CN115974976A - 拮抗多肽及用于制备抗急性肾损伤药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及拮抗多肽及其用于制备抗急性肾损伤药物的应用，属于生物药学领域。所述拮抗多肽为由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或者所述拮抗多肽为由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N末端或C末端连接有从N末端到C末端的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；所述拮抗多肽能通过特异性地阻滞KIM1和DR5的结合，减缓顺铂等损伤所导致的肾小管上皮细胞死亡，改善急性肾损伤及其向慢性肾病的转变。
Description
技术领域
本发明属于生物药学领域，更具体地，涉及拮抗多肽及其用于制备抗急性肾损伤药物的应用，尤其涉及肾损伤分子-1(KIM1)和死亡受体5(DR5)的拮抗多肽，其用于制备抗急性肾损伤及其向慢性肾病转变药物的应用。
背景技术
急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是指缺血、药物或中毒等因素导致的肾功能急剧下降，伴有代谢异常和水、电解质等失衡的临床综合征，尤其在住院患者中常见。全球每年超1000万人确诊急性肾损伤，造成约170万人死亡，严重威胁人民生命健康。急性肾损伤常引发胞外基质增多、肾小球系膜增厚、肾小管扩张或萎缩、细胞死亡，导致肾功能障碍与肾脏不可逆损伤，诱发严重的慢性肾脏疾病。目前尚无治疗急性肾损伤及其向慢性肾病转变的特效药物。因此，开发针对急性肾损伤及其向慢性肾病转变的治疗药物，具有重要的基础研究和临床转化意义。
发明内容
本发明解决了现有技术中治疗急性肾损伤的药物匮乏，效果不佳以及安全性不好的技术问题，提供了多种拮抗多肽、其用于制备抗急性肾损伤药物的应用。肾损伤分子-1(KIM1)和死亡受体-5(DR5)是促进急性肾损伤发生发展及其向慢性肾病转变的关键分子，本发明中的拮抗肽P1能特异性结合KIM1；拮抗肽P2能特异性结合DR5；拮抗肽P3能结合KIM1和DR5，均能特异性阻断KIM1和DR5间的结合，能预防和治疗急性肾损伤及其向慢性肾病转变。
根据本发明第一方面，提供了一种拮抗多肽P1，所述拮抗多肽的氨基酸序列由SEQID NO：1所示；
或者所述拮抗多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有序列SEQ ID NO：1活性的氨基酸序列。
根据本发明另一方面，提供了一种拮抗多肽P2，所述拮抗多肽的氨基酸序列由SEQID NO：2所示的氨基酸序列；
或者所述拮抗多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有序列SEQ ID NO：2活性的氨基酸序列。
根据本发明另一方面，提供了一种拮抗多肽P3，所述拮抗多肽的氨基酸序列由SEQID NO：1连接SEQ ID NO：2所示；
或者所述拮抗多肽的氨基酸系列由SEQ ID NO：1连接SEQ ID NO：2的多肽经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SEQ ID NO：1连接SEQ ID NO：2的多肽活性的氨基酸序列。
根据本发明另一方面，提供了所述的拮抗多肽P1、所述的拮抗多肽P2，或者所述的拮抗多肽P3用于制备抗急性肾损伤药物的应用。
根据本发明另一方面，提供了所述的拮抗多肽P1、拮抗多肽P2，或者所述的拮抗多肽P3用于制备改善急性肾损伤向慢性肾病转变药物的应用。
优选地，所述拮抗多肽P1用于与肾损伤分子-1特异性结合，从而特异性阻断肾损伤分子-1和死亡受体-5的结合。
优选地，所述拮抗多肽P2用于与死亡受体-5特异性结合，从而特异性阻断肾损伤分子-1和死亡受体-5的结合。
优选地，所述拮抗多肽P3用于与肾损伤分子-1和死亡受体-5特异性结合，从而特异性阻断肾损伤分子-1和死亡受体-5的结合。
优选地，所述拮抗多肽P1和拮抗多肽P2用于改善肾小管上皮细胞和原代肾小管上皮细胞的损伤。
优选地，所述拮抗多肽P1用于改善血清肌酐和尿素氮的堆积，从而缓解病理损伤；并且，拮抗多肽P1能改善肾损伤分子-1和死亡受体-5下游凋亡信号通路的激活。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明基于分子模拟技术，获取了KIM1和DR5的结合模式图，并发现了KIM1和DR5结合的关键氨基酸残基。通过模拟KIM1和DR5的结合口袋(关键氨基酸残基)，设计了一系列KIM1-DR5拮抗肽，他们对KIM1和/或DR5有高效亲和作用。其中，SEQ ID NO：1所示序列的拮抗肽P1与KIM1特异性结合，可有效抑制KIM1和DR5的结合，具有急性肾损伤预防和治疗的作用；SEQ ID NO：2所示序列的拮抗肽P2与DR5特异性结合，并特异性阻断KIM1和DR5两者间的结合。此发现有望解决急性肾损伤治疗中存在的药物匮乏问题。
(2)本发明通过分子模拟对接技术发现SEQ ID NO：1所示序列的拮抗肽P1与KIM1有较强结合(累计结合能-13.49kcal/mol)。细胞水平活性检测发现拮抗肽P1在肾小管上皮细胞和小鼠原代肾小管上皮细胞中可显著改善顺铂等所诱导的细胞损伤。
(3)本发明通过分子模拟对接技术发现SEQ ID NO：2所示序列的拮抗肽P2与DR5有较强结合(累计结合能-12.45kcal/mol)。细胞水平活性检测发现拮抗肽P2在肾小管上皮细胞和小鼠原代肾小管上皮细胞中可显著改善顺铂等所诱导的细胞损伤。
(4)本发明通过动物水平活性检测发现拮抗肽P1可在动物水平特异性阻滞KIM1与DR5间的结合，改善顺铂损伤所诱导的血清肌酐和尿素氮的堆积，缓解病理损伤。拮抗肽P1可显著抑制KIM1和DR5下游Caspase相关凋亡信号通路的激活。
(5)本发明中拮抗肽P1序列为SEQ ID NO：1所示序列；拮抗肽P2序列为SEQ ID NO：2所示序列。本申请以KIM1和DR5分子中互作序列氨基酸残基为设计模板，合成了拮抗肽P1和拮抗肽P2连接的两种拮抗KIM1-DR5结合的拮抗肽P3，为设计抗急性肾损伤药物提供了新思路。
(6)本发明基于Alphafold2高通量分子对接平台，对KIM1与DR5互作基序进行虚拟筛选，并在急性肾损伤及其向慢性肾病转变的细胞及动物模型中，考察了虚拟筛选所得多肽的活性及其对KIM1与DR5结合的影响。
附图说明
图1是本发明的三种拮抗肽的序列图。
图2是本发明中涉及的拮抗肽P1与KIM1的结合模式图。
图3是本发明中涉及的拮抗肽P1和P2细胞水平对于顺铂等损伤的保护效果。
图4是本发明中涉及的拮抗肽P1动物水平对于KIM1与DR5结合的干预及对于顺铂等损伤的保护效果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中的一种拮抗多肽，所述拮抗多肽含有从N末端到C末端的由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(拮抗肽P1)；
或者所述拮抗多肽P1含有从N末端到C末端的由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有序列SEQ ID NO：1活性的氨基酸序列；
所述拮抗多肽P1与肾损伤分子-1(KIM1)有特异性结合，能特异性阻断KIM1和死亡受体-5(DR5)的结合，从而改善急性肾损伤及其向慢性肾病的转变。
本发明中的第二种拮抗多肽，所述拮抗多肽含有从N末端到C末端的由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(拮抗肽P2)；
或者所述拮抗多肽P2含有从N末端到C末端的由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有序列SEQ ID NO：2活性的氨基酸序列；
所述拮抗多肽P2与DR5特异性结合，能特异性阻断KIM1和DR5的结合，从而改善急性肾损伤及其向慢性肾病的转变。
本发明中的第三种拮抗多肽P3，所述拮抗多肽含有从N末端到C末端的由SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，且在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N末端或C末端连接有从N末端到C末端的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
或者所述拮抗多肽P3含有以上SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2连接的多肽经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2连接的多肽活性的氨基酸序列；
所述拮抗多肽P3能特异性结合KIM1和DR5，阻滞KIM1与DR5间的结合。
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间可通过一个或多个甘氨酸、一个或多个丝氨酸、一个或多个苏氨酸或小分子连接。
本发明中的拮抗肽结构如图1所示。
本发明的拮抗肽按照标准的固相多肽合成步骤合成。多肽合成方向为C端到N端，首先是树脂的溶胀，使用的是氯树脂；然后将第一个氨基酸连在树脂上；第一个氨基酸连在树脂上需要double coupling即氨基酸与树脂反应两次；随后将氨基酸氨基端Fmoc基团的去除(脱保护)；再次是肽链延长的过程，经过重复缩合、洗涤、脱保护、洗涤、缩合的步骤，按多肽序列从C端向N端逐一连接氨基酸，直至合成所需肽片段；随着树脂去溶胀及干燥、将肽段切除和粗肽的纯化，即可合成附图1中的拮抗肽P1、拮抗肽P2和拮抗肽P3。
发明人研究发现拮抗肽P1与KIM1有较强亲和(累积结合能：-13.49kcal/mol)，拮抗肽P2与DR5有较强结合(累积结合能：-12.45kcal/mol)。基于Alphafold2分子模拟平台，通过虚拟筛选评估系列拮抗多肽对KIM1与DR5结合的影响，申请人设计合成了SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。细胞活性检测发现拮抗肽P1和拮抗肽P2均能显著改善顺铂所诱导的肾小管上皮细胞和原代肾小管上皮细胞的损伤；动物水平研究发现，拮抗肽P1可阻滞KIM1与DR5的相互结合，同时改善顺铂所诱导的血清肌酐和尿素氮的堆积，缓解病理损伤。同时，拮抗肽P1可抑制KIM1和DR5下游Caspase相关凋亡信号通路的激活。本发明的拮抗肽为设计抗急性肾损伤及其向慢性肾病转变拮抗/阻滞药物奠定了基础，为开发出更有效的治疗药物提供了新思路。以下为实施例：
实施例1
本发明的拮抗肽P1和拮抗肽P2与KIM1/DR5有较强亲和。
申请人研究发现拮抗肽P1与KIM1有较强亲和(累积结合能：-13.49kcal/mol)，拮抗肽P2与DR5有较强结合(累积结合能：-12.45kcal/mol)。通过模拟KIM1与DR5的结合基序，申请人设计合成了拮抗肽P1和拮抗肽P2。同时，申请人通过甘氨酸作为Linker，杂合拮抗肽P1和拮抗肽P2，设计合成了拮抗肽P3(示例图1和图2)。
实施例2
本发明的拮抗肽P1可在肾小管上皮细胞及原代肾小管上皮细胞中缓解顺铂所诱导的细胞损伤。
细胞活性检测：将肾小管上皮细胞(TCMK-1)或肾小管原代细胞(PTECs)铺于96孔板中(3000-4000个/孔)，待细胞贴壁后，给予顺铂处理，同时给予空白对照、拮抗肽P1处理24小时。加入MTT溶液(10μl/孔)，4小时后加入DMSO于490nm处检测吸光度值。MTT结果显示，顺铂可诱导肾小管细胞的死亡，拮抗肽P1无明显细胞毒性，且能抑制顺铂所引起的细胞死亡(示例图3中的A和B)。
实施例3
本发明的拮抗肽P2可在肾小管上皮细胞中缓解顺铂所诱导的细胞损伤。
细胞活性检测：将肾小管上皮细胞(HK-2)铺于96孔板中(3000-4000个/孔)，待细胞贴壁后，给予顺铂处理，同时给予空白对照、拮抗肽P2处理24小时。加入MTT溶液(10μl/孔)，4小时后加入DMSO于490nm处检测吸光度值。MTT结果显示，顺铂可诱导肾小管细胞的死亡，拮抗肽P2无明显细胞毒性，且能抑制顺铂所引起的细胞死亡(示例图3中的C)。
实施例4
动物水平，拮抗肽P1可抑制KIM1与DR5间的结合，改善顺铂所诱导的肾脏病理损伤及凋亡相关信号通路的激活。
图4是本发明的拮抗肽P1在动物水平的活性评价。在顺铂诱导的急性肾损伤动物模型中，给予小鼠尾静脉注射拮抗肽P1的处理(图4中的A)，可显著改善顺铂所诱导的血清肌酐、尿素氮的堆积(图4中的B-C)；H&E染色显示，拮抗肽P1可显著改善顺铂所造成的肾脏病理损伤(图4中的D)。组织免疫共沉淀技术结果显示，拮抗肽P1可在动物水平拮抗KIM1与DR5的相互结合(图4中的E)。通过检测KIM1和DR5下游凋亡关键Caspase信号通路，发现拮抗肽P1可在动物水平改善顺铂所诱导的Caspase3、8、9的活化(图4中的F)。上述结果表明，动物水平，拮抗肽P1可抑制KIM1与DR5间的结合，改善顺铂所诱导的肾脏病理损伤及凋亡相关信号通路的激活。
动物水平活性研究：选取8-10周龄雄鼠，腹腔注射30mg/kg顺铂(对照组注射同体积生理盐水)，构建急性肾损伤动物模型，同时给予拮抗肽P1尾静脉注射处理(2针/天，持续给药3天)。3天后，将小鼠处死，取血清进行肌酐和尿素氮的测定，结果显示拮抗肽P1可抑制顺铂所诱导的血清肌酐和尿素氮的堆积；取肾脏组织，包埋后进行组织切片染色，结果表明拮抗肽P1可改善顺铂所诱导的病理损伤；组织水平免疫共沉淀实验验证了拮抗肽P1对KIM1和DR5结合的干预作用；Caspase3、8、9信号通路的蛋白水平检测显示，拮抗肽P1可改善顺铂所诱导的KIM1和DR5下游凋亡信号通路的激活。
细胞水平及动物水平的活性验证结果显示，拮抗肽P1可干预KIM1与DR5的相互结合，并有效改善顺铂所诱导的肾脏损伤，因此拮抗肽P1具有潜在的抗急性肾损伤及其向慢性肾病转变预防和治疗作用。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种拮抗多肽P1，其特征在于，所述拮抗多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1所示；
或者所述拮抗多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有序列SEQ ID NO：1活性的氨基酸序列。
2.一种拮抗多肽P2，其特征在于，所述拮抗多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
或者所述拮抗多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有序列SEQ ID NO：2活性的氨基酸序列。
3.一种拮抗多肽P3，其特征在于，所述拮抗多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1连接SEQID NO：2所示；
或者所述拮抗多肽的氨基酸系列由SEQ ID NO：1连接SEQ ID NO：2的多肽经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SEQ ID NO：1连接SEQ ID NO：2的多肽活性的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的拮抗多肽P1、权利要求2所述的拮抗多肽P2，或者权利要求3所述的拮抗多肽P3用于制备抗急性肾损伤药物的应用。
5.如权利要求1所述的拮抗多肽P1、权利要求2所述的拮抗多肽P2，或者权利要求3所述的拮抗多肽P3用于制备改善急性肾损伤向慢性肾病转变药物的应用。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述拮抗多肽P1用于与肾损伤分子-1特异性结合，从而特异性阻断肾损伤分子-1和死亡受体-5的结合。
7.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述拮抗多肽P2用于与死亡受体-5特异性结合，从而特异性阻断肾损伤分子-1和死亡受体-5的结合。
8.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述拮抗多肽P3用于与肾损伤分子-1和死亡受体-5特异性结合，从而特异性阻断肾损伤分子-1和死亡受体-5的结合。
9.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述拮抗多肽P1和拮抗多肽P2用于改善肾小管上皮细胞和原代肾小管上皮细胞的损伤。
10.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述拮抗多肽P1用于改善血清肌酐和尿素氮的堆积，从而缓解病理损伤；并且，拮抗多肽P1能改善肾损伤分子-1和死亡受体-5下游凋亡信号通路的激活。
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