受体激动剂蛋白可以单独使用或与一种或多种额外的试剂（例如，化学治疗剂、放射疗法或生物试剂）组合使用。在一些实施方案中，所述试剂可以包括以下：13-顺-视黄酸；2-CdA；2-氯脱氧腺苷；5-阿扎胞苷；5-氟尿嘧啶；5-FU；6-巯基嘌呤；6-MP；6-TG；6-硫鸟嘌呤；紫杉醇纳米制剂(Abraxane)；Accutane®；放线菌素-D；Adriamycin®；Adrucil®；Afinitor®；Agrylin®；Ala-Cort®；阿地白介素；阿仑单抗；ALIMTA；阿利维A酸；Alkaban-AQ®；Alkeran®；全反式视黄酸；α干扰素；六甲蜜胺；氨甲喋呤；氨磷汀；氨鲁米特；阿那格雷；Anandron®；阿那曲唑；阿糖胞苷；Ara-C Aranesp®；Aredia®；Arimidex®；Aromasin®；Arranon®；三氧化二砷；Arzerra™；天冬酰胺酶；ATRA；Avastin®；氮杂胞苷；BCG；BCNU；苯达莫司汀；贝伐单抗；贝沙罗汀；BEXXAR®；比卡鲁胺；BiCNU；Blenoxane®；博莱霉素；硼替佐米；白消安；Busulfex®；C225；亚叶酸钙；Campath®；Camptosar®；喜树碱-11；Capecitabine Carac™；卡波铂；卡氮芥；卡莫司汀片；Casodex®；CC-5013；CCI-779；CCNU；CDDP；CeeNU；Cerubidine®；西妥昔单抗；苯丁酸氮芥；顺铂；柠胶因子；克拉屈滨；可的松；Cosmegen®；CPT-11；环磷酰胺；Cytadren®；阿糖胞苷；脂质体阿糖胞苷；Cytosar-U®；Cytoxan®；氮烯咪胺；达克金；更生霉素；阿法达贝泊汀；达沙替尼；柔红霉素；柔红霉素；盐酸柔红霉素；脂质体柔红霉素；DaunoXome®；地卡特隆；地西他滨；Delta-Cortef®；Deltasone®；地尼白介素；Diftitox；DepoCyt™；地塞米松；醋酸地塞米松；地塞米松磷酸钠；Dexasone；右丙亚胺；DHAD；DIC；Diodex；多西他赛；Doxil®；多柔比星；脂质体多柔比星；Droxia™；DTIC；DTIC-Dome®；Duralone®；Duvelisib；Efudex®；Eligard™；Ellence™；Eloxatin™；Elspar®；Emcyt®；表柔比星；阿法依泊汀；爱必妥；埃罗替尼；欧文氏菌L-天冬酰胺酶；雌莫司汀；Ethyol Etopophos®；依托泊苷；磷酸依托泊苷；Eulexin®；依维莫司；Evista®；依西美坦；Fareston®；Faslodex®；Femara®；非格司亭；氟尿苷；Fludara®；氟达拉滨；Fluoroplex®；氟尿嘧啶；氟尿嘧啶(霜剂)；氟羟甲睾酮；氟他胺；亚叶酸；FUDR®；氟维司群；吉非替尼；吉西他滨；吉妥珠单抗奥唑米星；健择；Gleevec™；Gliadel®片；GM-CSF；戈舍瑞林；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-MCSF)；Halotestin®；Herceptin®；地塞米松；Hexalen®；六甲基嘧胺；HMM；Hycamtin®；Hydrea®；Hydrocort Acetate®；氢化可的松；氢化可的松磷酸钠；氢化可的松琥珀酸钠；磷酸氢化可的松；羟基脲；Ibrutinib；替伊莫单抗；Ibritumomab Tiuxetan；Idamycin®；Idarubicin Ifex®；干扰素-α；干扰素-α-2b(PEG结合物)；异环磷酰胺；白介素-11(IL-11)；白介素-2(IL-2)；甲磺酸伊马替尼；咪唑甲酰胺；Intron A®；普利姆玛、 Iressa®；伊立替康；异维甲酸；伊沙匹隆；Ixempra™；KADCYCLA®；Kidrolase (t) Lanacort®；拉帕替尼；L-天冬酰胺酶；LCR；来那度胺；来曲唑；醛氢叶酸；瘤可宁；Leukine™；亮丙瑞林；长春新碱；Leustatin™；Lirilumab；脂质体Ara-C；Liquid Pred®；洛莫司汀；L-PAM；L-溶肉瘤素；Lupron®；Lupron Depot®；Matulane®；目滴舒；氮芥；盐酸氮芥；Medralone®；Medrol®；Megace®；甲地孕酮；醋酸甲地孕酮；MEK抑制剂；马法兰；巯基嘌呤；美司钠；Mesnex™；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；甲基强的松龙；Meticorten®；丝裂霉素；丝裂霉素-C；Mitoxantrone M-Prednisol®；MTC；MTX；Mustargen®；氮芥；Mutamycin®；Myleran®；Mylocel™；Mylotarg®；Navitoclax；Navelbine®；奈拉滨；Neosar®；Neulasta™；Neumega®；Neupogen®；Nexavar®；Nilandron®；尼洛替尼；尼鲁米特；Nipent®；Nitrogen Mustard Novaldex®；Nivolumab；Novantrone®；Nplate；奥曲肽；醋酸奥曲肽；奥法木单抗；Oncospar®；Oncovin®；Ontak®；Onxal™；奥普瑞白介素；Orapred®；Orasone®；奥沙利铂；紫杉醇；蛋白结合型紫杉醇；帕米膦酸二钠；帕尼单抗；Panretin®；Paraplatin®；帕唑帕尼；Pediapred®；PEG干扰素；培门冬酶；聚乙二醇非格司亭；PEG-INTRON™；PEG-L-天冬酰胺酶；PEMETREXED；Pembrolizumab；喷司他丁；帕妥珠单抗；苯丙氨酸氮芥；Pidilizumab；Platinol®；Platinol-AQ®；泼尼松龙；泼尼松；Prelone®；甲基苄肼；PROCRIT®；Proleukin®；Prolifeprospan 20连同卡莫司汀植入；Purinethol®；BRAF抑制剂；雷洛昔芬；Revlimid®；Rheumatrex®；Rituxan®；利妥昔单抗 ；Roferon-A®；罗米司亭；Rubex®；盐酸红比霉素；Sandostatin®；Sandostatin LAR®；沙格司亭；Solu-Cortef®；Solu-Medrol®；索拉非尼；SPRYCEL™；STI-571；STIVAGRA™、链佐星；SU11248；舒尼替尼；Sutent®；它莫西芬；Tarceva®；Targretin®；Tasigna®；Taxol®；Taxotere®；Temodar®；替莫唑胺；替西罗莫司；替尼泊苷；TESPA；沙利度胺；Thalomid®；TheraCys®；硫鸟嘌呤；ThioguanineTabloid®；硫代磷酰胺；Thioplex®；塞替派；TICE®；Toposar®；拓扑替康；托瑞米芬；Torisel®；托西莫单抗；曲妥单抗；Treanda®；曲美目单抗；维甲酸；Trexall™；Trisenox®；TSPA；TYKERB®；Urelumab；VCR；Vectibix™；Velban®；Velcade®；Venetoclax；VePesid®；Vesanoid®；Viadur™；Vidaza®；长春碱；硫酸长春碱；Vincasar Pfs®；长春新碱；长春瑞滨；酒石酸长春瑞滨；VLB；VM-26；伏立诺他；帕唑帕尼；VP-16；Vumon®；Xeloda®；Zanosar®；Zevalin™；Zinecard®；Zoladex®；唑来膦酸；伏立诺他；或Zometa®，和/或靶向类似途径而未在此具体列出的任何其它试剂。

当两种或更多种物质或原理被用作组合治疗方案的一部分时，其可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径、在基本上相同的时间或在不同的时间（例如基本上同时、连续或根据交替的方案）施用。当所述物质或原理通过相同施用途径被同时施用时，其可作为不同的药物制剂或组合物或组合药物制剂或组合物的一部分施用，正如对于技术人员将是清楚的。

同样，当两种或更多种活性物质或原理被用作组合治疗方案的一部分时，所述物质或原理中的每一者可以相同量并根据如当所述化合物或原理被单独使用时所用的相同方案施用，并且此类组合使用可能或可能不导致协同增强效应。然而，当所述两种或更多种活性物质或原理的组合使用导致协同增强效应时，也有可能减少一种、不止一种或全部所述物质或原理的施用量，同时仍然实现所需的治疗作用。这可例如用于避免、限制或减少与一种或多种所述物质或原理的使用（当其以其惯常量使用时）相关的任何不期望的副作用，同时仍然获得所需的药物或治疗效果。

根据本发明所用的治疗方案的有效性可以用于所涉及的疾病或障碍的任何本身已知的方式测定和/或随访，正如对于临床医生将是清楚的。临床医生将还能够（在适当情况下并在个案基础上）改变或修改具体的治疗方案，以便达到所需的治疗效果，以避免、限制或减少不期望的副作用，并且/或者以在一方面达到所需的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不期望的副作用之间实现适当的平衡。

一般来讲，将遵循所述治疗方案直至达到所需的治疗效果并且/或者在维持所需治疗效果期间一直保持。这同样可以由临床医生决定。

在各种实施方案中，本文提供了包含一种或多种TRAIL受体激动剂蛋白（单独地或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合）的药物组合物。在各种实施方案中，本文公开的药物组合物的用途的非限制性实例包括：诊断、检测和/或监测疾病；预防、治疗、管理和/或改善疾病或其一种或多种症状；以及/或者用于研究。药物组合物（单独地或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合）的制剂是本领域技术人员已知的（美国专利公布号20090311253 A1）。

在各种实施方案中，药物制剂可以包含一种或多种氨基酸、一种或多种多糖和/或聚山梨醇酯以及以约0.1至100 mg/ml之间（包括端点）的浓度（例如，0.1-10、1-10、.01-50、1-50、1-100、10-100、25-100、25-50或50-100 mg/ml）存在的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述制剂的pH在约5.0至7.0之间（包括端点）（例如，约5.0-6.0、5.5-6.0、5.0-6.5、5.5-6.5或6.0-7.0的pH）。在实施方案中，所述制剂中的至少一种氨基酸是组氨酸并以约10-20 mM、10-15mM、15-20mM或约15mM的浓度存在。在实施方案中，所述制剂中的至少一种多糖是蔗糖并以约0-8.0% 重量/体积 (w/v)的浓度存在。在实施方案中，所述制剂中的聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80并以约0-0.06% w/v的浓度存在。在实施方案中，所述制剂中的至少一种氨基酸是精氨酸并以约0-1.5% w/v (例如，0.5-1.5、1.0-1.5或0.5-1.0 w/v)的浓度存在。在实施方案中，所述TRAIL受体激动剂蛋白以下列浓度存在于所述制剂中：约0.1-100 mg/ml（例如，约1-100 mg/ml、或约1-15 mg/ml、或约1-7.5 mg/ml、或约2.5-7.5 mg/ml、或约5-7.5mg/ml、或约25-100 mg/ml、或约20-60 mg/ml、或约25-50 mg/ml、或约25 mg/ml、或约50mg/ml、或约0.1-60 mg/ml、或约0.1-25 mg/ml、或约1.0-60 mg/ml、或约0.5-60 mg/ml、或约0.1-2.0 mg/ml、或约0.5-2.0 mg/ml、或约1-5 mg/ml、或约1-7.5 mg/ml、或约1-15 mg/ml、或约0.5 mg/ml、或约1.0 mg/ml）。

如本文中所用，短语“有效量”意指这样的TRAIL激动剂蛋白的量，其导致与TRAIL功能障碍或与TRAIL相关疾病或障碍有关的一项或多项参数得到可检测的改善（例如，相对于基线至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或以上）。

在各种实施方案中，所述药物制剂是含水制剂、冻干制剂或冻干并再水化的制剂。在实施方案中，水化溶液是葡萄糖和/或盐水（例如，浓度约5% w/v的葡萄糖和/或浓度约0.9% w/v的盐水）。在实施方案中，所述药物制剂包含约15 mM 组氨酸、约0.03% (w/v) 聚山梨醇酯80、约4% (w/v) 蔗糖和约0.1-25 mg/ml的TRAIL受体激动剂蛋白或约1-15 mg/ml的TRAIL受体激动剂蛋白，并且pH为约6。在实施方案中，所述制剂还包含至少一种额外的试剂。

在各种实施方案中，所使用的制剂含有约25 mg/ml TRAIL受体激动剂蛋白、约15mM 组氨酸、0.03% 聚山梨醇酯80 (重量/体积, w/v)、4.0% 蔗糖 (w/v)，并且pH为约6.0。在一些实施方案中，所述制剂不包含精氨酸。在一些实施方案中，相比于包含其它组分或浓度的其它制剂，所述制剂具有意料之外的改善的冻融稳定性、液体制剂稳定性和/或冻干制剂稳定性。

本文提供的治疗剂的施用方法包括但不限于：口服施用、肠胃外施用（例如，皮内、肌内、腹腔内、静脉内和皮下）、硬膜外施用、瘤内施用、粘膜施用（例如，鼻内和口腔途径）和肺部施用（例如，借助吸入器或喷雾器施用的雾化吸入化合物）。用于特定施用途径的药物组合物制剂以及各种施用方法所必需的材料和技术对于本领域技术人员而言是现成并已知的（美国专利公布号20090311253 A1）。

在各种实施方案中，可调整剂量方案以提供最佳的所需响应（例如，治疗或预防响应）。例如，可施用单次团注、可随时间推移施用若干个分剂量或可根据治疗情况的急切需要所指示按比例地减少或增加剂量。在一些实施方案中，针对剂量的易施用性和均一性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物。术语“剂量单位形式”指代物理上分立的单位，其适合用作针对待治疗的哺乳动物个体的一体化剂型；每个单位含有经过计算的预定数量的活性化合物以结合所需药物载体产生所需的治疗效果。

本文提供的TRAIL受体激动剂蛋白的治疗或预防有效量的示例性非限制性范围是约0.1-100 mg/kg（例如，约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-15、1-7.5、1.25-15、1.25-7.5、2.5-7.5、2.5-15、5-15、5-7.5,1-20、1-50、7-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100 mg/kg，或其间任何浓度）。在一些实施方案中，所述TRAIL受体激动剂蛋白可以下列治疗有效浓度存在于药物组合物中，例如：约0.1-100 mg/ml的浓度（例如，约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-20、1-50、1-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100 mg/ml，或其间任何浓度）。注意，剂量值可随着待缓解的状况的类型和/或严重程度而变化。还应当理解，对于任何具体个体，特定剂量方案可根据个体需要和/或施用或指导施用所述组合物的人员的专业判断而随时间调整，并且本文所述的剂量范围仅为示例性的而并非旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。

实施例

1.生产TRAIL受体激动剂蛋白(sc TRAIL wt)

1.1 多肽结构

A)氨基酸 Met1 – Gly20

Ig-κ-信号肽，假定的信号肽酶裂解位点在氨基酸GIy 20之后。

B)氨基酸 Gln21 – Gly182

人类TRAIL配体的第一可溶性细胞因子域（TRAIL，SEQ ID NO: 1的氨基酸120 - 281）。

C)氨基酸 GIy 183 – Ser 190

SEQ ID NO: 2的第一肽接头元件。

D)氨基酸 Arg191 – Gly351

人类TRAIL配体的第二可溶性细胞因子域（TRAIL，SEQ ID NO: 1的氨基酸121 - 281）。

E)氨基酸 GIy352 – Ser359

SEQ ID NO: 2的第二肽接头元件。

F)氨基酸 Arg360 – Gly520

人类TRAIL配体的第三可溶性细胞因子域（TRAIL，SEQ ID NO:1的氨基酸121-281）。

G)氨基酸 Gly521 – Cys542

SEQ ID NO: 11的铰链-接头元件。

H)氨基酸 Pro543 - Lys760

SEQ ID NO: 10的抗体Fc片段域。

以上TRAIL受体激动剂蛋白示于SEQ ID NO: 14中。

所指示的接头可被其它优选的接头替换，例如，如SEQ ID NO: 3-9中所示。

应当注意的是，所述第一和第二肽接头不必是相同的。

信号肽序列（A）可被任何其它合适的例如哺乳动物信号肽序列替换。

1.2 编码所述多肽的基因盒

合成的基因可根据其密码子使用而优化以用于在合适的宿主细胞（例如昆虫细胞或哺乳动物细胞）中表达。优选的核酸序列示于SEQ ID NO: 16中。

2.表达和纯化

融合多肽的克隆、表达和纯化

在两种不同的真核宿主细胞中重组表达上述融合蛋白：

对于上述TRAIL受体激动剂融合蛋白的初步分析，将生长于补充有10% FBS、100 单位/ml 青霉素和100 [mu]g/ml 链霉素的DMEM + GlutaMAX (GibCo)中的Hek293T细胞用含有融合多肽和适当选择标志物的表达盒（例如包含杀稻瘟素、嘌呤霉素或潮霉素抗性基因的功能性表达盒）的质粒瞬时转染。在这些情况下（其中需要多条多肽链以获得最终产物），在转染期间，所述表达盒被合并至一个质粒上或位于不同的质粒上。在转染后三天收获含有重组融合多肽的细胞培养上清液并通过在300 x g离心然后通过0.22 μm无菌过滤器过滤而澄清。

对于用于体内的TRAIL受体激动剂融合蛋白的更大规模表达，将编码上述蛋白质的合成DNA盒插入到真核表达载体中，所述真核表达载体包含适当的选择标志物（例如，包含杀稻瘟素、嘌呤霉素或潮霉素抗性基因的功能性表达盒）和适于提高宿主细胞基因组内转录活性插入位点数量的遗传元件。通过电穿孔将经过序列验证的表达载体引入到适应悬浮的中国仓鼠卵巢细胞（CHO-S, Invitrogen）中。在转染后三天向经转染的细胞施加适当的选择压力。通过随后在选择压力下培养来回收携带来源于载体的抗性基因的幸存细胞。在轨道式振荡培养箱(100 rpm, 50mm 摇距)中于37℃和7% CO2 气氛下在化学成分确定的培养基（PowerCHO2-CD, Lonza）中稳定生长选定的细胞集合之后，通过检测上述蛋白质的ELISA测定法分析各个上清液，并于生产蛋白质之前在摇瓶中扩增具有最高特异生产率的细胞集合（轨道式摇床，100 rpm，摇距 50mm）。

对于实验室规模的蛋白质生产，将各个细胞集合在波浪式生物反应器20/50 EHT(GE-Healthcare)中于37℃和7% CO2 气氛下在化学成分确定的培养基(PowerCHO2-CD,Lonza)中培养7-12天。基础培养基是补充有4mM Glutamax的PowerCHO2-CD。波浪式培养起始于0.3至0.4 x 10e6 个细胞/ml的活细胞浓度以及下列设定（对于五或十升袋）：摇动频率 18rpm、摇动角度 7°、气流 0.2-0.3 L/min、7% CO2、36.5℃。在波浪式运行期间，用PowerFeed A (Lonza)为细胞培养进料两次，通常在第2天(20% 进料)和第5天(30% 进料)。在第二次进料后，将摇动频率增加到22 rpm，并将摇动角度增加到8°。

通常在第7天到第12天之间当细胞活力降至低于80%时收获生物反应器。首先，使用手动深度过滤系统(Millipore Millistak Pod, MC0HC 0.054m²)澄清培养上清液。对于经Strep-标签标记的蛋白质，添加亲和素至0.5mg/L的最终浓度。最后，使用瓶顶过滤器(0.22μm, PES, Corning)对含有TRAIL受体激动剂融合蛋白的培养上清液进行灭菌过滤并保存在2-8℃直到进一步加工。

对于亲和纯化，将Streptactin Sepharose填装在柱(凝胶床 1 ml)中，用15 ml缓冲液W (100 mM Tris-HCI、150 mM NaCI，pH 8.0)或PBS pH 7.4进行平衡，并且以4 ml/min的流速将细胞培养上清液施加到该柱上。随后，用15 ml 缓冲液W洗涤该柱并通过加入7x 1 ml 缓冲液E (100 mM Tris HCI、150 mM NaCI、2.5 mM 脱硫生物素，pH 8.0)逐步洗脱结合的多肽。作为另外一种选择，可以将含有2.5 mM 脱硫生物素的PBS pH 7.4用于此步骤。

作为基于Streptactin Sepharose的方法的另外一种选择，采用以固定的蛋白质-A作为亲和配体的柱以及Akta层析系统(GE-Healthcare)进行所述亲和纯化。选择对融合蛋白的FC域具有高亲和力的固相材料：MABSelect Sure^TM (GE Healthcare)。简而言之，将经过澄清的细胞培养上清液上样到在洗涤缓冲液-1(20 mM Pi、95 mM NaCl，pH7.2)中平衡的HiTrap MabSelectSure 柱 (CV=5ml)，上样量不超过10mg 融合蛋白/ml 柱床。用十倍柱体积(10CV)的上述平衡缓冲液然后是四倍柱体积(4CV)的洗涤缓冲液-2(20mM Pi、95mMNaCl，pH 8.0)洗涤该柱以耗尽宿主细胞蛋白质和宿主细胞DNA。然后，用洗脱缓冲液(20mMPi、95mM NaCl，pH 3.5)洗脱该柱并将洗脱液收集在最多至十个级分中，其中每个级分具有等于柱床体积的体积(5ml)。用等体积的上述洗涤缓冲液-2中和各个级分。在上述亲和层析方法的过程中，将线速度设为150cm/h并保持恒定。

对所述洗脱液级分的蛋白质量进行定量并通过超过滤浓缩峰值级分并通过尺寸排阻层析法(SEC)进一步纯化。

使用Akta层析系统(GE-Healthcare)在Superdex 200 10/300 GL 或 HiLoad 26/60 柱上进行SEC。将柱用磷酸盐缓冲盐水进行平衡，并将浓缩的、亲和纯化的多肽上样到SEC柱上，其中样品体积不超过柱体积的2 % (v/v)。就Superdex200 10/300 GL柱(GEHealthcare)而言，应用0.5ml/分钟的流速。就HiLoad 26/60 Superdex200柱而言，应用2.5ml/分钟的流速。通过在280 nm的吸光度监测多肽的洗脱概况。

为了确定经纯化的融合多肽在天然条件下的表观分子量，用具有已知分子量的标准蛋白质上样Superdex 200柱。根据该标准蛋白质的洗脱体积，绘制校正曲线并确定经纯化的融合多肽的表观分子量。包含TRAIL受体激动剂融合蛋白的FC域通常以大约160-180kDa的同源二聚体表观分子量从Supoerdex200柱上洗脱。

3.细胞凋亡测定法

使用Jurkat A3永久性T细胞系的细胞测定法被用于测定诱导TRAIL受体激动剂融合蛋白活性的细胞凋亡。在装着补充有10% FBS、100 单位/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素的RPMI 1640-培养基 + GlutaMAX (GibCo)的烧瓶中生长Jurkat细胞。测定之前，在96孔微量滴定板的每个孔中接种100,000个细胞。在将不同浓度的融合多肽加入到孔中之后，于37℃温育3小时。通过加入裂解缓冲液(250 mM HEPES、50 mM MgCI2、10 mM EGTA、5% Triton-X-100、100 mM DTT、10 mM AEBSF，pH 7.5)裂解细胞并将平板置于冰上30分钟至2小时。细胞凋亡伴随有增加的半胱天冬酶（例如，半胱天冬酶-3）活性。因此，特定半胱天冬酶底物Ac-DEVD-AFC (Biomol)的裂解被用于测定细胞凋亡的程度。事实上，半胱天冬酶活性与在用碘化丙锭和Hoechst-33342对细胞进行染色后从形态学上所测定的凋亡细胞的百分比是相关的。对于半胱天冬酶活性测定法，将20 μl细胞裂解物转移到黑色的96孔微量滴定板上。在加入80 μl含有50 mM HEPES、1% 蔗糖、0.1% CHAPS、50 μM Ac-DEVD-AFC和25 mM DTT，pH7.5的缓冲液之后，将平板转移到Tecan Infinite 500微量滴定板读取器并监测荧光强度的增加（激发波长 400 nm，发射波长 505 nm）。

3.1 细胞死亡测定法

为了在HT1080纤维肉瘤细胞中测定细胞死亡，将15,000个细胞置于96孔平板上在补充有10% FBS(Biochrom)的RPM1 1640-培养基 + GlutaMAX (GibCo)中过夜。将细胞与放线菌酮(Sigma)以2.5 g/ml的最终浓度共温育。通过用缓冲液KV(0.5% 结晶紫、20% 甲醇)染色对细胞死亡进行定量。在染色后，将孔用水洗涤并风干。用甲醇洗脱染料并用ELISA读取器测量595 nm处的光密度。

4.稳定性/聚集测试

4.1 聚集分析的原理（可溶性蛋白质的定义）

单体（TRAIL受体结合模块的限定的三聚体组件）和聚集体的含量由如实施例2中所述的分析型SEC测定。出于此特定目的，在含有生理盐浓度、处于生理pH的缓冲液（例如，0.9%NaCI，pH 7.4；PBS pH 7.4）中进行所述分析。典型的聚集分析在Superdex200柱(GEHealthcare)上完成。此柱分离在10至800 kDa范围内的蛋白质。

为了确定经纯化的融合多肽在天然条件下的表观分子量，用具有已知分子量的标准蛋白质上样Superdex 200柱。根据该标准蛋白质的洗脱体积，绘制校正曲线并基于洗脱体积计算经纯化的融合多肽的表观分子量。

可溶性非聚集的蛋白质（例如，三聚化TRAIL）的SEC分析通常在限定的洗脱体积内显示出明显的单蛋白峰。此洗脱体积对应于特定蛋白质的表观天然分子量并与基于一级氨基酸序列计算出的理论分子量大致相符。

如果发生蛋白质聚集，则SEC分析以更低的保持体积显示出额外的蛋白峰。对于TRAIL，可溶性蛋白质的聚集以特殊方式进行。所述蛋白质往往会形成“三聚体”的低聚物，形成九聚体(3 x 3)和27聚体(3 x 9)。这些低聚物充当聚集的种子，而高含量的低聚物可能导致所述蛋白质的聚集。大分子量的低聚物和聚集体在Superdex200柱的空隙体积中洗脱并且无法通过SEC对其天然分子量进行分析。

由于诱导了（完整的）聚集，经纯化的TRAIL-SF融合蛋白制备物应当优选地仅含有限定的三聚化蛋白质和极低量的低聚化蛋白质。特定TRAIL-SF蛋白质制备物的聚集/低聚化程度是基于SEC分析通过分别计算限定的三聚化和低聚物/聚集级分的OD280示意图的峰面积来测定的。基于总的峰面积，如下计算限定的三聚化蛋白质的百分比：

(% 三聚体含量 = [三聚体峰面积] / [总的峰面积] x 100)

如本文中所用的可溶性蛋白质的定义描述了经纯化的TRAIL蛋白的蛋白质制备物在具有生理盐浓度、生理pH的缓冲液中，其含有的限定的可溶性蛋白质（TRAIL域的三聚体组件）的含量> 90%，并处于0.2至10.0 mg/ml的典型蛋白质浓度范围内。

5.半衰期测定

分子A-D各自由两条通过链间二硫键共价连接的多肽构成。测试了糖基化位点和铰链半胱氨酸（得到蛋白质之间的链间二硫键）的数量以确定改变这些特性对这些化合物的半衰期的影响。

用1.2 mg/kg bw和/或用4 mg/kg bw的指定化合物以单次静脉内团注的形式处理雌性NMRI小鼠。在应用前（给药前）和施用测试项目后最多至168小时收集全血。制备血清并将样品保存在–80℃直到测定血清浓度。使用平均血清浓度以及用于非隔室药代动力学数据分析的药代动力学评价程序PK Solutions Version 2.0(Summit Research Services,Montrose, CO)计算药代动力学参数。PK Solutions是自动化的、基于Excel的应用程序，其从浓度-时间数据计算药代动力学参数，所述浓度-时间数据得自对例如静脉内或血管外途径施用后的生物样品的分析。PK Solutions在不假设任何特定的隔室模型的情况下计算结果。

用ELISA测定法进行测试项目在血清中的定量，所述ELISA测定法检测表7中所示的各个TRAIL受体激动剂，而不依赖于Strep-标签作为所述分子的一部分。总体布局示于图18中。结果汇总于表7中。

分子A（由SEQ ID NO:26的两条多肽构成）具有两个铰链半胱氨酸（形成两个链间二硫键）和位于Fc区的位置297（根据EU索引）的N残基，导致野生型CH2糖基化。分子A还在位置168和337具有糖基化位点。分子B（由SEQ ID NO: 19的两条多肽构成）具有三个铰链半胱氨酸（形成三个链间二硫键）（在位置513、519和522）和位于Fc区的位置297（根据EU索引）的N297S突变，导致CH2域的无糖基化。分子B还在位置168和337具有糖基化位点。分子C（由SEQID NO: 27的两条多肽构成）具有三个铰链半胱氨酸（形成三个链间二硫键）和位于Fc区的位置297（根据EU索引）的N297S突变，导致CH2域的无糖基化。另外，在位置168（接头1）而非位置337（接头2）存在糖基化位点。分子D（由SEQ ID NO:28的两条多肽构成）具有三个铰链半胱氨酸（形成三个链间二硫键）和位于Fc区的位置297（根据EU索引）的N297S突变，导致CH2域的无糖基化。另外，分子D中接头1和接头2上的糖基化位点（分别在位置168和337）已经被耗尽。

当与分子A相比时，分子B（两个接头均被糖基化、CH2糖基化位点耗尽并且添加了第三个铰链半胱氨酸）的体内稳定性（通过化合物半衰期判断）得到提高。另外，来自化合物（分子D）的所有糖基化位点的耗尽导致瞬时表达期间体内稳定性降低以及低生产率。当与分子B和D相比时，分子C（第一接头被糖基化、第二接头无糖基化、CH2糖基化位点耗尽）显示出介于二者之间的体内稳定性（参见表7中的结果）。

表7：NMRI小鼠中化合物半衰期测试结果

分子	糖基化位点数目	铰链半胱氨酸数目	终末半衰期 4mg/kg i.v.(小时)	终末半衰期 1.2 mg/kg i.v.(小时)
					A	6	2	23.1	17.7
B	4	3	33.94	28.28
					C	2	3	21.03	-
D	0	3	8.81	-

这些实验结果证实，将接头糖基化（在接头1和2二者中）与第三个链间二硫键（通过加入铰链半胱氨酸）以及Fc区中CH2域的去糖基化合并导致本发明的分子中更高的体内稳定性。

6.功效的体外展示

6.1 SEQ ID NO: 19的TRAIL受体激动剂蛋白体外抑制人类血液及实体肿瘤细胞存活

将肿瘤细胞以10,000个细胞/孔接种在96孔平板、在含有10% FBS的推荐培养基中，并用TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）在37^oC、潮湿的、5% CO₂气氛中处理24小时。随后，如制造商说明（Promega; Madison, WI）所述，使用CellTiter-Glo®试剂评估细胞活力。通过相对于未处理的对照细胞进行标准化的浓度反应数据的非线性回归分析测定IC₅₀值。所得Colo205、Jurkat和SKM-1细胞的浓度反应曲线的实例示于图19中，其显示了响应于TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）处理而发生的细胞活力丧失。表8示出了用TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）处理24小时的血液学(A; (n=40; 非霍奇金淋巴瘤, NHL; 急性髓细胞性淋巴瘤, AML; 急性淋巴细胞性白血病, ALL)和实体瘤(B; (n=44; 非小细胞肺癌, NSCLC; 胰腺癌; 结肠直肠癌, CRC; 乳腺癌, BrCa; 卵巢癌、纤维肉瘤; 头颈部癌, H&N; 小细胞肺癌, SCLC)细胞系以及通过CellTiter-Glo®评估的活力的结果。提供了TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）介导的对肿瘤细胞活力的影响的所得IC₅₀。

表8

SEQ ID NO: 19的TRAIL受体激动剂蛋白在人类肿瘤癌细胞系中的体外效力

6.2 SEQ ID NO: 19的TRAIL受体激动剂蛋白与抗肿瘤发生剂协同作用以诱导肿瘤细胞死亡

将肿瘤细胞以10,000个细胞/孔接种在96孔平板、在含有10% FBS的推荐培养基中，并用TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）和venetoclax(ABT-199)、navitoclax(ABT-263)或多西紫杉醇(DTX)在37^oC、潮湿的、5% CO₂气氛中共处理24小时。随后，如制造商说明所述，使用CellTiter-Glo®试剂评估细胞活力。采用了布里斯独立模型（Bliss independence model）(Wong 等人，2012; Mol.CancerTher.11:1026-1035; Bernebaum, 1981 Adv.Cancer Res.35:269-335; Borisy 等人，2003 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:7977-7982)以评估组合活性，其中负整数指示拮抗作用，零值指示加和活性，而正整数指示协同作用。计算了剂量模型中各个组合的布里斯分数并计算总数以给出“布里斯总和”值。通过用TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）和venetoclax、navitoclax或DTX共处理人类肿瘤细胞所诱导的协同肿瘤细胞死亡的实例，连同相关的布里斯总和示于图20(A-C)中。在表9中描绘了这些组合在多个肿瘤细胞系中所测定的布里斯总和。

表9

通过SEQ ID NO:19的TRAIL受体激动剂蛋白与DTX组合在NSCLC细胞系(A)中以及与venetoclax或navitoclax组合在NHL & AML细胞系(B)中体外细胞杀伤的布里斯协同作用评估。

7.SEQ ID NO:19的TRAIL受体激动剂蛋白处理体内抑制肿瘤生长

在皮下植入了Colo205(结肠直肠癌)、SKM-1(急性髓系白血病)和H460LM(非小细胞肺癌)异种移植肿瘤的SCID雌性小鼠(Charles Rivers Laboratories; Wilmington, MA)中评价了TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID No:19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）对肿瘤生长的影响。简而言之，在研究的第0天，将人类癌症细胞皮下接种到雌性SCID小鼠的右后侧腹中。在尺寸匹配的时间开始施用SEQ ID NO:19的TRAIL受体激动剂蛋白(0.3、1或3 mkd IV给药, QDx5或IP, Q2Dx5，如所指示的)。在实验持续期间测量肿瘤体积直到各组中的平均肿瘤体积达到>2000 mm³（对于Colo205和SKM-1）或 >2500 mm³（对于H460LM）的终点。结果示于图21-23中。在Colo205、SKM-1和H460LM异种移植肿瘤模型中，施用TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）诱导了显著的肿瘤生长抑制。

还在植入了来源于患者的异种移植瘤模型CTG-0069(结肠直肠癌)、CTG-0167(NSCLC)、CTG-0293(胰腺癌)、CTG-0714(肉瘤)、CTG-0136(食道癌)、CTG-485(胃癌)和CTG-0785(尤因氏肉瘤)的NSG雌性小鼠(Champions Oncology; Hackensack, NJ)中评价了TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID No:19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）对肿瘤生长的影响。简而言之，在研究的第0天，将肿瘤片段皮下传播到雌性NSG小鼠的右后侧腹中。在尺寸匹配的时间开始施用TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）（3 mkd IP给药, Q2Dx5）。在实验持续期间测量肿瘤体积直到各组中的平均肿瘤体积达到>2000 mm³的终点或直到60天。结果示于图24(A-G)中。在CTG-0069(直肠结肠癌)、CTG-0167(NSCLC)、CTG-0293(胰腺癌)、CTG-0714(肉瘤)、CTG-0136(食道癌)、CTG-485(胃癌)和CTG-0785(尤因氏肉瘤)PDX模型中，施用TRAIL受体激动剂蛋白（由具有SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列的两条多肽构成）诱导了显著的肿瘤生长抑制。

Claims (7)

1.由多肽组成的TRAIL受体激动剂蛋白，所述多肽包含SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列。

2.由两条多肽组成的TRAIL受体激动剂蛋白，所述两条多肽包含SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列。

3.权利要求2的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述两条多肽通过形成于各自多肽的半胱氨酸残基513、519和522之间的三个链间二硫键共价连接。

4.权利要求1、2或3的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述多肽的位置168和337处的天冬酰胺残基中的一个或多个是N-糖基化的。

5.权利要求1、2或3的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述多肽的位置168和337处的天冬酰胺残基均是N-糖基化的。

6.权利要求1-5任一项的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述多肽还经过翻译后修饰。

7.权利要求6的TRAIL受体激动剂蛋白，其中所述翻译后修饰包括将N-末端谷氨酰胺修饰成焦谷氨酸。

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