CN102746380A - 血管生成抑制剂多肽在制备治疗肿瘤及类风湿性关节炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制几种基质金属蛋白酶和抑制血管内皮细胞迁移的血管生成抑制剂，可用于实体肿瘤和类风湿性关节炎的预防和治疗。所述的多肽具体是指：多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV(见Seq NO.1、Seq NO.2、Seq NO.3、Seq NO.4)；这些多肽可用于治疗实体肿瘤和类风湿性关节炎。该四种血管生成抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤。

Description

血管生成抑制剂多肽在制备治疗肿瘤及类风湿性关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶和具有抑制包括血管内皮细胞迁移在内的血管生成抑制剂，可用于血管相关疾病包括肿瘤和类风湿在内的疾病治疗。

背景技术

近年我国肿瘤的发病率和病死率不断增长。无限制生长、侵袭和转移是肿瘤的恶性标志和特征，也是导致治疗失败和死亡的主要原因。因此，控制肿瘤的生长、侵袭和转移是改善预后，提高生存率的主要措施。1971年Folkman首先提出肿瘤生长依赖血管新生的理论，肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础，它不仅向肿瘤提供营养，也向宿主输出大量的肿瘤细胞导致肿瘤的生长和转移。绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。新生血管一方面为肿瘤生长提供营养和氧气，另一方面还是肿瘤转移的重要途径。因此，抑制肿瘤血管形成是重要的抗癌措施。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一组结构相似和功能相关的蛋白内切酶。它们可以切割各种细胞外基质，为炎症细胞和肿瘤细胞的转移打开“通路”；它们可以切割细胞因子或趋化因子，影响炎症细胞的募集；它们还可以切割各种膜连接分子，包括受体和细胞间连接分子，从而调节这些分子的功能。

基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是基质金属蛋白酶的典型代表，它的结构复杂、功能多样并且是一种诱导表达的酶。研究发现，MMP-9可以在几个方面促进肿瘤生长。首先，MMP-9是肿瘤部位血管增生的“开关”，它可以切割细胞外基质，释放连接于基质上的VEGF，促进血管增生，血管增生是肿瘤生长的前提条件。这一点可由MMP-9基因敲除小鼠抑制肿瘤部位血管增生得到证明。MMP-9还可以通过从细胞外基质释放VEGF的方式促进淋巴管增生，促进肿瘤转移。其次，肿瘤细胞以及进入肿瘤组织的巨噬细胞和T细胞表面都表达有TNF-α前体，几种金属蛋白酶(包括MMP-9)可以切割并释放有活性的TNF-α，促进血管增生和抑制肿瘤细胞的凋亡。另外，肿瘤部位的炎症细胞表达的MMP-9可以通过两个方面激活TGF-β途径，一是把TGF-β前体切割成有活性的TGF-β，二是切割TGF-β连接蛋白，把TGF-β从细胞外基质上释放出来，活化的TGF-β抑制免疫系统，却不抑制肿瘤本身的生长，从而间接的促进肿瘤生长。

MMP抑制剂不但可抑制肿瘤的生长和转移，还具有靶向功能，早在1999年，Koivunen就发现表达了MMP-9多肽抑制剂序列的噬菌体可富集于肿瘤部位。Schafers用MMP-9抑制剂将¹²³I带到肿瘤组织中的MMP-2和MMP-9高表达部位。在最近的研究中，用荧光探针标记的多肽片段(MMP的多肽底物)可以把肿瘤部位的MMP-2，MMP-9和MMP-14的活力定位于转移细胞的前端(已经做到亚细胞定位)。以上的例子表明MMP抑制剂具有靶向功能，不但可早期检测到肿瘤组织，还可以把目的物带到肿瘤部位。MMP-9多肽抑制剂的优势在于，其序列可以连接到其它有抗肿瘤活性的多肽或蛋白质上，新的分子不但可以抑制MMP-9活力，还可以通过MMP-9多肽抑制剂部分把有抗肿瘤活性的成分富集于肿瘤部位，提高其抗肿瘤效果。

内皮抑素是一种内源性血管增生抑制剂，但其分子中含有多个二硫键，作为基因工程表达产品，其生产工艺难于控制，影响到产物活性的发挥。

发现内皮抑素的50-60个氨基酸(ES-2)在体外具有很好的抑制血管生成的活性，甚至高于内皮抑素本身的活性。Xu小组研究发现ES-2在鸡胚尿囊膜(CAM)实验中抑制血管增生活性很高，但在小鼠移植肿瘤模型给药中并无此活性。这可能是因为体内实验中ES-2不能在肿瘤部位形成有效浓度。

基于这些研究结果，本实验室将MMP-9多肽抑制剂连接于ES-2的N端或C端，获得新的多肽。新多肽可以直接抑制MMP-9的活力，抑制肿瘤生长和转移；还可以把ES-2富集于肿瘤部位，增加其在肿瘤部位有效浓度，增强其抗肿瘤活性。根据这个思路设计的多肽在C57B1/6小鼠上显著的抑制了黑色素瘤B16F10的生长，证明了设计思路的正确性和可行性。

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是临床最常见的炎性关节病和主要致残因素之一。在全世界发病率约为0.5％-1.0％，在我国约为0.4％。RA可发生于任何年龄，随着年龄的增长，发病率也随之增高。女性高发年龄为45-55岁，性别与RA发病关系密切，男女之比约1∶3。RA是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。患者常以手部或腕部疼痛及肿胀(特别是腕背部的肿胀)为首发症状，症状持续不缓解，普通的对症治疗虽可以缓解症状，但常常由于用药不规则或不足量而导致症状反复。病情进展时可以出现明显的晨僵，通常可达1小时以上，并不断加重；同时出现一定的关节功能障碍。

RA的病理过程中，血管新生是一种标志性的组织学改变，新生血管形成伴随滑膜增生和炎细胞浸润，是RA中血管翳形成及关节破坏的基础。原来应该没有血管存在的关节软骨因某种异常变化，而形成新的血管，使得软骨受到侵蚀，造成关节变形或疼痛。新生血管引起类风湿关节炎患者滑膜组织发生异常变化，正常人的关节滑膜内层仅1-2层细胞组成，而RA患者的滑膜内层通常有4-10层细胞(有时甚至超过20层)。这些细胞不仅在数量上异常增多，而且在功能上处于异常活跃的状态，它们可以分泌大量的细胞因子、信号分子和蛋白酶，加速关节破坏的进程。另外，RA滑膜中还有大量炎性细胞的浸润，如T细胞、B细胞和单核细胞。因此，血管抑制多肽通过抑制血管生成不仅可阻止向滑膜输送氧气和营养物质，且直接导致血管退化，从而可能抑制RA滑膜增生。抑制新生血管的形成是治疗这类疾病的关键，而内皮细胞的增殖和迁移是新生血管形成的关键步骤。此外该序列中还含有新生血管抑制序列，研究发现其具有高效抑制新生血管生成的活性，特别是对类风湿性关节炎类疾病有很好的治疗作用。血管抑制多肽针对抑制血管新生治疗类风湿关节炎的作用靶点，为开发新型类风湿关节炎药物提供新的研究方向。

此外，在关节滑膜腔中，有大量炎症细胞释放的基质金属蛋白酶-9，本专利所设计的多肽本身有抑制基质金属蛋白酶-9的活力，可以减少该酶对滑膜组织的破坏，缓解类风湿性关节炎的症状。

新设计的多肽具有抑制包括基质金属蛋白酶-9在内的几种基质金属蛋白酶和抑制血管内皮细胞迁移两种作用，前期研究发现多肽能够抑制内皮细胞的迁移、小管生成，并发现其能体内抑制不同瘤株的生长。进一步研究发现其对类风湿性关节炎有治疗作用，增加了适用症，拓展了其社会价值和经济价值。

发明内容

发明目的

本发明针对多肽I、多肽II、多肽III、多肽IV做了进一步研究，发现其对多种实体肿瘤和类风湿性关节炎有治疗作用，增加了其适应症。

技术方案

血管生成抑制剂多肽，其特征在于其氨基酸序列为：

在序列Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸)的N端或C端加上血管抑制多肽序列X或序列Y，或Z序列，其中X的序列为Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Y的序列为

Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly，Z的序列为

Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro。

根据权利要求1所述的血管抑制多肽序列，其特征在于所述的多肽序列包括

多肽I：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu(其中Pyr为3-(3吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸)；

多肽II：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸)；

多肽III：Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸)；

多肽IV：Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸)。

根据权利要求1、2任意一项所述的血管生成抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱或睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤。

根据权利要求根据权利要求1、2任意一项所述的血管生成抑制剂，其特征在于所述的多肽共价连接佐剂，佐剂是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或聚乙二醇。

根据权利要求1、2任意一项所述的血管生成抑制剂多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。

根据权利要求3血管生成抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的药物组合物可通过多种给药方式治疗原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤及肉瘤，包括皮下或肌肉注射，静脉注射或者静脉滴注，口服给药如药丸、胶囊等，鼻喷剂。

根据权利要求1、2任意一项所述的血管生成抑制剂的制备方法，其特征在于所述的多肽是通过合成方法制备而得。

有益效果

先前报道Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu{其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸}具有抑制基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9和肿瘤坏死因子释放酶的活力，因此该多肽有抑制急性炎症的作用(参考文献1)。本专利在此基础上构建了新的多肽序列，新序列拓展了原来多肽的应用范围，将其应用于抗肿瘤领域。

多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro具有抑制血管内皮细胞迁移的活性(参考文献2)，但不能在体内抑制肿瘤细胞的生长，现将多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro连接于多肽Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu的C端或N端(多肽II和多肽IV还在其中加入4个Gly以增加整个分子的柔性)，获得了全新的多肽，这些多肽使Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu具有了新的功能，能够抑制实体肿瘤包括C57bl/6小鼠上黑色素瘤细胞B16F10在内的生长。这些多肽分子有望发展成为血管生成抑制剂类抗肿瘤药物，拓展了其社会价值和经济价值。

本专利还将多肽I，多肽II，多肽II和多肽IV应用于抗类风湿性关节炎上，进一步拓展了其应用范围。

参考文献1.Hu J，Dubois V，Chaltin P，Fiten P，Dillen C，Van den Steen PE，Opdenakker G.Inhibition of lethal endotoxin shock with an L-pyridylalanine containing metalloproteinase inhibitorselected by high-throughput screening of a new peptide library.Comb Chem High ThroughputScreen.2006，9(8)：599-611.

参考文献2.

SA，Alitalo K，Keski-Oja J.An endostatin-derived peptide interacts withintegrins and regulates actin cytoskeleton and migration of endothelial cells.J Biol Chem.2004May 7；279(19)：20178-85.

附图说明

附图1    多肽II对血管内皮细胞迁移的抑制作用；

具体实施方式

实施例1

血管生成抑制剂多肽的制备及检验

多肽采用固相合成法合成，采用高效液相色谱法纯化，并采用MS测定多肽的分子量，RP-HPLC测定多肽的纯度。

多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV固相合成法是以Fmoc-Rink-resin为起始原料，然后用保护氨基酸依次接各氨基酸，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得血管生成抑制剂粗品。将粗品溶解，用制备型高效液相经过两次纯化，最后浓缩冻干得到纯品。该方法不仅保证了合成的效率，又提高了纯度。

1.接肽的步骤如下：

称取Fmoc-Rink-resin适量，倒入玻璃砂芯反应柱中，加入CH₂Cl₂适量使树脂充分膨胀。

a、脱帽：加入六氢吡啶/DMF的脱帽液适量，反应一段时间后将脱帽液抽干，中间用DMF洗涤一次，然后再加入一次脱帽液适量反应，脱去Fmoc保护基。

b、洗涤：将脱帽液抽干，用DMF洗涤树脂几次，充分洗净副产物。

c、缩合：将用于接肽的保护氨基酸和激活剂溶于DMF和缩合剂中，摇匀，并充分反应。

d、洗涤：将反应液抽干，用DMF充分洗涤树脂，洗净副产物。

所述切肽的步骤如下：

把抽干的树脂装入圆底烧瓶中，加入切割液充分裂解合好的二十二肽中间体，用砂芯漏斗将树脂与多肽分离，所述的裂解液的体积组成为：三氟乙酸∶苯酚∶水∶苯甲硫醚∶EDT＝86∶2∶4∶3∶5。

2.后处理步骤如下：先加无水乙醚到切割液中将多肽析出，然后离心，把清液倒掉，然后再用无水乙醚洗涤多肽，抽干得多肽粗品。

3.纯化的步骤如下：

a、溶解：称取粗品配制成5-20g/l的溶液，用0.45μm的混合滤膜过滤。

制备：①一次纯化：用30％-40％的乙腈和60％-70％的缓冲溶液，流速为50 ml/min-100ml/min下冲洗10 min-20 min平衡制备柱。用输液泵上样，采集基线，收集紫外波长220nm吸收值大于200 mv的溶液，检验是否有样品。用梯度洗脱，乙腈的起始百分数为10％-20％，30-50 min后乙腈的百分数为80％-90％。收集紫外波长220 nm吸收值大于200mv的溶液，检测纯度大于95％的合并作为峰顶，待做二次分离纯化。②二次纯化：将一次收到的峰顶旋转蒸发掉有机溶剂后用输液泵上样，用30％-40％的乙腈和60％-70％的缓冲溶液。流速50-100 ml/min，并采集基线，收取在紫外波长220 nm吸收大于200 mv的溶液，检测是否有样品冲出。用梯度洗脱，乙腈的起始百分数为10％-20％，30-50 min后乙腈的百分数为80％-90％。收取在紫外波长220 nm吸收大于200 mv的溶液，通过检测纯度大于95％的作为合格。

b、浓缩、过滤、冻干：将合格溶液用旋转蒸发仪37℃减压浓缩，除去残留溶剂和注射用水。最后用0.22μm滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进行冷冻干燥。

4.纯度检测及分子量检测

收集冻干后的纯化产物，通过反向液相检测多肽纯度分析纯度。

本实验成功采用固相合成法合成了血管生成抑制剂多肽，此方法重复性高，可操作性强，污染少；实验可采用Rink树脂来合成多肽，相对其它树脂比较稳定，副反应少，工艺粗品峰型较好，纯化相对收率高，所以成本相对较低。

结果：合成的多肽经反向液相色谱分析进行纯度鉴定结果为96.18％，纯度均大于95％，符合设计要求。

实施例2

血管生成抑制剂对几种靶点酶的抑制作用。

实验方法：重组人基质金属蛋白酶-9由Sf9昆虫细胞表达.该酶用0.01μM的基质金属蛋白酶-3活性位点活化，所用的缓冲液为100 mM Tris/HCl，pH 7.4，100 mM NaCl，10 mM CaCl₂ and0.01％Tween-20。活化时基质金属蛋白酶-9的浓度为92ng/μl(1μM)。酶活力的检测是通过切割荧光产生多肽底物Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂并检测产生的荧光值实现的(激发波长＝328nm，检测波长＝392nm).所有的检测在37℃下100μl反应体系中进行。

重组人基质金属蛋白酶-8的检测与-9的检测类似并使用同样的荧光产生底物。反应也是在37℃下100μl反应体系中进行。检测时向反应体系中加20μl重组人基质金属蛋白酶-8(2ng/μl).底物的终浓度为10μM。

重组人基质金属蛋白酶-3用另外一个荧光产生底物Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH₂来检测(激发波长＝320 nm，发射波长＝405 nm)。反应在37℃下100μl反应体系中进行。反应开始时向反应体系中加10μl基质金属蛋白酶-3存储液(1 ng/μl)底物的终浓度为10μM。

肿瘤坏死因子释放酶的活力是通过切割荧光产生底物Mca-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Dpa-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-NH检测的(激发波长＝320 nm，发射波长＝405 nm)。反应在37℃下100μl反应体系中进行。反应开始时向反应体系中加4μl基质金属蛋白酶-3存储液(1 ng/μl)底物的终浓度为10μM。

结果：新设计的多肽保留了对几种靶点酶的抑制作用，如表1所示。

表1.血管生成抑制剂对几种基质金属蛋白酶和肿瘤坏死因子释放酶的抑制作用

实施例3

血管生成抑制剂多肽对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移抑制试验

将10 mg/ml Matrigel(BD公司，USA)用HUVEC专用培养基以1∶2稀释，涂布于transwell小室膜上，室温风干。将培养到对数生长期的HUVEC细胞消化，收集，计数，将细胞浓度调整到1×10⁵个/ml。将细胞接种到transwell小室中，每孔100μl，并且将各组试验用液加入小室中。24孔板中加入0.6ml含5％胎牛血清和1％ECGS的内皮细胞培养液刺激细胞迁移，于5％CO₂，37℃培养24h。弃去孔中培液，细胞定，染色，清水漂净，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算迁移抑制率(migration inhibition，MI)：

$\mathrm{MI}(\%)=1-\frac{N_{\mathrm{test}}}{N_{\mathrm{control}}}\×100\%$

其中N_test为测试组的细胞迁移数，N_control为空白对照组的细胞迁移数。

表2.血管生成抑制剂多肽I，II，III，IV对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用

a：^*P＜0.05，^**P＜0.01.

结果：多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV都可抑制血管内皮细胞的迁移，在1μg/ml剂量下其抑制率分别为65.54％、80.95％、79.79％和60.76％，四条多肽在该剂量下的细胞迁移数与对照组比有极显著性差异。

实施例4

血管生成抑制剂多肽对黑色素瘤B16F10 C57BL/6黑鼠移植肿瘤生长抑制试验

取生长旺盛期的瘤组织在无菌条件下碾磨，制备成1×10⁷个/ml细胞悬液，以0.1 ml接种于小鼠右侧腋部皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200 mm³后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察整合素阻断剂多肽对受试动物肿瘤的抑制效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组左侧腋部皮下注射多肽，阴性组同时给等量生理盐水，给药14 d，紫杉醇组每3天皮下给药一次，多肽一天给药一次。治疗14 d后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计t检验，^*P＜0.05为显著性差异，^**P＜0.01为极显著性差异。

表3.多肽I，II，III，IV对黑色素瘤B16F10 C57BL/6黑鼠移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对黑色素瘤B16F10 C57BL/6黑鼠移植肿瘤生长制作用见表3。紫杉醇组10 mg/kg，对黑色素瘤B16F10 C57BL/6黑鼠移植肿瘤的抑瘤率为80.97％，但对实验动物的体重有显著影响，毒副作用较明显。多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV在10 mg/kg/次剂量下对黑色素瘤B16F10的抑瘤率分别为51.10％，53.36％，51.92％和54.39％。

实施例5

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

取生长旺盛期的瘤组织在无菌条件下碾磨，制备成1×10⁷个/ml细胞悬液，以0.1 ml接种于小鼠右侧腋部皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200 mm³后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察整合素阻断剂多肽对受试动物肿瘤的抑制效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射多肽，阴性组同时给等量生理盐水，给药14 d。阳性组为阿瓦斯汀。阿瓦斯汀每3天尾静脉给药一次，其他组一天尾静脉给药一次。给药后休息一周，21 d后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计t检验，^*P＜0.05为显著性差异，^**P＜0.01为极显著性差异。

表4.多肽I，II，III，IV对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表4，阿瓦斯汀组，对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为77.50％，对实验动物的体重无显著影响；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为63.01％，62.86％，64.21％和63.82％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例6

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人胃癌MGC-803裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药奥沙利铂每4天尾静脉给药一次，希罗达灌胃给药每两天给药尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表5.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人胃癌MGC-803裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人胃癌MGC-803裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表5，化药联合用药组，对人胃癌MGC-803裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为58.23％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg次剂量下对人胃癌MGC-803裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为58.69％，56.03％，62.15％和69.72％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例7

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人肺癌H460裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药紫杉醇组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表6.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人肺癌H460裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人肺癌H460裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表6，化药紫杉醇组，对人肺癌H460裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为68.54％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人肺癌H460裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为67.56％，70.42％，63.48％和60.37％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例8

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人肝癌SMMC-7721裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药紫杉醇组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表7.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人肝癌SMMC-7721裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人肝癌SMMC-7721裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表7，化药紫杉醇组，对人肝癌SMMC-7721裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为78.10％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人肝癌SMMC-7721裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为66.12％，62.55％，63.58％和65.12％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例9

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人宫颈癌HeLa裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药顺铂组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表8.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人宫颈癌HeLa裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人宫颈癌HeLa裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表8，化药顺铂组，对人宫颈癌HeLa裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为73.76％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人宫颈癌HeLa裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为65.61％，62.41％，62.49％和61.19％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例10

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人子宫内膜癌HHUA裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药紫杉醇组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表9.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人子宫内膜癌HHUA裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人子宫内膜癌HHUA裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表9，化药紫杉醇组，对人子宫内膜癌HHUA裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为80.70％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10mg/kg/次剂量下对人子宫内膜癌HHUA裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为64.56％，63.21％，63.01％和60.54％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例11

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人前列腺癌DU-145裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药顺铂组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表10.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人前列腺癌DU-145裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人前列腺癌DU-145裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表10，化药顺铂组，对人前列腺癌DU-145裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为74.48％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人前列腺癌DU-145裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为63.45％，60.90％，64.01％和62.83％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例12

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人睾丸癌5637裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药5-氟尿嘧啶组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表11.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人睾丸癌5637裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人睾丸癌5637裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表11，化药5-Fu组，对人睾丸癌5637裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为77.74％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10mg/kg/次剂量下对人睾丸癌5637裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为64.15％，65.11％，66.00％和64.32％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例13

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药阿瓦斯汀组每2天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表12.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表12，阿瓦斯汀组，对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为78.51％，与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为65.45％，64.62％，65.12％和60.19％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例14

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人膀胱癌HT1376裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药阿瓦斯汀组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表13.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人膀胱癌HT1376裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人膀胱癌HT1376裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表13，阿瓦斯汀组，对人膀胱癌HT1376裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为81.89％，与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人膀胱癌HT1376裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为65.24％，66.94％，64.78％和61.10％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例15

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人胰腺癌SW-1990裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药阿瓦斯汀组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表14.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人胰腺癌SW-1990裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人胰腺癌SW-1990裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表14，阿瓦斯汀组，对人胰腺癌SW-1990裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为79.84％，与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人胰腺癌SW-1990裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为67.24％，68.64％，66.78％和62.97％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例16

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人食管癌Ec109裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药阿瓦斯汀组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表15.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人食管癌Ec109裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人食管癌Ec109裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表15，阿瓦斯汀组，对人食管癌Ec109裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为69.00％，与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响；多肽I，II，III，IV在10mg/kg/次剂量下对人食管癌Ec109裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为67.62％，67.13％，66.23％和63.88％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例17

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人结肠癌HT-29裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药顺铂组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表16.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人结肠癌HT-29裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人结肠癌HT-29裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表16，化药顺铂组，对人结肠癌HT-29裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为79.31％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人结肠癌HT-29裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为66.42％，65.62％，66.00％和61.96％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例18

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人甲状腺癌SW-579裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药顺铂组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表17.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人甲状腺癌SW-579裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人甲状腺癌SW-579裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表17，化药顺铂组，对人甲状腺癌SW-579裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为75.00％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人甲状腺癌SW-579裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为60.42％，60.58％，63.00％和56.94％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例19

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人肾癌A498裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药顺铂组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表18.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人肾癌A498裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人肾癌A498裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表18，化药顺铂组，对人肾癌A498裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为79.83％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人肾癌A498裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为60.00％，55.36％，50.12％和61.41％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例20

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药顺铂组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表19.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表19，化药顺铂组，对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为78.36％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为62.04％，66.63％，64.12％和62.76％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例21

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对肉瘤HT-1080裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药5-氟尿嘧啶组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表20.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对肉瘤HT-1080裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人肉瘤HT-1080裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表20，化药5-Fu组，对肉瘤HT-1080裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为78.10％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10mg/kg/次剂量下对人肉瘤HT-1080裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为62.56％，59.90％，62.12％和54.43％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例22

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人喉癌Hep-2裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药阿瓦斯汀组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表21.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人喉癌Hep-2裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人喉癌Hep-2裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表21，阿瓦斯汀组，对人喉癌Hep-2裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为76.79％，对实验动物的体重无显著影响；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人喉癌Hep-2裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为64.56％，65.13％，63.23％和60.41％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例23

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人脑瘤SF763裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药紫杉醇组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表22.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人脑瘤SF763裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人脑瘤SF763裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表22，化药紫杉醇组，对人脑瘤SF763裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为76.29％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人脑瘤SF763裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为60.25％，59.76％，63.78％和65.02％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例24

血管生成抑制剂多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人直肠癌Colo 320裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

肿瘤接种及检测评价方法见实施例5。阳性对照药紫杉醇组每3天尾静脉给药一次，其他组每天尾静脉给药一次。

表23.多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对人直肠癌Colo 320裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：多肽I，II，III，IV对人直肠癌Colo 320裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用见表23，化药紫杉醇组，对人直肠癌Colo 320裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为76.62％，但对实验动物的体重有显著影响，与阴性组和多肽给药组动物体重相比较轻，毒副作用较明显；多肽I，II，III，IV在10 mg/kg/次剂量下对人直肠癌Colo 320裸小鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为61.26％，60.89％，63.21％和65.42％，在此剂量下四条多肽组肿瘤体积与阴性组肿瘤体积相比有极显著性差异。与阴性对照组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例25

多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

构建胶原型小鼠关节炎动物模型，研究多肽对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen inducedarthritis，CIA)的治疗作用。采用小鼠作为受试动物，SPF级DBA/1小鼠(由上海西普尔-必凯实验动物有限公司(Sino-British SIPPR Lab.Animal Ltd)提供，动物生产许可证号码：SCXK(沪)2008-0016)，雄性，7-8周龄，体重为18-22g，随机分组，分别是正常对照组，模型对照组，多肽I至多肽IV组(10 mg/kg)，阳性药对照组(甲氨蝶呤1 mg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建立小鼠CIA模型，方法是鸡软骨III型胶原(cIII)用0.1 mol/l醋酸溶解成4 mg/ml的溶液，于4℃冰箱过夜。实验当天用III型胶原与含4 mg/ml Myeobaeterium tuberculosis strainH37Rv的完全弗氏佐剂(CFA)等体积充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮内每只注射乳化剂50μl进行致敏，21 d后用4 mg/ml的III型胶原(cIII)与不完全弗氏佐剂(IFA)等体积充分乳化后以相同剂量的乳化剂于尾部进行再次免疫。造模第30 d起皮下注射给药：多肽I至多肽IV(10 mg/kg)：每日两次，连续10天；阳性药对照组(甲氨蝶呤1 mg/kg)：每五天一次，连续3次；正常对照组和模型对照组(生理盐水)：连续10天。分别于造模后第21天至第70天每3天称量体重、关节评分、分别检测左右后足足踝直径来观察药物对小鼠胶原型关节炎的影响。在第70 d，脱臼处死小鼠。

关节炎评价指标如下：

1)关节评分：四肢：按0-4五级评分：0＝无红斑或红肿；1＝轻微的红斑或肿胀，其中的一个前/后趾关节有红斑或肿胀；2＝多于一只趾出现红斑或肿胀；3＝踝或腕关节下的足爪肿胀；4＝包括踝关节在内的全部足爪肿胀。小鼠四只足分别评分，最高评分为16分。分别于造模后第21天至第70天每3天进行关节评分，并记录结果。

2)测量足踝直径

分别于造模前和造模后第21天至第70天每3天用游标卡尺测量小鼠左、右足踝内侧到外侧的直径和足踝厚度，并记录结果。

试验结果的计量资料以数学平均数加减标准差(mean±SD)表示，用SPSS 11.0软件进行各给药组与对照组之间进行t检验，表中^*表示p＜0.05，^**表示p＜0.01。

结果：造模后小鼠与正常小鼠相比较，在小鼠尾部皮内注射含灭活的结核分枝杆菌完全弗氏佐剂和胶原等体积混合的乳化剂，21天后尾部皮内注射不完全弗氏佐剂和胶原等体积混合的乳化剂左后，免疫后第27天，CIA小鼠足爪红肿，关节炎指数评分增高，模型组第45-60天为肿胀高峰，模型组自第35天开始体重几乎不增加，后期还略微有下降。

多肽I至多肽IV在胶原诱导小鼠关节炎动物模型都能发挥体内免疫保护作用，结果见表24：阳性对照组、多肽I至多肽IV组足爪肿胀度与模型组比较，均有极显著性差异(p＜0.01)实验结果具有统计学意义。阳性对照组、多肽I至多肽IV组关节肿胀度与模型组比较，均有极显著性差异(p＜0.01)，实验结果具有统计学意义多肽I至多肽IV组四肢评分显著低于模型对照组(p＜0.01)，与模型对照组比较极显著性差异，实验结果具有统计学意义。

表24.多肽I对胶原型类小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

^*表示p＜0.05，^**表示p＜0.01.

结论：多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对小鼠胶原型关节炎具有治疗作用。

实施例26

多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV对佐剂型大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

构建佐剂型大鼠关节炎动物模型，研究多肽对佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis，AA)大鼠的治疗作用。采用大鼠作为受试动物，SPF级SD大鼠(由上海西普尔-必凯实验动物有限公司(Sino-British SIPPR Lab.Animal Ltd)提供，动物生产许可证号码：SCXK(沪)2008-0016)，雄性，体重为140 g-160 g，随机分组，分别是正常对照组，模型对照组，多肽I至多肽IV组(10 mg/kg)和阳性药对照组(甲氨蝶呤1mg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建立大鼠AA模型，方法是在大鼠的左侧后足足跎注射含灭活的结核分枝杆菌(H37RA，10 mg/ml)完全弗氏佐剂0.08 ml造成大鼠佐剂性关节炎模型。造模第10天起皮下注射给药：多肽I至多肽IV组(10 mg/kg)：每日两次，连续10天；阳性药对照组(甲氨蝶呤1 mg/kg)：每五天一次，连续3次；正常对照组和模型对照组(生理盐水)：连续10天。分别于造模后第8，11，14，17，20，23和26天，关节评分、分别检测左右后足足踝直径来观察药物对大鼠佐剂型关节炎的影响。

关节炎评价指标如下：

1)关节评分四肢：按0-4五级评分：0＝无红斑或红肿；1＝轻微的红斑或肿胀，其中的一个前/后趾关节有红斑或肿胀；2＝多于一只趾出现红斑或肿胀；3＝踝或腕关节下的足爪肿胀；4＝包括踝关节在内的全部足爪肿胀。大鼠四只足分别评分，最高评分为16分。

分别于造模后8，11，14，17，20，23和26天进行关节评分，并记录结果。

2)测量足踝直径

分别于造模前和造模后8，11，14，17，20，23和26天用游标卡尺测量大鼠左、右足踝内侧到外侧的直径和足踝厚度，并记录结果。

试验结果的计量资料以数学平均数加减标准差(mean±SD)表示，用SPSS 11.0软件进行各给药组与对照组之间进行t检验，表中^*表示p＜0.05，^**表示p＜0.01。

结果：造模后大鼠与正常大鼠相比较，在大鼠左后足跎处注射含灭活的结核分枝杆菌完全弗氏佐剂后，左后足会迅速产生原发性关节炎，出现明显的肿胀，并伴有溃烂；右后足大约10 d后开始出现继发性关节炎，评分的分值逐渐增大；同时耳部血管增生明显，红肿明显；尾部关节出现肿胀。

多肽I至多肽IV在胶原诱导大鼠关节炎动物模型都能发挥体内免疫保护作用，结果见表25：大鼠阳性对照组、多肽I至多肽IV组左后足踝直径与模型组比较，有极显著性差异(p＜0.01)，实验结果具有统计学意义。大鼠阳性对照组、多肽I至多肽IV组右后足踝直径与模型组比较，有显著性差异(p＜0.05)。多肽I至多肽IV组四肢评分显著低于模型对照组(p＜0.05)，与模型对照组比较差异均有统计学意义。

表25.多肽I对佐剂型类大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

实例27

PEG修饰的多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV体外对血管内皮细胞(HUVEC)迁移的抑制作用

PEG是pH中性、无毒、无抗原性、具有高度亲水性的高分子聚合物。蛋白及多肽类药物经PEG修饰后热稳定性增强，对酶降解敏感程度降低，溶解度增加，在体内循环半衰期、清除时间延长，免疫原性和抗原性降低及毒性减小。本实验室成功的用分子量20KD的PEG在N端定点修饰了多肽I至多肽IV，纯化后纯度大于96％，并用血管内皮细胞(HUVEC)迁移实验检测PEG修饰对多肽活性的影响。

试验方法见实例3，结果见表26。

表26.PEG修饰的多肽I，II，III，IV对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用

a：^*P＜0.05，^**P＜0.01.

结果：由表26可见，PEG修饰的多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV在10μg/ml剂量下对血管内皮细胞HUVEC迁移的抑制百分率分别为62.31％、75.12％、73.01％和56.98％，在该剂量下四条多肽组迁移的细胞数与对照组相比有极显著性差异。

Claims (7)

1.血管生成抑制剂多肽，其特征在于其氨基酸序列为：

在序列Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸)的N端或C端加上血管抑制多肽序列X或序列Y，或序列Z，其中X的序列为

Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Y的序列为

Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly，Z的序列为

Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro。

2.根据权利要求1所述的血管抑制多肽序列，其特征在于所述的多肽序列包括

多肽I：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸)；

多肽II：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸)；

多肽III：Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(其中Pyr为3-(3-吡啶基)L丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸)；

多肽IV：Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu--Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4，4’-联苯丙氨酸)。

3.根据权利要求1、2任意一项所述的血管生成抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱或睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤。

4.根据权利要求根据权利要求1、2任意一项所述的血管生成抑制剂，其特征在于所述的多肽共价连接佐剂，佐剂是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或聚乙二醇。

5.根据权利要求1、2任意一项所述的血管生成抑制剂多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。

6.根据权利要求3血管生成抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的药物组合物可通过多种给药方式治疗原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤及肉瘤，包括皮下或肌肉注射，静脉注射或者静脉滴注，口服给药如药丸、胶囊等，鼻喷剂。

7.根据权利要求1、2任意一项所述的血管生成抑制剂的制备方法，其特征在于所述的多肽是通过合成方法制备而得。

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