CN102317314A - 结合trail-r1和trail-r2的多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及TRAIL死亡受体的激动剂,所述激动剂包括具有多聚例如三聚结构域的多肽和与TRAIL死亡受体TRAIL-R1和TRAIL-R2中至少一个相结合的多肽序列。所述激动剂不结合TRAIL诱饵受体。三聚结构域可以来自人四联蛋白。激动剂能够诱导表达TRAIL死亡受体的病原细胞中的凋亡。所述药物组合物用于治疗与表达DR4和DR5的细胞如肿瘤细胞相关的疾病。用于筛选多肽并制备多聚复合物的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年10月10日提交的美国临时申请号61/104,538的权利,其通过引用全部并入本文。
序列表说明
序列列表仅以电子形式编入本申请中,并通过引用并入本文。序列表文本文件”____________”创建于___________,并且大小为________。
技术领域
广义地,本发明涉及癌症和其它疾病的治疗。具体地,本发明涉及结合TRAIL死亡受体并诱导表达TRAIL死亡受体的病原细胞凋亡的多肽。
背景技术
TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,除此之外,文献中也称为Apo2L和TNFSF10)属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族,并且已经鉴定为肿瘤细胞中程序化细胞死亡或凋亡的激活剂。TRAIL在免疫系统细胞中表达,包括NK细胞、T细胞、巨噬细胞和树突细胞,并且位于细胞膜中。TRAIL可以由半胱氨酸蛋白酶加工,产生蛋白质的可溶形式。TRAIL的膜结合和可溶形式均可作为三聚体并且能通过与靶细胞上的TRAIL受体相互作用而触发凋亡。在人类中,已经鉴定了五个受体具有结合TRAIL的活性。这五个受体中的两个,TRAIL-R1(DR4,TNFSF10a)和TRAIL-R2(DR5,TNFRSF10b),包含称为死亡结构域(DD)的细胞质区域。这两个受体分子上的死亡结构域是TRAIL结合受体后外在凋亡途径TRAIL-活化所需要的。其余三个TRAIL受体(称作TRAIL-R3(DcR1,TNFRSF10c)、TRAIL-R4(DcR2,TNFRSF10d)和循环骨保护素(OPG,TNFRSF11b))被认为是作为诱饵受体。这三个受体缺乏功能性DD,被认为主要通过隔绝TRAIL或刺激促存活信号而参与负调节凋亡。
一旦TRAIL与TRAIL-R1(DR4)或-R2(DR5)结合,三聚受体就会募集几种胞质蛋白,形成死亡诱导信号复合物(DISC),之后由其活化半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-10。这将触发两种不同的引起不可逆细胞死亡途径之一,一条途径中,半胱天冬酶-8直接激活效应物半胱天冬酶(半胱天冬酶-3、-6、-7),导致细胞分解,而另一条途径包括依赖促死亡Bcl-2家族蛋白Bid的半胱天冬酶-8的裂解,并参加线粒体或内在死亡途径。
根据这种细胞死亡活性,正在研究几种基于TRAIL的治疗方法。在一些临床前研究中,重组可溶TRAIL诱导了广谱的人肿瘤细胞系中的凋亡,所述细胞系来自白血病、多骨髓瘤和成神经细胞瘤,以及肺、直肠、胸、前列腺、胰腺、肾和甲状腺癌。已经在多种肿瘤异种移植物中观察到了肿瘤生长的剂量依赖型抑制,同时没有或有很小的全身毒性(Ashkenazi 1999,Jin 2004)。在这些研究中,虽然TRAIL的高度聚集形式与肝毒性有关,但是重组TRAIL制剂表现出对于选择性和抗肿瘤性质的重要性。重组TRAIL已经成功地用于患者。
正在开发几种TRAIL-R1或-R2人拮抗单克隆抗体。在细胞系和小鼠模型中,这些抗体有效地诱导凋亡。目前至少五个单克隆抗体作为单一药物治疗或与小分子化疗药物组合而在进行临床开发。在至少一项研究中,单克隆抗-DR4或-DR5抗体整体安全并且能够良好耐受,使多名患者病情稳定(即本身没有足够的效力),组合化学疗法正在评价中。使用结合DR5的单克隆抗体的临床前研究表明通过与二级抗体体外二次交联而介导的TRAIL受体超聚集(在体内很可能是通过抗体Fc结构域在肿瘤位点结合免疫细胞表面受体)表现出更强的活性。
然而,上述治疗方法有几点缺陷。例如,尽管本体/重组TRAIL能结合TRAIL-R1和TRAIL-R2(均为包含DD的受体),但是它还结合诱饵受体,极大限制了其活性。此外,TRAIL的半衰期非常短,为分钟级,进一步限制了它的作用。尽管提供了半衰期更长的分子,但是每种抗体方法都是对某一类受体有特异性的。此外,大的抗体会限制其肿瘤穿透性。
因此,本领域需要其他可结合TRAIL-R1和TRAIL-R2的分子,包含这些分子的组合物,用于筛选这种分子的方法,和在多种癌症的药物治疗中使用这种分子的方法。
发明内容
在最广泛的方面,本发明涉及非天然多肽,其包含三聚结构域和与至少一个TRAIL死亡受体结合的至少一个多肽。
在本发明的各个方面,三聚结构域包括在位置10、17、20、21、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34或35有多达五个氨基酸取代的SEQ ID NO:10的多肽,并且其中三个三聚结构域形成三聚复合物。在另一个实施方案中,所述三聚结构域包括选自下述之一的三聚多肽:hTRAF3[SEQ ID NO:]、hMBP[SEQ ID NO:]、hSPC300[SEQ ID NO:]、hNEMO[SEQ ID NO:]、hcubilin[SEQ IDNO:]、hThrombospondins[SEQ ID NO:],和人SP-D的颈区[SEQID NO:]、牛SP-D的颈区[SEQ ID NO:]、大鼠SP-D的颈区[SEQID NO:]、牛胶固素的颈区:[SEQ ID NO:];牛胶原凝集素的颈区:[SEQ ID NO:];和人SP-D的颈区:[SEQ ID NO:]。
在具体的实施方案中,本发明的非天然多肽结合TRAIL死亡受体DR4和DR5中的一个或两个。结合TRAIL死亡受体的多肽可以是C型类凝集素结构域(CLTD),其中环区段A或环区段B的环1、2、3或4之一包含结合DR4和DR5中的一个或两个的多肽序列。
在另一个方面,本发明涉及非天然多肽,其包含三聚结构域和结合TRAIL死亡受体DR4的多肽,其中所述结合DR4的多肽包含C型类凝集素结构域(CLTD),其包含CTLD的环1和4中序列的几种可能组合。在类似的实施方案中,本发明涉及非天然多肽,其包含三聚结构域和结合TRAIL死亡受体DR5的多肽,其中所述结合DR4的多肽包含C型类凝集素结构域(CLTD),其包含CTLD的环1和4中序列的几种可能组合。
在一个方面,本发明的非天然多肽不结合TRAIL诱饵受体,比如DcR1、DcR2和循环骨保护素(OPG)。
此外,本发明的多肽可以是融合蛋白的形式。
在本发明的各个方面,多肽结合DR4和DR5,或者多肽包含均结合DR4或均结合DR5的两个序列。例如,本发明的多肽可以包含结合DR4和DR5中至少一个的第一多肽,其位于三聚结构域的N-端或C-端之一,和结合DR4和DR5中至少一个的第二多肽,其位于三聚结构域的N-端或C-端中的另一端。第一和第二多肽均可结合DR4,或者第一和第二多肽均可结合DR5。或者,第一和第二多肽中的一个结合DR4,并且第一和第二多肽中的另一个结合DR5。
在另一个方面,本发明的多肽包括结合DR4或DR5的、位于三聚结构域的N-端和C-端之一的序列,并且在N-端和C-端的另一端包括结合肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)的多肽序列。在另一个方面,结合DR4或DR5的多肽位于三聚结构域的N-端和C-端之一,并且结合选自下组的受体的多肽位于N-端和C-端的另一端:Fn14、FAS受体、TNF受体和LIGHT受体。本发明的多肽还可以具有共价附着于多肽上的治疗剂。
此外,本发明涉及本发明的三个多肽的三聚复合物。例如,三聚结构域是四联蛋白三聚结构元件。
本发明还涉及诱导患者体内表达DR4和DR5中至少一个的肿瘤细胞凋亡的方法。方法包括用本发明的三聚复合物接触细胞。
本发明还涉及三聚复合物和至少一种医药上可接受的赋形剂的药物组合物。药物组合物可以用于治疗癌症患者,并且可以与治疗剂同时或顺序施用。
在另一个方面,本发明涉及制备可诱导细胞凋亡的多肽的方法。方法包括筛选结合DR4或DR5之一但不结合TRAIL诱饵受体的第一多肽,并将第一多肽与多聚结构域的N-端或C-端之一融合。方法还可以包括筛选特异性结合DR4和DR5中另一个的第二多肽,并将第二多肽与多聚结构域中N-端或C-端中另一端融合。在这个方面,方法可以包括筛选不结合TRAIL诱饵受体的多肽。
本发明的再一个方面包括制备可诱导细胞凋亡的多肽复合物,所述细胞表达TRAIL的至少一个死亡受体,其包含三个三聚多肽。
本发明的其它方面包括制备诱导肿瘤细胞凋亡的多肽的方法。这个方面的方法包括,产生包含CTLD的多肽文库,所述CTLD包含至少一个随机环区域,并从可结合DR4或DR5之一的文库筛选第一多肽。这个方面还可以包括将所筛选的多肽与多聚结构域的N-端或C-端融合,并筛选不结合TRAIL诱饵受体的多肽。
附图说明
图1描述人(SEQ ID NO:100)和鼠四联蛋白(SEQ ID NO:)成熟形式的编码区域的核苷酸和氨基酸序列比对,并指示了已知的二级结构元件。
图2显示四联蛋白家族三聚结构元件的氨基酸序列比对。氨基酸序列(单字母编码)对应于包含外显子2的残基V17至K52和人四联蛋白的外显子3的前三个残基(SEQ ID NO:1);鼠四联蛋白(SEQ IDNO:)(Sorensen等,Gene,152:243-245,1995);分离自礁鲨软骨的四联蛋白相似蛋白(SEQ ID NO:)(Neame和Boynton,1992,1996);和分离自牛软骨的四联蛋白相似蛋白(SEQ ID NO:)(Neame和Boynton,数据库登记号PATCHX:u22298)。七肽重复区域的a和d位置处的残基用粗体字表示。列出的四联蛋白家族三聚结构元件的保守序列(SEQ ID NO:10)包含图中所示七肽重复区域a和d位置处的残基,以及区域的其它保守残基。“hy”表示脂肪族疏水残基。
图3A、B、C和D显示用作本发明示例的四联蛋白三聚模块截短型的实例。
图4显示已知3D结构的十个CTLD的氨基酸序列比对。在每个序列上表示主要二级结构元件的序列位置,并按照数字顺序标为“αN”,表示α-螺旋数N,和“βM”,表示β-链数目M。参与CTLD的两个保守二硫桥形成的四个半胱氨酸残基在图中分别标注为“CI”、“CII”、“CIII”和“CIV”。两个保守的二硫桥分别为CI-CIV和CII-CIII。人四联蛋白序列中的各个环1-4和LSB(环5)用下划线标出。十个C-型凝集素为hTN:人四联蛋白(SEQ ID NO:XX),MBP:甘露糖结合蛋白(SEQ ID NO:XX);SP-D:表面活性剂蛋白D(SEQ ID NO:XX);LY49A:NK受体LY49A(SEQ ID NO:XX);H1-ASR:无唾液酸糖蛋白受体的H1亚基(SEQ ID NO:XX);MMR-4:巨噬细胞甘露糖受体结构域4(SEQ ID NO:XX);IX-A(SEQ ID NO:XX)和IX-B(SEQ ID NO:XX):凝结因子IX/X-结合蛋白结构域A和B;Lit:胰腺石蛋白(SEQ IDNO:XX);TU14:被囊动物C-型凝集素(SEQ ID NO:XX)。除TU14之外的所有这些CTLD都来自人蛋白。
图5描述分离自人(Swissprot P05452)(SEQ ID NO:XX)、小鼠(Swissprot P43025)(SEQ ID NO:XX)、鸡(Swissprot Q9DDD4)(SEQ IDNO:XX)、牛(Swissprot Q2KIS7)(SEQ ID NO:XX)、大西洋鲑鱼(Swissprot B5XCV4)(SEQ ID NO:XX)、青蛙(Swissprot Q5I0R9)(SEQID NO:XX)、斑马鱼(GenBank XP_701303)(SEQ ID NO:XX)的四联蛋白的几个C型凝集素结构域,和分离自畜养牛(Swissprot u22298)(SEQ IDNO:XX)和礁鲨(Swissprot p26258)(SEQ ID NO:XX)软骨的相关CTLD类似物的比对。
图6显示用于在CTLD中产生随机环的PCR策略。
具体实施方式
在各个方面,本发明涉及TRAIL受体激动剂(agonist),其包括具有多聚结构域的多肽和一个或多个结合TRAIL死亡受体的多肽。多肽中的两个、三个或多个能多聚形成激动剂,其为多聚复合物,包括结合TRAIL死亡受体的多肽。一旦与呈现这种受体的细胞上的TRAIL死亡受体结合,激动剂可诱导细胞凋亡。在另一个实施方案中,多肽结合死亡受体但不是受体的激动剂,使与多肽相关(例如,共价结合)的治疗剂,比如auristatin、maytansinoid等靶向传递。此外,本发明提供通过对受试对象施用激动剂而治疗受试对象的癌症和其它疾病的方法。多肽包括一个或多个多肽,其特异性地结合TRAIL-R1(DR4)或TRAIL-R2(DR5)中的一个或两个,并且,优选地,不结合TRAIL诱饵受体。
定义
在详细限定本发明之前,定义多个术语。除非本文提供术语的具体定义,否则本公开文件中使用的术语和短语应理解为具有本领域通常所理解的含义。此外,如同本文和附加权利要求中所使用的,除非上下文明确指出,否则单数形式包括复数指示对象。
“TRAIL”或“TRAIL多肽”指SEQ ID NO:62,以及SEQ ID NO:62的生物活性片段。片段包括,但不限于,具有SEQ ID NO:62的5至50个氨基酸残基,或5至25,或10至20个残基,或12至20个氨基酸残基的序列(例如,25、23、21、19、17、15或更少的氨基酸残基)。
如本文所使用的,术语“TRAIL死亡受体”指可结合TRAIL,并且一旦结合TRAIL即活化肿瘤细胞中的程序化细胞死亡(凋亡)的蛋白质。TRAIL死亡受体的某些非限定性实例包括常称作TRAIL-R1(DR4)(SEQ ID NO:42)或TRAIL-R2(DR5)(SEQ ID NO:43)的受体蛋白之一。
术语“DR4”、“DR4受体“和“TRAIL-R1”在本文互换使用,指SEQ ID NO:42的全长TRAIL受体序列和Pan等,Science,276:111-113(1997);1998年7月30日公开的WO98/32856;2002年1月29日提交的美国专利No.6,342,363;和1999年7月29日公开的WO99/37684中所述的受体的可溶、胞外结构域形式。
术语“DR5”、“DR5受体“和“TRAIL-R2”在本文互换使用,指SEQ ID NO:43的全长TRAIL受体序列和Pan等,Science,276:111-113(1997);Pan等,Science,277:815-818(1997),2000年6月6日提交的美国专利No.6,072,047;美国专利No.6,342,369,1009年11月19日公开的WO98/51793;1998年9月24日公开的WO98/41629;Screaton等,Curr.Biol.,7:693-696(1997);Walczak等,EMBO J.,16:5386-5387(1997);Wu等,Nature Genetics,17:141-143(1997);1998年8月20日公开的WO98/35986;1998年10月14日公开的EP870,827;1998年10月22日公开的WO98/46643;1999年1月21日公开的WO99/02653;1999年2月25日公开的WO99/09165;1999年3月11日公开的WO99/11791中所述的受体的可溶、胞外结构域形式,所述文献均通过引用全部并入本文。
如本文所使用的,术语“TRAIL诱饵受体“指可结合TRAIL并且,一旦结合TRAIL,不会活化肿瘤细胞中程序化细胞死亡(凋亡)的蛋白质。因此,认为TRAIL诱饵受体起程序化细胞死亡信号抑制剂而不是传感器的作用。TRAIL诱饵受体的某些非限定性实例包括常称作TRAIL-R3(也称作DcR1,TRID,LIT或TNFRSF10c)[(Pan等,Science,276:111-113(1997)Sheridan等,Science,277:818-821(1997);McFarlane等,J.Biol.Chem.,272:25417-25420(1997);Schneider等,FEBS Letters,416:329-334(1997);Degli-Esposti等,J.Exp.Med.,186:1165-1170(1997);和Mongkolsapaya等,J.Immunol.,160:3-6(1998)](SEQ ID NO:44),TRAIL-R4(也称作DcR2,TRUNDD和TNFRSF10d)(SEQ IDNO:45),[Marsters等,Curr.Biol.,7:1003-1006(1997);Pan等,FEBSLetters,424:41-45(1998);Degli-Esposti等,Immunity,7:813-820(1997)]和循环骨保护素(也称作OPG,TNFRSF11b)(SEQ ID NO:46)中的任何受体蛋白,所述文献均通过引用全部并入本文。
使用术语“TRAIL受体激动剂”或“激动剂”最广泛的含义,并且其中包括在体外、原位或体内,部分或全部增强、刺激或活化DR4和DR5及其生物活性变体的一种或多种生物活性的任何分子。这种生物活性的实例包括凋亡以及文献中进一步报道的活性。激动剂可以以直接或间接的形式起作用。例如,”TRAIL死亡受体激动剂“可以通过直接结合DR4或DR5,其可引起受体活化或信号转换,在体外、原位或体内,部分或全部增强、刺激或活化DR4和DR5的一种或多种生物活性。TRAIL受体激动剂包括本文定义的TRAIL多肽以及可结合TRAIL受体的、不被当作TRAIL多肽的多肽;例如,使用本文所述方法特异性结合TRAIL死亡受体但不结合TRAIL诱饵受体的多肽。
如本文所使用的,术语“结合成员”指彼此之间有结合特异性的分子对中的成员。结合对的成员可以天然产生或者全部或部分合成产生。分子对中的一个成员有表面区域或凹陷处,可结合并因此与分子对中另一个成员的特定空间和极性组织互补。因此分子对成员可以彼此特异性结合。
在本发明的各个方面,TRAIL死亡受体的结合成员是TRAIL受体激动剂。这些成员包括本文所述TRAIL多肽,以及包括TRAIL多肽和多聚(例如,三聚)结构域的多肽,和包括多聚结构域和非TRAIL多肽的多肽,但是其可结合并刺激TRAIL死亡受体,如本文所进一步描述的。在其它方面,本发明的多肽结合TRAIL死亡受体,但不是受体的激动剂。
如本文所使用的,术语“多聚结构域”表示氨基酸序列,其包含能和两个或多个其它氨基酸序列形成三聚物或其它多聚复合物的功能。在一个实例中,多肽包含氨基酸序列-“三聚结构域”-其与两个其它三聚结构域形成三聚复合物。三聚结构域能联合相同氨基酸序列的其它三聚结构域(同三聚体),或不同氨基酸序列的三聚结构域(异三聚体)。这种相互作用可能是由于三聚结构域组分之间的共价键合以及氢键力、疏水力、范德华力和盐桥而引起的。在本发明的各个实施方案中,多聚结构域是二聚化结构域、三聚结构域、四聚化结构域、五聚化结构域等。这些结构域能形成本发明的两个、三个、四个、五个或多个多肽的多肽复合物。
本发明的多肽的三聚结构域可以来自美国专利申请公开No.2007/0154901(‘901申请)中所述的四联蛋白,其通过引用全部并入本文。本文中以SEQ ID NO:100提供成熟人四联蛋白单链多肽序列(参见,例如,表1)。四联蛋白三聚结构域的实例包括SEQ ID NO:1的氨基酸17至49、17至50、17至51和17-52,其代表由人四联蛋白基因的外显子2编码的氨基酸,和可选地由所述基因的外显子3编码的前一个、两个或三个氨基酸。其它实例包括氨基酸1至49、1至50、1至51和1至52,其代表所有外显子1和2,和可选地由所述基因的外显子3编码的前一个、两个或三个氨基酸。可替换地,在三聚结构域中仅包括外显子1编码的部分氨基酸序列。具体地,三聚结构域的N-端可以在SEQ ID NO:1的残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17的任何位置开始。在具体的实施方案中,N端是I10或V17,并且C-端是Q47、T48、V49、C(S)50、L51或K52(根据SEQ ID NO:1编号)。此外,图3A-3D提供多种人四联蛋白三聚结构域的可能的截短型变体。
在本发明的一个方面,三聚结构域是包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的四联蛋白三聚结构元件(“TTSE”),其为四联蛋白家族三聚结构元件的保守序列,US 2007/00154901中有更完整的描述,其通过引用全部并入本文。如图2所示,TTSE环抱着四联蛋白的蛋白家族天然产生成员的变体,和具体地,氨基酸序列经过修正不会对TTSE形成α螺旋卷曲螺旋三聚体的能力产生任何实质的负面影响的变体。在本发明的各个方面,根据本发明的三聚多肽包括作为三聚结构域的TTSE,其与SEQ ID NO:10的保守序列具有至少66%的氨基酸序列同一性;例如与SEQ ID NO:1的保守序列具有至少73%,至少80%,至少86%或至少92%的序列同一性(仅计算确定(不包括X)残基)。即,SEQID NO:1中确定的氨基酸中至少一个,至少两个,至少三个,至少四个,或至少五个可以被取代。
在一个具体的实施方案中,SEQ ID NO:63在位置50(C50)处的半胱氨酸可以有利地突变为丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或任何其它氨基酸残基,以避免形成不理想的链间二硫桥,其会产生不理想的多聚。其它已知的变体包括选自第6、21、22、24、25、27、28、31、32、35、39、41和42个(根据SEQ ID NO:63编号)的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基,其可以由任何非螺旋阻断的氨基酸残基取代。这些残基已经表现出不会直接参与分子间的相互作用,所述相互作用可以稳定本体四联蛋白单体的三个TTSE之间的三聚复合物。在图2所示的一个方面,TTSE具有分子式为a-b-c-d-e-f-g(N至C)的重复的七肽重复序列,其中残基a和d(即,位置26、33、37、40、44、47和51)可以是任何疏水氨基酸(根据SEQ ID NO:1编号)。
在进一步的实施方案中,TTSE三聚结构域可以通过掺入聚组氨酸序列和/或蛋白酶裂解位点,例如,血凝因子Xa或颗粒酶B(参见US2005/0199251,其通过引用并入本文),并通过包括C-端KG或KGS序列而修正。此外,为了帮助纯化,位置2的脯氨酸可以用甘氨酸取代。
TTSE截短型和变体的具体的非限定性实例如图3A-3D所示。此外,已知多个与人四联蛋白的三聚结构域具有实质相似性(大于66%)的三聚结构域。
表1
已知可三聚的其它人多肽包括:
US 6,190,886中公开了三聚结构域的另一个实例(通过引用并入本文),其描述了包含胶凝素颈区的多肽。然后在合适的条件下可以用三个包含胶凝素颈区氨基酸序列的多肽形成三聚体。鉴定了多个胶凝素,包括:
人SP-D的胶凝素颈区:
VASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK[SEQ ID NO:]
牛SP-D的胶凝素颈区:
VNALRQRVGILEGQLQRLQNAFSQYKK[SEQ ID NO:]
大鼠SP-D的胶凝素颈区:
SAALRQQMEALNGKLQRLEAAFSRYKK[SEQ ID NO:]
牛胶固素的胶凝素颈区:
VNALKQRVTILDGHLRRFQNAFSQYKK[SEQ ID NO:]
牛胶凝素的胶凝素颈区:
VDTLRQRMRNLEGEVQRLQNIVTQYRK[SEQ ID NO:]
人SP-D的颈区:
GSPGLKGDKGIPGDKGAKGESGLPDVASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKKVELFPGGIPHRD[SEQ ID NO:]
MBP三聚结构域的其它实例在PCT申请序列号No.US08/76266,公开号为WO 2009/036349中描述,其通过引用全部并入本文。这个三聚结构域甚至可以进一步低聚,并产生更高级的多聚复合物。
在本上下文中,“三聚结构域”能与其它相似或相同的三聚结构域相互作用。相互作用的类型可产生三聚蛋白或多肽。这种相互作用可以由三聚结构域组分之间的共价键合以及通过氢键力、疏水力、范德华力和盐桥而引起。三聚结构域的三聚效应由卷曲螺旋结构引起,所述结构与其它两个三聚结构域的卷曲螺旋结构相互作用,形成三重α螺旋卷曲螺旋三聚体,其即使在相对较高的温度仍然稳定。在各个实施方案中,复合物在至少60℃稳定,例如在某些实施方案中至少70℃稳定。
术语“C型类凝集素蛋白”和“C型凝集素”用于指存在于任何真核生物物种的基因组中或其中编码的任何蛋白,所述蛋白包含一个或多个CTLD,或者一个或多个属于CTLD亚组的结构域,CRD,其结合碳水化合物配体。定义特异性地包括附着C型类凝集素蛋白和C-型凝集素的膜,“可溶”C-型类凝集素蛋白和缺乏功能性跨膜结构域的C-型凝集素和变体C-型类凝集素蛋白和C-型凝集素,所述变体中一个或多个氨基酸残基在体内通过糖基化或任何其它合成后修饰而改变,定义还包含通过C-型类凝集素蛋白和C-型凝集素的化学修饰而获得的任何产物。
CTLD由约120个氨基酸残基组成,并且,独特地,包含两个或三个链内二硫桥。虽然不同蛋白的CTLD之间氨基酸序列水平的相似性相对较低,但是已发现很多CTLD的3D结构都高度保守,结构变异性基本限定在所谓的环区域,经常由最多五个环限定。几种CTLD包含一个或两个钙的结合位点,并且大多数与钙相互作用的侧链都位于环区域。
根据已提供3D结构信息的CTLD,推测典型的CTLD通过以β1、α1、α2、β2、β3、β4和β5的顺序出现的七个主要的二级结构元件(即五个β-链和两个α-螺旋)而结构表征。图4阐述了十种C-型凝集素已知的三维结构的CTLD比对。在所有3D结构已经确定的CTLD中,β-链排列为两个不平行的β-折叠,一个包含β1和β5,另一个包含β2、β3和β4。另一个β-链,β0,经常在β1之前,并且如果存在,会与β1、β5-折叠相互作用形成另外一条链。此外,在至今为止鉴别的所有CTLD中都发现了两个二硫桥,一个连接α1和β5(CI-CIV),一个连接β3和连接β4和β5的多肽片段(CII-CIII)。此外,图5显示了来自人四联蛋白和9个其它四联蛋白或四联蛋白类多肽的CTLD的比对。
在CTLD 3D-结构中,这些保守的二级结构元件形成多个环的紧密骨架,其在本上下文中都被称作“环-区域”,由核心突出。在CTLD的一级结构中,这些环组成两个区段,环区段A、LSA,和环区段B、LSB。LSA代表连接β2和β3的长多肽区段,其经常缺乏常规的二级结构,并且包含多达四个环。LSB代表连接β-链β3和β4的多肽区段。LSA中的残基,以及β4中的单个残基,表现出可说明几种CTLD中的Ca2+-和配体-结合位点,包括四联蛋白中的位点。例如,突变研究,包括一个或几个残基的取代,表明CTLD结构域可以接受结合特异性、Ca2+-灵敏性和/或亲和性的变化。已知多个CLTD,包括下述非限定性实例:四联蛋白、胰腺石蛋白、小鼠巨噬蛋白半乳糖凝集素、Kupffer细胞受体、鸡神经聚糖、perlucin、唾液酸糖蛋白受体、软骨蛋白多糖核心蛋白、IgE Fc受体、胰腺炎相关蛋白、小鼠巨噬蛋白受体、自然杀伤细胞组、肝细胞生长因子、因子IX/X结合蛋白、甘露糖结合蛋白、牛胶固素、牛CL43、胶凝素肝1、表面活性剂蛋白A、表面活性剂蛋白D、e-选择素、截短c-型凝结素、CD94 NK受体结构域、LY49A NK受体结构域、鸡肝凝结素、鲑鱼c-型凝结素、HIV gp 120-结合c-型凝结素,和树突细胞免疫受体。参见美国专利公开No.2007/0275393,其通过引用全部并入本文。
表达方式“有效量”指本发明两种死亡受体激动剂中的一种或两种和细胞毒性或免疫抑制剂的量,其同时或顺序施用时,可有效预防、改善或治疗目的疾病或病症。在具体的实施方案中,有效量是死亡受体激动剂或死亡受体结合剂,和细胞毒性或免疫抑制剂组合足以增强或者增加细胞凋亡倾向性(比如协同地),减小肿瘤体积,或延长患有癌症或免疫相关疾病的哺乳动物存活期的量。
“治疗剂”指细胞毒性剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、免疫刺激剂,和/或生长抑制剂。
如本文在辅助治疗中所使用的,术语“免疫抑制剂”指可用于抑制或屏蔽本文所治疗的哺乳动物免疫系统的物质。这包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自抗原表达,或者屏蔽MHC抗原的物质。这种抑制剂的实例包括但不限于2-氨基-6-芳基-5-取代嘧啶(参见美国专利No.4,665,077);非甾体抗炎药物(NSAID);咪唑硫嘌呤;环磷酰胺;溴麦角隐亭;达那唑;氨苯砜;戊二醛(其屏蔽MHC抗原,如美国专利No.4,120,649所述);MHC抗原和MHC片段的抗独特性抗体;环孢菌素A;甾体如糖皮质激素,例如,强的松、甲基强的松龙、地塞米松和氢化可的松;甲氨蝶呤(口服或皮下);而羟氯喹;柳氮磺胺吡啶;来氟米特;细胞因子或细胞因子受体拮抗剂,包括抗-干扰素-γ(IFN-γ)、-β或-α抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(因福利美或阿达木单抗)、抗TNFα免疫粘附素(依那西普)、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体;抗LFA-1抗体,包括抗CD11a和抗CD18抗体;抗L3T4抗体;异源抗淋巴细胞球蛋白;pan-T抗体,优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体;包含LFA-3结合结构域的可溶肽(1990年7月26日公布的WO 90/08187);链激酶;TGF-β;链球菌去氧核糖核酸酶;宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脱氧格埃林;雷帕霉素;T-细胞受体(Cohen等,美国专利No.5,114,721);T-细胞受体片段(Offner等,Science,251:430-432(1991);WO 90/11294;Janeway,Nature,341:482(1989);和WO 91/01133);和T-细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9。
如本文所使用的,术语“细胞毒性剂”指可抑制或避免细胞的功能和/或引起细胞分解的物质。该术语意欲包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素),化学治疗剂和毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素,或其片段)。
“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂如噻替派和环磷酰胺;烷基磺酸盐如白消安,英丙舒凡和嗪消安;氯杂环丙烷如benzodopa,卡波醌,meturedopa和uredopa;乙烯亚胺和methylamelamines,包括六甲蜜胺,三乙撑蜜胺,三乙撑磷酰胺,三乙烯硫代磷酰胺和trimethylolomelamine;acetogenin(特别是泡番荔枝辛和bullatacinone);喜树碱(包括合成类似物拓扑替康);苔藓虫素;callystatin;CC-1065(包括其阿多来新,卡折来新和比折来新合成类似物);cryptophycin(具体为cryptophycin 1和cryptophycin 8);海兔毒素;duocarmycin(包括合成类似物,KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素;pancratistatin;sarcodictyin;软海绵素;氮芥如苯丁酸氮芥,萘氮芥,cholophosphamide,雌莫司汀,异环磷酰胺,二氮甲基二乙胺,氧化二氯甲基二乙胺氢氯化物,美法伦,新恩比兴,苯介胆甾醇,泼尼氮芥,曲膦胺,尿氮芥;nitrosurea如卡莫司汀,氯脲霉素,福莫斯汀,环己亚硝脲,嘧啶亚硝脲和雷莫司汀;抗生素如烯二炔抗生素(例如,加里刹霉素,特别是加里刹霉素γ11和加里刹霉素ω11(参见,例如,Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994));dynemicin,包括dynemicin A;双磷酸盐,比如氯膦酸盐,埃斯培拉霉素;以及新制癌菌素发色团和相关的发色团烯二炔抗生素发色团),aclacinomysins,放线菌素,authramycin,重氮丝氨酸,争光霉素,放线菌素(cactinomycin),carabicin,洋红霉素,嗜癌素,chromomycinis,放线菌素D,道诺霉素,地托比星,6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸,阿霉素(包括吗啉代-阿霉素,cyanomorpholino-阿霉素,2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素),表柔比星,依索比星,伊达比星,麻西罗霉素,丝裂霉素如丝裂霉素C,霉酚酸,诺加霉素,橄榄霉素,培洛霉素,potfiromycin,嘌呤霉素,三铁阿霉素,罗多比星,链黑菌素,链脲菌素,杀结核菌素,乌苯美司,新制癌菌素,佐柔比星;抗代谢产物如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU);叶酸类似物如二甲叶酸,甲氨蝶呤,蝶罗呤,三甲曲沙;嘌呤类似物如氟达拉滨,6-巯嘌呤,硫咪嘌呤,硫鸟嘌呤;嘧啶类似物如环胞苷,阿扎胞苷,6-氮杂尿苷,卡莫氟,阿糖胞苷,二脱氧尿苷,去氧氟尿苷,依诺他滨,氟尿苷;雄性激素如卡普睾酮,曲他雄酮丙酸酯,环硫雄醇,美雄烷,睾内酯;抗肾上腺素如氨鲁米特,米托坦,曲洛斯坦;叶酸补充物如frolinic acid;醋葡醛内酯;醛磷酰胺配糖;氨基酮戊酸;恩尿嘧啶;安吖啶;bestrabucil;比生群;edatraxate;defofamine;秋水仙胺;地吖醌;elfornithine;伊力醋铵;埃博霉素;依托格鲁;硝酸镓;羟基脲;香菇多糖;lonidainine;maytansinoid如美登素和安丝菌素;米托胍腙;米托蒽醌;mopidanmol;nitraerine;喷司他丁;重氨氮芥;吡柔比星;洛索蒽醌;podophyllinic acid;2-ethylhydrazide;甲基苄肼;多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.);雷佐生;利索新;西佐喃;锗螺胺;细交链孢菌酮酸;三亚胺醌;2,2′,22″-三氯三乙胺;单端孢霉烯(特别是T-2毒素,verracurin A,杆胞菌素A和anguidine);乌拉坦;长春地辛;达卡巴嗪;甘露醇氮芥;二溴甘露醇;二溴卫矛醇;胍血生;gacytosine;阿拉伯糖苷(″Ara-C″);环磷酰胺;噻替派;紫杉烷,例如,紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.),无蓖麻油ABRAXANETM紫杉醇、铝改造纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和doxetaxel(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France);chloranbucil;吉西他滨;6-硫鸟嘌呤;巯嘌呤;甲氨蝶呤;铂类似物如顺铂和卡铂;长春花碱;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞滨;米托蒽醌(novantrone);替尼泊苷;依达曲沙;正定霉素;氨蝶呤;希罗达;伊班膦酸钠;CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类维生素A如视黄酸;卡培他滨和医药可接受的盐,酸或上述任何的衍生物。定义中还包括蛋白酶体抑制剂如硼替佐米(Velcade),BCL-2抑制剂,IAP拮抗剂(例如,Smac mimics/xIAP和cIAP抑制剂如某些肽,嘧啶化合物如(S)-N-{6-苯[1,3]二氧-5-基-1-[5-(4-氟-苯基)-吡啶-3-基甲基]-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基}-2-甲基胺-丙酰胺,xIAP反义),HDAC抑制剂(HDACI)和激酶抑制剂(索拉非尼)。
本定义还包括抗激素剂,其用于调节或抑制激素对肿瘤的作用,比如抗-雌性激素和选择性雌性激素受体调节剂(SERM),包括,例如,他莫昔芬(包括他莫昔芬),雷洛昔芬,屈洛昔芬,4-羟基他莫昔芬,曲沃昔芬,keoxifene,LY117018,奥那斯酮和法乐通-托瑞米芬;可抑制芳香化酶的芳香化酶抑制剂,其调节肾上腺中雌性激素的产生,比如,例如,4(5)-咪唑,安鲁米特,醋酸甲地孕酮,依西美坦,formestanie,法倔唑,伏氯唑,来曲唑和阿那曲唑;和抗-雄激素如氟他胺,尼鲁米特,比卡鲁胺,亮丙瑞林和戈舍瑞林;以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,具体为可抑制abherant细胞增殖中包括的信号途径中基因表达的那些,比如,例如,PKC-α,Ralf和H-Ras;核酶如VEGF表达抑制剂(例如,核酶)和HER2表达抑制剂;疫苗如基因治疗疫苗,例如,疫苗,疫苗和疫苗;rIL-2;拓扑异构酶1抑制剂;rmRH和医药上可接受的盐、酸或上述任何的衍生物。
“生长抑制剂”在本文中用于指可在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此,生长抑制剂是可显著降低在S期过度表达这种基因的细胞百分比的抑制剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞循环进程(在S期之外)的抑制剂,比如诱导G1捕获和M-期捕获的抑制剂。传统的M-期阻断剂包括长春花(长春新碱和长春花碱),taxol和topoII抑制剂如阿霉素,表柔比星,道诺霉素,依托泊苷和争光霉素。可捕获G1的抑制剂还可进入S-期捕获,例如,DNA烷化剂如三苯氧胺、强的松、达卡巴嗪,二氯甲基二乙胺,顺铂,甲氨蝶呤,5-氟脲嘧啶和ara-C。可以在Murakami等.The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohnand Israel,eds.,Chapter 1,entitled″Cell cycle regulation,oncogenes,andantineoplastic drugs″(WB Saunders:Philadelphia,1995,pg.13)中找到进一步的信息。
还包括可诱导细胞压力的试剂,如精氨酸耗尽剂如精氨酸酶。
还包括靶向抗体如美罗华。此外,TRAIL激动剂和阿司匹林和NFkB途径抑制剂的组合物有益。
如本文所使用的,“协同活性”,“协同”,“协同效应”表示使用TRAIL死亡受体激动剂和治疗剂时效应(1)大于单独(或单个)应用TRAIL死亡受体激动剂或治疗剂时实现的效应和(2)大于TRAIL死亡受体激动剂或治疗剂的效应总和(加合)。这种协同或协同效应可以通过各种本领域已知的方法确定。例如,TRAIL死亡受体激动剂和治疗剂的协同效应可以在检查肿瘤细胞数或肿瘤质量的降低时在体外或体内测试形式中观察到。
术语“凋亡”和“凋亡活性”使用广义,指哺乳动物中细胞死亡的有序或受控形式,其伴有一种或多种特征性细胞变化,包括细胞质压缩,细胞膜微绒毛丢失,核分裂,染色体DNA降解或线粒体功能丧失。这种活性可以使用公知的领域方法确定和测定,例如,通过细胞活性测试,FACS分析或DNA电泳,膜联蛋白V的结合,DNA破碎,细胞收缩,内质网扩张,细胞破碎,和/或膜囊泡的形成(称作凋亡体)。
术语“癌症”、“癌性”和“恶性”指或描述哺乳动物的生理状况,其通常由不受调控的细胞生长所表征。癌症的实例包括但不限于,癌,包括腺癌,淋巴癌,胚细胞瘤,黑素瘤,肉瘤,和白血病。这种癌的更具体的实例包括鳞状细胞癌,小细胞肺癌,非小细胞肺癌(NSCLC),肠癌,霍奇金和非霍奇金淋巴瘤,胰腺癌,恶性胶质瘤,胶质瘤,宫颈癌,卵巢癌,肝癌如肝癌和肝细胞瘤,膀胱癌,乳癌,结肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜癌,骨髓瘤(如多发性骨髓瘤),唾腺癌,肾癌如肾细胞癌和维尔姆斯瘤,基底细胞癌,黑素瘤,前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌,睾丸癌,食道癌和各类头部和颈部癌症。
术语“免疫相关疾病”表示疾病或病症中哺乳动物免疫系统组分可引起、调节或促进哺乳动物中发病率。还包括其中免疫响应的刺激或干涉对于疾病进程有改善作用的疾病。本术语还包括自免疫疾病,免疫调节炎症,非免疫调节炎症,传染病和免疫缺陷疾病。免疫相关和炎症疾病的实例,其中一些为免疫或T细胞介导,其能根据本发明治疗,包括全身性红斑狼疮,风湿性关节炎,青少年慢性关节炎,脊椎关节病,系统性硬化(硬皮病),先天炎症肌肉疾病(皮肌炎,多肌炎),干燥综合症,全身性血管炎,肉状瘤病,自免疫溶血性贫血(免疫全血细胞减少症,突发夜间血红蛋白尿),自免疫血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜,免疫介导血小板减少症),甲状腺炎(Grave疾病,桥本氏甲状腺炎,青少年淋巴细胞甲状腺炎,萎缩甲状腺炎),糖尿病,免疫介导肾脏疾病(血管球性肾炎,小官间质性肾炎),中枢和周边神经系统的脱髓鞘疾病如多发性硬化,先天脱髓鞘多神经病或格林-巴利综合症,如慢性炎症脱髓鞘多神经病,肝胆疾病如感染性肝炎(肝炎A,B,C,D,E和其它非亲肝病毒),自免疫慢性活动性肝炎,初级胆汁性肝硬化,和硬化性胆道炎,炎症性和纤维化肝病,如炎症性肠胃疾病(溃疡性结肠炎:克罗恩病),谷蛋白-灵敏的肠下垂和惠普耳氏病,自免疫或免疫调节皮肤病包括打泡皮肤病,多形性红斑和接触性皮炎,牛皮癣,变态反应病如哮喘,过敏性鼻炎,过敏性皮肤炎,食物过敏和荨麻疹,肺部的免疫疾病如嗜暑红肺炎,先天肺纤维化和过敏性肺炎,移植相关疾病,包括移植排斥和移植-对-宿主-疾病,传染病包括AIDS(HIV感染),肝炎A,B,C,D和E,细菌感染,真菌感染,原生动物感染和寄生虫感染。
“B-细胞恶性肿瘤”是包括B细胞的恶性肿瘤。实例包括霍奇金氏病,包括淋巴系统为主型霍奇金氏病(LPHD);非霍奇金氏淋巴瘤(NHL);滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤;急性淋巴细胞白血病(ALL);慢性淋巴细胞白血病(CLL);毛细胞白血病;浆细胞样淋巴细胞淋巴瘤;套细胞淋巴瘤;AIDS或HIV相关淋巴瘤;多发性骨髓瘤;中枢神经系统(CNS)淋巴瘤;移植后淋巴组织增生障碍(PTLD);巨球蛋白血症(淋巴浆细胞性淋巴瘤);粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和边缘区域淋巴瘤/白血病。
非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)包括,但不限于,低级/滤泡NHL,复发或难治性NHL,一线低级NHL,III/IV期NHL,化学疗法相关NHL,小淋巴细胞(SL)NHL,中级/滤泡NHL,中级扩散性NHL,扩散性大细胞淋巴瘤,侵袭性NHL(包括侵袭性一线NHL和侵袭性复发NHL),自体干细胞移植后复发或难治性NHL,高级免疫母细胞NHL,高级淋巴母细胞NHL高级小非开裂细胞NHL,肿块性病变NHL等。
肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)是在肿瘤细胞中产生的分子,其能触发宿主中的免疫响应。尽管表达水平不同,但在肿瘤和正常细胞中均发现了肿瘤相关抗原,然而肿瘤特异性抗原专一地由肿瘤细胞表达。肿瘤细胞表面展示的TAA或TSA包括但不限于甲胎蛋白,癌胚抗原(CEA),CA-125,MUC-1,磷脂酰肌醇聚糖-3肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72),上皮肿瘤抗原,酪氨酸酶,黑素瘤相关抗原,MART-1,gp100,TRP-1,TRP-2,MSH-1,MAGE-1、-2、-3、-12,RAGE-1,GAGE1-、-2,BAGE,NY-ESO-1,β-连环蛋白,CDCP-1,CDC-27,SART-1,EpCAM,CD20,CD23,CD33,EGFR,HER-2,乳房肿瘤相关抗原BTA-1和BTA-2,RCAS1(SiSo细胞上表达的受体结合癌症抗原),PLACenta-特异性1(PLAC-1),多配体聚糖,MN(gp250),个体基因型等。肿瘤相关抗原还包括血型抗原,例如,Lea,Leb,LeX,LeY,H-2,B-1,B-2抗原(参见本文结尾处的表XX)。理想地,就本发明而言,TAA或TSA靶标在结合时不内在化。
下面详细描述本发明,在一个方面,本发明涉及包含三聚结构域的非天然多肽,其包括可结合至少一个TRAIL死亡受体的至少一个多肽结合成员。根据本发明,结合成员可以连接至多聚结构域的N-或C-端氨基酸残基。此外,在某些实施方案中,可以有利地将结合成员连接至单体的多聚结构域的N-端和C-端,并且由此提供包含六个能结合TRAIL死亡受体的结合成员的多聚多肽复合物。本发明的多肽是非天然多肽,例如,三聚结构域和结合TRAIL死亡受体的多肽序列的融合蛋白。非天然多肽也可以是天然多肽,其中天然产生的氨基酸序列已经通过氨基酸的加入、删除或取代而改变。这种多肽的实例包括具有C-型类凝集素结构域(CTLD)的多肽,其中结构域的一个或多个环区域已经如本文所述而修饰。天然产生的TRAIL死亡受体不是本发明范畴内的非天然多肽。在本发明的这个方面,所述三聚结构域不是能获得自结合TRAIL死亡受体的天然产生多肽,和与所述多肽有实质相似性的序列。在本发明的其它方面,所述结合至少一个TRAIL死亡受体的多肽是结合死亡受体的天然多肽的片段或变体,其中当天然产生多肽、变体或片段融合至多聚结构域时,融合蛋白不再是天然产生多肽。因此,本发明不排除天然发生多肽,其片段或变体作为本发明融合蛋白的一部分。
在本发明的各个方面,多聚结构域是三聚结构域,如本文所述的非限定性实例。
在本方面的实施方案中,多肽与激活肿瘤细胞凋亡的TRAIL死亡受体结合。在一个实施方案中,多肽与TRAIL-R1(DR4)(SEQ ID NO:42)或TRAIL-R2(DR5)(SEQ ID NO:43)或其保守取代变体结合。在具体的实施方案中,多肽非特异性结合至少一个TRAIL诱饵受体。
在各个方面,单体多肽包括至少两个区段:能与其他多聚结构域形成多聚复合物的多聚结构域,和结合至少一个TRAIL死亡受体的多肽序列。结合TRAIL死亡受体的序列可以在结构域的N-端、C-端或同时在N-和C-端与多聚结构域融合。
在一个实施方案中,结合TRAIL-R1(DR4)(SEQ ID NO:42)或TRAIL-R2(DR5)(SEQ ID NO:43)的第一多肽在三聚结构域的N-端和C-端之一融合,并且结合TRAIL-R1(DR4)(SEQ ID NO:42)或TRAIL-R2(DR5)(SEQ ID NO:43)的第二多肽在三聚结构域的N-端和C-端中的另一端融合。
在进一步的实施方案中,第一和第二多肽均可结合TRAIL-R1(DR4)(SEQ ID NO:42)或者第一和第二多肽均可结合TRAIL-R2(DR5)(SEQ ID NO:43)。在更进一步的实施方案中,第一多肽结合TRAIL-R1(DR4)(SEQ ID NO:42),并且第二多肽结合TRAIL-R2(DR5)(SEQ IDNO:43)。由于对于同时表达DR4和DR5的一些患者和表达一个或另一个的其它患者之间产生差异表达,所以可靶向两种受体的双特异性分子的优势是具有更大的效能和覆盖范围。此外,理想的是,双特异性分子通过在分子两端的肿瘤细胞特异性结合而产生超聚类,即,在两个方向上介导的超聚类效应。
因为TRAIL受体在人组织间表达得相对广泛,所以本发明的另一个方面包括具有多肽的三聚结构域,所述多肽可在结构域的一端(N-端或C-端之一)结合DR4或DR5,和可在另一端(N-端或C-端中的另一端)结合肿瘤相关(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)的多肽。可结合TAA或TSA的结构域可以是肽,比如CTLD,单链抗体,或者可特异性结合目的靶标的任何类型结构域。在这些情况下,通过多个三聚复合物结合指定肿瘤细胞表面的TAA或TSA,并与附近的另一个肿瘤细胞相互作用而介导超聚类,可促进凋亡的、针对靶标的激动剂活性显著增强。此外,肿瘤特异性肽结合结构域能将药物(与三聚复合物结合)指向肿瘤位置,从而使肿瘤杀灭活性更特异,并且能通过改善肿瘤特异性而改善靶标停留时间。与抗体相比,由于尺寸更小(~70kD vs150kD)而提高了肿瘤穿透性,以及由于亲和力(极为贴近的三个结合臂vs.两个)而改进了靶标停留时间,其预期能提供额外的效率和安全优势。
在一个具体的方法中,可以通过在可改进聚类(通过在三聚结构域的第二末端上的肿瘤特异性多肽而介导)的三聚结构域的一端设计具有弱激动剂活性的分子而降低对正常组织产生毒性的潜在风险,所述弱激动剂活性通过DR4-或DR5-结合多肽介导。在各个方面,多肽结合死亡受体的亲和力低于TAA或TSA。更特别地,多肽结合TAA或TSA的活性比多肽结合死亡受体的亲和力高至少2倍,例如,2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、15、20、50和100倍。
对于肿瘤抗原-靶向位点的更高的亲和力还可能通过在结合TRAIL受体和TAA或TSA靶向剂时防止TRAIL-受体内在化而增强效力。类似地,组合疗法或死亡受体激动剂和防止内在化的试剂如氯丙嗪的化学连接,能增强TRAIL受体激动剂的效力(参见,Zhang,等,Mol.Cancer Res.(2008)6:1861-72)。
在一个方面,本发明涉及可结合一个或多个TRAIL死亡受体但不是受体的激动剂的多肽。结合DR4/DR5但缺少激动剂活性的多肽可用于传送负荷从而杀死癌细胞。将DR4/DR5受体内在化(Kohlhaas,J BiolChem.2007 Apr 27;282(17):12831-41)。
此外,通过在三聚结构域的一端提供具有DR4或DR5激动剂的双特异性分子,并在三聚结构域的另一端提供TNF受体激动剂、FN14激动剂、FAS受体激动剂、LIGHT受体激动剂,靶向与TRAIL受体协同工作的死亡受体,可以增强TRAIL受体激动剂的效力。(参见本文结尾处的表XX)。
用于具有TRAIL受体-结合多肽和TAA或TSA靶向剂的三聚复合物的适应症包括非小细胞肺癌(NSCLC),结肠直肠癌,卵巢癌,肾癌,胰腺癌,恶性毒瘤,非霍奇金淋巴瘤(NHL),多发性骨髓瘤,乳癌,前列腺癌,黑素瘤,恶性胶质瘤,成神经细胞瘤。
此外,尽管正常细胞为在细胞表面显示磷脂酰丝氨酸,但是凋亡中的细胞会在表面将磷脂酰胆碱翻转为磷脂酰丝氨酸。因此,通过磷脂酰丝氨酸结合剂可以靶向凋亡细胞。磷脂酰丝氨酸结合剂包括但不限于抗体,抗体片段,如,例如Burtea等(Mol Pharm.2009 Sept.10[published online ahead of print])所述的CTLD或肽。在一端为具有DR4和/或DR5激动剂活性的分子,另一端为磷脂酰丝氨酸靶向肽,这将实现DR激动剂更好的肿瘤靶向,以及可能通过交联而增强效力。
在另一个方面,CTLD的环区域中包含可特异性结合TRAIL死亡受体的多肽。多肽可以是TRAIL多肽,或者可以是如本文所述鉴定的序列,但是不是天然产生的TRAIL序列或其片段,并且不是本文所述的TRAIL多肽。在这个方面,CLTD的环区域包含序列,并且将CTLD在结构域的N-端或C-端直接或者通过适当接头与三聚结构域融合。此外,本发明的多肽可以包括第二CLTD结构域,在N-端和C-端的另一端融合。在本方面的变化中,多肽包括可在三聚结构域的一端结合TRAIL死亡受体和在另一端结合CLTD的多肽。一个、两个或三个多肽可以是三聚复合物的一部分,所述复合物最多包含TRAIL死亡受体的六个特异性结合成员。
本发明的多肽在本体TRAIL序列或随机序列中包括一个或多个氨基酸突变,其对于DR4受体或DR5受体有选择性结合亲和力,但是不是TRAIL诱饵受体。在另一个实施方案中,TRAIL变体或随机序列对于DR4和DR5均有选择性结合亲和力,但不是TRAIL诱饵受体。在各种实施方案中,序列选择性地结合DR4,但不结合DR5和诱饵受体。在类似的实施方案中,序列结合DR5,但不结合DR4和诱饵受体。
可结合一个或多个TRAIL死亡受体的多肽序列能具有对DR4和/或DR5的结合亲和力,其与本体TRAIL对死亡受体的亲和力大致相等。在某些实施方案中,本发明的多肽对一个或多个TRAIL死亡受体的结合亲和力大于本体TRAIL对相同的TRAIL死亡受体的结合亲和力。
在一个方面,本发明的TRAIL死亡受体激动剂对于DR4和DR5受体有选择性。例如,当与本体序列TRAIL相比,这种结合成员对DR4或DR5受体的结合亲和力大约相等(不变)或更大(增加),并且与本体序列TRAIL相比,结合成员对诱饵受体的结合亲和力小于或几乎消除时,就本文而言,认为结合成员的结合亲和力对于DR4或DR5受体有“选择性”。在另一个实例中,结合成员对于死亡受体的亲和力小于TRAIL对相同受体的亲和力,但是如果对于死亡受体的亲和力大于对于诱饵受体的亲和力,仍然认为结合成员是有选择性的。与诱饵受体相比,本发明优选的DR4和DR5选择性激动剂与死亡受体的结合亲和力至少高5倍,优选至少高10倍,并且与诱饵受体相比,甚至更优选地,与死亡受体的结合亲和力至少高100倍。结合成员对于DR4和DR5可以有不同的结合亲和力。
可以确定激动剂各自的结合亲和力,并通过本领域已知的ELISA、RIA和/或BIAcore方法,与本体TRAIL,或其部分的结合性质比较。本发明优选的DR4和DR5选择性激动剂将在至少一种类型的哺乳动物细胞(例如,癌细胞)中诱导凋亡,并且这种凋亡活性可以通过已知的本领域方法如阿拉玛蓝或晶体紫方法确定。
在一个实施方案中,TRAIL死亡受体激动剂包含抗体或抗体片段。在本上下文中,使用“抗体”描述天然或部分或全部合成产生的免疫球蛋白。因为可以以多种方式修饰抗体,所以术语“抗体”应理解为涵盖对于需要的受体特异性具有结合结构域的任何特异性结合成员或物质。因此,这个术语涵盖抗体片段,抗体的衍生物、功能性等同物和相似物,包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽,无论天然或全部或部分合成的。因此包括包含免疫球蛋白结合结构域的嵌合分子,或者相当地,包含与另一个多肽融合的分子。术语还涵盖具有结合结构域的任何多肽或蛋白,所述结构域是抗体结合结构域,或者与其相似,例如,抗体模拟物。这些可以由天然来源衍生,或者可以部分或全部地合成生产。抗体的实例是免疫球蛋白同型和它们的同型亚类;包含抗原结合结构域如Fab,Fab′,F(ab′)2,scFv,Fv,dAb,Fd的片段;和抗体。
在另一个方面,本发明涉及三个多肽的多聚复合物,每个多肽包含多聚结构域和至少一个可结合至少一个TRAIL死亡受体的多肽。在实施方案中,多聚复合物包含具有多聚结构域的多肽,所述结构域选自与人四联蛋白三聚结构元件,包括甘露糖结合蛋白(MBP)三聚结构域的其它人三聚多肽,胶凝素颈区多肽,和其它多肽具有实质相似性的多肽。多聚复合物可以包含本发明的任何多肽,其中多聚复合物的多肽包含能彼此关联形成多聚体的多聚结构域。因此,在一些实施方案中,多聚复合物是由具有相同氨基酸序列的多肽组成的均多聚复合物。在其它实施方案中,多聚复合物是由具有不同氨基酸序列的多肽组成的异多聚复合物,比如,不同的多聚结构域,和/或不同的可结合TRAIL死亡受体的多肽。在这种实施方案中,可特异性结合TRAIL死亡受体的多肽可以靶向至相同的TRAIL死亡受体。在其它实施方案中,可特异性结合TRAIL死亡受体的多肽靶向至不同的TRAIL死亡受体,例如,DR4和DR5。因此,在某些实施方案中,多聚复合物包含本发明的多肽,其中每个多肽包含至少一个可结合DR4的多肽,其中DR4结合多肽可以相同或不同,和/或至少一个可结合DR5的多肽,其中DR5-结合多肽可以相同或不同。
此外,在一个方面,本发明涉及用于制备可诱导细胞凋亡的多肽的方法,所述细胞表达TRAIL的至少一个死亡受体,包括:(a)选择可特异性结合DR4或DR5之一但不结合TRAIL诱饵受体的第一多肽;(b)将第一多肽转移至四联蛋白CTLD的一个或两个环区域中,形成第一结合确定因子或者直接将多肽与TTSE融合(c)将第一CTLD与四联蛋白三聚结构元件的N-端或C-端之一融合。在这个方面的另一个实施方案中,方法进一步包含(a)选择可经过选择特异性结合DR4和DR5中相对于第一多肽为另一个的第二多肽;(b)将第二多肽转移至四联蛋白CTLD的环区域,形成第二结合确定因子或者直接将多肽与TTSE融合;和(c)将第二CTLD与四联蛋白多聚结构元件的N-端或C-端的另一端融合。
四联蛋白CTLD有多达五个环区域,其中可以插入TRAIL死亡受体的结合成员。因此,当本发明的多肽包括CTLD时,多肽可以具有多达四个通过CTLD附着于三聚结构域的TRAIL死亡受体的结合成员。每个结合成员可以相同或不同,并且可以是DR4或DR5,或者两者的激动剂。
在本发明的多肽的其它方面,受体激动剂可以与三聚结构域的一端结合,并且一个或多个治疗剂可以与第二端结合。实际可以直接或通过合适的接头,如本领域技术人员所理解的结合。这种试剂在与激动剂相同的凋亡途径中作用,或者可以以不同的途径治疗癌症和其它病症。此外,这种试剂可以上调DR4和DR5表达。除了结合至多肽端点之一,但是试剂可以通过与三聚结构域中侧链相结合或者通过结合半胱氨酸残基而与三聚结构域共价结合。将试剂与模块共价耦合的其它方法也可以如US 6,190,886中所述使用,所述文献通过引用并入本文。
对于TRAIL死亡受体具有特异性的多肽序列的鉴别
在一个方面,TRAIL死亡受体的特异性结合成员可以通过选择特异性结合受体的文库成员而由多肽随机文库获得。已知很多展示推定配体结合位点的表型的系统。这些包括:噬菌体展示(例如丝状噬菌体fd[Dunn(1996),Griffiths和Duncan(1998),Marks等(1992)],λ噬菌体[Mikawa等(1996)]),在真核病毒上展示(例如杆状病毒[Ernst等(2000)]),细胞展示(例如在细菌细胞[Benhar等(2000)],酵母细胞[Boder和Wittrup(1997)],和哺乳动物细胞[Whitehorn等(1995)]上展示,核糖体连接展示[Schaffitzel等(1999)],和质粒连接展示[Gates等(1996)]。
此外,US2007/0275393,其通过引用全部并入本文,专门描述了实现用于产生CLTD文库的展示系统的过程。通常的过程包括(1)如果提供了相关信息,则通过参照所选CTLD的3D结构鉴别环区域的位置,或者,如果没有,通过与已知序列的序列比对,在由鉴别对应于β2和β3保守序列元件的序列元件和上文也已公开的β4-链特征而进一步确证的辅助下,鉴别β2、β3和β4链的序列位置;(2)在蛋白展示载体系统中亚克隆编码所选CTLD的核苷酸片段,之前插入或未插入接近编码β2、β3和β4的核酸内切酶限制性位点;和(3)用组的随机选择成员取代编码所选CTLD的部分或全部环区域的核苷酸片段,所述组由多个核苷酸片段组成,其中的核苷酸片段在插入编码接收框架的核苷酸背景中将用随机选择的核苷酸片段取代编码原始环区域多肽片段的核苷酸片段。每个克隆的核苷酸片段,其编码替代原始环区段或全部环区域的新多肽,将在新序列背景中的阅读框内解码。
可以形成复合物,用作均-三聚蛋白,经由TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)受体发出信号,诱导凋亡。因为通过TRAIL配体进行的这些受体的三聚涉及死亡-诱导信号复合物(DISC)的形成和之后凋亡信号通路的完全诱导,所以人四联蛋白的三聚结构代表独特的理想骨架,在其中可以用能结合TRAIL-R1和TRAIL-R2受体并诱导受体三聚和激动剂活性的成员构建文库。然而必须首先鉴别具有TRAIL受体结合活性的肽。为此,可以使用具有已知结合活性的肽或通过从展示文库筛选而鉴别的其它新肽。可以使用很多不同的展示系统,比如但不限于噬菌体、核糖体和酵母展示。
为了选择具有结合活性的新肽,可以构建文库并首先筛选结合TRAIL受体的单体元件,作为单个单体CTLD结构域,或者在噬菌体表面展示各个肽。一旦已经鉴别了具有TRAIL受体结合活性的序列,这些序列将移植到人四联蛋白的三聚结构域上,产生能结合三聚复合物中三个受体的可能的蛋白药物,诱导激动剂活性(凋亡)。
在构建这些噬菌体展示文库和三聚结构域构建体中可以使用四种主要的策略。第一种策略是构建和/或使用随机肽噬菌体展示文库。单独在噬菌体颗粒表面展示构建为含二硫环的随机线性肽和/或随机肽,并通过噬菌体展示“淘选”而筛选与期望TRAIL受体结合的成员。在获得具有TRAIL受体结合活性的肽克隆后,这些肽将移植到人四联蛋白的三聚结构域上或进入CTLD结构域的环,然后移植到三聚结构域上并筛选激动剂活性。
构建噬菌体展示文库和三聚结构域构建体的第二种策略包括获得CTLD来源的连接肽。可以通过将噬菌体表面展示的人四联蛋白CTLD骨架中五个不同环的一个或多个中氨基酸随机化而构建文库。可以通过噬菌体展示淘选而筛选与TRAIL受体的结合。在获得包含证明具有TRAIL受体结合活性的肽环的CTLD克隆后,这些CTLD克隆之后将移植到人四联蛋白的三聚结构域并筛选激动剂活性。
构建噬菌体展示文库和三聚结构域构建体的第三种策略包括使用具有结合TRAIL受体能力的已知序列,并将其直接移植到人四联蛋白的三聚结构域,并筛选激动剂活性。
第四种策略包括使用具有已知的结合TRAIL受体能力的肽序列,并首先通过用肽两侧的随机氨基酸或/或肽中的随机选择内部氨基酸建立新文库而提高结合能力,然后通过噬菌体展示筛选更好的结合。获得亲和力更好的连接肽后,这些肽的连接肽移植到人四联蛋白的三聚结构域并筛选激动剂活性。在这种方法中,如下构建原始文库:在噬菌体颗粒表面展示的游离肽,第一种策略(上文),或者如上所述的第二种策略中在CTLD骨架中包含环。在获得亲和力更好的连接肽后,将这些肽移植到人四联蛋白的三聚结构域并筛选激动剂活性。
可以使用三聚结构域的截短型,其或者在N-端去除多达16个残基(V17),或者改变C-端。称作Trip V[SEQ ID NO:],Trip T[SEQ IDNO:],Trip Q[SEQ ID NO:]和Trip K[SEQ ID NO:](见图3)的截短型变体在三聚结构域上独特呈现CTLD结构域。TripK变体是最长的构建体,在CTLD和三聚结构域之间包含最长而且最灵活的接头。Trip V,Trip T,Trip Q直接在三聚模块上呈现CTLD分子的融合,而没有任何结构灵活性,但是将第1/3个CTLD分子由TripV变成TripT和由TripT变成TripQ。这是由于这些氨基酸中每个都位于α-螺旋转弯处并且需要3.2aa形成完整转弯。在第一、第三和第四种策略中选择用于连接的游离肽可以移植到任何上述形式的三聚结构域。然后筛选获得的融合体,看肽和方向的哪种组合得到最好的活性。四联蛋白CTLD环中包含的用于筛选结合的肽能移植到全长三聚结构域。
更具体地,下面描述四种策略。尽管这些策略集中在噬菌体展示上,但是可以使用鉴别多肽的其它等同方法。
策略1
市场销售肽展示文库试剂盒如,但不限于,New England BiolabsPh.D.噬菌体展示肽文库试剂盒,并且可以购买用于筛选具有TRAIL受体结合活性的新肽。有三种形式的New England Biolabs试剂盒可供使用:包含长7个氨基酸的线性随机肽的Ph.D.-7肽文库试剂盒,文库大小为2.8x109个单独克隆,包含以长7个氨基酸的随机肽的二硫限定环构建的肽的Ph.D.-C7C二硫限定肽文库试剂盒,文库大小为1.2x109个单独克隆,和包含长12个氨基酸的线性随机肽的Ph.D.-12肽文库试剂盒,文库大小为2.8x109个单独克隆。
可以用包含与这些试剂盒相似的随机氨基酸的肽从头构建可替换的相似文库。使用NNK或NNS策略产生用于构建的随机核苷酸,其中N代表四种核苷酸碱基A、C、G和T的等量混合物。K代表G或T的等量混合物,而S代表G或C的等量混合物。这些随机位置可以克隆在噬菌体或噬菌粒展示载体系统中的GeneIII蛋白上。NNK和NNS策略均覆盖所有20种可能的氨基酸和一个终止密码子,编码氨基酸的效率略有不同。因为细菌转化效率的限制,噬菌体展示产生的文库大小的数量级如上文所述,因此可以产生包含多达7个随机氨基酸位置的肽,并包含全部理论组合(207=1.28x109)。可以使用NNK或NNS策略构建更长的肽文库,但是由于细菌转化的要求,实际噬菌体展示文库的大小可能不包含与这种长度有关的所有可能的理论氨基酸组合。
因此当需要更大/更长的随机肽时,核糖体展示文库是有益的。对于二硫限定文库,使用相似的NNK或NNS随机核苷酸策略。然而,这些随机位置两侧为半胱氨酸残基,可以形成二硫桥。N端的半胱氨酸前面经常会加上另一个氨基酸如丙氨酸。此外,由(但不限于)几个甘氨酸残基组成的灵活接头可以作为肽和任何上述随机肽文库的gene III蛋白之间的间隔区。
策略2
图1和4中所示人四联蛋白CTLD包含五个环(LSA中的四个环和包含LSB的一个环),其能改变,使CTLD结合不同的蛋白靶标。可以在这些环的一个或多个环中放置随机氨基酸序列,产生文库,从中可以筛选具有理想结合性质的CTLD结构域。可以使用策略1中所述的NNK或NNS完成在人四联蛋白CTLD五个环中任何或所有环中含有随机肽的文库的构建。下面给出一个方法实例,通过所述方法可以将七个随机肽插入TN CTLD的环1中。
可以使用下述引物进行片段A的PCR:正向oligoF1(5’-GCC CTCCAGACG GTC TGC CTGAAG GGG-3’;SEQ ID NO:),其结合CTLD的N端;反向oligo R1(5’-GTT GAG GCC CAG CCA GAT CTC GGCCTC-3’;SEQ ID NO:49),其结合环1的5’DNA序列。使用正向oligoF2(5’-GAG GCC GAG ATC TGG CTG GGC CTC AAC NNK NNKNNK NNK NNK NNK NNK TGG GTG GAC ATG ACC GGC GCG CGCATC-3’;SEQ ID NO:)和反向引物R2(5’-CAC GAT CCC GAA CTGGCA GAT GTA GGG-3’;SEQ ID NO:)产生片段B。正向引物F2包含与引物R1互补的5’-末端,并用随机氨基酸取代环1的前7个氨基酸,而且包含可结合环1最后一个氨基酸及其3’序列的3’末端,而反向引物R2与CTLD序列末端互补并与其结合(参见图6)。可以使用高保真聚合酶或taq混合和标准PCR热循环条件进行PCR。然后凝胶分离片段A和B,之后将其混合,使用如上所述的引物R1和R2进行重叠延伸PCR。用限制性酶Bgl II和PstI消化可以分离包含TN CTLD的环的片段,并且之后可以连接到包含如下所示融合至Gene III的限制修饰CTLD的噬菌体展示载体(如CANTAB 5E)中,所述载体相似地用Bgl II和Pst I消化以进行克隆(参见图7)。
可以用随机化氨基酸替换,与如上所示过程相似地进行其它环的修饰。用随机化氨基酸替换环中的确定氨基酸不受任何特定环所限,也不受环的初始大小所限。类似地,不需要环的全部替换,任何环都可能进行部分替换。在某些例子中,环内一些初始氨基酸的保留,比如图4中所示的钙配位氨基酸,可能是理想的。在这些例子中,可以用随机化氨基酸替换环内的少量氨基酸,以保留钙配位氨基酸,或者可以在环中加入额外的随机化氨基酸,以增加环的整体大小,并仍然保留这些钙配位氨基酸。通过将环区域如环1和2或环3和4并入一个更大的替换环,可以容纳并测试非常大的肽。此外,其它CTLD,比如但不限于MBL CTLD,可以用于替代四联蛋白的CTLD。可以使用与上述方法相似的方法将肽移植到这些CTLD中。
在本发明的各个示例方面中,基于CTLD骨架,使用组合肽文库和编码文库多肽的核酸序列文库可以鉴别可结合TRAIL死亡受体的多肽,其中已经根据多个示例方案修饰了多肽的CTLD,其经过标记,可以仅进行方案(a)-(g)的鉴别:
(a)CTLD环区段A(LSA)中四个环中至少一个环的一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包括环1中至少一个氨基酸的插入和环1中至少五个氨基酸的随机取代;
(b)CTLD环区段A(LSA)中四个环中至少一个环的一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包括环1中至少五个氨基酸的随机取代,和环2中至少三个氨基酸的随机取代;
(c)CTLD环区段A(LSA)中四个环中至少一个环的一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包括环1中至少七个氨基酸的随机取代和环4中至少一个氨基酸的随机取代;
(d)CTLD环区段A(LSA)中四个环中至少一个环的一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包括环1中至少五个氨基酸的插入和环3中至少三个氨基酸的随机取代;
(e)CTLD环区段A(LSA)中四个环中至少一个环的一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包括将两个环合并为一个环的修饰,其中两个合并的环是环3和环4;
(f)CTLD环区段A(LSA)中四个环中至少一个环的一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包括环4中至少一个氨基酸插入,和环4中至少三个氨基酸取代;
(g)CTLD环区段A(LSA)和环区段B(LSB)的五个环中至少一个环的一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包括环3中五个氨基酸残基的随机取代,和环5中至少三个氨基酸的随机取代。
因此,在一个方面,本发明涉及多肽成员的组合多肽文库,所述多肽成员包含修饰的C型凝集素结构域(CTLD),其中修饰的CTLD包括在LSA中四个环的至少一个或者在CTLD的LSB环(环5)有一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包含环1中至少一个氨基酸的插入和环1中至少五个氨基酸的随机取代。
在这个方面的实施方案中,组合文库中的CTLD来自人四联蛋白,CTLD还有精氨酸-130的随机取代。对于非人四联蛋白CTLD的CTLD,这个肽紧邻C-端方向中环2的C-端肽。例如,在小鼠四联蛋白中,这个肽是Gly-130。在这个方面的实施方案中,组合文库中的CTLD来自人或小鼠四联蛋白,CTLD包括环4中赖氨酸-148到丙氨酸的取代。在这个方面的某些实施方案中,组合文库包含环1的两个氨基酸插入,环1中至少五个氨基酸的随机取代,精氨酸-130或C-端方向环2外或紧邻环2的其它氨基酸的随机取代,和环4中赖氨酸-148到丙氨酸的取代。
在一个方面,本发明涉及多肽成员的组合多肽文库,所述多肽成员包含修饰的C型凝集素结构域(CTLD),其中修饰的CTLD包括在CTLD的环区段(LSA)中四个环的至少一个有一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包含环1中至少五个氨基酸的随机取代,环2中至少三个氨基酸的随机取代,和精氨酸-130或C-端方向环2外或紧邻环2的其它氨基酸的随机取代,和环4中赖氨酸-148到丙氨酸的取代。
在一个方面,本发明涉及多肽成员的组合多肽文库,所述多肽成员包含修饰的C型凝集素结构域(CTLD),其中修饰的CTLD包括在CTLD的环区段(LSA)中四个环的至少一个有一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包含环1中至少七个氨基酸的随机取代和环4中至少一个氨基酸的插入。
在这个方面的实施方案中,组合文库进一步包含环4中至少两个氨基酸的随机取代。在某些实施方案中,组合文库包含环1中至少七个氨基酸的随机取代,环4中三个氨基酸的插入,和环4中至少两个氨基酸的随机取代。
在一个方面,本发明涉及多肽成员的组合多肽文库,所述多肽成员包含修饰的C型凝集素结构域(CTLD),其中修饰的CTLD包括在CTLD的环区段(LSA)中四个环的至少一个有一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包含环3中至少六个氨基酸的随机取代,例如3、4、5、6或更多,和,可选地,环4中赖氨酸-148到丙氨酸的取代。
在一个方面,本发明涉及多肽成员的组合多肽文库,所述多肽成员包含修饰的C型凝集素结构域(CTLD),其中修饰的CTLD包括在CTLD的环区段(LSA)中四个环的至少一个有一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包含环3中至少一个氨基酸插入和环3中至少三个氨基酸的随机取代和环4中赖氨酸-148到丙氨酸的取代。
在一个方面,本发明涉及多肽成员的组合多肽文库,所述多肽成员包含修饰的C型凝集素结构域(CTLD),其中修饰的CTLD包括在CTLD的环区段(LSA)中四个环的至少一个有一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包含环3中至少一个氨基酸插入和环3中至少六个氨基酸的随机取代和环4中赖氨酸-148到丙氨酸的取代。
在这个方面的实施方案中,组合文库进一步包含环4中至少一个氨基酸插入。在某些实施方案中,组合文库进一步包含环4中至少三个氨基酸的随机取代。在某些实施方案中,组合文库包含环3中的三个氨基酸插入。在某些实施方案中,组合文库进一步包含环4中的三个氨基酸插入。
在一个方面,本发明涉及多肽成员的组合多肽文库,所述多肽成员包含修饰的C型凝集素结构域(CTLD),其中修饰的CTLD包括在CTLD的环区段(LSA)中四个环的至少一个有一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包含将两个环合并为一个环的修饰,其中两个合并的环是环3和环4。
在本方面的一个实施方案中,组合文库包含序列NWEXXXXXXXXGGXXXN(SEQ ID NO:),其中X是任何氨基酸并且其中氨基酸序列由合并和修饰的环3和环4形成单个环。
在一个方面,本发明涉及多肽成员的组合多肽文库,所述多肽成员包含修饰的C型凝集素结构域(CTLD),其中修饰的CTLD包括在CTLD的环区段(LSA)中四个环的至少一个有一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包含环4中至少一个氨基酸的插入,和环4中至少三个氨基酸的随机取代。
在本方面的一个实施方案中,组合文库包含环4中四个氨基酸的插入,和环4中至少三个氨基酸的随机取代。在组合文库包含环4区域一个或多个氨基酸修饰(单独或者与CTLD其它区域的修饰组合)的实施方案中,可以设计修饰以保持、调节或消除CTLD的金属离子-结合亲和力。这种修饰能影响CTLD的血纤维蛋白溶酶原-结合活性(参见,例如,Nielbo,等,Biochemistry,2004,43(27),pp 8636-8643;或Graversen 1998)。
在进一步的实施方案中,CTLD环区域能延伸为下述非限定性实例中详细阐述的示例性构建体。指定文库中四个LSA环和LSB环(环5)的任何进一步修饰可以包含一个或多个氨基酸修饰(例如,通过插入、延伸或随机化)。因此,在各个实施方案的任何方案中,修饰的CTLD还包含对于LSB环区域的一个或多个氨基酸修饰,单独或者与来自(LSA)的环区域(环1-4)的任何一个、两个、三个或四个组合。
在一个方面,本发明涉及多肽成员的组合多肽文库,所述多肽成员包含修饰的C型凝集素结构域(CTLD),其中修饰的CTLD包括在CTLD的环区段(LSA)中四个环的至少一个有一个或多个氨基酸修饰,和环区段B(LSB,或环5)中一个或多个氨基酸修饰,其中一个或多个氨基酸修饰包含LSB氨基酸残基的随机化。
在这个方面的一个实施方案中,组合文库包含修饰的环3和修饰的环5区域,其中修饰的环3区域包含五个氨基酸残基的随机化,并且修饰的环5区域包含三个氨基酸残基的随机化。在一个实施方案中,组合文库包含修饰的环3,修饰的环5区域,和修饰的环4区域,其中对环4的修饰消除了血纤维蛋白溶酶原结合。在一个实施方案中,对环4的修饰包含赖氨酸148的取代。
根据本文所述的各个实施方案,来自CTLD区域的任何两个、三个、四个或五个环可以包含一个或多个氨基酸修饰(例如,对两个环区域、三个环区域、四个环区域或全部五个环区域的随机氨基酸修饰的任何随机组合)。修饰的CTLD文库可以进一步包含对LSA或LSB区域之外的CTLD区域的额外氨基酸修饰,比如在α-螺旋和β-链(参见,例如,图4)。
在某些实施方案中,重组的CTLD文库可以进行体细胞高变(参见,例如,美国专利公开2009/0075378,其通过引用并入本文)DNA改组,通过随机破碎(Stemmer,PNAS 1994)、环改组、环步移、易错PCR突变和其它本领域已知方法产生序列多样性,从而产生具有最优结合活性的分子。在进一步的实施方案中,重组CTLD文库可以可选地在环区域中保留某些Ca2+整合氨基酸,和/或可以消除血纤维蛋白溶酶原结合活性(见下文)。
策略3
已经鉴别了对TRAIL受体具有结合活性的多个肽。与受体形成的复合物中TRAIL配体的晶体结构已经鉴别了参与结合作用的氨基酸序列(S.G.Hymowitz,等,1999;Sun-Shin Cha等,2000)。此外,肽和抗体(其结合DR5受体)的序列分析已经鉴别了共有的三肽基序(B.Li等,2006)。这些肽可以作为游离线性肽或含二硫环,使用胱氨酸直接克隆至三聚结构域的N或C端。也可以将能结合TRAIL受体的单链抗体或结构域抗体克隆到三聚结构域的任一端。此外,可以将具有已知结合性质的肽直接克隆到TN CTLD的任一个环区域中。作为含二硫环或抗体的互补确定区域的肽可以非常容易地重新安置到人四联蛋白的CTLD的环区域中。对于所有这些构建体,之后在与三聚结构域融合时可以进行测试单体的结合,以及三聚体的结合和拮抗活化。
策略4:
在某些情况下,具有结合活性的肽的直接克隆可能不充分,需要进一步的优化和筛选。例如,已知可与TRAIL受体结合的肽,比如但不限于上述肽,可以移植进入人四联蛋白的CTLD中。为了筛选这些肽结合的最优结果,可以将侧翼氨基酸的一个或多个随机化,然后进行结合筛选的噬菌体展示。此外,单独表现出有限或弱结合的肽还可以移植进入包含另一个额外环的随机化的CTLD文库的一个环中,然后也通过噬菌体展示筛选更好的结合和/或特异性。此外,对于通过晶体结构鉴别的肽,其中已知特异性相互作用/结合氨基酸,可以尝试非结合氨基酸的随机化,然后通过噬菌体展示筛选更好的结合和受体特异性。还可以跨种属研究已鉴别为负责结合的TRAIL配体的区域。可以保留保守的氨基酸,测试非种属保留位置的随机化和筛选。
治疗方法
另一个方面,本发明涉及诱导表达DR4和DR5中至少一个的肿瘤细胞的凋亡的方法。方法包括用本发明的死亡受体激动剂接触细胞,其中包括三聚结构域和可特异性结合至少一个TRAIL死亡受体的至少一个多肽。在本方面的一个实施方案中,方法包含用本发明的三聚复合物接触细胞。在本发明的各个方面中,蛋白和复合物诱导依赖半胱天冬酶以及不依赖半胱天冬酶的凋亡。
在另一个方面,本发明涉及通过施用治疗有效量的死亡受体激动剂而治疗具有肿瘤的受试对象的方法,所述激动剂包括具有三聚结构域和可特异性结合至少一个TRAL死亡受体的至少一个多肽的多肽。在本方面的一个实施方案中,方法包含对受试对象施用本发明的三聚复合物。
本发明的另一个方面涉及组合疗法。本发明还提供包含死亡受体激动剂和治疗剂的制剂。相信这种制剂将特别适用于保存以及治疗施用。可以通过已知技术制备制剂。例如,可以通过在凝胶过滤柱上缓冲液过滤而制备制剂。
本文所述死亡受体激动剂和治疗剂可以用于多种治疗应用。其中的应用是治疗各种癌症的方法。可以根据已知方法施用死亡受体激动剂和治疗剂,比如作为丸剂静脉内施用或者通过一段时间的连续输液,通过肌肉内,腹膜内,脑脊髓内,皮下,关节内,滑液内,囊内,口服,局部用药或吸入途径。可选地,可以使用各种商业提供设备,通过小型泵输液用药。
可以凭经验确定施用死亡受体激动剂的有效剂量和方案,并且这种决定属于本领域的技术。可以使用单一或多剂量。目前认为单独使用的死亡受体激动剂的有效剂量或量可以从约1μg/kg到约100mg/kg体重每天或者更多。可以以本领域已知的方式进行种间剂量的调整,例如,如Mordenti等,Pharmaceut.Res.,8:1351(1991)中所公开的。
在使用死亡受体激动剂的体内用药时,正常剂量值可以在约10ng/kg到多达100mg/kg哺乳动物体重每天或更多的范围内变化,优选约1μg/kg/天到10mg/kg/天,取决于用药途径。文献中提供了对于具体剂量和传递方法的指导[参见,例如,美国专利No:4,657,760;5,206,344;或5,225,212]。一名技术人员将了解不同制剂对于不同的治疗化合物和不同病症有效,其靶向一个器官或组织的用药,例如,可能需要的传递方式与靶向另一个器官或组织的用药不同。本领域的技术人员应理解的是,必须施用的死亡受体激动剂的剂量将随着,例如,接受死亡受体激动剂的哺乳动物,用药途径,和对哺乳动物施用的其它药物或疗法而变化。
期望在方法中使用其它疗法。一种或多种其它疗法可以包括但不限于,放射性疗法、细胞因子、生长抑制剂、化学治疗剂、细胞毒性剂、酪氨酸激酶抑制剂、ras法尼基转移酶抑制剂、血管生成抑制剂和细胞周期素依赖型激酶抑制剂或本领域已知的可增强癌细胞被死亡受体激动剂杀死的感受性的任何其它试剂的施用。
可以根据生产商的说明使用或由技术人员凭经验确定化学治疗剂的制备和剂量使用方案。Chemotherapy Service Ed.,M.C.Perry,Williams & Wilkins,Baltimore,Md.(1992)中也描述了这种化学疗法的制备和剂量使用方案。化学治疗剂可以在Apo2L变体施用之前或者之后,或者可以与其同时施用。
死亡受体激动剂和治疗剂(和一种或多种其它疗法)可以同时或顺序施用。在具体的实施方案中,本发明的非天然多肽,或其多聚(例如,三聚)复合物,和治疗剂可以同时施用。在另一个实施方案中,多肽或三聚复合物可以在施用治疗剂之前施用。在另一个实施方案中,治疗剂可以在多肽或三聚复合物之前施用。施用后,可以分析体外处理的细胞。如果进行了体内治疗,经过治疗的哺乳动物可以以技术人员公知的各种方法监控。例如,可以从病理上检查肿瘤组织,检验细胞的死亡,或者对于免疫系统响应,可以分析血清。
药物组合物
在另一个方面,本发明涉及药物组合物,其包含治疗有效量的本发明的多肽,以及医药上可接受的载体或赋形剂。如本文所使用的,“医药上可接受的载体”或“医药上可接受的赋形剂”包括任何和全部溶剂,分散介质,涂层,抗菌和抗真菌剂,等张和吸收延迟剂,和生理相容的类似试剂。医药上可接受的载体或赋形剂的实例包括一种或多种水,盐,磷酸缓冲盐,葡萄糖,甘油,乙醇等及其组合。在很多情况下,优选在组合物中包括等张剂,例如,糖,多醇如甘露醇、山梨醇,或氯化钠。还可以包括医药上可接受的物质如润湿或小量辅助物质如润湿或乳化剂,防腐剂或缓冲液,其可增强抗体或抗体部分的货架期或有效性。可选地,可以包括崩解剂,比如交联聚乙烯吡咯烷酮,琼脂,海藻酸或其盐,比如海藻酸钠等。除了赋形剂,药物组合物可以包括下述的一种或多种,载体蛋白比如血清白蛋白、缓冲液、结合剂、甜味剂和其它香料;着色剂和聚乙二醇。
组合物可以是多种形式,包括,例如,液体,半固体和固体剂型,比如液体溶液(例如可注射和可输液溶液),分散剂或悬浮液,片剂,丸剂,粉剂,脂质体和栓剂。优选的形式取决于意欲施用途径和治疗应用。在一个实施方案中,组合物是可注射或可输液溶液的形式,比如与用抗体对人进行被动免疫所使用的组合物相似的组合物。在一个实施方案中,施用模式为肠胃外(例如,静脉内,皮下,腹膜内,肌肉内)。在一个实施方案中,通过静脉内输液或注射施用多肽(或三聚复合物)。在另一个实施方案中,通过肌肉内或皮下注射施用多肽或三聚复合物。
药物组合物的施用的其它合适途径包括,但不限于,直肠,透皮,阴道,穿粘膜或肠内施用。
治疗组合物通常在生产和储存的条件下无菌并稳定。组合物可以调配为溶液、微乳液、分散液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。可以通过将活性化合物(即多肽或三聚复合物)以需要的量并入合适的溶剂中而制备无菌注射溶液,所述容积包含上面列举的一种成分或成分的组合,根据需要,然后进行过滤除菌。通常,可以通过将活性化合物并入无菌载体而制备分散液,所述载体包含基本分散介质和来自上面列举的其它需要的成分。对于制备无菌注射溶液所用的无菌粉末,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥,获得活性成分粉末加上来自前面其无菌过滤溶液的其它期望成分。可以维持溶液的正确流动性,例如,通过使用涂层如卵磷脂,通过维持分散剂中合适的颗粒大小和通过使用表面活性剂。通过在组合物中包括可推迟吸收的试剂,例如,单硬脂酸盐和明胶,可以实现可注射组合物的延长吸收。
制品如试剂盒,其包含死亡受体激动剂和本文所述病症治疗中有用的治疗剂,至少包含容器和标签。合适的容器包括,例如,瓶,小瓶,注射器和试管。容器可以由多种材料形成,比如玻璃或塑料。容器上或与容器相关的标签标明制剂用于治疗所选择的症状。制品可以进一步包含容器,其包含医药上可接受的缓冲液,比如磷酸缓冲盐、Ringer溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户的角度,可以进一步包括其它期望的材料,包括其它缓冲液,稀释剂,过滤器,针,注射器和带有使用说明的包装衬垫。制品还可以包含容器,其包含如上所述的另一种活性剂。
通常,在制剂中使用合适量的医药上可接受的盐,以赋予制剂等张性。医药上可接受的载体的实例包括盐,Ringer溶液和葡萄糖溶液。制剂的pH优选从6至9,并且更优先从7至7.5。对于本领域技术人员显而易见的是,取决于,例如,施用途径和死亡受体激动剂和治疗剂的浓度,某些载体更优选。
可以通过将具有合适纯度水平的期望分子与可选的医药上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington′s Pharmaceutical Sciences,16thedition,Osol,A.ed.(1980)),以冻干制剂、水溶液或水悬浮液的形式制备治疗组合物。合适的载体、赋形剂或稳定剂优选在使用的剂量和浓度优选对接受者无毒,并且包括缓冲液如Tris,HEPES,PIPES,磷酸盐,柠檬酸盐,和其它有机酸;抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(比如氯化十八烷基二甲基苄基铵;氯化六烃季铵;氯化苯甲烃铵,苄索氯铵;苯酚,丁基或苯基醇;烷基苯甲酸酯如甲基或丙基苯甲酸酯;苯邻二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(小于约10个残基)多肽;蛋白质,比如白蛋白,明胶,或免疫球蛋白;亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸;单糖,二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖或糊精;糖如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇;成盐抗衡离子如钠;和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
这种载体的其它实例包括离子交换剂,铝,硬脂酸铝,卵磷脂,血清蛋白,比如人血清白蛋白,缓冲物质如甘氨酸,山梨酸,山梨酸钾,饱和植物脂肪酸的部分甘油化混合物,水,盐,或电解质如硫酸鱼精蛋白,磷酸氢二钠,磷酸氢钾,氯化钠,硅胶,三硅酸镁,聚乙烯吡咯烷酮,和纤维素基物质。局部或基于凝胶形式的载体包括多糖如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素,聚乙烯吡咯烷酮,聚丙烯酸酯,聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-嵌段共聚物,聚乙二醇,和木蜡酒精。这种形式包括,例如,微胶囊,纳米胶囊,脂质体,膏药,吸入剂形式,鼻喷雾,舌下片,和缓释制剂。
体内使用的制剂应该无菌。这可以通过在冷冻干燥和复水重构之前或之后,由无菌过滤膜过滤而容易地实现。如果全身施用,制剂可以以冻干形式或溶液储存。如果是冻干形式,通常与其它成分组合配制,在使用时与合适的稀释剂重构。液体制剂的实例是装在单剂量小瓶中用于皮下注射的无菌、透明、无色、未加防腐剂的溶液。
治疗制剂通常放在容器中,所述容器具有无菌开口,例如,具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。制剂优选反复静脉内(i.v)、皮下(s.c)、肌肉内(i.m.)注射或输液施用,或者作为适合鼻内或肺内传递(肺内传递参见,例如,EP 257,956)的喷雾制剂施用。
本文公开的分子还能以缓释制备物的形式施用。缓释制备物的合适实例包括包含蛋白质的固体疏水聚合物的半渗透基质,所述基质为成形材料,例如,膜,或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯,水凝胶(例如,Langer等,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982)所述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)),聚交酯(美国专利No.3,773,919,EP 58,481),L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(Sidman等,Biopolymers,22:547-556(1983)),不可降解乙烯-乙酸乙烯酯(Langer等,见上文),可降解乳酸-乙醇酸共聚物如Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球),和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
多肽的产生
通过在可表达多肽的条件下培养用编码多肽的载体转化的宿主,可以在任何合适的标准蛋白表达系统中表达本发明的多肽。优选地,表达系统时期望的蛋白易于分离的系统。通常,可以使用原核表达系统,因为可以获得高产量的蛋白并有有效的纯化和再折叠策略。因此,合适的表达系统(包括载体和细胞类型)的选择属于本领域技术人员的常识。类似地,一旦选择了本发明多肽的一级氨基酸序列,本领域普通技术人员可以容易地设计合适的重组DNA构建体,其将编码期望的氨基酸序列,此时需考虑下述因素,如选择宿主的密码子偏好性,是否需要宿主中分泌信号序列,在信号序列中导入蛋白酶分解位点,等等。
在一个实施方案中,分离的多核苷酸编码特异性结合TRAIL死亡受体和三聚结构域的多肽。在一个实施方案中,分离的多核苷酸编码特异性结合TRAIL死亡受体的第一多肽,特异性结合TRAIL死亡受体的第二多肽,和三聚结构域。在某些实施方案中,特异性结合TRAIL死亡受体(或第一多肽和第二多肽)和三聚结构域的多肽在一个连续多核苷酸序列中编码(基因融合)。在其它实施方案中,特异性结合TRAIL死亡受体(或第一多肽和第二多肽)和三聚结构域的多肽由不连续的多核苷酸序列编码。因此,在一些实施方案中,特异性结合TRAIL死亡受体(或特异性结合TRAIL死亡受体的第一多肽和第二多肽)和三聚结构域的至少一个多肽作为单独的多肽和与本发明多肽融合在一起的形式表达、分离并纯化。
这些重组DNA构建体可以插入适合于所选宿主的多个表达载体中任何载体中的阅读框内。在某些实施方案中,表达载体包含控制重组多肽构建体表达的强启动子。在使用重组表达策略产生本发明的多肽时,可以使用本领域公知的标准程序分离和纯化获得的多肽,并且可选地进行进一步的处理如冷冻干燥。
标准技术可用于重组DNA分子、蛋白和多肽的产生,以及组织培养和细胞转化。参见,例如,Sambrook,等.(下文)或Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等,eds.,Green Publishers Inc.and Wiley andSons 1994)。通常根据生产商的说明进行纯化技术,或者使用传统程序如本领域通常实现的进行纯化,比如Sambrook等(Molecular Cloning:ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY(1989)中提出的技术,或本文所述的技术。除非特别说明,本文所述的与实验室程序联合使用的名词,和与分子生物学、生物化学、分析化学和药物/制剂化学相关的技术是本领域公知并且常用的。标准技术可用于生物化学合成、生物化学分析、药物制备、制剂和传递,和患者的治疗。
应理解的是,灵活的分子连接肽可以可选地插入特定的结合成员和三聚结构域之间,或者与其共价交联。在某些实施方案中,连接肽是约1-20个氨基酸残基的多肽序列。连接肽可以小于10个氨基酸,更优选地,5、4、3、2或1个氨基酸。在某些情况下,9、8、7或6个氨基酸是合适的。在有用的实施方案中,连接肽必需地是非免疫原性的,不易蛋白分解并且不包含已知可与其它残基(例如胱氨酸残基)相互作用的氨基酸残基。
下面的描述还涉及产生多肽和共价附着于(后文称作“共轭结合”)至一个或多个化学基团的三聚复合物的方法。适用于这种共轭结合的化学基团优选没有显著的毒性或免疫原性。化学基团可选地经过选择产生能储存并在适合于储存的条件下使用的共轭结合物。可与多肽共轭结合的多种示例性化学基团在本领域中已知,并且包括例如碳水化合物,比如在糖蛋白、聚谷氨酰胺和不含蛋白聚合物如多醇上天然产生的碳水化合物(参见,例如,美国专利No.6,245,901)。
例如,多醇,可以在一个或多个氨基酸残基与本发明的多肽共轭结合,包括赖氨酸残基,如WO 93/00109,见上文中公开的。使用的多醇可以是任何水溶性的聚(环氧烷烃)聚合物并且具有线性链或支链。合适的多醇包括在一个或多个羟基位置用化学基团取代的多醇,如用具有一个和四个碳之间的烷基基团取代。通常,多醇是聚(烷烃二醇),比如聚(乙二醇)(PEG),并且,因此,为了易于描述,讨论的其它部分涉及示例性实施方案,其中使用的多醇为PEG,并且将多醇共轭结合至多肽的过程称作“聚乙二醇化”。然而,本领域的技术人员可识别能使用本文所述用于PEG的共轭结合技术使用其它多醇如聚(丙二醇)和聚乙-聚丙二醇共聚物。
Apo2L的聚乙二醇化中使用的PEG的平均分子量可变,并且通常在约500至约30,000道尔顿(D)的范围内变化。优选地,PEG的平均分子量从约1000至约25000 D,并且更优选地从约1000至约5000 D。在一个实施方案中,用平均分子量约1000 D的PEG进行聚乙二醇化。可选地,PEG均聚物未取代,但是也可以在烷基基团的一端取代。优选地,烷基基团是C1-C4烷基基团,并且最优选甲基基团。PEG制备物商业有售,并且通常地,适用于本发明的那些PEG制备物是根据平均分子量销售的非均一制备物。例如,商业提供的PEG(5000)制备物通常包含分子量略有不同的分子,经常是±500 D。本发明的多肽能进一步使用本领域已知的技术修饰,比如,共轭结合至小分子化合物(例如,化学治疗剂);共轭结合至单个分子(例如,荧光团);共轭结合至特定结合对的分子(例如,生物素/链霉亲和素,抗体/抗原);或通过糖基化、PEG化而稳定,或者进一步融合至稳定结构域(例如,Fc结构域)。
本领域已知各种将蛋白聚乙二醇化的方法。产生共轭结合至PEG的蛋白的具体方法包括美国专利No.4,179,337,4,935,465和5,849,535中所述的方法。通常,蛋白通过蛋白的一个或多个氨基酸残基共轭结合至聚合物的末端反应活性基团,主要取决于反应条件,聚合物分子量,等等。在本文中具有反应活性基团的聚合物称为活化聚合物。反应活性基团选择性地与蛋白质上游离氨基或其它反应活性基团反应。PEG聚合物可以以随机或位点特异性方式与蛋白上的氨基或其它反应活性基团耦合。然而,应理解的是,为了获得最优的结果,所选的反应活性基团的类型和量,以及使用的聚合物的量,将依赖于使用的具体蛋白或蛋白变体,以避免包含可与蛋白上太多活性基团反应的反应活性基团。因为这不可能完全避免,所以通常推荐使用从约0.1至1000摩尔,优选2至200摩尔活化聚合物每摩尔蛋白,依赖蛋白浓度。活化聚合物每摩尔蛋白的最终量是维持最优活性的平衡量,而同时如果可能的话,优化蛋白的循环半衰期。
在本文中使用时,术语“多醇”广义上指多元醇化合物。多醇可以是任何水溶性的聚(氧化烷烃)聚合物,例如,并且可以包含线性链或支链。优选的多醇包括那些在一个或多个羟基位置用化学基团取代的多醇,比如具有一个和四个碳之间的烷基基团。通常,多醇是聚(烷基二醇),优选聚(乙二醇)(PEG)。然而,本领域的技术人员将识别其它多醇,比如,例如,聚(丙二醇)和聚乙-聚丙二醇共聚物,可以使用本文所述共轭结合至PEG的技术使用。本发明的多醇包括本领域公知的那些和公开提供的,比如来自商业来源。
此外,其它半衰期延长分子可以附着于三聚结构域的N或C端,包括血清白蛋白-结合肽,IgG-结合肽或与FcRn结合的肽。
应注意的是,本文使用的子标题仅用于文本组织的目的,不应以任何限定所述主题的方式理解。本文引用的所有参考文献通过引用全部并入本文。
下述实施例仅用于理解本发明的某些实施方案,并且不应视为对本发明的限定,本发明由所附的权利要求所限定。
实施例
下述实施例中讨论的载体(pANA)来自之前所述载体[参见US2007/0275393]。序列列表中提供了某些载体序列,并且技术人员将能根据本文提供的描述得到载体。pPhCPAN噬菌体展示载体(SEQ ID NO:273)具有通过连接头与编码ALQT的hTN序列融合的gIII信号肽编码序列(等)。CTLD区域的C末端通过连接头融合至gIII区域。在CTLD区域中,产生核苷酸突变,所述突变不改变编码序列,但是产生适合于克隆PCR片段的限制性位点,所述片段包含改变的环区域。去除这些限制性位点之间的部分环区域,从而使所有文库噬菌体只表达重组体但不表达野生型四联蛋白。
实施例1
文库构建:环1的突变和延伸
人四联蛋白的序列和环1、2、3、4(LSA),和5(LSB)的位置如图1和4所示。对于人四联蛋白C-型凝集素结合结构域的1-2个延伸文库(“人1-2X”),修饰环1的编码序列,使其编码表1中所示序列,其中五个氨基酸AAEGT(SEQ ID NO:);人)由核苷酸NNK NNK NNK NNKNNK NNK NNK(SEQ ID NO:)编码的七个随机氨基酸取代;N表示A、C、G或T;K表示G或T。紧跟在环2之后的氨基酸精氨酸也通过使用编码链中的核苷酸NNK完全随机化。随机化这个氨基酸是因为精氨酸接触环1中的氨基酸,并且可能限制由于环1随机化而可获得的构型。此外,改变环4的编码序列,使其编码丙氨酸(A),而不是赖氨酸(K),从而消除血纤维蛋白溶酶原结合,其已经表现为依赖环4赖氨酸(Graversen等,1998)。
表2
来自人和小鼠四联蛋白(TN)的环区域的氨基酸。
括号表示未作为环的一部分考虑的邻近氨基酸。
X=任何氨基酸。
以下述方式使用重叠PCR产生人环1扩展文库(引物序列如表2所示)。混合引物1Xfor(SEQ ID NO:)和1Xrev(SEQ ID NO:)并通过PCR延伸,并且混合引物BstX1for(SEQ ID NO:3)和PstBssRevC(SEQID NO:)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段,混合并在存在外部引物Bglfor12(SEQ ID nO:5和PstRev(SEQ ID NO:)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化,并用BglII和PstI剪切,并克隆进噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中。噬菌体展示载体pPhCPAB来自pCANTAB(Pharmacia),并且包含与M13基因III蛋白融合的部分人四联蛋白CTLD。修饰CTLD区域使其在环1-4的侧翼包括BglII和PstI限制性酶位点,并且改变1-4区域使其包括终止密码子,从而在不连接框内插入时,不会由载体产生功能性基因III蛋白。通过用SEQ IDNO:274(pANA27)的BamHI至ClaI序列替代BamHI至ClaI区域而由pPhCPAB产生pANA27。这样用谷氨酰胺密码子替换了琥珀抑制终止密码子,并且载体包括基因III截短。
将连接的材料转化进电感受态XL-Blue大肠杆菌(Stratagene),四至八升细胞过夜生长,并分离DNA产生用于淘选的主文库DNA储液。获得的文库大小为1.5×108,检查的克隆在靶标区域表现出多样化的序列。
表3
产生噬菌体展示C型凝集素结构域文库中使用的序列。
M=A或C;N=A,C,G或T;K=G或T;S=G或C;W=A或T。
实施例2
文库构建:环1和2的突变
对于人和小鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环1-2文库(“人1-2”),修饰环1的编码序列,使其编码表1中所示序列,其中用由核苷酸编码的五个随机氨基酸NNK NNK NNK NNK NNK((SEQ ID NO:)替代五个氨基酸AAEGT(SEQ ID NO:;人);N表示A、C、G或T;K表示G或T)。在环2中(包括邻近精氨酸),用由核苷酸编码的四个随机氨基酸NNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:)替代人的四个氨基酸TGAR。此外,改变环4的编码序列,使其编码丙氨酸(A),而不是环中的赖氨酸(K),从而消除血纤维蛋白溶酶原结合,其表现为依赖环4赖氨酸(Graversen等,1998)。
以下述方式使用重叠PCR产生人环1扩展文库(引物序列如表2所示)。混合引物1-2for(SEQ ID NO:)和1-2rev(SEQ ID NO:)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段,混合并在存在外部引物Bglfor12(SEQ ID NO:)和PstRev12(SEQ ID NO:)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化,并用BglII和PstI剪切,并克隆进噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中,如上所述。获得的文库大小为4.86×108,并且检查的克隆在靶标区域中表现出具有多样化的序列。
实施例3
文库构建:环1和4的突变和扩展
对于人四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环1-4文库(“人1-4”),修饰环1的编码序列,使其编码表1中所示序列,其中用由核苷酸NNSNNS NNS NNS NNS NNS((SEQ ID NO:)编码的七个随机氨基酸替代七个氨基酸DMAAEGT(SEQ ID NO:)(N表示A、C、G或T;S表示G或C;K表示G或T)。此外,修饰环4的编码序列,使其编码表1中所示序列,其中对人用核苷酸NNS NNS NNS NNS NNS(SEQ ID NO:)编码的五个随机氨基酸,或对小鼠用核苷酸NNK NNK NNK NNKNNK(SEQ ID NO:)编码的五个随机氨基酸,替代五个随机氨基酸。
以下述方式使用重叠PCR产生人环1扩展文库(引物序列如表2所示)。混合引物BglBssfor(SEQ ID NO:)和BssBglrev(SEQ ID NO:)并通过PCR延伸,并且混合引物BssPstfor(SEQ ID NO:)和PstBssRev(SEQ ID NO:)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段,混合并在存在外部引物Bglfor(SEQ ID NO:)和PstRev(SEQ ID NO:)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化,并用BglII和PstI限制性酶剪切,并克隆进相似消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中,如上所述。获得的文库大小为2×109,并且在淘选之前12个检查的克隆在靶标区域中表现出具有多样化的序列。
实施例4
文库构建:环3和4的突变和扩展
对于人四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环3-4文库(“人3-4X”),修饰环3的编码序列,使其编码表1中所示序列,其中在编码链中用由核苷酸NNK NNK NNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:)编码的六个随机氨基酸替代四联蛋白的三个氨基酸EIT(N表示A、C、G或T;K表示G或T)。此外,在环4中,用由核苷酸NNK NNK NNKNNK NNK NNK(SEQ ID NO:)编码的六个随机氨基酸替代三个氨基酸KTE。
以下述方式使用重叠PCR产生人环1扩展文库(引物序列如表2所示)。混合引物H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:)和H Loop 3-4Ext-R(SEQID NO:)并通过PCR延伸,并且混合引物H Loop 3-4 Ext-F(SEQ ID NO:29和H Loop 5-R(SEQ ID NO:)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段,混合并在存在额外的H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:)和H Loop 5-R(SEQ ID NO:)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化,并用BglII和PstI限制性酶剪切,并克隆进相似消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中,如上所述。获得的文库大小为7.9×108,并且检查的克隆在靶标区域中表现出具有多样化的序列。
实施例5
文库构建:环3和4和环间PRO的突变
对于人四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环3-4联合体文库(“人3-4联合体”),修饰环3和4和这两个环之间的脯氨酸的编码序列,使其编码表1中所示序列,其中用13个氨基酸序列XXXXXXXXGGXXX,(SEQ ID NO:)替代人序列TEITAQPDGGKTE(SEQ ID NO:),其中X代表由序列NNK(N代表A、C、G或T;K代表G或T)编码的随机氨基酸。
以下述方式使用重叠PCR产生人环3-4联合体文库(引物序列如表2所示)。混合引物H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:)和H Loop 3-4Combo-R(SEQ ID NO:)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段,混合并在存在额外的H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:)和H Loop 5-R(SEQ IDNO:)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化,并用BglII和PstI限制性酶剪切,并克隆进相似消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中,如上所述。获得的文库大小为4.95×109,并且检查的克隆在靶标区域中表现出具有多样化的序列。
实施例6
文库构建:环4的突变和扩展
对于人和小鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环4扩展文库(“人4”),修饰环4的编码序列,使其编码表1中所示序列,其中在编码链中用由核苷酸NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK((SEQ IDNO:)编码的七个随机氨基酸替代四联蛋白的三个氨基酸KTE;N表示A、C、G或T;K表示G或T。
以下述方式使用重叠PCR产生人环1扩展文库(引物序列如表2所示)。混合引物H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:)和H Loop 3-R(SEQ IDNO:)并通过PCR延伸,并且混合引物H Loop 4 Ext-F(SEQ ID NO:)和H Loop 5-R(SEQ ID NO:)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段,混合并在存在额外的H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:)和H Loop 5-R(SEQID NO:)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化,并用BglII和PstI限制性酶剪切,并克隆进相似消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中,如上所述。获得的文库大小为2.79×109,并且检查的克隆在靶标区域中表现出多样化的序列。
实施例7
文库构建:扩展和不扩展环3的情况下的突变
对于人四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环3变化文库,修饰环3的编码序列,使其编码表1中所示序列,其中在编码链中用由核苷酸NNK NNK NNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:),NNK NNK NNKNNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:155),和NNK NNK NNK NNKNNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:)编码的六个、七个或八个随机氨基酸替代小鼠四联蛋白的六个氨基酸ETEITA(SEQ ID NO:);N表示A、C、G或T;并且K表示G或T。此外,在环4中,用由核苷酸NNKNNK NNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:)编码的六个随机氨基酸替代人的三个氨基酸KTE。此外,改变环4的编码序列,使其编码丙氨酸(A),而不是环中的赖氨酸(K),从而消除血纤维蛋白溶酶原结合,其表现为依赖环4赖氨酸(Graversen等,1998)。
以下述方式使用重叠PCR产生人环3变化文库(引物序列如表2所示)。将引物HLoop3F6,HLoop3F7和HLoop3F8(分别为SEQ ID NO:)各自与HLoop4R(SEQ ID NO:)混合并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段,混合并在存在寡核苷酸H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:),HuBglfor(GCC GAG ATC TGG CTG GGC CTG A(SEQ ID NO:XXX))和PstRev(SEQ ID NO:)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化,并用BglII和PstI限制性酶剪切,并克隆进相似消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中,如上所述。产生文库后,将三个文库合并进行淘选。
实施例8
文库构建:环3和5的突变
对于人和小鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环3和5变化文库,修饰环3和5的编码序列,使其编码表1中所示序列,其中用由核苷酸NNK NNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:xxx)编码的五个氨基酸替代人四联蛋白的五个氨基酸TEITA,并且用由核苷酸NNK NNKNNK编码的三个氨基酸替代人的三个氨基酸AAN。此外,改变环4的编码序列,是其编码丙氨酸(A),而不是环中的赖氨酸(K),从而消除血纤维蛋白溶酶原结合,其表现为依赖环4赖氨酸(Graversen等,1998)。
以下述方式使用重叠PCR产生人环1扩展文库。混合引物h3-5AF(SEQ ID NO:)和h3-5AR(SEQ ID NO:)并通过PCR延伸,并且混合引物h3-5BF(SEQ ID NO:)和h3-5BR(SEQ ID NO:)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段,混合并在存在h3-5OF(SEQ ID NO:)和PstRev(SEQ ID NO:)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化,并用BglII和PstI限制性酶剪切,并克隆进相似消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中,如上所述。
实施例9
人文库1-4的淘选与筛选
在重组TRAIL R1(DR4)/Fc嵌合体和TRAIL R2(DR5)/Fc嵌合体上对由人文库1-4产生的噬菌体进行淘选。在三、四和/或五轮淘选后,使用ELISA平板测试方法进行筛选,鉴别受体特异性结合肽。
实施例10
用于选择和筛选TRAIL受体DR4和DR5的文库和克隆的构建
可以从制造商如New England Biolabs(NEB)购买表达各种长度线性或环形随机肽的噬菌体文库。或者,可以产生在人四联蛋白的C-型凝集素结构域(CTLD)的环(SEQ ID NO:)中包含随机肽的噬菌体展示文库。环1、2、3和4如图4所示。可以使用NNS或NNK重叠PCR突变策略将这些环中的氨基酸随机化。可以用突变的NNS或NNK密码子替代任一个环中的一至七个密码子,产生用于筛选的文库;或者,突变氨基酸的数量可以超过被替换的氨基酸的数量(可以用五个替代两个氨基酸,得到更大的随机环)。此外,可以同时改变多个环。重叠PCR策略能在环2和3之间的最终DNA构建体中产生KpnI位点,其改变环之间的一个氨基酸,将苏氨酸交换为原始的丙氨酸。或者,可以在环2和3之间掺入BssH II位点,其不改变原始氨基酸序列。
实施例11
TRAIL受体DR4和DR5的激动剂的选择和筛选
通过分别使用噬菌体文库的噬菌体甘油管或文库DNA感染或转染细菌如大肠杆菌TG-1或XL-1 Blue,产生表达噬菌体的细菌菌落。O.D.600为1.0的五十毫升感染/转染细菌在室温(RT)生长15分钟,之后向培养基中加入40%终浓度的选择药物标记,并在37℃温育1h。温育后加入其余用于筛选的药物,并在37℃再温育一小时。加入辅助噬菌体VCS M13并温育2h。向培养基中加入卡那霉素(70μg/mL),然后在37℃震荡过夜温育。通过离心富集噬菌体,然后用三分之一体积的20%聚乙二醇(PEG)8000/2.5 M NaCl将噬菌体从上清冷沉淀。将噬菌体重悬于包含蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche Complete Mini EDTA-free)的缓冲液中,然后无菌过滤。在大肠杆菌TG-1,XL1-Blue,或其它合适的细菌宿主中测试噬菌体文库的滴度。
在针对人DR4和/或DR5的几轮阳性筛选中淘选噬菌体。人DR4和DR5(aka人TRAIL死亡受体1和2)可以购得可溶解形式(AntigenixAmerica,Cell Sciences,或者以Fc(Genway Biotech,R&D Systems)或GST融合形式(Novus Biologicals)的。在PBS中的可溶DR4或DR5直接与固相支持体结合,比如微孔板的孔底部(Immulon 2B板),或者与磁珠如Dynabead结合。通过在4℃或RT在PBS中过夜温育,将约250ng至500ng的可溶DR4或DR5与固体基质结合。然后用PBS/0.05%Tween 20将板(或珠)洗三次,然后加入阻滞剂如1%BSA,0.05%叠氮化钠的PBS溶液,并在RT温育至少0.5h,以防止在将来的步骤中产生材料与非特异性表面的结合。还可以使用阻滞剂如包含3%脱脂乳粉或煮沸酪蛋白的PBS。
在可替换的方案中,为了结合DR4或DR5 Fc融合蛋白,首先用商业购买的0.5-1μg抗-Fc抗体在PBS温育板或珠。洗涤板(或珠)并用如上所述的1%BSA,0.05%叠氮化钠的PBS溶液阻断,然后与5μg/ml死亡受体融合蛋白温育,并在RT温育2h。然后用PBS/0.05%Tween 20洗涤板三次。
向包含直接或间接结合的死亡受体的孔(或珠)加入浓度约1011或1012pfu/mL的噬菌体文库。尽管要筛选不同结合性质时需要的温育时间和温度不同,但是在RT温育噬菌体至少2h。用PBS/0.05%Tween20至少洗涤孔八次,然后用PBS洗涤(8x)。在后面的筛选轮次中可以用更酸的酸性缓冲液洗涤孔,比如100mM Tris pH 5.0,Tris pH 4.0和Tris pH 3.0。通过胰蛋白酶消化洗脱结合的噬菌体(用100μL 1mg/mL胰蛋白酶的PBS溶液洗脱30分钟)。还可以使用0.1M甘氨酸,pH 2.2洗脱结合的噬菌体。或者,可以使用TRAIL(可从AbD Serotec购得)洗脱结合的噬菌体,筛选与TRAIL竞争结合死亡受体的CTLD或肽。进一步地,可以用已知与TRAIL竞争结合死亡受体的化合物洗脱结合的噬菌体。
洗脱的噬菌体用10mL新鲜生长至OD600为0.8的细菌温育15分钟,并且如上处理感染的细菌,产生第二轮淘选的噬菌体。再进行另外两轮或三轮阳性淘选。
作为使用直接或间接结合支持体的DR4和/或DR5的可替换方案,可以在阳性筛选各轮中使用由癌细胞系外源表达或由转染细胞如293细胞表达的DR4和/或DR5。对于转染细胞,在淘选前两天使用例如Qiagen AttracteneTM方案和合适的表达质粒如携带DR4或DR5的pcDNA3.1,pCEP4或pCEP5进行转染。细胞在非胰蛋白酶解离缓冲液中解离,并将6×106个细胞重悬于2mL IMDM缓冲液中。在加入细胞之前透析待淘选的噬菌体,并在RT温育2h。通过在IMDM中多次吸取重悬而洗涤细胞,并用甘氨酸缓冲液洗脱噬菌体。
为了选择对DR4和/或DR5有亲和力但对诱饵受体没有亲和力的那些肽,伴随阳性筛选进行阴性筛选轮次或阴性筛选。使用诱饵受体DcR1、DcR2、可溶的DcR3,和/或骨原壳蛋白(OPG,R&D系统)进行阴性筛选。OPG和可溶的DcR3可以从市场购得(GeneTex,R&D系统),DcR1和DcR2与Fcor GST(R&D Systems,Novus Biologicals)共轭结合。对于阴性筛选轮次,将诱饵受体与板或珠结合,并如上对于阳性筛选轮次所述进行阻断。对于较大的表面积,珠更理想,分子可以接触淘选的文库。初级文库或来自其它阳性筛选轮次的噬菌体与诱饵受体在室温温育2h,或者在4℃过夜温育。然后去除未结合的噬菌体并进行一轮阳性筛选。
阳性筛选也可以与阴性筛选同时进行。阻断用可溶DR4或DR5涂布的孔或珠,并使其接触初级文库或来自上述筛选轮次的噬菌体,但是包括浓度为10μg/mL的诱饵受体如DcR1。本策略中洗脱之前的4℃温育时间可以从2h延伸至几天,从而获得对于DR4或DR5的特异性和亲和力更强的噬菌体。使用DR4以获得DR5-特异性,或使用DR5以获得DR4-特异性结合肽的阴性筛选,也可以使用上述方法进行。
还可以在癌细胞或表达一个或多个诱饵受体的转染细胞上进行阴性筛选。与上述阳性筛选相似地进行阴性筛选,但是在温育后淘选细胞,然后从上清回收噬菌体,然后用于阳性筛选轮次。
实施例12
三聚TRAIL受体激动剂和三聚CTLD-衍生TRAIL受体激动剂的质粒构建
将来自噬菌体展示或肽-移植、肽-三聚结构域(TD)融合体,肽-TD-CTLD融合体或其各种组合的各种三聚TRAIL受体激动剂和三聚CTLD-衍生TRAIL受体激动剂亚克隆到细菌表达载体(pT7 in house载体,或pET,NovaGen)和哺乳动物表达载体(pCEP4,pcDNA3,Invitrogen)中进行小规模或大规模生产。
设计引物从来自实施例1的各种功能展示载体PCR扩增连接肽/激动剂。5’端引物侧有BamH I限制性位点,并且在载体pT7CIIH6框内,具有前导序列。5’引物还可以掺入蛋白酶Granzyme B或因子Xa的分解位点。3’引物侧有EcoRI限制性位点。用BamHI/EcoRI消化PCR产物,然后连接进用相同酶消化的pT7CIIH6中,产生细菌表达载体pT7CIIH6-TRAILa。
可以将TRAIL受体激动剂DNA亚克隆进载体pT7CIIH6或pET28a(NovoGen),没有任何前导序列和6XHis。5’引物侧有NdeI限制性位点,并且3’引物侧有EcoRI限制性位点。用NdeI/EcoRI消化PCR产物,并连接进用相同酶消化的载体中,产生表达载体pT7-TRAILa和pET-TRAILa。
可以将TRAIL受体激动剂DNA亚克隆进载体pT7CIIH6或pET28a(NovoGen),具有分泌信号肽。将表达的蛋白质导出至细菌周质中,并在转移过程中去除分泌信号肽。5’引物侧有NdeI限制性位点,并且将引物掺入细菌分泌信号肽,PelB,OmpA或OmpT。3’引物侧有EcoRI限制性位点。可选地可将6xHis标签编码序列掺入3’引物中。用NdeI/EcoRI消化PCR产物,并连接进用相同酶消化的载体中,产生表达载体pT7-sTRAILa,pET-sTRAILa,pT7-sTRAILaHis,和pET-sTRAILHis。
可以将TRAIL受体激动剂DNA和分泌信号肽一起亚克隆进哺乳动物表达载体pCEP4或pcDNA3.1。将表达的蛋白质分泌进培养基,并在分泌过程中去除分泌信号肽。5’引物侧有NheI限制性位点,并且将引物掺入四联蛋白分泌信号肽,或另一个信号肽(例如,Ig肽)。3’引物侧有XhoI限制性位点。可选地可将6xHis标签编码序列掺入3’引物中。用NheI/XhoI消化PCR产物,并连接进用相同酶消化的载体中,产生表达载体pCEP4-TRAILa,pcDNA-TRAILa,pCEP4-TRAILaHis,和pcDNA-TRAILaHis。
实施例13
来自细菌的TRAIL受体激动剂的表达和纯化
将细菌表达构建体转化进细菌菌株BL21(DE3)(Invitrogen)。将新鲜平板上的单菌落接种进摇瓶中的100mL 2xYT培养基。摇瓶在旋转摇床上在37℃以250rpm温育12h或过夜。使用过夜培养物(50mL)接种4L摇瓶中的1L 2xYT。在摇瓶中培养细菌OD600至约0.7,此时向培养基加入IPTG至终浓度1mM。4h温育后,通过离心收集细菌团,并保存以进行后续的蛋白纯化。
在10升发酵罐中在补料批式条件下进行细菌发酵。一升复合发酵培养基包含5g酵母提取物,20g蛋白胨,0.5g NaCl,4.25g KH2PO4,4.25g K2HPO4·3H2O,8g葡萄糖,2g MgSO4·7H2O,和3mL痕量金属溶液(2.7%FeCl3·6H2O/0.2% ZnCl2·4H2O/0.2% CoCl2·6H2O/0.15%Na2MoO4·2H2O/0.1%CaCl2·2H2O/0.1%CuCl2/0.05%H3BO3/3.7%HCl)。用过夜培养物(5%体积比)接种发酵罐,并在pH 6.9(用氢氧化铵和磷酸控制)和30℃,在恒定操作条件下生长。变化空气流量和搅拌速度以保持40%的最低溶氧水平。当培养基中的葡萄糖水平低于1g/L时开始补料(40%葡萄糖),并且在发酵的其余时间将葡萄糖水平维持在0.5g/L。当OD600到达约60时,向培养基中加入IPTG至终浓度0.05mM。诱导后四小时,富集细胞。通过离心获得细菌团,并在-80℃保存以进行后续的蛋白纯化。
可溶的、分泌到细菌细胞的周质中,并包括亲和标签(例如,6xHis标签蛋白)的表达蛋白可使用标准色谱方法纯化,比如金属螯合色谱(例如,Ni亲和柱),阴离子/阳离子亲和色谱,尺度排阻色谱,或其任意组合,所述技术为本领域技术人员所公知。
表达的蛋白能在细菌细胞中形成不溶的包涵体。在起初的纯化步骤中在变形条件下纯化这些蛋白,并进行之后的再折叠过程。将细菌团悬浮于裂解缓冲液(0.5M NaCl,10mM Tris-HCl,pH 8,和1mM EDTA)中并超声破碎。通过离心回收包涵体,然后溶解于包含6M氯化胍,50mM Tri-HCl,pH8和0.1M DTT的结合缓冲液中。将溶解的部分过Ni亲和柱。由柱洗下未结合材料后,用洗脱缓冲液(6M氯化胍,50mM Tri-HCl pH8.0,10mM 2-巯基乙醇,250mM咪唑)洗脱蛋白。分离的蛋白通过缓冲液交换进结合缓冲液,并重新过Ni+柱,去除变性剂。一旦载入柱上,使用不含变性剂(50mM Tri-HCl pH8.0,10mM 2-巯基乙醇,加2mM CaCl2)的5C.V.(柱体积)缓冲液,通过线性梯度(0-0.5M NaCl)将蛋白质再折叠。用包含0.5M NaCl,50mM Tris-HClpH8.0,和250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。用因子Xa或Granzyme B分解融合标签(6xHis,CII6His),并过Ni+-NTA亲和柱从蛋白样品去除标签。通过在Q-琼脂糖(GE)上进行离子交换色谱,使用10C.V.缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0和2mM CaCl2)的线性梯度(0-0.5M NaCl)进一步纯化蛋白。将蛋白透析如1XPBS缓冲液。可选地,通过Mustang E过滤器(PALL)去除内毒素。
为了从细菌细胞制备周质中表达蛋白的可溶提取物,将细菌团悬浮于上样缓冲液(10mM磷酸缓冲液pH 6.0)中,并使用超声裂解(或者用French按压)。在旋转分离不容部分后,将可溶提取物过SP F柱(GE)。也通过渗透压休克或“软”超声制备周质提取物。通过Ni+-NTA柱,如上所述纯化分泌的可溶6xHis标签蛋白。将粗提物通过缓冲液交换进入亲和柱上样缓冲液,然后过SP FF柱。用4C.V.上样缓冲液洗涤后,使用100%梯度,用8C.V.高盐缓冲液(10mM磷酸缓冲液,0.5M NaCl,pH 6.0)洗脱蛋白质。将洗脱液通过Mustang E过滤器去除内毒素,过滤洗脱液。将部分纯化的蛋白质经过缓冲液交换进入10mM磷酸缓冲液,pH 7.4,然后载入至Q FF柱。在用7C.V. 10mM磷酸缓冲液pH 6.0洗涤后,使用100%梯度,用8C.V.高盐缓冲液(10mM磷酸缓冲液,pH 6.0,0.5M NaCl)洗脱蛋白质。通过Mustang E过滤器再次去除内毒素。
实施例14
来自哺乳动物细胞的TRAIL受体激动剂的表达和纯化
使用Qiagen Endofree Maxi Prep Kit制备每个表达构建体的质粒。使用质粒瞬时转染HEK293-EBNA细胞。收集组织培养上清液,在转染后2-4天进行蛋白质纯化。
对于大规模生产,在CHO或PER.C6细胞中的稳定细胞系过表达TRAIL受体激动剂。将细胞(5x108)接种在20L生物反应器(Wave)中的2.5L培养基中。细胞倍增后,即加入新鲜培养基(1x初始体积),并在细胞倍增时继续加入,直至终体积达到10L。细胞培养约10提案,直至细胞存活率下降至20%。然后收集细胞培养物上清进行纯化。
如上所述使用His-标签蛋白纯化(通过Ni+-NTA柱)和非标签蛋白纯化(通过离子交换色谱)。
实施例15
模拟辅助的TRAIL受体激动剂的亲和力成熟
使用模拟对从CTLD噬菌体展示文库筛选中鉴别的TRAIL受体激动剂进行亲和力成熟。根据已知的四联蛋白3D结构建立激动剂相似性模型。使用LOOPER(DS2.1,Accelrys)及其相关算法限定并优化激动剂相似性模型的环构象。这个过程包括三个基本步骤:1.构建一组可能的环构象异构体,其中环骨架与蛋白质其余部分的相互作用经过优化;2.环侧链的建立和结构优化,并且所有环原子的能量最小化;3.对保留的环构象的变体进行最后的评分和分级。使用手动和基于分子动力学的停靠(docking)的组合,鉴别位于DR4/DR5胞外结构域上的可能的结合区域或表位为激动剂。通过使用DR4/DR5胞外结构域的缺失或点突变和激动剂进行结合实验,进一步确认结合结构域。在DR4/DR5和TRAIL CTLD激动剂上确定参与决定结合特异性的氨基酸残基(或序列)。使用基于结构的计算筛选各个靶标位置的随机突变组合,确定与结构模板的相容性。根据表观包装缺陷分析,选择进行突变的残基,构建噬菌体展示文库。
可以使用TRAIL受体拮抗肽和DR4/DR5的3D模型作为参照,限定肽移植CTLD和DR4/DR5模型模拟。在将TRAIL受体拮抗肽移植进入CTLD环时,优化环构象并通过使用模拟改变侧翼和周围氨基酸残基而重新使其表面与拮抗肽/DR4/DR5结合相匹配。根据已知的四联蛋白3D结构建立肽移植CTLD激动剂相似性模型。使用如上所述的LOOPER(DS2.1,Accelrys)及其相关算法限定并优化激动剂相似性模型的环构象。使用基于结构的计算筛选各个靶标位置的随机突变组合,确定与结构模板的相容性。根据表观包装缺陷分析,选择肽侧翼和周围要突变的氨基酸残基,构建噬菌体展示文库。
实施例16
癌细胞增殖的抑制
将表达DR4和/或DR5的人癌细胞系如COLO205(结肠直肠癌),NCI-H2122(非小细胞肺癌),MIA PaCa-2(胰腺癌),ACHN(肾细胞癌),WM793B(黑素瘤)和U266B1(淋巴瘤)(全部购自American TypeTissue Collection(Manassas,VA))在合适的条件下培养并以5000-20000细胞/孔的细胞密度接种(根据每种癌细胞系的生长曲线确定合适的值)。以0.0001-100μg/mL的浓度加入DR4/5拮抗细胞。可选地,将DR4/DR5激动剂与治疗方法组合,包括化学疗法(例如硼替佐米)或通过辐射预先敏化的细胞,产生协同效应,上调DR4或DR5或改变半胱天冬酶活性。24和48h后使用“AQueousOne Solution CellProliferation Assay”(Promega),根据生产商的说明,评价活细胞数量,并确定DR4/DR4激动剂的IC50浓度。
实施例17
癌细胞系中通过DR5和DR4拮抗分子激活半胱天冬酶
将表达DR4和/或DR5的人癌细胞系如COLO205(结肠直肠癌),NCI-H2122(非小细胞肺癌),MIAPaCa-2(胰腺癌),ACHN(肾细胞癌),WM793B(黑素瘤)和U266B1(淋巴瘤)(全部购自American TypeTissue Collection(Manassas,VA))在合适的条件下培养并以5000-20000细胞/孔的细胞密度接种(根据每种癌细胞系的生长曲线确定合适的值)。以0.0001-100μg/mL的浓度加入DR4/5拮抗细胞。可选地,将DR4/DR5激动剂与治疗方法组合,包括化学疗法(例如硼替佐米)或通过辐射预先敏化的细胞,产生协同效应,上调DR4或DR5或改变半胱天冬酶活性。在不同的时间点使用“APO-ONE半胱天冬酶试验”(Promega),根据生产商的说明确定半胱天冬酶活性。
通过如上所述温育2×106个肿瘤细胞,由蛋白印迹法进行进一步分析。制备后续的细胞裂解液进行蛋白印迹分析。通过SDS-PAGE分离蛋白,并转移至硝酸纤维素膜。用抗体温育滤膜,所述抗体可识别凋亡蛋白PARP、半胱天冬酶3、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、bid和肌动蛋白的前蛋白和裂解形式。通过HRP-耦合二级抗体和增强化学发光检测对应于具体蛋白质的条带。
实施例18
肿瘤异种移植模型中的拮抗分子评价
将癌细胞系(例如HCT-116,SW620,COLO205)皮下注射进Balb/cnude或SCID小鼠。使用卡尺一周测量两次肿瘤长度和宽度。一旦肿瘤的大小达到250mm3,将小鼠随机分组并肌肉注射或皮下注射10-100mg/kg DR4或DR5激动剂。将治疗与其它疗法如化学疗法(例如伊立替康,硼替佐米或5FU)或放射性治疗组合。观察肿瘤大小30天,除非肿瘤大小达到1500mm3,此时要处死小鼠。
实施例19
人文库1-4对人DR4和DR5的淘选
1.对DR4受体的淘选
使用人CTLD的人环1-4文库进行淘选,淘选在DR4/Fc抗原涂布(R&D Systems)孔上进行,所述孔在用以100μL PBS每孔稀释的250ng至1μg载体自由靶标抗原结合前一晚新鲜制备。抗原板在4℃过夜温育,然后在37℃温育1h,用PBS/0.05%Tween 20洗涤两次,并用PBS洗涤两次,然后用1%BSA/PBS在37℃阻断1h,之后进行淘选。每轮使用六孔,使用未稀释、1∶10和1∶100稀释度平行的纯化噬菌体上清储液,在37℃将噬菌体与孔结合两小时。因为靶标抗原表达为Fc融合蛋白,所以噬菌体上清储液包含1μg/mL可溶IgG1 Fc作为可溶竞争剂。此外,在靶标抗原结合前,将噬菌体上清预结合至包含人IgG1 Fc的抗原孔,去除Fc接头(预结合过程中不存在可溶的IgG1 Fc竞争剂)。
为了产生用于第一轮淘选的噬菌体,将10μg文库DNA转移进电感受态TG-1细菌并在包含40μg/mL羧苄青霉素和2%葡萄糖的SB的100mL培养基中在37℃生长1小时。然后将羧苄青霉素的浓度增加至50μg/mL,并且使培养基再生长一小时。然后将培养体积增至500mL,并用辅助噬菌体以5x109pfu/mL的感染量(MOI)感染培养物,并在37℃再生长一小时。离心细菌并重悬于包含50μg/mL羧苄青霉素和100μg/mL卡那霉素的500mL SB中,并在室温于250rpm震荡,生长过夜。第二天将细菌离心,并用终浓度4%PEG/0.5 M NaCl在冰上沉淀噬菌体1小时。然后在4℃以10,500rpm离心沉淀的噬菌体。将噬菌体团重悬于包含Roche不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂的1%BSA/PBS中。然后在微量离心机中以13,200rpm中将重悬的噬菌体离心10分钟,并通过0.2μM滤膜,去除残余细菌。
50μL纯化的噬菌体上清储液每孔与IgG Fc涂布的孔在37℃预结合1小时,然后以合适的稀释度转移至用靶标抗原涂布的孔,如上所述在37℃预结合2小时。然后用PBS/0.05%Tween 20上下吸取而洗涤5分钟(第一轮洗涤1次,第二轮洗涤5次,并且在第三轮和第四轮洗涤10次)。用60μL每孔酸洗脱缓冲液(甘氨酸pH 2)将结合靶标抗原的噬菌体洗脱,然后用2M Tris 3.6μL/孔中和。然后使用洗脱的噬菌体在室温感染TG-1细菌(2mL,OD600为0.8-1.0)15分钟。将培养物用包含40μg/mL羧苄青霉素和2%葡萄糖的SB补充至10mL,并在37℃以250rpm震荡,生长1小时。然后将羧苄青霉素浓度增至50μg/mL,并使培养物再生长一小时。然后将培养体积增至100mL,并用MOI为5x109pfu/mL的辅助噬菌体感染细菌,在37℃再生长一小时。离心细菌,并重悬于包含50μg/mL羧苄青霉素和100μg/mL卡那霉素的100mL SB中,在室温以250rpm震荡,过夜生长。类似地进行后面轮次的淘选,由于培养体积更小而作相应调整,并且在后面的轮次中增加洗涤次数。克隆在DR4/Fc上进行四轮淘选,从第三和第四轮筛选中获得克隆。
2.噬菌体ELISA
使用细菌的TG-1菌株进行至少四轮淘选。在每轮淘选中,取样本并涂布在包含50μg/mL羧苄青霉素和2%葡萄糖的LB平板上。为了筛选噬菌粒克隆对受体靶标的特异性结合,在后面的淘选轮次中从这些平板挑取单个菌落,并在室温以250rpm震荡,在包含2%葡萄糖和50μg/mL羧苄青霉素的250μL 2xYT培养基中过夜生长,所述培养基在聚丙烯96-孔中,顶部覆盖透气膜。第二天通过用30μL前面的过夜培养物接种包含2%葡萄糖和50μg/mL羧苄青霉素的500μL 2xYT,在96孔深孔板中建立复制板。使用其余过夜培养物,通过向每个孔加入100μL 50%甘油而获得主储液板,并在-80℃储存。复制培养板在37℃以250rpm生长约2小时,直到OD600为0.5-0.7。然后用混合至5x109pfu/mL的K07辅助噬菌体感染孔,并在37℃不震荡温育30分钟,然后在37℃以250rpm震荡,再温育30分钟。然后以2500rpm和4℃离心培养物20分钟。从孔去除上清,并将细菌细胞团重悬于包含50μg/mL羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的500μL 2xYT中。将透气膜放在培养模块上,并且细胞在室温以250rpm震荡过夜生长。
在第3天,离心培养物,并用3%牛奶/PBS将包含噬菌体的上清在室温阻断1小时。使用75-100ng结合抗原每孔进行初始噬菌体ELISA。在前一晚通过加入用100μL PBS每孔稀释的上述量的抗原结合,新鲜制备DR4/Fc抗原(R&D Systems)-包被孔和IgG Fc包被孔。在4℃过夜温育抗原板,然后再37℃温育1小时,用PBS/0.05%Tween 20洗涤两次,并用PBS洗涤两次,然后在ELISA之前用3%牛奶/PBS在37℃阻断1小时。将阻断的噬菌体与阻断的抗原-结合板结合1小时,然后用0.05%Tween 20/PBS洗涤两次,再用PBS洗涤两次。然后使用用3%牛奶/PBS稀释的结合HRP的抗-M13二级抗体,结合1小时,并如上所述洗涤。使用90μL TMB底物混合物显示ELISA信号,然后用90μL 0.2M硫酸终止,然后在450nm读取ELISA板。在鉴别的阳性结合克隆上进行二级ELISA筛选,针对其他TRAIL受体和诱饵受体筛选,测试特异性(DR4,DR5,DcR1和DcR2)。同上述方案相似地进行二级ELISA筛选。
DR4特异结合克隆。从人TN1-4文库中选择的与DR4受体特异性结合的环1和4的氨基酸序列详细列于下面的表4中。
表4
与人DR4连接的环1和环4序列
3.对DR5受体的淘选
除了进行五轮淘选和在包被BSA而不是IgG1 Fc的孔上进行预结合之外,与上述对DR4受体的淘选相似地进行对DR5受体的淘选。然而噬菌体上清储液包含在每轮中用作Fc结合的可溶性竞争剂的可溶性IgG1 Fc。从第5轮筛选获得DR5特异性结合克隆。获得自用于DR5特异性结合的克隆的环1和4的氨基酸序列如表5所示。
表5
来自可连接人DR5的接头的环1和4的序列
如上所述,环1在筛选文库中包含七个随机化氨基酸,而环4具有5个随机化氨基酸的插入,替代2个本体氨基酸(表5中的下划线区域)。在一些改变的环中包含谷氨酰胺(Q)的克隆中,琥珀-抑制终止密码子(TAG)编码谷氨酰胺,并用小写“q”表示。在淘选过程中,鉴别了几个在这些区域之外包含改变的克隆,例如,在环4中,羰基侧翼氨基酸在几个实例中由E变为K。
实施例20
可与人DR4和DR5受体结合的atrimer接头的亚克隆和产生
通过用BglII和MfeI限制性酶双消化,从DR4/DR5接头DNA释放环区域DNA片段,并连接至细菌表达载体pANA4、pANA10或pANA19,在大肠杆菌中产生分泌的atrimer。
将表达构建体转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,并且将细菌涂布在包含氨苄青霉素的LB琼脂上。将新鲜平板上的单菌落接种到包含氨苄青霉素的2xYT培养基中。将培养物在37C,200rpm震荡的摇床上温育,直至OD600达到0.5,然后冷却至室温。加入arabinosis至终浓度0.002-0.02%。在室温以120-150rpm震荡,过夜进行诱导,之后通过离心收集细菌。通过等渗休克或轻柔地超声提取周质蛋白。
通过Ni+-NTA亲和色谱纯化6xHis-标签atrimer。简而言之,在His-结合缓冲液(100mM HEPES,pH 8.0,500mM NaCl,10mM咪唑)中重构周质蛋白并载入用His-结合缓冲液预平衡的Ni+-NTA柱上。用10倍体积的结合缓冲液洗涤柱。用洗脱缓冲液(100mM HEPES,pH 8.0,500mM NaCl,500mM咪唑)洗脱蛋白。将纯化的蛋白透析进入PBS缓冲液中,并通过离子交换去除细菌内毒素。
通过Strep-Tactin亲和色谱纯化strep II-标签atrimer。简而言之,在1X结合缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.5,150mMNaCl,2mMCaCl2,0.1%Triton X-100)中重构周质蛋白并载入用结合缓冲液预平衡的Strep-Tactin柱上。用10倍体积的结合缓冲液洗涤柱。用洗脱缓冲液(包含2.5mM脱硫生物素的结合缓冲液)洗脱蛋白。将纯化的蛋白透析进入结合缓冲液并通过阳离子交换去除细菌内毒素。
将环区域的DNA片段亚克隆进入哺乳动物表达载体pANA2和pANA11中,在HEK293瞬时表达系统中产生atrimer。通过用BglII和MfeI限制性酶双消化,从IL-23R接头DNA释放环区域的DNA片段,并连接至表达载体pANA2和pANA11,所述载体已用BglII和MfeI预消化。通过Qiagen HiSpeed Plasmid Maxi Kit(Qiagene)从细菌纯化表达质粒。对于HEK293粘附细胞,根据生产商的方案通过QiagenSuperFect Reagent(Qiagene)进行瞬时转染。转染后一天,去除培养基并转移至293 Isopro无血清培养基(Iryine Scientific)。两天后,向培养基加入0.5 M HEPES中的20%葡萄糖至终浓度1%。转染后4-7天收集组织培养物上清用于纯化。对于HEK293F悬浮细胞,通过Invitrogen的293Fectin及其方案进行瞬时转染。第二天,向培养基中加入1倍体积的新鲜培养基。转染后4-7天收集组织培养物上清用于纯化。如上所述从哺乳动物组织培养物上清纯化His-或Strep II-标签atrimer。
将环区域的DNA片段亚克隆进哺乳动物表达载体pANA5、pANA6、pANA7、pANA8和pANA9,在HEK293瞬时表达系统中产生具有不同CTLD-呈现方向的atrimer。pANA5是在人TN中包含C-端His-标签和V49缺失的修饰pCEP4载体。相似地,pANA6具有T48缺失,并且pANA7具有T48和V49缺失。pANA8具有C50,C60——S50,S60双突变,提供比野生型TN更灵活的CTLD。pANA9具有E1-V17缺失,去除糖基化位点。通过用BglII和MMfI限制性酶双消化,从IL-23R接头DNA释放环区域的DNA片段,并连接至表达载体pANA5、pANA6、pANA7、pANA8和pANA9,所述载体已用BglII和MfeI预消化。
实施例21
使用Biacore鉴别人DR4和DR5受体接头的亲和力
表6和7分别提供了三聚DR4和DR5接头的表观亲和力。使用标准的胺耦合化学进行抗-人IgG Fc抗体(Biacore)与CM5芯片(Biacore)的固定化,并且使用这个表面捕获重组的人DR4或DR5受体Fc融合蛋白(R&D Systems)。以30ul/分向IL-23受体表面注射atrimer稀释液(1-500nM),并使用Biaevaluation软件(3.1版,Biacore)由感应图数据产生动力学常数。数据收集为3分钟关联和5分钟解离。用3M氯化镁的30s脉冲再生抗-人IgG表面。所有感应图均为针对活化和阻断流通池以及缓冲液注射的双重参照。
表6
H环1-4文库的DR4受体接头的表观亲和力。
分析物 | Ka(1/M·s) | Kd(1/s) | KA(1/M) | KD(nM) |
014-42.3D10 | 1.22E+04 | 1.85E-03 | 6.58E+06 | 152 |
014-42.3B8 | 1.12E+05 | 1.01E-03 | 1.11E+08 | 9.01 |
014-42.3D11 | 1.33E+04 | 5.26E-04 | 2.53E+07 | 39.5 |
表7
H环1-4文库的DR5受体接头的表观亲和力
分析物 | Ka(1/M·s) | Kd(1/s) | KA(1/M) | KD(nM) |
1a7b(=A8G) | 4.05E+04 | 6.29E-04 | 6.43E+07 | 15.6 |
8b6b(=A1H) | 1.29E+04 | 5.06E-04 | 2.56E+07 | 39.1 |
9b3d(=B3D) | 116 | 1.04E-04 | 1.11E+06 | 899 |
2a1a(=B9F) | 4.38E+04 | 1.84E-03 | 2.38E+07 | 42.8 |
4a8c(=A3C) | 6.30E+04 | 3.62E-04 | 1.74E+08 | 5.74 |
细胞检测说明。
在96孔白色透明板(Costar)中,在10%FBS/RMPI培养基中以1×104细胞/孔将H2122肺腺癌细胞(ATCC#CRL-5985)和A2780卵巢癌细胞(欧洲细胞培养物中心,#93112519)与DR5 atrimer(20ug/mL)或TRAIL(0.2ug/mL,R&D Systems)温育。对照孔装培养基和各种缓冲液:DR5atrimer为TBS,TRAIL为PBS。20小时后,通过ViaLight Plus(Lonza)确定细胞活力,并在Glomax luminometer(Promega)上检测。用相对于各自缓冲液对照的细胞死亡百分比表示数据。使用Excel绘制三次重复的平均值和标准偏差。测试了五个DR5 atrimer:4a8c、2a1a、1a7b、9b3d和8b6b。三个DR5 atrimer(4a8c、1a7b和8b6b)在两种细胞系中均表现出超过50%的杀死细胞率。在各次单独实验中获得了相似的数据。
实施例22
针对人DR5的NEB肽文库淘选和DR5特异性肽的鉴别
使用New England Biolabs(NEB)Ph.D.噬菌体展示文库进行肽文库的淘选。在DR5/Fc抗原-包被(R&D Systems)孔上进行淘选,所述孔在与用150uL 0.1M NaHCO3pH 8.6每孔稀释的3ug无载体靶标抗原结合前一晚新鲜制备。每轮使用两个重复孔。在4℃过夜温育抗原板,然后在37C温育1小时。去除抗原,然后在淘选前用PBS pH 7.4中的0.5%煮沸酪蛋白在37C阻断1小时。然后去除酪蛋白,然后用300uLTBST(0.1%Tween)洗涤孔六次,然后加入噬菌体。因为靶标抗原表达为Fc融合蛋白,所以在靶标抗原结合前,将噬菌体上清与包含人IgG1Fc的抗原孔预结合1小时,去除Fc接头(在第2轮到第4轮的过程中)。如上所述,与DR5/Fc抗原结合孔相似地进行Fc抗原结合孔的制备。
对于第一轮淘选,向每个孔加入100uL TBST(0.1%Tween),并向每个孔加入3个NEB肽文库(Ph.D.-7,Ph.D.-12和Ph.D.-C7C)各5uL。在室温轻轻震荡板,然后用TBST(0.1%Tween)洗涤十次。用100uL包含浓度为100ug/mL的可溶性DR5/Fc靶标抗原的PBS洗脱结合的噬菌体。在室温震荡洗脱噬菌体1小时。然后从孔去除洗脱的噬菌体,并用于感染OD600nm为0.05至0.1的20ml ER2738细菌,并在37℃在250rpm震荡生长4.5小时。然后以12K X G在4℃将培养物中的细菌离心分离20分钟。将细菌转移至新鲜管中并再次离心。再次将上清转移至新鲜管中,并通过加入1/6体积的20%PEG/2.5M NaCl而沉淀噬菌体。在4℃过夜沉淀噬菌体。第二天,以12K X G在4℃将沉淀的噬菌体离心20分钟。弃去上清并将噬菌体团重悬于1ml TBST(0.1%Tween)中。通过在4℃在微量离心机中以13.2K离心10分钟而去除其余细菌。然后将噬菌体上清转移至新管中,并通过加入1/6体积的20%PEG/2.5M NaCl而再次沉淀,并在冰上以4℃温育1小时。在微量离心机中以13.2K在4℃将沉淀的噬菌体离心10分钟。弃去上清并将噬菌体团重悬于200uL TBS中。除了噬菌体与Fc包被孔预结合1小时以及从前一轮得到的4uL扩增的噬菌体储液每孔用于结合之外,后面的淘选轮次与第一轮相似。除此之外,10次洗涤中使用的tween在TBST中的浓度增加至0.5%。
噬菌体ELISA
使用ER2738细菌菌株进行至少四轮淘选。在每轮淘选中,取样并使用LB/Xgal平板上的顶层琼脂涂布获得噬菌斑。为了筛选噬菌体克隆与受体靶标的特异性结合,从来自后面淘选轮次的这些平板挑取各个噬菌斑,并用于感染OD600nm为0.05至0.1的ER2738细菌,并在37℃以250rpm震荡生长4.5小时。然后在4℃过夜保存。
在第2天,在4℃以12K X G将培养物离心20分钟,并用3%牛奶/PBS在室温将包含噬菌体的上清阻断1小时。使用75-100ng DR5/Fc抗原结合每孔进行最初的噬菌体ELISA。使用包含75-100ng人IgG1 Fc每孔的孔测量非特异性结合。通过结合用100uL PBS每孔稀释的上述量的抗原,在前一晚新鲜制备用DR5/Fc抗原(R&D Systems)-包被的孔和IgG1 Fc包被的孔。在4℃过夜温育抗原板,然后在37℃温育1小时,用PBS/0.05%Tween 20洗涤两次,并用PBS洗涤两次,然后在ELISA之前用3%牛奶/PBS在37C阻断1小时。将阻断的噬菌体与阻断的抗原结合平板结合1小时,然后用0.05%Tween 20/PBS洗涤两次,然后用PBS再洗涤两次。然后使用用3%牛奶/PBS稀释的HRP-耦合抗-M13二级抗体,结合1小时,并如上所述洗涤。使用90uL TMB底物混合显示ELISA信号,然后用90uL 0.2M硫酸终止,然后在450nM读取ELISA板。在鉴别的阳性结合克隆上进行二次ELISA筛选,针对其它TRAIL受体和诱饵受体筛选,测试特异性(DR4、DR5、DcR1和DcR2)。与上述方案相似地进行二次ELISA筛选。
DR5特异性结合克隆。表XX中详细显示了由NEB Ph.D.-C7C噬菌体文库筛选与DR受体特异性结合的肽的氨基酸序列实例。
表8
克隆 | 肽序列 | 肽SEQ ID NO |
088-13.1H3 | ACFPIMTLHCGGG |
上述实例不限制这些文库产生的各种变化的范围。可以产生其它文库,其中各种数量的随机或更多的靶向氨基酸用于替代现有氨基酸,并且可以使用环的各种组合。此外,可以使用其它突变和产生突变的方法,比如随机PCR突变,提供可进行淘选的多种文库。
上文给出的实例仅为阐释性,不意味着对本发明的所有可能的实施方案、应用或修正的穷尽式列举。因此,在不背离本发明范畴和精神的情况下,对于本领域的技术人员而言,本发明的所述方法和系统的各种修正和变化是显而易见的。尽管本发明通过具体实施方案进行描述,但是应理解的是,要求权利要求的本发明不限于这些具体的实施方案。事实上,进行本发明的所述节点的各种修正,其对于分子生物学、免疫学、化学、生物化学或相关领域的技术人员是显而易见的,这些修正意欲包含于所附权利要求的范围中。
应理解的是,本发明不受本文所述特定方法学、方案和试剂等的限制,因为如同技术人员可识别的,这些可以变化。还应理解的是,本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的,不意欲限定本发明的范围。
本发明的实施方案和其各种特点和优势将参照非限定性实施方案更完整地解释和/或在附图和下述描述中阐释。应注意的是,图中阐释的特点不需要按比例绘制,并且一个实施方案的特点可以与其它实施方案使用,如同技术人员将识别的,即使本文未阐明。
本文引用的任何数值包括从较低值到较高值的所有数值,以一个单位递增,只要任何较低值和较高值之间有至少两个单位的分隔。作为一个实例,如果提到组分的浓度或过程变量的数值如,例如,大小、角度、压力、时间等,为,例如,从1至90,具体为从20至80,更具体为从30至70,则在这种说明中意欲表示数值如15至85,22至68,43至51,30至32等。对于小于一的数值,在适当的情况下,一个单位认为是0.0001,0.001,0.01或0.1。这些仅是具体的实例,最低值和最高值之间数值的所有可能组合在本申请中以相似的方式表示。
尽管在本发明的实践和测试中可以使用与本文所述相似或相当的任何材料和方法,但是仍描述了具体的方法、设备和材料。本文引用的所有文献和出版物的公开通过引用全部并入本文,其程度与通过引用单独并入相同。
表9:TRAIL相关序列
表10:其它死亡受体序列信息
表11:TAS和TAA序列信息
表12:载体序列
由下页开始
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本文所有标明的已发表专利申请通过引用全部并入本文。
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Claims (42)
1.非天然多肽,其包含三聚结构域和与至少一个TRAIL死亡受体结合的至少一个多肽。
2.权利要求1的多肽,其中所述三聚结构域包含SEQ ID NO:10的多肽,其在位置10、17、20、21、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34或35有多达五个氨基酸取代,并且其中三个三聚结构域形成三聚复合物。
3.权利要求1的多肽,其中所述三聚结构域包含选自下组的三聚多肽:hTRAF3[SEQ ID NO:]、hMBP[SEQ ID NO:]、hSPC300[SEQID NO:]、hNEMO[SEQ ID NO:]、hcubilin[SEQ ID NO:]、hThrombospondins[SEQ ID NO:],和人SP-D的颈区[SEQ IDNO:]、牛SP-D的颈区[SEQ ID NO:]、大鼠SP-D的颈区[SEQ IDNO:]、牛胶固素的颈区:[SEQ ID NO:];牛胶原凝集素的颈区:[SEQID NO:];和人SP-D的颈区:[SEQ ID NO:]。
4.权利要求1的多肽,其中至少一种TRAIL死亡受体是DR4或DR5。
5.权利要求1的多肽,其中所述结合TRAIL死亡受体的至少一种多肽包含C型类凝集素结构域(CLTD),其中环区段A或环区段B的环1、2、3或4中的一个包含结合DR4和DR5中至少一个的多肽序列。
8.权利要求1的多肽,其中所述结合TRAIL死亡受体的至少一个多肽不结合TRAIL诱饵受体。
9.权利要求8的多肽,其中所述TRAIL诱饵受体是DcR1、DcR2和循环骨保护素(OPG)中的至少一个。
10.权利要求1的多肽,其中所述多肽是融合蛋白。
11.权利要求10的多肽,其中所述结合至少一个TRAIL死亡受体的多肽与DR5结合,并包含下述序列:ACFPIMTLHCGGG[SEQ IDNO:]。
12.权利要求1的多肽,其中所述结合TRAIL死亡受体的至少一个多肽包含结合DR4的多肽和结合DR5的多肽。
13.权利要求12的多肽,其中所述结合DR4和DR5中至少一个的第一多肽位于三聚结构域的N-端或C-端之一,并且所述结合DR4和DR5中至少一个的第二多肽位于三聚结构域的N-端或C-端中的另一端。
14.权利要求13的多肽,其中所述第一和第二多肽均结合DR4。
15.权利要求13的多肽,其中所述第一和第二多肽均结合DR5。
16.权利要求13的多肽,其中所述第一和第二多肽中的一个结合DR4,所述第一和第二多肽中的另一个结合DR5。
17.权利要求13的多肽,其中所述第一和第二多肽中至少一个包含CTLD,其中环区段A或环区段B的环1、2、3或4之一包含结合DR4和DR5中至少一个的多肽。
18.权利要求4的多肽,其中所述结合DR4或DR5的多肽位于三聚结构域的N-端和C-端之一,并且在N-端和C-端中的另一端还包含结合肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)的多肽序列。
19.权利要求18的多肽,其中所述多肽结合肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)的亲和力比所述多肽结合DR4或DR5的亲和力至少高两倍。
20.权利要求4的多肽,其中结合DR4或DR5的多肽位于三聚结构域的N-端或C-端之一,并且在N-端和C-端中的另一端还包含结合选自下组的受体的多肽序列:Fn14、FAS受体、TNF受体和LIGHT受体。
21.权利要求1的多肽,其还包含共价附着于多肽上的治疗剂。
22.包含三个如权利要求1所述的多肽的三聚复合物。
23.权利要求22的三聚复合物,其中所述三聚结构域是四联蛋白三聚结构元件。
24.权利要求22的包含三个多肽的三聚复合物,其中所述复合物包含结合DR4的三个多肽序列,其中所述序列相同或不同,并且所述复合物包含特异性结合DR5的三个多肽序列,其中所述序列相同或不同。
25.编码多肽的分离的多核苷酸,所述多肽包含权利要求1的多肽。
26.包含权利要求25的多核苷酸的载体。
27.包含权利要求26的载体的宿主细胞。
28.诱导患者体内表达DR4和DR5中至少一个的肿瘤细胞凋亡的方法,其包含用权利要求22的三聚复合物接触细胞。
29.权利要求28的方法,其中所述三聚复合物诱导半胱天冬酶依赖型凋亡。
30.权利要求29的方法,其中所述三聚复合物诱导半胱天冬酶非依赖型凋亡。
31.药物组合物,其包含权利要求22的三聚复合物和至少一种医药上可接受的赋形剂。
32.治疗癌症患者的方法,其包含对有需要的患者施用权利要求31的药物组合物。
33.权利要求32的方法,其还包含对患者同时或顺序施用治疗剂。
34.包含权利要求22的复合物的DR4受体激动剂。
35.包含权利要求22的复合物的DR5受体激动剂。
36.用于制备诱导细胞凋亡的多肽的方法,其包含:
a)选择结合DR4或DR5之一但不结合TRAIL诱饵受体的第一多肽;
b)将第一多肽与多聚结构域的N-端或C-端之一融合。
37.权利要求36的方法,其还包含:
a)选择特异性结合DR4和DR5中另一个的第二多肽;
b)将第二多肽与多聚结构域的N-端或C-端中的另一端融合。
38.权利要求37的方法,其中步骤(a)还包含选择不结合TRAIL诱饵受体的多肽。
39.用于制备诱导细胞凋亡的多肽复合物的方法,其中所述细胞表达TRAIL的至少一个死亡受体,所述方法包含将根据权利要求37制备的三个多肽三聚。
40.用于制备诱导肿瘤细胞凋亡的多肽,其包含:
a)建立包含CTLD的多肽文库,所述CTLD包含至少一个随机环区;
b)从文库中选择结合DR4和DR5之一的第一多肽。
41.权利要求40的方法,其还包含:(c)将选择的多肽附着于多聚结构域的N-端或C-端。
42.权利要求40的方法,其中步骤(b)还包含选择不结合TRAIL诱饵受体的多肽。
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