CN1161151C - 内皮抑素的新用途及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了内皮抑素的新用途及其应用，具体表现在，内皮抑素具有促进软骨细胞生长的作用，具有抑制基质外金属蛋白酶基因表达及其活性的作用，具有促进基质外金属蛋白酶抑制剂TIMP1基因表达及其活性的作用。在内皮抑素上述功能的基础上，可以生产以内皮抑素为活性成分的治疗关节炎及类风湿的药物，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及内皮抑素的新用途及其应用。
背景技术
内皮抑素(endostatin)最初发现于小鼠血管内皮瘤细胞EOMA的培养上清中，具有强大的抑制新血管生成和抑制肿瘤形成、转移的功能。自发现之初，就以其强大的抑瘤活性引起广泛关注。作为肿瘤治疗辅助药物，内皮抑素在美国已经开始一期临床实验观察，但其作用机理还未阐明。目前研究认为，内皮抑素抑制肿瘤的活性，是由于抑制了血管内皮细胞的增殖，即抑制新血管的形成，从而切断肿瘤的营养供应，饿死了肿瘤。至今为止关于内皮抑素的生物活性的报道都是围绕抑制新血管形成、抑制肿瘤生长方面。并且据国外报道，内皮抑素的活性并不稳定，不同研究小组的报道也有矛盾之处。我们认为，内皮抑素的作用不一定局限于血管内皮细胞，可能对更广泛的细胞类型，特别是那些与血管内皮细胞有共同祖先来源的细胞类型也会有作用。
另一方面，软骨组织是机体的重要组成部分，以软骨组织损伤为主要表现形式的关节炎、类风湿等病症长期以来给人类及牲畜等造成了巨大的痛苦和威胁。
发明内容
本发明的目的是提供内皮抑素的新用途。
本发明的另一个目的是提供内皮抑素在新用途基础上的应用。
本发明证实，内皮抑素具有保护软骨的用途。
具体表现在，所述内皮抑素具有促进软骨细胞生长的作用；具有抑制基质外金属蛋白酶(MMP9)基因的表达及其活性的作用；具有促进基质外金属蛋白酶抑制剂TIMP1基因表达的，提高抑制剂TIMP1活性的作用。
在内皮抑素上述功能的基础上，可以生产以内皮抑素为活性成分的治疗关节炎及类风湿的药物。内皮抑素在制备治疗关节炎的药物，治疗类风湿的药物中有广阔的应用前景。
本发明的实验结果表明，内皮抑素可促进软骨细胞的增殖，促进软骨特异基质蛋白胶原II的表达，对软骨细胞具有保护作用。基质外金属蛋白酶(MMP9)会造成关节炎发生时软骨基质的过度降解，引起软骨的损伤，而内皮抑素具有抑制基质外金属蛋白酶(MMP9)基因的表达及其活性的作用，并且可促进MMP9抑制剂TIMP1基因的表达，提高抑制剂TIMP1的活性，还具有维持软骨细胞表型的功能，因而起到对软骨的保护作用，阻止关节炎的发生，可制成治疗关节炎、类风湿的药物，给广大的关节炎、类风湿患者带来了福音。
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为所提取的内皮抑素抑制bFGF刺激的人脐静脉血管内皮细胞增殖的直方图。
图2为内皮抑素刺激原代培养的兔软骨细胞[3H]-TdR掺入的直方图。
图3为内皮抑素处理的细胞RNA的Northern blotting结果。
图4为无血清培养基加内皮抑素培养的兔软骨细胞
图5为无血清培养基加PBS培养的兔软骨细胞
图6为无血清培养基加PBS培养的人软骨肉瘤细胞sw1353
图7为无血清培养基加内皮抑素培养的人软骨肉瘤细胞sw1353
图8为胎牛血清培养基加PBS培养的人软骨肉瘤细胞sw1353
首先，介绍本发明实施例中所用到的实验材料的获得。
具体实施方式
一、人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的分离培养
无菌条件下取新鲜人脐带，用含抗生素的PBS缓冲液洗去脐静脉中的血细胞，用止血钳夹住一端，灌入0.1％胶原酶II，37℃消化20h后PBS洗两遍，合并消化液和PBS，加15％胎牛血清，900r/h离心10h，收集细胞，重悬于含20％胎牛血清的IMDM培养基中，记数105接种于明胶铺板的六孔培养板上。第二天除去悬浮细胞换IMDM完全培养基(含，20％胎牛血清；0.9％肝素；1％BSA；2ng/mlbFGF)，37℃、5％CO2培养至长满后1∶5传代。用VIII因子免疫组化鉴定纯度，第3-8代HUVEC被用来做生物活性实验。
二、内皮抑素的获得与鉴定
内皮抑素的提取可以用PCR的方法从人胎肝cDNA文库中扩增出人内皮抑素的cDNA，测序正确后转入毕赤巴斯德)(pichia pastoris)甲醇酵母，获得高效可溶型表达，用肝素亲和层析的方法进行纯化，得到产物。(冯怡等，2001(2).人内皮抑素在毕赤酵母中的表达及其纯化与生物功能研究。生物工程学报)。如图1所示，以人脐静脉血管内皮细胞为实验材料，通过以加入缓冲液PBS为对照的加入不同浓度的人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与内皮抑素(分别为bFGF10ng；bFGF10ng+内皮抑素50ng；bFGF10ng+内皮抑素500ng；bFGF10ng+内皮抑素lug)所进行的实验证实，在加入相同剂量的bFGF的情况下，随着加入内皮抑素剂量的增加，人脐静脉血管内皮细胞的增长受到抑制，方差显示效果稳定，证明所提取出的内皮抑素是正常的。所提取出的内皮抑素的可信性还可以通过MTT比色试验及鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验得到证实(冯怡等，2001(2).人内皮抑素在毕赤酵母中的表达及其纯化与生物功能研究。生物工程学报)。
三、关节软骨细胞的原代培养
取一月龄的新西兰幼兔关节软骨，切成1mm3大小，用含青霉素(50万单位/升)链霉素(50万单位/生)的10mM PBS缓冲液洗净。按顺序用0.01％透明质酸酶37℃消化40分钟，去消化液；0.25％胰蛋白酶37℃消化1小时，去消化液；0.2％胶原酶II型37℃消化30分钟，去消化液；0.2％胶原酶II型消化90分钟，吹打散开，收集消化液，1000转/分离心3分钟，去上清，重悬于含12％胎牛血清的DMEM/F-12(1∶1)培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3天换液一次，待细胞长满后用0.25％胰酶消化传代，第3-5代细胞被用来进行试验。可用苏木精-亮绿-番红花“O”染色和软骨细胞特异的胶原II免疫组化鉴定软骨细胞纯度。
实施例1、[3H]-TdR标记掺入实验
取状态良好的兔软骨细胞，用0.25％胰酶消化，吹打、离心后重悬与一定体积的培养基中，调节到100ul 5×104个细胞，按每孔100ul接种于96孔板。贴壁过夜后换含2％血清的培养基，继续培养24小时，然后加入试验样品每种处理平行三个，继续培养20小时，然后加入[3H]-TdR(5μ Ci per well)，4小时后吸去培养液，PBS洗去残存培养基，加入胰酶消化至脱落，收集细胞到玻璃纤维膜上，烤干后收于5ml闪烁液中，用液闪仪测量，所得数据进行统计学分析。如图2所示，左侧的直方图是加入PBS缓冲液的对照组，右侧的直方图是加入10ug/ml内皮抑素的实验组，从图中可以看出，处理组与对照组兔软骨细胞增殖速度的差异达到极显著水平(P＜0.01)，说明内皮抑素有显著的促进软骨细胞生长的功能。
实施例2、细胞周期检测
将状态良好的兔软骨细胞用0.25％胰酶消化，吹打、离心后重悬于一定体积的培养基中，正常传代至50ml细胞培养瓶中，培养至铺满瓶底的80％，换无血清培养基，继续培养24小时，分别加入PBS对照，内皮抑素10ug。继续培养16小时，用0.25％胰酶+0.04MEDTA消化至脱落，加培养基补齐到5ml，900转/分钟离心10分钟，吸弃上清，加5mlPBS重悬细胞，再次离心900转/分钟10分钟，吸净上清，用75％4℃冰冷的乙醇5ml重悬固定细胞，放于4℃保存至PI染色，染色前用PBS洗净细胞，最后一次离心后吸净上清，加入100ul 0.1mg/ml RNA酶37℃闭光孵育20分钟，加入100ul50ug/ml碘化丙啶(PI)染色15分钟后加入PBS缓冲液至500ul，1小时内流式细胞仪检测。结果如下：
G0-G1(％) S(％) G2-M(％)
PBS 84.38 8.89 6.73
Endo(5ug/ml) 69.17 24.21 6.77
从上述结果可以看出，加入内皮抑素后S期细胞增多，G0-G1期细胞减少，证实内皮抑素可刺激软骨细胞进入细胞周期，即促进软骨细胞的生长。
实施例3、RNA与探针杂交(Northern blotting)实验
将状态良好的兔软骨细胞接种于75cm2的细胞培养瓶中，在含12％FCS的培养基中培养至铺满瓶底80％，换含2％胎牛血清的培养基，24小时后分别加入内皮抑素1ug/ml和PBS对照，继续培养48小时。用Trizol提取细胞总RNA。取20ugRNA上样于低甲醛琼脂糖凝胶中，在1×MOPS缓冲液中电泳后转移至硝酸纤维素膜，80℃干烤。用Promega公司的Primer-a-gene标记试剂盒标记探针，GAPDH为内标，68℃杂交过夜。2×SSC，0.1％SDS室温下洗膜2次，0.1×SSC，0.1％SDS60℃洗膜2次，每次15分钟。结果如图3所示，图中的各样品均用GAPDH标定，各样品上样量一致，其中，A带为基质外金属蛋白酶(MMP9)抑制剂TIMP1的Northern blotting结果；B带为软骨特异基质蛋白胶原II(Collagen II)的Northern blotting结果；C带为基质外金属蛋白酶(MMP9)的Northern blotting结果；D带为GAPDH对照；A、B、C、D带中的1均为未经内皮抑素处理的细胞的RNA Northern blotting结果，2均为经内皮抑素处理的细胞的RNA Northern blotting结果。从图中可以看出，内皮抑素可促进软骨细胞特异基质蛋白胶原II的表达，即可促进软骨细胞的增殖，对软骨细胞具有保护作用；内皮抑素还可抑制基质外金属蛋白酶(MMP9)基因的表达，并抑制其活性，进而防止关节炎发生时软骨基质的过度降解，避免损伤的发生；同时，内皮抑素还可以促进MMP9抑制剂TIMP1基因的表达，并提高其活性，从而抑制MMP9的作用，关节炎发生时可以起到间接地保护软骨的作用。
实施例4、内皮抑素可维持无血清培养条件下软骨细胞的正常生长
原代培养的兔软骨细胞需在加有血清的培养基中才能正常生长，细胞呈梭形，当不加血清时不能正常生长，细胞成圆形，很快死亡。在无血清的培养基中加入10ug/ml的内皮抑素，用该培养基来培养生长情况良好的兔软骨细胞，18小时后，如图4所示，兔软骨细胞形态正常，同时，在无血清的培养基中加入10ug/ml的PBS缓冲液来培养生长情况良好的兔软骨细胞，作为上述实验的对照，18小时后，如图5所示，兔软骨细胞已成圆形并死亡。可见，内皮抑素可使无血清培养的软骨细胞维持正常的形态，和正常的生长，对软骨有保护作用。
实施例5、内皮抑素可维持无血清培养条件下人软骨肉瘤细胞sw1353的正常生长
人软骨肉瘤细胞sw1353需在加有血清的培养基中才能正常生长，细胞呈梭形，当不加血清时不能正常生长，细胞成圆形，很快死亡。在无血清的培养基中加入10ug/ml的内皮抑素，用该培养基来培养人软骨肉瘤细胞sw1353，12小时后，如图7所示，人软骨肉瘤细胞sw1353形态正常，与如图8所示的，在10％胎牛血清培养基中(加入10ug/mlPBS缓冲液)培养12小时的人软骨肉瘤细胞sw1353形态相同，同时，如图6所示，在加入10ug/mlPBS缓冲液的无血清培养基中培养的人软骨肉瘤细胞sw1353，培养12小时时已成圆形并死亡。说明内皮抑素对人的软骨具有保护作用。
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1、内皮抑素在制备治疗关节炎及类风湿的药物中的应用。
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