KR102003422B1 - 인테그린 차단제 폴리펩타이드 및 그의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 약물 분야에 관한 것이며, 구체적으로 종양 혈관의 생성을 억제하고, 인테그린 친화성과 결합 능력을 가진 인테그린 차단제에 관한 것이며, 고형 종양과 류마티스 관절염의 예방 및 치료에 이용될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 구체적으로 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III(Seq NO.1, Seq NO.2, Seq NO.3 참고)를 가리킨다. 상기 폴리펩타이드는 고형 종양과 류마티스 관절염의 치료에 이용될 수 있다. 상기 3종류의 인테그린 차단제 폴리펩타이드는 두경부, 뇌부, 갑상선, 식도, 췌장, 폐장, 간장, 위, 유방, 신장, 담낭, 결장/직장, 난소, 자궁, 자궁경부, 전립선, 방광, 고환에서 발생하는 원발성/계발성 암, 흑색종 또는 육종인 종양을 치료하는 약물의 제조에 응용된다.
Description
본 발명은 약물 분야에 관한 것이며, 구체적으로 종양 혈관의 생성을 억제하고, 인테그린 친화성 및 결합능력을 가진 인테그린 차단제에 관한 것이다. 이러한 인테그린 차단제는 2종의 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 인테그린 폴리펩타이드는 고형 종양과 류마티스 관절염의 치료에 사용될 수 있다.
최근 중국에서 종양의 발병률 및 치사률이 계속하여 증가하고 있다. 무제한 성장, 침습과 전이는 악성 종양의 대표적 특징이며, 또한 치료 실패와 사망의 주요원인이기도 하다. 따라서, 종양의 성장, 침습과 전이를 억제하는 것은 예후를 개선하여 생존율을 높이는 주요 대책이다. 종양 성장은 혈관 신생에 의존한다는 이론을 1971년에 Folkman가 먼저 제출하였고, 종양 혈관 생성은 종양 성장과 전이의 형태학 기초이며, 종양에 영양을 제공할 뿐만 아니라, 숙주에 대량의 종양세포를 보내어 종양의 성장과 전이를 일으킨다고 하였다. 난소암, 간암, 자궁경부암과 유방암과 같은 대부분의 악성 고형 종양은 혈관 의존성 종양이다. 신생 혈관은 한편으로 종양 성장에 영양과 산소를 제공하고, 다른 한편으로는 종양 전이의 중요 경로이다. 따라서, 종양 혈관의 형성을 억제하는 것은 중요한 항암 조치이다.
인테그린은 세포 표면에 광범위하게 분포되어 있는 수체이며, 혈관 내피 세포와 종양 세포의 부착을 매개하고, 이들은 세포 내의 세포 골격 단백질과 세포 외의 기질 분자를 연결하는 상호 작용을 통해 혈관 생성과 종양 전이에 참여한다. 현재 적어도 8종의 인테그린(α1β1 、 α2β1 、 α3β1 、 α6β1 、 α6β4 、 α5β1 、 αvβ3 、αvβ5)이 종양 혈관 생성에 참여하며, 그중 αvβ3이 중요 작용을 발휘한다. αvβ3은 αv서브유닛(CD51, 150kD)과 β3서브유닛(CD61, 105kD)으로 형성된 막관통 헤테로다이머 당단백질이며, VN 수체라고도 한다. αvβ3는 리간드 분자 중의 RGD 서열(arg-gly-asp)을 식별할 수 있다. αvβ3는 다양한 세포 유형에서 발현될 수 있으며, 다양한 세포 활동 과정에서 다양한 리간드와 결합하여, 종양의 혈관 생성, 침습 및 전이 과정에 참여한다. RGD 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 인테그린 길항제 작용을 가지며, 세포 표면의 접착분자의 발현을 줄일 수 있어, 세포 내의 신호 전달을 조절하여, 종양 혈관 생성을 억제하여 종양 성장과 전이를 억제한다. 따라서, 인테그린을 타겟으로 하는 인테그린 차단제는 인테그린의 하류의 세포 내 신호전달을 차단할 수 있어, 종양 혈관 생성을 효과적으로 억제하여, 종양 성장과 전이를 억제하므로, 종양치료에서 광활한 응용 전망을 가진다.
현재, 국제적으로 개발된 인테그린 차단제는 Ⅱ기 임상실험에 진입했다. 그러나, 중국 시장에는 유사하거나 같은 종류의 제품이 아직 없어, 자주적인 지식재산권을 갖는 이러한 약물을 개발하는 것이 매우 필요하다. 중국출원번호가 ZL200610039298.2이고, 발명 명칭이 혈관 생성 억제 폴리펩타이드 및 그 제조 방법과 응용인 중국 특허는, 주로 인테그린의 제6-49번째 아미노산에 대해 개조 및 수식을 하였고, 수식 및 개조 후의 폴리펩타이드는 엔도스테틴(endostatin)보다 더욱 좋은 체내 활성과 종양 표적성을 가진다. 상기 특허에서는 여러 종류의 인테그린 억제제를 소개하였고, 그중 2가지는 Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe(EDSM-1이라 약칭, Seq NO.4 참고), Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys(EDSM-2이라 약칭, Seq NO.5 참고)이다. 상기 2가지 서열에는 인테그린 리간드 서열 Arg-Gly-Asp, Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys(Seq NO.6 참고) 및 신생혈관 억제 서열(Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe, Seq NO.7 참고)을 포함한다. 상기 특허에서는 폴리펩타이드 EDSM-1과 EDSM-2의 복제(clone), 원핵세포 발현벡터의 구축과 EDSM-1의 간암 및 위암 치료에 대해서만 초보적으로 연구하였다. 본 발명은 엔도스테틴 서열에 대해 추가 연구를 하였고, 인테그린의 제6~48번째 아미노산이 더욱 좋은 혈관 생성 억제 작용을 가지고 있음을 발견하여, 이 아미노산에 대해 수식을 진행하였으며, 수식 후의 폴리펩타이드는 혈관 생성 억제 서열 Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala(Seq NO.1 참고)의 N단/C단에 인테그린 리간드 서열(Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly)을 추가하여 2종류의 인테그린 차단제, 즉 폴리펩타이드Ⅱ(Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala(Seq NO.2 참고))와 폴리펩타이드Ⅲ(Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp(Seq NO.3 참고))를 만들었고, 인테그린 리간드 서열에 RGD 서열((Arg-Gly-Asp)을 포함함으로써, 상기 폴리펩타이드 서열로 하여금 종양 특이성이 발현되는 인테그린 아형에 효과적으로 결합될 수 있게 하며, 또한 해당 서열에 신생 혈관 억제 서열이 포함되어 있어, 종양 신생 혈관의 형성을 억제하여 종양의 성장과 전이를 억제하는 효과를 이룬다. 새로 설계된 폴리펩타이드 서열의 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III는 타겟 결합 작용과 친화성을 갖는 인테그린 차단제이며, 다양한 종양에 대해 치료 작용이 있므로, 적응증이 추가되어, 사회적 가치와 경제적 가치를 넓혔다.
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)는 임상에서 가장 일반적인 염증성 관절 질환이며, 불구로 만드는 주요한 요인 중의 하나이다. RA의 발병률은 전세계에서 약 0.5~1.0%이고, 중국에서는 약 0.4%이다. RA는 어느 연령에서나 발생할 수 있으며, 연령이 높아질수록, 발병률 또한 높아진다. 여성은 발병률이 높은 연령대가 45~55세이고, 성별과 RA 발병은 밀접한 관계가 있고, 남녀 비율은 약 1:3이다. RA는 일종의 발병 원인이 밝혀지지 않은 전신성 만성 염증성 질병이고, 만성, 대칭성, 다발성 관절활막염과 관절 외 병변이 주요 임상 증상으로 나타나며, 자가 면역 염성 질병에 속한다. 환자의 초기증상은 일반적으로 손 또는 손목의 통증 및 종창(腫脹, 특히 손목 배부(背部)가 부음)이며, 증상은 완화되지 않고 지속되며, 일반적인 치료는 증상을 완화시킬 수 있으나, 보통 투약이 불규칙적이거나 또는 투여량이 부족하여 증상이 반복된다. 병세가 진전되면 조조강직(morning stiffness)이 뚜렷하게 나타날 수 있으며, 일반적으로 1시간 이상 지속되며, 끊임없이 가중된다. 동시에 일정한 관절 기능 장애가 나타날 수 있다.
류마티스 관절염의 발병 원인과 발병 체제는 아직 완전히 밝혀지지 않았으며, 기본 병리 특징은 혈관염과 활막염이다. 관절 내에서 활막혈관이 증식하여, 판누스(pannus)를 형성하므로, 활막이 두꺼워져, 삼출(渗出)이 증가하여, 여러 종류의 세포인자를 분비하여, 연골에 침투하여 골질손상을 일으킨다. 그 주위의 근강(筋腔), 인대, 갱글리언, 근육 등 조직 또한 침식될 수 있으므로, 관절의 안정에 영향을 주어, 관절기형이 쉽게 발생하여 기능장애를 발생시킨다. 혈관염은 주변의 각 장기 조직에 침범하여, 계통성 질병을 형성할 수 있다.
현재 RA를 치료하는 약물은 크게 증상을 억제하는 약물과 질병을 억제하는 약물로 나뉜다. 증상을 억제하는 항류마티즘 약물은 다음과 같은 4종류로 나뉜다. 1. 비스테로이드 항염증약, 일반적으로 1차 약물(first line drug)이라 불리우며, 이러한 악물은 종류가 매우 많고, 중국 내 시장에서 판매되고 있는 종류만해도 수십종에 이른다. 2. 스테로이드 호르몬, 호르몬은 매우 좋은 진통 항염 약물이나, 장기간 단독으로 사용하면 병세를 개선할 수 없고, 오히려 많은 부작용을 가져오게 되며, 호르몬은 완만하게 작용하는 2차 약물로서 효과를 내기 전에 과도성 약물로 사용하는 것은 가능하나, 사용량이 적어야 하고, 사용 시간이 너무 길어서는 안된다. 병세가 비교적 심하고, 관절 외부 증상이 수반되는 환자를 2차 약물을 병용하여 단기 충격 치료 할 때 필수적이다. 3. 완만하게 작용하는 항류머티즘 약물, 일반적으로 2차 약물로 불리우고, 소위 말하는 완만하게 작용하는 약물은 항말라리아약, 금염, 페니실라민 및 설파살라진(sulfasalazine)을 포함하고, 이들은 RA의 치료 효과가 느리고, 장기적으로 작용하면 RA 병에 대해 완화 효과가 있으므로, 병세 개선 약물으로 불리기도 한다. 4. 면역 억제제: 상용하는 것으로 메토트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 아자티오프린(azathioprine), 뇌공등(Tripterygium wilfordii), 청풍(caulis sinomenii) 등이 있다.
RA의 병리 과정에서, 혈관 신생은 대표적인 조직학적 변화이고, 신생 혈관 형성은 활막 증식과 염증 세포 침윤을 수반하고, 신생 혈관의 형성은 RA에서 판누스 형성 및 관절 파괴의 기초가 된다. 원래는 혈관이 존재하지 말아야 하는 관절 연골이 어떤 이상 변화로 인해 새로운 혈관을 형성하여 연골이 침식되게 하고, 관절 변형 또는 통증을 발생시킨다. 신생 혈관은 류머티즘 관절염 환자의 활막 조직에 이상 변화가 일어나게 하고, 정상 사람의 관절 활막 내층은 단지 1~2층의 세포로 구성되나, RA 환자의 활막 내층은 일반적으로 4~10층의 세포가 있다(때로는 20층을 초과함). 이런 세포는 수량 상에서 비정상적으로 많아질 뿐만 아니라 기능상에서도 비정상적으로 활성화된 상태이고, 이들 세포는 대량의 세포 인자, 신호 분자 및 단백 효소를 분비하여, 관절 파괴 진행 과정을 가속화시킬 수 있다. 그 밖에, RA활막 중에 대량의 T세포, B세포 및 단핵 세포와 같은 염증성 세포의 침윤이 있다.
신생 혈관의 생성은 정상적인 생리 조건에서, 높은 정도로 조절되고, 생식, 배아 발육, 조직 복원 및 상처 치유에 필수적인 과정이다. 혈관 생성은 여러 가지 병리 조건 하에서도 발생하고, 상기 병리 조건은 종양 성장 및 전이; 염증성 장애를 포함하고, 상기 염증성 장애는 예를 들면 류머티즘 관절염, 건선, 골관절염, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 결장염 및 기타 염증성 장애이다.
인테그린 αvβ3은 리간드 분자 중의 RGD 서열(arg-gly-asp)을 식별할 수 있고, 다세포 활동 과정에서의 다양한 리간드와 결합하여 종양의 혈관 생성, 침습, 전이, 염증, 상처 치유와 응혈 등 생리 및 병리 과정에 참여한다. 따라서, RGD 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 인테그린 길항제 작용이 있고, RGD 서열은 담체로서, 신생 혈관 내피로 타켓팅 전달됨으로써, 신생 혈관성 질병에 대해 더욱 높은 효율의 치료를 이룰 수 있다. 따라서, 혈관 억제 폴리펩타이드는 혈관 생성을 억제하는 것을 통해 활막으로 산소와 영양물질을 수송하는 것을 막을 수 있을 뿐만 아니라, 또한 직접적으로 혈관 퇴화를 일으켜, RA 활막 증식을 억제할 수 있다. 신생 혈관의 형성을 억제하는 것은 이런 질병을 치료하는 관건이고, 내피 세포의 증식과 이동은 신생 혈관이 형성되는 관건적인 단계이다.
폴리펩타이드Ⅱ와 폴리펩타이드Ⅲ는 RGD 서열(Arg-Gly-Asp)을 함유함으로써, 상기 폴리펩타이드 서열이 인테그린에 효과적으로 결합될 수 있게 하고, 세포내 세포 골격 단백과 세포외 기질 분자의 상호작용을 억제하여, 세포와 세포 외 기질 및 세포와 세포 간의 상호 접착을 억제하는 것을 통해, 세포와 세포 외 매개체 및 세포와 세포 간의 신호 전달을 억제함으로써, 혈관 생성을 억제한다. 그 밖에 상기 서열에 신생 혈관 억제 서열이 더 포함되고, 연구 결과 신생 혈관 억제 서열은 신생 혈관 생성을 고효율적으로 억제하는 활성이 있고, 특히 류머티즘 관절염 질병에 대해 아주 좋은 작용이 있다. 혈관 억제 폴리펩타이드는 혈관 신생을 억제하여 류머티즘 관절염을 치료하는 작용 타겟에 대해, 새로운 류머티즘 관절염 약물을 개발하기 위하여 새로운 연구 방향을 제공하였다.
새로 설계된 폴리펩타이드 서열인 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III는 인테그린에 대해 타겟 결합 작용과 친화성을 갖는 폴리펩타이드이며, 선행 연구에 의하면 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III는 내피 세포의 증식, 이동, 소관 생성을 억제할 수 있고, 유세포 분석기로 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III의 작용 타겟은 인테그린 αvβ3임을 분석하였다. 그 후의 연구에 의하면, 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III은 랫트 동맥환 관형구조의 형성을 억제할 수도 있으며, 세포 접착 실험을 통해 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III의 작용 타겟은 인테그린 αvβ3임을 검증하였고, 류마티스 관절염에 치료 작용이 있음로, 적응증이 추가되어, 사회적 가치와 경제적 가치를 넓혔다.
본 발명은 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III에 대해 더 연구하여, 이들이 다양한 고형 종양과 류마티스 관절염에 대해 치료 작용이 있어, 적응증이 추가되었음을 발견하였다.
본 발명의 인테그린 차단제 폴리펩타이드는 아미노산 서열이 X-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Y이고, X의 서열은 결실, Arg-Gly-Asp, Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly, Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys 또는 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly이고；Y의 서열은 결실, Arg-Gly-Asp, Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly, Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys 또는 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly인 것을 특징으로 한다.
상기 인테그린 차단제 폴리펩타이드에 있어서, 아미노산 서열은,
폴리펩타이드Ⅰ: Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala;
폴리펩타이드Ⅱ: Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala;
폴리펩타이드Ⅲ: Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp;
폴리펩타이드Ⅳ: Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala;
폴리펩타이드Ⅴ: Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala;
폴리펩타이드Ⅵ: Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp;
폴리펩타이드Ⅶ: Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp;
폴리펩타이드Ⅷ: Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys;
폴리펩타이드Ⅸ: Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys;
폴리펩타이드Ⅹ: Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala이고, 상기 폴리펩타이드의 허용 가능한 염을 유효 함량으로 함유하거나 또는 필요한 경우 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 한다.
종양을 치료하는 약물의 제조에서 제1 발명 또는 제2 발명에 따른 인테그린 차단제의 응용에 있어서, 상기 종양은 두경부, 뇌부, 갑상선, 식도, 췌장, 폐장, 간장, 위, 유방, 신장, 담낭, 결장 또는 직장, 난소, 자궁, 자궁경부, 전립선, 방광, 고환에서 발생하는 원발성/계발성 암, 흑색종 또는 육종인 것을 특징으로 한다.
제1 발명 또는 제2 발명에 따른 인테그린 차단제 폴리펩타이드는 류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 약물의 제조에 응용된다.
제1 발명 또는 제2 발명에 인테그린 차단제의 제조방법으로서, 상기 폴리펩타이드는 고체상 합성방법 또는 발현체 재조합 방법을 통해 제조한다.
제1 발명 또는 제2 발명에 따른 인테그린 차단제로서, 상기 폴리펩타이드는 보강제에 공유 결합되고, 보강제는 소 혈청 알부민(BOVINE SERUM ALBUMIN, BSA), 인간 혈청 알부민(HUMAN SERUM ALBUMIN) 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 한다.
종양을 치료하는 약물의 제조에서 제4 발명에 따른 인테그린 차단제의 응용에 있어서, 약물 조성물은 다양한 투약방법을 통해 원발성 또는 계발성의 암, 흑색종 및 육종을 치료할 수 있으며, 상기 투약방법은 피하 주사 또는 근육 주사; 정맥 주사 또는 정맥 점적 주사; 정제, 캡슐 등의 경구 투여, 비강 분무제의 경비 투여를 포함하는 것을 특징으로 한다.
1. 선행 중국 특허 ZL200610039298.2에서는 엔도스테틴의 제6-49번째 아미노산은 비교적 좋은 항종양 작용을 가진다고 하였으며, 본 발명은 이에 대해 광범위하게 연구하여, 엔도스테틴의 제6-48번째 아미노산(폴리펩타이드I, EDSM이라 명함, Seq NO.1 참고)은 더욱 좋은 항종양 작용이 있음을 발견하였고, 동시에 폴리펩타이드I은 류마티스 관절염을 효과적으로 치료할 수 있어, 적응성을 증강시켜, 적응증이 추가되었고, 동시에 하나의 아미노산을 줄여, 합성 원가를 더욱 낮춘다는 것을 발견하여, 사회적 가치와 경제적 가치를 넓혔다.
폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III는 본 실험실에서 설계 합성한 새로운 아미노산 서열이며, 국내외에는 특허출원등록된 것이 아직 없으며, 선행 중국 특허 ZL200610039298.2에 기재된 EDSM-1과 EDSM-2의 아미노산 수는 각각 47과 55이며, 종래의 서열과 비교하면, 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III는 인테그린 리간드 서열RGD와 신생 혈관 억제 서열 사이에 4개의 Gly를 추가하여, EDSM-1을 바탕으로 유연성을 증가시켜, 인테그린 리간드 서열RGD로 하여금 타켓과 더욱 쉽게 결합하게 하여, 활성을 더욱 높였고, EDSM-2를 바탕으로 아미노산 수를 감소시켰으나, 여전히 비교적 높은 항종양 활성을 유지하여, 원가를 크게 감소시켰다. 동시에 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III는 비교적 좋은 류마티스 관절염 치료 작용이 있어, 적응성을 증강시켜, 적응증이 추가되어, 사회적 가치와 경제적 가치를 넓혔다.
2. 약리작용 소개
연구 결과, 폴리펩타이드I은 종양 혈관 생성을 억제하고 류마티스 관절염을 치료하는 작용이 있다. RGD 서열은 인테그린의 중요한 리간드이므로, RGD 서열을 함유하는 폴리팝테이드 Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp 또한 인테그린을 특이적으로 식별할 수 있다. 본 발명의 인테그린 차단제 폴리팝타이드는 혈관의 생성을 억제하는 작용을 가진 서열 Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala의 N/C단에 인테크린 패밀리와 친화성 및 결합능력을 가진 아르기닌-글리신-아스파르틱산(RGD)을 함유한 Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp 서열을 결합시켜, 인테그린과 친화성 및 결합 능력을 가진 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III를 만들었다. 상기 인테크린 차단제인 폴리펩타이드Ⅱ(Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala)와 폴리펩타이드Ⅲ(Phe-Gln- Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp)는, 50개의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드이며, 분자 중 에서 RGD 서열은 인테그린 친화성과 결합 능력을 가지며, 연구에 의하면 작용 타겟은 인테그린 αvβ3이며, 인테그린 길항제 작용을 가지며, 세포 표면의 접착 분자의 발현을 감소시킬 수 있으며, 세포 내 신호 전달을 조절한다. 또한 상기 서열 중에 신생 혈관 억제 서열을 함유하므로, 종양 신생 혈관 형성을 억제하고, 나아가 종양 성장 및 전이를 억제하는 효과에 도달한다.
국내외의 광범위한 연구 결과, 동일한 조직 유형이고, 분화정도가 동일한 종양이라 할지라도, 동일한 약물에 대한 민감성 또한 다를 수 있으므로, 약물 개발에 있어서 어떤 분자에 대해 항종양 계보 선별을 진행해야 한다. 이는 어떤 약물은 특정 종양 세포에만 효과가 있고, 다른 종양은 효과가 없거나 또는 효과가 낮으므로, 실험을 통해 치료 효과를 모색 및 검증해야 하기 때문이다.
발명자는 많은 실험을 통해 상기 인테그린 차단제는 타겟이 명확하고, 체외에서 인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 이동, 증식 및 관형 구조체의 형성을 확실하게 억제할 수 있으며, 사람의 특정 종양 세포의 증식에 대해서도 억제 작용을 한다는 것을 알았다. 체내 실험에서 확실한 항종양 효과를 나타냈으며, 부작용이 작고, 사용량이 적으며, 원가가 낮다. 이는 본 발명에 따른 인테그린 차단제 폴리펩타이드는 과학적이며, 합리적이고, 효과적이며, 인류 고형 종양을 치료하는 치료 약물로서, 상기 인테그린 차단제의 치료 계보를 크게 확대하고, 미래의 약물 개발을 위하여 새로운 방향과 전망을 제공하며, 현저한 사회적 가치와 시장적 가치가 있다는 것을 설명한다.
본 발명의 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III은 표적성을 가진 RGD 서열을 함유하므로, 폴리펩타이드가 RA의 판누스 형성 과정에서 신생 혈관 내피에 타겟팅되어, 신생 혈관의 형성을 억제하여, 류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 효과에 도달한다. 발명자는 많은 실험을 통해, 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III은 랫트 애주번트 관절염과DBA/1콜라겐 유발성 관절염의 진행을 억제하며, 체내 실험에서 뚜렷한 항종양 효과가 있고, 부작용이 적고, 사용량이 적어 원가가 낮다는 것을 알았다. 이는 본 발명에 따른 인테그린 차단제 폴리펩타이드는 과학적이며, 합리적이고, 효과적이며, 인류 고형 종양을 치료하는 치료 약물로서, 상기 인테그린 차단제의 치료 계보를 크게 확대하고, 미래의 약물 개발에 새로운 방향과 전망을 제공하며, 현저한 사회적 가치와 시장적 가치가 있다는 것을 설명한다.
도 1은 Western blotting법으로 intergrin αv와 Integrin β3의 Bel-7402 세포에서의 발현을 검출한 것이다.
도 2는 유세포 실험으로 인테그린 차단제 폴리펩타이드II와 타겟의 결합을 검출한 것이다.
도 3은 유세포 실험으로 인테그린 차단제 폴리텝타이드III와 타겟의 결합을 검출한 것이다.
도 2는 유세포 실험으로 인테그린 차단제 폴리펩타이드II와 타겟의 결합을 검출한 것이다.
도 3은 유세포 실험으로 인테그린 차단제 폴리텝타이드III와 타겟의 결합을 검출한 것이다.
실시예 1
인테그린 차단제 폴리펩타이드의 제조 및 검사
폴리펩타이드I, II, III는 모두 고체상 합성방법을 이용하여 합성되며, 고성능 액체크로마토그래피를 이용하여 정제하고, MS를 이용하여 폴리펩타이드의 분자량을 측정하고, RP-HPLC로 폴리펩타이드의 순도를 측정한다.
폴리펩타이드I의 고체상 합성방법은 Fmoc-Phe(Otbu)-wang resin 또는 Fmoc-Arg (Otbu)-CTC resin를 출발 원료로 하고, 폴리펩타이드II의 고체상 합성방법은 Fmoc-Phe(Otbu)-wang resin 또는 Fmoc- Phe (Otbu)-CTC resin를 출발 원료로 하고, 폴리펩타이드Ⅲ의 고체상 합성방법은 Fmoc-Phe(Otbu)-wang resin 또는 Fmoc-Phe (Otbu)-CTC resin를 출발 원료로 하고, 그 다음 보호 아미노산으로 디펩타이드 내지 43/50 펩타이드를 차례로 결합시키고, 펩타이드 결합이 완료되면 충분히 세척한 다음, 펩타이드 절단, 후처리를 거쳐 인테그린 차단제 폴리펩타이드II/폴리펩타이드III의 조생성물을 얻는다. 조생성물을 먼저 용해시킨 다음, 제조형 HPLC에 의해 2차 정제를 거치고, 마지막으로 농축하고 냉동 건조시켜 정제물을 얻는다. 상기 방법은 합성의 효율을 보장할 뿐만 아니라, 순도를 향상시킨다.
1. 펩타이드 결합(디펩타이드 내지 43/50 펩타이드의 결합을 포함) 단계는 다음과 같다.
폴리펩타이드I: Fmoc-Phe(Otbu)-wang resin 또는 Fmoc-Arg(Otbu)-CTC resin 적당량을 취하여, 유리 글라스 샌드 코어 반응 칼럼에 넣고, CH2Cl2 적당량을 첨가하여 수지를 충분히 팽창시킨다.
폴리펩타이드Ⅱ: Fmoc-Arg(Otbu)-wang resin 또는 Fmoc-Arg(Otbu)-CTC resin 적당량을 취하여, 유리 글라스 샌드 코어 반응 칼럼에 넣고, CH2Cl2 적당량을 첨가하여 수지를 충분히 팽창시킨다.
폴리펩타이드Ⅲ: Fmoc-Phe(Otbu)-wang resin 또는 Fmoc-Phe(Otbu)-CTC resin적당량을 취하여, 유리 글라스 샌드 코어 반응 칼럼에 넣고, CH2Cl2 적당량을 첨가하여 수지를 충분히 팽창시킨다.
a. 디캡핑: 피페리딘/DMF의 디캡핑액을 적당량을 첨가하고, 일정시간 반응시킨 후 디캡핑액을 다 뽑아내며, 중간에 DMF로 1회 세척한 다음, 적당량의 디캡핑액 다시 한번 첨가하여 반응시켜, Fmoc 보호기를 제거한다.
b. 세척: 디캡핑액을 다 뽑아내고, DMF로 수지를 몇 번 세척하고, 부산물을 충분히 세정한다.
c. 축합: 펩타이드 결합에 이용되는 보호아미노산과 활성제를 DMF와 축합제에 용해시키고, 흔들어서 균일하게 하여, 충분히 반응시킨다.
d. 세척: 반응액을 다 뽑아내고, DMF로 수지를 충분히 세척한 후, 부산물을 세정한다.
상기 폴리펩타이드 절단 단계는 다음과 같다.
뽑아낸 수지를 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 절단액을 첨가하여 합성된 50펩타이드 중간체를 충분히 분해시키고, 샌드코어 퍼넬(Sand core funnel)로 수지와 폴리펩타이드를 분리시키고, 상기 분해액의 부피 조성은, 트리플루오로아세트산: 페놀: 물: 사이오아니졸: EDT=88-92: 2.5-3.5: 2.5-3.5: 1.5-2.5: 1.5-2.5이다.
2. 후처리 단계는 다음과 같다. 먼저 무수에테르를 절단액에 첨가하여 폴리펩타이드를 석출시킨 다음, 원심 분리시켜, 청정액을 버리고 다시 무수에테르로 폴리펩타이드로 세척하고 뽑아내면 폴리펩타이드 조생성물을 얻는다.
3. 정제의 단계는 다음과 같다.
a. 용해: 조생성물을 취하여 5~20g/l의 용액을 만들고, 0.45㎛의 혼합 여과막으로 여과한다.
제조: ① 1차 정제: 30~40%의 아세토니트릴과 60~70%의 완충 용액을 이용하여, 50ml/min~100ml/min 유속에서 10~20min 세정하여 제조 칼럼(preparation column)을 평형시킨다. 주입 펌프로 샘플을 로딩시키며, 베이스 라인을 채집하고, 220nm의 자외선 파장에서 200mv보다 큰 용액을 수거하고, 샘플이 있는지 검사한다. 기울기 용리를 이용하고, 아세토니트릴 초기 백분수는 30~40%이며, 30~50min 후 아세토니트릴의 백분수는 80~90%이다. 220nm의 자외선 파장에서 흡수가 200mv보다 큰 용액을 수거하고, 순도가 95%보다 큰 것을 검출하여 피크 용액(峰頂)으로 병합하고, 2차 분리 정제를 대기한다. ② 2차 정제: 1차 정제에서 수거된 피크 용액으로부터 유기 용제를 회전 증발시킨 후 주입펌프로 샘플 로딩하며, 30~40%의 아세토니트릴과 60~70%의 완충 용액을 사용한다. 유속은 50~100ml/min이며, 베이스 라인을 채집하고, 220nm의 자외선 파장에서 흡수가 200mv보다 큰 용액을 수거하고, 샘플이 튀어나왔는지 여부를 검사한다. 기울기 용리를 이용하고, 아세토니트릴 초기 백분수는 30~40%이며, 30~50min 후 아세토니트릴의 백분수는 80~90%이다. 220nm의 자외선 파장에서 흡수가 200mv보다 큰 용액을 수거하고, 순도 검사를 통해 95%보다 큰 것을 합격으로 한다.
b. 농축, 여과, 동결 건조: 합격된 용액을 회전 증발기로 37℃에서 감압 농축하여, 잔류용제와 주입용 물을 제거한다. 마지막으로 0.22㎛의 여과막으로 여과하고, 여과액을 동결 건조 트리이에 넣고, 동결 건조기로 동결 건조시킨다.
4. 순도 검출 및 분자량 검출
동결 건조된 정제 산물을 수집하고, 역상 액체 크로마토그래피를 통해 폴리펩타이드의 순도를 검출하여 순도를 분석한다.
본 실험은 고체상 합성방법을 성공적으로 이용하여 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III을 합성하였고, 이 방법은 중복성이 높고, 조작성이 강하며, 오염이 적다. 실험은 2가지 수지, 즉 wang resin 또는 CTC resin 를 이용하여 폴리펩타이드를 합성할 수 있다. 실험용 wang resin은 다른 수지에 비해 안정하고, 부반응이 적고, 공정 조생성물 피크 패턴이 비교적 좋으며, 정제 상대적 수율이 높아, 원가가 상대적으로 낮다. 실험용 CTC resin의 반응은 온도의 영향을 적게 받고, 반응 속도가 빠르다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 폴리펩타이드를 정제하고, 기울기 용리는 등용매 용리에 비해, 분리 효과가 좋고, 분리 과정에서, 유지시간이 적당하고, 생산효율이 높고, 순도가 높다.
결과: 합성된 폴리펩타이드는 역상 액체 크로마토그래피를 통해 순도 감정을 진행한 결과, 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 순도는 각각 95.39%, 98.41%, 96.40%으로 순도가 모두 평균 95%보다 크므로, 설계 요구에 부합한다.
실시예 2
인테그린 차단제 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III의 타겟 분석
(1) Western Blotting법으로 세포 발현의 타겟 intergrin αvβ3 분석
0.25%의 트립신을 이용하여 대수 성장기 세포 Bel-7402를 소화시키고, 800rpm의 속도로 5min 동안 원심 분리하여 세포를 수집하고; 수를 세어, 20μl/1×105개의 세포별로 단백질 추출액을 첨가하여, 흐터진 세포를 취흡(吹吸)하고, 4℃에서 30min동안 방치하여 세포를 분해시키고; 1/4 부피의 5×단백질 로딩 완충액을 첨가하고, 끓는 수욕에서 5~10min 동안 가열한다. 20μl의 단백질 샘플을 취하고, 10%의 SDS-PAGE 전기영동을 진행한다. 반건조식 전기이동방법으로 겔 상의 단백질을 PVDF막으로 이동시키고, 1mA/cm2의 정전류가 3h 동안 흐르게 한다. PVDF막을 폰소 중에서 30s 동안 염색하고, dH2O로 선명한 띠가 나타날 때까지 탈색하고, 단백질 면을 구분하도록 우측 상단을 잘라낸다. PVDF막을 차단액(confining liquid)으로 1.5h 동안 실온 차단한다. PBST으로 막을 2~3회 세척하고, 매번 5~10min 동안 세척한다. 1차 항체를 넣고, 4℃에서 하룻밤 방치하거나 또는 37℃에서 1.5h 동안 배양한다. PBST로 막을 3~5회 세척하고, 매번 5~10min 동안 세척한다. 2차 항체를 넣고, 실온에서 1h 동안 배양한다. PBST로 3~5회 세척하고, 매번 5~10min 동안 세척한다. 암실(홍색 광원 허용)에서, PVDF막의 단백질 면을 위로하여 랩 상에 놓고, 표면에 발광약을 떨어드려, 5min 동안 반응시킨다. PVDF막을 랩으로 감싸고, 같은 크기의 X-RAY필름을 재단하여, 필름 상자에 놓고 0.5~5min 동안(밴드 광선 강도에 따라 정해짐) 노광시킨다. X-RAY 필름을 꺼내고, 현상액에서 밴드가 나타날 때까지 헹구고, 현상 정지액(5% 빙초산)에 넣고 1min 동안 현상 정지시키고, 흐르는 물로 1min 동안 세정한 후 고착제에서 배경부분이 투명해질 때까지 헹구고, 마지막으로 흐르는 물로 20min 동안 세정하여 이미지를 고착시킨다.
(2) 유세포 실험으로 인테그린 차단제 폴리펩타이드II 및 폴리펩타이드III와 타겟의 결합을 분석
세포 Bel-7402는 세포 배양병에서 80%까지 배양하여 융합한 후, 소화 수집하고, 얼음으로 미리 냉각시킨 PSB로 2회 세척하고, 세포를 1%의 BSA를 함유하는 PSB로 30min 동안 재현탄한다. 2μl의 쥐 항-인간 αvβ3 기능차단 단일클론항체(1.0㎍/μl, 1:200) 및 2μl의 쥐 항-인간 α5vβ1 기능차단 단일클론항체(1.0㎍/μl, 1:200)을 사용하여 세포 현탁액과 함께 4℃에서 1.5h 동안 배양한다. 세포를 수집하고, 얼음으로 미리 냉각시킨 PBS로 2회 세척한 다음, 100μl의 FITC로 표지된 수식 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III(2mg/ml)를 사용하여 세포 현탁액과 함께 4℃에서 1.5h 동안 배양한다. 표지화 후, 세포를 수집하고 얼음으로 미리 냉각시킨 PBS로 2회 세척한 다음, 400μl의 PBS로 재현탁하고, 유세포 분석기로 분석하고, FITC 형광용 FL1채널로 형광 강도를 검출한다.
결과: 세포에서 발현된 타겟 intergrin αvβ3의 측정은, 도 1에 도시한 바와 같고, Bel-7402 세포 표면에서 발현된 integrin αvβ3은 후기(後期) 타겟 결합 실험의 대상으로 할 수 있다.
유세포 실험을 통해 인테그린 차단제 폴리펩타이드II 및 폴리펩타이드III와 타겟의 결합을 분석하면, 결과는 도 2, 도 3에 도시한 바와 같다. FITC로 표지된 인테그린 차단제 폴리펩타이드II는 항체를 넣지 않고 세포를 배양시킬 때 형광 강도가 대략 80.4%이며, integrin αvβ3 항체를 넣은 후 형광 강도는 13.4%까지 감소하고, integrin α5β1 항체를 넣은 후 형광 강도는 33.2%까지 약해진다. FITC로 표지된 인테그린 차단제 폴리펩타이드III는 항체를 넣지 않고 세포를 배양시킬 때 형광 강도가 약 82.4%이며, αvβ3 항체를 넣은 후 형광 강도는 11.3%까지 약해지고, integrin α5β1 항체를 넣은 후 형광 강도는 25.9%까지 약해지며, 유세포 분석기를 통해 검출 분석한 결과, 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III는 동시에 integrin αvβ3 및 integrin α5β1와 결합할 수 있으나, 주요한 결합 타겟은 여전히 integrin αvβ3이다.
실시예 3
인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드의 이동억제 실험
10mg/ml의 Matrigel(BD사, USA)를 HUVEC 전용 배양기(基)를 사용하여 1:2로 희석하고, transwell 소실막 상에 도포하고, 실온에서 바람으로 건조한다. 대수 성장기까지 배양한 HUVEC 세포를 트립신 소화액으로 소화시키고, 수집하여, PBS로 2회 세척한 후 공백 HUVECs 전용 배양기를 이용하여 재현탁한다. 현미경으로 수를 세어, 세포 농도를 1×105개/ml로 조절한다. 각 군(組)의 실험용 액체를 배합하여, 공백 HUVECs 전용 배양기를 이용하여 100μl될 때까지 희석한다. 세포를 transwell 소실에 접종하고, 각 웰은 100μl이며, 또한 각 군의 실험용 액체를 소실에 넣는다. 24웰플레이트에 5%의 우태혈청(FBS)과 1%의 ECGS를 함유하는 0.6ml의 내피 세포 배양액을 넣어 세포 이동을 자극하고, 5%의 CO2에서, 37℃로 24h 동안 배양한다. 웰 중의 배양액을 제거하고, 90%의 알코올을 이용하여 상온에서 30min 동안 고정하고, 0.1%의 크리스털 바이올렛으로 상온에서 10min 동안 염색하고, 맑은 물로 깨끗하게 헹구고, 면봉으로 상층의 이동하지 않은 세포를 살살 닦아내고, 현미경으로 관찰하여 4개의 시야를 선택하여 사진을 찍고 수를 센다. 다음 공식에 따라 이동 억제율(migration inhibition, MI)을 계산한다.
여기서, Ntest는 시험군의 세포 이동수이며, Ncontrol는 공백 대조군의 세포 이동수이다.
실험은 독립적으로 3회에 걸쳐 반복하고, 실험으로 얻은 결과에 의해 mean ± SD를 계산하고, 통계학 t검증을 진행하고, *p<0.05는 현저한 차이이며, **p<0.01는 매우 현저한 차이이다.
[표 1] 인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I의 이동 억제 작용
a: * p<0.05, ** p<0.01.
[표 2] 인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 이동 억제 작용
[표 3] 인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 이동 억제 작용
결과: 인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 이동 실험에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I의 영향은 표 1과 같으며, 음성 대조군과 비교하면, 인테그린 차단제 폴리펩타이드I은 5%의 우태혈청 및 1%의 ECGS가 유발하는 HUVEC의 이동작용을 억제할 수 있으며, 중, 저 투여량에서 일정한 투여량 의존성을 보인다. 고, 중, 저 투여량에서, 폴리펩타이드I의 세포 이동에 대한 억제율은 음성 대조군과 비교하면 매우 현저한 차이가 있으며(**p<0.01), 고투여량에서 내피 세포 이동을 억제하는 능력은 중투여량에 비해 낮아진다. 폴리펩타이드I의 투여량이 6㎍/ml일 때, 세포 이동에 대한 억제율은 최대치인 41.39%에 도달한다.
인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 이동 실험에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 영향은 표 2와 같으며, 음성 대조군과 비교하면, 인테그린 차단제 폴리펩타이드II는 5%의 우태혈청 및 1%의 ECGS가 유발하는 HUVEC의 이동 작용을 억제할 수 있으며, 중, 저 투여량에서 일정한 투여량 의존성을 나타낸다. 고, 중, 저 각 투여량에서, 폴리펩타이드II의 세포 이동에 대한 억제율은 음성 대조군과 비교하면 매우 현저한 차이가 있으며(**p<0.01), 고투여량에서 내피 세포 이동을 억제하는 능력은 중투여량에 비해 낮아진다. 투여량이 4㎍/ml, 8㎍/ml, 16㎍/ml일 때 억제율은 모두 50% 이상에 도달하며, 각각 54.10%, 69.87%, 60.27% 및 57.24%이다. 폴리펩타이드II의 투여량이 8㎍/ml일 때, 세포 이동에 대한 억제율은 최대값인 69.87%에 도달한다.
인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 증식 실험에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 영향은 표 3과 같으며, 음성 대조군과 비교하면, 인테그린 차단제 폴리펩타이드III는 5%의 우태혈청 및 1%의 ECGS가 유발하는 HUVEC의 이동작용을 억제할 수 있으며, 중, 저 투여량에서 일정한 투여량 의존성을 나타내며, 고, 중 저 각 투여량에서, 폴리펩타이드II의 세포 이동에 대한 억제율은 음성 대조군과 비교하면 매우 현저한 차이가 있으며(**p<0.01), 고투여량에서 내피 세포 이동을 억제하는 능력은 중투여량에 비해 낮아진다. 폴리펩타이드III의 투여량이 1㎍/ml, 2㎍/ml, 4㎍/ml일 때 억제율은 50% 이상에 도달하며, 각각 52.04%, 76.78%와 62.64%이며, 폴리펩타이드III의 투여량이 2㎍/ml일 때, 세포 이동에 대한 억제율은 최대값인 76.78%에 도달한다.
실시예 4
인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드의 소관 생성 억제 실험
-20℃에서 동결 보전한 10mg/ml의 Matrigel(BD사, USA)를 4℃의 냉장고에 넣고 하룻밤 녹이고, HUVEC 배양기를 사용하여 1:1로 희석하고, 30μl를 96웰플레이트(Greiner사, USA) 상에 도포하고, 37℃의 인큐베이터에서 1h 동안 중합시킨다. 대수 성장기까지 배양한 HUVEC 세포를 0.2%의 EDTA로 소화시키고, 수집하여, PBS로 2회 세척하고 공백 HUVEC 배양기로 재현탁한다. 현미경으로 수를 세고, 세포 농도를 1×105개/ml로 조절한다. 각 군의 실험용 액체를 배합하여, 공백 HUVECS 전용 배양기를 이용하여 100μl될 때까지 희석한다. 세포를 96웰플레이트에 접종하고, 각 웰은 100μl이며, 또한 각 군의 실험용 액체를 소실에 넣고, 5%의 CO2로 37 ℃에서 배양한다. 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 60h의 각 투여량에 대해 5개의 시야를 무작위로 선택하여 사진을 찍고 수를 세어, 각 농도에서 관으로 분화되는 수량을 통계내고, HUVEC 세포가 관으로 분화되는 능력에 대한 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III의 영향을 분석한다. 다음 공식에 따라 소관 생성 억제율을 계산한다.
Ntest
소관 생성 억제율(%)= 1- 
×100%
Ncontrol
여기서, Ntest은 실험군의 소관 수량이며, Ncontrol은 공백 대조군의 소관 수량이다.
실험을 독립하여 3회에 걸쳐 반복하고, 실험으로 얻은 결과에 의해 mean ± SD를 계산하고, 통계학 t검증을 진행하고, *p<0.05는 현저성 차이이며, **p < 0.01는 매우 현저한 차이이다.
[표 4] 인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 소관 생성에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 5] 인체 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 소관 생성에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: HUVECs 분화에 대한 폴리펩타이드II의 영향은 표 4를 참고하길 바란다. 6h~60h 내에 모세혈관 모양의 관상(管狀) 구조로 분화되고, 6h일 때 소관은 이미 형성되고, 6h와 12h일 때 소관 수량이 가장 많으며, 12h 후 소관은 점차 줄어들고, 60h일 때 기본적으로 소실된다. 폴리펩타이드II의 각 투여량에서 형성된 소관의 수량은 모두 음성에 비해 적으며, 각 투여량에서 폴리펩타이드II는 HUVECS가 소관으로 분화되는 것에 대해 모두 억제 작용이 있으며, 중, 저 투여량일 때 모두 50% 이상에 도달하며, 또한 투여량과 억제율을 일정한 투여량 의존 관계를 보여준다. 폴리펩타이드II의 투여량이 2㎍/ml, 4㎍/ml, 8㎍/ml일 때 생성된 소관 수량이 제일 적고, 억제율은 가장 높다. 6h 시점에서 폴리펩타이드II의 투여량이 2㎍/ml, 4㎍/ml, 8㎍/ml일 때 억제율은 각각 74.65%, 78.87%, 71.83%에 도달하고, 12h 시점에서 폴리펩타이드II의 투여량이 2㎍/ml, 4㎍/ml, 8㎍/ml일 때 억제율은 각각 80.77%, 81.68%, 76.19%에 도달한다. 폴리펩타이드II와 내피 세포가 6h 동안 작용한 후 투여량이 0.5㎍/ml, 1㎍/ml, 2㎍/ml, 4㎍/ml, 8㎍/ml일 때 음성군과 매우 현저한 차이가 있다.
HUVECS 분화에 대한 폴리펩타이드III의 영향은 표 5를 참고하길 바란다. 6h~60h 내에 분지형 모세혈관 모양의 관상 구조로 분화되고, 6h일 때 소관은 이미 형성되고, 6h와 12h일 때 소관 수량이 가장 많으며, 12h 후 소관은 점차 줄어들고, 60h일 때 기본적으로 소실된다. 폴리펩타이드III의 각 투여량에서 형성된 소관의 수량은 모두 음성에 비해 적으며, 각 투여량에서 폴리펩타이드III는 HUVECS가 소관으로 분화되는 것에 대해 모두 억제 작용이 있으며, 중, 저 투여량일 때 모두 60% 이상에 도달하며, 투여량과 억제율은 일정한 투여량 의존 관계를 보여준다. 폴리펩타이드III의 투여량이 1㎍/ml, 2㎍/ml일 때 생성된 소관 수량이 제일 적고, 억제율은 가장 높다. 6h 시점에서 폴리펩타이드III의 투여량이 1㎍/ml, 2㎍/ml일 때 억제율은 각각 66.26%, 67.28%에 달한다. 12h 시점에서 폴리펩타이드III의 투여량이 1㎍/ml, 2㎍/ml일 때 억제율은 각각 57.10%, 55.45%에 달한다. 폴리펩타이드III와 내피 세포가 6h 동안 작용한 후 0.25㎍/ml, 0.5㎍/ml, 1㎍/ml, 2㎍/ml의 모든 투여량에서 음성군과 모두 현저한 차이가 있다.
실시예 5
흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
성장 왕성기에 있는 종양조직을 취하여 무균조건에서 갈아서, 1×107개/ml의 세포 현탁액을 제조하고, 0.1ml를 마우스의 우측 겨드랑이에 피하 접종한다. 마우스의 이식 종양은 버니어캘리퍼스로 이식 종양의 직경을 측정하고, 종양이 100~200 mm3까지 성장한 후 동물을 무작위로 분조(分組)한다. 종양의 직경을 측정하는 방법을 사용하여, 테스트 동물의 종양에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드의 억제 효과를 동적으로 관찰한다. 종양 직경의 측정 회수는 2일 1회이고, 매번 측정할 때마다 동시에 마우스의 체중도 측량해야 한다. 실험군은 우측 겨드랑이에 폴리펩타이드를 피하 주사하고, 동시에 음성군은 같은 양의 생리식염수를 14d 동안 투여하고, 시클로포스파미드를 격일로 1회 피하 주사하고, 탁솔군은 3일마다 1회 피하 주사하고, 폴리펩타이드 저투여량군은 1일에 2회 투약하고, 다른 각 군은 1일 1회 투약한다. 14d 동안 치료한 후, 마우스를 죽이고 수술하여 종양을 떼내어 무게를 칭량한다. 종양 부피(tumor volume, TV)의 계산공식은 다음과 같다.
TV = 1/2×a×b2
여기서, a, b는 각각 길이와 넓이를 의미한다.
측정 결과에 따라 상대적 종양 부피(relative tumor volume, RTV)를 계산하고, 계산 공식은 RTV = Vt/V0이다. 여기서, V0는 우리를 구분하여 투약할 때(즉 d0) 측정하여 얻은 종양 부피이고, Vt는 매번 측정할 때의 종양 부피이다. 항종양 활성의 평가지표는 상대적인 종양 증식률 T/C(%)이며, 계산 공식은 다음과 같다.
TRTV
T/C(%)= ────×100%
CRTV
TRTV: 치료군 RTV, CRTV: 음성대조군 RTV
실험은 독립적으로 3회에 걸쳐 반복하고, 실험으로 얻은 결과에 의해 mean ± SD를 계산하고, 통계학 t검증을 진행하고, *p<0.05는 현저한 차이이며, **p<0.01는 매우 현저한 차이이다.
[표 6] 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 7] 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 8] 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 6을 참고하기 바란다. 탁솔 10mg/kg을 투여했을 때, 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양에 대한 억제율은 70.80%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투약군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용도 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I 고투여량군, 저투여량군은 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양에 대한 억제율은 37.26%, 32.17%이다. 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 실험 결과에 따르면, 음성대조군에 비해, 폴리펩타이드I은 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양 성장에 대해 비교적 좋은 억제 작용이 있고, 음성대조군에 비해, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 7을 참고하기 바란다. 탁솔 10mg/kg을 투여했을 때, 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양에 대한 억제율은 75.49%이나, 실험 동물 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투약군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 시클로포스파미드 15mg/kg을 투여했을 때, 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양에 대한 억제율은 72.89%이나 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군과 폴리펩타이드 투약군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군 및 1일 2회 투약한 저투여량군은 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양에 대한 억제율이 40.80%, 34.17%, 59.06%, 55.22%이다. 저투여량군 및 1일 2회 투약한 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 8을 참고하기 바란다. 폴리펩타이드III 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군 및 1일 2회 투약한 저투여량군은 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양에 대한 억제율이 63.07%, 59.82%, 68.67%, 69.21%이다. 고투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군, 저투여량군과 1일 2회 투약한 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 폴리펩타이드III 0.09375mg/kg을 매일 2회 투여한 군은 흑색종 B16F10 C57BL/6이 이식된 검은 쥐의 종양 성장에 대해 억제 작용이 제일 좋다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 6
인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
성장 왕성기에 있는 종양 조직을 취하여 무균 조건에서 갈아서, 1×107개/ml의 세포 현탁액을 제조하고, 0.1ml를 마우스의 우측 겨드랑이에 피하 접종한다. 마우스의 이식 종양은 버니어캘리퍼스로 이식 종양의 직경을 측정하고, 종양이 100~200mm3까지 성장한 후 동물을 무작위로 분조한다. 종양의 직경을 측정하는 방법을 사용하여, 테스트 동물의 종양에 대한 인테그린 차단자 폴리펩타이드의 억제 효과를 동적으로 관찰한다. 종양 직경의 측정회수는 2일 1회이고, 매번 측정할 때마다 동시에 마우스의 체중도 칭량해야 한다. 실험군은 폴리펩타이드를 미정맥 주사하고, 동시에 음성군은 같은 양의 생리식염수를 14d 동안 투여한다. 양성군은 아바스틴을 투여하며, 아바스틴을 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다. 투약 후 일주일 휴식하고, 21d 후, 마우스를 죽이고, 수술하여 종양을 떼내어 무게를 측량한다. 종양 부피(tumor volume, TV)의 계산 공식은 다음과 같다.
TV = 1/2×a×b2
여기서, a, b는 각각 길이와 넓이를 의미한다.
측정 결과에 따라 상대적 종양 부피(relative tumor volume, RTV)를 계산하고, 계산 공식은 RTV = Vt/V0이다. 여기서, V0는 우리를 구분하여 투약할 때(즉 d0) 측정하여 얻은 종양 부피이고, Vt는 매번 측정할 때의 종양 부피이다. 항종양 활성의 평가지표는 상대적인 종양 증식률 T/C(%)이며, 계산 공식은 다음과 같다.
TRTV
T/C(%)= ────×100%
CRTV
TRTV: 치료군 RTV, CRTV: 음성대조군 RTV
실험은 독립적으로 3회에 걸쳐 반복하고, 실험으로 얻은 결과에 의해 mean ± SD를 계산하고, 통계학 t검증을 진행하고, *p<0.05는 현저한 차이이며, **p<0.01는 매우 현저한 차이이다.
[표 9] 인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 10] 인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 11] 인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 9를 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 78.53%이며, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 없다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 52.95%, 58.82%, 51.26%이다. 저투여량군은 음성군과 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군의 종양 부피와 음성군의 종양 부피를 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 부피에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용도 없다.
인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 10을 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 78.53%이며, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 없다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 63.80%, 67.82%, 57.83%이다. 고투여량군, 저투여량군은 음성군과 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 부피에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용도 없다.
인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 11을 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 68.95%이며, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 없다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체유방암 MDA-MB-231이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 58.82%, 72.86%, 61.91%이다. 고투여량, 저투여량은 음성군과 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 부피에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용도 없다.
실시예 7
인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고하기 바란다. 양성대조군은 옥살리플라틴을 4일 1회 미정맥 주사하고, 카페시타빈을 2일 1회 경구 투여하고, 기타 군은 매일 1회 미정맥 주사한다.
[표 12] 인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 13] 인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 14] 인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 12를 참고하기 바란다. 항암제 병용 투여군은 인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 51.76%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 38.28%, 38.46%, 35.90%이다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표13을 참고하기 바란다. 항암제 병용 투여군은 인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 51.76%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 38.28%, 79.72%, 70.67%이다. 중투여량군 및 저투여량군의 종양 부피는 음성대조군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표14를 참고하기 바란다. 항암제 병용 투여군은 인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 51.76%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저 투여량군은 인체 위암세포 MGC-803이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 57.65%, 66.03%, 70.08%이다. 중투여량군의 종양 부피는 음성대조군의 종양 부피와 비교하면, 현저한 차이가 있으며, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 8
인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고하기 바란다. 양성대조군인 탁솔군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 15] 인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 16] 인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 17] 인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 15를 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 68.21%이나, 실험 동물의 체중에 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 46.60%, 54.54%, 42.05%이다. 고투여량군, 저투여량군은 음성군과 현저한 차이가 있으며, 중투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표16을 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 68.21%이나, 실험 동물의 체중에 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 57.68%, 65.37%, 53.49%이다. 고투여량군, 저투여량군은 음성군과 현저한 차이가 있으며, 중투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표17을 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 68.21%이나, 실험 동물의 체중에 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 폐암 H460이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 68.05%, 74.42%, 69.23%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 음성군과 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 9
인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군인 탁솔군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 18] 인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 19] 인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 20] 인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 18을 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 78.10%이나, 실험 동물의 체중에는 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량, 저투여량군은 인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 종양 억제율이 56.70%, 63.00%, 58.26%이다. 중투여량군은 음성군과 매우 현저한 차이가 있으며, 고투여량군, 저투여량군은 음성군과 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 19를 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 78.10%이나, 실험 동물의 체중에는 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 68.75%, 75.12%, 71.54%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 음성군과 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 20을 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 78.10%이나, 실험 동물의 체중에는 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 간암 SMMC-7721이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 77.55%, 82.55%, 71. 85%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량은 음성군과 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 10
인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군인 시스플라틴군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 21] 인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 22] 인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 23] 인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 21을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양의 종양 억제율이 73.13%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있고, 음성대조군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 62.85%, 70.71%, 65.00%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 22를 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 73.13%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있고, 음성대조군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 55.82%, 68.19%, 64.45%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 23을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 73.13%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있고, 음성대조군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 자궁경부암 HeLa가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 64.35%, 72.41%, 68.68%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 11
인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군인 탁솔군은 3일 1 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 24] 인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I 의 억제 작용
[표 25] 인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 26] 인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 24를 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.82%이나, 실험동물의 체중에 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 47.36%, 55.30%, 54.39%이다. 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II 의 억제 작용은 표 25를 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.82%이나, 실험동물의 체중에 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 59.65%, 67.54%, 64.03%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 26을 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 73.13%이나, 실험동물의 체중에 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 자궁내막암 HHUA가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 66.67%, 73.21%, 70.53%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 현저한 차이가 있다. 음성 대조 군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 12
인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군 시스플라틴군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 27] 인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 28] 인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 29] 인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 27을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 73.84%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 66.43%, 72.02%, 67.83%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 28을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 73.84%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 54.25%, 67.83%, 62.92%이다. 고투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있고, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성대조군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 29를 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 73.84%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 전립선암 DU-145가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 60.73%, 69.90%, 64.08%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 13
인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대군인 5-Fu군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 30] 인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 31] 인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린차단제 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 32] 인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 30을 참고하기 바란다. 항암제 5-Fu군은 인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 77.80%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 54.76%, 63.49%, 56.34%이다. 고 투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 31을 참고하기 바란다. 항암제 5-Fu군은 인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 77.80%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 52.49%, 64.32%, 60.96%이다. 고 투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 32를 참고하기 바란다. 항암제 5-Fu군은 인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 73.84%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 고환암 5637이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 60.51%, 65.11%, 62.63%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 14
인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대군인 아바스틴군은 2일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 33] 인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 34] 인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 35] 인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 33을 참고하기 바란다. 폴리펩타이드I의 3가지 투여량군의 이식 종양 억제율은 58.33%, 65.00%, 56.67%이다. 고투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여랑군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 현저한 독성 부작용이 없다.
인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 34를 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 78.85%이다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 60.48%, 69.19%, 62.00%이다. 고투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 현저한 독성 부작용이 없다.
인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 35를 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 76.79%이다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 담낭암 GBC-SD가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 63.73%, 74.62%, 64.55%이다. 고투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 현저한 독성 부작용이 없다.
실시예 15
인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대군인 아바스틴군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 36] 인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 37] 인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 38] 인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 36을 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.60%이며, 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드 마우스의 종양에 대한 억제율이 49.20%, 56.34%, 53.17%이다. 중투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 37을 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.60%이며, 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드 마우스의 종양에 대한 억제율이 60.97%, 71.10%, 67.72%이다. 고투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있고, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 38을 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.60%이며, 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 방광암 HT1376이 이종이식된 누드 마우스의 종양에 대한 억제율이 67.92%, 76.94%, 72.55%이다. 고투여량군, 저투여량군, 중투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 16
인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군인 아바스틴군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 39] 인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 40] 인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 41] 인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 억제 작용은 표 39를 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.07%이며, 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 55.04%, 63.57%, 60.47%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없고, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 40을 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.07%이며, 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 65.05%, 72.97%, 70.09%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없고, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 41을 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.07%이며, 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 췌장암 SW-1990이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 71.01%, 78.64%, 74.68%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없고, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 17
인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군 아바스틴군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 42] 인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 43] 인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 44] 인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 42를 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 69.00%이며, 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 64.71%, 69.00%, 65.36%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 43을 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 69.00%이며, 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 53.34%, 63.88%, 59.65%이다. 고투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 44를 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 69.00%이며, 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 식도암 Ec109가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 59.75%, 67.13%, 65.63%이다. 고투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있고, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 18
인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II와 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군인 시스플라틴군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 45] 인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 46] 인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 47] 인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 45를 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.17%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있고, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 61.11%, 65.97%, 68.05%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없고, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 46을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.17%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있고, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 72.93%, 81.96%, 78.32%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없고, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 47을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.17%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있고, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 결장암 HT-29가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이79.11%, 85.62%, 83.70%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없고, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 19
인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군인 시스플라틴군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 48] 인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 49] 인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 50] 인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 48을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스 종양에 대한 억제율이 74.09%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 58.01%, 64.89%, 64.12%이다. 고 투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있다. 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 49를 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 74.09%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 56.59%, 66.94%, 60.97%이다. 고 투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있고, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 50을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 74.09%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 갑상선암 SW-579가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 63.38%, 70.58%, 66.40%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 20
인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군 시스플라틴군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 51] 인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 인테그린 차단제 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 52] 인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 53] 인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 인테그린 차단제 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 51을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.83%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이53.65%, 60.16%, 58.53%이다. 고투여량, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 현저한 차이가 있다. 중투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 52를 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.83%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 64.90%, 71.41%, 67.03%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 53을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 79.83%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 신장암 A498이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 66.36%, 75.36%, 70.74%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 21
인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군인 시스플라틴군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 54] 인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I 의 억제 작용
[표 55] 인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II 의 억제 작용
[표 56] 인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I 의 억제 작용은 표 54를 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스 종양에 대한 억제율이 78.36%이나 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스 종양에 대한 억제율이 67.13%, 70.89%, 69.40%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험 동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 55를 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스 종양에 대한 억제율이 78.36%이나 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스 종양에 대한 억제율이 63.25%, 72.76%, 68.36%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험 동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 56을 참고하기 바란다. 항암제 시스플라틴군은 인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스 종양에 대한 억제율이 78.36%이나 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 난소암 SK-OV-3이 이종이식된 누드마우스 종양에 대한 억제율이 69.98%, 76.63%, 73.87%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피와 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성 대조군과 비교하면, 실험 동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 22
육종(肉腫) HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제의 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군인 5-Fu군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 57] 육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 58] 육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 59] 육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 57을 참고하기 바란다. 항암제 5-Fu군은 육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 78.10%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 64.23%, 73.72%, 69.34%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피를 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 58을 참고하기 바란다. 항암제 5-Fu군은 육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 78.10%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 67.06%, 74.43%, 70.60%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피를 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 59를 참고하기 바란다. 항암제 5-Fu군은 육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 78.10%이나, 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중을 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 육종 HT-1080이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 73.29%, 79.90%, 75.87%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군 종양 부피를 비교하면 모두 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 23
인체 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성 대조군인 아바스틴군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 60] 인체 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 61] 인체 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 62] 인체 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 60을 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 76.79%이며, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 55.35%, 63.39%, 60.90%이다. 고투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 61을 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 76.79%이며, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 60.76%, 70.41%, 64.98%이다. 고투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 62를 참고하기 바란다. 아바스틴군은 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 76.79%이며, 실험동물의 체중에 영향이 없다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인후암 Hep-2가 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 62.81%, 75.13%, 67.29%이다. 고투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 현저한 차이가 있으며, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 24
인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군인 탁솔군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 63] 인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 64] 인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 65] 인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 63을 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 76.29%이나 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 60.16%, 71.19%, 67.80%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비 교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 64를 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 76.29%이나 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 65.48%, 75.02%, 70.61%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 65를 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 76.29%이나 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용이 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 뇌종양 SF763이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 74.06%, 79.76%, 72.82%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 종양 부피는 음성군의 종양 부피와 비 교하면 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 25
인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한에 인테그린 차단제 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 억제 실험
종양 접종 및 검측 평가 방법은 실시예 6을 참고한다. 양성대조군인 탁솔군은 3일 1회 미정맥 주사하고, 기타 군은 1일 1회 미정맥 주사한다.
[표 66] 인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한에 폴리펩타이드I의 억제 작용
[표 67] 인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한에 폴리펩타이드II의 억제 작용
[표 68] 인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한에 폴리펩타이드III의 억제 작용
결과: 인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한에 폴리펩타이드I의 억제 작용은 표 66을 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 76.62%이나 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용은 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드I의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 59.20%, 64.80%, 58.40%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군과 음성군은 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한에 폴리펩타이드II의 억제 작용은 표 67을 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 76.62%이나 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용은 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 67.41%, 75.42%, 72.26%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군과 음성군은 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양 성장에 대한에 폴리펩타이드III의 억제 작용은 표 68을 참고하기 바란다. 항암제 탁솔군은 인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 76.62%이나 실험동물의 체중에 현저한 영향이 있으며, 음성군 및 폴리펩타이드 투여군의 동물 체중과 비교하면 비교적 가볍고, 독성 부작용은 비교적 뚜렷하다. 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군은 인체 직장암 Colo320이 이종이식된 누드마우스의 종양에 대한 억제율이 73.51%, 80.89%, 70.34%이다. 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군과 음성군은 매우 현저한 차이가 있다. 음성대조군과 비교하면, 실험동물의 체중에 영향이 없으며, 뚜렷한 독성 부작용이 없다.
실시예 26
콜라겐 유도성 마우스 관절염 동물 모델에서의 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 체내 면역 보호 작용
콜라겐형 마우스 관절염 동물 모델을 만들어, 마우스 콜라겐 유도성 관절염(collagen induced arthritis, CIA)에 대한 폴리펩타이드의 치료 작용을 연구한다. 마우스를 실험 대상 동물로 하고, SPF급 DBA/1 마우스(Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd에서 제공하고, 동물 생산 허가증 번호는 SCXK(후)2008-0016임) 수컷(7~8주, 체중 18~22g)을 무작위로 각각 정상대조군; 모델대조군; 폴리펩타이드I 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.2, 0.4, 0.8mg/kg); 폴리펩타이드II 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.2, 0.4, 0.8 mg/kg); 폴리펩타이드III 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.1, 0.2, 0.4mg/kg); 및 양성약물대조군(메토트렉세이트 1mg/kg)로 나눈다. 정상군 외에, 제0일째 각 실험군은 마우스 CIA모델을 만드는데, 그 방법은 닭연골(Chicken Cartilage) III형 콜라겐(cIII)을 0.1mol/l의 초산을 이용하여 4ml/ml의 용액으로 용해시켜, 4℃의 냉장고에 하룻밤 동안 놔둔다. 실험 당일, III형 콜라겐과 4 mg/ml의 Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv을 함유하는 완전프로인트보강제(CFA)를 같은 부피로 충분히 유화(乳化)시키고, DBA/1마우스가 마취된 후, 꼬리부위에 유화제를 마리당 50μl 피내 주사하여 면역시키고, 21d 후 40mg/ml의 III형 콜라겐(cIII)과 불완전프로인트보강제(IFA)를 같은 부피로 충분히 유화시킨 후 같은 량의 유화제를 꼬리부위에 투여하여 재면역을 실시한다. 모델을 만든지 30일째되는 날부터 폴리펩타이드I 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.2, 0.4, 0.8mg/kg); 폴리펩타이드II 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.2, 0.4, 0.8mg/kg), 폴리펩타이드III 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.1, 0.2, 0.4mg/kg)은 1일 2회, 연속 10일 동안 피하 주사하고, 양성약물대조군(메토트렉세이트 1mg/kg)은 5일 1회, 연속해서 3회 피하 주사하고, 정상대조군과 모델대조군(생리염수)은 연속 10일 피하 주사한다. 각각 모델을 만든 후 제21일~제70일 사이에 3일마다 체중을 칭량하고, 관절에 대해 평점하고, 각각 좌우 뒷다리 복사뼈 직경을 측정하여 마우스 콜라겐형 관절염에 대한 약물의 영향을 관찰한다. 70일째, 마우스를 탈구시켜 죽인다.
관절염 평가지표는 다음과 같다.
1) 관절에 대한 평점
사지: 0~4의 5등급으로 평점하되, 0 = 무홍반 또는 무홍종(紅虜); 1 = 경미한 홍반 또는 종창, 하나의 전/후측 발가락 관절에 홍반 또는 종창(swelling, 虜脹)이 있음; 2 = 둘 이상의 발가락에 홍반 또는 종창이 발생; 3 = 발목 관절 아래의 발에 종창이 발생; 4 =모든 발(발목 관절을 포함)에 종창이 발생. 마우스의 네 발에 대해 각각 평점을 하고 최고 평점은 16점이다.
각각 모델을 만든 후의 제21일 내지 제70일 사이에 3일마다 관절에 대해 평점하여 결과를 기록한다.
2) 복사뼈 직경 측정
각각 모델을 만들기 전과 만든 후의 제21일 내지 제70일 사이에 3일마다 버니어캘리퍼스로 마우스의 좌, 우 복사뼈의 내측에서 외측까지의 직경 및 복사뼈의 두께를 측정하여 결과를 기록한다.
시험결과의 측정 데이터는 평균값±표준편차(mean ± SD)로 표시하고, SPSS 11.0 소프트웨어를 이용하여 각각의 투약군과 대조군 간의 t검증을 진행하며 *는 p<0.05를 나타내며, **는 p<0.01를 나타낸다.
결과：모델을 만든 후의 마우스와 정상 마우스를 비교하면, 마우스 꼬리부위에 불활성화 결핵균을 함유한 완전프로인트보강제와 콜라겐을 같은 부피로 혼합한 유화제를 피내 주사하고, 21일이 지난 후 꼬리부위에 불완전프로인트보강제와 콜라겐을 같은 부피로 혼합한 유화제를 피내 주사하여 면역시킨 후, 제27일째에 CIA마우스의 족발에 홍종이 발생하였고, 관절염 지수 평점이 높아지고 모델군은 제45~60일째가 종창 피크시기이며, 모델군은 제35일째부터 체중이 거의 증가하지 않으며, 후기(後期)에는 약간 낮아진다. 폴리펩타이드Ⅰ는 콜라겐 유도성 마우스 관절염 동물 모델에서 모두 체내 면역 보호 작용을 발휘하며, 결과는 표 69를 참조하기 바란다. 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅰ의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 발 종창도(腫脹度)는 모델군과 비교하면, 모두 매우 현저한 차이가 있고(p<0.01), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다. 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅰ의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 관절 종창도는 모델군과 비교하면, 모두 매우 현저한 차이를 나타냈으며(p<0.01), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다. 폴리펩타이드Ⅰ의 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군의 사지 평점은 모델대조군보다 현저하게 낮으며(p<0.01), 모델대조군과 비교하면 매우 현저한 차이를 나타냈으며 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다.
[표 69] 콜라겐 유도성 마우스 관절염 동물 모델에 대한 폴리펩타이드I의 체내 면역 보호 작용
*는 p< 0. 05를 나타내고, **는 p< 0. 01을 나타낸다.
폴리펩타이드II는 콜라겐 유도성 마우스 관절염 동물 모델에서 모두 체내 면역 보호 작용을 발휘하며, 작용 결과는 표 70을 참고하기 바란다. 양성대조군, 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 발 종창도는 모델군과 비교하면, 모두 매우 현저한 차이가 있고(p<0.01), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다. 양성대조군, 폴리펩타이드II의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 관절 종창도는 모델군과 비교하면, 모두 매우 현저한 차이가 있으며(p<0.01), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다. 폴리펩타이드II 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군의 사지 평점은 모델대조군(p<0.01)보다 현저하게 낮으며, 모델대조군과 비교하면 현저한 차이가 있고, 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다.
[표 70] 콜라겐 유도성 마우스 관절염 동물 모델에 대한 폴리펩타이드II의 체내 면역 보호 작용
*는 p< 0. 05를 나타내고, **는 p< 0. 01을 나타낸다.
폴리펩타이드III은 콜라겐 유도성 마우스 관절염 동물 모델에서 모두 체내 면역 보호 작용을 발휘하며, 작용 결과는 표 70을 참고하기 바란다. 양성대조군, 폴리펩타이드III의 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 발 종창도는 모델군과 비교하면, 모두 매우 현저한 차이가 있고(p<0.01), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다. 양성대조군, 폴리펩타이드III 고투여량군, 중투여량군, 저투여량군의 관절 종창도는 모델군과 비교하면, 모두 매우 현저한 차이가 있으며(p<0.01), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다. 폴리펩타이드III 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군의 사지 평점은 모델대조군(p<0.01)보다 현저하게 낮으며, 모델대조군과 비교하면 현저한 차이가 있고, 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다.
[표 71] 콜라겐 유도성 마우스 관절염 동물 모델에 대한 폴리펩타이드III의 체내 면역 보호 작용
*는 p< 0. 05를 나타내고, **는 p< 0. 01을 나타낸다.
결론: 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III은 마우스 콜라겐형 관절염에 대해 치료 작용을 갖는다.
실시예 27
랫트 애주번트 관절염 동물 모델에 대한 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II, 폴리펩타이드III의 체내 면역 보호 작용
랫트 애주번트 관절염 동물 모델을 만들고, 애주번트 관절염(Adjuvant arthritis, AA) 랫트에 대한 폴리펩다이드의 치료 작용을 연구한다. 랫트를 실험 대상 동물로 하고, SPF급 SD랫트(Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd에서 제공하고, 동물 생산 허가증 번호는 SCXK(후)2008-0016임) 수컷(체중 140-160g)을 무작위로 각각 정상대조군; 모델대조군; 폴리펩타이드I 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.4, 0.8, 1.6ml/kg); 폴리펩타이드II 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.4, 0.8, 1.6ml/kg), 폴리펩타이드III 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.2, 0.4, 0.8ml/kg); 및 양성약물대조군(메토트렉세이트1mg/kg)로 나눈다. 정상군 외에, 제0일째 각 실험군은 랫트 AA모델을 만드는데, 그 방법은 랫트의 좌측 뒷쪽 足?에 불활성화 결핵균(H37RA, 10mg/ml)을 함유한 완전프로인트보강제 0.08ml를 주사하여 랫트 애주번트 관절염 모델을 만든다. 모델을 만든 후의 10일째부터, 폴리펩타이드I 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.4, 0.8, 1.6mg/kg), 폴리펩타이드II 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.4, 0.8, 1.6mg/kg), 폴리펩타이드III 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군(0.2, 0.4, 0.8mg/kg)은 1일 2회, 연속 10일 동안 피하 주사하고, 양성약물대조군(메토트렉세이트1ml/kg)은 5일 1회씩, 연속 3회 피하 주사하고, 정상대조군과 모델대조군(생리염수)은 연속 10일 피하 주사한다. 각각 모델을 만든 후의 제 8, 11, 14, 17, 20, 23과 26일, 관절에 대해 평점하고, 좌우 뒷다리 복사뼈 직경을 측정하여 랫트 애주번트 관절염에 대한 약물의 영향을 관찰한다.
관절염 평가지표는 다음과 같다.
1) 관절에 대한 평점
사지: 0~4의 5등급으로 평점하되, 0=무홍반 또는 무홍종(紅虜); 1=경미한 홍반 또는 종창, 하나의 전/후측 발가락 관절에 홍반 또는 종창이 발생; 2=둘 이상의 발가락에 홍반 또는 종창이 발생; 3=발목 관절 아래의 발에 종창이 발생; 4=모든 발(발목 관절을 포함)에 종창이 발생. 랫트의 네 발에 대해 각각 평점을 하고, 최고 평점은 16점이다.
각각 모델을 만든 후의 제 8, 11, 14, 17, 20, 23과 26일에 관절에 대해 평점을 진행하여, 결과를 기록한다.
2) 복사뼈 직경 측정
각각 모델을 만들기 전과 만든 후의 제8, 11, 14, 17, 20, 23과 26일에 버니어캘리퍼스를 이용하여 랫트의 좌, 우 복사뼈의 내측에서 외측까지의 직경과 복사뼈 두께를 측정하여, 결과를 기록한다.
실험결과의 측정 데이터는 평균값±표준편차(mean ± SD )로 표시하고, SPSS 11.0소프트웨어를 이용하여 각각의 투약군과 대조군 간의 t검증을 진행하고, *는 p< 0. 05를 나타내며, **는 p< 0. 01 를 나타낸다.
결과: 모델을 만든 후의 랫트와 정상 랫트를 비교하면, 좌측 후족에 불활성화 결핵균을 함유한 완전프로인트보강제를 주사한 후, 좌측 뒷발에 원발성 관절염이 빠르게 발생하여 현저한 종창이 나타면서 곪았다. 우측 뒷발은 약 10일후에 계발성 관절염이 나타나기 시작했으며 평가 점수가 점차 높아졌고, 동시에 귀 부위 혈관이 현저하게 증식하고 홍종이 뚜렷해 지고, 꼬리부위 관절에 종창이 발생하였다.
폴리펩타이드Ⅰ는 콜라겐 유도성 랫트 관절염 동물 모델(AIA 랫트 모델)에서 체내 면역 보호 작용을 발휘하며, 결과는 표 72와 같다. 랫트 양성대조군, 폴리펩타이드I 중투여량군의 좌측 뒷다리 복사뼈 직경은 모델군과 비교하면, 매우 현저한 차이가 있으며(p<0.01), 인테그린 차단제 폴리펩타이드I 저투여량군, 고투여량군의 좌측 뒷다리 복사뼈 직경은 모델군과 비교하면, 모두 현저한 차이가 있으며(p<0.05), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다. 랫트 양성대조군, 폴리펩타이드I 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군의 우측 뒷다리 복사뼈 직경은 모델군과 비교하면, 현저한 차이가 있다(p<0.05). 폴리펩타이드I 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군의 사지 평점은 모델대조군(p<0.05)에 비해 현저하게 낮으며, 모델대조군과 비교하면 차이는 모두 통계학적 의미를 갖는다.
[표 72] 애주번트 랫트 관절염 동물 모델에 대한 폴리펩타이드I의 체내 면역 보호 작용
*는 p< 0. 05를 나타내고, **는 p< 0. 01을 나타낸다.
폴리펩타이드II는 콜라겐 유도성 랫트 관절염 동물 모형에서 체내 면역 보호 작용을 발휘하며, 결과는 표73과 같다. 랫트 양성대조군, 폴리펩타이드II 중투여량군의 좌측 뒷다리 복사뼈 직경은 모델군과 비교하면, 매우 현저한 차이가 있으며(p<0.01), 폴리펩타이드II 저투여량군, 고투여량군의 좌측 뒷다리 복사뼈 직경은 모델군과 비교하면, 모두 현저한 차이가 있으며(p<0.05), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다. 랫트 양성대조군, 폴리펩타이드II 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군의 우측 뒷다리 복사뼈 직경은 모델군과 비교하면, 현저한 차이가 있다(p<0.05). 폴리펩타이드II 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군의 사지 평점은 모델대조군(p<0.05)에 비해 현저하게 낮으며, 모델대조군과 비교하면 차이는 모두 통계학적 의미를 갖는다.
[표 73] 애주번트 랫트 관절염 동물 모델에 대한 폴리펩타이드II의 체내 면역 보호 작용
*는 p< 0. 05를 나타내고, **는 p< 0. 01을 나타낸다.
폴리펩타이드III는 콜라겐 유도성 랫트 관절염 동물 모델에서 체내 면역 보호 작용을 발휘하며, 결과는 표 74와 같다. 랫트 양성대조군, 폴리펩타이드III 중투여량군의 좌측 뒷다리 복사뼈 직경은 모델군과 비교하면, 매우 현저한 차이가 있으며(p<0.01), 폴리펩타이드III 저투여량군, 고투여량군의 좌측 뒷다리 복사뼈 직경은 모델군과 비교하면, 모두 현저한 차이가 있으며(p<0.05), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 갖는다. 랫트 양성대조군, 폴리펩타이드III 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군의 우측 뒷다리 복사뼈 직경은 모델군과 비교하면, 현저한 차이가 있다(p<0.05). 폴리펩타이드III 저투여량군, 중투여량군, 고투여량군의 사지 평점은 모델대조군(p<0.05)에 비해 현저하게 낮으며, 모델대조군과 비교하면 차이는 모두 통계학적 의미를 갖는다.
[표 74] 애주번트 랫트 관절염 동물 모델에 대한 폴리펩타이드III의 체내 면역 보호 작용
*는 p< 0. 05를 나타내고, **는 p< 0. 01을 나타낸다.
결론: 폴리펩타이드I, 폴리펩타이드II 및 폴리펩타이드III는 AA 랫트 관절염에 대해 치료 작용을 가진다.
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Claims (8)
- 아미노산 서열이 X-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Y이고, X 및 Y의 서열은 결실 또는 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys 을 함유하는 폴리펩타이드인, 인테그린 차단제 폴리펩타이드로서,
상기 인테그린 차단제 폴리펩타이드가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 인테그린 차단제 폴리펩타이드:
폴리펩타이드 I: Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala (서열번호 1);
폴리펩타이드 IV: Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala (서열번호 8);
폴리펩타이드 Ⅴ: Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala (서열번호 9);
폴리펩타이드 VII: Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (서열번호 11); 및
폴리펩타이드 VIII: Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (서열번호 12). - 제1항의 폴리펩타이드; 및
상기 폴리펩타이드에 공유결합으로 연결된, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 보강제(adjuvant)
로 이루어진, 인테그린 차단제 폴리펩타이드. - 제1항 또는 제2항에 따른 인테그린 차단제 폴리펩타이드를 포함하는, 종양 치료용 약학 조성물로서,
상기 종양은 두경부, 뇌부, 갑상선, 식도, 췌장, 폐장, 간장, 위, 유방, 신장, 담낭, 결장, 직장, 난소, 자궁, 자궁경부, 전립선, 방광 또는 고환에서 발생하는 원발성/계발성 암, 흑색종, 또는 육종인 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 조성물은 상기 폴리펩타이드의 염을 유효 함량으로 함유하거나 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 조성물은 피하 주사, 근육 주사, 정맥 주사, 정맥 점적 주사, 경구 투약 및 비강 분무(nasal spray) 투여로 이루어진 군에서 선택되는 투여 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 제1항 또는 제2항에 따른 인테그린 차단제 폴리펩타이드를 포함하는, 류마티스 관절염 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 조성물은 상기 폴리펩타이드의 염을 유효 함량으로 함유하거나 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 제1항에 따른 인테그린 차단제 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
상기 폴리펩타이드는 합성방법 또는 발현체 재조합 방법을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 인테그린 차단제 폴리펩타이드의 제조방법.
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